DE3850480T2

DE3850480T2 - Grundbestandteile mit fungizider Wirkung, fungizide Zusammensetzungen, Verfahren zur Pilzbekämpfung, Verfahren zur Herstellung von Grundbestandteilen mit fungizider Wirkung, ein Pilz und fungizide Zusatzmittel.

Info

Publication number: DE3850480T2
Application number: DE3850480T
Authority: DE
Inventors: Ruby Ione Nielsen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1987-11-17
Filing date: 1988-11-16
Publication date: 1994-12-15
Anticipated expiration: 2008-11-17
Also published as: PT89010A; IL88395A; HU204673B; JPH01287007A; KR970007932B1; DD283553A5; PT89010B; EP0320130B1; HUT51461A; IL88395A0; DK604687D0; ATE107836T1; ZA888551B; AU622423B2; EP0320130A2; DE3850480D1; EP0320130A3; JP2801223B2; KR890007642A; NZ226994A

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein biochemisches aktives Prinzip, das durch Kultivierung von Pilzen der Gattung Phaeoramularia erhältlich ist, fungizide Zusammensetzungen, die eine fungizid wirksame Menge des Prinzips, agronomisch oder physiologisch verträgliche Verdünnungsmittel und/oder Träger und wahlweise weitere aktive Materialien enthalten; und die Verwendung des Prinzips und der fungiziden Zusammensetzungen für die Bekämpfung von Pilzen in Pflanzen oder Tieren unter Einschluß von Säugern und als Konservierungsmittel für Nahrungsmittel, Farben und Holz.

Stand der Technik

Pilze werden gegenwärtig in Pflanzen durch Auftragung synthetischer anorganischer oder organischer Fungizide auf das zu behandelnde Gebiet bekämpft.
Derartige Fungizide sind teuer und verbrauchen Energie zu ihrer Herstellung, und oftmals sind sie nicht besonders wirksam bei der Bekämpfung der Pilze. Dies kann seine Ursache oftmals in klimatischen Bedingungen oder Umweltbedingungen haben, die in dem Gebiet oder zur Zeit der Anwendung vorherrschen. Darüber hinaus besteht bei Anwendung eines Fungizids über eine lange Zeitspanne die Gefahr einer Selektion von Pilzen, die gegenüber dem Fungizid tolerant sind.
Die meisten bekannten Fungizide sind für die Ökosysteme, in denen sie verteilt werden, fremd, und es besteht die Gefahr einer Anreicherung und gegebenenfalls unerwünschter Nebenwirkungen.
Aus diesen und anderen Gründen ist es wünschenswert, biologische Fungizide zu entwickeln, die leicht in der Natur verdaut werden und die keine große Energiemenge, die für die chemische Synthese der meisten bekannten Fungizide erforderlich ist, verbrauchen.
Durch die Arbeiten des Erfinders ist überraschenderweise festgestellt worden, daß Pilze, die zur Gattung Phaeoramularia gehören, in dieser Hinsicht interessante Eigenschaften zeigen.
Die Gattung Cercospora ist weltweit als Ursache für Blattfleckenkrankheiten auf einer großen Anzahl von Wirten verschiedener Gattungen bekannt. Von einigen Spezies von Cercospora ist bekannt, daß sie verschiedene Metaboliten bilden, z. B.:
C. beticola bildet Fulvosäure (T. Sakaki, A. Ichihara, S. Sakamura: Isolation offulvic acid from Cercospora beticola. Agric. Biol. Chem., Bd. 45/5 (1981), S. 1275-1276) und ein gelbes Phytotoxin (S.S. Martin, M.P. Steinkamp: The yellow phytotoxins of Cercospora beticola. Proc. Int. Bot. Congr., Bd. 13 (1981), S. 296).
C. kikuchii bildet Cercosporin (S. Matsueda, K. Takagaki, M. Shimoyama und A. Shiota: Studies on fungal products. V. Antimicrobial aspects of Quinone derivatives. Yakugaku Zasshi, Bd. 100/9 (1980), S. 900-902) und Ergosterol-5,8- peroxid (S. Matsueda, M. Shimoyama, T. Imaizumi, Y. Tsushima: Studies on fungal products 4. Biological effects of ergosterol-5,8-peroxid. Yakugaku Zasshi, Bd. 102/4 (1982), S. 347- 351).
Matsueda et al. haben festgestellt, daß Cercosporin das Wachstum von Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, E. coli und Candida japonica hemmt. Cercosporin ist in Form roter Kristalle isoliert worden (Pfizer Handbook of Microbial Metabolites, McGraw-Hill Book Co., Inc., NY, Toronto, London, von Shimpei Kuyama und Teiichi Tamura. J. Am. Chem. Soc., Bd. 79 (1957), S. 5725-5726).
C. arachidicola bildet einen Anthrachinoid-Metaboliten (A. Stoessl, J.B. Stothers: Minor anthraquinonoid metabolites of Cercospora arachidicola. Can. J. Chem., Bd. 63/6 (1985), S. 1258-1262), und
C. cruenta bildet Metaboliten, die strukturell in Beziehung zu Abscisinsäure stehen (Takayuki Oritani, Kyohei Yamashita: Isolation and structure of 4'-hydroxy-gamma-ionylidene acetic acids from Cercospora cruenta, a fungus producing (+) - Abscisic acid. Agric. Biol. Chem., Bd. 51/1 (1987), S.
275-278), wie Mutastein (Japanisches Patent Nr. 98920, erteilt am 27.10.1986).
C. rosicola bildet Abscisinsäure (Japanische Patentanmeldung Nr. 192674, eingereicht am 02.11.1982).
Phaeoramularia (seinerzeit Cercospora) fusimaculans ist aus einer Reihe von Gräsern isoliert worden (M.B. Ellis, More dematiaceous Hyphomycetes. Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England (1976)), und es ist berichtet worden, daß er eine Blattkrankheit bei Sorghum spp. (G.C. Wall, L.K. Mughogho, R.A. Frederiksen, G.N. Odvody: Foliar disease of sorghum spp. caused by Cercospora fusimaculans. Plant Dis., Bd. 71/8 (1987), S. 759-760) und bei Bajra Pennisetum typhoides (K.S. Patel: A Cercospora fusimaculans leaf spot disease of Bajra Pennisetum typhoides in Gujarat. Curr. Sci. (Bangalore), Bd. 42/1, S. 34 ) hervorruft. Bisher ist nicht berichtet worden, daß P. fusimaculans ein aktives fungizides Prinzip bildet.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Im Hinblick auf die vorstehenden Ausführungen hat der Erfinder der vorliegenden Anmeldung überraschenderweise festgestellt, daß Pilze, die zur Gattung Phaeoramularia gehören, interessante fungizide Eigenschaften aufweisen. Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein biochemisch aktives Prinzip, das durch Kultivieren von Phaeoramularia fusimaculans (Atk), Liu & Guo CBS 616.87 erhältlich ist, wobei festgestellt wurde, daß dieses Prinzip eine einzigartige fungizide Aktivität aufweist.
Dementsprechend bezieht sich die Erfindung gemäß einem zweiten Aspekt auf eine fungizide Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines fungizid aktiven Prinzips, das durch Kultivieren eines Pilzes der Gattung Phaeoramularia fusimaculans (Atk) Liu & Guo CBS 616.87 erhältlich ist, und einen agrochemisch und/oder physiologisch verträglichen Träger oder ein Verdünnungsmittel umfaßt.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine fungizide Zusammensetzung, die eine Suspension einer wirksamen Anzahl von Sporen oder Mycelien eines Pilzes von Phaeoramularia fusimaculans (Atk) Liu & Guo CBS 616.87 in einem passenden Medium umfaßt.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bekämpfung von Pilzen bei Pflanzen, wobei eine wirksame Menge eines fungizid aktiven Prinzips, das durch Kultivieren eines Pilzes der Gattung Phaeoramularia fusimaculans (Atk) Liu & Guo CBS 616.87 erhältlich ist, auf eine zu behandelnde Region aufgebracht wird. Dieser Aspekt umfaßt auch die Bekämpfung oder Kontrolle von Pilzen in Nahrungsmittel, Holz, Farbe und dergl. unter Einschluß von Nährmedien für Mikroorganismen.
Gemäß einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines fungizid aktiven Prinzips, das durch Kultivieren eines Pilzes, der zur Gattung Phaeoramularia fusimaculans (Atk) Liu & Guo CBS 616.87 gehört, erhältlich ist, bei der Bekämpfung von Pilzen bei Pflanzen.
Ein sechster Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines fungizid aktiven Prinzips durch Kultivieren eines Pilzes der Gattung Phaeoramularia fusimaculans (Atk) Liu & Guo CBS 616.87 und Gewinnen des aktiven Prinzips.

Hinterlegung von Mikroorganismen

Ein Stamm der Gattung Phaeoramularia, nämlich Phaeoramularia fusimaculans (Atk) Liu & Guo ist beim Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Postfach 273, NL-3740 AB BAARN, Holland, für die Zwecke des Patentierungsverfahrens am nachstehend angegebenen Datum hinterlegt worden. CBS als internationale Hinterlegungsstelle nach dem Budapester Vertrag bietet eine dauerhafte Hinterlegung gemäß Regel 9 des Vertrags.
Hinterlegungsdatum: 22. Oktober 1987
Zeichen des Hinterlegenden: Cercospora fusimaculans Atk
CBS-Bezeichnung: CBS 616.87

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Wie bereits angegeben, betrifft die Erfindung gemäß ihrem ersten Aspekt ein fungizid aktives Prinzip, das durch Kultivieren von CBS 616.87 erhältlich ist.
Gemäß ihrem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine fungizide Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines fungizid aktiven Prinzips gemäß dem vorstehenden Absatz und einen agrochemisch und/oder physiologisch verträglichen Träger oder ein Verdünnungsmittel enthält.
Abhängig von den Umständen, wie der Feldfrucht, bei der Pilze bekämpft werden sollen, den Umweltbedingungen und anderen Faktoren kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung zusätzlich zu dem fungizid aktiven Prinzip auch weitere aktive Bestandteile, wie andere Biozide, Pestizide, Herbizide, Insektizide, Nematozide, Acarizide oder Pflanzennährstoffe oder Düngemittel enthalten.
Zur Bekämpfung von Pilzen bei Tieren würde die erfindungsgemäße Zusammensetzung üblicherweise nur das aktive Prinzip mit einem physiologisch verträglichen Träger oder ein Verdünnungsmittel umfassen, sie kann jedoch auch mit anderen aktiven Bestandteilen, wie einem Antibiotikum, kombiniert werden.
Gemäß einem speziellen Aspekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die eine Suspension einer wirksamen Anzahl von lebensfähigen Einheiten (Sporen oder Mycelien) von Phaeoramularia fusimaculans (Atk) Liu & Guo oder einer Mutante oder einem genetisch veränderten Transformanten mit der gleichen charakteristischen Fähigkeit, das aktive Prinzip zu bilden, suspendiert in einem passenden Medium umfaßt.
Diese Zusammensetzung wird zweckmäßigerweise unter Verwendung eines flüssigen Nährmediums zur Bildung des Pilzes hergestellt, wobei das Medium anschließend auf eine geeignete Anzahl lebensfähiger Einheiten (Sporen und/oder Mycelien) pro ml verdünnt wird, und zwar typischerweise im Bereich von 10² bis 10¹&sup0; und vorzugsweise von etwa 10&sup4; bis etwa 10&sup6;.
Anschließend wird die Suspension auf den Bereich, der behandelt werden soll, aufgebracht. Die auf den Bereich aufgebrachte Menge kann abhängig von den gleichen Bedingungen, wie sie vorstehend genannt wurden, variieren.
Eine erfindungsgemäße fungizide Zusammensetzung mit dem fungizid aktiven Prinzip als aktivem Bestandteil kann für agronomische Anwendungen und/oder Anwendungen im Gartenbau durch Mischen des aktiven Prinzips mit geeigneten inerten und verträglichen Trägern oder Verdünnungsmitteln formuliert werden, um eine Zusammensetzung der Art zu erhalten, wie sie allgemein bei landwirtschaftlichen Zusammensetzungen verwendet wird, wie ein benetzbares Pulver, ein emulgierbares Konzentrat, eine Körnerformulierung, ein wasserlösliches Pulver, ein Alginat, eine Xanthanlösung und/oder ein Aerosol. Als feste Träger können Bentonit, Kieselgur, Apatit, Gips, Talcum, Pyrophyllit, Vermiculit, gemahlene Muscheln und Ton genannt werden. Ein oberflächenaktives Mittel kann zur Bildung einer homogenen und stabilen Formulierung ebenfalls zugegeben werden.
Bei dem Verdünnungsmittel oder Träger in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kann es sich, wie angegeben, um einen Feststoff oder um eine Flüssigkeit, wahlweise verbunden mit einem oberflächenaktiven Mittel, z. B. einem Dispergiermittel, einem Emulgiermittel oder einem Netzmittel, handeln. Geeignete oberflächenaktive Mittel umfassen anionische Verbindungen, wie ein Carboxylat, z. B. ein Metallcarboxylat einer langkettigen Fettsäure; ein N-Acylsarcosinat; Mono- oder Diester von Phosphorsäure mit Fettalkoholethoxylaten oder Salze derartiger Ester; Fettalkoholsulfate, wie Natriumdodecylsulfat, Natriumoctadecylsulfat oder Natriumcetylsulfat; ethoxylierte Fettalkoholsulfate; ethoxylierte Alkylphenolsulfate; Ligninsulfonate; Petrolsulfonate; Alkylarylsulfonate, wie Alkylbenzolsulfonate oder niedere Alkylnaphthalinsulfonate, z. B. Butylnaphthalinsulfonat; Salze von sulfonierten Naphthalin-Formaldehyd-Kondensaten; Salze von sulfonierten Phenol- Formaldehyd-Kondensaten; oder komplexere Sulfonate, wie Amidsulfonate, z. B. das sulfonierte Kondensationsprodukt von Oleinsäure und N-Methyltaurin, oder Dialkylsulfosuccinate, z. B. das Natriumsulfonat von Dioctylsuccinat. Nicht-ionische Mittel umfassen Kondensationsprodukte von Fettsäureestern, Fettalkoholen, Fettsäureamiden oder Fettalkyl- oder -alkenylsubstituierten Phenolen mit Ethylenoxid, Fettsäureester mehrwertiger Alkoholether, z. B. Sorbitanfettsäureester, Kondensationsprodukte derartiger Ester mit Ethylenoxid, z. B. Polyoxyethylensorbitanfettsäureester, Blockcopolymere von Ethylenoxid und Propylenoxid, acetylenische Glykole, wie 2,4,7,9- Tetraethyl-5-decin-4,7-diol oder ethoxylierte acetylenische Glykole.
Beispiele für kationische oberflächenaktive Mittel umfassen aliphatische Mono-, Di- oder Polyamine als Acetate, Naphthenate oder Oleate; sauerstoffhaltige Amine, wie Aminoxide oder Polyoxyethylenalkylamine; amidähnliche Amine, die durch Kondensation einer Carbonsäure mit einem Di- oder Polyamin hergestellt werden; oder quaternäre Ammoniumsalze.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können beliebige dem Fachmann für die Formulierung von Agrochemikalien bekannte Formen annehmen, z. B. eine Lösung, eine Dispersion, eine wäßrige Emulsion, ein Pudermittel, ein Saatbeizmittel, ein dispergierbares Pulver, ein emulgierbares Konzentrat oder Körner. Darüber hinaus können sie in einer geeigneten Form für die direkte Anwendung oder als ein Konzentrat oder eine primäre Zusammensetzung vorliegen, die eine Verdünnung mit einer geeigneten Menge Wasser oder einem anderen Verdünnungsmittel vor der Anwendung erfordert.
Ein emulgierbares Konzentrat umfaßt einen aktiven Bestandteil gelöst in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, das in Gegenwart eines emulgierenden Mittels mit Wasser eine Emulsion bildet.
Ein Pudermittel umfaßt den wirksamen Bestandteil innig gemischt und gemahlen mit einem festen pulverförmigen Verdünnungsmittel, z. B. Kaolin.
Ein körniger Feststoff umfaßt den aktiven Bestandteil verbunden mit ähnlichen Verdünnungsmittel wie diejenigen, die bei Pudermitteln eingesetzt werden können, das Gemisch wird jedoch nach bekannten Verfahren granuliert. Alternativ dazu umfaßt er den aktiven Bestandteil absorbiert oder adsorbiert auf einem vorgranulierten Verdünnungsmittel, z. B. Walkerde, Attapulgit oder Kalkstein-Grobsand.
Benetzbare Pulver, Granulate oder Körner umfassen üblicherweise den aktiven Bestandteil im Gemisch mit einem geeigneten oberflächenaktiven Stoff und einem inerten pulverförmigen Verdünnungsmittel, wie Porzellanerde.
Ein weiteres geeignetes Konzentrat ist ein fließfähiges Suspensionskonzentrat, das durch Zerkleinern des aktiven Bestandteils mit Wasser oder einer anderen Flüssigkeit, einem Netzmittel und einem Suspendiermittel gebildet wird.
Zur Verwendung bei der Bekämpfung von Pilzen bei Tieren unter Einschluß von Säugern kann das aktive Prinzip durch Mischen des Prinzips mit geeigneten inerten und verträglichen Trägern, die dem Fachmann für die Verwendung bei topischen Formulierungen bekannt sind, formuliert werden.
Die Konzentration des hier beschriebenen aktiven Prinzips in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kann innerhalb eines weiten Bereichs abhängig von der Art der Formulierung und dem Gebiet der Anwendung variieren.
In diesem Zusammenhang wird erwähnt, daß nachstehend genannte Tests gezeigt haben, daß das aktive Prinzip bei der Bekämpfung von Pilzen, die Säuger befallen, in Konzentrationen von 0,5 ug/ml bis 5 ug/ml wirksam ist, und es wird dementsprechend in Betracht gezogen, daß das aktive Prinzip in Konzentrationen im Bereich von etwa 0,01 ug/ml bis 10 ug/ml für die Verwendung bei der Bekämpfung von Pilzen bei Tieren angewandt wird.
Gemäß ihrem dritten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bekämpfung von Pilzen bei Pflanzen, wobei eine wirksame Menge eines fungizid aktiven Prinzips, das durch Kultivierung von CBS 616.87 erhältlich ist, auf den zu behandelnden Bereich aufgebracht wird.
Im Zusammenhang mit diesem Aspekt können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen für agronomische Anwendungen oder Anwendungen im Gartenbau in einem zu behandelnden Bereich entweder direkt auf den Erdboden zur Behandlung vor dem Auslaufen oder auf das Blattwerk oder die Früchte der Pflanzen zur Behandlung nach dem Auslaufen aufgebracht werden. Abhängig von der Feldfrucht und den Umständen kann die Behandlung verschoben werden, bis Samen oder Früchte an den Pflanzen auftreten, bei denen Pilze bekämpft werden sollen.
Die aktive Zubereitung oder die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können direkt auf die Pflanze z. B. durch Besprühen oder Bestäuben zu dem Zeitpunkt, an dem der Pilz auf der Pflanze auftritt, oder vor dem Auftreten des Pilzes als vorbeugende Maßnahme aufgebracht werden. In beiden Fällen besteht die bevorzugte Art der Anwendung im Besprühen der Blätter. Es ist im allgemeinen wichtig, in frühen Stadien des Pflanzenwachstums eine gute Bekämpfung der Pilze zu erzielen, da dies der Zeitpunkt ist, zu dem die Pflanze am schwersten geschädigt wird. Das Sprühmittel oder der Puder können zweckmäßigerweise ein Herbizid zur Verwendung vor oder nach dem Auslaufen enthalten, wenn dies für erforderlich gehalten wird.
Gelegentlich ist es zweckmäßig, die Wurzeln der Pflanzen vor oder während des Anbaus zu behandeln, z. B. durch Eintauchen der Wurzeln in eine geeignete flüssige oder feste Zusammensetzung. Wenn die erfindungsgemäße aktive Zubereitung direkt auf die Pflanze aufgebracht wird, dann beträgt eine geeignete Anwendungsmenge 0,001 bis 100 kg pro Hektar und vorzugsweise 0,05 bis 5 kg pro Hektar.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die erfindungsgemäße aktive Zubereitung allein oder in Kombination mit einem herkömmlichen Biozid auch auf die Samen oder den Standort aufgebracht werden. Die Zubereitung kann also direkt auf den Boden vor, während oder nach dem Aussäen gebracht werden, so daß das Vorhandensein des aktiven Bestandteils im Erdboden das Wachstum von Pilzen bekämpfen kann, die die Samen befallen.
Wenn der Erdboden direkt behandelt wird, dann kann die aktive Zubereitung allein oder im Gemisch mit dem herkömmlichen Biozid auf eine beliebige Weise aufgebracht werden, die es ermöglicht, daß sie innig mit dem Erdboden vermischt wird, wie durch Sprühen, durch breitwürfige Verteilung einer festen Form von Körnern oder durch Aufbringen des Wirkstoffs zum Zeitpunkt des Aussäens durch Einfüllen in die gleiche Sämaschine wie die Samen. Eine geeignete Menge liegt im Bereich von 0,01 bis 20 kg pro Hektar und insbesondere von 0,05 bis 10 kg pro Hektar.
Die vorliegende Erfindung wird zwar ausführlich im Zusammenhang mit der Bekämpfung von Pilzen bei Tieren und Pflanzen beschrieben, es ist jedoch auch vorgesehen, daß das fungizid aktive Prinzip für die Konservierung von Holz durch Zugabe des Prinzips zu Holzkonservierungs- und/oder Imprägnierungszusammensetzungen verwendet werden kann. Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße aktive Prinzip geeignet als Fungizid und Konservierungsmittel in Farben, und zwar sowohl um das Wachstum in der Farbe während der Lagerung als auch das Wachstum auf dem gestrichenen Objekt, wie der verputzten Oberfläche eines Hauses, zu verhindern.
Ferner kann das erfindungsgemäße fungizid aktive Prinzip aufgrund seiner geringen Toxizität für die Konservierung von Nahrungsmitteln, wie Marmelade, Orangenmarmelade und anderen Produkten, verwendet werden, wobei das Prinzip nach einem Kochvorgang zugegeben werden kann.
Das erfindungsgemäße fungizid aktive Prinzip kann auch als fungizides Additiv bei Nährmedien für verschiedene Mikroorganismen, wie E. coli, B. subtilis, Pseudomonas aeruginosa und S. aureus, verwendet werden.

Das fungizid aktive Prinzip

Das erfindungsgemäße fungizid aktive Prinzip kann extrazellulär sowohl mit Oberflächensubstraten als auch mit Submerssubstraten mit einem Gehalt an verschiedenen Kohlenhydraten und Stickstoffquellen hergestellt werden. Wenn es im Rohzustand so, wie es in Schüttelkolben gebildet wird, angewandt wird, dann hat es keinen offensichtlichen Einfluß auf das Wachstum von
E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Torulopsis ernobii, Rhodotorula ruda, Rhodotorula gracilis, Hansenula holstii, Candida albicans, Penicillium funiculosum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus phoenicis, Aspergillus awamori und Staphylococcus aureus.
Es ist festgestellt worden, daß es eine hemmende Wirkung auf das Wachstum von Pilzen der folgenden Gattungen hat:
Botrytis, Rhizomucor, Pyricularia, Fusarium, Penicillium und insbesondere auf Botrytis cinerea, Rhizomucor miehei, Pyricularia oryzae, Penicillium digitatum, Cercospora traversiana, Cercospora sorghii, Cercospora sesami, Cercospora scirpicola, Cercospora kikuchii, Cercospora haji, Cercospora beticola, Sclerotinia fructicola, Aspergillus oryzae, Fusarium culmorum, Fusarium decemcellulase, Fusarium acuminatum, Fusarium moniliforme, Fusarium sporotrichioides, Fusarium poae, Fusarium fugikurai, Fusarium longipes, Rhizopus oligosporus, Trichophyton, Microsporum, Epidermaphyton, Pichia sp., Torulopsis spherica, Rhodotorula aurantiaca, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula minuta, Candida albicans, Trichoderma viride, Drechslera australiensis, Gibberella fugikuri, Phoma herbarum, Pycnoporus sangiuneus, Penicillium notatum, Penicillium oxalicum, Penicillium crustosum, Penicillium implicatum, Penicillium lividum, Penicillium cyclopium, Penicillium digitatum, Penicillium italicum, Aspergillus cervinus, Aspergillus cremens und viele andere.
Vorstehend wurde angegeben, daß Matsueda et al. (1980) festgestellt haben, daß Cercosporin, eine Verbindung, die aus C. kikuchii isoliert wurde, eine hemmende Wirkung auf bestimmte Mikroorganismen hat. Aus dem vorstehenden Abschnitt ist offensichtlich, daß das erfindungsgemäße aktive Prinzip von Cercosporin verschieden ist. Auch konnte das rote Pigment, das von CBS 616.87 gebildet wird und Cercosporin enthalten könnte, leicht vom erfindungsgemäßen aktiven Prinzip abgetrennt werden, ohne die Aktivität des Prinzips zu beeinträchtigen. Das Pigment zeigt keine Hemmung des Wachstums von Botrytis cinerea.
Das Prinzip ist aktiv über einen weiten Bereich von pH- Werten und Temperaturen, es wird jedoch inaktiviert, wenn es für etwa 1 Minute gekocht wird. Es gibt keinen offensichtlichen Verlust an Aktivität, wenn es als Kulturbrühe in einem Kühlschrank für 3 Monate gelagert wird.
Es zeigt keine Anzeichen einer mutagenen Aktivität, wenn es in Gegenwart und Abwesenheit des S-9-metabolischen Aktivierungssystems (Ames-Test) untersucht wird. Kulturbrühe mit einem Gehalt an dem Fungizid und lebensfähigen Sporen zeigte keine Wirkung auf Mäuse bei intraperitonealer Verabreichung mit einer Dosis von 20 mg pro kg Körpergewicht. Diese Dosis enthielt 3 · 10&sup8; lebensfähige Einheiten.

Das Fungizid bildende Stämme

Die Pilze, die das erfindungsgemäße aktive Prinzip bilden, sind als zur Gattung Phaeoramularia gehörend identifiziert worden.
Die Kolonien sind meistens hypophyllös. Conidiophoren büschelförmig, blaßoliv-braun, mit kleinen Schrammen. Conidia oft kettenförmig, durchsichtig, fast immer 3-4-fach durch Scheidewände geteilt, 15-70 · 2-2,5 um.
CBS 616.87 wurde aus Blättern von Panicum maximum, die in St. Andrews, Jamaica, im Dezember 1986 gesammelt wurden, isoliert. Er wurde als Phaeoramularia fusimaculans identifiziert. Zur gleichen Zeit wurden eine Anzahl von Phaeoramularia, die ein fungizid aktives Prinzip bilden, aus Blättern von P. maximum isoliert, und im August 1988 wurden Phaeoramularia, die ebenfalls eine entsprechende Aktivität bildeten, aus Blättern von P. maximum, die in St. Catherine, Jamaica, gesammelt wurden, isoliert. Die Spezies kann aus Blättern von vielen verschiedenen Gräsern isoliert werden (Ellis, a.a.O.).

Kultivierung von Stämmen

Der das Fungizid bildende Stamm kann auf Agarschrägflächen mit einem Gehalt an den folgenden Bestandteilen in g/l kultiviert werden: Hefeextrakt: 4, 0; Kaliumdihydrogenphosphat: 1,0; Magnesiumsulfat-heptahydrat: 0,1; Glucose: 15; und Bacto®-Agar (Difco Laboratories, Detroit, USA): 20. Dieses Substrat wird 20 oder 40 Minuten bei 121ºC autoklaviert und nachstehend als YPG-Agar bezeichnet. Agarschrägflächen enthalten 12 ml YPG-Agar und werden nach Animpfen 7 Tage oder länger bei 20 bis 25ºC inkubiert.

Fungizidbildung

Ein Substrat für Schüttelkolben wurde mit den folgenden Bestandteilen pro Liter hergestellt: 4,0 g Hefeextrakt; 1,0 g Kaliumdihydrogenphosphat; 0,1 g Magnesiumsulfat-heptahydrat; 15 g Glucose; und 0,1 g Pluronic® L61 (BASF, Bundesrepublik Deutschland); und entmineralisiertes Wasser. Die Sterilisierung wurde 20 Minuten bei 121ºC durchgeführt. Ein 500 ml fassender Erlenmeyerkolben mit 100 ml Substrat wurde mit 10&sup6; Sporen aus einer YPG-Agarschrägfläche, die zuvor mit CBS 616.87 angeimpft worden war, angeimpft. Die Kolben wurden 3 bis 7 Tage bei 230 U/min bei 25ºC geschüttelt, wonach die Fermentationsbrühe zentrifugiert wurde. Der Überstand mit einem Gehalt an dem Fungizid wurde dabei von den Mycelien abgetrennt. Die Mycelien wurden verworfen, und der Überstand wurde auf seine fungizide Aktivität untersucht.
Das Fungizid kann auch in Oberflächenkulturen gebildet werden.

Analyse

10&sup6; Sporen von Botrytis cinerea wurden zu 50 ml verdünnter Salzlösung mit:
Ammoniumhydrogenphosphat 66 mg
Kaliumdihydrogenphosphat 68 mg
Dikaliumhydrogenphosphat 87 mg
Calciumchlorid-dihydrat 7,4 mg
Magnesiumchlorid-hexahydrat 10 mg
die auf 1 l mit destilliertem Wasser aufgefüllt und 20 Minuten bei 121ºC sterilisiert wurde, gegeben.
Dies wurde mit 50 ml YPG-Agar bei einer Temperatur, die die Lebensfähigkeit der Botrytis-Sporen begünstigt, im Bereich von etwa 30ºC bis etwa 45ºC gemischt, wobei der Agar ohne Schaden für die Sporen flüssig gehalten wird. 12 ml dieses Gemisches wurden in 9 cm-Petrischalen gegossen und verfestigt. 1 bis 5 Löcher mit einem Durchmesser von 4 mm wurden in den Agar gestanzt, und 15 ul Kulturbrühe wurden in jedes Loch gegeben.
Die Petrischalen wurden 2 Tage bei 20 bis 25ºC inkubiert. Das Vorhandensein eines Fungizids zeigt sich durch eine klare Nicht-Wachstumszone um die Löcher herum - je größer die Zone, um so stärker das Fungizid. Unter diesen Bedingungen führte der Überstand zu einer klaren Zone von 25 mm.

Extraktion des aktiven Prinzips

Das erfindungsgemäße aktive Prinzip konnte durch Adsorption an Amberlite XAD-4-Adsorptionsmittel, das gründlich mit Aceton, Ethanol und destilliertem Wasser gewaschen wurde, extrahiert werden. Nach dem Auftragen der Probe auf das Adsorptionsmittel wird mehrfach mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Elution wird mit Ethanol und Aceton durchgeführt, und das aktive Prinzip wird im Vakuum bei Raumtemperatur eingeengt.

Schutz von Weintrauben gegen Botrytis cinerea

Im Handel erhältliche weiße Trauben wurden vereinzelt, gewaschen und getrocknet. Die Stiele wurden an den Früchten belassen. 2 Löcher mit einer Tiefe von 1 mm wurden in die Früchte mit der Spitze einer Spritze mit einem Gehalt an 10&sup6;/ml Botrytis-Sporen eingestochen. Die Trauben wurden anschließend in einer feuchten Atmosphäre 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Sie wurden dann mit der Kulturbrühe übergossen und wieder unter die feuchten Bedingungen für etwa 1 Woche gebracht. Im anderen Fall wurden die Früchte in die Kulturbrühe getaucht, und 24 Stunden später wurden sie mit einer Spritze mit einem Gehalt an Botrytis-Sporen angestochen. Auch hier wurden sie etwa 1 Woche in einer feuchten Atmosphäre inkubiert.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Art der Behandlung Schutzwirkung 1. Tag 2. Tag Vers. 1 Vers. 2 Vers. 3* Botrytis cinerea Wasser Kulturbrühe * Bei diesem Versuch wurde ein Stamm von Botrytis cinerea verwendet, der resistent gegenüber 100 ppm Iprodione (Rhone Poulenc) war.
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, wurden die Trauben, die mit Kulturbrühe von CBS 616.87 behandelt worden waren, im Vergleich zu denjenigen, die mit Wasser behandelt wurden, sehr wirksam gegen Botrytis cinerea geschützt. Ein noch höherer Grad des Schutzes ist zu erwarten, wenn die Sporen nicht in die Trauben injiziert werden. Darüber hinaus war der Schutz auch vorhanden, wenn Botrytis cinerea resistent gegenüber bekannten chemischen Fungiziden war.

Feldversuche für den Schutz gegen Botrytis cinerea

I: Tomaten

Das Fungizid wurde auf seine Fähigkeit untersucht, Tomatenpflanzen gegen Botrytis cinerea im Gewächshaus zu schützen. Sowohl die Kontrollen als auch die Versuche bestanden aus 3 Parzellen mit jeweils 8 Pflanzen mit einer Höhe von 75- 90 cm. 100 Verletzungen wurden auf den Blättern der 8 Pflanzen erzeugt, und sie wurden unmittelbar danach mit 1% einer gefriergetrockneten Probe von Kulturbrühe besprüht, bis diese herunterlief. Die Kontrollen wurden mit Wasser besprüht. 4 Stunden später wurden die einzelnen Pflanzen mit 4 · 10&sup6; Sporen von Botrytis cinerea besprüht. Das Gewächshaus wurde bei einer Temperatur von 18 bis 20ºC und einer relativen Feuchtigkeit von etwa 90% für 2 Wochen gehalten. Nach dieser Zeit wurde die Anzahl der infizierten Blätter gezählt.
Die Kontrollpflanzen wiesen insgesamt 126 Infektionen auf, während die mit dem Cercospora-Fungizid behandelten 44 aufwiesen.

II: Erbsen

20% Eluat (vgl. Extraktion des aktiven Prinzips) wurden auf Erbsen (Typ: Bodil) im Feld gesprüht, um festzustellen, ob die Pflanzen gegen eine natürliche Infektion durch Botrytis geschützt werden konnten. 4 Parzellen von jeweils 30 Quadratmetern wurden für den Test herangezogen, und 4 als Kontrolle. Die folgenden Verbindungen wurden zu dem Eluat gegeben:
0,2% Bevaloid 211, ein Dispergiermittel (Bevaloid Ltd., Postfach 3, Flemingate, Berverley, North Humberside HK 270 NW, England);
1% Alcopol, ein oberflächenaktives Mittel (Allied Colloids Ltd., Postfach 38, Low Moor, Bradford, Yorkshire BD 120 JZ, England) und
1 : 1600 Chevron Spray Sticker, Ortho-Product 2786.
Die erste Besprühung wurde beim Einsetzen des Blühens durchgeführt, und die zweite 10 Tage später. Als die Schoten völlig reif waren und die Pflanzen vertrocknet waren, wurden 10 Pflanzen zufällig in jeder Parzelle ausgewählt und im Labor auf eine Botrytis-Infektion der Schoten und der Stengel untersucht. Die nachstehenden Ergebnisse zeigen die durchschnittliche Infektion pro Gruppe.
Behandlung Infektion (%)
Schoten Stengel Kontrolle 11 63
CBS 616.87-Fungizid 6 35

Kombination mit Kerbiziden

Petrischalen wurden wie vorstehend unter "Analyse" vorbereitet und verwendet, um die Wirkung von Herbiziden auf das Phaeoramularia-Fungizid zu untersuchen. Es wurde festgestellt, daß das Fungizid nicht beeinträchtigt wurde, wenn es mit Chlorsulfuron (du Pont) (0,05-0,5 mg/ml), Atrazin (Ciba Geigy) (1-10 mg/ml) und Simazin (Ciba Geigy) (0,1-1 mg/ml) kombiniert wurde. Seine Aktivität war geringfügig erhöht (10- 20%), wenn es mit 0,1-10 mg/ml Lasso (Monsanto) versetzt wurde. Die 4 Herbizide hatten keine Wirkung auf Botrytis, wenn sie allein angewandt wurden.
Das Fungizid kann in Fällen verwendet werden, bei denen Botrytis cinerea resistent gegenüber Chemikalien ist, die heutzutage eingesetzt werden. Es kann auf Früchten und Gemüsen, wie Weintrauben, Erdbeeren, Tomaten und Citrusfrüchten, sowie zum Schutz nach der Ernte z. B. auf Karotten verwendet werden. Es kann auch schützend oder heilend bei Pflanzen verwendet werden, die normalerweise von Botrytis befallen werden.

Wirkung des Fungizids auf Dermatophytes

Das von CBS 616.87 gebildete Fungizid wurde für Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes und Microsporum canis untersucht. Es handelte sich um neuere klinische Isolierungen, und sie wurden bei 25ºC auf einem Agar mit einem Gehalt an den folgenden Bestandteilen in g/l inkubiert:
Bacto Yeast Morphology Agar: 35, (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;: 1,5; NaH&sub2;PO&sub4;·2H&sub2;O: 0,429; K&sub2;HPO&sub4;: 0,92; 5n NaOH: 1 ml; der pH-Wert betrug 7,1. Dieses Substrat wurde 20 Minuten bei 121ºC sterilisiert.
Mycelien der 3 Pilze wurden mit sterilen Glaskügelchen in sterilem Wasser zerkleinert, und 1 Tropfen wurde in der Mitte auf Petrischalen mit einem Gehalt an dem vorstehenden Agar, zu dem jedoch Phaeoramularia-Fungizid gegeben worden war, aufgebracht. Das Fungizid wurde in einer Konzentration von 0,5 ug/ml bis 5 ug/ml des vorstehend unter "Extraktion des aktiven Prinzips" beschriebenen Eluats zugegeben. Griseofulvin wurde zum Vergleich verwendet. Die Kontrollen wurden mit dem gleichen Agar, jedoch ohne das Fungizid, vorbereitet. 5 Wiederholungsversuche wurden für jede Untersuchung durchgeführt.
Alle Schalen wurden 5 Tage bei 25ºC inkubiert. Nach dieser Zeit wurde das Pilzwachstum untersucht.

Ergebnisse

Das Phaeoramularia-Fungizid verhinderte vollständig das Wachstum der 3 Pilze in allen untersuchten Konzentrationen. Dies bedeutet, daß die MHK 0,5 ug/ml betrug. Die minimale Hemmkonzentration (MHK) für Griseofulvin beträgt 1,5 ug/ml, 3 ug/ml und 10 ug/ml für Trichophyton rubrum, Microsporum canis bzw. T. mentagrophytes.

Konservierung von Holz

Poria placenta und Gloeophyllum trabeum, 2 auf Holz lebende Pilze, wurden 4 Tage bei 25ºC auf Malzagar kultiviert. Filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 8 mm wurden mit 25 ul Eluat mit einem Gehalt an dem erfindungsgemäßen fungiziden Prinzip benetzt und auf dem Agar 20 mm von der Kante der aktiv wachsenden Kolonien entfernt angeordnet. Es gab 3 Wiederholungsversuche. Die weitere Inkubation zeigte, daß das Wachstum der beiden Pilze durch das Fungizid stark gehemmt wurde.

Claims

1. Fungizides aktives Prinzip, erhältlich durch Kultivierung von Phaeoramularia fusimaculans (Atk) Liu & Guo CBS 616.87.

2. Fungizide Zusammensetzung, enthaltend eine wirksame Menge eines fungiziden aktiven Prinzips, das durch Kultivierung von Phaeoramularia fusimaculans (Atk) Liu & Guo CBS 616.87 erhältlich ist, und einen agrochemisch und/oder physiologisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.

3. Fungizide Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das fungizide aktive Prinzip mit einem oder mehreren anderen aktiven Stoffen kombiniert ist.

4. Fungizide Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die anderen aktiven Stoffe aus Bioziden, Pestiziden, Herbiziden, Insektiziden, Nematoziden, Akariziden und Fungiziden ausgewählt sind.

5. Fungizide Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die anderen aktiven Stoffe aus Pflanzennährstoffen, das Pflanzenwachstum fördernden Substanzen und Düngemitteln ausgewählt sind.

6. Fungizide Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die anderen aktiven Stoffe aus Antibiotika und Sulfonamiden ausgewählt sind.

7. Fungizide Zusammensetzung, enthaltend eine wirksame Anzahl lebensfähiger Einheiten (Sporen und/oder Mycelien) eines Pilzes von Phaeoramularia fusimaculans (Atk) Liu & Guo oder einer Mutante oder genetisch veränderten Transformante, die die gleiche charakteristische Fähigkeit zum Bilden des aktiven Prinzips besitzt, und die in einem passenden Medium suspendiert ist.

8. Fungizide Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei der Pilz der Stamm Phaeoramularia fusimaculans (Atk) Liu & Guo CBS 616.87 oder eine Mutante oder genetisch veränderte Transformante, die die gleiche charakteristische Fähigkeit zum Bilden des aktiven Prinzips besitzt, ist.

9. Zusammensetzung zur Verwendung als Fungizid an Tieren einschließlich Säugetieren, das eine wirksame Menge eines fungiziden aktiven Prinzips enthält, das durch Kultivierung von Phaeoramularia fusimaculans (Atk) Liu & Guo CBS 616.87 erhältlich ist.

10. Verfahren zum Bekämpfen von Pilzen bei Pflanzen, wobei eine wirksame Menge einer fungiziden Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 8 auf eine zu behandelnde Region aufgebracht wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die zu bekämpfenden Pilze zum Genus Botrytis, Rhizomucor, Fusarium, Pyricularia, Penicillium und /oder Rhizopus gehören.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Pilz Botrytis ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Botrytis Botrytis cinerea ist.

14. Verfahren zur Herstellung eines fungiziden aktiven Prinzips, wobei Phaeoramularia fusimaculans (Atk) Liu & Guo oder eine Mutante oder genetisch veränderte Transformante, die die gleiche charakteristische Fähigkeit zum Bilden des aktiven Prinzips besitzt, in Gegenwart von Quellen assimilierbaren Stickstoffs, Kohlenstoffs und Sauerstoffs zusammen mit essentiellen Nährstoffen kultiviert wird, und wobei das aktive Prinzip gewonnen wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das aktive Prinzip aus dem Kulturmedium gewonnen wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das aktive Prinzip gewonnen wird, indem das Kulturmedium einer Adsorptionschromatographie und einer anschließenden Vakuumkonzentration unterzogen wird.

17. Verfahren nach Anspruch 14, 15 oder 16, wobei der Pilz Phaeoramularia fusimaculans (Atk) Liu & Guo CBS 616.87 ist oder eine Mutante oder genetisch veränderte Transformante, die die gleiche charakteristische Fähigkeit zum Bilden des aktiven Prinzips besitzt.

18. Pilz Cercospora fusimaculans Atk, der bei dem Centraalbureau voor Schimmelcultures am 22. Oktober 1987 hinterlegt wurde und dem die Hinterlegungsnummer CBS 616.87 zugeteilt wurde, oder eine Mutante oder genetisch veränderte Transformante, die die gleiche charakteristische Fähigkeit zum Bilden des aktiven Prinzips besitzt.

19. Fungizider Wachstumsmediumzusatz, der das fungizide Prinzip nach einem der vorhergehenden Ansprüche oder hergestellt nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 14-17 aufweist.

20. Fungizider Nahrungsmittelzusatz, der das fungizide Prinzip nach einem der vorhergehenden Ansprüche oder hergestellt nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 14-17 aufweist.

21. Fungizider Holzkonservierungszusatz, der das fungizide Prinzip nach einem der vorhergehenden Ansprüche oder hergestellt nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 14-17 aufweist.

22. Fungizides aktives Prinzip, das durch Kultivierung von Phaeoramularia fusimaculans (Atk) Liu & Guo CBS 616.87 erhältlich ist, zur Verwendung bei der Bekämpfung von Pilzen.

23. Verwendung eines fungiziden aktiven Prinzips, das durch Kultivierung von Phaeoramularia fusimaculans (Atk) Liu & Guo CBS 616.87 erhältlich ist, zur Herstellung eines Medikamentes zur Bekämpfung von Pilzen.