CZ131597A3

CZ131597A3 - Oligopeptidické inhibitory elastáz

Info

Publication number: CZ131597A3
Application number: CZ971315A
Authority: CZ
Inventors: Evžen Ing. Csc. Kasafírek; Pavel Pihera; Antonín Ing. Šturc; Aleksi Doc. Mudr. Csc. Šedo
Original assignee: Vúfb, A. S.
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1997-04-30
Publication date: 1998-11-11
Also published as: JP2002511848A; CZ285911B6; DE69827618D1; AU6819798A; DE69827618T2; EP0979245A1; WO1998049197A1; EP0979245B1

Description

Vynález se týká oligopeptidických inhibitorů elastáz, avlástě pak leukocytární elastázy (LE). Elastolytické enzymy, např. DE anebo pankreatická elastáza (PE) náleží k serinovým proteinázám, které narušují (degradují) přírodní substrát elastin; elastin tvoří podstatnou část bílkovinné hmoty organizmu. Ve zdravém organizmu je tato destrukční aktivita inhibována endogenními enzymy, např, X-^ proteinásovým inhibitorem (e^-^PI). V případě nedostatku X-^PI z různých příčin (infekce, výživa, pracovní prostředí, dědičnost) nastává autodigesce životně důležitých, orgánů LE a ΓΕ a tím ku vzniku společenských závažných chorob, jakou je např. akutní pankreatitida, plicní emfyzém, artritida nebo gingivitida.

Dosavadní stav techniky

Jednou z možností dosáhnout homoestáze, tj. rovnováhy mezi elastázou a odpovídajícím endogenním inhibitorem (v případe patogenního stavu), je substituční terapie, tj, aplikace exogenního přírodního anebo syntetického inhibitoru typu c(--jPI. Tento způsob je prakticky prováděn aplikai L R í?

cí Λ--.ΡΙ, jednak přírodního (Antilysin ., Trasylol , Contrykal ) anebo např. syntetického inhibitoru typu Nafamstat mesylát, PUT (Tori Co, Tokyo, Japan), V nedávné minulosti původci navrhli syntetický účinný inhibitor v terapiú akutní pankreatitidy Glt-Ala^-NEEt, Inpankin VÚPB 16834 (Gut 33, 701-706 (1992)).

Vážným nedostatkem izolovaných (přírodních) inhibitorů je jich antigenita, (X-^PI je druhově specifický) ale i event. kontaminace bovinní spongiforianí encefalopatií (BES). Naopak syntetické nízkomolekulární inhibitory, postrádají tyto vedlejší účinky, jsou účinnější a stabilnější. Jejich · chemická struktura je přesně definována a charakterizována, chemicky i fyzikálně.

Podstata’ vynálezu

Vynález se týká oligopeptidických inhibitorů elastáz obecného vzorce I

Y - Mí (1),

X - Mí

CO - Ala - Ala - Pro - IÍH - iBu kde X značí A nebo B, přičemž A se liší od B,

Y značí A nebo B nebo A-Ala, přičemž A se liší od B, a je-li A-Ala, pak X značí B,

A znáči nasycenou kyselinu s δ až 16 atomy uhlíku,

B značí zbytek ř-karboxypropionylu nebo 4-karboxybutyroylu.

Sloučeniny obecného vzorce I jsou účinné kompetitivní inhibitory serinových proteináz, zvláště pak leukocytární elastázy (LS) a pankreatické elastázy (EE). Tyto enzymy destruktivně poškozují buněčné a cévní stěny a jsou příčinou závažných onemocnění. Vedle nejčastěji sledovaného plicního emfyzému, akutní pankreatitidy, různých typů artritid, jsou to hemoragické záněty periodontu; proto jednou z atraktivních aplikací je použití těchto.sloučenin jako přísady do různých dentálních přípravků, např. zubních past, zubních ústních vod. Zvláště zajímavou aplikací je použití těchto účinných inhibitorů jako přísad do zubních žvýkacích gum; přísady v těchto medicinálních přípravcích zaručují konstantní hladinu účinného inhibitoru v ústní dutině i v denním pracovním režimu, kdy z časových a pracovních důvodů není možné zubní chrup spolehlivě hygienicky ošetřit standardním způsobem (kartáčkem a zubní pastou).

ate

H

Zcela v neposlední řade je potenciální uplatnění inhibitorů LE při blokádě aktivace pro-enzymů, např. katiiepsinu B (Biochim. Biophys. Acta 1226, 117-125 (1994) anebo inhibici matrix metaloproteinázy j (MřďP-5) tzv, stromelysinu z odpovídajícího zymogenu (PEB3 Lett. 249, 555-558 (1989)). MMP-5 je známa jako klíčový enzym v patogenezi maligního onemocnění a rozbušené sklerózy (sclerosis multiplex).

Protože účinné inhibitory jsou syntetizovány výhradně z fyziologických, tudíž netoxických komponent, tj, aminokyselin (alaninu, prolinu a lysinu) vyšších mastných kyselin a kyseliny jantarové či glutarové, jsou dostatečné záruky jejich zdravotní nezávadnosti.

Sloučeniny obecného vzorce I lze používat ve formě volných kyselin, resp. z důvodů vyšší rozpustnosti ve formě rozpustných solí, např. s alkalickými kovy, zejména sodnou.

Syntéza oligopeptidických inhibitorů elastázy. podle vy·* nálezu včetně všech meziproduktů, je vyznačena schématy 1, 2 a 5· Konečné sloučeniny a meziprodukty jsou charakterizovány teplotou tání (t.t.), případně optickou rotací anebo i chromatografií na tenké vrstvě (TLC) a hodnoty jsou vyznačeny v tabulkách I až VI.

Klíčovou sloučeninou pro syntézu všech oligopeptidických inhibitorů je isobutylamid alanyl-alanyl-prolinu (Collection Czechoslov. Chem. Commun. 52, 5054-5041 (1987); acylace aminokyselin vyššími mastnými zbytky je popsána v patentovém spise č. CS 280 726. Vlastní syntéza meziproduktů a konečných látek je provedena syntézou v roztoku a je zřejmá z příkladů provedení. Hodnocení (stanovení inhibiČních konstant Ki) lidskou leukocytární elastázou bylo provedeno známým způsobem (Biol. Chem. Eoppe-Seyler 566, 555-545 (1985)) a výsledky stanovení některých sloučenin jsou vyznačeny v tabulce VII.

Použité zkratky a symboly mají následující význam:

Ala = alanin Pro - prolín Lys = lysin Suc = suke iny 1

Kpl = kaproyl Lau = lauroyl Myr = myristoyl Pal - palmitoyl

Git = glutaryl z = benzyloxykarbonyl Suc - 0 = anhydrid

Boc = terč.butyloxykarbonyl kyseliny jantarové iBu = is o butyl

AcOK = kyselina octová

DMPA = α ime thyf ormamid

AcOEt = octan ethylnatý

DCCI = N,N-dicyklohexylkarbodiimiá

OHSuc = N-hydroxysukcinimid

EtO-CO-Cl = chlormravenčan ethylnatý

Standardní způsob přípravy: surový reakční produkt se rozpustí v AcOEt a postupně se vytřepe 1% kyselinou citrónovou, vodou, IíaHCOj, vodou, vysuší bezvodým a odpaří.

Veškerá odpařování se prováděla za sníženého tlaku na rotační vakuové odparce.

Chromatografie na tenké vrstvě (TLC- silikagel G) byla provedena v soustavě S-^: n-butanol - kyselina octová - voda (4:1:1)

Optická rotace byla změřena nejpoiarimetru Perkin-Elmer 141. T.t. byly stanoveny na Koflerově bloku a nebyly korigovány.

Schéma 1

Boc-Lys(Z) + Ala-Ala-Pro-IíH-iBu

I

Boc-Lys (Z ) -A la -A la -Pr o-NH-iBu.

Boc-Iys-A la-A la-Pro-NH-iBu j Pal-Cl

Boc -Lys ( Pa 1) -A la-A la-Pr o-Iffi-iB a | TPA/anex L 150

Lys (Pa 1) -Ala-A la-Pro-NH-iBu.

)i—1

Suc-0

Suc-lys (Pa 1) -A la -A la-Pro-NH-iBu I

.....e r ’ —* * > :

“ *n>*· ...»

Schéma 2

A - Lys(Z) - Ala - Ala - Pro - KH - iBu H₂/Pd Il(a-d)

A - Lys - Ala - Ala - Pro - NH - iBu i-1 íú — 0 , iil(a-d)

Π,

A - Lys(M) - Ala - Ala	- Pro - NE - IV(a-h) '	iBu
III	A	IV	A	M
	Kpl	a	Kpl	Suc.
	Lan	b	Lau	Suc
	Myr	c	Myr	Suc
	Pal	a	Pal	Suc
		e	Kpl	Git
		f	Lau	Git
		g	Myr	Git
		h	Pal	Git

Schéma 3

Boc - Lys -Ala - Ala - Pro - NH - iBu

I

Boc - Lys(B) - Ala - Ala - Pro - NH - iBu _; V(a-d) j 1) HCl/AcOH 2) auex (Zerolit)

Lys(B). - Ala - Ala - Pro - NH - iBu ^r—¹

Vl(a-d) { Suc - O

Suc - Lys(B) - Ala - Ala - Pro - NH - iBu Vll(a-d)

V, VI, VII	B
a	Kpl-Ala ’
b	Lau-Ala
c	iíyr-A la
a	Pal-Ala

Tabulka I

Il(a-o)Τ,ί, °C

a Kpl-Lys(Z)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu	205-205
b Lau-Lys(Z)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu	188-190
c iiáyr-Lys(Z)-Ala-Ale-Pro-NK-iBu	178-181
d Pcl-Lys(Z)-Ala-Al5-Pro-NH-iBu	169-172
Tabulka II
Ill(a-d)	T.t. °C
a Kpl-Lys-Ala-Ala-Pro-NH-iBu	177-181
b Lau-Lys-Ala-Ala-Pro-KH-iBu	185-185
c Myr-Lys-Ala-Ala-Přo-NE-iBu	175-176
d Pal-Lys-Ala-Ala-Pro-KH-iBu	154-158
Tabulka III
IV(a-h)	T.t. °c
a Kpl-Lys(Suc)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu	141-144
b Lau-Lys(Suc)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu	145-145
c Myr-Lys(Suc)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu	148-151
d Pal-Lys(Suc)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu	142-144
e Kpl-Lys(Glt)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu	126-128
f Lau-Lys(Glt)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu	152-155
g Myr-Lys(Glfc)-Ala-Ala-Pro-HH-iBu	147-150
h Pal-Lys(Glt)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu	124-126
Tabulka IV
V(a-d)	^JT.t. °C
a Boc-Lys(Kpl-Ala)-Ala-Ala-Pro-NE-	iBu 179-182
b Boc-Lys(Lau-Ala)-Ala-Ala-Pro-NH-	iBu 181-184
c Boc -Lys (Myr-A la) -A la -A la-Pro-NH-	•iBu 155-155
d Boc -Lys (Pa 1 -A la ) -A la -A la -Pr o -NH-	•iBu 146-150

Tabulka V

Vl(a-č) a Lys (Kpl-A la) -A la -Ala-Pro-NH-i3u b Lys(Lau-Al3)-Al3-Ala-?ro-NH-iBu c Lys(Myr-Al3)-Ala-Al3-?rc-NH-iBu a Lys(?3l-Ala)-Ala-Ala-?ro-NIí-iBu

4-L · u « V

185-168

139-191

164-13?

156-161

Tabulka VI V.II(a-ó) a Suc-Lys (Kpl-A la )-A la-A la-Pr o-KS-iBu 182-135 b Suc-Lys(Lau-Ala)-Ala-Ala-?ro-IíK-iBu 188-169 c Suc-Lys(Myr-Ala )-Ala-Alá-?ro-KS-i3u 181-184 d Suc-Lys(?al-Ala)-Ala-Ala-?ro-KK-iBu 171-174

Tabulka VII

Inhibiční konstanty (Ki) lidské leukocyfcární elastasy

lila	Kpl-Lys-A la-Ala-Prο-Νϋ-iBu	2,27.10^-5 M
IVa	Kpl-Lys (Suc) -A la-Ala-Pro-KH-iBu	4,50.10^-5 M
IVb	La u-Lys (Suc ) -A la-A la -?ro-NK-iBu	5,52.ΙΟ⁶ M
IVc	My r-Ly s (S uc) -A la -A la -?r o-KS- iBu	6,82.10^-6 M
IVe	Kpl-Lys (Gl fc ) -A la -A la -Pro -NH-iBu	9,96.1c⁶ li
IVf	Lau-Iy s (Git) -A la -A la-Pr o-NH-iBu	7,55.10^-6 M
Tvh	Pa 1-Lys(G1fc) -A la -A la -Př o-KH-iBu	1,46.10^-5 M
VIb	Lys (La u-A la) -A la -A la -?ro-NH-iBu	5,58.10^-7 M
Vllb	S uc -Lys (La u-A la ) -A la -A la -Pr o-NK-	iBu 5,92.10^-7 M
Vid	Lys (Pal-A la) -A la-A la-?ro-NH-iBu	2,47.10^-5 M
Vild	S uc -Ly s (P al -A la ) -A la -A la -Př o- NB-	iBu 1,19.10^-5 M

Příklady provedení

Příklad 1

Boc -Lys ( Z) -A la -A la -Pr· o-NH-iBu

K roztoku Boc-lys(Z) (20 mmolů) a N-Stp (2,8 ml) v

DMPA (50 ml) ochlazenému na -10 °C byl přidán EtOCO-Cl (2 ml); po 5min míchání a chlazení (-10 °C) byl k reakčnímu roztoku přidán roztok Ala-Ala-Pro-EH-iBu (6,3 g; 20 mmolů) v DMFA (20 ml). Po 30 min míchání při 0 °C a 2 h při teplotě místnosti byl reakční roztok odpařen, odparek rozpuštěn ve směsi AcOEt a vody a standardním způsobem I zpracován. Pevný odparek byl krystalován z 2-propanolu a petroletheru. Bylo získáno 5)7 g produktu o t.t. 168-170 °C.

Boc -Lys-Ala-Ala-Pro-ME-iBu

K roztoku Boc-Lys(Z)-Ala-Ala-Pro-iíE-iBu (3,4 g; 5 mmolů) v methanolu (300 ml) byla přidána suspenze 5% Pd/C (0,3 g) v toluenu (10 ml) a reakční směs byla hydrogenována v autoklavu 20 min při tlaku 2 MPa, Po odfiltrování katalyzátoru byl methanolický roztok odpařen. Bylo získáno 2,8 g o t.t, 150-153 °C

Boc-Lys(Pal)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu

K roztoku Boc-Lys-Ala-Ala-Pro-HE-iBu (1,1 g; 2 mmoly) v v DMFA (4 ml) a 1 M NaOH (3,5 ml) bylo při teplotě místnosti přidáno během 30 m/Pal-01 (1 ml); po dalších 30 min míchání byl reakční roztok okyselen 10% AcOE (pH 5) a vyloučená hrubozrnná sraženina byla odfiltrována. Bylo získáno 0,9 g chroh matograficky homogenního produktu ( R^ = 0,71/sp.

Ly s ( Pa 1)-A la-A la-Pr o-NH-iB u

K roztoku Boc-Lys(Z)-Ala-Ala-Pro-EH-iBu (390 mg) v AcOE (0,5 ml) byl přidána TFA (0,5 ml). Po 1 h stání při teplotě místnosti byl reakční roztok odpařen a vysušen nad kysličníkem fosforečným. Potom byl získaný trifluoracetát rozpuštěn v methanolu a deionizován na slabě basickém anexu (L 150), Bylo získáno 180 mg produktu (báze) o t.t. 139-142 °C;

-78,3 ° (c - 0,2; methanol).

uc -lys (Pa 1) -A la-A la-?ro-KE-iBu

K roztoku Lýs(Psl)-Ala-Ala-Pro-NK-i3u (140 mgp,2 mmoly) v DMPA (20 ml) byl přidán k reakčnímu roztoku anhydrid kyseliny jantarové (25 mg); po 30 min zahřívání při SO °C byl reakční roztok odpařen a gelovitý odparek byl krystalován z rotoku DMEA a AcOEt. Bylo získáno 60 mg produktu o t.t. 157-160 °C; A7|° -73*5 ° (c = 0,2; methanol)·»

Příklad 2

Myr-Lys ( Z ) -A la -A la -Pro-NH- iB u (I Ic )

K roztoku Myr-Lyz(Z) (5,05 g; 10 mmolů) v BMEA (150 ml) byl přidán HOSuc (1,15 g) v DIvIEA (20 ml); po ochlazení na O °C byl přidán DCCI (2,2 g). Po 1 h míchání a chlazení (0 °C) byl přidán Ala-Ala-Pro-HH-iBu (3,15 g; 10 mmolů) v DMEA (25 ml).

-Po 12 h stání při teplotě místnosti bylo k reakčnímu roztoku přidáno AcOH (0,2 ml) a reakční suspense po 30 min uložení při 0 °G byla sfiltrována a promyta DMEA, a odpařeni Gelovitý odparek byl krystalován z horkého DMEA (40 ml). Bylo' získáno

4,7 g produktu, o t.t. 178-131 °C. Obdobným způsobem byly připraveny sloučeniny II(a,b,d)

Myr-Lys-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (IIIc)

K roztoku Myr-Lys(Z)-Ala-Ala-Pro-l'JH-iBu (4 g; 5 mmolů).

v methanolu (300 ml) byla přidána suspenze 5% Pd/C (0,3 g) a tlaková hydrogenolyza byla provedena obdobně (2 MPa) jak je uvedeno v příkladě 1, Bylo získáno 2,9 g produktu o t.t.' 173-176 °C. Obdobným způsobem byly připraveny sloučeniny III(a,ty3).

Myr-Ly s(S uc)-A1a-A1a -Pr o -NH- iNH- iB u (IV c )

K roztoku Myr-Lys-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (1,35 g;2 mmoly) v dioxanu (30 ml) byl přidán anhydrid kyseliny jantarové (380 mg) a reakční roztok byl 30 min zahříván pod zpětným chladičem. Po ochlazení'bylo získáno 1,75 g produktu o t.t. 148-151 °C. Obdobným způsobem byly získány sloučeniny IV(a,b,d),

Pa 1-Lys(G1t )-Ala-Ala-Pro-KH-iBu (IVh)

K roztoku Pal-Lys-Ala-Ala-Pro-KH-iBu (2,05 g; 3 mmoly) v dioxanu (30 ml) byl přidán anhydrid kyseliny glutarové (600 mg) a reakční roztok byl zahříván 30 min pod zpětným chladičem; po ochlazení bylo získáno 2,1 g produktu o t.t. 124-126 °C. -34,6° (c = 0,2; DkPA). Obdobným způsobem byly připraveny sloučeniny ±V(e-g).

Příklad 3

Boc-Lys(Pal-Ala)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (Vd) £ roztoku Pal-Ala (985 mg; 3 mmoly) v DMPA (25 ml) byl přidán OHSuc (350 mg) a po ochlazení na -5 °C byl k reakčnímu roztoku přidán DCCI (660 mg); po dalších 30 min míchání a chlazení (-5 °C) byl přidán roztok Boc-Lys-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (1,65.g.; 3 mmoly) v DivlPA (30 ml). Po 3 h míchání při teplotě

Ί · ·.

místnosti byla vyloučená sraženina odfiltrována, promyta ĎívIPA a k nekrystalickému odparku byla přidána voda (50 ml). Vyloučená sraženina byla odfiltrována a byla krystalována' z 2-propanolu. Bylo získáno 1,75 S produktu o t.t. 146-150 °C. Obdobným způsobem byly získány sloučeniny V(a-c).

Lys(Pal-Ala)-AIa-Ala-Pro-NH-iBu (Vid) £ roztoku Boc-Lys(Pal-Ala)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu (1,7 g;

mmoly) v AcOH (20 ml) byl přidán roztok 0,6 M ECl/AcOH (4. ml). Po 3 h stání při teplotě místnosti byl vzniklý hydrochlorid vysrážen etherem, odfiltrován a vysušen nad kysličníkem fosforečným a NaOH. Potom byl hydrochlorid deionizován silně basickým anexem (Zerolit PP/OH-cykl) v methanolu, roztok byl odpařen a pevný odparek byl krystalován z 2-propanolu a petroletheru. Byla získána baze (820 mg) o t.t, 158-161 °C. Obdobným způsobem byly připraveny sloučeniny Vl(a-c).

!

S uc-Ly £( Pa 1-A la ) -A la -A la -Pr o~NH-iBu (Vild)

K roztoka Lys(Pal-Ala)-Ala-Ala-?ro-KH-iBu (750 mg;

mmol) v DtóPA (20 ml) byl přidán anhydrid kyseliny jantarové (160 mg). Po 2 h míchání při teplotě místnosti byl produkt vysrážen přídavkem vody (50 ml) a krystalován z 2-propanolu a AcOSfc. Bylo získáno 690 mg konečného produkty o t.t. · 171-174- °C. Obdobným způsobem byly připraveny sloučeniny Vll(a-c).

Claims

PATENTOVÁ NÁROKY obecného vzorce I o

Oiigopeptidické inhibitory elastáz kde X značí A nebo 3, přičemž A se liší od 3,

Ϊ značí A nebo B nebo A-Ala, přičemž A se liší od B., a je-li A-Ala, pak X značí B,^ .

A znáči nasycenou kyselinu s 8 až ló -atony- uhlíku,

B značí zbytek 2-karboxypropionylu nebo 4-karboxybutyroylu