DE69823787T2 - Picolinsäure-Derivate zur Behandlung von IL-1 und TNF bedingten Erkrankungen - Google Patents

Picolinsäure-Derivate zur Behandlung von IL-1 und TNF bedingten Erkrankungen Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue 5-substituierte Picolinsäureverbindungen und insbesondere auf neue 5-substituierte Picolinsäureverbindungen, die durch Fermentation eines Fungus Marasmiellus sp., produziert werden, der als FERM BP-5735 hinterlegt wurde. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zur Herstellung der 5-substituierten Picolinsäureverbindungen und eine pharmazeutische Zusammensetzung, die dieselben umfasst und die bei der Behandlung von Krankheiten, die durch IL-1 und TNF vermittelt werden, nützlich ist.
  • Stand der Technik
  • Interleukin-1 (IL-1) und Tumornekrosefaktor (TNF) sind biologische Substanzen, die durch eine Vielzahl von Zellen wie zum Beispiel Monocyten oder Macrophagen, produziert werden. Es wurde bewiesen, dass IL-1 und TNF eine Vielzahl biologischer Aktivitäten vermitteln, von denen angenommen wird, dass sie bei der Immunregulierung und anderen physiologischen Zuständen bzw. Krankheitsbildern, zum Beispiel Entzündung, wichtig sind.
  • Es gibt viele Krankheitszustände, bei denen eine übermäßige oder unregulierte IL-1-Produktion bei der Verschlimmerung und/oder Verursachung der Krankheit impliziert ist. Diese umfasst rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Endotoxemie und/oder Syndrom des toxischen Schocks, andere akute oder chronische inflammatorische Krankheitszustände wie zum Beispiel inflammatorische Reaktion, induziert durch Endotoxin, oder inflammatorisches Bowel-Syndrom; Tuberkulose, Athe rosklerose, Muskeldegeneration, Kachexie, psoriatische Arthropatie, Reiter-Syndrom, rheumatoide Arthritis, Gicht, traumatische Arthritis, Rubella-Arthritis und akute Synovitis. Jüngere Beweise stellen auch eine Verbindung zwischen IL-1-Aktivität und Diabetes her (T. Mandrup-Poulsen et al., Allergy, 1985, 40, 424). Der einzige IL-1-Blocker, der derzeit verfügbar ist, ist der natürliche IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1RA), der in einfacher Weise mit sehr kurzer Halbwertszeit im Blutstrom metabolisiert wird (E. V. Granowitz et al., Cytokine, 1992, 4, 353). Somit wurden aktive Forschungen durchgeführt, um stabile, langanhaltende Agenzien zu entwickeln, die durch orale Verabreichung oder parenterale Injektionen anstatt durch intravenöse Infusion, die für IL-1RA erforderlich ist, genommen werden können. Es wurde eine Reihe von Verbindungen als IL-1-Rezeptorantagonisten, IL-1-Biosytheseinhibitoren und IL-1-Konvertierungsenzyminhibitoren bekannt (C. C. George et al., Exp. Opin. Ther. Paten, 1996, 6 (1), 41).
  • Übermäßige oder unregulierte TNF-Produktion war auch bei der Vermittlung oder Verschlimmerung einer Reihe von Krankheiten impliziert; diese umfassen rheumatoide Arthritis, rheumatoide Spondylitis, Osteoarthritis, Gichtarthritis und andere arthritische Krankheitsbilder; Sepsis, septischer Schock, endotoxischer Schock, grammnegative Sepsis, Syndrom des toxischen Schocks, Schocklunge, cerebrale Malaria, chronische Lungenentzündung, Silikose, Lungensarcoisose, Knochenresorptionskrankheiten, Reperfusionsverletzung, erworbenes Immundefektsyndrom (AIDS), AIDS-related Komplex (ARC), Keloidbildung, Narbengewebebildung, Crohnsche Krankheit, ulceröse Colitis oder Pyresis. Obgleich deutliche Fortschritte bei der Entwicklung wirksamer TNF-Modulatoren durch die Verwendung rekombinant abgeleiteter Proteine, einschließlich monoklonaler Antikörper und löslicher Rezeptoren, erreicht wurden, war die Entwicklung von Biosyntheseinhibitoren und Rezeptorantagonis ten weniger erfolgreich. Kürzlich wurde eine Reihe von kleinen Molekülen als TNF-Modulatoren beansprucht. Die meisten von diesen, die eine TNF-Produktion spezifisch hemmen, tun dies, indem sie intrazelluläres cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) erhöhen, das letztlich die TNF-Genexpression blockiert (Y. KATAKAMI et al., Immunology, 1988, 64, 719). Die wichtigsten dieser Verbindungen sind die mit Rolipram und Pentoxyfyllin verwandten Inhibitoren für Phosphodiesterase IV (PDE IV), die von einer Reihe pharmazeutischer Firmen im Handel sind (A. BADGER et al., Circul. Shock, 1994, 44, 188). Die Fähigkeit von Thalidomid, die TNF-Produktion zu blockieren, trägt zu seinen therapeutischen Eigenschaften bei Menschen bei (E. P. SAMPAIO et al., J. Exp. Med, 1991, 73, 699). Jüngste Untersuchungen legen nahe, dass zellassoziierter TNF für normale Wirtsabwehrmechanismen notwendig sein kann. Diese Erkenntnis trug zu der Aufregung bezüglich der Identifizierung eines einzigen Metalloproteinaseenzyms, das für die proteolytische Prozessierung von TNF verantwortlich ist, bei. Es traten Inhibitoren für das mit Matrixmetalloproteinase verwandte Enzym auf (K. M. MOHLER et al., Nature, 1994, 370, 218).
  • Inhibitoren von Interleukin 1, 6 und 8 und TNF werden in der PCT-Anmeldung US94/07969 beschrieben, welche am 26. Januar 1995 als WO-A-95/02591 veröffentlicht wurde. Die TNF-Inhibitoren werden auch in der PCT-Anmeldung US94/04950 beschrieben, welche am 24. November 1994 als WO-A-94/26277 veröffentlicht wurde. Es wurden substituierte Picolinsäureverbindungen bekannt, die von Pilzen bzw. Fungus produziert werden. Diese umfassen Phenopicolinsäure (5-(4-Hydroxybenzyl)picolinsäure) (T. Nakamura et al., J. Antibiotics, 27: 477-, 1975), Fusarinsäure (5-Butylpicolinsäure) (H. Hidaka et al., J. Antibiotics, 22: 228-, 1969) und Fusarinolsäure (K. Steiner et al., Helv. Chim., Acta, 54: 845-, 1971).
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung neuer 5-substituierter Picolinsäureverbindungen mit ausgezeichneten Aktivitäten zur Inhibierung der TNF- und/oder IL-1-Biosynthese und einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die dieselben umfasst. Eine andere Aufgabe besteht in der Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung der neuen 5-substituierten Picolinsäureverbindungen.
  • Kurze Offenbarung der Erfindung
  • Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung neue 5-substituierte Picolinsäureverbindungen der Formel (I):
    Figure 00040001
    oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon bereit, wobei R1 und R2 unabhängig voneinander H, C2-C6-Acyl oder Halogensubstituiertes Benzoyl sind und R3 -C(O)O-C1-C6-Alkyl, C(O)OH, CN, CONH2, CONHCH3, CON(CH3)2, 1-Methyltetrazol oder 2-Methyltetrazol ist, mit der Maßgabe, dass, wenn R2 Acetyl ist und R3 Methoxycarbonyl ist, R1 nicht H ist, und dass, wenn R3 CN, CONH2, CONHCH3, CON(CH3)2, 1-Methyltetrazol oder 2-Methyltetrazol ist, R1 und R2 H sind.
  • Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind solche der oben dargestellten Formel (I), wobei R3 -C(O)O-C1-C6-Alkyl oder C(O)OH ist, mit der Maßgabe, dass, wenn R2 Acetyl ist und R3 Methoxycarbonyl ist, R1 nicht H ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Kultur von Marasmiellus sp. FERM BP-5735 bereit, die fähig ist, die 5-substituierten Picolinsäureverbindungen, speziell solche der Formel (I), worin R1 und R2 H sind und R3 Methoxycarbonyl ist (Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat), oder R1 Acetyl ist, R2 H ist und R3 Methoxycarbonyl ist, (Methyl-5-(1-acetoxy-2-hydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat), zu produzieren.
  • Darüberhinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der 5-substituierten Picolinsäureverbindungen der Formel (I) bereit, das Kultivieren eines Mikroorganismus mit identifizierenden Charakteristika von Marasmiellus sp., FERM BP-5735 oder einer mutanten oder einer rekombinanten Form davon umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit, das außerdem die zusätzlichen Schritte einer Isolierung der 5-substituierten Picolinsäureverbindungen aus der Fermentationsbrühe und einer chemischen Modifizierung der isolierten Verbindungen umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Behandlung von durch IL-1 und/oder TNF vermittelten Krankheiten bereit, welche die 5-substituierten Picolinsäureverbindungen der Formel (I), worin R1 und R2 H sind und R3 Methoxycarbonyl ist, (Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat); R1 Acetyl ist; R2 H ist und R3 Methoxycarbonyl ist, (Methyl-5-(1-acetoxy-2-hydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat); R1 und R2 H sind und R3 C(O)OH ist, (5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarbonsäure), oder R1 und R2 Acetyl sind und R3 Methoxycarbonyl ist, (Methyl-5-(1,2-diacetoxypropyl)-2-pyridincarboxylat) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz in einer Menge, die in solchen Behandlungen wirksam ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
  • Ferner wird in der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer Verbindung der Formel (I), worin R1 und R2 H sind und R3 Methoxycarbonyl ist, (Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat); R1 Acetyl ist; R2 H ist und R3 Methoxycarbonyl ist, (Methyl-5-(1-acetoxy-2-hydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat); R1 und R2 H sind und R3 C(O)OH ist, (5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarbonsäure), oder R1 und R2 Acetyl sind und R3 Methoxycarbonyl ist, (Methyl-5-(1,2-diacetoxypropyl)-2-pyridincarboxylat), oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von durch IL-1 und/oder TNF vermittelten Krankheiten bereit gestellt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Mikroorganismus ist ein Marasmiellus sp.-Stamm, der von der University of Tennessee identifiziert wurde und auch erhalten wurde. Er wurde von Pfizer Pharmaceutical Inc., Mitsui Building, Nishishinjuku 2-chome, Shinjuku-ku, Tokio 263, Japan, unter der Zugriffsnummer FERM BP-5735 am National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Adresse: 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki 305, Japan) gemäß dem Budapester Vertrag vom 29. Oktober 1996 hinterlegt. Die taxonomischen Eigenschaften der Gattung Marasmiellus wurden von Singer R. (in The Agaricales in modern taxonomy, 320–328, 1986) beschrieben.
  • In der vorliegenden Erfindung kann auch eine mutante oder eine rekombinante Form vom FERM BP-5735 verwendet werden, die die Fähigkeit hat, die neuen 5-substituierten Picolinsäureverbindungen der Formel (I) zu produzieren. Die mutante oder die rekombinante Form kann durch spontane Mutation, künstliche Mutation mit ultravioletter Strahlung oder durch Behand lung mit einem Mutagen, wie zum Beispiel N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin oder Ethylmethansulfonat, oder ein Zelltechnologieverfahren, wie zum Beispiel Protoplastenfusion, Genmanipulation oder dergleichen nach gut bekannten Verfahren erhalten werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können die neuen 5-substituierten Picolinsäureverbindungen der Formel (I) durch aerobe Fermentation von FERM BP-5735 oder einer mutanten oder einer rekombinanten Form davon unter Bedingungen, die ähnlich den Bedingungen sind, die im Allgemeinen zur Herstellung bioaktiver Verbindungen durch Fermentation verwendet werden, produziert werden.
  • FERM BP-5735 oder eine mutante oder eine rekombinante Form davon wird üblicherweise unter aeroben Tauchbedingungen bei Rühren und bei einer Temperatur von 20 bis 40°C für 1 bis 20 Tage, was entsprechend den Fermentationsbedingungen variiert werden kann, fermentiert. Eine Kultivierung von FERM BP-5735 zur Herstellung der 5-substituierten Picolinsäureverbindungen der Formel (I) erfolgt vorzugsweise in wässrigen Nährstoffmedien bei einer Temperatur von 25 bis 35°C für 10 bis 15 Tage. Der pH des Mediums kann im Bereich von 4,0 bis 9,0, vorzugsweise von 5,5 bis 7,0 eingestellt werden.
  • Nährstoffmedien, die zur Fermentation nützlich sind, umfassen eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, zum Beispiel Zucker, Stärken und Glycerin; eine Quelle für organischen Stickstoff, zum Beispiel Casein, enzymatischer Caseinverdau, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnussmehl, Weizengluten, Sojamehl, Fleischextrakt und Fischmehl; eine Quelle für Wachstumssubstanzen, zum Beispiel Mineralsalze, Natriumchlorid und Calciumcarbonat; und Spurenelemente wie zum Beispiel Eisen, Magnesium, Kupfer, Zink, Kobalt und Mangan. Wenn einem übermäßigen Schäumen während der Fermentation entgegengewirkt wird, können Antischaummittel wie Polypropylenglycole oder Silikone dem Fermentationsmedium zugesetzt werden.
  • Eine Belüftung des Mediums in Fermentern für Tauchwachstum wird bei 10 bis 200%, vorzugsweise 50 bis 100% Volumina an steriler Luft pro Volumen des Mediums pro Minute gehalten. Die Rührgeschwindigkeit hängt vom verwendeten Rührtyp ab. Ein Schüttelkolben wird üblicherweise mit 150 bis 250 Upm bewegt, während ein Fermenter üblicherweise mit 300 bis 200 Upm bewegt wird. Es müssen selbstverständliche aseptische Bedingungen während des Transfers des Mikroorganismus und während seines Wachstums aufrechterhalten werden.
  • Die so produzierten 5-substituierten Picolinsäureverbindungen können durch Standardtechniken, zum Beispiel Extraktion und verschiedene chromatographische Techniken, isoliert werden.
  • Als 5-substituierte Picolinsäureverbindungen der vorliegenden Erfindung wurden eine Verbindung der Formel (I), worin R1 und R2 H sind und R3 Methoxycarbonyl ist, (Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat), und eine Verbindung der Formel (I), worin R1 Acetyl ist, R2 H ist und R3 Methoxycarbonyl ist, (Methyl-5-(1-acetoxy-2-hydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat), in einer im Wesentlichen reinen Form aus dem Fermentationsgemisch isoliert. Als 5-substituierte Picolinsäureverbindungen der vorliegenden Erfindung wurden 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarbonsäure, Methyl-5-(1,2-diacetoxypropyl)-2-pyridincarboxylat, Methyl-5-(1,2-di-p-brombenzoyloxypropyl)-2-pyridincarboxylat, 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarbaxamid, 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-N,N-dimethyl-2-pyridincarboxamid, 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarbonitril, 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-(2-methyl-2H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)pyridin und 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-(1-methyl-1H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)pyridin aus Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat durch chemische Modifikation isoliert. Diese Verbindungen wurden durch verschiedene spektroskopische Techniken, zum Beispiel UV-Spektrophotometrie, NMR- und Massenspektrometrie, identifiziert und die Resultate sind im Abschnitt für Arbeitsbeispiele dargestellt.
  • Die Verbindungen der Formel (I), worin R1 und R2 eine Acylgruppe sind, können durch Acylierung vom Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat hergestellt werden und die Verbindungen der Formel (I), worin R3 Alkoxycarbonyl ist, können Alkylierung von Demethylmethyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat hergestellt werden, wobei geeignete Acylierungs- und Alkylierungsmittel unter geeigneten Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden.
  • Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen solche der Formel (I), worin
    R1 und R2 H sind und R3 Methoxycarbonyl ist, (Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat);
    R1 Acetyl ist; R2 H ist und R3 Methoxycarbonyl ist, (Methyl-5-(1-acetoxy-2-hydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat);
    R1 und R2 H sind und R3 C(O)OH ist, (5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarbonsäure);
    R1 und R2 Acetyl sind und R3 Methoxycarbonyl ist, (Methyl-5-(1,2-diacetoxypropyl)-2-pyridincarboxylat), und
    R1 und R2 p-Brombenzoyl sind und R3 Methoxycarbonyl ist, (Methyl-5-(1,2-di-p-brombenzoyloxypropyl)-2-pyridincarboxylat).
  • Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen auch solche der Formel (I), worin
    R1 und R2 H sind und R3 CN ist, (5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarbonitril) ist;
    R1 und R2 H sind und R3 CONH2 ist, (5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxamid);
    R1 und R2 H sind und R3 CONHCH3 ist, (5-(1,2-Dihydroxypropyl)-N-methyl-2-pyridincarboxamid);
    R1 und R2 H sind und R3 CON(CH3)2 ist, (5-(1,2-Dihydroxypropyl)-N,N-dimethyl-2-pyridincarboxamid);
    R1 und R2 H sind und R3 1-Methyltetrazol ist, (5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-(1-methyl-2H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)pyridin; und
    R1 und R2 H sind und R3 2-Methyltetrazol ist, (5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-(2-methyl-2H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)pyridin.
  • Bevorzugtere Verbindungen umfassen eine Verbindung der Formel (I), worin
    R1 und R2 H sind und R3 Methoxycarbonyl ist, (Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat); R1 Acetyl ist; R2 H ist und R3 Methoxycarbonyl ist, (Methyl-5-(1-acetoxy-2-hydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat);
    R1 und R2 H sind und R3 C(O)OH ist, (5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarbonsäure); und
    R1 und R2 Acetyl sind und R3 Methoxycarbonyl ist, (Methyl-5-(1,2-diacetoxypropyl)-2-pyridincarboxylat).
  • Weitere bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen auch solche der Formel (I), worin
    R1 und R2 H sind, R3 CONH2 ist, (5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxamid);
    R1 und R2 H sind, R3 CON(CH3)2 ist, (5-(1,2-Dihydroxypropyl)-N,N-dimethyl-2-pyridincarboxamid);
    R1 und R2 H sind, R3 CN ist, (5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarbonitril);
    R1 und R2 H sind, R3 1-Methyltetrazol ist, (5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-(2-methyl-2H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)pyridin); und
    R1 und R2 H sind, R3 2-Methyltetrazol ist, (5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-(1-methyl-1H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)pyridin).
  • Die inhibitorischen Aktivitäten der oben beschriebenen 5-substituierten Picolinsäureverbindungen Methyl-5-(1,2-di hydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat, Methyl-5-(1-acetoxy-2-hydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat, 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarbonsäure, Methyl-5-(1,2-diacetoxypropyl)-2-pyridincarboxylat, Methyl-5-(1,2-di-p-brombenzoyloxypropyl)-2-pyridincarboxylat, 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxamid, 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-N,N-dimethyl-2-pyridincarboxamid, 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarbonitril, 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-(2-methyl-2H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)pyridin und 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-(1-methyl-1H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)pyridin) auf die Biosynthese von IL-1 und TNF wurden durch das unten beschriebene in vitro-Standardprotokoll gemessen. Es wurde festgestellt, dass die Verbindungen inhibitorische Aktivitäten auf die IL-1- und TNF-Biosynthese haben.
  • TNF-Bioassay
  • Heparinisiertes, humanes Vollblut, mit RPMI-Medium vierfach verdünnt, wurde mit 10 μg/ml Lipopolysaccharid (LPS) in Gegenwart verschiedener Probenkonzentrationen bei 37°C in befeuchteter Atmosphäre, die 5% CO2 enthielt, für 4 Std. inkubiert. Der TNF-Titer in den Überständen wurde mit L929-Zellen, die durch TNF zerstört wurden, quantitativ bestimmt. L929-Zellen (2,5 × 104 Zellen) in 90 μl EMEM-Medium, das 1% fötales Kälberserum und 0,5 μm/ml Actinomycin D enthielt, wurden in Vertiefungen von Mikroplatten mit 96 Vertiefungen (flacher Boden) gegeben. 10 μl der Überstände wurden in jede Vertiefung gegeben und es wurde bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre, die 5% CO2 enthielt, inkubiert. Nach 18 Std. wurden die Platten mit 0,9% steriler Salzlösung gespült und für 10 Minuten mit 0,4% Kristallviolett in MeOH gefärbt. Die Platten wurden mit destilliertem Wasser gewaschen und luftgetrocknet. In jede Vertiefung wurden 50 μl Methanol gegeben, um das Kristallviolett zu eluieren und die Platten wurden mit einem Mikroplattenlesegerät (Modell 3550, BIO-RAD) bei 595 nm gelesen. Die inhibitorische Aktivität auf die TNF-Produktion wird durch die folgende Formel berechnet:
  • Figure 00120001
  • IL-1-Bioassay
  • Die Überstände, die durch dasselbe Verfahren wie beim TNF-Bioassay hergestellt worden waren, wurden bzgl. des IL-1-Titers durch das im Handel erhältliche spezifische ELISA-System analysiert. Die Platten wurden mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Modell 3550, BIO-RAD) bei 490 nm gelesen. Die inhibitorische Aktivität auf die IL-1-Produktion wird durch die folgende Gleichung errechnet:
  • Figure 00120002
  • Die pharmazeutisch annehmbaren Salze von Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat, Methyl-5-(1-acetoxy-2-hydroxypropyl)-2-pryridincarboxylat, 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarbonsäure, Methyl-5-(1,2-diacetoxypropyl)-2-pyridincarboxylat und Methyl-5-(1,2-di-p-brombenzoyloxypropyl)-2-pyridincarboxylat werden in herkömmlicher Weise durch Behandeln einer Lösung oder Suspension der Verbindung mit etwa einem chemischen Äquivalent einer pharmazeutisch annehmbaren Säure hergestellt. Bei der Isolierung der Salze werden herkömmliche Konzentrierungs- und Umkristallisierungstechniken angewendet.
  • Verabreichung
  • Die 5-substituierten Picolinsäureverbindungen der Formel (I) und ein pharmazeutisch annehmbares Salz sind bei der Behandlung von Entzündungen oder dergleichen einsetzbar. Die 5-substituierten Picolinsäureverbindungen der Formel (I) und ein pharmazeutisch annehmbares Salz können allein oder in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern entweder in Einzeldosen oder in Mehrfachdosen verabreicht werden. Geeignete pharmazeutische Träger umfassen inerte feste Verdünnungsmittel oder Füllstoffe, sterile wässrige Lösungen und verschiedene organische Lösungsmittel. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die durch Kombinieren der 5-substituierten Picolinsäureverbindungen der Formel (I) und der pharmazeutisch annehmbaren Träger gebildet werden, werden dann in einfacher Weise in einer Vielzahl von Dosierungsformen, zum Beispiel Tabletten, Pulvern, Lutschtabletten, Sirupen, injizierbaren Lösungen und dergleichen, verabreicht. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können, wenn dies gewünscht wird, zusätzliche Ingredienzien wie zum Beispiel Aromastoffe, Bindemittel, Excipienzien und dergleichen enthalten. Zu Zwecken einer oralen Verabreichung können so Tabletten, die verschieden Excipienzien wie Natriumcitrat, Calciumcarbonat und Calciumphosphat enthalten, zusammen mit verschiedenen Zerfallsmitteln, zum Beispiel Stärke, Alginsäure und bestimmten komplexen Silikaten, zusammen mit Bindemitteln wie zum Beispiel Polyvinylpyrrolidon, Saccharose, Gelatine und Akaziengummi, verwendet werden. Zu Tablettierzwecken sind oft zusätzlich Gleitmittel wie zum Beispiel Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talk verwendbar. Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Typs können auch als Füllstoffe in weichen und harten gefüllten Gelatinekapseln verwendet werden. Bevorzugte Materialien hierfür umfassen Laktose oder Milchzucker und Polyethylenglycole mit hohem Molekulargewicht. Wenn wässrige Suspensionen oder Elixiere zu oralen Verabreichung erwünscht sind, können die essentiellen Wirkstoffe darin mit verschiedenen Süßungsmitteln oder Aromamitteln, Färbematerialien oder Farbstoffen und, wenn gewünscht, Emulgier- oder Suspendiermitteln, zusammen mit Verdünnungsmitteln wie Wasser, Ethanol, Propylenglycol, Glycerin und Kombinationen davon, kombiniert werden.
  • Zur parenteralen Verabreichung können Lösungen der 5-substituierten Picolinsäureverbindungen der Formel (I) und eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes in Sesam- oder Erdnussöl, wässrigem Propylenglycol oder in steriler wässriger Lösung verwendet werden. Solche wässrigen Lösungen sollten, wenn notwendig, geeignet gepuffert sein und das flüssige Verdünnungsmittel sollte zuerst mit ausreichend Kochsalzlösung oder Glucose isotonisch gemacht werden. Diese besonderen wässrigen Lösungen sind speziell zur intravenösen, intramuskulären, subkutanen und intraperetonealen Verabreichung geeignet. In diesem Zusammenhang wird erwähnt, dass die verwendeten sterilen wässrigen Medien alle in einfacher Weise durch Standardtechniken, die dem Fachmann bekannt sind, verfügbar sind.
  • Zusätzlich können die 5-substituierten Picolinsäureverbindungen der Formel (I) und ein pharmazeutisch annehmbares Salz topisch verabreicht werden, wenn Krankheitsbilder der Haut behandelt werden; dies kann durch Cremes, Gallerten, Gels, Pasten und Salben entsprechend der pharmazeutischen Standartpraxis erfolgen.
  • Im Allgemeinen liegen die 5-substituierten Picolinsäureverbindungen der Formel (I) oder ihr pharmazeutisch annehmbares Salz in den obigen Dosierungsformen mit Konzentrationen im Bereich von 5 bis 70 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis 50 Gew.-%, vor.
  • Im Allgemeinen wird eine therapeutisch wirksame Tagesdosis für die aktive Verbindung im Bereich von 0,01 bis 100 mg/kg, im Allgemeinen von etwa 1 bis etwa 5 mg/kg, liegen. Wie allgemein bekannt ist, hängt die wirksame Dosierung für die aktive Verbindung vom vorgesehenen Verabreichungsweg und anderen Faktoren, zum Beispiel Alter und Gewicht des Patienten, ab, was dem behandelnden Arzt klar ist. Die Dosierung hängt auch von der zu behandelnden Krankheit ab.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wir durch die folgenden Beispiele erläutert. Allerdings sollte einzusehen sein, dass die Erfindung nicht auf die spezifischen Details dieser Beispiele beschränkt wird. Spektraldaten und physikalisch-chemische Daten wurden mit den folgenden Geräten erhalten: IR, Shimadzu IR-470; UV, JASCO Ubest-30; optische Drehungen, JASCO DIP-370 mit einer 5 cm-Zelle; NMR, JEOL JNM-GX270, ausgestattet mit einem LSJ-11/73 Wirtsrechner, einstellbarer TH-5-Sonde und Software, Version 1.6; EI-MS, Hitachi M-80 mit einem direkten Einlassmodul; und FAB-MS, JEOL JMS-700. Die Peakformen werden wie folgt angegeben: s (Singulett), d (Dublett), t (Triplett), q (Quartett), m (Multiplett) und br (breit). FAB-MS-Spektren wurden unter Verwendung einer Glycerinmatrix gemessen.
  • Beispiel 1
  • Fermentation von Marasmiellus sp. (FERM BP-5735)
  • Zellen aus einer 10 bis 21 Tage alten Petrischale mit Marasmiellus sp. FERM BP-5735, die auf Malzagarmedium (Malzextrakt 2,5% und Agar 1,5%) gewachsen waren, wurden geerntet und in 2 ml sterilem Wasser suspendiert. Diese Suspension wurde ver wendet, um zwei 500 ml-Kolben zu beimpfen, die 100 ml Medium-1 (Glucose 2%, Malzextrakt 2%, Hefeextrakt 0,18, Maltose 0,24% und Agar 0,1%) enthielten. Die Kolben wurden bei 26°C 7 Tage lang an einem Drehschüttler mit 7 cm-Ausschlag mit 220 Upm geschüttelt, um eine Impfkultur zu erhalten. Die Impfkultur wurde verwendet, um 40 500 ml-Kolben zu beimpfen, die 100 ml Medium-2 (Kartoffeldextrosebrühe 2,4%) enthielten. Diese Kolben wurden bei 26°C für 14 Tage an einem Drehschüttler mit 7 cm-Ausschlag mit 250 Upm geschüttelt.
  • Extraktion und Isolierung
  • Die Fermentationsbrühe (3 l) wurde nach Zusatz von 2 1 Ethanol filtriert. Das Filtrat wurde zu einer wässrigen Lösung (1 l) konzentriert, die dann dreimal mit je 1 l n-Butanol extrahiert wurde. Der Extrakt wurde unter Erhalt eines öligen Rückstands abgedampft. Der ölige Rückstand (3,5 g) wurde auf eine Sephadex LH-20-Säule (40 × 500 mm, Pharmacia, Marke) aufgetragen und mit Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden auf eine YMC-Packungs-ODS-AM-343-Säule (20 × 250 mm, Yamamura, Marke) aufgetragen und mit Methanol-Wasser (15 : 85 bis 70 : 30) für 45 Minuten mit einer Durchflussrate von 10 ml/Min. eluiert. Die Detektion erfolgte durch UV-Absorption bei 220 nm. Die eluierten Pieks, die Aktivität zeigten, wurden gesammelt, wobei die Verbindungen Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat (76,7 mg) und Methyl-5-(1-acetoxy-2-hydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat (10,2 mg) erhalten wurden.
  • HPLC-Analyse
  • Analytische HPLC von Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat und Methyl-5-(1-acetoxy-2-hydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat wurde unter Verwendung einer YMC-gepackten ODS AM-312-Säule (6,0 × 150 mm, Yamamura, Marke) durchgeführt und mit Methanol-Wasser (20 : 80 bis 70 : 30) für 10 Minuten und anschließend mit MeOH für 5 Minuten bei einer Durchflussrate von 0,8 ml/Min. durchgeführt. Die Retentionszeiten (Min.) waren Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat (7,7) und Methyl-5-(1-acetoxy-2-hydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat (10,9).
  • Charakterisierung
  • Die physikalisch-chemischen Eigenschaften und die Spektraldaten von Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat und Methyl-5-(1-acetoxy-2-hydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat waren wie folgt:
    Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat: weißes amorphes Pulver; Molekülformel C10H13NO4; LRFAB-MS m/z 212 [M + H]+; HRFAB-MS m/z 212.0940 (berechnet für C10H14NO4, 212,0923); [α]D 24 + 20.0° (c 0,13, MeOH); UV lmax (MeOH) nm (e) 230 (9500), 270 (5800); IR γmax (KBr) cm–1 3325, 1736, 1437, 1309, 1257, 1122, 1089, 1028, 1001, 817, 709; 1H NMR (CD3OD) δ 8,66 (1H, d, J = 1,9 Hz), 8,12 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,99 (1H, dd, J = 8,1 und 1,9 Hz), 4,55 (1H, d, J = 5,9 Hz), 3,96 (3H, s), 3,86 (1H, dq, J = 6,2 und 5,9 Hz), 1,17 (3H, d, J = 6,2 Hz); 13C NMR/CD3OD) d 167,39 (s), 150,60 (d), 148,20 (s), 144,80 (s), 138,57 (d), 126,57 (d), 77,49 (d), 72,79 (d), 53,95 (q), 19,95 (q).
  • Methyl-5-(1-acetoxy-2-hydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat: weißes amorphes Pulver; Molekülformel C12H15NO5; LRFAB-MS m/z 254 [M + H]+; HRFAB-MS m/z 254,1051 (berechnet für C12H16NO5, 254,1028); [α]D 24 + 27,1° (c 0,17, MeOH); UV lmax (MeOH) nm (e) 230 (8200), 270 (4400); IR γmax (KBr) cm–1 3465, 1732, 1435, 1370, 1309, 1239, 1120, 1058, 813, 758, 912; 1H NMR (CD3OD) δ 8,67 (1H, d, J = 1,6 Hz), 8,13 (1H, d, J = 8,1 Hz), 8,01 (1H, dd, J = 8,1 und 1,6 Hz), 5,03 (1H, dt, J = 6,2 und 5,4 Hz), 4,82 (1H, d, J = 5,4 Hz), 3,97 (3H, s), 1,95 (3H, s), 1,20 (3H, d, J = 6,2 Hz).
  • Beispiel 2
  • Herstellung von 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pryridincarbonsäure
  • Zu einer Lösung von Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat (5 mg) in Wasser (0,1 ml) wurde 1 N Lithiumhydroxid (50 μl) bei Raumtemperatur gegeben. Nach einstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit 1 N HCl neutralisiert. Die Lösung wurde auf eine Diaion HP20 (Mitsubishikasei-Marke)-Säule aufgetragen und mit Methanol-Wasser (1 : 1) eluiert, wodurch 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarbonsäure erhalten wurde: weißes amorphes Pulver; Molekülformel C9H11NO4; LRFAB-MS m/z 196 [M – H]–; 1H-NMR (D3O) δ 8,74 (1H, d, J = 2,2 Hz); 8,47 (1H, d, J = 8,1 Hz), 8,28 (1H, dd, J = 8,1 und 2,2 Hz), 4,88 (1H, d, J = 4,3 Hz), 4,12 (1H, dq, J = 6,5 und 4,3 Hz), 1,21 (3H, d, J = 6,5 Hz).
  • Beispiel 3
  • Herstellung von Methyl-5-(1,2-diacetoxypropyl)-2-pyridincarboxylat
  • Zu einer Lösung von Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat (6 mg) in Pyridin (0,1 ml) wurde Essigsäureanhydrid (50 μl) bei Raumtemperatur gegeben. Nach einstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch unter N2-Gas eingeengt. Der Rückstand wurde auf eine Silicagelplatte (Kieselgel GF254, 10 × 10 cm, Merck, Marke) aufgetragen und mit Chloroform-Methanol (95 : 5) entwickelt, wodurch Methyl-5-(1,2-diacetoxypropyl)-2-pyridincarboxylat erhalten wurde: weißes amorphes Pulver; Molekülformel C14H17NO6; LRFAB-MS m/z 296 [M + H]+; 1H-NMR (CDCl3) δ 8,68 (1H, d, J = 2,2 Hz), 8,16 (1H, d, J = 8,1 Hz), 8,03 (1H, dd, J = 8,1 und 2,2 Hz), 5,95 (1H, d, J = 4,3 Hz), 5,28 (1H, dq, J = 6,5 und 4,3 Hz), 3,97 (3H, s), 2,12 (3H, s), 1,99 (3H, s), 1,18, (3H, d, J = 6,5 Hz).
  • Beispiel 4
  • Herstellung von Methyl-5-(1,2-di-p-brombenzoyloxypropyl)-2-pyridincarboxylat
  • Zu einer Lösung von Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat (4,1 mg) und einer katalytischen Menge an 4-N,N-Dimethylaminopyridin in Pyridin (1 ml) wurde bei Raumtemperatur p-Brombenzoylchlorid (10 mg) gegeben. Nach Rühren bei 90°C über drei Tage wurde das Reaktionsgemisch unter N2-Gas eingeengt. Der Rückstand wurde auf eine Silicagelplatte (Kieselgel GF254, 10 × 10 cm, Merck, Marke) aufgetragen und mit Chloroform-Methanol (95 : 5) entwickelt, wodurch 1,03 mg Methyl-5-(1,2-di-p-brombenzoyloxypropyl)-2-pyridincarboxylat erhalten wurden: weißes amorphes Pulver; Molekülformel C24H19Br2NO6; LREI-MS m/z 577 [M]+; 1H-NMR (CDCl3) δ 8,88 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,16 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,94 (1H, dd, J = 8,4 und 2,2 Hz), 7,89 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,80 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,61 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,58 (2H, d, J = 8,4 Hz), 6,27 (1H, d, J = 4,4 Hz), 5,68 (1H, dq, J = 6,6 und 4,4 Hz), 4,01 (3H, s), 1,41 (3H, d, J = 6,6 Hz).
  • Beispiel 5
  • Herstellung von 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxamid
  • Ein homogenes Gemisch von Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat (70,0 mg, 0,33 mmol) und einer 2,0 M Lösung von Ammoniak in Methanol (Aldrich, 15,0 ml, 30,0 mmol) wurde bei einer Badtemperatur von zwischen 50 und 60°C über Nacht in einem Mikroreaktor gerührt und erhitzt. Nach Abkühlung wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum konzentriert, wodurch ein weißer Feststoff (64,0 mg) erhalten wurde. Dieser wurde durch präparative TLC gereinigt [Merck Kieselgel 60, Art. 1.05744, 0,5 mm dick, × 2; Entwicklung: CH2Cl2 – MeOH (8 : 1); Elution: CH2Cl2 – MeOH (3 : 1), 240 ml]. Der isolierte weiße feste Rückstand wurde in THF suspendiert und das Gemisch wurde durch ein kurzes Celitepolster filtriert. Der Filterkuchen wurde mit THF gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten wurden kombiniert und im Vakuum konzentriert, wobei 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxamid als weißer Feststoff erhalten wurde (70,7 mg, quantitativ): 1H-NMR (270 MHz) δ (CDCl3 + DMSO-d6) 8,57 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 8,11 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,89 (dd, J = 8,1, 2,1 Hz, 1H), 7,86 (br. s, 1H), 6,71 (br. s, 1H), 4, 98 (d, J = 4,3 Hz, 1H), 4,67 (dd, J = 4,3, 4,3 Hz, 1H), 4,00 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 4,00~3,87 (m, 1H), 1,07 (d, J = 6,2 Hz, 3H) ppm; MS m/z 197 (0,83%, M+ + 1), 152 (100).
  • Beispiel 6
  • Herstellung von 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-N,N-dimethyl-2-pyridincarboxamid
  • Ein Gemisch aus Methyl-5-(1,2-dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxylat (52,0 mg, 0,25 mmol) und einer 2,0 M-Lösung von Dimethylamin in Methanol (Aldrich, 15,0 ml, 30,0 mmol) wurde gerührt und bei einer Badtemperatur von 100°C in einem Mikroreaktor über vier Nächte erwärmt. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum konzentriert. Der Rückstand (60,3 mg) wurde durch präparative TLC [Merck Kieselgel 60, Art. 1.05744, 0,5 mm dick, × 2; Entwicklung: CH2Cl2-MeOH (8 : 1); Elution: CH2Cl2-MeOH (3 : 1), 240 ml] gereinigt. Der isolierte weiße feste Rückstand wurde in THF suspendiert und das Gemisch wurde durch ein kurzes Celitepolster filtriert. Der Filterkuchen wurde mit THF gewaschen. Filtrat und Waschflüssigkeiten wurden kombiniert und im Vakuum unter Erhalt von 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-N,N-dimethyl-2-pyridincarboxamid als weißer Feststoff (45,2 mg, 80,6%) konzentriert: 1H-NMR (270 MHz) δ (CDCl3) : 8,41 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,76 (dd, J = 7,9, 1,8 Hz, 1H), 7,52 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,86 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 4,11~3,97 (m, 1H), 3,80 (br. s, 1H), 3,13 (s, 3H), 3,04 (s, 3H), 2,68 (br. s, 1H), 1,15 (d, J = 6,6 Hz, 3H) ppm; MS m/z: 255 (7,9%, M+ + 1), 224 (50,9%, M+), 153 (100%).
  • Beispiel 7
  • Herstellung von 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarbonitril
  • Zu einer Lösung von 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxamid (29,5 mg, 0,142 mmol) in DMF (2 ml) wurden 2-Methoxypropen (41 ml, 0,425 mmol) und p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (4,9 mg, 0,0283 mmol) bei Raum temperatur gegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 70 Minuten wurde das Gemisch mit NaHCO3 basisch gemacht. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat (30 ml) verdünnt, mit Wasser gewaschen (20 ml × 2) und über Na2SO4 getrocknet. Nachdem das Lösungsmittel im Vakuum verdampft worden war, wurde der ölige Rückstand durch präparative TLC [Aceton/Hexan (1/2, V/V)] gereinigt, wodurch 16,4 mg (49%) 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxamid als weißer Feststoff erhalten wurden: 1H-NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8,49 (1H, d, J = 1,8 Hz), 8,20 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,84 (1H, br.s), 7,80 (1H, dd, J = 1,8 und 8,1 Hz), 5,89 (1H, br.s), 5,27 (1H, d, J = 7,0 Hz), 4,66 (1H, Quintett, J = 6,5 Hz), 1,66 und 1,49 (jeweils 3H, 2 s), 0,82 (3H, d, J = 6,5 Hz) ppm.
  • Zu einer gerührten Lösung von 5-(2,2,5-Trimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)-2-pyridincarboxamid (16,4 mg, 0,0695 mmol) in 1,4-Dioxan (1 ml) wurden Pyridin (23 ml, 0,278 mmol) und Trifluoressigsäureanhydrid (20 ml, 0,139 mmol) bei Raumtemperatur gegeben. Nach einstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Gemisch mit Ethylacetat (20 ml) verdünnt, mit gesättigter NaHCO3 (10 ml × 2) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und im Vakuum unter Erhalt eines braunen Sirups konzentriert. Dieser wurde durch präparative TLC [Aceton/Hexan (1/4, V/V)] gereinigt, wodurch 9,7 mg (64%) 5-(2,2,5-Trimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)-2-pyridincarbonitril als Feststoff erhalten wurden: 1H-NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8,62 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,80 (1H, dd, J = 1,8 und 8,1 Hz), 7,70 (1H, d, J = 8,1 Hz), 5,25 (1H, d, J = 7,0 Hz), 4,67 (1H, Quintett, J = 6,6 Hz), 1,64 und 1,48 (jeweils 3H, 2s), 0,82 (3H, d, J = 6,6 Hz) ppm.
  • Ein Gemisch aus (3) (9,7 mg, 0,0444 mmol) und 80%iger wässriger Essigsäure (2 ml) wurde für 2,5 h gerührt und bei 60°C erwärmt. Das Gemisch wurde im Vakuum unter Erhalt eines Sirups konzentriert. Dieser wurde durch präparative TLC [Metha nol/Dichlormethan (1/10)] gereinigt, wodurch 7,4 mg (94%) 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarbonitril erhalten wurden: 1H-NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8,68 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,91 (1H, dd, J = 2,2 Und 8,1 Hz), 7,70 (1H, d, J = 8,1 Hz), 4,84 (1H, d, J = 3,7 Hz), 4,11 (1H, dt, J = 6,2, 6,2 und 10,3 Hz), 2,99 (1H, br.s), 2,31 (1H, br.s), 1,06 (3H, d, J = 6,2 Hz) ppm.
  • Beispiel 8
  • Herstellung von 5-(1,2-Di-hydroxypropyl)-2-(2-methyl-2H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)pyridin und 5-(1,2-Di-hydroxypropyl)-2-(1-methyl-1H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)pyridin
  • Zu einer Lösung von 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-pyridincarboxamid (161 mg, 0,771 mmol) in DMF (6 ml) wurden Imidazol (1,05 g, 15,4 mmol) und t-Butylchlordimethylsilan (1,16 g, 7,71 mmol) bei Raumtemperatur gegeben. Nachdem das Gemisch für 5,5 h bei 70°C gerührt und erwärmt worden war, wurde Wasser (2 ml) zugegeben und das Rühren wurde unter denselben Heizbedingungen für 2 h fortgesetzt. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat (200 ml) verdünnt, mit Wasser (100 ml × 4) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und im Vakuum unter Erhalt eines kristallinen Rückstands konzentriert. Dieser wurde an Silicagel (20 g) chromatographiert. Eine Elution mit Ethylacetat/Hexan (1/4, V/V) lieferte 326 mg (99%) 5-[1,2-Di-{(1-(tert-butyl)-1,1-dimethylsilyloxy}propyl]-2-pyridincarboxamid als weißen Feststoff: 1H-NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8,50 (1H, d, J = 1,8 Hz), 8,15 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,86 (1H, br.s), 7,81 (1H, dd, J = 2,2 und 8,1 Hz), 5,89 (1H, br s), 4,40 (1H, d, J = 6,6 Hz), 3,74 (1H, Quintett, J = 6,1 Hz), 1,23 (3H, d, J = 6,2 Hz), 0,87 und 0,75 (jeweils 9H, 2s), 0,06, –0,11, –0,18, und –0,40 (jeweils 3H, 4s) ppm.
  • Zu einer gerührten Lösung von 5-[1,2-Di-{(1-(tert-butyl)-1,1-dimethylsilyloxy}propyl]-2-pyridincarboxamid (326 mg, 0,769 mmol) in 1,4-Dioxan (8 ml) wurden Pyridin (0,25 ml, 3,07 mmol) und Trifluoressigsäureanhydrid (0,22 ml, 1,54 mmol) bei Raumtemperatur gegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur über 0,5 h wurde das Gemisch mit Ethylacetat (100 ml) verdünnt, mit gesättigter NaHCO3 (50 ml × 2) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und im Vakuum unter Erhalt eines öligen Rückstandes konzentriert. Dieser wurde an Silicagel (30 g) chromatographiert. Eine Elution mit Ethylacetat/Hexan (1/15, V/V) lieferte 264 mg 5-[1,2-Di-{(1-(tert-butyl)-1,1-dimethylsilyloxy}propyl]-2-pyridincarbonitril als Feststoff: 1H-NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8,65 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,80 (1H, dd, J = 1,8 und 7,7 Hz), 7,65 (1H, d, J = 7,7 Hz), 4,39 (1H, d, J = 6,6 Hz), 3,72 (1H, Quintett, J = 6,2 Hz), 1,22 (3H, d, J = 6,2 Hz), 0,88 und 0,75 (jeweils 9H, 2s), 0,07, –0,08, –0,18 und –0,38 (jeweils 3H, 4s) ppm.
  • Zu einer Lösung von 5-[1,2-Di-{(1-(tert-butyl)-1,1-dimethylsilyloxy}propyl]-2-pyridincarbonitril (191 mg, 0,468 mmol) in Toluol (4 ml) wurden NaN3 (122 mg, 1,87 mmol) und Tributylzinnchlorid (0,51 ml, 1,87 mmol) bei Raumtemperatur gegeben. Das Rühren wurde unter Erwärmen am Rückfluss für 27 h fortgesetzt. Nach Verdünnen des Gemisches mit Toluol (2 ml) wurden 1 M NaOH (2,4 ml) und MeI (0,6 ml, 9,37 mmol) bei Raumtemperatur zugesetzt. Nach dreistündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Gemisch mit Ethylacetat (100 ml) verdünnt, mit Wasser (50 ml × 3) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und im Vakuum unter Erhalt eines öligen Rückstandes konzentriert. Dieser wurde durch präparative TLC [Aceton/Hexan (1/5, V/V)] gereinigt, wodurch 149 mg (68%) 5-[1,2-Di-{(1-(tert-butyl)-1,1-dimethylsilyloxy}propyl]-2-(2-methyl-2H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)pyridin erhalten wurden: 1H-NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8,64 (1H, d, J = 1,8 Hz), 8,31 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,88 (1H, dd, J = 1,8 und 8,4 Hz), 4,58 (3H, s), 4,42 (1H, d, J = 7,0 Hz), 3,77 (1H, Quintett, J = 6,2 Hz), 1,26 (3H, d, J = 6,2 Hz), 0,90 und 0,76 (jeweils 9H, 2s), 0,09, –0,07, –0,15, und –0,37 (jeweils 3H, 4s) ppm; und 63 mg (29%) 5-[1,2-Di-{(1-(tert-butyl)-1,1-dimethylsilyloxy}propyl]-2-(1-methyl-1H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)pyridin: 1H-NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8,72 (1H, d, J = 1,8 Hz), 8,19 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,82 (1H, dd, J = 2,2 und 8,1 Hz), 4,45 (3H, s), 4,41 (1H, d, J = 6,6 Hz), 3,79 (1H, Quintett, J = 6,2 Hz), 1,23 (3H, d, J = 6,2 Hz), 0,88 und 0,75 (jeweils 9H, 2s), 0,07, –0,09, –0,17 und –0,36 (jeweils 3H, 4s) ppm.
  • Zu einer Lösung von 5-[1,2-Di-{(1-(tert-butyl)-1,1-dimethylsilyloxy}propyl]-2-(2-methyl-2H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)pyridin (149 mg, 0,320 mmol) in THF (4 ml) wurden bei Raumtemperatur Essigsäure (73 ml, 1,28 mmol) und 1 M Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) (1,3 ml, 1,28 mmol) gegeben. Nach 2,5 h Rühren wurde das Gemisch im Vakuum unter Erhalt eines sirupartigen Rückstands konzentriert. Dieser wurde durch präparative TLC [Aceton/Hexan (1/1, V/V)] gereinigt, wodurch 42 mg (56%) 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-(2-methyl-2H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)pyridin erhalten wurden: 1H-NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8,68 (1H, d, J = 1,8 Hz), 8,19 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,93 (1H, dd, J = 2,0 und 8,2 Hz), 4,85 (1H, d, J = 3,7 Hz), 4,47 (3H, s), 4,19–4,11 (1H, m), 3,99 (1H, br.s), 3,27 (1H, br.s), 1,09 (3H, d, J = 6,2 Hz) ppm.
  • Zu einer Lösung von 5-[1,2-Di-{(1-(tert-butyl)-1,1-dimethylsilyloxy}propyl]-2-(1-methyl-1H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)pyridin (76,1 mg, 0,164 mmol) in THF (3 ml) wurden Essigsäure (38 ml, 0,656 mmol) und 1 M TBAF (0,7 ml, 0,656 mmol) bei Raumtemperatur gegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 2 h wurde das Gemisch im Vakuum unter Erhalt eines sirupartigen Rückstandes konzentriert. Dieser wurde durch präpara tive TLC [Aceton/Hexan (1/1, V/V)] gereinigt, wodurch 24 mg (63%) 5-(1,2-Dihydroxypropyl)-2-(1-methyl-1H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)pyridin erhalten wurden: 1H-NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8,69 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,14 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,89 (1H, dd, J = 2,0 und 8,1 Hz), 4,85 (1H, d, J = 3,7 Hz), 4,44 (3H, s), 4,17–4,08 (1H, m), 3,83 (1H, br.s), 3,13 (1H, br.s), 1,07 (3H, d, J = 6,2 Hz) ppm.
  • Die chemische Struktur der Verbindungen, die in den Beispielen hergestellt wurden, sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
  • TABELLE
    Figure 00270001

Claims (13)

  1. Verbindung der Formel (I):
    Figure 00280001
    oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, wobei R1 und R2 unabhängig voneinander H, C2-C6-Acyl oder halogensubstituiertes Benzoyl sind; und R3 -C(O)O-C1-C6-Alkyl, C(O)OH, CN, CONH2, CONHCH3, CON(CH3)2, 1-Methyltetrazol oder 2-Methyltetrazol ist, mit der Maßgabe, dass, wenn R2 Acetyl ist und R3 Methoxycarbonyl ist, R1 nicht H ist; und dass, wenn R3 CN, CONH2, CONHCH3, CON(CH3)2, 1-Methyltetrazol oder 2-Methyltetrazol ist, R1 und R2 H sind.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R3 -C(O)O-C1-C6-Alkyl oder C(O)OH ist, mit der Maßgabe, dass, wenn R2 Acetyl ist und R3 Methoxycarbonyl ist, R1 nicht H ist.
  3. Verbindung nach Anspruch 2, wobei die Verbindung eine der Folgenden ist: eine Verbindung der Formel (I), worin R1 und R2 H sind und R3 Methoxycarbonyl ist, eine Verbindung der Formel (I), worin R1 Acetyl ist; R2 H ist und R3 Methoxycarbonyl ist, eine Verbindung der Formel (I), worin R1 und R2 H sind und R3 für C(O)OH steht, eine Verbindung der Formel (I), worin R1 und R2 Acetyl sind und R3 Methoxycarbonyl ist; und eine Verbindung der Formel (I), worin R1 und R2 p-Brombenzoyl sind und R3 Methoxycarbonyl ist.
  4. Verbindung nach Anspruch 3, wobei die Verbindung eine der Folgenden ist: eine Verbindung der Formel (I), worin R1 und R2 für H stehen und R3 Methoxycarbonyl ist, eine Verbindung der Formel (I), worin R1 Acetyl ist; R2 H ist und R3 Methoxycarbonyl ist, eine Verbindung der Formel (I), worin R1 und R2 H sind und R3 für C(O)OH steht, und eine Verbindung der Formel (I), worin R1 und R2 Acetyl sind und R3 Methoxycarbonyl ist.
  5. Verbindung nach Anspruch 3, wobei R1 und R2 H sind und R3 Methoxycarbonyl ist oder R1 Acetyl ist, R2 H ist und R3 Methoxycarbonyl ist.
  6. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R1 und R2 H sind und R3 CN, CONH2, CONHCH3, CON(CH3)2, 1-Methyltetrazol oder 2-Methyltetrazol ist.
  7. Verbindung nach Anspruch 6, wobei R3 CONH2, CON(CH3)2, CN, 1-Methyltetrazol oder 2-Methyltetrazol ist.
  8. Kultur von Marasmiellus sp. FERM BP-5735, die fähig ist eine Verbindung nach Anspruch 5 zu produzieren.
  9. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, umfassend Kultivieren eines Mikroorganismus mit den identifizierenden Charakteristika von Marasmiellus sp. FERM BP-5735 oder einer Mutanten oder einer rekombinanten Form davon.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, dass außerdem die nachfolgenden Schritte einer Isolierung der 5-substituierten Picolinsäure-Verbindungen aus der Fermentationsbrühe und einer chemischen Modifizierung der isolierten Verbindungen umfasst.
  11. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Behandlung von durch IL-1- und/oder TNF-vermittelten Krankheiten und der Inhibierung der IL-1- und/oder TNF-Produktion, welche eine Verbindung nach Anspruch 4 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon in einer Menge, die bei solchen Behandlungen wirksam ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
  12. Verwendung einer Verbindung, wie sie in Anspruch 4 definiert ist, bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von durch IL-1- und/oder TNF-vermittelten Krankheiten.
  13. Verbindung nach Anspruch 4 zur Verwendung als Pharmazeutikum.
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