DE69827618T2

DE69827618T2 - Oligopeptidinhibitoren für elastase und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE69827618T2
Application number: DE69827618T
Authority: DE
Inventors: Evzen Kasafirek; Pavel Pihera; Antonin Sturc; Aleksi Sedo
Original assignee: Procter and Gamble Co
Current assignee: Procter and Gamble Co
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1998-04-27
Publication date: 2005-11-03
Anticipated expiration: 2018-04-28
Also published as: WO1998049197A1; CZ131597A3; AU6819798A; CZ285911B6; EP0979245B1; EP0979245A1; DE69827618D1; JP2002511848A

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft oligopeptidische Elastaseinhibitoren, insbesondere Leukocytelastase (LE). Elastolytische Enzyme, beispielsweise LE oder Elastase der Bauchspeicheldrüse (PE), sind Mitglieder der Gruppe von Serinproteinasen, welche am Abbau des natürlichen Substrats Elastin teilnehmen; Elastin bildet den wesentlichen Teil des Proteinpools des Organismus. In dem gesunden Organismus wird diese zerstörerische Aktivität durch endogene Enzyme, beispielsweise α₁-Proteinaseinhibitor (α₁-PI) inhibiert. In dem Fall einer α₁-PI-Insuffizienz verschiedener Ursachen (Infektion, Ernährung, Arbeitsumgebung, genetische Faktoren) kann man die Autodigestion von lebenswichtigen Organen durch LE und PE beobachten, was die Grundlage des Ursprungs von verschiedenen Erkrankungen, beispielsweise der akuten Bauspeicheldrüsenentzündung (Pancreatitis), der Lungenaufblähung (Lungenemphysem), Arthritis oder Gingivitis, bildet.
Stand der Technik
Eine der Möglichkeiten zum Erreichen der Homöostase – dem Gleichgewicht zwischen Elastase und dem entsprechenden endogenen Inhibitor (in dem Fall einer pathogenen Erkrankung) – ist die Substitutionstherapie, was die Verabreichung eines exogenen natürlichen oder synthetischen Inhibitors des α₁-PI-Typs bedeutet. Diese wird erreicht durch Verabreichung entweder von natürlichem (Antilysin^®, Trasylol^®, Contrykal^®) oder synthetischem α₁-PI-ähnlichen Nafamstatmesylat, FUT (Tori Co., Tokyo, Japan). Die WO-A-90/04409 betrifft synthetische Peptidinhibitoren für Elastase, welche eine Sequenz Lys-Ala-Pro mit zusätzlichen anderen angehängten Gruppen umfassen. In ähnlicher Weise offenbaren die US-A-4,528,133 und die Veröffentlichung "Anionic inhibitor of pancreatic and leukocyte elastase", Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 366, 333–343 (1985) Tetrapeptidalkylamide auf der Basis von Sequenzen Glu-Ala-Ala-Pro oder Asp-Ala-Ala-Pro, welche als Elastaseinhibitoren wirken. Kürzlich haben die Erfinder einen synthetischen wirksamen Inhibitor für die Therapie der akuten Bauchspeicheldrüsenentzündung (Pancreatitis) Glt-Ala₃-NHEt, Inpankin VÚFB 16834 (Gut 33, 701–706, 1992) vorgeschlagen.
Der schwerwiegende Defekt der isolierten (natürlichen) Inhibitoren liegt nicht nur in deren Antigenizität (α₁-PI zeigt die Artenspezifizität), sondern ebenso in der möglichen Kontamination durch die bovine spongioforme Encephalopathie (BSE). Im Gegensatz dazu weisen die synthetischen niedermolekulargewichtigen Inhibitoren keine unerwünschten Nebeneffekte auf und sind wirksamer sowie stabiler. Deren chemische Struktur ist streng definiert und in chemischer und physikalischer Weise gekennzeichnet.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfindung betrifft oligopeptidische Elastaseinhibitoren der allgemeinen Struktur I
worin
X A oder B bedeutet,
Y A oder B oder A-Ala bedeutet, und wenn Y A-Ala ist, X B bedeutet,
A eine gesättigte Säure mit 8 bis 16 Kohlenstoffatomen bedeutet,
B den 3-Carboxypropionyl- oder 4-Carboxybutyroyl-Rest bedeutet.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Struktur I zur Verfügung gestellt, worin Y B ist, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass Lysin mit geschützten Amino-Gruppen mit einer Verbindung der Formel: Ala-Ala-Pro-NH-iBu, in Kontakt gebracht wird, die ε-Aminogruppe des Produkts entschützt wird, das resultierende Produkt mit der Verbindung der Formel A-X¹, worin A die oben angegebene Bedeutung aufweist und X¹ ein Halogen darstellt, umgesetzt wird, die α-Aminogruppe entschützt wird und die resultierende Verbindung der Formel Lys(A)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu mit Bernsteinsäure- oder Glutarsäureanhydrid in Kontakt gebracht wird.
Die Erfindung umfasst ebenso ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Struktur I, worin Y A bedeutet, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Verbindung der Formel A-Lys(W), worin W eine Schutzgruppe ist und A die oben angegebene Bedeutung aufweist, mit einer Verbindung der Formel Lys(W), worin W eine Schutzgruppe ist und A die oben angegebene Bedeutung aufweist, mit einer Verbindung der Formel: Ala-Ala-Pro-NH-iBu in Kontakt gebracht wird, das Produkt entschützt wird und die resultierende Verbindung der Formel A-Lys-Ala-Ala-Pro-NH-iBu mit Bernsteinsäure- oder Glutarsäureanhydrid in Kontakt gebracht wird.
Die Erfindung umfasst ebenso das Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Struktur I, worin Y A-Ala ist, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Verbindung der Formel A-Ala mit einer Verbindung der Formel: W-Lys-Ala-Ala-Pro-NH-iBu, worin W eine Schutzgruppe ist und A die oben angegebene Bedeutung aufweist, in Kontakt gebracht wird, das Produkt entschützt wird und die resultierende Verbindung der Formel Lys(A-Ala)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu mit Bernsteinsäure- oder Glutarsäureanhydrid in Kontakt gebracht wird.
Verbindungen der allgemeinen Struktur I sind wirksame kompetitive Inhibitoren von Serinproteinasen, insbesondere von Leukocytelastase (LE) und Elastase der Bauspeicheldrüse (PE). Diese Enzyme sind der Grund für den destruktiven Schaden der Zelle und der Venenwände und sind daher der Grund für ernsthafte Erkrankungen. Neben dem am häufigsten beobachteten Lungenemphysem, der aktiven Bauchspeicheldrüsenentzündung und verschiedenen Arthritistypen rufen die oben erwähnten Enzyme hämorrhagische Periodontitis hervor. Dieses stellt den Grund dafür da, warum eine der attraktiven Anwendungen der beschriebenen Verbindungen deren Verwendung als Bestandteile verschiedener Dentalzubereitungen, beispielsweise von Zahnpasta und Mundspülungen, ist. Eine besonders interessante Anwendung wäre die Verwendung dieser wirksamen Inhibitoren als Bestandteile von Kaugummis; die Bestandteile dieser medizinischen Zubereitungen sichern ein konstantes Niveau des aktiven Inhibitors im Mundraum ebenso während der täglichen Arbeit, wenn aus Arbeits- und Zeitgründen die normale Hygienepflege des Dentalraums nicht möglich ist.
Eine weitere potentielle Verwendung von LE-Inhibitoren besteht in der Blockierung der Aktivierung von Pro-Enzymen, beispielsweise Cathepsin B (Biochim. Biophys. Acta 1226, 117–125, 1994) oder in der Inhibierung von Matrixmetallproteinase-3 (MMP-3) – sogenanntes Stromelysin aus dem korrespondierenden Zymogen (FEBS Lett. 229, 353–356, 1989). MMP-3 ist als Schlüsselenzym in der Pathogenese von verschiedenen bösartigen Erkrankungen und ebenso in der multiplen Sklerose (Sclerosis multiplex) bekannt.
Die Garantie für die Abwesenheit des unerwünschten oder toxischen Nebeneffekts der Inhibitoren, wie beschrieben, liegt in der Tatsache, dass diese nur aus physiologischen und somit nichttoxischen Verbindungen synthetisiert werden, was Aminosäuren (Alanin, Prolin, Lysin), höhere Fettsäuren und Bernstein- oder Glutarsäuren bedeutet. Die Verbindungen der allgemeinen Struktur I kann in der Form der freien Säuren oder (aus Gründen der höheren Löslichkeit) in der Form mit Alkalimetallen gebildeten löslichen Salzen, in erster Linie mit Natrium, verwendet werden. Die Synthese der oligopeptidischen Elastaseinhibitoren gemäß der vorliegenden Erfindung einschließlich aller Intermediate wird in den Sche ma 1, 2 und 3 beschrieben. Die fertigen Produkte und Intermediate werden durch ihre Schmelzpunkte (Schmp.) oder durch deren optische Drehungen, in einigen Fällen durch Dünnschichtchromatographie (TLC) charakterisiert. Die Werte sind in den Tabellen I bis VI angegeben.
Die Schlüsselverbindung zur Synthese aller oligopeptidischen Inhibitoren ist Isobutylamid von Alanyl-Alanyl-Prolin (Collection Czechoslov. Chem. Commun. 52, 3034–3041, 1987); die Acylierung der Aminosäuren durch höhere Fettreste wird in dem Patentdokument Nr. CS 280 276 beschrieben. Die Synthese der Intermediate und der fertigen Produkte wird in Lösung durchgeführt und ist aus den Herstellungsbeispielen ersichtlich. Die Evaluierung (Bestimmung der Inhibitorkonstanten Ki) durch menschliche Leukozytelastase wurde unter Verwendung bekannter Verfahren (Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366, 333–343, 1985) durchgeführt, wobei die Ergebnisse der Bestimmungen einiger Verbindungen in Tabelle VII beschrieben sind.
Die folgenden Abkürzungen und Symbole wurden verwendet:
Ala = Alanin
Pro = Prolin
Lys = Lysin
Suc = Succinyl
Glt = Glutaryl
Kpl = Caproyl
Lau = Lauroyl
Myr = Myristoyl
Pal = Palmitoyl
Z = Benzyloxycarbonyl
Boc = Tertbutyloxycarbonyl
iBu = Isobutyl
DCCI N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
OHSuc = N-Hydroxybernsteinsäureimid
EtO-CO-Cl = Ethylchlorformiat
= Bernsteinsäureanhydrid
Die Standardherstellung: das rohe Reaktionsprodukt wurde in AcOEt gelöst und mit 1%iger Zitronensäure extrahiert, gefolgt von der Extraktion mit H₂O, anschließend mit 5%iger NaHCO₃ und wiederum mit H₂O. Das Produkt wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und eingedampft. Das gesamte Eindampfen wurde unter vermindertem Druck in einem Rotationsvakuumverdampfer durchgeführt.
Die Dünnschichtchromatographie (TLC – Silicagel G) wurde in dem System S₁: n-Butanol-Essigsäure-H₂O (4 : 1 : 1) durchgeführt.
Die optische Drehung wurde unter Verwendung des Perkin-Elmer-141-Polarimeters bestimmt. Die Schmelzpunkte wurden auf dem Kofflerblock bestimmt und wurden nicht korrigiert.
Schema 1
Schema 2
Schema 3
Tabelle I
Tabelle I
Tabelle II
Tabelle III
Tabelle IV
Tabelle V
Tabelle VI
Tabelle VII Inhibitorkonstanten (Ki) von menschlicher Leukozytelastase
Beispiele
Beispiel 1
Boc-Lys(Z)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu
Zu der Lösung von Boc-Lys(Z) (20 mmol) und N-Etp (2,8 ml) in DMFA (50 ml), welches auf –10°C abgekühlt wurde, wird EtOCO-Cl (2 ml) zugesetzt; nach 5-minütigem Rühren (–10°C) wurde zu der Reaktionsmischung die Lösung von Ala-Ala-Pro-NH-iBu (6,3 g; 20 mmol) in 20 ml DMFA zugesetzt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang (0°C) gerührt, und anschließend wurde das Rühren für weitere 2 Stunden (Raumtemperatur) fortgesetzt. Danach wurde die Reaktionsmischung eingedampft, der Rückstand wurde in der Mischung von AcOEt und H₂O gelöst, und es folgte das Standardverfahren I. Der Rückstand wurde aus 2-Propanol und Leichtpetroleum kristallisiert. Es wurden 5,7 g des Produkts (Schmelzpunkt 168–170°C) erhalten.
Boc-Lys-Ala-Ala-Pro-NH-iBu
Zu der Lösung von Boc-Lys(Z)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (3,4 g; 5 mmol) in Methanol (300 ml) wurde die Suspension von 5% Pd/C (0,3 g) in Toluol (10 ml) zuge setzt, und die Reaktionsmischung wurde in einem Autoklaven 20 Minuten lang unter dem Druck von 2 MPa hydriert. Nach der Entfernung des Katalysators durch Filtration wurde die Methanollösung eingedampft. Es wurden 2,8 g des Produkts (Schmelzpunkt 150–153°C) erhalten.
Boc-Lys(Pal)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu
Zu der Lösung von Boc-Lys-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (1,1 g; 2 mmol) in DMFA (4 ml) und 1 M NaOH (3,5 ml) wurde Pal-Cl (1 ml) innerhalb von 30 Minuten (Raumtemperatur) zugesetzt; nach einem weiteren 30-minütigen Rühren wurde die Reaktionsmischung angesäuert (10% AcOH, pH 5), und der rohe gebildete Niederschlag wurde mittels Filtration abgetrennt. Es wurden 0,9 g des Produkts (chromatographische Homogenität, R_f = 0,71/S₁) erhalten.
Lys(Pal)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu
Zu der Lösung von Boc-Lys(Z)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (390 mg) in AcOH (0,5 ml) wurde TFA (0,5 ml) zugesetzt. Nach 1-stündigem Stehenlassen der Mischung bei Raumtemperatur wurde sie eingedampft und über P₂O₅ getrocknet. Anschließend wurde das erhaltene Trifluoracetat in Methanol gelöst und unter Verwendung von leicht basischem Anex (L 150) entionisiert. Es wurden 180 mg Produkt (Base, Schmelzpunkt 139–142°C; [α]²⁰ _D –78,3° (c = 0,2; Methanol) erhalten.
Suc-Lys(Pal)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu
Zu der Lösung von Lys(Pal)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (140 mg; 0,2 mmol) in DMFA (20 ml) wurde Bernsteinsäureanhydrid (25 mg) zugesetzt; die Reaktionsmischung wurde bei einer Temperatur von 80°C 30 Minuten lang gehalten, anschließend wurde die Reaktionsmischung eingedampft, und der Gelrückstand wurde aus der Lösung von DMFA und AcOEt kristallisiert. Es wurden 60 mg Produkt (Schmelzpunkt 157–160°C; [α]²⁰ _D –73,5°/c = 0,2; Methanol/) erhalten.
Beispiel 2
Myr-Lys(Z)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (IIc)
Zu der Lösung von Myr-Lys(Z) (5,05 g; 10 mmol) in DMFA (150 ml) wurde HOSuc (1,15 g) in DMFA (20 ml) zugesetzt, und nach dem Kühlen auf 0°C wurde DCCI (2,2 g) zugegeben. Nach 1-stündigem Rühren (0°C) wurde Ala-Ala-Pro-NH-iBu (3,15 g; 10 mmol) in DMFA (25 ml) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 12 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, anschließend wurde AcOH (0,2 ml) zugegeben, und die Reaktionssuspension wurde 30 Minuten lang bei 0°C gehalten. Anschließend wurde sie filtriert, mit DMFA gewaschen und eingedampft. Der gelförmige Rückstand wurde aus heißem DMFA (40 ml) kristallisiert. Es wurden 4,7 g des Produkts (Schmelzpunkt 178–181°C) erhalten. Ein ähnliches Verfahren wurde zur Herstellung der Verbindungen II (a, b, d) verwendet.
Myr-Lys-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (IIc)
Zu der Lösung von Myr-Lys(Z)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (4 g; 5 mmol) in Methanol (300 ml) wurde die Suspension von 5% Pd/C (0,3 g) zugesetzt, und die Hydrogenolyse unter Druck wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt (2 MPa). Es wurden 2,9 g des Produkts (Schmelzpunkt 173-176°C) erhalten. Ein ähnliches Verfahren wurde zur Herstellung der Verbindungen III (a, b, d) verwendet.
Myr-Lys(Suc)-Ala-Ala-Pro-NH-iNH-iBu (IVc)
Zu der Lösung von Myr-Lys-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (1,35 g; 2 mmol) in Dioxan (30 ml) wurde Bernsteinsäureanhydrid (380 mg) zugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten lang unter Rückfluss erwärmt. Nach dem Abkühlen wurden 1,75 g des Produkts (Schmelzpunkt 148–151°C) erhalten. Ein ähnliches Verfahren wurde zur Herstellung der Verbindungen IV (a, b, d) verwendet.
Pal-Lys(Glt)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (IVh)
Zu der Lösung von Pal-Lys-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (2,05 g; 3 mmol) in Dioxan (30 ml) wurde Glutarsäureanhydrid (600 mg) zugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten lang unter Rückfluss erwärmt. Nach dem Abkühlen wurden 2,1 g des Produkts (Schmelzpunkt 124–126°C; [α]²⁰ _D –34,6°/c = 0,2; DMFA/) erhalten. Ein ähnliches Verfahren wurde zur Herstellung der Verbindungen IV (e–g) verwendet.
Beispiel 3
Boc-Lys(Pal-Ala)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (Vd)
Zu der Lösung von Pal-Ala (985 mg; 3 mmol) in DMFA (25 ml) wurde OH-Suc (350 mg) zugesetzt, nach dem Abkühlen auf –5°C wurde DCCI (660 mg) zugegeben, nach 30-minütigem Rühren (–5°C) wurde die Lösung von Boc-Lys-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (1,65 g; 3 mmol) in DMFA (30 ml) zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden lang gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde mittels Filtration abgetrennt, mit DMFA gewaschen, und Wasser (50 ml) wurde zugesetzt. Der Niederschlag wurde mittels Filtration abgetrennt und aus 2-Propanol umkristallisiert. Es wurden 1,75 g Produkt (Schmelzpunkt 146–150°C) erhalten. Ein ähnliches Verfahren wurde zur Herstellung der Verbindungen V (a–c) verwendet.
Lys(Pal-Ala)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (IVd)
Zu der Lösung von Boc-Lys(Pal-Ala)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (1,7 g; 2 mmol) in AcOH (20 ml) wurde die Lösung von 0,6 M HCl/AcOH (4 ml) zugesetzt. Nach 3-stündigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurde das gebildete Hydrochlorid mittels Ether ausgefällt, durch Filtration abgetrennt und in Gegenwart von P₂O₅ und NaOH getrocknet. Anschließend wurde das Hydrochlorid durch stark basisches Anex (Zerolit FF/OH-Zyklus) in Methanol entionisiert. Die Lösung wurde eingedampft, und der Rückstand wurde aus 2-Propanol und Leichtpetroleum kristallisiert. Die Base (820 mg) wurde erhalten (Schmelzpunkt 158–161°C). Ein ähnliches Verfahren wurde zur Herstellung der Verbindungen VI (a–c) verwendet.
Suc-Lys(Pal-Ala)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (VIId)
Zu der Lösung von Lys(Pal-Ala)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (750 mg; 1 mmol) in DMFA (20 ml) wurde Bernsteinsäureanhydrid (160 mg) zugesetzt. Nach 2-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Produkt durch Zugabe von H₂O (50 ml) ausgefällt und aus 2-Propanol und AcOEt kristallisiert. Es wurden 690 mg des fertigen Produkts erhalten (Schmelzpunkt 171–174°C). Ein ähnliches Verfahren wurde zur Herstellung der Verbindungen VII (a–c) verwendet.

Claims

Oligopeptidische Elastaseinhibitoren der allgemeinen Struktur I:
worin X A oder B bedeutet, Y A oder B oder A-Ala bedeutet, und wenn Y A-Ala ist, X B bedeutet, A eine gesättigte Säure mit 8 bis 16 Kohlenstoffatomen bedeutet, B den 3-Carboxypropionyl- oder 4-Carboxybutyroyl-Rest bedeutet.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Struktur I nach Anspruch 1, worin Y B ist, dadurch gekennzeichnet, dass Lysin mit geschützten Amino-Gruppen mit einer Verbindung der Formel: Ala-Ala-Pro-NH-iBu in Kontakt gebracht wird, die ε-Aminogruppe des Produkts entschützt wird, das resultierende Produkt mit einer Verbindung der Formel: A-X¹, worin A wie in Anspruch 1 definiert ist und X¹ ein Halogen darstellt, umgesetzt wird, die α-Aminogruppe entschützt wird und die resultierende Verbindung der Formel Lys(A)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu mit Bernsteinsäure- oder Glutarsäureanhydrid in Kontakt gebracht wird.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Struktur I nach Anspruch 1, worin Y A bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel A-Lys(W), worin W eine Schutzgruppe ist und A nach Anspruch 1 definiert ist, mit einer Verbindung der Formel: Ala-Ala-Pro-NH-iBu in Kontakt gebracht wird, das Produkt entschützt wird und die resultierende Verbindung der Formel A-Lys-Ala-Ala-Pro-NH-iBu mit Bernsteinsäure- oder Glutarsäureanhydrid in Kontakt gebracht wird.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Struktur I nach Anspruch 1, worin Y A-Ala ist, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel A-Ala mit einer Verbindung der Formel: W-Lys-Ala-Ala-Pro-NH-iBu, worin W eine Schutzgruppe ist und A wie in Anspruch 1 definiert ist, in Kontakt gebracht wird, das Produkt entschützt wird und die resultierende Verbindung der Formel Lys(A-Ala)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu mit Bernsteinsäure- oder Glutarsäureanhydrid in Kontakt gebracht wird.