DE69837559T2 - Verfahren zur Bestimmung der Waschleistung eines Enzyms. - Google Patents

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions

Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Enzyme sind ein unerlässlicher Bestandteil vieler gegenwärtig auf dem Markt befindlichen Detergenszusammensetzungen und der Einschluss von Enzymen in Detergenszusammensetzungen wird in der Zukunft zweifellos zunehmen. Eine der wichtigsten Herausforderungen, mit der sich ein Detergenshersteller heutzutage konfrontiert sieht, ist die Identifizierung neuer und verbesserter Enzyme und Detergenszusammensetzungen. Neue Enzyme können Varianten von bekannten Enzymen umfassen, und dies ist üblicherweise auch der Fall.
  • Verschiedene Methoden zum Untersuchen der Waschleistung eines Enzyms sind im Stand der Technik bekannt. Die EP-A-0 739 982 beschreibt beispielsweise einen Schmutzredepositionsverhinderungstest, bei dem ein weißes Baumwollgewebe mit gefärbtem Schmutz und anderen Produkten in einem Detergens inkubiert wird. Eine Cellulase wird dann zu der Lösung gegeben und unter Rührbedingungen (90 U/min) inkubiert. Nach dem Inkubieren wird das Gewebe mit laufendem, kaltem Wasser gespült und dann getrocknet. Der Weißheitsgrad des Gewebes wird anhand der Remission unter Verwendung eines Kolorimeters gemessen.
  • Die EP-A-0 352 244 offenbart Waschtests mit verschiedenen Detergenzien, die Savinase (eine Protease) enthalten. In diesem Test werden Standardgewebe, die mit Blut, Milch und Tinte oder Kakao, Milch und Zucker verunreinigt wurden oder mit Milch und Tinte verunreinigte Polyester/Baumwolle verwendet. Es wurde die Lichtremission von gewaschenem Gewebe, verunreinigtem Gewebe und sauberem Gewebe gemessen.
  • Die WO-A-97 41212 betrifft einen Activity-in-Detergent-Assay, der mit einem neuartigen lipolytischen Enzym durchgeführt und mit dem bekannten Enzym LipolaseTM verglichen wurde. Baumwollmuster mit Olivenöl werden zu der Detergenslösung gegeben und gerührt. Das zurückgebliebene Detergens wird durch Spülen in Leitungswasser entfernt. Eine gute Waschleistung äußert sich in der Hydrolyse von Öl auf den Textilmustern, d.h. dass die Wirkung des lipolytischen Enzyms durch Messen des Hydrolysegrads gemessen wird.
  • Ein weiterer Waschtest ist aus der WO-A-97 23593 bekannt, bei dem die Muster (weiße Baumwolllaken) mit verschiedenen Flecken, wie Spinat, Schokoladeneis oder EMPA-Blut, präpariert wurden. Anschließend wurden die Muster unter Rühren zu einer eine Protease umfassende Detergenszusammensetzung gegeben. Nach dem Waschen wurden die Muster getrocknet und durch einen Fachausschuss unter Verwendung einer Vierpunkt-Scheffé-Skala hinsichtlich der Entfernung der Flecken beurteilt.
  • In der WO-A-97 07202 ist ein Waschtest unter Verwendung von lipolytischen Enzymen und mit Schweinefett/Sudanrot befleckten Mustern beschrieben. Diese Muster werden in einer Detergenszusammensetzung inkubiert, die ein lipolytisches Enzym umfasst. Nach dem Spülen und Trocknen der Muster wird die Remission bei 460 nm gemessen. Anschließend wird der Fettstoff von den Mustern entfernt und die Menge des auf den Mustern hinterlassenen Fettstoffs gewichtsanalytisch bestimmt. Ein anderes in der WO-A-97 07202 beschriebenes Bestimmungsverfahren ist die Dünnschichtchromatographie und die Bestimmung der % Entfernung von Schweinefett oder der Deltaremission.
  • Die WO-A-95 10615 beschreibt Waschleistungstests, bei denen die Entfernung eines Flecks (Blut/Milch/Ruß) von einem Stoffmuster unter Verwendung eines Detergens und durch Zugabe von Subtilisinvarianten zu der Lösung bestimmt wird. Nach dem Spülen, Trocknen und Bügeln wird die Remission der Muster mittels eines Chroma-Meters gemessen.
  • In der WO-A-93 05134 wird ein Waschleistungstest beschrieben, der auf mit Grassaft-verunreinigter Baumwolle mit Detergens und zugegebenem Enzym durchgeführt wird und die Bestimmung der % Remission bei 460 nm einschließt.
  • Ein weiterer Waschtest ist aus der US-A-5 612 306 bekannt, bei dem in einem ersten Schritt mit Grasflecken befleckte Baumwollmuster hergestellt werden. Dann wird eine stabile enzymhaltige Fleckenvorbehandlungswaschmittelzusammensetzung, die wenigstens ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel enthält, auf das Muster aufgebracht. Die Fleckenentfernungseigenschaften werden auf der von 1 bis 5 reichenden Skala der AATCC-Fleckenentfernungsreplika bewertet, wobei 1 im Wesentlichen keine Entfernung und 5 eine vollständige Entfernung anzeigt.
  • Mehrere Faktoren können die Bestimmung der "Verbesserung" eines neuen Enzyms gegenüber einem Vorgängerenzym beeinflussen, d.h. das Enzym selbst, die Waschbedingungen und die Detergenszusammensetzung, mit der das Enzym gemischt wird. Beispielsweise funktioniert ein in einer Detergenszusammensetzung gut funktionierendes Enzym in einer anderen Detergenszusammensetzung möglicherweise nicht so gut. In gleicher Weise funktioniert ein Enzym und/oder eine Detergenszusammensetzung möglicherweise gut bei einer Waschbedingungsgruppe, d.h. japanischen Waschbedingungen, jedoch nicht unter einer anderen Waschbedingungsgruppe, d.h. nordamerikanischen Waschbedingungen. Das Identifizieren eines neuen und verbesserten Enzyms oder einer neuen und verbesserten Detergenszusammensetzung kann jedoch eine zeitaufwendige Aufgabe sein. Als Folge verbesserter Technologien, die es einem Forscher ermöglichen können, eine große Anzahl von Varianten in sehr kurzer Zeit zu erzeugen, wurde es beispielsweise für den Forscher entscheidend, diese Varianten schnell, effizient und effektiv untersuchen zu können.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Untersuchen der Waschleistung eines Enzyms bereit, umfassend das Bereitstellen eines Musters, das ein Stück eines Materials und einen Fleck umfasst. Der Fleck wird dann an das Material fixiert und ein kleineres Muster kann aus dem Muster entfernt werden. Alternativ dazu kann das kleinere Muster aus dem größeren Muster entfernt werden und der Fleck dann fixiert werden. Als nächstes wird ein Enzym auf das Muster oder das kleinere Muster aufgebracht und zusammen inkubiert.
  • Das Verfahren kann ferner das Messen des Grads der Entfernung des Flecks aus dem Material umfassen. Das Verfahren kann zudem das Bewegen des kleineren Musters und Enzyms während der Inkubation umfassen. Das Material kann beispielsweise Baumwolle, Polyester oder Mischungen von natürlichen und synthetischen Fasern sein. Der Fleck kann Blut, Milch, Tinte, Gras, Bratensoße, Schokolade, Ei, Käse, Lehm, Färbemittel, Öl und Kombinationen davon umfassen. Das Enzym kann zusammen mit einem Detergensbestandteil auf das Muster oder das kleinere Muster aufgebracht werden.
  • Das Verfahren umfasst das Messen des Grads der Entfernung des Flecks aus dem Material. Das Verfahren umfasst das Bewegen des Musters oder des kleineren Musters und der Detergenszusammensetzung während der Inkubation. Die Materialien können beispielsweise Baumwolle, Polyester oder Mischungen von natürlichen und synthetischen Fasern, Cellulose und Cellulosederivate sein. Der Fleck kann Blut, Milch, Tinte, Gras, Spinat, Wein, Tee, Bratensoße, Schokolade, Ei, Käse, Lehm, Färbemittel, Öl und Kombinationen davon umfassen. Die Detergenszusammensetzung kann zusammen mit einem Enzym auf das Muster oder das kleinere Muster aufgebracht werden.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnung
  • 1 zeigt die Korrelation der Ergebnisse des Testens der sechs Proteasevarianten in einem Tergotometertest gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Untersuchen der Waschleistung eines Enzyms, welches das Bereitstellen eines Materialmusters – eines Stücks eines Materials und eines Flecks –, das anschließende Fixieren des Flecks an das Material, gegebenenfalls das Entfernen eines kleineren Musters aus dem Muster, das Aufbringen des Enzyms auf das Muster oder das kleinere Muster, das Inkubieren derselben, das Entfernen des Musters oder Überstands, und das Messen des Grads der Entfernung des Flecks aus dem Material durch Messen der Extinktion oder Fluoreszenz eines Bestandteils des Flecks in dem Überstand umfasst.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Untersuchen der Herauslösung eines Flecks aus einem mit Blut/Milch/Tinte (BMI) befleckten Muster, umfassend das Messen der Extinktion oder Fluoreszenz nach dem Inkubieren des Musters mit einem Enzym von beispielsweise der Tinte, dem markierten Blut oder der markierten Milch im Überstand.
  • Ferner umfasst ein Aspekt der Erfindung einen Schritt des Bewegens der Mikrotiterplatte in ausreichendem Maße, um die vollständige und gründliche Inkubation des Enzyms mit dem kleineren Muster sicherzustellen. Das Verfahren umfasst das Aufbringen eines Plattendichtungsmittels auf die Oberseite der Mikrotiterplatte und das nachfolgende Befestigen eines Deckels auf dem Plattendichtungsmittel.
  • Irgendein Enzym oder irgendeine Kombination von Enzymen kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bevorzugte Enzyme umfassen diejenigen Enzyme, die Substrate, z.B. Flecken, hydrolysieren können.
  • Diese Enzyme sind als Hydrolasen bekannt, die Proteasen (bakterielle, pilzliche, saure, neutrale oder alkalische), Amylasen (alpha oder beta), Lipasen, Cellulasen und Mischungen davon umfassen, nicht jedoch darauf beschränkt sind. Besonders bevorzugte Enzyme sind Subtilisine und Cellulasen. Am meisten bevorzugt sind Subtilisine, wie die in dem US-Patent 4 760 025, dem EP-Patent 130 756 B1 und der EP- Patentanmeldung WO 91/06637 beschriebenen, und Cellulasen, wie Multifect L250TM und PuradaxTM, die von Genencor International kommerziell erhältlich sind. Andere Enzyme, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Oxidasen, wie Laccasen, Transferasen, Dehydratasen, Reduktasen, Hemicellulasen und Isomerasen.
  • Ein "Muster" ist ein Stück eines Materials, wie ein Gewebe, das einen darauf aufgebrachten Fleck aufweist. Das Material kann beispielsweise ein Gewebe aus Baumwolle, Polyester oder Mischungen von natürlichen und synthetischen Fasern sein. Das Muster kann ferner Papier, wie Filterpapier oder Nitrocellulose, oder ein Stück eines harten Materials, wie Keramik oder Glas, sein. Der Fleck kann Blut, Milch, Tinte, Gras, Tee, Wein, Spinat, Bratensoße, Schokolade, Ei, Käse, Lehm, Färbemittel, Öl oder Mischungen dieser Verbindungen sein.
  • Ein "kleineres Muster" ist ein Stück des Musters, das entweder vor oder nach dem Fixieren des Flecks an das Muster aus dem Materialmuster herausgeschnitten oder auf andere Weise aus dem Materialmuster entfernt wurde und beispielsweise in das Well einer 24-, 48- oder 96-Well-Mikrotiterplatte passt. Das "kleinere Muster" kann auch durch Aufbringen eines Flecks auf ein kleines Stück eines Materials erzeugt werden. Vorzugsweise ist das kleinere Muster ein Stück eines Gewebes mit einem Fleck von 5/8'' im Durchmesser, besonders bevorzugt weist das kleinere Muster einen Durchmesser von 0,25'' auf.
  • Wenn beispielsweise unbehandelte BMI-Muster in Detergens ohne Bleichmittel gewaschen werden, wird ein großer Teil der Tinte selbst ohne Hilfe einer Protease freigesetzt. Die Zugabe einer Protease führt zu einer geringen Zunahme der Tintenfreisetzung, die gegen den hohen Hintergrund schwer zu quantifizieren sein kann. Die vorliegende Erfindung stellt ein Behandlungsprotokoll bereit, welches ermöglicht, den Grad der Fixierung eines Flecks zu kontrollieren. Folglich ist es möglich, Muster herzustellen, die beispielsweise beim Waschen in Abwesenheit einer Protease unterschiedliche Mengen an Tinte freisetzen. Die Verwendung von fixierten Mustern führt zu einer drastischen Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses in dem Waschversuch. Durch Variieren des Fixierungsgrads können ferner Muster erzeugt werden, die unter den verschiedenen Reinigungsbedingungen optimale Ergebnisse ergeben.
  • Muster mit Flecken mit bekannter "Stärke" auf verschiedenen Materialarten sind kommerziell erhältlich (EMPA, St. Gallen, Schweiz; wfk-Testgewebe GmbH, Krefeld, Deutschland; oder Center for Test Materials, Vlaardingen, Niederlande) und/oder können durch den Fachmann hergestellt werden (Morris und Prato, Textile Research Journal 52(4): 280–286 (1982)). Bevorzugte Muster sind ein Blut/Milch/Tinte (BMI)-Fleck auf einem baumwollhaltigen Gewebe, ein Spinatfleck auf einem baumwollhaltigen Gewebe oder Gras auf einem baumwollhaltigen Gewebe und Schokolade/Milch/Ruß auf einem baumwollhaltigen Gewebe.
  • Ein Fleck kann an einem Material auf mehrere Arten fixiert werden. Beispielsweise kann das Muster mit einem Vernetzungsmittel inkubiert werden, um den Fleck zu fixieren. Der Fixierungsgrad kann beispielsweise durch Erhöhen oder Verringern der Inkubationszeit, Variieren der Temperatur, bei der die Inkubation stattfindet und/oder Variieren der Chemikalienkonzentration beeinflusst werden. Geeignete Vernetzungsmittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Wasserstoffperoxid, Bleichmittel, Glutaraldehyd und Carbodiimide.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann ein BMI-Fleck an Baumwolle mit 0,0003–0,3% Wasserstoffperoxid fixiert werden. Andere Kombinationen umfassen Gras oder Spinat, fixiert mit 0,001–1% Glutaraldehyd, Gelatine und Coomassie-Fleck, fixiert mit 0,001–1% Glutaraldehyd, oder Schokolade, Milch und Ruß, fixiert mit 0,001–1% Glutaraldehyd.
  • Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass das Muster, Enzym und Detergensformulierung während der Inkubation gut bewegt werden müssen. Wir haben beobachtet, dass die Waschleistungsmesswerte von der Orientierung der Muster in den Wells (horizontal verglichen mit vertikal) abhängen, insbesondere in der 98-Well-Platte. Dies deutet darauf hin, dass das Mischen während der Inkubationsdauer ungenügend war. Obwohl es mehrere Arten gibt, um eine ausreichende Bewegung während der Inkubation sicherzustellen, kann ein Plattenhalter, in dem die Mikrotiterplatte zwischen zwei Aluminiumplatten aufgenommen ist, konstruiert werden. Dies kann so einfach sein wie beispielsweise das Legen eines haftfähigen Plattendichtungsmittels über die Wells und das anschließende Befestigen der zwei Aluminiumplatten an die 96-Well-Platte mit irgendwelchen geeigneten, kommerziell erhältlichen Klammern. Dieser kann dann in einen kommerziellen Inkubatorschüttler montiert werden. Das Einstellen des Schüttlers auf etwa 400 U/min führt zu einem sehr wirksamen Mischen, während das Auslaufen oder eine Kreuzkontamination durch die Haltevorrichtung wirksam verhindert wird.
  • Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) kann verwendet werden, um die Konzentration der Aminogruppen in der Waschflüssigkeit zu quantifizieren. Dies kann als Maß für die aus dem Muster entfernte Proteinmenge dienen (siehe Cayot und Tainturier, Anal. Biochem. 249: 184–200 (1997)). Wenn jedoch ein Detergens oder eine Enzymprobe zur Bildung von ungewöhnlich kleinen Peptidfragmenten führt (beispielsweise durch das Vorhandensein von Peptidasen in der Probe), wird ein stärkeres TNBS-Signal, d.h. mehr "Rauschen", erhalten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen anderen und besseren Weg bereit, um die Waschleistung von Blut/Milch/Tinte zu messen, der auf der Freisetzung von Tinte beruht. Die Proteolyse von Protein auf den Mustern führt zur Freisetzung von Tintenpartikeln, die durch Messen der Extinktion der Waschflüssigkeit quantifiziert werden können. Die Extinktion kann bei irgendeiner Wellenlänge zwischen 350 und 800 nm gemessen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Wellenlänge 410 nm oder 620 nm. Die Waschlösung kann auch untersucht werden, um die Waschleistung hinsichtlich Flecken zu bestimmen, die Gras, Spinat, Gelatine oder einen Coomassie-Fleck enthalten. Bevorzugte Wellenlängen für diese Flecken umfassen 670 nm für Spinat oder Gras und 620 nm für Gelatine oder Coomassie. Es wird beispielsweise ein Aliquot der Waschflüssigkeit (üblicherweise 100–150 μl, beispielsweise aus einer 96-Well-Mikroplatte) entnommen und in eine Küvette oder eine Multiwell-Mikroplatte gegeben. Diese wird dann in ein Spektrophotometer gegeben und die Extinktion bei einer geeigneten Wellenlänge ausgelesen.
  • Die Leistung von Proben von Proteasevarianten (beispielsweise hergestellt gemäß der Offenbarung des U.S.-Patents 77807) kann durch das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung von TNBS sowie dem Nachweis der Tintenfreisetzung verglichen werden. Mehrere dieser Proben zeigen bei der Verwendung des TNBS-Nachweises eine überhöhte Waschleistung (vermutlich aufgrund einer Peptidasekontamination), während bei der Messung der Extinktion der Waschflüssigkeit sämtliche Proben zu ununterscheidbaren Signalen führen.
  • Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um ein bevorzugtes Enzym und/oder eine bevorzugte Waschmittelzusammensetzung zum Geschirrspülen zu bestimmen, beispielsweise unter Verwendung eines Blut/Milch/Tintenflecks auf einem geeigneten Substrat, wie einem Gewebe, Kunststoff oder Keramik.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein BMI-Fleck an Baumwolle fixiert, indem 0,3% Wasserstoffperoxid auf das BMI/Baumwolle-Muster für 30 Minuten bei 25 °C oder 0,03% Wasserstoffperoxid auf das BMI/Baumwolle-Muster für 30 Minuten bei 60 °C aufgebracht wird. Kleinere Muster von ungefähr 6,35 mm (0,25'') werden aus dem BMI/Baumwolle-Muster herausgeschnitten und in die Wells einer 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben. In jedes Well wird eine bekannte Mischung einer Detergenszusammensetzung und eines Enzyms, wie einer Proteinvariante, gegeben. Nachdem ein haftfähiges Plattendichtungsmittel auf die Oberseite der Mikrotiterplatte gelegt wurde, wird die Mikrotiterplatte an einer Aluminiumplatte befestigt und für 10–300 Minuten bewegt. Am Ende dieser Zeitdauer werden die Überstände in die Wells einer neuen Mikrotiterplatte überführt und die Extinktion der Tinte bei 620 nm gemessen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Spinat- oder Grasfleck an Baumwolle fixiert, indem 0,01% Glutaraldehyd auf das Spinat/Baumwolle-Muster oder das Gras/Baumwolle-Muster für 30 Minuten bei 25 °C aufgebracht wird. Kleinere Muster von ungefähr 6,35 mm (0,25'') werden aus dem Muster herausgeschnitten und in die Wells einer 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben. In jedes Well wird eine bekannte Mischung einer Detergenszusammensetzung und eines Enzyms, wie einer Proteinvariante, gegeben. Nachdem ein haftfähiges Plattendichtungsmittel auf die Oberseite der Mikrotiterplatte gelegt wurde, wird die Mikrotiterplatte an einer Aluminiumplatte befestigt und für 10–300 Minuten bewegt. Am Ende dieser Zeitdauer werden die Überstände in die Wells einer neuen Mikrotiterplatte überführt und die Extinktion der Tinte bei 670 nm gemessen.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Schokolade/Milch/Ruß-Fleck an Baumwolle fixiert, indem 0,01% Glutaraldehyd auf das Schokolade/Milch/Ruß/Baumwolle-Muster für 30 Minuten bei 25 °C aufgebracht wird. Kleinere Muster von ungefähr 6,35 mm (0,25'') werden aus dem Muster herausgeschnitten und in die Wells einer 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben. In jedes Well wird eine bekannte Mischung einer Detergenszusammensetzung und eines Enzyms, wie einer Proteinvariante, gegeben. Nachdem ein haftfähiges Plattendichtungsmittel auf die Oberseite der Mikrotiterplatte gelegt wurde, wird die Mikrotiterplatte an einer Aluminiumplatte befestigt und für 10–300 Minuten bewegt. Am Ende dieser Zeitdauer werden die Überstände in die Wells einer neuen Mikrotiterplatte überführt und die Extinktion der Tinte bei einer geeigneten Wellenlänge gemessen.
  • Beispiele
  • Beispiel I
  • A. Beschreibung des Tergotometer-Protokolls
  • Es wurde ein durch die United States Testing Company hergestelltes Tergotometergerät verwendet. Das Gerät besteht aus vier oder sechs 1,5 Liter-Becher und Rührwellen, die in die Becher eingeschoben sind und bei einer kontrollierten Geschwindigkeit in einer Vor-und-Zurück-Weise rotiert werden, üblicherweise bei 100 U/min, um die Art der Bewegung, die in kommerziellen Waschmaschinen erfolgt, nachzuahmen. Die Becher werden in ein temperierbares Wasserbad eingetaucht.
  • Jeder Becher wurde mit einem Liter deionisiertem Wasser gefüllt, zu dem eine kontrollierte Menge an Calcium und Magnesium gegeben wurde, um die Wasserhärtebedingungen, die in der zu untersuchenden Region vorliegen, nachzuahmen. Die Wasserhärte für nordamerikanische Bedingungen wurde auf 3–6 Grains pro 3,79 Liter (1 Gallone) eingestellt. Das Wasserbad wurde auf 20 °C eingestellt und die Temperatur des Wassers in den Bechern bis zum Erreichen eines Gleichgewichts bei der Testtemperatur stehen gelassen. 1 Gramm eines Tide-Waschmittels ohne Bleichmittel und Enzym (Procter & Gamble, Cincinnati, Ohio) wurde zu jedem Becher gegeben und für 1 Minute gemischt, während die Wellen mit 100 U/min rotiert wurden. Das Enzym wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 Mikrogramm pro Milliliter zugegeben und für 1 Minute gemischt. Es wurden mit Blut-Milch-Tinte verunreinigte Muster von 7,62 cm × 11,43 cm (3'' × 4 1/2'') verwendet, die von der EMPA erhalten und durch Aussetzen gegenüber 3,0% Wasserstoffperoxid für 30 Minuten bei 20 °C und Trocknen modifiziert wurden. Sechs verunreinigte Muster wurden zu jedem Becher gegeben und für 20 Minuten inkubieren gelassen. Nach der Inkubationsdauer wurden die Muster sofort aus den Bechern entfernt und gründlich mit Wasser gespült. Die Muster wurden dann flach auf eine saubere Laborbank zum Trocknen gelegt. Als die Muster trocken waren, wurde die Remission jedes Musters an 3 verschiedenen Punkten auf jedem Muster unter Verwendung eines Remissionsspektrophotometers mit einer Öffnung mit geringem Durchmesser (üblicherweise 6,35 mm (1/4'')), das die Ergebnisse in der Standard-LAB-Skala anzeigen kann, gemessen. Für BMI ist es ausreichend, nur den L-Wert anzugeben, der mit der Dunkelheit des Flecks korreliert. Die von den Mustern in jedem Gefäß erhaltenen L-Werte wurden gemittelt, um die ausgewiesenen Endergebnisse zu erhalten.
  • B. Beschreibung des 24-Well-Assay-Protokolls
  • Blut/Milch/Tinte-Muster wurden von der EMPA erhalten und gegenüber 0,03% Wasserstoffperoxid für 30 Minuten bei 60 °C ausgesetzt und dann getrocknet. Kreise mit 6,35 mm (1/4'') Durchmesser wurden aus den getrockneten Mustern geschnitten und jeweils ein Kreis in ein Well einer 24-Well-Mikroplatte gegeben. 1 Gramm pro Liter Tide-Waschmittel ohne Bleichmittel und Enzym wurde in deionisiertem Wasser hergestellt und ein konzentriertes Calcium- und Magnesiumausgangsmaterial wurde zugegeben, was zu einem Wasserendhärtewert von 6 Grains pro 3,79 Liter (1 Gallone) führte. Das Detergens wurde für 15 Minuten gemischt und wurde dann durch einen 0,2 μm Celluloseacetatfilter filtriert. Das Enzym wurde aus einer konzentrierten Stammlösung zu dem filtrierten Detergens gegeben, was zu einer Endkonzentration von 1,25 Mikrogramm pro Milliliter führte. Die Enzym/Detergens-Lösung wurde dann zu den entsprechenden Wells der Mikroplatte gegeben. Die Mikroplatte wurde dann versiegelt, um ein Auslaufen zu verhindern und in einer Haltevorrichtung auf einem Inkubatorschüttler, der auf 20 °C und 400 U/min eingestellt war, angeordnet und für eine Stunde geschüttelt. Die Platte wurde dann von dem Inkubator/Schüttler entfernt und ein Aliquot von 20 Mikrolitern wurde aus jedem Well entnommen und die Extinktion bei einer Wellenlänge von 620 nm für jedes Aliquot ausgelesen und ausgewiesen.
    • C. Sechs Proteasevarianten wurden gemäß obigen A und B getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Korrelation der Daten ist in 1 graphisch aufgetragen. Der R2-Wert beträgt 0,9652.
  • Tabelle 1 Tergotometer-Mikromuster
    Figure 00100001

Claims (8)

  1. Verfahren zum Untersuchen der Waschleistung eines Enzyms, umfassend: a) Bereitstellen eines Musters, umfassend ein Stück eines Materials mit einem darauf aufgebrachten Fleck; b) Fixieren des Flecks an das Material; c) Aufbringen eines Enzyms auf das Muster; d) Inkubieren des Musters und des Enzyms unter Bewegung; e) Entfernen des Musters oder Überstandes; und f) Messen des Grades der Entfernung des Flecks aus dem Material durch Messen der Extinktion oder Fluoreszenz eines Bestandteils des Flecks im Überstand.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Enzym aus der Gruppe bestehend aus einer Protease, einer Cellulase, einer Amylase, einer Laccase und einer Lipase ausgewählt ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Material aus der Gruppe bestehend aus Gewebe, Kunststoff, Glas oder Keramik ausgewählt ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Fleck aus der Gruppe bestehend aus Blut, Milch, Tinte, Gras, Spinat, Bratensoße, Schokolade, Ei, Käse, Lehm, Färbemittel, Öl und Kombinationen davon ausgewählt ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Enzym zusammen mit einem Detergensbestandteil auf das Muster aufgebracht wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Bestandteil Tinte aus einem Blut/Milch/Tinte-Fleck ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Bestandteil markiertes Blut aus einem Blut/Milch/Tinte-Fleck ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Fleck fixiert wird durch Inkubieren des Musters mit einem Vernetzungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffperoxid, Bleichmitteln, Glutaraldehyd und Carbodiimiden.
DE69837559T 1997-12-24 1998-12-23 Verfahren zur Bestimmung der Waschleistung eines Enzyms. Expired - Lifetime DE69837559T3 (de)

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