DE69837824T2

DE69837824T2 - Löslicher Natamycin-Proteinkomplex

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Publication number: DE69837824T2
Application number: DE69837824T
Authority: DE
Inventors: Ferdinand Theodorus Joseph Van Rijn; Jacobus Stark; Edith Magda Lucia Geijp
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1997-03-14
Filing date: 1998-03-11
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2018-03-12
Also published as: US5997926A; CA2232149A1; DK0865738T3; US6228408B1; DE69837824D1; ATE363214T1; EP0865738B1; AU5838498A; AU730551B2; EP0865738A1; ES2285747T3; PT865738E

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Zusammensetzungen, die Natamycin enthalten, sowie die Verwendung von solchen Zusammensetzungen für die Behandlung von Nahrungsmitteln wie verschiedenen Arten von Käse und Wurst oder von landwirtschaftlichen Produkten wie Früchten, Körnern und Samen. Ebenfalls beschrieben sind mit erfindungsgemäßen Zusammensetzungen behandelte Produkte.
Natamycin wird seit über 20 Jahren zur Vorbeugung von Pilzwachstum auf verschiedenen Arten von Käse und Wurst verwendet.
Käse werden durch Eintauchen in eine Suspension von Natamycin in Wasser behandelt oder mit einer Emulsion eines Polymers in Wasser, hauptsächlich Polyvinylacetat, beschichtet. Würste werden in erster Linie durch Eintauchen oder durch Sprühbeschichten mit einer Suspension von Natamycin in Wasser behandelt. Üblicherweise enthalten wäßrige Suspensionen für Immersionsbehandlungen 0,1 bis 0,2% (w/v) Natamycin, während Polymeremulsionen für Beschichtungszwecke 0,01% bis 0,05% (w/v) Natamycin enthalten.
Diese Behandlungen können für die Vorbeugung von Pilzwachstum auf der Oberfläche von verschiedenen Arten von Käse und Wurst hochwirksam sein. Aufgrund der niedrigen Löslichkeit des Natamycins werden jedoch Schimmelpilzarten, die gegenüber Natamycin weniger empfindlich sind, manchmal nicht vollständig gehemmt. Auf diese Art und Weise kann nach wie vor Verderb aufgrund von Pilzwachstum stattfinden. Pilzarten, die gegenüber Natamycin stärker tolerant sind, sind zum Beispiel Verticilium cinnabarinum, Botrytis cinerea und Trichophyton-Arten. Stärker tolerante Arten finden sich auch unter den Gattungen Aspergillus, Fusarium und Penicillium. Ein Beispiel für solch eine Art, die manchmal zu Schimmelpilzproblemen in der Käsereiwirtschaft führt, ist Penicillium discolour.
Aufgrund der niedrigen Löslichkeit von Natamycin wird ein Nahrungsmittelprodukt, das mit diesem Antimykotikum behandelt ist, länger gegen Pilzwachstum geschützt werden. Nur das in Lösung befindliche Natamycin wird für die Ausübung einer antifungalen Wirksamkeit verfügbar sein.
Natamycin weist für die meisten Pilze, die Lebensmittel befallen, eine MHK (Minimale Hemmkonzentration) von weniger als 10 ppm auf, während seine Löslichkeit in Wasser 30 bis 50 ppm beträgt (Brik, H.; "Natamycin" Analytical Profiles of Drug Substances 10, 513-561, (1981)). Obwohl dieses Antimykotikum seit vielen Jahren kontinuierlich verwendet wird, sind noch nie natamycinresistente Pilze beobachtet worden (De Boer, E.; Stolk-Horsthuis, M.; "Sensitivity to natamycin (pimaricin) of fungi isolated in cheese warehouses" [Natamycin-(pimaricin-)Sensivität von in Käselagern isolierten Pilzen] J. of Food Prot. 40, 533-536, (1977)). Unter normalen Bedingungen schützt Natamycin Nahrungsmittelprodukte wie Käse kurzfristig vollständig gegen Verderb durch Pilze. Manchmal treten in der Umwelt jedoch viele Pilze auf, zum Beispiel in einer Käsefabrik, so daß die gelöste Natamycinfraktion nicht ausreicht, um Pilzwachstum auf Käse zu verhindern, oder weil die Produktions- oder Lagerbedingungen in Fabriken für das Wachstum von Pilzen besonders günstig sind. Ein Beispiel für einen wichtigen Faktor, der das Pilzwachstum fördert, ist eine ungenügende Kontrolle der relativen Feuchtigkeit.
In solchen Fällen werden tolerantere Schimmelpilzarten auf natamycinbehandelten Produkten wachsen.
Verderb durch Schimmelpilze kann zu beträchtlichen wirtschaftlichen Schäden führen, und der Schutz von Nahrungsmittelprodukten wie Käse durch Verderb durch stärker natamycintolerante Schimmelpilzarten erfordert ein wirksameres antifungales System.
In der EP 0466038 werden antifungale wasserdispergierbare Polyenkomplexe und Verfahren zu ihrer Herstellung beschrieben.
Ein Komplex von Amphotericin B mit Desoxycholat weist möglicherweise toxische Nebenwirkungen auf, von denen der wichtigste Nephrotoxizität ist. Diese toxischen Nebenwirkungen können mit der schlechten Wasserlöslichkeit zusammenhängen. Die beschriebenen Komplexe weisen den Vorteil auf, daß sie das antifungale Mittel rasch in das Wasser freisetzen, ohne seine Wirkung zu verringern.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, mit dem die Wirkung von Natamycin gegenüber Pilzen verbessert werden soll, sowie Zusammensetzungen, die nach diesem Verfahren hergestellt werden. Insbesondere können sich solche Zusammensetzungen für die Bekämpfung von Schimmelpilzen und Hefen eignen, die normalerweise relativ weniger empfindlich gegenüber der Wirkung von Natamycin sind.
Bei Pilzen mit einer relativ niedrigen Empfindlichkeit gegen Natamycin können Solubilisierung und Diffusion dessen antifungale Wirkung stärker einschränken. Wird ein traditionelles Fungizidpräparat, das Natamycin enthält, verwendet, so kann im Gleichgewichtsstadium die durchschnittliche Menge an gelöstem Natamycin unter die Wirkkonzentration absinken, da eine Elimination nicht entsprechend durch Lösung und Diffusion der antifungalen Verbindung kompensiert wird.
Eine Modifikation der polymorphen Form von antifungalen Polyenverbindungen wie Natamycin kann auch zu einer verbesserten Wirksamkeit dieser Verbindungen gegenüber weniger empfindlichen Arten führen, europäische Patentanmeldung Nr. 670676 (1995). Beispiele für solche modifizierten Formen sind Natamycinsolvate, wie das Methanolsolvat, sowie Kristallmodifikationen von Natamycin. Die Wirksamkeit von Polyenfungiziden kann auch dadurch verbessert werden, daß man die Verbindung in ein Erdalkalimetallsalz, wie die Calcium- und Bariumsalze, umwandelt.
Ein weiteres Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit von Polyenfungiziden besteht darin, daß man die antifungale Verbindung erst in einem Lösungsmittel löst und dann das gelöste Fungizid in eine wäßrige Zusammensetzung einarbeitet ( europäische Anmeldung Nr. 670676 ). Beispiele für geeignete Lösungsmittelsysteme sind niedere Alkohole wie Methanol, Ethanol und Propanol; Glyzerin und Glykol; Methoxyethanol und Ethoxyethanol; Eisessig sowie wäßrige Säure- und Basenlösungen; es können auch geeignete Lösungsvermittler verwendet werden.
Diese modifizierten Polyenantibiotika können auch mit gutbekannten Verfahren auf einen Träger aufgetragen werden, z.B. durch Sprühbeschichtungstechniken, bei denen eine Lösung der antifungalen Zusammensetzung auf einem Träger verwendet wird, oder durch Abdampfen des Lösungsmittels aus einer Mischung aus einer Lösung des antifungalen Mittels und des Trägers.
Die Lösung der antifungalen Verbindung kann in die schlußendliche Zusammensetzung dadurch eingearbeitet werden, daß man die Lösung zu einem Präparat gibt oder umgekehrt.
Eine Erhöhung der Wirksamkeit konnte dadurch erzielt werden, daß man die Verfügbarkeit der antifungalen Verbindung aufgrund eines verbesserten Auflösens verbesserte ( EP 670676 ). Die Löslichkeit in Wasser kann mit alkalischen oder sauren Bedingungen erhöht werden.
Die Löslichkeit kann auch dadurch erhöht werden, daß man Lösungsmittel verwendet. Es ist jedoch gutbekannt, daß gelöstes Natamycin unter solchen Bedingungen rasch abgebaut wird (Brik, siehe oben). Außerdem ist bekannt, daß gelöstes Natamycin im Vergleich zur Kristallform weniger stabil ist. So kann zum Beispiel Natamycin aufgrund der Einwirkung von Licht oder durch Hydrolyse durch Abbau desaktiviert werden.
Hieraus läßt sich schließen, daß alle bekannten Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit von Polyenfungiziden durch Erhöhung der Verfügbarkeit zu einem raschen Abbau des Polyenfungizids führen.
Unerwarteterweise wurde nun gefunden, daß die Wirksamkeit von Natamycin gegenüber Schimmelpilzen und Hefen wesentlich erhöht werden kann, wenn Natamycin mit einer geeigneten Verbindung komplexiert wird.
Außerdem wurde gefunden, daß die in der vorliegenden Schrift beschriebenen Komplexe unter wäßrigen Bedingungen, z.B. einer Lösung für die Beschichtung von Käse oder einer Eintauch-/Sprühlösung, sehr stabil sind.
Die vorliegende Erfindung sieht einen Komplex vor, der mit einem oder mehreren Proteinen oder Aminosäuren komplexiertes Natamycin enthält, und der, wenn er im Wasser vorliegt, keine bei Verwendung eines Mikroskops mit einer Vergrößerung von 400x sichtbaren Kristalle bildet.
Vorteilhafterweise verliert dieser Komplex, wenn er in Wasser vorliegt, innerhalb von 60 Tagen nicht wesentlich an Aktivität. Im allgemeinen beträgt das Verhältnis zwischen Natamycin und der gesamten Protein- oder Aminosäuremenge 10000:1 bis 1:10, vorzugsweise beträgt dieses Verhältnis 100:1 bis 1:1.
Vorzugsweise ist mindestens eines der Proteine ein Milchprotein, stärker bevorzugt ein Molkeprotein, Kasein oder Kaseinat.
Der Komplex kann nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden:

(1) Lösen von Natamycin in einer wäßrigen Flüssigkeit durch Erhöhen oder Senken des pH-Wertes, wie mit Hilfe von bekannten Verfahren;
(2) Mischen des (gelösten) Natamycins mit der geeigneten Verbindung (oder dem Komplexiermittel);
(3) Anlagern von Natamycin an die geeignete Verbindung durch Einstellen des pH-Werts auf die erforderliche Stufe nach bekannten Verfahren; und gegebenenfalls
(4) Isolieren des Komplexes des an die geeignete Verbindung angelagerten Natamycins aus der Flüssigfraktion nach bekannten Verfahren.

Der Komplex kann auch nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden:

(1) Lösen von Natamycin in einem Lösungsmittelsystem;
(2) Anlagern des Natamycins an die geeignete Verbindung durch Mischen des gelösten Natamycins mit dieser Verbindung; und
(3) Gegebenenfalls Isolieren des an die geeignete Verbindung angelagerten Natamycins aus der Flüssigfraktion nach als solchen bekannten Verfahren. Diese Verbindung kann in einer wäßrigen Lösung oder Suspension vorliegen.

Der Komplex des an eine geeignete Verbindung angelagerten Natamycins kann für unterschiedliche Anwendungen verwendet werden, darunter auch für die Vorbeugung von Pilzinfektion und -wachstum auf Naturprodukten, bei denen es sich um Nahrungsmittel oder landwirtschaftliche Produkte handelt. Vor der Anwendung kann der gebildete und gegebenenfalls aufgereinigte Komplex auch mit wäßrigen Systemen wie Wasser oder Käsebeschichtung, oder mit anderen geeigneten Verbindungen vermischt werden.
Statt den Komplex zu isolieren, kann der Komplex auch direkt im Lösungsmittelsystem oder in der wäßrigen Zusammensetzung verwendet werden, z.B. für den Anwendungszweck der Käsebeschichtung.
Es wird angenommen, daß die verbesserte Wirksamkeit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung auf der verbesserten Verfügbarkeit der antifungalen Verbindung aufgrund des verbesserten Lösens dieser Verbindung beruht.
Üblicherweise wird nur das Natamycin, das sich in Lösung befindet, verfügbar sein, um eine antifungale Wirksamkeit auszuüben. Bei einem Fungizid mit niedriger Löslichkeit ist einer der Faktoren, der die Fungizidwirkung beeinflußt, das Auflösen des Fungizids. Weitere wichtige Faktoren sind die Diffusion des gelösten Fungizids zur Kontamination hin sowie die Elimination des gelösten Fungizids. Natamycin kann zum Beispiel durch Abbau aufgrund der Einwirkung von Licht oder durch Hydrolyse inaktiviert werden (Daamen, C.B.G. und Berg, G. van den; "Prevention of mould growth an cheese by means of natamycin [Verhinderung des Schimmelpilzwachstums auf Käse mittels Natamycin]", Voedingsmiddelentechnologie, 18 (2), 26-29, (1985)).
Natamycin weist eine für die meisten Pilze, die auf Lebensmitteln wachsen, minimale Hemmkonzentration (MHK) von weniger als 10 ppm auf. Wie oben erwähnt beträgt die Löslichkeit von Natamycin in Wasser 30 bis 50 ppm, was in den meisten Fällen ausreicht, um kurzfristig Pilzwachstum zu verhindern. Im allgemeinen wird in solchen Fällen für die Elimination von gelöstem Natamycin ausreichend dadurch kompensiert, daß ungelöstes Natamycin in Lösung geht und daß gelöstes Natamycin an die Infektionsstelle diffundiert.
In der vorliegenden Erfindung wird ein Komplex von Natamycin, das an eine geeignete Verbindung angelagert ist, beschrieben. Außerdem werden Verfahren zur Herstellung dieses Komplexes beschrieben.
Ein Verfahren zur Herstellung des Komplexes von an eine geeignete Verbindung angelagertem Natamycin besteht dadurch, den pH-Wert nach fachbekannten Verfahren zu erhöhen oder zu erniedrigen. Vorzugsweise liegt der pH-Wert oberhalb 10 oder unterhalb 4. Beispiele für geeignete wäßrige Säuren sind wäßrige Lösungen von HCl, H₂SO₄, Zitronensäure und Milchsäure. Beispiele für geeignete basische Lösungen sind Lösungen von Hydroxiden wie NaOH, KOH und NH₄OH.
Das gelöste Natamycin wird mit der geeigneten Verbindung, vorzugsweise einem Protein oder einer Aminosäure, vermischt. Vorzugsweise wird ein Protein in Lebensmittelqualität verwendet. Beispiele für geeignete Proteine sind Milchproteine, z.B. Molkeproteine, Kaseine und Kaseinate, und andere Verbindungen wie L-Glutamin. Ebenfalls verwendet werden können Mischungen von unterschiedlichen Proteinen und Mischungen von Proteinen mit anderen Verbindungen wie Fetten, z.B. pflanzlichen und tierischen Fetten, oder Ölen wie Milchfett, Butterfett, Sojaöl und Sonnenblumenöl. Es können auch Zusammensetzungen oder Produkte, die (Mischungen von) diese(n) Verbindungen enthalten, verwendet werden. Beispiele für solche Mischungen sind Kuhmilch oder Sojamilch.
Nach dem Vermischen des gelösten Natamycins mit der geeigneten Verbindung wird der pH-Wert auf zwischen 5 und 9 eingestellt, vorzugsweise auf zwischen 6 und 8. War die geeignete Verbindung nicht vorhanden, so wird das Natamycin auskristallisieren. Überraschenderweise wurde gefunden, daß das Vorhandensein der geeigneten Verbindung die Bildung von sichtbaren Kristallen bei Verwendung eines Mikroskops mit einer Vergrößerung von 400x verhindert. Es wird angenommen, daß das Natamycin und die Verbindung (z.B. Milch, Proteine) einen Komplex bilden, der unter dem Mikroskop bei dieser Vergrößerung nicht sichtbar ist. Möglicherweise wird dieser Komplex an der Oberfläche des Proteins gebildet. Es wurde festgestellt, daß ein Teil des Natamycins bei hohem Natamycin/Protein-Verhältnissen nicht immer den Komplex bildete, sondern statt dessen Kristalle bilden konnte.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung eines Komplexes aus Natamycin und der geeigneten Verbindung besteht darin, daß man das Natamycin in einem geeigneten Lösungsmittelsystem auflöst.
Geeignete Lösungsmittelsysteme sind niedere Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol, Ethylenglykol, Propylenglykol und Glyzerin sowie deren Mischungen. Weiterhin kann eine oder mehrere Hydroxygruppen in einem geeigneten alkoholischen Lösungsmittel mittels Esterbindung an eine Fettsäure oder mittels Etherbindung an eine andere Alkoholgruppe gebunden werden. Beispiele für solche Lösungsmittel sind Methoxyethanol und Ethoxyethanol.
Weiterhin kann das Lösungsmittel noch mit Lösungsvermittlern wie Tensiden versetzt werden. Beispiele für geeignete Lösungsvermittler sind Natriumlaurylsulfat, Dioctylsulfosuccinat, Calciumchlorid oder Tenside des nichtionischen Typs, zum Beispiel diejenigen, die unter den Handelsbezeichnungen Tween, Span, Brij und Myrj vertrieben werden.
Die Anlagerung oder Komplexbildung zwischen dem Natamycin und dem geeigneten Protein kann durch Versetzen der Lösung mit dem Protein oder umgekehrt erfolgen. Das Protein kann bereits in einem wäßrigen Milieu wie Wasser oder Milch vorhanden sein.
Der Komplex aus Natamycin und dem einen Protein bzw. den mehreren Proteinen kann direkt für den gewünschten Verwendungszweck eingesetzt werden oder weiter aufgearbeitet werden. So kann der Komplex zum Beispiel nach gutbekannten Verfahren isoliert und/oder aufgereinigt werden. Beispiele für Trocknungsmethoden zur Abtrennung des Komplexes von einer Flüssigkeit sind Filtration, Zentrifugation, Abdampfen der Flüssigkeit, Sprühtrocknen, Gefriertrocknen und Wirbelbettrocknen.
Der Komplex kann auch unter wäßrigen Bedingungen, z.B. in einem Käsebeschichtungsmaterial, über einen längeren Zeitraum, z.B. über mindestens ein halbes Jahr, aufbewahrt werden, ohne wesentlich an Aktivität zu verlieren.
Der aufgereinigte Komplex aus Natamycin und einem oder mehreren Proteinen wird für die Behandlung von Naturprodukten wie Nahrungsmitteln oder landwirtschaftlichen Produkten eingesetzt.
Außerdem wird der nichtaufgereinigte Komplex aus Natamycin und einem oder mehreren Proteinen in dem wäßrigen System oder in dem Lösungsmittelsystem für die Behandlung dieser Naturprodukte eingesetzt.
Zusammensetzungen, die einen erfindungsgemäßen Komplex enthalten, können für die Behandlung von Nahrungsmitteln und landwirtschaftlichen Produkten mit Behandlungsverfahren, die als solche bekannt sind, z.B. Eintauchen oder Besprühen, behandelt werden.
Die erfindungsgemäße antifungale Zusammensetzung kann für die Behandlung von Nahrungsmitteln oder landwirtschaftlichen Produkten eingesetzt werden. Besonders bevorzugt für den Einsatz in Behandlungen sind Emulsionen, die aus Beschichtungsemulsionen, die üblicherweise in der Nahrungsmittelindustrie verwendet werden, hergestellt werden. So kann zum Beispiel für die Behandlung von verschiedenen Arten von Käse eine wäßrige Polymeremulsion des Polyvinylacetattyps eingesetzt werden, die durch Bestreichen oder mit einem Sprühgerät eingesetzt werden kann. Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auch in Form einer Emulsion (z.B. zum Beschichten) des Öl-in-Wasser-Typs oder des Wasser-in-Öl-Typs vorliegen. Beispiele für geeignete Präparate für die Behandlung von landwirtschaftlichen Produkten wie Früchten sind Filme aus polymeren Substanzen, wie zum Beispiel Polyolefinen, z.B. Polyethylen und Polypropylen.
Die Natamycinmenge in einer flüssigen Zusammensetzung für die Tauch- oder Sprühbehandlung kann im Bereich von 0,01% bis 2% (w/v) liegen. Vorzugsweise liegt die Menge im Bereich von 0,01% bis 1% (w/v). Im Prinzip kann die Tauchflüssigkeit beliebige Formen annehmen. Wird ein wäßriges System verwendet, so kann der Zusatz eines Tensids vorteilhaft sein, insbesondere für die Behandlung von Objekten mit hydrophober Oberfläche. Geeignete Tenside sind zum Beispiel anionische Tenside wie Natriumlaurylsulfat oder Polyethylenalkylether wie Cetomacrogol^® 1000 oder Polyoxyethylenether, z.B. Tween^® 60, 61 und 65.
In einer erfindungsgemäßen Beschichtungsemulsion kann die Natamycinmenge im Bereich von 0,005% bis 2% (w/v), vorzugsweise im Bereich von 0,01% bis 1% (w/v), stärker bevorzugt im Bereich von 0,01% bis 0,5% (w/v) liegen.
Legende zu den Abbildungen
1 zeigt den Hemmhof (in mm) von Penicillium discolour in Abhängigkeit von der Zeit (Tage).
2 zeigt die durchschnittliche Kolonienzahl/Würfel in Abhängigkeit von der Zeit.
Die Erfindung soll nun beispielhaft anhand der beiliegenden Beispiele beschrieben werden.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel beschreibt ein mikrobiologisches Verfahren für die Bestimmung der Verfügbarkeit einer antifungalen Komponente aus einer antifungalen Zusammensetzung.
Papierfilterscheibchen (S&S Antibiotics Test Discs Nr. 321 260) mit einem Durchmesser von 0,6 cm wurden mit dem Testpräparat versehen. Jedes Scheibchen wurde mit 250 μg Natamycin beladen, das heißt, es wurden 50 μl einer Probe, die 5000 ppm Natamycin enthielt, auf ein Scheibchen aufgetragen. Anschließend wurden die Scheibchen auf Agar gelegt, der mit Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 inokuliert war und 24 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Als Bezugsproben wurden Scheibchen frisch mit verschiedenen bekannten Natamycinmengen, die in wäßrigem Methanol gelöst waren, versehen.
Am nächsten Tag wurden die Probenscheibchen auf frische Petrischalen, die mit Saccharomyces cerevisiae inokulierten Agar enthielten, umgesetzt. Als Bezugsproben wurden frische Scheibchen hergestellt, die frisch mit verschiedenen Mengen an gelöstem Natamycin versehen waren. Die frischen Schalen mit den Probenscheibchen und den frischen Bezugsproben wurden 24 Stunden lang bei 30°C inkubiert.
Die Größe des Hemmhofs ist ein Maß für das aus dem Probescheibchen freigesetzte Natamycin. Die freigesetzte Natamycinmenge kann anschließend nach bekannten Verfahren berechnet werden.
Durch Wiederholen des Vorgangs kann das freigesetzte Natamycin täglich bestimmt werden.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung des Natamycinkomplexes.

1. 0,5 Gramm Natamycin wurden in 80 ml Wasser gelöst und zwar dadurch, daß man den pH-Wert mit NaOH (4 N) auf 11,5 anhob.
2. Geeignete Verbindungen für die Komplexierung mit Natamycin waren: – Natriumkaseinat (MIPRODAN^® 30, MD food) in entmineralisiertem Wasser zu 3,3% (w/w) gelöst (A) – Molkeprotein (ESPIRION 580, DMV, Veghel) in entmineralisiertem Wasser zu 6,6% (w/w) gelöst (B) – Butterfett (Corman) – Sojaöl (Cargill) – Sonnenblumenöl (Cargill) – Sojagetränk (Provamel) (C) – sterilisierte Milch (Campina) (D) Außerdem wurden Emulsionen (500 ml) dadurch hergestellt, daß man die folgenden (komplexbildenden) Verbindungen mischte und 5 Minuten lang in einem Ultraturax-T50-Gerät (Janke & Kunkel) bei 8000-9500 Umdrehungen pro Minute inkubierte: – entmineralisiertes Wasser 96,0%, Butterfett (Corman) 4% (E) – entmineralisiertes Wasser 92,7% (w/w), 3,3% Natriumkaseinat (w/w), Butterfett 4,0% (w/w). (F) – entmineralisiertes Wasser 92,7%, Natriumkaseinat 3,3%, Sojaöl 4% (G) – entmineralisiertes Wasser 89,4%, Molkeprotein 6,6%, Butterfett 4,0% (H) – entmineralisiertes Wasser 89,4%, Molkeprotein 6,6%, Sonnenblumenöl 4,0% (I)
3. 80-ml-Portionen des gelösten Natamycins wurden mit jeweils 5,0 ml des gelösten Natriumkaseinats, des gelösten Molkeproteins, des Sojagetränks, der sterilisierten Milch oder der hergestellten Emulsionen (A-I) versetzt. Als Kontrolle wurde eine Probe mit nur Natamycin hergestellt. (J)
4. Der pH-Wert jeder Probe wurde durch Versetzen mit HCl (4 N) auf 5,8 gesenkt. Jede Probe wurde mit entmineralisiertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml versetzt.

BEISPIEL 3
Dieses Beispiel beschreibt die tägliche Freisetzung der unterschiedlichen Natamycinformulierungen.
50 μl jeder gemäß Beispiel 2 hergestellten Probe (die Proben A bis J) wurden wie in Beispiel 1 beschrieben auf ein Scheibchen aufgetragen.
Die Freisetzung von Natamycin aus dem Scheibchen wurde 3 Tage lang nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Tägliche Freisetzung von Natamycin (μg/Scheibchen)

Geeignete Verbindungen	Tag
Geeignete Verbindungen	1	2	3
J (Kontrolle)	2,5	1,8	1,7
A	8,4	7,6	6,7
B	7,8	5,4	5,3
C	4,2	2,3	2,2
D	6,0	7,4	6,0
E	2,7	2,0	2,1
F	11,3	11,6	5,5
G	9,3	7,7	5,8
H	7,5	6,0	4,0
I	7,8	6,0	4,1

Die Freisetzungsrate der meisten Natamycinkomplexe war beträchtlich höher als die Freisetzungsrate der Kontrolle. Dies bedeutet, daß vermutlich mehr Natamycin verfügbar war, um Schimmelpilze zu hemmen. Wie oben beschrieben weist nur das gelöste Natamycin eine antifungale Wirksamkeit auf. Nur bei der Formulierung E (Butterfett) ist die Freisetzungsrate des Natamycins nicht verbessert. Bei der Formulierung C (Sojagetränk) wurde nur am ersten Tag eine höhere Freisetzungsrate beobachtet.
BEISPIEL 4
Dieses Beispiel beschreibt die Wirksamkeit der Natamycinkomplexe gegen Penicillium discolour, einen stärker toleranten Schimmelpilz, der manchmal zu Verderbproblemen in der Käsereiwirtschaft führt.
Es wurde eine Sporensuspension hergestellt, und zwar dadurch, daß man die Sporen von einer sporulierten Kultur von P. discolour abschabte und die Sporen in sterilem Wasser mit 0,05% Tween suspendierte.
Die frisch hergestellte Sporensuspension wurde mit Schimmelpilzagar auf eine Endkonzentration von 10² Sporen/ml Agar vermischt und es wurden Agarplatten hergestellt. Mittig in die Platten wurde eine Ausnehmung mit einem Durchmesser von 5 mm gemacht.
In jede Ausnehmung wurden 25 μl der Formulierung in A, B, C, D, F, I und J (aus Beispiel 2) injiziert.
Die Platten wurden 6 Tage lang bei 24°C inkubiert. Nach 2, 3 und 6 Tagen wurden die Hemmhöhen gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
Aus 1 geht deutlich hervor, daß P. discolour stärker durch die neuen Formulierungen als durch Natamycin allein gehemmt wurde.
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel zeigt die Wirkung der Natamycinkomplexe auf Penicillium discolour an Käse.
Die Zusammensetzungen A, B, D, F und J wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt.
5 ml jeder Zusammensetzung wurden mit 45 ml Plasticoat^® (einer wäßrigen Polyvinylacetatemulsion von National Starch and Chemicals B.V.) so vermischt, daß Beschichtungsemulsionen, die 500 ppm Natamycin enthielten, erhalten wurden.
Außerdem wurde eine Beschichtungsemulsion ohne Natamycin als Kontrolle (K) hergestellt.
Die Beschichtungszusammensetzungen wurden auf die Oberfläche von Goudakäse aufgetragen, und zwar nach der folgenden Vorschrift:
ein frisch aus der Salzlake genommener Laib Goudakäse wurde erst waagerecht in zwei Teile geschnitten. Anschließend wurde jeder Teil in Stücke mit einer Größe von 5 mal 5 mal 5 cm geschnitten. Nur Stücke mit einer flachen Rindenoberfläche wurden bei dem Versuch eingesetzt. Die Stücke wurden in ein Bad aus geschmolzenem Paraffin mit einer Temperatur von 80°C so eingetaucht, daß die Rindenoberfläche paraffinfrei blieb, während die restlichen fünf Flächen mit einer dünnen Paraffinschicht bedeckt wurden. Anschließend wurde die Rindenoberfläche mit ungefähr 1,9 × 10³ KBE/cm² einer Sporenmischung der drei Stämme von Penicillium discolour (CBS-Nummern: 611,92, 612,92 und 613,92) inokuliert. Es wurde dadurch inokuliert, daß man 0,15 ml einer Sporensuspension, die ungefähr 2 × 10⁵ KBE/ml enthielt, auf die Oberfläche des Käsestücks auftrug. Das Inokulum wurde mit einem sterilen Wattetupfer, der mit der Sporensuspension gesättigt war, gleichmäßig über die Oberfläche verteilt.
Nachdem die Käsestücke über Nacht in verschlossenen Plastikdosen bei ungefähr 6°C stehengelassen wurden, wurden sie mit den verschiedenen Zusammensetzungen behandelt. Für jede Behandlung wurden vier Stück Käse genommen. Auf jedes Stück wurden 0,8 ml der Zusammensetzung A, B, D, F, J bzw. K aufgetragen und gleichmäßig mit einem sterilen rechteckigen Plastikstück mit einer Größe von ungefähr 2 mal 5 cm über die Oberfläche verteilt. Nachdem die Käsestücke 2 Stunden lang unter Umweltbedingungen stehengelassen wurden, wurden sie bei 15°C und einer relativen Feuchtigkeit von 95% inkubiert.
Jeden Tag wurden die Anzahl der sichtbaren Kolonien, die sich auf jedem Käsestück gebildet hatten, bestimmt, und die durchschnittliche Anzahl pro Stück wurde für jede Behandlung berechnet. Sobald die Anzahl der Kolonien auf einem Käsestück den Wert 50 überschritt, galt das Käsestück als völlig verschimmelt.
Die Ergebnisse sind in 2 zusammengefaßt.
Die Ergebnisse zeigen deutlich die Überlegenheit der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen im Vergleich zu Natamycin allein. Die 2 zeigt, daß die neuen Zusammensetzungen die Kolonienzahl auf den Käsestücken beträchtlich erniedrigen. Auch noch nach 3 Wochen wurde kaum Schimmelpilzwachstum beobachtet, während die mit Natamycin (J) behandelten Kontrollstücke Schimmelpilzwachstum nur 15 Tage lang verhinderten.
BEISPIEL 6
Dieses Beispiel zeigt die Wirkung der Natriumkaseinatkonzentration auf die Natamycinfreisetzung.
Eine 15%ige Natriumkaseinatlösung wurde dadurch hergestellt, daß man 15 Gramm Natriumkaseinat in 100 ml Wasser löste.
Bei den hergestellten Natamycinkomplexen handelte es sich um die folgenden:

1. 0,5 Gramm Natamycin wurden in 75 ml Wasser durch Anheben des pH-Werts auf 11,5 mit NaOH (4 N) gelöst.
2. Das Wasser wurde mit 25 (L), 20 (M), 15 (N), 10 (O), 5 (P), 1 (Q), 0,5 (R) oder 0,1 (S) ml des gelösten Natriumkaseinats (15%ig) versetzt.
3. Der pH-Wert jeder Probe wurde durch Versetzen mit HCl (4 N) auf 5,8 gesenkt. Jede Probe wurde mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml versetzt. Als Kontrolle wurde eine Probe mit nur Natamycin hergestellt (J).

50 μl jeder Probe (Formulierungen J und L bis S) wurden wie in Beispiel 1 beschrieben auf jedes Scheibchen aufgetragen.
Die Natamycinfreisetzung aus den Scheibchen wurde 3 Tage lang nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt.
Es wurde gefunden, daß die freigesetzte Natamycinmenge der Kontrollprobe (J) 2 μg pro Tag betrug.
Es wurde gefunden, daß die freigesetzte Natamycinmenge der Zusammensetzungen L, M, N, O, P und Q am 1. Tag 3,5 mal (Q) bis 8 mal (L) höher war.
Am 2. und 3. Tag war die Freisetzung bei diesen Zusammensetzungen 2 bis 4 mal höher als bei der Kontrolle (J).
Die Freisetzung bei den Zusammensetzungen R und S war am 1. Tag höher (5 μg Natamycin). Am 2. und 3. Tag war die Natamycinfreisetzung mit der Kontrolle (J) vergleichbar.
BEISPIEL 7
Dieses Beispiel beschreibt die Freisetzung von Natamycin aus dem Natriumkaseinatkomplex "N" (siehe Beispiel 6) in Polyvinylacetat (PVA), und zwar mit dem Auflösungstest.
Die Zusammensetzung in "N" wurde wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt.
Diese Zusammensetzung wurde folgendermaßen mit Plasticoat^®, einer wäßrigen PVA-Emulsion von National Starch & Chemical B.V., vermischt:

– 5 ml Zusammensetzung "N" wurden mit 45 Gramm PVA vermischt (Zusammensetzung "N-PVA")
– jedes Scheibchen (siehe Beispiel 1) wurde mit 50 μl Zusammensetzung "N-PVA" (die 25 μg Natamycin enthielt) versehen
– Die Scheibchen wurden durch 24-ständiges Inkubieren bei Raumtemperatur getrocknet
– Die Scheibchen wurden auf Agarplatten gelegt (siehe Beispiel 1) und 24 Stunden lang bei 6°C inkubiert
– Die Scheibchen wurden von Agarplatten entfernt und auf eine frische Agarplatte gelegt, wonach die vorinkubierten Platten 24 Stunden lang bei 30°C inkubiert wurden
– Die freigesetzte Natamycinmenge wurde wie in Beispiel 1 beschrieben berechnet.

Als Kontrolle wurde eine Probe mit nur Natamycin in PVA hergestellt ("PVA-J").
Die Freisetzung von Natamycin aus den Scheibchen wurde 3 Tage lang bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: tägliche Freisetzung von Natamycin in PVA (μg/Scheibchen)

Tag

Zusammensetzung 1 2 3

PVA-J 1,5 2,5 2,5

PVA-N 4,0 4,5 3,0
Die Freisetzungsrate der Zusammensetzung PVA-N ist beträchtlich höher als die Freisetzungsrate der Kontrolle. Dies bedeutet, daß wenn PVA-Beschichtung mit der Zusammensetzung N versetzt wird, auch mehr Natamycin verfügbar ist, um Schimmelpilze zu hemmen.
BEISPIEL 8
Dieses Beispiel beschreibt die Isolation und Stabilität der neuen Natamycinzusammensetzungen.
Die Zusammensetzung N wurde wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt. Ein Pulver wurde folgendermaßen hergestellt:

– 2,1 Liter Zusammensetzung N wurden hergestellt
– die Probe wurde mit einem Sprühtrockner (Büchi) nach gutbekannten Verfahren getrocknet, was 71 Gramm Pulver (POW-N) ergab
– die Pulverzusammensetzung wurde bei 6°C in verschlossenen Eimern aufbewahrt.

Die Natamycinmenge nach dem Sprühtrocknen (14,5%) (w/w) war beinahe gleich groß wie die maximale Natamycinmenge, die aufgrund der vor dem Sprühtrocknen zugefügten Natamycinmenge erwartet werden kann (15,3%) (w/w).
Die neue Zusammensetzung wird durch das Sprühtrocknungsverfahren nicht inaktiviert.
Die Stabilität der Pulverzusammensetzung wurde dadurch bestimmt, daß man den Natamycingehalt des Pulvers mittels HPLC (gemäß IDF-Standard 140, International Dairy Federation, 1987) unmittelbar nach der Herstellung sowie nach 28-tägiger Aufbewahrung im Dunkeln bei 20°C bestimmte.
Nach 28-tägiger Lagerung war die Natamycinkonzentration nicht wesentlich verändert. Die Natamycinkonzentration unmittelbar nach der Herstellung und nach 28-tägiger Lagerung betrug 14,5% (w/w).
Die Pulverzusammensetzung "POW-N" wurde in Wasser gelöst und zu PVA auf eine Endkonzentration von 250 ppm zugegeben. Die Stabilität des Natamycins in dieser neuen Formulierung (POW-PVA-N) wurde dadurch bestimmt, daß man den Natamycingehalt unmittelbar nach der Herstellung und nach 28-tägiger Lagerung bei 15°C im Dunkeln bestimmte. In beiden Fällen betrug die Natamycinkonzentration 250 ppm.
Die Natamycinfreisetzung aus der Formulierung "POW-N" unmittelbar nach der Herstellung und nach 4-wöchiger Lagerung bei 6°C wurde folgendermaßen bestimmt:

– "POW-N" wurde in Wasser auf eine Endkonzentration von 5000 ppm gelöst
– jedes Scheibchen (siehe Beispiel 1) wurde mit 50 μl der gelösten Formulierung (die 250 μg Natamycin enthielt) versehen
– Die Scheibchen wurden auf Agarplatten gelegt (siehe Beispiel 1) und 24 Stunden lang bei 6°C inkubiert
– Die Scheibchen wurden von Agarplatten entfernt und auf eine frische Agarplatte gelegt, wonach die vorinkubierten Platten 24 Stunden lang bei 30°C inkubiert wurden
– Die freigesetzte Natamycinmenge wurde wie in Beispiel 1 beschrieben berechnet.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Die Natamycinfreisetzung aus der Formulierung "POW-PVA-N" unmittelbar nach der Herstellung und nach 4-wöchiger Lagerung bei 15°C wurde folgendermaßen bestimmt:

– die Pulverzusamensetzung "POW-N" wurde in Wasser gelöst und zu PVA auf eine Endkonzentration von 500 ppm zugegeben (POW-PVA-N)
– jedes Scheibchen (siehe Beispiel 1) wurde mit 50 μl der Zusammensetzung "POW-PVA-N" (die 25 μg Natamycin enthielt) versehen
– Die Scheibchen wurden durch 24-ständiges Inkubieren bei Raumtemperatur getrocknet
– Die Scheibchen wurden auf Agarplatten gelegt (siehe Beispiel 1) und 24 Stunden lang bei 6°C inkubiert
– Die Scheibchen wurden von Agarplatten entfernt und auf eine frische Agarplatte gelegt, wonach die vorinkubierten Agarplatten 24 Stunden lang bei 30°C inkubiert wurden
– Die freigesetzte Natamycinmenge wurde wie in Beispiel 1 beschrieben berechnet.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3: Freisetzung von Natamycin (μg/Scheibchen) unmittelbar nach der Herstellung und nach 4-wöchiger Lagerung

(Zusammensetzung Frisch 28 Tage

POW-N 43,0 43,0

PVA-POW-N 3,5 3,5
Anmerkung: die Freisetzung aus einer PVA-Formulierung ist aufgrund der verzögernden Eigenschaften der PVA-Matrix immer niedriger.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß die neuen Formulierungen bei Herstellung als Pulver oder bei Formulierung in PVA stabil sind und ihre verbesserte Wirksamkeit beibehalten.
BEISPIEL 9
Dieses Beispiel zeigt die Wirkung der neuen Natamycinzusammensetzungen gegen Schimmelpilze auf Edamer Käse. Der Versuch wurde in einer Käsefabrik durchgeführt, in der Edamer Käse hergestellt wurde. Zur Zeit des Feldversuchs traten dort durch Penicillium discolor Schimmelpilzprobleme auf. Diese Käsefabrik wurde ausgewählt, um die verbesserte Wirksamkeit gegen weniger empfindliche Schimmelpilzarten in der Praxis nachzuweisen.
Es wurden Beschichtungszusammensetzungen hergestellt, und zwar folgendermaßen:

1 die Beschichtung A wurde als "POW-PVA-N" (siehe Beispiel 8) hergestellt, nur daß als einziger Unterschied "POW-PVA-N" die Beschichtung A 500 ppm Natamycin enthält.
2 bei der Beschichtung B handelte es sich um standardmäßiges Plasticoat^®, das 500 ppm standardmäßiges Natamycin enthielt.

96 Edamer Käse zu je 2,5 kg wurden nach gutbekannten Verfahren hergesellt. 48 Käse wurden mit Beschichtung A behandelt, 48 Käse wurden mit Beschichtung B behandelt, und zwar nach gutbekannten Verfahren. Die Käse wurden zweimal beschichtet (ungefähr 7 Gramm Beschichtung pro Käse und Behandlung). Nach Behandeln der Käse mit Salzlake wurden diese 3 Tage lang aufbewahrt, wonach die getrockneten Käse zum ersten Mal mit der Beschichtung behandelt wurden. Nach 5 Tagen wurden die Käse umgedreht. Die zweite Behandlung erfolgte nach 8 Tagen. Nach 11 Tagen wurden die Käse umgedreht. Die Käse wurden zur Reifung unter Standardbedingungen aufbewahrt (relative Luftfeuchtigkeit 87%, Temperatur 11°C).
21 Tage nach der Herstellung wurden die Käse mit dem bloßen Auge auf Schimmelpilzwachstum an der Oberfläche untersucht. Auf 22 Käsen, die mit der standardmäßigen Beschichtung (Beschichtung B) behandelt waren, wurden Schimmelpilzkolonien beobachtet. Auf den Käsen, die mit der neuen Formulierung (Beschichtung A) behandelt worden waren, wurden nur 3 Käse mit Schimmelpilzkolonien beobachtet.
Die Ergebnisse zeigen, daß die neue Zusammensetzung auch bei der Bekämpfung von Schimmelpilzen auf Edamer Käse, der in einer Käsefabrik hergestellt und aufbewahrt wurde, wirksamer ist.

Claims

Komplex, der mit einem oder mehreren Proteinen oder Aminosäuren komplexiertes Natamycin enthält, und der, wenn er in Wasser vorliegt, keine bei Verwendung eines Mikroskops mit einer Vergrößerung von 400x sichtbaren Kristalle bildet.
Komplex nach Anspruch 1, der, wenn er in Wasser vorliegt, innerhalb von 60 Tagen nicht wesentlich an Aktivität verliert.
Komplex nach Anspruch 1, bei dem das Verhältnis zwischen Natamycin und der gesamten Protein- oder Aminosäuremenge 10.000:1 bis 1:10 beträgt.
Komplex nach Anspruch 3, bei dem das Verhältnis zwischen Natamycin und der gesamten Protein- oder Aminosäuremenge 100:1 bis 1:1 beträgt.
Komplex nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem mindestens eines der Proteine ein Milchprotein ist.
Komplex nach Anspruch 5, wobei das Milchprotein ein Molkeprotein, Kasein oder Kaseinat umfaßt.
Zusammensetzung, die einen Komplex nach einem der vorhergehenden Ansprüche sowie ein Fett oder Öl enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, bei der sowohl mindestens eines der in dem Komplex vorliegenden Proteine als auch das Fett oder Öl aus Milch stammen.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei es sich bei der Milch um Kuhmilch oder Sojamilch handelt.
Verfahren zur Herstellung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das die folgenden Schritte umfaßt: Lösen von Natamycin in einem Lösungsmittel; Vermischen des gelösten Natamycins mit einem oder mehreren Proteinen; und gegebenenfalls Isolieren des gebildeten Komplexes.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem Lösungsmittel um eine wäßrige Flüssigkeit handelt und das Lösen des Natamycins durch Erniedrigen oder Erhöhen des pH-Werts erzielt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Komplex dadurch gebildet wird, daß man den pH-Wert der Mischung von gelöstem Natamycin und Protein auf zwischen 5 und 9 einstellt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem Lösungsmittel um ein organisches Lösungsmittel handelt und der Komplex in diesem Lösungsmittel oder einer Flüssigkeit, die dieses Lösungsmittel enthält, gebildet wird.
Verwendung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 9 als vorbeugende antimykotische Behandlung für Naturprodukte wie ein Nahrungsmittel oder ein landwirtschaftliches Produkt.
Naturprodukt, wie ein Nahrungsmittel oder ein landwirtschaffliches Produkt, das mit einem Komplex nach den Ansprüchen 1 bis 6 oder einer Zusammensetzung nach den Ansprüchen 7 bis 9 behandelt worden ist.