DE69815518T2

DE69815518T2 - S-2'-(2-(1-methyl-2-piperidyl) ethyl) cinnamanilide als 5-ht2 rezeptor antagonist

Info

Publication number: DE69815518T2
Application number: DE69815518T
Authority: DE
Inventors: M. Samir Amer
Original assignee: Amer Samir M Carpenteria
Current assignee: Amer Samir M Carpenteria
Priority date: 1997-02-28
Filing date: 1998-01-23
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2018-01-24
Also published as: DE69815518D1; US5780487A; AU750603B2; AU6037798A; WO1998038165A1; EP0973741B1; CA2282840A1; EP0973741A1; ATE242765T1; CA2282840C; ES2201440T3; NO318443B1; KR20000075696A; JP2001527521A; NO994181L; NO994181D0; JP3492378B2

Description

Die vorliegende Erfindung die Herstellung eines speziellen Isomers, nämlich eines speziellen S- (oder (–) oder I- oder Levo-)-Isomers und speziell die Verbindung S-2'-[2-(1-Methyl-2-piperidyl)ethyl]cinnamanilid oder dessen saures Salz.
In meiner US-P-5 266 571 vom 30. November, 1993, habe ich ein Verfahren zum Behandeln oder Verhüten von Hämorrhoiden bei Tieren durch Verabreichung eines 5-HT₂-Rezeptorantagonisten auf der Grundlage der Entdeckung offenbart und diese patentrechtlich beansprucht, dass 5-HT(5-Hydroxytryptamin oder Serotonin) eine bedeutende Rolle bei der Heilung sowohl der Erhöhung des venösen Druckes und/oder der Thrombozytenaggregation spielt, die zur Verstopfung der Venen im Hämorrhoidalplexus führen, das 5-HT₂-Rezeptoren eher als 5-HT₁-Rezeptoren beteiligt sind und dass 5-HT₂-Rezeptorantagonisten damit Hämorrhoiden inhibieren. Als derartige bevorzugte Antagonisten wurden 2'-[2-(1-Methyl-2-piperidyl)ethyl]cinnamanilid-hydrochlorid (MPEC) und zwei andere Verbindungen erwähnt.
In meiner US-P-5 605 902 vom 25. Februar, 1997, von der die vorliegende Patentanmeldungeine Teilfortführungsanmeldung ist, wobei die ältere US-Patentanmeldung der am 1. September, 1994, veröffentlichten PCT WO 94/18958 veröffentlichten Anmeldung entspricht, wurde von mir außerdem die Verwendung der gleichen 5-HT₂-Rezeptorantagonisten zum Behandeln oder Verhüten von Krampfadern oder Venenklappeninsuftizienz oder zum Behandeln von Wunden offenbart und diese patentrechtlich beansprucht.
Gegenstand der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung eines Verfahrens für die Herstellung einer verbesserten, reineren und verdünnten und/oder effektiveren Form von S-MPEC sowie als eine neue intermediäre Verbindung für die Herstellung eines solchen Produktes.
Weitere Aufgaben und Vorteile werden anhand der Beschreibung offensichtlich.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Lösung einer oder mehrere der vorgenannten Aufgaben wird dadurch möglich, dass die racemische (RS) MPEC-Mischung, die in den Erfindungen meiner zwei vorgenannten US-Patentanmeldungen zum Einsatz gelangt, in ihre einzelnen S- und R- (oder (+) oder d)-Isomere getrennt wird und entdeckt worden ist, dass das R-Isomer vollständig oder weitgehend frei ist von jeglicher Aktivität als 5-HT₂-Rezeptorantagonist und in diesem Zusammenhang ein Fälschungsstoff oder Verunreinigung in jeglicher Mischung mit dem S-Isomer darstellt, wobei die Mischung des S-Isomers der einzige aktive 5-HT₂-Rezeptorantagonist ist, und dass das S-Isomer (S-MPEC) damit überraschend mindestens als 5-HT₂-Rezeptorantagonist 2 Mal so wirksam ist wie die racemische MPEC-Mischung (RS-MPEC). Damit lässt sich der 5-HT₂-Rezeptor-blockierende Effekt, der mit irgendeiner vorgegebenen Menge des RS-MPEC erzielt wird, mit sagen wir der Hälfte der Menge des S-MPEC erzielen. Jeder beliebigen therapeutischen Zusammensetzung, die eine gleiche Menge von Wirkstoff und Fälschungsmittel enthält, würden ansonsten Nachteile innewohnen. Die isomeren und racemischen Formen von MPEC haben die folgende empirische Formel gemeinsam: C₂₃H₂₈N₂O (MW 348,49).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung gewährt ein Verfahren zum Herstellen von S-MPEC entsprechend der Festlegung in dem hierin beigefügten Anspruch 1. Darin wird die Verwendung in therapeutischen Zusammensetzungen und in der Behandlung von Tieren mit einem Bedarf für einen 5-HT₂-Rezeptor-blockierenden Effekt von Verbindungen oder Mischungen davon offenbart, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus R-Isomer-freiem S-2'-[2-(1-Methyl-2-piperidyl)ethyl]cinnamanilid (S-MPEC), einem pharmazeutisch zulässigen Salz davon und beliebige Mischungen davon mit bis zu etwa 10% irgendeines ihrer entsprechenden R-Isomere (R-MPEC) und Salze davon.
Die vorgenannten Mischungen enthalten bevorzugt nicht mehr als etwa 4% und mehr bevorzugt nicht mehr als etwa 1% der R-MPEC-Verunreinigung, wobei das S-MPEC bevorzugt das Chlorwasserstoffsalz ist und/oder das S-MPEC bevorzugt frei ist von R-MPEC. Der Begriff "weitgehend frei von R-Isomer" (oder gleichwertige Formulierung) soll Mischungen umfassen, die von etwa 0,0001% bis etwa 10% des R-Isomers (Stereoisomer) enthalten.
Die Erfindung umfasst auch die Herstellung eines neuartigen Intermediats, S-[2-(o-Aminophenethyl)-1-methyl-piperidin-dibenzoyl-L-tartrat-Salz] (S-APEMP. DBLT (oder L-DBT)), umfassend das Umsetzen von 1 Mol 2-Nitrobenzaldehyd mit 1 Mol 2-Picolin in Gegenwart von Essigsäureanhydrid und Behandeln des resultierenden 2-(o-Nitrostyryl)-pyridin mit einem quaternisierenden Methylierungsmittel, um das entsprechende 2-(o-Nitrostyryl)-1-methylpyridinium (NSMP)-Salz zu erzeugen; Reduzieren des Pyridinium-Salzes durch katalytische Hydrierung, um das entsprechende RS-2-(o-Aminophenethyl)-1-methylpiperidin (RS-APEMP)-Hydrosalz zu erzeugen; Behandeln des Hydrosalzes mit einem alkalischen Mittel, um die freie Base (RS-APEMP) freizusetzen; und Behandeln der freien Base mit Dibenzoyl-L-weinsäure (DBLT oder L-DBT), um das neuartige S-APEMP.DBLT zu erzeugen. Das Letztere wird sodann mit einem alkalischen Mittel behandelt, um die freie Base (S-APEMP) freizusetzen, die dann mit einer äquimolaren Menge von Cinnamoylchlorid unter Erzeugung von S-MPEC umgesetzt wird.
In dem vorgenannten Verfahren wurden die ersten Schritte für das Herstellen des NSMP-Salzes in Dykstra et al., J. Med. Chem. 16 1015 (1973) und L. Horwitz, J. Org. Chem. 21 1039 (1956) offenbart und der nächste Schritt der Herstellung von APEMP-Hydrosalz in Dykstra et al., US-P-4 064 254 und speziell in Beispiel 1 offenbart. Die Beispiele 1, 25 und 141 der letztgenannten Patentschrift offenbaren die Herstellung des "I"-MPEC und "d"-MPEC separat unter Anwendung von Prozeduren, die ganz ähnlich des vorstehend beschriebenen Prozesses des Anmelders mit der Ausnahme sind, dass die Abtrennung mit d-Camphersäure in 95% Ethanol (anstelle der Dibenzoyl-L-Weinsäure des Anmelders) erreicht wird und eine fraktionierte Kristallisation erfordert, die unzureichend ist. Außerdem zeigt die in der Patentschrift für das "I"-MPEC angegebene optische Drehung von –42,8° eine verminderte Wirksamkeit (im Vergleich zu dem S-MPEC-Produkt des Anmelders mit einer optischen Drehung von –46°).
Es ist ferner signifikant, dass in der Patentschrift US-P-4 064 254 keine Erkenntnis irgendeiner Möglichkeit dafür offenbart wird, dass die Eigenschaften der S- und R-Isomere von MPEC differieren könnten und noch viel weniger, dass eines der Isomere in einem Bereich vollständig inaktiv sein könnte, in dem das andere Isomer in hohem Maße aktiv ist, und noch viel weniger, wenn diese Aktivität dem Blockieren der 5-HT₂-Rezeptoren dient, und noch viel weniger bei der Behandlung oder Verhütung von Hämorrhoiden, Krampfadern oder Venenklappeninsuffizienz oder Koronarinsuffizienz oder bei der Behandlung von Wunden oder als Analgetikum oder Lokalanästhetikum. Die Anmelder der US-P-5 266 571 haben die Insuffizienz nach dem Bekanntheitsstand diskutiert und die Antiserotonin-Aktivität allgemein als eine Grundlage in der Erwartung eines Erfindungsgedankens auf der Grundlage des 5-HT₂-Rezeptorantagonismus vorgeschlagen. Eine ähnliche Situation besteht hier, wo die einzige, in der '254-Patentschrift offenbarte Aktivität die von Antiarrythmie und Antiserotonin ist.
Das S-MPEC (oder sein Salz) kann in reiner Form oder mit einem Gehalt der geringfügigen, angegebenen Mengen der inaktiven R-Isomerverunreinigung so in freier Form bereitgestellt und verwendet werden, oder in oder mit einem nichttoxischen pharmazeutisch zulässigen festen, flüssigen oder partikulären Träger in Form einer Paste, Salbe, Creme oder Gel-Zusammensetzung, die für die topische oder rektale Verabreichung geeignet sind, wünschenswert mit einem Mittel zur Gelbildung, zum Binden oder Eindicken, um die gewünschte Viskosität zu vermitteln, oder in Form einer Tablette, Kapsel, Kautablette, Pastille, Pulver, Spray, Aerosol, Einlauf, Zäpfchen, Sirup, Elixier, wässrige oder ölige Suspension, Emulsion oder Lösung, Paste, Salbe, Creme oder Gel in einer für die systemisch orale, rektale oder parenterale Verabreichung als, wie beispielsweise durch subkutane, intraperitoneale, intramuskuläre oder intravenöse Injektion oder mit Hilfe der transdermalen oder Inhalationstherapie.
Die S-MPEC kann in freier Form oder als ein in der Regel wasserlösliches, nichttoxisches, pharmazeutisch zulässiges saures Additionssalz mit solchen verhältnismäßig nichttoxischen organischen oder anorganischen Säuren eingesetzt werden, Schwefelsäure, Sulfonsäure, Phosphorsäure, Phosphonsäure, Bromwasserstoffsäure, Chlorwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Sulfaminsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Essigsäure, Milchsäure, Succinsäure, Äpfelsäure, Schleimsäure, Weinsäure, Citronensäure, Gluconsäure, Benzoesäure, Cinnamonsäure, Isethionsäure und dergleichen.
Geeigneterweise weisen die Zusammensetzungen ein ausreichend aktives S-MPEC-Material auf, um eine Dosis von 0,05 bis 10 mg/kg Körpergewicht und mehr geeignet 0,2 bis 6 mg/kg Körpergewicht bereitzustellen. Diese Zusammensetzungen können 1 bis 3 Mal täglich oder nach Erfordernis so lange genommen werden, bis das Symptom oder die Erkrankung, die behandelt werden, zurückgegangen oder behoben worden sind.
Die Zusammensetzungen können den Wirkstoff in Mengen im Bereich von weniger als 1% bis mehr als 99% enthalten, wobei der Rest ein pharmazeutisch zulässiger fester oder flüssiger Träger ist, der andere konventionelle Arzneimittelträger enthalten kann. Beispiele für derartige Träger und Arzneimittelträger schließen Füllstoffe ein, Bindemittel, Geschmacksmittel, Süßungsmittel, Füllmittel und Farbmittel, Antioxidantien, anionische, nichtionische, kationische, zwitterionische und amphotere oberflächenaktive Mittel, suspendierende, dispergierende und emulgierende Mittel, puffernde und pH-Wert-regulierende Mittel, Wasser und organische Lösemittel, Feuchthaltemittel, Eindickungsmittel, Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel, Formtrennmittel, Zerfallhilfsmittel, Antizerfallsmittel, Gleitmittel und dergleichen. Beispiele für konventionelle, pharmazeutisch zulässige Träger und Arzneimittelträger sind umfangreich auf dem Gebiet offenbart worden, einschließlich in den Diskussionen der US-P-4 515 772 (Parran et al., Proctor & Gamble), US-P-4 966 777 (Gaffar et al., Colgate-Palmolive Company) und US-P-4 728 512 (Mehta et al., American Home Products).
Die folgenden Beispiele sind für bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung lediglich veranschaulichend. Sofern nicht anders angegeben, sind hierin und in den beigefügten Patentansprüchen alle angegebenen Teile und Anteile auf Gewicht bezogen und die Temperaturen in °C angegeben.
Das folgende Beispiel 1 veranschaulicht anhand der Gleichung und Beschreibung eine bevorzugte Ausführungsform eines Verfahrens zum Herstellen von S-MPEC mit unterstützenden Daten, die die Eigenschaften von Intermediaten, Endprodukten, usw. charakterisieren, identifizieren und/oder untermauern.
Beispiel 1 Herstellung und Bestätigung von S-MPEC-I
S-MPEC-chemischer Prozess
(A) 2-(o-Nitrostyryl)-1-methylpyridiniumiodid (NSMP-I)
In einen 50-Liter-Rundkolben wurden 2-Nitrobenzaldehyd (3.500 g, 23,2 Mole), 2-Picolin (3,2 l, 32.8 Mole) und Essigsäureanhydrid gegeben. Die Mischung wurde ausreichend unter einer inerten Atmosphäre (Stickstoff oder ein anderes inertes Gas) gerührt und am Rückfluss für 27 Stunden erhitzt. Die Mischung wurde zur sicheren Handhabung bis unterhalb von 100°C gekühlt, in einem geeigneten, mit einer äußeren Kühlung ausgestattetem Behälter und unter wirksamem Rühren auf 10,5 kg Eis abgeschreckt. Der pH-Wert wurde mit 45%igem wässrigem Natriumhydroxid mit einer Geschwindigkeit auf 11 eingestellt, um die Temperatur unterhalb von 50°C zu halten. Nach dem Kühlen bis 20° bis 30°C wurde der granuläre Feststoff durch Filtration aufgenommen und ausgiebig mit Wasser gewaschen. Ausbeute: 6.572 g rohes 2-(o-Nitrostyryl)pyridin (NSP).
Dieser Feststoff wurde in einen 50-Liter-Rundkolben gegeben, in Aceton (14 l) und Methyliodid (2,94 l, 47,7 Mol) (quaternisierendes Methylierungsmittel) zugesetzt. (Es können andere derartige Mittel (Alkylierungsmittel) verwendet werden, die in der Regel die Formel CH₃X haben, wobei X ein Anion darstellt, wie beispielsweise Sulfat, Methylsulfat, Halogenid (Cl, Br, I), usw.). Die Mischung wurde unter einer inerten Atmosphäre (Stickstoff oder ein anderes inertes Gas) für 18 Stunden unter dem Rückfluss erhitzt. Nach dem Kühlen bis 20°C wurde der Niederschlag durch Filtration aufgenommen und mit Aceton oder einer 1 : 1-Mischung von Aceton : Ethylacetat (3 × 3,5 l) gewaschen. Das Trocken bis zur Gewichtskonstanz bei 50° bis 60°C lieferte 6.839 g (80%) von NSMP.I.
(B) RS-2-(o-Aminophenethyl)-1-methylpiperidin, Hydroiodid (RS-APEMP.HI)
In ein 18,9-Liter (5 gal) Reaktionsgefäß wurde eine Lösung von NSNP.I (935 g, 2,5 Mol) in Methanol (14 l) in einer Wasserstoffatmosphäre bei 378,95 kPa (55 psi) in Anwesenheit von Pd/C (5 oder 10%, 98 g) reduziert. Nach Entfernung des Katalysators und Eindampfen des Filtrats in der üblichen Weise wurde der Rückstand in heißem Methanol (2,8 l) aufgelöst. Der heißen Mischung wurde Ethylacetat (2,8 l) zugesetzt, um die Kristallisation einzuleiten. Ausbeute: 516,3 g (59%) an RS-APEMP.HI.
(C) S-[2-(o-Aminophenethyl-1-methylpiperidin-dibenzoyl-L-tartrat] (S-APEMP.DBLT)
Es wurde eine Lösung von RS-APEMP.HI (516 g, 1,5 Mol), Ethylacetat (5,5 g) (oder ein anderes niedrig siedendes und mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel, wie beispielsweise Benzol, Toluol, usw.) mit 5%igem wässrigem Natriumhydroxid extrahiert, um die freie Base freizusetzen (organische Phase), die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, über einem geeigneten Trocknungsmittel getrocknet (wie beispielsweise wasserfreies Natriumsulfat, Magnesiumsulfat, Kaliumcarbonat, usw. ). Nach dem Abtrennen des Lösemittels von dem Trocknungsmittel wurde die Lösung unter Vakuum eingedampft und die restliche freie RS-APEMP-Base in Methanol (1,0 l) aufgelöst und eine Lösung von Dibenzoyl-L-Weinsäure (540 g, 1,5 Mol) in Methanol (2,3 l) zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gehalten. Der kristalline Niederschlag wurde aufgenommen und aus Methanol (3,4 l) umkristallisiert. Ausbeute: 246 g an S-APEMP.DBLT. (28,6 Gew.%, 57,2% an S-APEMP).
(D) S-2'-[2-(1-Methyl-2-piperidyl)ethyl]-cinnamanilid (S-MPEC)
Es wurde eine Lösung von S-APEMP.DBLT (287 g, 0,5 Mol) in Ethylacetat (3,2 l) (oder ein anderes niedrig siedendes und mit Wasser nicht mischbares Lösemittel) mit 7,5%igem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3,2 l) extrahiert, um das S-APEMP freizusetzen. Nach einer Wäsche mit Wasser und einem Trocknen über einem geeigneten Trocknungsmittel wurde das Lösemittel unter Vakuum entfernt. Der ölige Rückstand, S-APEMP, wurde in Ethylacetat (1,0 l) aufgelöst und wasserfreies Kaliumcarbonat (412 g, 3,0 Mol) (oder ein anderer geeigneter Säureakzeptor, wie beispielsweise Triethylamin, Pyridin, usw.) zugesetzt. Es wurde langsam Cinnamoylchlorid (143 g, 0,7 Mol) in 700 ml Ethylacetat zugegeben. Nach der ersten Reaktion wurde die Mischung für 14 Stunden refluxiert. Nach dem Kühlen bis Raumtemperatur wurde die Mischung mit Wasser (1,7 l) extrahiert und über einem geeigneten Trocknungsmittel getrocknet. Nach dem Entfernen des Trocknungsmittels wurde das Lösemittel im Vakuum abgetrieben und der Rückstand in heißem Ethylacetat (280 ml) aufgelöst und langsam auf Raumtemperatur kühlen gelassen; die Filtration ergab S-MPEC (136 g, 79% Ausbeute). Analyse: berechnet für C, H, N: C, 79,27; H, 8,10; N, 8,04. Gefunden: C, 79,27; H, 8,06; N, 8,07. HPLC(chiral)-Reinheit: 99,5% [α]_D25* = –46° (c = 0,01, EtOH); Schmelzpunkt: 128°C.
Absolute Konfiguration von 1-MPEC
Zusammenfassung
Die absolute Konfiguration von 1-MPEC wurde als "S" anhand der Röntgenkristallographie von 1-APEMP.L-DBT.2H₂O ermittelt, bei dem es sich um ein Intermediat von 1-MPEC handelt.
Da die Bemühungen, von 1-MPEC Kristalle aufzuziehen, zu keinerlei erfolgreichen Ergebnissen führten, wurde sodann die Umkristallisation feiner Kristalle von 1-APEMP.L-DBT, bei dem es sich um ein Intermediat von 1-MPEC handelt, versucht. Das langsame Umkristallisieren von 1-APEMP.L-DBT ergab ausreichend große Kristalle des entsprechenden Dihydrats.
Umkristallisation
1-APEMP.L-DBT → 1-APEMP.L-DBT.2H₂O
MeOH-Wasser (1/1)
Die absolute Konfiguration von 1-APEMP.L-DBT.2H₂O wurde als "S" anhand der Röntgenkristallographie ermittelt. Die Konfiguration von 1-APEMP.L-DBT ist unter Reaktionsbedingungen zur Umwandlung in 1-MPEC erhalten worden, da Cinnamoylchlorid lediglich mit einer Amino-Gruppe am Benzolring reagiert und keinen anderen Teil des Moleküls beeinflusst. Demzufolge wurde die absolute Konfiguration von 1-MPEC als "S" ermittelt.
Experimentelles
Es wurden 500 mg feiner Kristalle von 1-APEMP.L-DBT, dessen stereochemische Reinheit größer als 99,5% d. e. betrug, in 10 ml Methano/Wasser (1/1) aufgelöst und die Kristalle bei Raumtemperatur für 7 Tage aufgezogen, um Kristalle von 1-APEMP.L-DBT. 2H₂O zu ergeben. Die experimentellen Einzelheiten und Ergebnisse der Röntgenkristallographie sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Die für die Röntgenkristallstrukturanalyse des 1-APEMP.L-DBT-Salzes verwendete Anlage war wie folgt:

Messanordnung:	ENRAF NONIUS CAD4 (ein automatisches Röntgendiffraktometer für Einkristalle)
Mess-Software:	Express^®
Computer für die Analyse:	DEC VAX3100
Software für die Analyse:	Molen^®

Tabelle 1 Röntgenkristallographie von I-ADEMP.L-DBT.2H₂O

Probename	I-ADEMP.L-DBT. 2H₂O
Molekularformeln	C₃₂H₃₆N₂O₈. 2H₂O
Röntgen	CuKα (λ = 1,54184Å)
Kristallgröße (mm)	0,4 × 0,3 × 0,3
Kristallsystem	orthorhombisch
Raumgruppe	P2₁ 2₁ 2₁
a (Å)	13,3583 (7)
b (Å)	30,298 (2)
c (Å)	7,8105 (6)
Vol. (Å)	3161,2 (5)
z	4
2θ (Grad)	6,4 < 2θ 150
D (berechn.)	1,287
R	0,052
Zahl der Reflektionen	3724
Zahl der verwendeten Parameter	518
μ(CuKα)(cm^–1 )	1,89
Zahl von I > 3 σ (I)	3476
Maximum e/Å³	0,239
Standardreflektion	24 Punkte (8 < θ < 14)
Methode Datenkorrektur	Lorentz- und Polarisationseffekt
Aufnahme der Reflektionsdaten	Enraf Nonius CAD-4 System
Strukturbestimmung	Enraf Nonius MolEN Programm

Tabelle 2 Bescheinigung der Analyse Verbindungsname: (–)-2'-[2-(1-Methyl-2-piperidyl)ethyl]cinnamanilid (I-MPEC, S-MPEC)
Tabelle 3 Bescheinigung der Analysen Verbindungsname: d-2'-[2-(1-Methyl-2-piperidyl)ethyl]cinnamanilid (R-MPEC, (+)-MPEC)
Referenzbeispiel 2
Einflüsse von MPEC in isolierter Human-Colonvene, kontrahiert mit 5-Hydroxytryptamin (5-HT)
Das Ziel dieser Untersuchung war die Bestimmung des IC₅₀ von MPEC in isolierter Human-Colonvene, kontrahiert durch 5-Hydroxytryptamin. MPEC wurde unter drei Formen getestet: das Racemat, das R-Isomer und das S-Isomer, um das aktive Isomer zu identifizieren. Es wurden Stammlösungen von MPEC(10^–2 M) (Racemat, R- und S-Isomere) in angesäuertem Wasser angesetzt (Wasser-Salzsäure, 99,50–0,50%) und anschließend in Wasser verdünnt.
Es wurde 5-HT (5-Hydroxytryptamin oder Serotonin) in Wasser mit 10^–2 M aufgelöst und anschließend in Wasser verdünnt.
Das in dieser Untersuchung verwendete Wasser wurde von einem Milli Q-Apparat (Millipore) erhalten.
Die Human-Colonvenen wurden von Patienten (4 Männer und 2 Frauen, 60 ± 7 Jahre alt) erhalten, die einer Resektion eines Teils des Colons aufgrund einer Colon-Malignität oder Polyposis unterzogen wurden. Unmittelbar nach der operativen Entfernung wurde eine Colonvenenprobe entnommen und sofort in das Labor in physiologischer Kochsalzlösung der folgenden Zusammensetzung gebracht (in mM): NaCl (112), KCl (5), NaHCO₃ (25), Glucose (11,5), KH₂PO₄ (1,2), CaCl₂ (2,5) und MgSO₄ (1,2), pH 7,4. Diese Lösung wurde bei 37°C gehalten (tragbare Thermostatbox, Veba Meditemp) und mit Sauerstoff begast. Unter dem Stereomikroskop wurden Ringe der Human-Colonvenen (3–5 mm, 9,6 ± 1,1 mg, n = 25) ohne Fett präpariert und unter 500 mg Ruhespannung in einem 25 ml Organbad aufgezogen, das physiologische Kochsalzlösung enthielt und bei 37°C gehalten wurde (Niedertemperatur-Thermostat Lauda RCS6) und mit 95% O₂ und 5% CO₂ begast. Die Spannung wurde isometrisch mit einem Messwandler (Grass FT 03) gemessen, der mit einem Verstärker (Brückenkopplungstyp 570, Hugo Sach Elektronik) verbunden war, der an einem oszillographischen Schreiber angeschlossen war (Graphtec-Zeilenschreiber, Marke VII WR 3101, Hugo Sach Elektronik) sowie mit einem Computer zur Datenerfassung und Kontrolle von Elektroventilen (Amstrad PC 1512SD, ausgestattet mit AD/DA-Karte und IO-Karte).
Jeden Ring ließ man für 60 min in physiologischer Kochsalzlösung äquilibrieren. Nach Ablauf dieser Zeit wurde die Human-Colonvene durch 5-HT (3 × 10^–6 M, Konzentration zum induzieren einer submaximalen phasischen Kontraktion) stimuliert. Sobald die maximale Spannung beobachtet wurde, wurde die Colonvene mit physiologischer Kochsalzlösung alle 10 min für die Dauer von 40 min gewaschen. Sobald reproduzierbare Kontroll-Kontraktionen erhalten wurden, wurden die Präparate für 60 min inkubiert mit MPEC (die Racemat-Form des S- oder des R-Isomers) bei einer konstanten Konzentration: 10^–9, 3 × 10^–9 oder 10^–8 M oder mit Wasser als Kontrolle vor einer letzten Kontraktionserzeugung durch 5-HT mit 3 × 10^–6 M. Es wurden ausschließlich Präparate verwendet, bei denen die Kontrollkontraktionen angepasst waren. Präparate, die eine Spannung unterhalb von 250 mg entwickelten oder weniger als 2 mg wogen, wurden verworfen.
Zwischen den unterschiedlichen experimentellen Gruppen wurde kein statistischer Unterschied in den Werten der Kontrollparameter festgestellt.
Die durch MPEC ausgelöste, beobachtete Hemmung wurde als Prozentwert der letzten Kontrollkontraktion ausgeführt. Der pD'₂-Wert (der negative Logarithmus der molaren Konzentration eines Antagonisten, der zur Verringerung auf 50% des maximalen Ansprechens in der Lage ist, das von einem Agonisten hervorgerufen wurde) wurde nach der Methode von Van Rossum (1963) berechnet. Es wurden ausschließlich Daten verwendet, die in Beziehung zur Konzentration des Hemmstoffes standen, der eine mittlere Hemmung zwischen 10 und 90% erzeugte. Der IC₅₀-Wert wurde als der Numerus von pD'₂ berechnet.
Die Ergebnisse wurden als Mittelwerte ± mittlere Standardabweichung angegeben.
Der Vergleich zwischen 2 Mittelwerten wurde unter Anwendung des "Student t-Versuches" nach Prüfung der Varianzhomogenität mit Hilfe des X²-Tests ausgeführt. Der Vergleich zwischen den verschiedenen Werten wurde unter Anwendung eines F-Tests (Varianzanalyse mit einem Klassifikationsparameter) nach Kontrolle der Homogenität der Varianzen unter Anwendung des Bartlett-Tests (Lambert, 1963) ausgeführt.
Tabelle 4
Die vorstehend angegebenen Ergebnisse zeigen, dass S-MPEC 34,67 Mal so aktiv ist wie R-MPEC (zwei Mal so aktiv wie RS-MPEC) und zwar beim Blockieren von 5-HT₂-Rezeptoren in Human-Colonvenen. Dieses ist der Hauptmechanismus der Wirkung von MPEC gegen Hämorrhoiden, Krampfadern, Venenklappeninsuftizienz und Koronarinsuffizienz, Wundheilung und andere 5-HT₂-Rezeptor-induzierte Symptome. R-MPEC zeigt sich hier weitgehend unwirksam und effektiv als Verunreinigung.
Referenzbeispiel 3
Einflüsse von MPEC auf Phenylchinon-induziertes Winden in Mäusen
Mäuse, die oral mit bestimmten Analgetika, Tranquilizern oder Anxiolytika dosiert sind, sprechen nicht in einer typischen Form auf eine intraperitoneale Dosis (2,5 mg/kg) von Phenyl-p-benzochinon (PPB) an. Das übliche Ansprechen ist ein Winden, das charakterisiert ist durch ein Strecken und Drehen des Körpers. Die Blockade dieses Verhaltens wird gemessen, indem die Zahl der Windungsepisoden, die bei verschiedenen Dosismengen der Testverbindung beobachtet werden, mit denen verglichen wird, die bei Kontrolltieren mit Vehikel beobachtet werden. Die Windungsepisoden bei 5 Tieren werden gleichzeitig mit einem 5-Tasten-Laborzähler gezäht. Die Gesamtzahl der Windungsepisoden wird für jede Maus bei exakt 10 min nach PPB-Injektion gezählt.
Die Ergebnisse der Tests von RS-, R- und S-MPEC in der vorgenannten Prozedur mit einer physiologischen Kochsalzlösung als Kontrolle und einem bekannten analgetischen Indomethacin sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
Tabelle 5
Die vorgenannten Ergebnisse zeigen, dass R-MPEC, das 25,3 Windungen erlaubt, als ein Analgetikum weitgehend inaktiv ist und S-MPEC, das lediglich 11,4 Windungen erlaubt, im Wesentlichen die gesamte analgetische Wirkung der Mischung von S-MPEC und R-MPEC in RS MPEC übernimmt, das 15,3 Windungen erlaubt. Die überraschend hohe analgetische Wirkung von S-MPEC ist eine bedeutende Eigenschaft bei der Behandlung von Hämorrhoiden, Wunden und Krampfadern, ist aber auch oftmals anwendbar bei der Behandlung von Venenklappeninsuftizienz und Koronarinsuffizienz.
Referenzbeispiel 4
Blockade von 5-HT₂-Rezeptoren auf Ratten-Vorderhirn
Es wurden Ratten durch die Dekapitierung getötet, um die Cortex Cerebralis zu entfernen, zu der ein 10-faches Volumen einer 0,32 M Saccharose-Lösung zur Homogenisierung mit POLYTRON zugesetzt wurde (Einstellungen: 6 und 30 Sekunden, KINEMATICA AG, Schweiz). Anschließend wurde für 10 min eine Zentrifugation bei 1.000 g ausgeführt. Der resultierende Überstand wurde einer 20-minütigen Zentrifugation bei 35.000 g unterworfen und ein 10-faches Volumen von 50 nM Tris-Puffer (pH: 7,4; 25°C) dem Niederschlag zugesetzt, der vor dem erneuten Suspendieren erhalten wurde. Diese Suspension wurde einer 10-minütigen Inkubation bei 37°C vor der Ausführung einer 20-minütigen erneuten Zentrifugation bei 35.000 g unterzogen. Der abschließende Niederschlag wurde in einem 40-fachen Volumenpuffer für die Messung suspendiert (50 mM Tris, 4 mM CaCl₂, 10 μM Pargylin, 0,1% Ascorbinsäure, pH: 7,7, 25°C) und diese Suspension als das Membranpräparat in dem Bindungsversuch verwendet. Es wurde ³N-Ketanserin mit 0,1 ml (Endkonzentration: 0,4 nM) und 0,4 ml des Membranpräparats dem Testmedikament (S-MPEC und R-MPEC) und 0,5 ml Puffer zur Messung zugesetzt, worin die Endkonzentration (1 μM) von Methysergid aufgelöst wurde. Die Lösung wurde auf ein Gesamtvolumen von 1,0 ml angesetzt und für 20 min bei 37°C reagieren gelassen. Nach Beendigung der Reaktion wurde die reaktionsfähige Lösung durch Absaugen unter vermindertem Druck und Verwendung von 0,1% Polyethylenimin-Lösung-imprägniertem Whatmann GF/C-Filter filtriert und das Filter 3 Mal mit 5 ml 50 mM Tris-Puffer (pH: 7,4, 25°C) gewaschen, das sofort mit Eis gekühlt wurde und wozu 5 ml Scintisol zugesetzt wurden, um die Radioaktivität auf dem Filter mit einem Flüssigszintillationszähler zu zählen. Das spezifische Bindungsvolumen wurde als derjenige Wert ermittelt, der nach Abzug des nichtspezifischen Bindungsvolumens unter Anwesenheit von 1 μM Methysergid von dem Gesamtbindungsvolumen erhalten wurde. Der gesamte Versuch wurde in 3-facher Ausführung ausgeführt. Ein Protein-Assay des verwendeten Membranpräparats wurde nach der Methode von Lowry et al. ausgeführt.
Die Testergebnisse von S-MPEC und R-MPEC in der vorstehend ausgeführten Prozedur sind in der folgenden Tabelle dargestellt.
Tabelle 6
Die vorgenannten Ergebnisse zeigen, dass S-MPEC für das Blockieren von 5-HT₂-Rezeptoren von Ratten-Vorderhirnen 67 Mal so stark ist (116/1,73) wie R-MPEC.
Referenzbeispiel 5
Einfluss von MPEC auf Serotonin plus Kollagen-induzierter pulmonarer thromboembolischer Tod in Mäusen
Aufgabe:
Serotonin spielt eine bedeutende Rolle bei der Thrombusbildung. Die antiserotonerge Wirkung von MPEC wurde durch eine Hemmung von thromboembolischem Tod untersucht.
Tiere:
männliche Mäuse des Stammes ddY.
Referenz-Arzneimittel:
Ticlopidin, klinisch als Antithrombotikum verwendet.
Test-Arzneimittel:
S-MPEC, R-MPEC.
Methode:
Es wurden Mäuse verwendet, die über Nacht nüchtern gehalten wurden. Der akute pulmonare Thromboembolismus wurde durch eine schnelle Injektion der Mischung von Serotonin (50 μg/10 g Körpergewicht) und Kollagen (10 μg/10 g Körpergewicht) in die Schwanzvene eingeleitet und dann die Sterblichkeit der Mäuse innerhalb von 10 min ermittelt. Arzneimittel wurden intrarektal 1 Stunde oder oral 3 Stunden vor der Injektion von Serotonin und Kollagen verabreicht. Bei oraler Verabreichung war das Arzneimittel in Tween 80/destilliertem H₂O (0,5 Vol.%/Vol.) suspendiert und bei intrarektaler Verabreichung in Alvolen dispergiert.
Bei diesem Thrombosemodell haben wir die Dosis für jeden Stimulus so gewählt, dass eine Mortalität von 0 bis 15% durch jeden Stimulus allein und eine Mortalität von etwa 80% durch Kombination beider Stimuli erzeugt wurde.
Die Testergebnisse sind wie folgt zusammengestellt:
Tabelle 7
Diese Ergebnisse legen nahe, dass MPEC durch den Darm aufgenommen werden kann und eine antithrombotische Wirkung ausübt. Bei einer oralen Dosis von 10 mg/kg Körpergewicht gewährt S-MPEC bei 80% einen um das 3-fache besseren Schutz als den Schutz von 25% des R-MPEC. Die antithrombotische Wirkung, die hier zum Ausdruck kommt, könnte entscheidend für die positiven Wirkungen von S-MPEC bei Wundheilung sein. Ein Teil des Problems bei dieser Erkrankung ist die Freisetzung von Serotonin, das 2 wichtige Dinge zur Folge hat: 1) es bewirkt eine Engstellung von Gefäßen (in dem Versuch, den Blutverlust herabzusetzen), der durch S-MPEC entgegengewirkt wird, und 2) es ruft eine Thrombose hervor (wiederum zur Verminderung des Blutverlustes), der S-MPEC entgegenwirkt. Eine gute Zirkulation ist bei der Wundheilung entscheidend.
Referenzbeispiel 6
Einfluss von S-MPEC auf die Hemmung des durch Serotonin (5-HT) hervorgerufenen Blutflusses der Rektalschleimhaut
Versuchsmethode
Männliche Ratten vom SD-Stamm (Körpergewicht 388–588 g) wurden in dorsaler Lage unter Anästhesie mit Pentobarbital-Na (45 mg/kg, I. p.) fixiert. Nachdem das Rektalgewebe peripher ausgeschält wurde, wurde die Schleimhautoberfläche ausgestülpt und auf einer Korkplatte mit Stiften fixiert. Die Kanülen wurden auf der rechten Oberschenkelvene bzw. der Gesamthalsschlagader für die 5-HT-Verabreichung und Blutdruckmessung aufgesetzt und die Messsonde des Laser-Doppler-Durchflussmessers (PeriFlux, Schweden) auf der Rektalschleimhaut angebracht: Das S-MPEC wurde suspendiert in 0,5% Tween 80 rektal gegeben, nachdem sichergestellt war, dass sich der Blutdruck stabilisiert hatte. Danach wurden 10 μg/kg 5-HT 15 min nach S-MPEC-Verabreichung injiziert. Der Blutfluss der Schleimhaut wurde 5 min und 1 min nach 5-HT-Injektion gemessen. Die Testergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellt:
Tabelle 8
Diese Ergebnisse zeigen, dass S-MPEC der Wirkung von 5-HT der Abnahme des Blutflusses der rektalen Schleimhaut bei Ratten (5-HT₂-Rezeptor) entgegenwirkt, nicht jedoch der Blutdruck-senkenden Wirkungen von 5-HT auf den arteriellen Blutdruck entgegenwirkt (5HT₁-Rezeptor).
Die folgenden Beispiele veranschaulichen Formulierungen, die reines S-MPEC wahlweise zugemischt mit bis zu etwa 10% und bevorzugt unterhalb von etwa 4% R-MPEC enthalten, geeigneterweise für die Behandlung von Tieren, speziell Menschen, bei denen ein Bedarf für eine 5HT₂-Rezeptor-blockierende Wirkung besteht.
Referenzbeispiel 7
Topische oder hämorrhoidale Creme
Die Cremebasis enthielt:

Alvolen 71,0 g

flüssige Vaseline 25,0 g

weißes Bienenwachs 3,0 g

Wasser 1,0 g

Summe 100,0 g
Die Basis wurde durch Anreiben aller Bestandteile bis zur Homogenität hergestellt.
Aktive Creme:

S-MPEC 1,0 g

Cremebasis 99,0 g

Summe 100,0 g
Stabilität von MPEC in der Cremebasis (aktive Creme)
Die Stabilität der aktiven Creme wurde untersucht, indem Proben der Creme bei Raumtemperatur (24° bis 27°C), 50°C und 80°C sowie unter starkem Leuchtstofflampenlicht für 6 bzw. 12 Wochen gelagert wurden und der prozentuale Anteil des nach der angegebenen Lagerzeit verbliebene anfängliche S-MPEC assayiert wurde.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt: Tabelle 9
Referenzbeispiel 8 – Tablette

Material Menge

S-MPEC 50,0 g

Magnesiumstearat 1,3 g

Maisstärke 12,4 g

vorgelatinierte Maisstärke 1,3 g

Lactose 185,0 g
Die vorgenannten Materialien wurden in einem Doppeltrommelmischer gemischt und sodann granuliert und zu Tabletten mit einem Gewicht von jeweils 250 mg verpresst. Jede Tablette enthielt 50 mg Wirkstoff. Die Tablette kann in 4 Teilen gekerbt sein, so dass eine Dosis von 12,5 mg Wirkstoff mühelos erhalten werden kann.
Referenzbeispiel 9 – Kapsel
Die vorgenannten Materialien wurden in einem Doppeltrommelmischer gemischt und anschließend in Hartgelatinekapseln Nr. 1 gefüllt, so dass jede Kapsel 12,5 mg Wirkstoff enthielt.
Referenzbeispiel 10 – intravenöse Lösung
Es wurde eine sterile Lösung angesetzt, indem 10,0 g S-MPEC in einer Mindestmenge von 0,5 N Salzsäure aufgelöst wurde. Diese Lösung wurde auf einen pH-Wert von 4,3 mit 0,1 N Natriumhydroxid eingestellt und auf ein Gesamtvolumen von 1.000 ml mit Salzlösung aufgefüllt. Die Lösung wurde durch eine Passage durch ein Bakterienfilter sterilisiert.
Die vorliegende Erfindung ist im Bezug auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen offenbart worden, wobei als selbstverständlich gilt, dass Modifikationen und Änderungen daran, die für den Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sind mit in den Geltungsbereich der beigefügten Ansprüche einbezogen werden.

Claims

Verfahren zum Herstellen von S-2'-[2-(1-Methyl-2-piperidyl)ethyl]cinnamanilid (S-MPEC), umfassend das Umsetzen von 2-Nitrobenzaldehyd und 2-Picolin in Gegenwart von Acetanhydrid, wobei 2-Nitrobenzaldehyd und 2-Picolin in einem Molverhältnis von 1 : 1 vorliegen, um 2-(o-Nitrostyryl)-pyridin zu erzeugen, Behandeln des 2-(o-Nitrostyryl)-pyridins mit einem quaternisierenden Methylierungsmittel zur Erzeugung von 2-(o-Nitrostyryl)-1-methylpyridinium-Salz; Reduzieren des Pyridinium-Salzes durch katalytische Hydrierung unter Erzeugung von 2-(o-Aminophenethyl)-1-methylpiperidin (RS-APEMP)-Hydrosalz; Behandeln des Hydrosalzes mit einem alkalischen Mittel, um die freie Base (RS-APEMP) freizusetzen; Behandeln der freien Base mit Dibenzoyl-L-weinsäure, um S-APEMP.DBLT zu erzeugen; Behandeln des S-APEMP.DBLT mit einem alkalischen Mittel unter Erzeugung von S-APEMP und Umsetzen von S-APEMP mit einer äquimolaren Menge von Cinnamoylchlorid, um S-MPEC zu erzeugen.
S-[2-(o-Aminophenethyl)-1-methylpiperidin-dibenzoyl-L-tartrat-Salz] (S-APEMP.DBLT)
Verfahren zum Herstellen von S-[2-(o-Aminophenethyl)-1-methylpiperidindibenzoyl-L-tartrat-Salz] (S-APEMP.DBLT), umfassend das Umsetzen von 2-Nitrobenzaldehyd und 2-Picolin in Gegenwart von Acetanhydrid, wobei das 2-Nitrobenzaldehyd und 2-Picolin in einem Molverhältnis von 1 : 1 vorliegen, um 2-(o-Nitrostyryl)-pyridin zu erzeugen; Behandeln des 2-(o-Nitrostyryl)-pyridins mit einem quaternisierenden Methylierungsmittel, um 2-(o-Nitrostyryl)-1-methylpyridinium-Salz zu erzeugen; Reduzieren des Pyridinium-Salzes durch katalytische Hydrierung unter Erzeugung von 2-(o-Aminophenethyl)-1-methylpiperidin (RS-APEMP)-Hydrosalz; Behandeln des Hydrosalzes mit einem alkalischen Mittel, um die freie Base (RS-APEMP) freizusetzen; und Behandeln der freien Base mit Dibenzoyl-L-weinsäure unter Erzeugung von S-APEMP.DBLT.