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Technisches Gebiet
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Die
Erfindung betrifft eine Zubereitung oder Präparat einer Spüllösung für die Augenchirurgie
zur Verwendung bei Operationen von Katarakt, Glaukom oder einer
Linsentransplantation. Sie bezieht sich spezifisch auf die Zubereitung
einer Spüllösung, die
sich zum Schutz der intraokulären
Gewebe eignet, zum Absaugen der nach der Operation im Auge verbliebenen
Substanzen und die verhindert, dass die Oberfläche des Hornhautepitheliums
und die Bindehaut trocken wird, damit die Operation sicher und wirksam
durchgeführt
werden kann.
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Hintergrund
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In
letzter Zeit hat die Entwicklung von Verfahren der Augenchirurgie
für Operationen
von Katarakt, Glaukom, Linsentransplantationen und dergleichen bemerkenswerte
Fortschritte erzielt. Eine Spüllösung, die als
chirurgisches Hilfsmittel verwendet werden kann, spielt eine wichtige
Rolle bei der sicheren und wirksamen Durchführung der vorstehend erwähnten Operationen.
Wenn zum Beispiel die Peripherie der Hornhaut zu Beginn einer Kataraktoperation
mit einem Skalpell eingeschnitten wird, fließt sofort die Augenkammerflüssigkeit aus.
Deshalb ist die Injektion einer Spüllösung und einer viskoelastischen
Substanz unerlässlich
zum Schutz der intraokulären
Gewebe und Zellen und zur Erhaltung des Raums der Kammer vor der
Iris. Wenn ferner zum Zeitpunkt, an dem die kristalline Linse zerbricht,
die Spüllösung im
Auge vorhanden ist, können
die Stücke
glatt durch Absaugen extrahiert werden. Mit der Spüllösung wird
außerdem
verhindert, dass die Hornhaut und die Bindehaut während der
Operation austrocknen.
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Folgende
Punkte sind in der Zubereitung für
die Zwecke solcher Anwendungen der Spüllösung wichtig: (1) der osmotische
Druck und pH-Wert der Zubereitung muss physiologisch auf die intraokulären Gewebe und
auf die Endothelialzellen der Hornhaut abgestimmt sein; (2) die
wesentlichen Verbindungen der Komponenten der Augenkammerflüssigkeit,
wie etwa organische Salze, Energiequellen und zellaktivierende Substanzen
müssen
zugeführt
werden; (3) die Zubereitung muss biologisch sicher sein; und (4)
die Zubereitung muss bei Raumtemperatur langfristig haltbar bleiben.
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Eine
der derzeit auf dem japanischen Markt verfügbaren Zubereitungen einer
Spüllösung für die Augenchirurgie
ist ein handelsübliches
Produkt, das Oxyglutathion als zellaktivierende Substanz enthält, und
ein weiteres handelsübliches
Produkt, das ein Puffersystem aus Bicarbonat auf Ionenbasis enthält, wird
bereits in der Praxis verwendet.
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Weil
es sich jedoch um Zweikomponentenzubereitungen handelt, die zwei
Lösungstypen
erfordern, die vor der Verwendung zusammengemischt werden müssen, oder
um eine Zubereitung, die keine wirksamen Inhaltsstoffe zum Schutz
der Endothelialzellen der Hornhaut enthält, sind nicht wenige Probleme
hinsichtlich der Stabilität,
einfachen Anwendung und der Wirksamkeit als Zubereitung zu lösen.
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Eine
Zubereitung einer Spüllösung für die Augenchirurgie,
die im Wesentlichen aus 3-Hydroxybuttersäure als Energiequelle zusammengesetzt
ist, wird in der Beschreibung der U.S. Patente Nr. 5,116,868 und 5,298,487
offenbart. Die darin beschriebenen Zubereitungen enthalten jedoch
keine Bicarbonationen, die erforderlich sind, um die Funktion der
Zellen des Hornhautendotheliums aufrecht zu erhalten. Als Begründung, warum
die Bicarbonationen nicht bereits von Anfang an enthalten sein müssen, wird
aufgeführt,
dass der pH-Wert der Zubereitung wegen des CO2 Partialdrucks
schwankt, wodurch die Zubereitung instabil wird und dass die 3-Hydroxybuttersäure durch
den Stoffwechsel CO2 erzeugt und das CO2 zu Bicarbonationen umgesetzt wird, die
damit automatisch erzeugt werden. Zusätzlich ist Natriumacetat, von
dem im Allgemeinen angenommen wird, dass es in der Augenkammerflüssigkeit
nicht vorhanden ist, in der vorstehend aufgeführten Zubereitung enthalten.
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Von
der D-3-Hydroxybuttersäure
oder ihren Salzen, die in der gegenwärtigen Erfindung als aktive
Bestandteile vorhanden sind, ist bekannt, dass es sich um biologische
Substanzen handelt, die bei Menschen und in den meisten Säugern vorhanden
sind und in Biosynthese durch einen Oxidationsprozess von Fettsäuren in
der Leber produziert werden und aus der Leber heraus vom Blut in
die Hornhaut und zu peripheren Geweben transportiert werden, um
als wirksame Energiequelle zu fungieren (siehe Lehninger, New Biochem.,
2. Auflage, Seite 625, 1993 und NATURE Nr. 4, 841, Seite 597, 1962).
Es ist auch bekannt, dass die Substanzen für die Hornhautgewebe als Energiequelle
viel nützlicher
sind als Glucose (siehe TRANSPLANTATION, 57, Seiten 1778–1785, 1994).
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Die
D-3-Hydroxybuttersäure
oder ihre Salze werden im TCA-Kreislauf dieser Gewebe oxidiert,
um ATP zu produzieren und schließlich werden sie in Kohlendioxid
und Wasser umgesetzt (siehe NATURE Nr. 4841, Seite 597, 1962).
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Was
die Anwendung von D-3-Hydroxybuttersäure und ihrer Salze in Arzneimitteln
betrifft, so wird berichtet, dass sie in eine Infusionslösung zur
Nahrungsversorgung von Patienten in einem beschleunigten Stadium
des biologischen Proteinabbaustoffwechsels oder eines Befalls eingemischt
werden (siehe japanische Patentanmeldung Nr. 191212/1990).
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In
GANKA RINSHO IHO; Vol. 92, Nr. 7 (1998), Seiten 902–905, wird
offengelegt, dass der Einfluss einer intraokulären Spüllösung, die β-Hydroxybutyrat enthält, auf
Retinas anhand eines Elektroretinogramms (ERG) untersucht wurde,
für das
von Kaninchen extrahierte Retinas benützt wurden und dass die intraokuläre Spüllösung Retinafunktionen
gleichwertig oder besser als das auf dem Markt vorhandene Produkt
BSS PLUS (eingetragenes Warenzeichen) aufrecht erhält. Die
D-Form von β-Hydroxybutyrat
ist jedoch in die sem Bericht nicht offengelegt, nur der Einfluss
von β-Hydroxybutyrat
auf die Retina ist offengelegt.
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Zusätzlich wurde
im Proceeding 201 der am 24.–26.
Juli 1997 abgehaltenen 36. Tagung der Retina Vitreous Society von
Japan bekanntgegeben, dass der Einfluss einer intraokulären Spüllösung, die
Natrium-D-β-Hydroxybutyrat
enthält,
auf die Retina anhand eines ERG untersucht wurde, für das die
von Kaninchen extrahierten Retinas verwendet wurden und dass die
neu rezeptierte intraokuläre
Spüllösung das
ERG einer Retinaprobe in vitro gleichwertig oder besser als BSS
PLUS halten konnte.
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Die
genaue Zusammensetzung der vorstehend erwähnten Spüllösung wird jedoch in diesem
Bericht nicht bekannt gegeben, nur der Einfluss auf die Retina wird
offengelegt.
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Beschreibung der Erfindung
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Eine
Aufgabe der gegenwärtigen
Erfindung ist die Schaffung einer Einkomponentenlösung als
Spüllösung für die Augenchirurgie
bei Operationen von Katarakt, Glaukom oder einer Linsenverpflanzung,
wobei diese Lösung
die augenbezüglichen
Gewebe und die Zellen des Endotheliums vor und nach der Operation
ausgezeichnet schützt
und eine hohe Stabilität
in vivo hat.
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Eine
weitere Aufgabe der gegenwärtigen
Erfindung ist es, eine intraokuläre
Zubereitung einer Spüllösung zu
schaffen, die zusätzlich
zu den oben erwähnten
ausgezeichneten Eigenschaften eine stabile Rezeptur durch Zugabe
von anorganischen Ionen, Energiequellen, isotonischen Wirkstoffen,
Puffern, Bicarbonat-Ionen und Stabilisatoren aufweist.
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Weitere
erfindungsgemäße Aufgaben
und Vorteile sind aus der folgenden Beschreibung erkennbar.
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In Übereinstimmung
mit der gegenwärtigen
Erfindung können
die vorstehend aufgeführten
Aufgaben und Vorteile mit einer Einkomponenten-Zubereitung einer
Spüllösung für die Augenchirurgie
bei Operationen von Katarakt, Glau kom oder einer Linsentransplantation
erreicht werden, nämlich
mit einer wässerigen
Lösung beinhaltend:
- (1) mindestens 0,1 mM, aber weniger als 500
mM von mindestens einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe, die D-3-Hydroxybuttersäure und
deren wasserlösliche
Salze umfasst, als D-3-Hydroxybutyrat-Anion;
- (2) mindestens 0,1, mM aber weniger als 100 mM von wasserlöslichen
Bicarbonatsalzen als Bicarbonat-Ion;
- (3) mindestens 0,1 mM, aber weniger als 50 mM von mindestens
einer Verbindung ausgewählt
aus der Gruppe, die Phosphorsäure
und deren wasserlösliche
Phosphatsalze umfasst, als Phosphat-Ion;
- (4) mindestens 0,01 mM, aber weniger als 50 mM von wasserlöslichen
Calciumsalzen als Calcium-Ion; und
- (5) mindestens 0,01 mM von wasserlöslichen Magnesiumsalzen als
Magnesium-Ion.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 zeigt den Vergleich von
zellaktivierenden Effekten durch optische Isomere von 3-Hydroxybuttersäure (3-HBA).
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2 zeigt, welche Schutzwirkungen
(in vitro Versuche) die erfindungsgemäße Lösung und Vergleichslösungen auf
die Hornhaut haben.
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3 zeigt das Ausmaß der Änderungen
der Hornhautdicke im Zeitverlauf für jede der oben erwähnten Lösungen.
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4 zeigt, welche Erholungswirkungen
D-3-HBA und Oxyglutathion auf die Kultur einer geschädigten Endothelialzelle
einer Rinderhornhaut haben.
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5 zeigt das Ausmaß der Änderungen
der Hornhautdicke im Zeitverlauf für eine Zubereitung, die ein
Bicarbonatsalz mit oder ohne D-3-HBA enthält.
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6 zeigt das Ausmaß der Änderungen
der Hornhautdicke im Zeitverlauf für eine Zubereitung mit oder
ohne D-3-HBA, die keine Bicarbonatsalze enthält.
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Bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung
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Im
Folgenden wird die erfindungsgemäße Zubereitung
ausführlich
beschrieben.
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Hinsichtlich
der absoluten Konfiguration an der Position C3 in
der chemischen Strukturformel der 3-Hydroxybuttersäure gibt
es eine Gruppe der D-Form,
eine D,L-Form und eine L-Form. Von diesen wird erfindungsgemäß die D-Form
verwendet, um die größtmögliche Wirkung
für die
Rezeptur einer Spüllösung für die Augenchirurgie
zu erzielen. Untersucht man nämlich
den Unterschied in der Aktivität
auf Grundlage der optischen Isomere im Hinblick auf die Wirkung
der Aktivierung einer Endothelialzelle – das ist eines der Verfahren zur
Bewertung der Wirksamkeit der Zubereitung – dann erhält man mit der D-Form Aktivität, während mit
der L-Form kaum eine Aktivität
erreicht wird und es wird vermutet, dass bei Verwendung der D,L-Form
die L-Form einen nachteiligen Einfluss auf die Aktivität haben
kann. Die D-3-Hydroxybuttersäure
und ihre Salze lassen sich leicht und mit einem hohen asymmetrischen
Ertrag synthetisieren, durch asymmetrische Hydrierung der Ketongruppen
eines Acetessigesters in Gegenwart eines rutheniumoptisch aktiven
Phosphinkomplexes als Katalysator und alkaline Hydrolyse des Esters,
deshalb sind die Verbindungen mit relativ niedrigem Kostenaufwand
zu erzielen (siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 99367/1990).
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Bevorzugte
Beispiele für
die wasserlöslichen
Salze der D-3-Hydroxybuttersäure
in der gegenwärtigen Erfindung
schließen
Natriumsalze, Kaliumsalze, Bariumsalze, Magnesiumsalze, Lithiumsalze,
L-Lysinsalze, L-Histidinsalze und L-Argininsalze ein. Die D-3-Hydroxybuttersäure und
ihre wasserlöslichen
Salze können
allein oder in Kombination von zwei oder mehr verwendet werden.
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Der
Begriff „wasserlöslich" bezieht sich in
seiner Verwendung in der gegenwärtigen
Erfindung auf die Eigenschaft, die den Verbindungen die Auflösung in
der erfindungsgemäßen Zubereitung
in der für
die Zubereitung erforderlichen gewünschten Konzentration erlaubt.
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Übereinstimmend
mit der gegenwärtigen
Erfindung beträgt
die Konzentration der D-3-Hydroxybuttersäure und/oder ihrer wasserlöslichen
Salze in der Zubereitung einer wässerigen
Lösung
mindestens 0,1 mM, aber weniger als 500 mM, vorzugsweise mindestens
1 mM, aber weniger als 200 mM und noch mehr zu bevorzugen mindestens
5 mM, aber weniger als 100 mM.
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Bei
der gegenwärtigen
Erfindung übt
die Zuführung
von Bicarbonat-Ionen einen bemerkenswerten Einfluss auf einen Effekt
aus, der das Anschwellen der Hornhaut hemmt, was einer der wichtigen
Indices für die
Erhaltung der Hornhautfunktionen ist. Als Stücke der extrahierten Corneasclera
von Kaninchen unter Verwendung einer Zubereitung, die Bicarbonat-Ionen
enthielt und einer Zubereitung, die keine Bicarbonat-Ionen enthielt,
inkubiert und Änderungen
in der Hornhautdicke gemessen wurden, stellte die Zubereitung, die
die Ionen enthielt (die erfindungsgemäße Zubereitung) die Hornhaut
zu einem nahezu normalen Zustand wieder her, während die Zubereitung, die
keine solchen Ionen enthielt, das Anschwellen der Cornea beschleunigte,
was beweist, dass hier der Effekt, der die Hornhaut schützt, fehlte.
Dieser Sachverhalt erwies sich auch in einem in vivo Versuch an
Kaninchenaugen als richtig, das heißt, die Zubereitung, die solche
Ionen enthielt (die erfindungsgemäße Zubereitung) stellte die
Hornhaut wieder zu ihrem normalen Zustand her, während die Zubereitung, die
keine solchen Ionen enthielt, das Anschwellen der Hornhaut beschleunigte.
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In
Anbetracht dieser Tatsachen müssen
in der erfindungsgemäßen Zubereitung,
die D-3-Hydroxybuttersäure
enthält,
Bicarbonat-Ionen enthalten sein. Bevorzugte Beispiele für die wasserlöslichen
Bicarbonatsalze schließen
Natriumbicarbonat und Kaliumbicarbonat ein.
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Die
Konzentration der wasserlöslichen
Bicarbonatsalze beträgt
mindestens 0,1 mM, aber weniger als 100 mM, vorzugsweise mindestens
1 mM, aber weniger als 60 mM und noch mehr zu bevorzugen sind mindestens
10 mM, aber weniger als 60 mM, als wasserlösliche Bicarbonat-Ionen (HCO3 –).
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Die
erfindungsgemäße Zubereitung
enthält
Phosphationen, die aus Phosphorsäure
oder aus wasserlöslichen
Phosphatsalzen abgeleitet sind. Die Phosphationen sind vorzugsweise
aus einer Pufferlösung
auf Phosphatbasis abgeleitet, die wasserlösliche Phosphatsalze enthält, wie
zum Beispiel Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat,
Dikaliumhydrogenphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat. Die Pufferlösung auf
Phosphatbasis ist beim Menschen als Komponente des Kammerwassers
enthalten. Die Konzentration der Phosphationen beträgt mindestens
0,1 mM, aber weniger als 50 mM, vorzugsweise mindestens 0,5 mM,
aber weniger als 30 mM und noch mehr zu bevorzugen sind mindestens
1 mM, aber weniger als 10 mM.
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Die
erfindungsgemäße Zubereitung
enthält
ferner Calciumsalze. Die Calciumsalze können der erfindungsgemäßen Zubereitung
zugefügt
werden in Form von Salzen, die D-3-Hydroxybuttersäure-Ionen,
Bicarbonat-Ionen oder Phosphationen enthalten, wie vorstehend beschrieben
und von Calciumionen oder als wasserlösliche Salze. Bevorzugte Beispiele
solcher wasserlöslicher
Salze schließen
Calciumchlorid, Calciumglycerophosphat und Calciumglucuronat ein.
Die Calciumsalze können
allein oder in Kombination von zwei oder mehr zum Einsatz kommen.
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Die
Konzentration der wasserlöslichen
Calciumsalze beträgt
mindestens 0,01 mM, aber weniger als 50 mM, vorzugsweise mindestens
0,1, aber weniger als 20 mM und noch mehr zu bevorzugen mindestens
0,5 mM, aber weniger als 10 mM als Calciumionen.
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Die
erfindungsgemäße Zubereitung
enthält
ferner wasserlösliche
Magnesiumsalze. Die Magnesiumsalze können der erfindungsgemäßen Zubereitung
zugefügt
werden in Form von Salzen, die D-3-Hydroxybuttersäure-Ionen,
Bicarbonat-Ionen oder Phosphationen enthalten, wie vorstehend beschrieben
und von Magnesiumionen oder von anderen wasserlöslichen Salzen. Bevor zugte
Beispiele solcher wasserlöslichen
Salze schließen
Magnesiumchlorid und Magnesiumsulfat ein.
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Die
Konzentration der wasserlöslichen
Magnesiumsalze beträgt
mindestens 0,01 mM, aber weniger als 50 mM, vorzugsweise mindestens
0,1 mM, aber weniger als 20 mM und noch mehr zu bevorzugen sind mindestens
0,5 mM, aber weniger als 10 mM, als Magnesiumionen.
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Was
die Zusätze
zur Zubereitung der erfindungsgemäßen Spüllösung betrifft, so werden vorzugsweise die
beim Menschen im Kammerwasser vorhandenen anorganischen Salze, Glucose
als weitere Energiequelle, isotonische Wirkstoffe und Pufferlösungen zur
Harmonisierung des osmotischen Drucks und des pH-Wertes bei den
intraokulären
Geweben und den Endothelialzellen, sowie Stabilisatoren für die Zubereitung
und dergleichen als geeignet befunden und verwendet.
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Als
erfindungsgemäße anorganische
Salze und isotonische Wirkstoffe werden zusätzlich zu den vorstehend aufgeführten Calciumsalzen
und Magnesiumsalzen vorzugsweise anorganische Salze, wie alkaline Metallsalze,
zum Beispiel Natriumchlorid und Kaliumchlorid und isotonische Wirkstoffe,
wie Carbohydrate, zum Beispiel Mannitol, Sorbitol, Xylitol und Dextran
verwendet.
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Diese
können
allein oder in Kombinationen von zwei oder mehr zum Einsatz kommen.
Die Konzentration der anorganischen Salze und der isotonischen Wirkstoffe
liegt vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 1,000 mM. Ferner wird
der osmotische Druck des Zubereitungs vorzugsweise im Bereich von
270 bis 350 mOsm gehalten.
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Als
Pufferlösungen
können
zusätzlich
zu den vorstehend erwähnten
wasserlöslichen
Phosphatsalzen auch Zitronensäure,
Citratsalze, Bicarbonatsalze, Acetatsalze und Puffer auf Grundlage
von Borsäure,
wie Borsäure
und Natriumborat verwendet werden. Die Konzentration der Pufferlösungen liegt
vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 50 mM.
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Der
pH-Wert der wässerigen
Lösung
der erfindungsgemäßen Zubereitung
liegt vorzugsweise im Bereich von 6,8 bis 8,2, wo keine Schädigung an
den intraokulären
Geweben und Zellen eintritt und der zur Aufrechterhaltung der betreffenden
Funktionen erforderlich ist. Ferner ist ein pH-Wert zwischen 7,2
und 8,0 noch mehr vorzuziehen, weil sich dieser Bereich bei Prüfung der
Funktionalität
und Sicherheit an Kaninchenaugen als zulässig für eine Spüllösung zum Einsatz in der Augenchirurgie
erwiesen hat.
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Obwohl
erfindungsgemäß die D-3-Hydroxybuttersäure die
Hauptenergiequelle für
die Zubereitung der Spüllösung ist,
kann auch Glucose als Hilfs-Energiequelle
zugefügt
werden. Die Glucosekonzentration liegt vorzugsweise im Bereich von
0,1 bis 50 mM.
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Als
Stabilisatoren werden vorzugsweise wasserlösliche Citratsalze verwendet.
Bevorzugte Beispiele von wasserlöslichen
Citratsalzen schließen
Zitronensäure
und ihre Natriumsalze und Kaliumsalze ein. Ihre Konzentration liegt
vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 50 mM und noch mehr ist ein
Bereich von 0,1 bis 10 mM, in Form von Citrationen zu bevorzugen.
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Die
erforderlichen Mengen dieser Hauptkomponenten und Additive werden
nacheinander in destilliertem Wasser aufgelöst und der pH-Wert der Lösungen wird
mit verdünnter
Salzsäure
oder einer verdünnten
alkalischen Lösung
eingestellt und die resultierenden Lösungen können jeweils in einer mit Stopfen
versehenen transparenten Glas- oder Plastikflasche als Einkomponentenlösung aufbewahrt
werden. Die so hergestellten Zubereitungen wurden bei 40°C und einer
Luftfeuchtigkeit von 75% 6 Monate lang gelagert und die nach 6 Monaten
Lagerung entnommene Probe war im Aussehen und im osmotischen Druck
unverändert
gegenüber
der zu Beginn des Versuchs entnommenen Probe. Was den pH-Wert bei
einer Einstellung der Konzentration der Zitronensäure oder
ihrer Salze auf den Bereich von vorzugsweise 0,1 mM bis 50 mM und
noch mehr zu bevorzugen auf 0,1 mM bis 10 mM anbelangt, so liegt
der pH-Wert der Zubereitung zu Beginn des Tests bei 7,3 bis 7,4
und am Ende der Lagerzeit bei 7,4 bis 7,8, was darauf schließen lässt, dass
die Änderung
im pH-Wert gering ist und dass selbst in Gegenwart von Bicarbonat-Ionen
eine stabile Spüllösung erzielt
werden kann.
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Beispiele
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Die
folgenden Beispiele dienen der weiteren Veranschaulichung der gegenwärtigen Erfindung.
Es versteht sich jedoch, dass die gegenwärtige Erfindung nicht auf diese
Beispiele begrenzt ist.
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Beispiel 1
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Spüllösung Nr.
1 (Beispiel) und Nr. 2 (Vergleichsbeispiel) wurden zur Prüfung zubereitet
durch aufeinander folgende Auflösung
vorbestimmter Mengen der in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten in der Reihenfolge,
in der sie aufgeführt
sind und schließlich
von D-3-Hydroxybutyrat (nachstehend als "D-3-HBA
bezeichnet) in destilliertem Wasser, zur Einstellung der Gesamtmenge
der Lösungen
auf 1 Liter; Einstellung des pH-Wertes der Lösungen mit verdünnter Salzsäure und
aseptische Filtrierung der Lösungen.
Die Bestandteile der handelsüblichen
Produkte B (Vergleichslösung
1) und M (Vergleichslösung
2), die als zusätzliche
Vergleichsbeispiele dienten, und die Konzentrationen der Bestandteile
sind in Tabelle 1 aufgeführt.
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Beispiel 2
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Der
Stabilitätstest
für die
Zubereitung der D-3-HBA mit der Lösung Nr. 1 von Beispiel 1 wurde
durchgeführt.
Fünf Flaschen
mit der zu prüfenden
Lösung
wurden zubereitet durch Einfüllen
von 500 ml der Zubereitung in transparente Glasbehälter und
Verschließen
der Flaschen. Die Flaschen wurden für einen Zeitraum von 6 Monaten
in einem Gerät
gelagert, das auf 40 ± 0,5°C und 75 ± 5% relativer
Luftfeuchtigkeit gehalten wurde. Es traten keine Veränderungen
im Aussehen der Lösungen,
in der Prüfung
auf unlösliche
Verunreinigungen und im osmotischen Druck auf. Die pH-Werte der
Lösungen
lagen zu Beginn der Lagerung bei 7,3 bis 7,4 und nach 6 Monaten
Lagerung bei 7,4 bis 7,8. Es traten also nur kleine Änderungen
auf. Damit hatte sich herausgestellt, dass die Zubereitung während der
Lagerung bei Raumtemperatur über
längere
Zeit stabil bleibt.
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Beispiel 3
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Zur
Bestätigung,
dass die D-Form des Isomers von 3-HBA unter den Isomeren der D-Form,
DL-Form und L-Form die stärkste
Wirkung hat, wurde der zellaktivierende Effekt von jedem Isomer
unter Verwendung einer inkubierten Endothelialzelle einer Rinderhornhaut
nach einem Verfahren auf Grundlage des MTT-Versuchs quantitativ
gemessen (Chem. Pharm. Bull., 41, 1118, 1993)
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Die
D-Form, D,L-Form und die L-Form der D-3-HBA wurde jeweils in Konzentrationen
von 0 (Kontrolle), 5 und 20 mM des Inkubationsmediums DULBECCO's MEM Salz aufgelöst und die
resultierenden Lösungen
wurden auf einer mit Kollagen beschichteten Nährlösungsplatte mit 24 Aufnahmestellen,
die mit der Endothelialzelle einer Rinderhornhaut vorinkubiert war,
injiziert und über
einen Zeitraum von 48 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden
jeder Aufnahmestelle 50 μl
aus dem Zellzählungs-Kit
(Produkt der DOJIN KAGAKU Ltd.) zugefügt und am Überstand die Extinktion bei
450 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
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Hinsichtlich
der zellaktivierenden Wirkungen der D-Form, D,L-Form und L-Form waren die in
Gegenwart der D-3-HBA inkubierten Zellen bei jeder Konzentration
am wirksamsten und die optimaole Konzentration war 20 mM. Die L-Form
zeigte im Vergleich zur Kontrollgruppe (die kein HBA enthielt) bei
keiner Konzentration einen signifikanten Unterschied in der Aktivität. Die D,L-Form zeigte im Vergleich
zur Kontrollgruppe bei Konzentrationen von 5 mM und 20 mM keinen
signifikanten Unterschied.
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Beispiel 4
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Unter
Verwendung von vier der in Beispiel 1 beschriebenen Test-Spüllösungen,
nämlich
der Lösungen Nr.
1 und Nr. 2, sowie der Vergleichslösungen 1 und 2 wurden deren
hornhautschützende
Wirkungen in einem in vitro-Versuch
miteinander verglichen.
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Sclerocorneas
(5 Stück
für jede
der vier Testlösungen,
insgesamt 20 Stück)
mit ungefähr
5 mm breiten Sclerae um die Cornea herum wurden aus reifen Kaninchen
extrahiert und 5 Stunden lang bei 36°C in den Test-Spüllösungen inkubiert.
Die Corneadicke wurde mit einem Ultraschall-Pachymeter (DHG-500 PACHETTE, ein
Produkt der DHG TECHNOLOGY) gemessen.
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Das
Ausmaß der
Veränderungen
der Dicke der Cornea (= Corneadicke vor der Inkubation minus Corneadicke
nach 5 Stunden Inkubation) nach der Inkubation von 5 Stunden Dauer
ist in 2 dargestellt.
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Die
Lösung
Nr. 1, die D-3-HBA und Bicarbonat-Ionen enthielt, hatte eine bemerkenswerte
corneaschützende
Wirkung im Vergleich zur Lösung
Nr. 2, die kein Bicarbonat enthielt. Ferner zeigte die Lösung Nr. 1
auch einen Effekt, der die Corneaschwellung verhindert, der gleichwertig
mit dem der handelsüblichen
Vergleichslösungen
1 und 2 oder besser war.
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Beispiel 5
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Die
vier in Beispiel 1 beschriebenen Typen der Test-Spüllösungen,
nämlich
die Lösungen
Nr. 1 und Nr. 2 und die Vergleichslösungen 1 und 2 wurden auch
auf ihren Einfluss auf die Hornhautdicke untersucht, in einem Versuch,
bei dem die Lösungen
in die vordere Kammer (die Kammer vor der Iris) von holländischen
Kaninchen (männlich
und weiblich, mit einem Gewicht von 1,9 bis 2,9 kg). eingebracht
wurden.
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Die
Durchführung
der Versuche erfolgte in Kaninchen, die intramuskulär mit Xylazin-Hydrochlorid ("Celactal®", ein Produkt der
Bayer AG) und mit Ketamin-Hydrochlorid ("Ketalar®", ein Produkt der
Sankyo AG) anästhetisiert
worden waren. Ein 3,2 mm breiter Einschnitt wurde mit einem Skalpell
für die
Augenchirurgie an der Cornea des rechten und des linken Auges von
jedem Kaninchen vorgenommen. Danach wurde durch den Einschnitt eine
Injektionsnadel der Größe 18 Gauge
mit gerundeter Spitze in die vordere Kammer eingeführt und
die vier Test-Spüllösungen 120
Minuten lang mit einer Durchflussrate von 10 ml/min angewandt. Das
Ausmaß der Änderung
in der Hornhautdicke durch jede der Lösungen wurde mit dem oben erwähnten Ultraschallpachymeter
vor Beginn der Spülung
und alle 30 Minuten nach dem Beginn der Spülung gemessen, unter Aufrechterhaltung
der lokalen Betäubung
durch Gabe von Augentropfen einer 0,4% Oxyprocain-Hydrochloridlösung. Das
Ausmaß der Änderungen
der Hornhautdicke im Zeitverlauf ist in 3 dargestellt.
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3 zeigt, dass die Lösung Nr.
1, die D-3-HBA und Bicarbonat-Ionen enthält, eine Spüllösungs-Zubereitung ist, die
eine signifikant kleine Änderung
in der Hornhautdicke verursacht und wie im Ergebnis des in vitro
Versuches von Beispiel 4 im Vergleich zu der Lösung Nr. 2, die keine Bicarbonat-Ionen
enthält
und zu den Vergleichslösungen
1 und 2 eine ausgezeichnete horn-hautschützende Wirkung hat.
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Beispiel 6
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In
einem invasiven Modell mit der Annahme eines Verfahrens der Linsenemulgierung
und Aspiration als chirurgisches Verfahren einer Kataraktoperation
wurden inkubierte Endothelialzellen der Rindercornea, die durch
Ultra schall geschädigt
waren, einem Versuch zur Untersuchung der Wiedererholung ihrer Barrierefunktion
unterzogen.
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Unter
Verwendung der durch Ultraschall geschädigten, inkubierten Endothelialzellen
der Rindercornea wurde in einem Versuch nach dem folgenden Verfahren
ermittelt, wie weit sich die Barrierefunktion durch die Wirkung
von D-3-HBA und Oxyglutathion wieder erholen kann.
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Die
einlagige Schicht einer Kultur von Endothelialzellen der Rindercornea
auf einem Filter, die durch Ultraschallanwendung auf die Zellen
in drei Durchgängen
mit 92 W/cm2 in Intervallen von 0,1 s geschädigt war, wurde
im Medium DULBECCO's
MEM (mit 10% Embryonalserum von Rindern), das 20 mM D-3-HBA oder 0,3 mM
Oxyglutathion enthielt, inkubiert. 4 zeigt
die Messergebnisse des Ausmaßes
der Erholung der Barrierefunktion anhand einer Änderung des spezifischen elektrischen
Widerstandes der Endothelialschicht im Zeitverlauf.
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Die
einlagige Schicht im Medium, das D-3-HBA enthielt, zeigte einen
Widerstandswert, der zu jedem Beobachtungszeitpunkt näher am Wert
vor der Ultraschallanwendung lag, als im MEM Medium; das Oxyglutathion
enthielt und im MEM Medium, das weder D-3-HBA, noch Oxyglutathion
enthielt und zeigte eine rasche Erholungswirkung der Barrierefunktion.
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Die
Spüllösung Nr.
1 (Beispiel) und die Test-Lösungen
Nr. 3, Nr. 4 und Nr. 5 (Vergleichsbeispiele) wurden durch Auflösung vorbestimmter
Mengen der in Tabelle 2 aufgeführten
Komponenten und schließlich
von D-3-HBA zur Einstellung der Gesamtmengen der wässerigen
Lösungen
auf 1 Liter zubereitet; die pH-Werte der Lösungen wurden mit verdünnter Salzsäure eingestellt
und die Lösungen
einer aseptischen Behandlung unterzogen.
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Für einen
Versuch wurden holländische
Kaninchen (männliche
und weibliche mit einem Gewicht zwischen 1,9 und 2,9 kg) verwendet.
Die Versuche wurden an Kaninchen durchgeführt, die durch intramuskuläre Injektion
von Xylazin-Hydrochlorid ("Celactal®", ein Produkt der
Bayer AG) und Ketamin-Hydrochlorid
("Ketalar®", ein Produkt der
Sankyo Co. Ltd.) anästhetisiert
waren, wobei am Rand der Cornea mit einem Skalpell für die Augenchirurgie
ein 3,2 mm breiter Einschnitt vorgenommen wurde. Danach wurde jeweils
eine Injektionsnadel der Größe 18 Gauge
mit gerundeter Spitze durch den Enschnitt in die Augenkammer vor
der Iris eingeführt
und die Spüllösung 90
Minuten lang mit einer Durchflussrate von 10 ml/min zur Perfusion
angewandt. Nach der Perfusion wurde der Einschnitt jeweils mit einer
Nähnadel
in einer Naht zugenäht.
Die Corneadicke wurde vor und während
der Perfusion mit dem in Beispiel 4 verwendeten Ultraschall-Pachymeter
gemessen (in Abständen
von 30 Minuten).
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Die
Wirkung der D-3-HBA, die darauf abzielt, Veränderungen der Hornhautdicke
durch Zugabe von D-3-HBA und von Bicarbonat-Ionen in die intraokuläre Perfusatlösung klein
zu halten, war signifikant (5). Andererseits
war bei den Zubereitungen, denen der intraokulären Spüllösung keine Bicarbonat-Ionen
zugefügt wurden,
die Wirkung, die darauf abzielt, Veränderungen der Hornhautdicke
durch Zugabe von D-3-HBA klein zu halten, nicht signifikant (6).
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Wie
vorstehend beschrieben, konnte die Zubereitung einer Spüllösung für die Augenchirurgie
erfindungsgemäß durch
Verwendung von Natrium-D-3-Hydroxybuttersäure und/oder von deren Salzen,
von Bicarbonat-Ionen; Phosphationen, Calciumionen, Magnesiumionen
und in einigen Fällen
Citrationen in Kombination mit einer Energiequelle durchgeführt werden
und dieses Präparat
weist eine hohe Sicherheit als Perfusatlösung für die Augenchirurgie auf, hat
eine ausgezeichnete Schutzwirkung für die Gewebe des Auges, einschließlich der
Endothelialzellen der Cornea und eine ausgezeichnete Wirkung bezüglich der
physischen Erholung geschädigter
okulärer
Gewebe und wird durch Zugabe von anorganischen Salzen, isotonischen
Wirkstoffen, Glucose, Pufferlösungen
und Stabilisatoren stabilisiert.