DE69507112T2

DE69507112T2 - Verwendung eines Serotoninagonisten in Kombination mit einem Tachykininrezeptorantagonisten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention oder Behandlung der Migräne

Info

Publication number: DE69507112T2
Application number: DE69507112T
Authority: DE
Inventors: Marlene Lois Carmel Indiana 46032 Cohen; Kirk Willis Camby Indiana 46113 Johnson; Lee Alan Fountaintown Indiana 46130 Phebus
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1994-10-05
Filing date: 1995-10-03
Publication date: 1999-06-10
Anticipated expiration: 2015-10-04
Also published as: AU4130196A; SI0710479T1; DK0710479T3; ATE175347T1; ES2125567T3; WO1996011000A1; ZA958173B; IL115451A0; US5744482A; GR3029666T3; EP0710479B1; EP0710479A1; DE69507112D1

Description

Migränekopfschmerzen sind ein schwächender Zustand, bei dem etwa 53 Millionen Menschen pro Jahr an akutem Schmerz leiden. Auf vielen Wegen sind Kopfschmerzen die kraniale Entsprechung des Schmerzes aus anderen viszeralen Organen. Daher können Kopfschmerzen eine zugrundeliegende Störung einer Organfunktion refektieren.
Die erste Hauptabhandlung über Migräne wurde von E. Liveing 1873 beschrieben, worin er das Phänomen mit epileptischer Aktivität oder "Nervengewitter" assoziiert. E. Liveing, London: Churchill (1873). 1938 zeigten Graham und Wolff, daß die Verabreichung von Ergotamin die Amplitude des Pulses bei den superfizialen Temporalarterien von Patienten mit Kopfschmerzen verringert und dies wurde oft aber nicht immer von der Linderung des Schmerzes begleitet. J. R. Graham und H. G Wolff, Archives in Neurology, 39: 737-763 (1938). Diese vaskuläre Hypothese schlug vor, daß die Migränekopfschmerzen durch die Vasodilatation von extrakranialen Blutgefäßen verursacht werden und daß eine Ergot-induzierte Vasokonstriktion für dessen Linderung verantwortlich ist. Siehe obige Literaturstelle.
In den letzten zehn Jahren wurde klar, daß meningeale Blutgefäße anatomische und physiologische Eigenschaften aufweisen, die sie mit anderen Geweben teilen, die die Schmerzquelle sein können. Beispielsweise enervieren Neuropeptid-enthaltende unmyelinisierte C Fasern, die vom trigeminalen Ganglion ausgehen, meningeale Blutgefäße. T. P. O'Connor und D. von der Kooy, Journal of Neurosciences, 6: 2200-2208 (1986). Die trigeminovaskulären Fasern enden teilweise innerhalb des trigeminalen Nukleus caudilis. Die Aktivierung von trigeminovaskulären Fasern löst neuronale Reaktionen innerhalb der Gehirnregionen aus, die früher mit der Übermittlung von nociceptiver Information assoziert wurden. A. Strassman et al., Brain Research, 379: 242-250 (1986).
Es wurde mehr und mehr klar, daß moderne Experimente die bestehenden Konzepte von Wolff und seinen Mitarbeitern nicht unterstützen, die eine einfache Beziehung zwischen Vasodilatation und Schmerz und Vasokonstriktion und Linderung vorschlagen. Ansatt dessen favorisiert die Erkenntnis einen neurogenen Mechanismus der Arzneimittelwirkung, der auf der Blockade der neuronalen Übermittlung und neurogenen Entzündung basiert.
Seit der Entdeckung des Serotonins (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) vor über vier Jahrzehnten zeigen die angesammelten Ergebnisse von vielen unterschiedlichen Untersuchungen, daß Serotonin eine signifikante Rolle bei der Funktion des Säugerkörpers sowohl im zentralen Nervensystem als auch in den peripheren Systemen spielt. Morphologische Untersuchungen des zentralen Nervensystems haben gezeigt, das serotonerge Neurone, die im Hirnstamm entspringen, ein sehr diffuses System bilden, das auf die meisten Bereiche des Gehrins und des spinalen Rückenmarks projeziert. R. A. O'Brien, Serotonin in Mental Abnormalities, 1: 41 (1978), H. W. M. Steinbusch, Handbook of Chemical Neuroanatomy, Band 3, Teil II, 68 (1984), N. E. Anden et al., Acta Physiologica Scandinavia, 67: 313 (1966). Diese Untersuchungen wurden von der biochemischen Erkenntnis ergänzt, die zeigt, daß hohe 5-HT Konzentrationen im Gehirn und dem spinalen Rückenmark vorkommen. H. W. M. Steinbusch, siehe obige Literaturstelle.
Mit einem solchen diffusen System ist es nicht überraschend, daß 5-HT eine Beteiligung bei der Bildung von mehreren Verhaltensweisen, physiologischen Reaktionen und Erkrankungen zugesprochen wurde, die im zentralen Nervensystem ihren Ursprung haben. Dies umfaßt so verschiedene Bereiche, wie Schlafen, Essen, Schmerzwahrnehmung, Kontrolle der Körpertemperatur, Kontrolle des Bludrucks, Depression, Schizophrenie und andere Körperzustände. R. W. Fuller, Biology of Serotonergic Transmission, 221 (1982), D. J. Boullin, Serotonin in Mental Abnormalities 1: 316 (1978), J. Barchas et al., Serotonin and Behavior, (1973).
Serotonin spielt auch eine wichtige Rolle in peripheren Systemen. Beispielsweise werden etwa 90% des Serotonins im Körper im gastrointestinalen System synthetisiert und es wurde gefunden, daß Serotonin eine Vielzahl an kontraktilen, sekretorischen und elektrophysiologischen Effekten in diesem System vermittelt. Serotonin kann von den Blutplättchen aufgenommen werden und nach einer Blutplättchenaggregation so freigesetzt werden, daß das kardiovaskuläre System ein weiteres Beispiel für ein peripheres Netzwerk darstellt, das gegenüber Serotonin sehr empfindlich ist. In Anbetracht der breiten Verteilung von Serotonin im Körper ist es verständlich, daß ein enormes Interesse an Arzneimitteln besteht, die die serotonergen Systeme beeinflusssen. Insbesondere sind Rezeptor-spezifische Agonisten und Antagonisten bei der Behandlung einer großen Vielzahl an Störungen von Interesse, beispielsweise Angstzuständen, Depression, Bluthochdruck, Migräne, zwanghaften Störungen, Schizophrenie, Autismus, neurodegenerative Störungen, wie Alzheimersche Erkrankung, Parkinsonismus und Chorea Huntington, und durch Krebschemotherapie hervorgerufenes Erbrechen. M. D. Gershon et al., The Peripheral Actions of 5- Hydroxytryptamin, 246 (1989), P. R. Saxena et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 15: Supplement 7 (1990).
Serotonin ruft seine Wirkungen auf die Zellphysiologie durch die Bindung an spezialisierte Rezeptoren auf der Zelloberfläche hervor. Man gelangte nun zu der Erkenntnis, daß mehrere Rezeptortypen für viele Neurotransmitter und Hormone existieren, einschließlich für Serotonin. Die Existenz von mehrfachen, strukturell unterschiedlichen Serotoninrezeptoren eröffnete die Möglichkeit, das Subtyp-selektive pharmakologische Mittel hergestellt werden können. Die Entwicklung solcher Verbindungen könnte zu neuen und immer selektiveren therapeutischen Mitteln mit geringeren Nebenwirkungen führen, da die Aktivierung von einzelnen Rezeptorsubtypen so funktionieren kann, daß sie spezifische Wirkungen auf die unterschiedlichen Teile der zentralen und/oder peripheren serotonergen Systeme beeinflußt.
Ein Beispiel für eine solche Spezifität kann durch die Verwendung des vaskulären Systems als Beispiel gezeigt werden. Bei bestimmten Blutgefäßen ruft die Stimulierung der 5-HT&sub1;-artigen Rezeptoren auf den Endothelzellen eine Vasodilatation hervor, während die Stimulierung der 5-HT&sub2; Rezeptoren auf den glatten Muskelzellen eine Vasokonstriktion hervorruft. Im Gegensatz dazu vermitteln bestimmte 5-HT&sub1;-artige Rezeptoren eine Vasokonstriktion.
Derzeit umfassen die Hauptklassen der Serotoninrezeptoren (5-HT&sub1;, 5-HT&sub2;, 5-HT&sub3;, 5-HT&sub4;, 5-HT&sub5;, 5-HT&sub6; und 5-HT&sub7;) etwa vierzehn bis achtzehn getrennte Reptoren, die formal aufgrund ihrer pharmakologischen oder strukturellen Unterschiede klassifiziert wurden. [Siehe Glennon et al., Neuroscience an Bahavioral Reviews 14: 35 (1990) als ausgezeichnete Zusammenfassung der pharmakologischen Wirkungen und klinischen Begleiterscheinungen der verschiedenen Rezeptortypen.]
Tachykinine sind eine Peptidfamilie, die eine amidierte carboxyterminale Sequenz gemeinsam haben. Die Substanz P war das erste isolierte Peptid dieser Familie, obwohl dessen Reinigung und die Bestimmung der Primärsequenz nicht vor den frühen siebziger Jahren stattfand.
Zwischen 1983 und 1984 berichteten einige Gruppen von der Isolierung von zwei neuen Säugertachykininen, die jetzt als Neurokinin A (auch bekannt als Substanz K, Neuromedin L und Neurokinin α) und Neurokinin B (auch bekannt als Neuromedin K und Neurokinin β) bezeichnet werden. Siehe J. E. Maggio, Peptids 6 (Supplement 3): 237-243 (1985) als Zusammenfassung dieser Entdeckungen.
Die Tachykinine sind sowohl in den zentralen als auch in den peripheren Nervensystemen weit verbreitet, werden aus Nerven freigesetzt und rufen eine Vielzahl an biologischen Wirkungen hervor, die in den meisten Fällen von der Aktivierung bestimmter Rezeptoren abhängen, die auf der Membran der Zielzelle exprimiert werden. Tachykinine werden auch von mehreren nicht-neuronalen Geweben gebildet.
Die Säugertachykinine Substanz P, nämlich Neurokinin A und Neurokinin B wirken durch drei Hauptrezeptorsubtypen, die jeweils als NK-1, NK-2 und NK-3 bezeichnet werden. Diese Rezeptoren sind auf einer Vielzahl an Organen vorhanden.
Die Substanz P dürfte unter anderem bei der Neuroübermittlung von Schmerzereignissen beteiligt sein, einschließlich dem Schmerz, der mit Migränekopfschmerzen und Arthritis zusammenhängt. Diese Peptide spielen auch eine Rolle bei gastrointestinalen Störungen und Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts, wie der entzündlichen Darmerkrankung. Tachykinine spielen auch eine Rolle bei mehreren anderen Erkrankungen, wie dies oben diskutiert wird.
Tachykinine spielen eine Hauptrolle bei der Vermittlung der Entstehung und Übertragung von Schmerz oder Schmerzwahrnehmung, insbesondere Migränekopfschmerzen. Siehe beispielsweise S. L. Shepheard et al., British Journal of Pharmacology, 108: 11-20 (1993), S. M. Moussaoui et al., European Journal of Pharmacology, 238: 421-424 (1993) und W. S. Lee et al., British Journal of Pharmacology, 112: 920-924 (1994).
In Anbetracht der großen Anzahl an klinischen Krankheiten, die mit einem Überschuß an Tachykinin zusammenhängen, dient die Entwicklung von Tachykininrezeptorantagonisten der Kontrolle dieser klinischen Zustände. Die ersten Tachykininrezeptorantagonisten waren Peptiderivate. Von diesen Antagonisten stellte sich heraus, daß sie aufgrund ihrer metabolischen Instabilität eine begrenzte pharmakologische Brauchbarkeit aufweisen.
Kürzliche Publikationen beschreiben neue Klassen von Nicht-Peptid-Tachykininrezeptorantagonisten, die allgemein eine höhere orale Bioverfügbarkeit und metabolische Stabilität aufweisen, als die früheren Klassen an Tachykininrezeptorantagonisten. Beispiele für solche neueren Nicht-Peptid-Tachykininrezeptorantagonisten findet man in EP 0 591 040 A1 vom 6. April 1994, WO 94/01402 A vom 20. Januar 1994, WO 94/04494 A vom 3. März 1994, WO 94/07843 vom 14. April 1994 und WO 93/01169 A vom 21. Januar 1993.
Die derzeitigen Behandlungen der Migräne umfassen im allgemeinen zwei Verbindungsklassen. Die erste Klasse, die Ergotalkaloide, typisiert durch Dihydroergotamin dürften als α-adrenerge Blockierungsmittel mit direkten stimulierenden Wirkungen auf den glatten Muskel vonperipheren und kranialen Blutgefäßen wirken und eine Depression der zentralen vasomotorischen Zentren hervorrufen. Die zweite Verbindungsklasse, typisiert durch Sumatriptan, dürfte als Serotoninagonisten wirken, die für den 5-HT&sub1; Rezeptortyp spezifisch ist. Die Ergotalkaloide zeigen auch etwas Aktivität als Serotoninagonisten, wenn auch nicht mit der Spezifität, die Sumatriptan zeigt. Alle diese Verbindungen haben jedoch ernste Nebenwirkungen, die bei den wirksamen Dosierungen eine überwachte Verabreichung erfordern. Physician's Desk Reference (48. Ausgabe, 1994).
Aufgrund der derzeitigen Unzufriedenheit mit den derzeit vermarkteten Behandlungen für Migräne in der betroffenen Bevölkerung, besteht ein Bedarf für eine wirksamere und sicherere Behandlung.
Die Erfindung liefert die Verwendung einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die sowohl Tachykininrezeptorantagonistaktivität als auch Serotoninagonistaktivität aufweist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention von Migräne.
Die Erfindung liefert ferner die Verwendung einer Zusammensetzung mit Serotoninagonistenaktivität und eine Zusammensetzung mit Tachykininreptorantagonistenaktivität zur Herstellung eines Arzneimittels zur Be handlung und Prävention von Migräne, worin die Zusammensetzungen in einer Form vorliegen, die zur aufeinanderfolgenden Verabreichung geeignet ist.
Die Erfindung liefert ferner die Verwendung einer Zusammensetzung mit Tachykininreptorantagonistenaktivität und eine Zusammensetzung mit Serotoninagonistenaktivität zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prävention von Migräne, worin die Zusammensetzungen in einer Form vorliegen, die zur aufeinanderfolgenden Verabreichung geeignet ist.

Beschreibung der Figur

Die Fig. 1 zeigt das Ergebnis eines typischen Experiments, worin das Extravasationsverhältnis der stimulierten Dura zur unstimulierten Dura gegen die Dosis der Testverbindung aufgetragen ist. Die geschlossenen Kreise ( ), die an die Y-Achse angrenzen, zeigen die Wirkung, wenn nur Kochsalzlösung zugegeben wird. Die offenen Kreise (O) stehen für die Verabreichung von (R)-2-[N-(2-((4-Cyclohexyl)piperazin-1-yl)acetyl)amino]-3- (1H-indol-3-yl)1-[N-(2-methoxybenzyl)acetylamino]propan alleine. Die gefüllten Quadrate ( ) stehen für die Dosis-Antwortkurve, die mit Sumatriptan alleine erzeugt wird. Die gefüllten Dreiecke ( ) stehen für die Dosis- Antwortkurve, die erzeugt wird, wenn unterschiedliche Dosierungen von (R)-2-[N-(2-((4-Cyclohexyl)piperazin-1- yl)acetyl)amino]-3-(1H-indol-3-yl)1-[N-(2-methoxybenzyl)acetylamino]propan zusammen mit 1,2 ng/kg Sumatriptan verabreicht werden.
Die Ausdrücke und Abkürzungen, die in den vorliegenden Präparationen und Beispielen verwendet werden, haben ihre normale Bedeutung, falls nichts anderes angeben wird. Beispielsweise bezieht sich "ºC" auf Grad Celsius, "N" bezieht sich auf normal oder Normalität, "mmol" bezieht sich auf Millimol, "g" bezieht sich auf Gramm, "ml" steht für Milliliter, "1" steht für Liter, "M" bezieht sich auf molar oder Molarität, "MS" bezieht sich auf Massenspektrometrie, "IR" bezieht sich auf Infrarotspektroskopie und "NMR" bezieht sich auf Kernmagnetresonanzspektroskopie.
Es wurden viele Serotonin-bindende Rezeptoren identifiziert. Diese Rezeptoren werden allgemein in sieben Klassen auf der Grundlage ihrer Struktur und der Pharmakologie des Rezeptors eingeteilt, wie dies durch die Bindungseffizienz und die Arzneimittel-abhängigen Eigenschaften von mehreren Serotoninrezeptor bindenden Verbindungen bestimmt wird. In einigen Gruppen wurden mehrere Subtypen identifiziert. [Eine relativ neue Zusammenfassung von 5-Hydroxytryptaminrezeptoren ist E. Zifa und G. Fillion, Pharmacological Reviews, 44: 401- 458 (1992), D. Hoyer et al., Pharmacological Reviews, 46: 157-203 (1994).] Die folgende Tabelle I führt die sieben Klassen der Serotoninrezeptoren wie auch mehrere bekannte Subtypen auf. Diese Tabelle liefert auch die physiologische Verteilung dieser Rezeptoren wie auch die biologischen Reaktionen, die durch die Rezeptorklasse oder den Subtyp vermittelt werden, falls eine solche Reaktion bekannt ist. Diese Tabelle stammt von D. Hoyer et al., "VII: International Union of Pharmacology Classification of Rezeptors for 5-Hydroxytryptamine (Seroton)", Pharmacological Reviews, 46: 157-203 (1994), einer Veröffentlichung des Serotonin Club Receptor Nomenclature Committee des IUPHAR Committee for Receptor Nomenclature. Tabelle I
Die Literaturstelle Hoyer et al., beschreibt für jede Klasse oder jeden Subtyp eine oder mehrere Verbindungen, die eine Wirksamkeit als Antagonisten oder Agonisten für den Rezeptor aufweisen.
Die 5-HT&sub1; Familie umfaßt Subtypen, die aufgrund der Abwesenheit von Introns in den klonierten Genen, eines gemeinsamen G-Protein gekuppelten Transduktionssystems (Hemmung der Adenylatcyclase) und ähnlichen Funktionscharakteristiken zu einer Gruppe zusammengefaßt werden können. Die 5-HT&sub1; Familie der hemmenden Rezeptoren umfaßt die Subtypen A, B, D, E und F. Die G-Protein abhängigen 5-HT&sub1; Rezeptortypen hemmen allgemein die Bildung von cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP), während die G-Protein abhängigen 5-HT&sub2; Rezeptoren die Phosphoinositolhydrolyse stimulieren.
Der 5-HT1A Rezeptor war der erste klonierte Serotoninrezeptor des Menschen. Aktivierte 5-HT1A Rezeptoren, die in HeLa Zellen exprimiert werden, hemmen die durch Forskolin stimulierte Adenylatcyclaseaktivität. Der 5-HT1D Rezeptor wurde ursprünglich in der Gehrinmembran vom Rind durch Heuring und Peroutka identifiziert. RE. Heuring und S. J. Peroutka, Journal of Neuroscience, 7: 894-903 (1987). Die 5-HT1D Rezeptoren sind der verbreitetste 5-HT Rezeptorsubtyp im humanen Gehirn und könnten zum 5-HT&sub1;-artigen Rezeptor in der kranialen Vaskulatur identisch sein. S. D. Silberstein, Headache, 34: 408-417 (1994). Sumatriptan und die Ergotalkaloide haben eine hohe Affinität sowohl für die 5-HT1D als auch die 5-HT1B Rezeptoren des Menschen. Siehe obige Literaturstelle.
Der 5-HT1F Rezeptorsubtyp weist eine geringe Affinität für 5-Carboxyamidotryptamin (5-CT) im Gegensatz zu den anderen 5-HT Rezeptoren außer dem 5-HT1E Subtyp auf. Im Gegensatz zu den 5-HT1E Rezeptoren zeigen die 5-HT1F Rezeptoren jedoch eine Affinität für Sumatriptan.
Während einer Migräneattacke nimmt 5-HT in den Blutplättchen ab, bei einigen Patienten nimmt 5-HT im Harn zu und die 5-Hydroxyindolessigsäure (5-HIAA), ein Hauptmetabolit von 5-HT, kann zunehmen. Siehe obige Literaturstelle. Einige glauben, daß ein 5-HT Freisetzungsfaktor im Plasma auftauchen kann. Kopfschmerzen, die zu Migräne ähnlich sind, können durch 5-HT freisetzende Mittel hervorgerufen werden, wie Fenfluramin oder Reserpin, und durch die selektive Hemmung der 5-HT Wiederaufnahme durch Arzneimittel, wie Zimelodin, verschlimmert werden.
Aufgrund der Rolle der Serotoninrezeptoren bei der Verursachung von Migräne, sollte die Verwendung von Verbindungen, die mit diesen Rezeptoren wechselwirken, wirksam sein. Bevorzugte Verbindungen sind die Verbindungen, die mit einer Untergruppe an Serotoninrezeptoren wechselwirken.
Die biologische Wirksamkeit einer Verbindung, die als Serotoninagonist wirksam sein dürfte, kann bestätigt werden, indem man einen ersten Screeningtest verwendet, der schnell und genau die Bindung der Testverbindung an einen oder mehrere Serotoninrezeptoren mißt. Wenn die Bindung der Testverbindung ein einen oder mehrere Serotoninrezeptoren feststeht, wird die in vivo Aktivität der Testverbindung auf den Rezeptor ermittelt. Tests, die zur Austestung von Serotoninagonisten brauchbar sind, sind in der Technik gut bekannt. Siehe beispielsweise E. Zifa und G. Fillion, obige Literaturstelle, D. Hoyer et al., obige Literaturstelle und die hierin zitierten Literaturangaben.

Serotoninrezeptorbindungsaktivität

Bindung an den 5-HT1F Rezeptor

Die Fähigkeit einer Verbindung, an einen Serotoninrezeptor zu binden, wird mittels Standardverfahren gemessen. Beispielsweise wird die Fähigkeit einer Verbindung, an den 5-HT1F Rezeptorsubtyp zu binden, im wesentlichen ermittelt, wie dies in N-Adham et al., Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 90: 408- 412 (1993) beschrieben ist.
Der klonierte 5-HT1F Rezeptor wird in stabil transfizierten LM (tk) Zellen exprimiert. Es werden Membranpräparationen hergestellt, indem man diese transfizierten Zellinien bis zur Konfluenz anzieht. Diese Zellen werden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, in 5 ml eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung geschabt und bei 200 · g für etwa 5 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Das Pellet wird in 2,5 ml kaltem Tris Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 bei 23ºC, 5 mM EDTA) resuspendiert und homogensiert. Das Lysat wird bei 200 · g für etwa fünf Minuten bei 4ºC zentrifugiert, um die großen Fragmente zu pelletieren. Der Überstand wird dann bei 40 000 · g für etwa 20 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Die Membranen werden einmal in Homogenisierungspuffer gewaschen und in 25 mM Glycylglycinpuffer pH 7,6 bei 23ºC resuspendiert.
Es werden Bindungsstudien mit radioaktiv markiertem Liganden mittels [³H]5-HT (20-30 Ci/mmol) durchgeführt. Es werden Kompetitionsexperimente unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen an Arzneimittel und 4,5-5,5 nM [³H]5-HT durchgeführt. Die unspezifische Bindung wird durch 10 uM 5-HT be stimmt. Die Bindungsdaten werden durch eine nichtlineare Regressionsanalyse analysiert. Die HK&sub5;&sub0; Werte werden mittels der Cheng-Prusoff Gleichung in Ki Werte umgewandelt.
Für Vergleichszwecke können die Bindungsafflnitäten von Verbindungen für verschiedene Serotoninrezeptoren im wesentlichen so bestimmt werden, wie dies oben beschrieben ist, außer daß verschiedene klonierte Rezeptoren anstelle des hierin verwendeten 5-HT1F Rezeptorklons verwendet werden.

Serotorunagornstenaktivität

Adenylatcyclaseaktivität

Die Adenylatcyclaseaktivität wird in anfänglichen Experimenten in LK(tk&supmin;) Zellen mittels Standdardtechniken bestimmt. Siehe beispielsweise N. Adham et al. obige Literaturstelle, R. L. Weinshanlc et al., Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 89: 3630-3634 (1992) und die hierin zitierten Literaturangaben.
Die intrazellulären Spiegel von cAMP werden mittels der oben beschriebenen klonal abstammenden Zellinie bestimmt. Die Zellen werden für etwa 20 Minuten bei 37ºC in 5% Kohlendioxid in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium vorinkubiert, worin 10 mM HEPES, 5 mM Theophyllin und 10 uM Pargylin enthalten sind. Es werden verschiedene Konzentrationen der Testverbindung zu diesem Medium gegeben, um die Hemmung der Forskolin-stimulierten Adenylatcyclase zu bestimmen.
Einige Verbindungen, die an die Serotoninrezeptoren binden, zeigen keine Rezeptorselektivität, das heißt sie binden an unterschiedliche Rezeptorsubtypen mit einer vergleichbaren Affinität. Ein Beispiel einer solchen nicht-selektiven an den Serotoninrezeptor bindenden Verbindung ist Dihydroergotamin, eine Verbindung mit der folgenden Struktur
und dem chemischen Namen 9,10-Dihydro-12'-hydroxy-2-methyl-5'-(phenylmethyl)ergotaman-3,6',18'-trion. Diese Verbindung ist im Handel erhältlich [als Mesylatsalz] oder kann hergestellt werden, wie dies von Stoll und Hofmann, Helv. Chimica Acta, 26: 2070 (1943) beschrieben wurde.
Eine Verbindung mit einer hohen Affinität für einen (oder wenige) Rezeptorsubtypen und niedriger Affinität für andere Rezeptorsubtypen unter Verwendung von Untersuchungen, die zu den oben beschriebenen Bindungstests analog sind, werden als Subtyp-selektiv betrachtet. Solche Verbindungen sind in den erfindungsgemäßen Verfahren besonders bevorzugt.
Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist Sumatriptan, eine Verbindung mit der folgenden Struktur
und dem chemischen Namen 3-[2-(Dimethylamino)ethyl]-N-methyl-1H-indol-5-methansulfonamid. Diese Verbindung ist im Handel erhältlich oder kann hergestellt werden, wie dies in US 5 037 845 A vom 6. August 1991 beschrieben ist, das hiermit eingeführt ist. Sumatriptan ist für die 5-HT&sub1; Rezeptorsubtypen selektiv.
Ein zusätzlicher Serotoninagonist, der für die 5-HT&sub1; Klasse von Rezeptoren spezifisch ist, ist eine Verbindung der Struktur
mit der Bezeichnung 311C90 und dem chemischen Namen (S)-4-[[3-[2-(Dimethylamino)ethyl]-1H-indol-5- yl]methyl]-2-oxazolidinon. Diese Verbindung kann synthetisiert werden, wie dies in der WO 91/18897 A vom 12. Dezember 1991 beschrieben ist. Im Gegensatz zu Sumatriptan dürfte 311C90 zur Überwindung der Blut-Hirn- Schranke fähig sein. Scrip, 7. September 1994.
Einige zusätzliche klassische Serotoninagonisten, die häufig verwendet werden, sind: (a) Rauwolscin - eine Verbindung der Formel
mit dem chemischen Namen 17α-Hydroxy-20α-yohimban-16β-carbonsäuremethylester. Diese Verbindung, auch als α-Yohimbin bekannt, kann hergestellt werden, wie dies in Toke et al., Journal of Organic Chemistry 38: 2496 (1973) beschrieben ist oder kann von vielen Quellen im Handel bezogen werden. (b) Yohimbin - eine Verbindung, die auch als allo-Yohimbin bekannt ist, mit folgender Formel
und dem chemischen Namen 17-Hydroxyyohimban-16-carbonsäuremethylester. Diese Verbindung, die von Quellen im Handel erhalten werden kann, kann auch synthetisiert werden, wie dies von Toke et al. siehe obige Literaturstelle beschrieben ist. (c) α-Methyl-5-hydroytryptamin - eine Verbindung der Formel
mit dem chemischen Namen 3-(2-Aminopropyl)-1H-indol-5-ol, die von Quellen im Handel erhältlich ist. (d) 1-(1-Naphthyl)piperazin - eine Verbindung der Formel
die in US 4 520 024 vom 28. Mai 1985 beschrieben ist, das hiermit eingeführt ist. (e) Metoclopramid - eine Verbindung der Formel
mit dem chemischen Namen 4-Amino-S-chlor-N-[(2-diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamid, die in US 3 177 252 A beschrieben ist, das hiermit eingeführt ist.
Die obigen Verbindungsgruppen stehen nur erläuternd für die Serotoninrezeptoragonisten, die derzeit in der Entwicklung sind und häufig in Serotoninrezeptorstudien verwendet werden. Die Liste der Verbindungsgruppen soll nicht vollständig sein, wobei die erfindungsgemäßen Verfahren jeden Serotoninrezeptoragonisten verwenden können und auf keine bestimmte Verbindungsklasse beschränkt sind.
Sumatriptan und die Ergotalkaloide weisen ernste Nachteile bei Dosierungen auf, die für die Behandlung der Migräne als wirksam angesehen werden. Beide Verbindungstypen werden als Injektionen verabreicht, wobei die Ergotalkaloide gewöhnlich als intramuskuläre Injektion verabreicht werden, während Sumatriptan gewöhnlich als subkutane Injektion verabreicht wird. Physician's Desk Reference, siehe obige Literaturstelle. Die intravenöse Injektion einer der beiden Substanzen führt zu koronaren Vasospasmen. Siehe selbe Literaturstelle. Beide Verbindungstypen sind aufgrund der vasokonstriktiven Eigenschaften auch für Patienten kontraindiziert, die an unkontrolliertem Bluthochdruck leiden. Siehe selbe Literaturstelle. Patienten, die eine der beiden Verbindungstypen einnehmen, beklagen häufig Übelkeit, Brustenge und andere Nebenwirkungen. Siehe selbe Literaturstelle, Siehe auch Scrip, Nr. 1952, 26. August 1994 auf Seite 15.
Die erfindungsgemäßen Verfahren verwenden zusätzlich zu den Serotoninagonisten, von denen Beispiele oben beschrieben sind, auch verschiedene Tachykininrezeptoren. In vorangegangenen Veröffentlichungen wurden viele verschiedene Gruppen an nicht-peptidartigen Tachykininrezeptorantagonisten beschrieben.
Die WO 94/01402 A vom 20. Januar 1994 beschreibt eine Reihe an Verbindungen, die am besten durch die folgende Verbindung typisiert werden.
Die EP 0 591 040 A vom 6. April 1994 beschreibt eine Reihe an Verbindungen, die am besten durch die folgende Verbindung typisiert werden
worin A für ein pharmazeutisch annehmbares Anion steht.
Die WO 94/04494 vom 3. März 1994 beschreibt eine Reihe an Verbindungen, die durch die folgende Verbindung typisiert werden.
Die WO 93/01169 vom 21. Januar 1993 beschreibt eine Reihe an Verbindungen, die durch die folgende Verbindung typisiert werden.
Eine weitere Gruppe an Tachykininrezeptorantagonisten wird durch die Verbindung der folgenden Formel charakterisiert
die die Bezeichnung (±)-CP 96345 trägt. Diese Verbindungen und ihre Synthesen sind in E. J. Warawa et al., Journal of Medicinal Chemistry, 18: 357 (1975) beschrieben.
Eine weitere Gruppe an Tachykininrezeptorantagonisten ist durch die Verbindung der folgenden Formel charakterisiert
die die Bezeichnung RP 67580 trägt. Diese Verbindungen und ihre Synthesen sind in C. Garret et al., Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 88: 10208-10211 (1991) und den hierin zitierten Literaturangaben beschrieben.
Die WO 94/07843 beschreibt eine Reihe an Cyclohexylaminderivaten, die durch die folgende Verbindung typisiert werden
die als Tachykininrezeptorantagonisten brauchbar sind.
Eine weitere als Tachykininrezeptorantagonisten brauchbare Verbindungsgruppe ist durch die folgende Verbindung typisiert.
Die Synthese dieser Verbindungen ist in der europäischen Patentanmeldung 95302707.5 beschrieben.
Die obigen Verbindungsgruppen sind für die Tachikininrezeptorantagonisten, die derzeit in der Entwicklung sind, nur erläuternd. Diese Liste an Verbindungsgruppen soll nicht vollständig sein, wobei die erfindungsgemäßen Verfahren jeden Tachikininrezeptorantagonisten verwenden können und nicht auf eine bestimmte Verbindungsklasse beschränkt sind.
Eine am meisten bevorzugte Klasse an Tachikininrezeptorantagonisten sind die Verbindungen mit der folgenden Struktur
worin R¹ und R² unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Wasserstoff, Methyl, Methoxy, Chlor und Trifluormethyl mit der Maßgabe, daß nicht mehr als eines von R¹ und R² für Wasserstoff stehen kann und Y steht für
N-Ra oder CH-NRbRc
worin Ra, Rb und Rc unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Wasserstoff und C&sub1;-C&sub6; Alkyl, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Solvat hiervon. Die Synthese dieser Verbindungen ist in WO 95/14017 A beschrieben. Die Synthesen von zwei typischen Verbindungen dieser Klasse sind im folgenden im Detail beschrieben. Synthese von (R)-2-[N-(2-((4-Cyclohexyl)piperazin-1-yl)acetyl)amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-[N-(2- methoxybenzyl)acetylaminopropan (a) Herstellung von (R)-3-(1H-Indol-3-yl)-2-(N-triphenylmethylamino)propansäure [N-Trityltryptophan)
Chlortrimethylsilan (70,0 ml, 0,527 mol) wird in einer mittleren Geschwindigkeit zu einer gerührten Aufschlämmung aus D-Tryptophan (100,0 g, 0,490 mol) in wasserfreiem Methylenchlorid (800 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben. Dieses Gemisch wird kontinuierlich für 4,25 Stunden gerührt. Triethylamin (147,0 ml, 1,055 mol) wird zugegeben gefolgt von der Zugabe einer Lösung aus Triphenylmethylchlorid (147,0 g, 0,552 mol) in Methylenchlorid (400 ml) mittels eines Zugabetrichters. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre für mindestens 20 Stunden gerührt. Die Reaktion wird durch die Zugabe von Methanol (500 ml) gestoppt.
Die Lösung wird in einem Rotationsverdampfer fast bis zur Trockne konzentriert und das Gemisch wird in Methylenchlorid und Ethylacetat rückgelöst. Eine wäßrige Aufarbeitung mittels 5% Citronensäurelösung (2 x) und Kochsalzlösung (2 x) wird dann durchgeführt. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und in einem Rotationsverdampfer bis zur Trockne konzentriert. Der Feststoff wird in heißem Diethylether gefolgt von der Zugabe von Hexan gelöst, um die Kristallisation zu fördern. Durch dieses Verfahren isoliert man 173,6 g (0,389 mol) an analytisch reinem (R)-3-(1H-Indol-3-yl)-2-(N-triphenylmethylamino)propansäure als weißen Feststoff in zwei Kristallisaten und einer Gesamtausbeute von 79%.
FDMS 446 (M&spplus;)
¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 2,70 (m, 1H), 2,83 (m, 2H), 3,35 (m, 1H), 6,92-7,20 (m, 12H), 7,30-7,41 (m, 8H), 10,83 (s, 1H), 11,73 (br s, 1H)
Analyse für C&sub3;&sub0;H&sub2;&sub6;N&sub2;O&sub2;:
Theorie C 80,69, H 5,87, N 6,27
Gefunden: C 80,47, H 5,92, N 6,10 (b) Herstellung von (R)-3-(1H-Indol-3-y1)-N-(2-methoxybenzyl)-2-(N-triphenylmethylamino)propanamid
Zu einer gerührten Lösung aus (R)-3-(1H-Indol-3yl)-2-(N-triphenylmethylamino)propansäure (179,8 g, 0,403 mol), 2-Methoxybenzylamin (56,0 ml, 0,429 mol) und Hydroxybenzotriazolhydrat (57,97 g, 0,429 mol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (1,7 l) und wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (500 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre bei 0ºC werden Triethylamin (60,0 ml, 0,430 mol) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethoxycarbodiimidhydrochlorid (82,25 g, 0,429 mol) gegeben. Das Gemisch kann sich unter einer Stickstoffatmosphäre für mindestens 20 Stunden auf Raumtemperatur erwärmen. Das Gemisch wird in einem Rotationsverdampfer konzentriert und dann in Methylenchlorid rückgelöst und eine wäßrige Aufarbeitung aus 5% Citronensäurelösung (2 x), gesättigter Natriumbicarbonatlösung (2 x) und Kochsalzlösung (2 x) wird durchgeführt. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und auf einem Rotationsverdampfer zur Trockne konzentriert. Das gewünschte Produkt wird aus heißem Ethylacetat unter Bildung von 215,8 g (0,381 mol, 95%) an analytisch reinem Material umkristallisiert.
FDMS 565 (M&spplus;)
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 2,19 (dd, J = 6,4 Hz, Δν = 14,4 Hz, 1H), 2,64 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 3,19 (dd, J = 4,3 Hz, Δν = 14,4 Hz, 1H), 3,49 (m, 1H), 3,63 (s, 3H), 3,99 (dd, J = 5,4 Hz, Δν = 14,2 Hz, 1H), 4,25 (dd, J = 7,1 Hz, Δν = 14,2 Hz, 1H), 6,64 (4 J = 2,1 Hz, 1H), 6,80 (4 J = 8,2 Hz, 1H), 6,91 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,06-7,38 (m, 21 H), 7,49 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H)
Analyse für C&sub3;&sub8;H&sub3;&sub5;N&sub3;O&sub2;:
Theorie: C 80,68, H 6,24, N 7,43
Gefunden: C 80,65, H 6,46, N 7,50 (c) Herstellung von (R)-3-(1H-Indol-3-yl)-1-[N-(2-methoxybenzyl)amino]-2-(N-triphenylmethylamino)propan Reduktion von Carbonyl
RED-AL® [eine 3,4 M Lösung aus Natrium-bis(2-methoxyethoxy)aluminiumhydrid in Toluol] (535 ml, 1,819 mol), das in wasserfreiem Tetrahydrofuran (400 ml) gelöst ist, wird langsam unter Verwendung eines Zugabetrichters zu einer am Rückfluß siedenden Lösung des oben hergestellten Acylierungsprodukts (R)-3-(1H-Indol-3- yl)-N-(2-methoxybenzyl)-2-(N-triphenylmethylamino)propanmaid (228,6 g, 0,0404 mol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (1,01) unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben. Das Reaktionsgemisch wird, eine purpurfarbene Lösung. Die Reaktion wird nach mindestens 20 Stunden durch die langsame Zugabe einer übersättigten Rochelle's Salzlösung (Kaliumnatriumtartrattetrahydrat) gestoppt. Die organische Phase wird isoliert, mit Kochsalzlösung gewaschen (2 x), über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und auf einem Rotationsverdampfer zu einem Öl konzentriert. Es wird keine weitere Reinigung durchgeführt und das Produkt wird direkt im nächsten Schritt verwendet. (d) Herstellung von (R)-3-(1H-Indol-3-yl)-1-[N-(2-methoxybenzyl)acetylamino]-2-(N-triphenylmethylamino)pro- pan Acylierung des sekundären Amins
Zu einer gerührten Lösung aus (R)-3-(1H-Indol-3-yl)-1-[N-(2-methoxybenzyl)amino]-2-(N-triphenylmethylamino)propan (0,404 mol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (1,2 l) wird unter einer Stickstoffatmosphäre bei 0ºC Triethylamin (66,5 ml, 0,477 mol) und Essigsäureanhydrid (45,0 ml, 0,477 mol) gegeben. Nach 4 Stunden wird das Gemisch in einem Rotationsverdampfer konzentriert, in Methylenchlorid und Ethylacetat rückgelöst, mit Wasser (2 x) und Kochsalzlösung (2 x) gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und in einem Rotationsverdampfer bis zu einem Feststoff konzentriert. Der entstehende Feststoff wird in Chloroform gelöst, auf Silicagel 60 (230-400 Mesh) aufgetragen und mit einem 1 : 1 Gemisch aus Ethylacetat und Hexan eluiert. Das Produkt wird dann aus einem Gemisch aus Ethylacetat / Hexan kristallisiert. Das entstehende Produkt (R)-3-(1H-Indol-3-yl)-1-[N-(2-methoxybenzyl)acetylamino]-2-(N-triphenylmethylamino)propan wird kristallisiert und über drei Kristallisate unter Bildung von 208,97 g (87% Ausbeute) analytisch reinem Materials isoliert. Analyse für C&sub4;&sub0;H&sub3;&sub9;N&sub3;O&sub2;:
Theorie: C 80,91, H 6,62, N 7,08
Gefunden: C 81,00, H 6,69, N 6,94 (e) Herstellung von (R)-2-Amino-3-(1H-indol-3-yl)-1-[N-(2-methoxybenzyl)acetylamino]propan Schutzgruppenabspaltung
Es wird Ameisensäure (9,0 ml, 238,540 mmol) zu einer gerührten Lösung aus (R)-3-(1H-indol-3-yl)-1-[N- (2-methoxybenzyl)acetylamino]-2-(N-triphenylmethylamino)propan (14,11 g, 23,763 mmol) in wasserfreiem Methylenchlorid unter einer Stickstoffatmosphäre bei 0ºC gegeben. Nach 4 Stunden wird das Reaktionsgemisch in einem Rotationsverdampfer zu einem Öl konzentriert und in Diethylether und 1,0 N Chlorwasserstoffsäure rückgelöst. Die wäßrige Phase wird zweimal mit Diethylether gewaschen und mit Natriumhydroxid bis zu einem pH von mehr als 12 basisch gemacht. Das Produkt wird mit Methylenchlorid (4 x) herausextrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und auf einem Rotationsverdampfer zu einem weißen Schaum konzentriert. Die Verbindung (R)-2-Amino-3-(1H-indol-3-yl)-1-[N-(2-methoxybenzyl)- acetylamino]propan (7,52 g, 21,397 mmol) wird mit einer Ausbeute von 90% isoliert. Es ist keine weitere Reinigung notwendig. (f) Herstellung von (R)-2-Amino-3-(1H-indol-3-yl)-1-[N-(2-methoxybenzyl)acetylamino]propandihydrochlorid
Eine gerührte Lösung aus (R)-3-(1H-indol-3-yl)-1-[N-(2-methoxybenzyl)acetylamino]-2-(N-triphenylmethylamino)propan in zwei Volumina Methylenchlorid wird zwischen -40ºC und -50ºC gekühlt. Wasserfreies Chlorwasserstoffgas wird in einer Geschwindigkeit zugegeben, daß die Temperatur des Reaktionsgemisches nicht über 0ºC steigt. Das Reaktionsgemisch wird für 30 Minuten bis ein Stunde bei 0-10ºC gerührt.
Zu diesem Reaktionsgemisch werden zwei Volumina Methyl-t-butylether gegeben und das entstehende Gemisch kann für 30 Minuten bis eine Stunde bei 0-10ºC rühren. Der entstehende kristalline Feststoff wird durch Filtration entfernt und dann mit Methyl-t-butylether gewaschen. Das Reaktionsprodukt wird unter Vakuum bei 50ºC getrocknet. (Ausbeute > 98%) Analyse für C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub5;N&sub3;O&sub2; · 2 HCl
Theorie: C 59,44, H 6,41, N 9,90
Gefunden: C 60,40, H 6,60, N 9,99

(g) Herstellung von 2-((4-Cyclohexyl)piperazin-1-yl)essigsäurekaliumsalzhydrat

Cyclohexylpiperazin (10,0 g, 0,059 mol) wird zu zehn Volumina Methylenchlorid bei Raumtemperatur gegeben. Zu diesem Gemisch wird Natriumhydroxid (36 ml einer 2 N Lösung, 0,072 mol) und Tetrabutylammoniumbromid (1,3 g, 0,004 mol) gegeben. Nach der Zugabe des Natriumhydroxids und des Tetrabutylammoniumbromids wird Methylbromacetat (7,0 ml, 0,073 mol) zugegeben und das Reaktionsgemisch wird für vier bis sechs Stunden gerührt. Der Fortschritt der Reaktion wird durch Gaschromatographie verfolgt.
Die organische Fraktion wird abgetrennt und die wäßrige Phase wird mit Methylenchlorid rückextrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt und zweimal mit entionisiertem Wasser, einmal mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung und dann mit Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und die Lösemittel werden im Vakuum unter Bildung von Methyl-2-((4-cyclohexyl)piperazin-1- yl)acetat als gelbliches Öl entfernt.
Die Titelverbindung wird durch Lösen des Methyl-2-((4-Cyclohexyl)piperazin-1-yl)acetats (10,0 g, 0,042 mol) in zehn Volumina Diethylether hergestellt. Diese Lösung wird auf 15ºC gekühlt und dann wird Kaliumtrimethylsilanoat (5,9 g, 0,044 mol) zugegeben. Dieses Gemisch wird dann für vier bis sechs Stunden gerührt. Das Reaktionsprodukt wird durch Filtration entfernt, zweimal mit fünf Volumina Diethylether und dann zweimal mit 5 Volumina Hexan gewaschen und dann in einem Vakuumofen für 12-24 Stunden bei 50ºC getrocknet. Analyse für C&sub1;&sub2;H&sub2;&sub1;KN&sub2;O&sub2; · 1,5 H&sub2;O
Theorie: C 49,63, H 7,98, N 9,65
Gefunden: C 49,54, H 7,72, N 9,11

(h) Herstellung von (R)-2-[N-(2-((4-Cyclohexyl)piperazin-1-yl)acetyl)amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-[N-(2- methoxybenzyl)acetylamino]propan

Die Titelverbindung wird hergestellt, indem man zuerst 2-((4-Cyclohexyl)piperazin-1-yl)essigsäurekaliumsalz auf eine Temperatur zwischen -8ºC und -15ºC in 5 Volumina wasserfreiem Methylenchlorid kühlt. Zu diesem Gemisch wird Isobutylchlorformiat mit einer Geschwindigkeit gegeben, so daß die Temperatur -8ºC nicht übersteigt. Das entstehende Reaktionsgemisch wird für etwa 1 Stunde gerührt, wobei die Temperatur zwischen -8ºC und -15ºC gehalten wird.
Zu diesem Gemisch wird dann (R)-2-Amino-3-(1H-indol-3-yl)-1-[N-(2-methoxybenzyl)acetylamino]- propandihydrochlorid in einer Geschwindigkeit gegeben, so daß die Temperatur nicht über 0ºC steigt. Als nächstes wird N-Methylmorpholin zu diesem Gemisch in einer Geschwindigkeit gegeben, so daß die Temperatur 0ºC nicht übersteigt. Dieses Gemisch wird dann für etwa 1 Stunde bei einer Temperatur zwischen -15ºC und -8ºC gerührt.
Die Reaktion wird durch die Zugabe von 5 Volumina Wasser gestoppt. Die organische Phase wird einmal mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die organische Phase wird dann über wasserfreiem Kaliumcarbonat getrocknet und filtriert, um das Trocknungsmittel zu entfernen. Zum Filtrat werden dann 2 Äquivalente konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gefolgt von 1 Volumen Isopropylalkohol gegeben. Das Methylenchlorid wird dann unter Vakuum durch Destillation gegen Isopropylalkohol ausgetauscht.
Das schließliche Volumen Isopropylalkohol wird dann durch Vakuum auf drei Volumina konzentriert. Das Reaktionsgemisch wird auf 20ºC bis 25ºC gekühlt und da Produkt kann für mindestens 1 Stunde kristallisieren. Das gewünschte Produkt wird dann durch Filtration gewonnen und unter Bildung eines farblosen Filtrats mit ausreichend Isopropylalkohol gewaschen. Der Kristallkuchen wird dann unter Vakuum bei 50ºC getrocknet.
MS 560 (M+1&spplus;)
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 1,09-1,28 (m, 5H), 1,64 (d, J = 10 Hz, 1H), 1,80-1,89 (m, 4H), 2,10 (s, 3H), 2,24-252 (m, 9H), 2,90 (s, 2H), 2,95 (d, J = 7 Hz, 1H), 3,02 (d, J = 7 Hz, 1H), 3,12 (dd, J = 5,14 Hz, 1 H, 3,77 (s, 3H), 4,01 (dd, J = 10, 14 Hz, 1H), 4,49 (ABq, J = 17 Hz, 43 Hz, 2H), 4,56 (m, 1H), 6,79-6,87 (m, 3H), 7,05-7,24 (m, 4H), 7,34-7,41 (m, 2H), 7,67 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,22 (s, 1H).
Analyse für C&sub3;&sub3;H&sub4;&sub3;N&sub5;O&sub3;
Theorie: C 70,81, H 8,10, N 12,51
Gefunden: C 70,71, H 8,21, N 12,42 Synthese von (R)-3-(1H-indol-3-yl)-1-[N-(2-methoxybenzyl)acetylamino]-2-[N-(2-(4-(piperidin-1-yl)piperidin-1- yl)acetyl)amino]propan

(a) Herstellung von 2-(4-(Piperidin-1-yl)piperidin-1-yl)essigsäure, Kaliumsalz

4-(Piperidin-1-yl)piperidin (1,20 kg, 7,13 mol) wird zu Methylenchlorid (12,0 l) unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben Tetrabutylammoniumbromid (0,150 kg, 0,47 mol) und Natriumhydroxid (1,7 l einer 5 N Lösung, 8,5 mol) werden dann zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird auf 10-15ºC gekühlt und Methylbromacetat (1,17 kg, 7,65 mol) wird zugegeben und das entstehende Reaktionsgemisch wird für ein Minimum von 16 Stunden gerührt.
Dann wird entionisiertes Wasser (1,2 l) zum Gemisch gegeben und die Phasen werden getrennt. Die wäßrige Phase wird mit Methylenchlorid (2,4 l) rückextrahiert. Die organischen Fraktionen werden vereinigt und mit entionisiertem Wasser (3 · 1,2 l), einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung (1,1 l) und einer gesättigten Natriumchloridlösung (1,1 l) gewaschen. Die organische Fraktion wird dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und auf einem Rotationsverdampfer unter Bildung von 1,613 kg (93,5%) Methyl-2-(4-(Piperidin-1-yl)- piperidin-1-yl)acetat konzentriert.
Eine Lösung aus Methyl-2[4-piperidin-1-yl]piperidin-1-yl]acetat (2,395 kg, 9,96 mel) in Methanol (2,4 l) wird zu einer Lösung aus Kaliumhydroxid (0,662 kg, 10,0 mol, 85% Reinheit) in Methanol (10,5 l) unter einer Stickstoffatmosphare gegeben. Das Reaktionsgemisch wird für mindestens 16 Stunden auf 45-50ºC erhitzt.
Es wird ein Lösemittelwechsel von Methanol zu Aceton (15,0 l) mit der Lösung in einem Rotationsverdampfer durchgeführt. Diese Lösung wird langsam über 16 Stunden auf Raumtemperatur gekühlt. Die entstehende Feststoffe weiden filtriert, mit Aceton (5,0 l) gewaschen und dann unter Bildung von 2,471 kg (93,8%) 2-(4- Piperidin-1-yl)piperidin-1-yl)essigsäurekaliumsalz getrocknet.
MS 265 (M&spplus;¹)

(b) Herstellung von (R)-3-(1H-Indol-3-yl)-1-[N-(2-methoxybenzyl)acetylamino]-2-[N-(2-(4-(piperidin-1- yl)piperidin-1-yl)acetyl)amino]propan

Die Titelverbindung wird hergestellt, indem man zuerst (R)-2-Amino-3-(1H-indol-3-yl)-1-[N-(2-methoxybenzyl)acetylamino]propandihydrochlorid (50,0 g, 0,118 mol) mit 100 ml Methylenchlorid unter einer Stickstoffatmosphäre mischt.
In einem zweiten Kolben wird unter einer Stickstoffatmosphäre 2-(4-Piperidin-1-yl)piperidin-1yl)essigsäurekaliumsalz (62,3 g, 0,236 mol) zu 600 ml Methylenchlorid gegeben. Dieses Gemisch wird auf etwa -10ºC abgekühlt und das Rühren wird fortgesetzt. Zu diesem Gemisch wird Isobutylchlorformiat (23 ml, 0,177 mol) tropfenweise so zugegeben, daß die Temperatur des 2-(4-(Piperidin-1-yl)piperidin-1-yl)essigsäurekaliumsalzgemisches nie deutlich ansteigt.
Diese Reaktion wird bei etwa -10ºC für etwa 1,5 Stunden gerührt, wonach das wie oben hergestellte (R)- 2-Amino-3-(1H-indol-3-yl)-1-[N-(2-methoxybenzyl)acetylamino]propandihydrochlorid/Methylenchloridgemisch langsam zur Lösung aus 2-(4-(Piperidin-1-yl)piperidin-1-yl)essigsäurekaliumsalz/Isobutylchlorformiat/Methylenchlorid gegeben wird. Das entstehende Gemisch wird dann für etwa 1 Stunde bei einer Temperatur zwischen -15ºC und -8ºC gerührt.
Das Reaktionsgemisch wird aus dem Eisbad entfernt und kann sich auf 15-20ºC erwärmen und die Reaktion wird durch die Zugabe von 200 ml Wasser gestoppt. Der pH der Lösung wird durch die Zugabe von 1 N Schwefelsäure auf 2,3-2,7 eingestellt. Die Phasen werden getrennt und die wäßrige Phase wird mit 100 ml Methylenchlorid gewaschen.
Die organischen Fraktionen werden vereinigt und mit Wasser (100 ml) gewaschen. Das Waschwasser wird mit Methylenchlorid (50 ml) rückextrahiert und mit der wäßrigen Fraktion von oben vereinigt. Methylenchlorid (500 ml) wird zu den vereinigten wäßrigen Phasen gegeben und das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 15 Minuten nach einem basisch Machen mit 2 N Natriumhydroxid auf einen schließlichen pH von 9,8 bis 10,2 gegeben.
Die organischen und wäßrigen Phasen werden getrennt. Die wäßrige Fraktion wird mit Methylenchlorid gewaschen und das Methylenchlorid wird zur organischen Fraktion gegeben. Die organische Fraktion wird dann mit einem Gemisch aus gesättigter Natriumbicarbonatlösung (100 ml) und Wasser (50 ml) gewaschen. Die Bicarbonatwaschlösung wird von der organischen Fraktion abgetrennt und mit Methylenchlorid (50 ml) rückextrahiert. Die Rückextraktion wird mit der Methylenchloridfraktion vereinigt und die vereinigten Fraktionen werden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Magnesiumsulfat wird durch Filtration entfernt und die flüchtigen Stoffe werden durch Vakuumdestillation unter Bildung des Titelprodukts als Schaum entfernt. (72,5 g, > 98% Ausbeute). MS 559 (M&spplus;¹)
NMR (DMSO-d&sub6;, 3 : 2 Gemisch aus Amidrotameren) δ 1,25-1,70 (m, 10 H), 1,77-2,00 (m, 2H), 1,95 (s, 3/5 · 3H), 2,04 (s, 2/5 · 3H), 2,10-2,97 (m, 9H), 3,10-3,65 (m, 3H), 3,72 (s, 2/5 · 3H), 3,74 (s, 3/5 · 3H), 4,26-4,58 (m, 3H), 6,76-7,12 (m, 6H), 7,13-7,35 (m, 2H), 7,42-7,66 (m, 2H), 10,80 (br s, 1H).
Analyse für C&sub3;&sub3;H&sub4;&sub5;N&sub5;O&sub3;
Theorie: C 70,81, H 8,10, N 12,51
Gefunden: C 70,57, H 8,05, N 12,39
Die biologische Wirksamkeit einer Verbindung, die als Tachykininrezeptorantagonist wirksam sein könnte, kann durch die Verwendung eines ersten Screeningtests bestätigt werden, der schnell und genau die Bindung der getesteten Verbindung an bekannte NK-1 und NK-2 Rezeptorstellen mißt. Tests, die zur Evaluierung von Tachykininrezeptorantagonisten brauchbar sind, sind in der Technik gut bekannt. Siehe beispielsweise J. Jukie et al., Life Sciences, 49: 1463-1469 (1991), N. Kucharczyk et ah Journal of Medicinal Chemistry, 36: 1654-1661 (1993); N. Rouissi et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 176: 894-901 (1991).

NK-1 Rezeptorbindungstest

Es werden radioaktiv markierte Rezeptorbindungsstudien mittels einer Modifizierung eines vorher beschriebenen Protokolls durchgeführt. D. G. Payan et al., Journal of Immunology, 133: 3260-3265 (1984). In diesem Test wird ein Aliquot von IM9 Zellen (1 · 10&sup6; Zellen/Röhrchen in RPMI 1604 Medium, das mit 10% fetalem Kälberserum versetzt ist) mit 20 pM ¹²&sup5;I-markierter Substanz P in Gegenwart von ansteigenden Kompetitorkonzentrationen für 45 Minuten bei 4ºC inkubiert.
Die IM9 Zellinie ist eine gut charakterisierte Zellinie, die leicht frei erhältlich ist. Siehe beispielsweise Annals of the New York Academy of Science, 190: 221-234 (1972), Nature (London), 251: 443-444 (1974), Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 71: 84-88 (1974). Diese Zellen werden routinemäßig in RPMI 1640 kultiviert, das mit 50 ug/ml Gentamicinsulfat und 10% fetalem Kälberserum supplementiert ist.
Die Reaktion wird durch Filtration durch ein Glasfaserfiltererntesystem mittels Filter beendet, die vorher für 20 Minuten in 0,1% Polyethylenimin getränkt wurden. Die spezifische Bindung der markierten Substanz P wird in Gegenwart von 20 nM unmarkiertem Liganden bestimmt.
Viele der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen sind ebenfalls als Antagonisten des NK-2 Rezeptors wirksam.

NK-2-Rezeptorbindungstest

CHO-hNK-2R Zellen, eine von der CHO abstammende Zellinie, die mit dem humanen NK-2 Rezeptor transformiert ist und etwa 400 000 solche Rezeptoren pro Zelle exprimiert, werden in 75 cm² Kolben oder Rollflaschen in Minimal Essential Medium (alpha Modifizierung) mit 10% fetalem Rinderserum angezogen. Die Gensequenz des humanen NK-2 Rezeptors ist in N P Gerard et al., Journal of Biological Chemistry 265: 20455-20462 (1990) angegeben.
Für die Präparation der Membranen werden 30 konfluente Rollflaschenkulturen dissoziiert, indem man jede Rollflasche mit 10 ml Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) phne Calcium und Magnesium gefolgt von der Zugabe von 10 ml enzymfreier Zelldissoziationslösung auf der Grundlage von PBS von Specialty Media, Inc.) wäscht. Nach weiteren 15 Minuten werden die dissoziierten Zellen vereinigt und bei 1000 Upm für 10 Minuten in einer klinischen Zentrifuge zentrifugiert. Die Membranen werden durch Homogenisierung der Zellpellets in 300 ml 50 mM Tris-Puffer pH 7,4 mit einem Tekmar® Homogenisator für 10-15 Sekunden gefolgt von einer Zentrifugation bei 12000 Upm (20 000 · g) für 30 Minuten mittels eines Beckman JA-14® Rotors präpariert. Die Pellets werden einmal unter Verwendung des obigen Verfahrens gewaschen und die schließlichen Pellets werden in 100-120 ml 50 mM Tris Puffer pH 7,4 resuspendiert und 4 ml Aliquots werden bei -70ºC gefroren gelagert. Die Proteinkonzentration dieser Präparation beträgt 2 mg/ml.
Für den Rezeptorbindungstest wird ein 4 ml Aliquot der CHO-hNK-2R Membranpräparation in 40 ml des Testpuffers suspendiert, der 50 mM Tris pH 7,4, 3 mlvi Manganchlorid, 0,02% Rinderserumalbumin (BSA) und 4 ug/ml Chymostatin enthält. Es wird ein Volumen von 200 ul des Homogenats (40 ug Protein) pro Probe Probe verwendet. Der radioaktive Ligand ist [¹²&sup5;I]-Iodhistidylneurokinin A (New England Nuclear, NEX-252), 2200 Ci/mmol. Der Ligand wird in einem Testpuffer mit 20 nCi pro 100 ul hergestellt, wobei die Endkonzentration im Test 20 uM betragt. Die unspezifische Bindung wird mitels 1 uM Eledoisin bestimmt. Zehn Konzentrationen von Eledoisin von 0,1 bis 1000 nM werden für eine Standardkonzentrations-Reaktionskurve verwendet.
Alle Proben und Standards werden zur Inkubation für das Screening in 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) (Einzeldosis) oder in 5 ul DMSO für die HK&sub5;&sub0; Bestimmungen gegeben. Die Mengen der Zugaben für die Inkubation betragen 190 oder 195 ul Testpuffer, 200 ml Homogenat, 10 oder 5 ul Probe in DMSO, 100 ul radioaktiver Ligand. Die Proben werden für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dann auf einem Zellerntegerät durch Filter gesaugt, die vorher für zwei Stunden in 50 mM Tris-Puffer pH 7,7 mit 0,5% BSA getaucht wurden. Das Filter wird dreimal mit etwa 3 ml kaltem 50 mM Tris-Puffer pH 7,7 gewaschen. Die Filterscheiben werden dann in 12 · 75 mm Polystyrolröhrchen gedrückt und in einem gamma-Zähler ausgezählt.
Der Nutzen einer Kombination aus einem Serotoninagonisten und einem Tachykininrezeptorantagonisten bei der Behandlung der Migräne kann am besten durch das folgende Experiment beschrieben werden, das klar den hemmenden Effekt der Kombinationstherapie auf ein Tiermodell zeigt, das für Migränetherapien aussagekräftig ist.

Neurogene Plasmaextravasation in der duralen Schicht, die durch elektrische Stimulierung hervorgerufen wird

Harlan Sprague-Dawley Ratten (225-325 g) oder Meerschweinchen von den Charles River Laboratories (225-325 g) werden mit Natriumphenobarbitol (intraperitoneal jeweils 65 mg/kg oder 45 mg/kg) betäubt und in einen Stereotaxisrahmen (David Kopf Instruments) mit einer Einstellung des Schieberiegels bei -3,5 mm für Ratten oder -4,0 mm für Meerschweinchen. Der sagitalen Mittellinieninzision des Fells folgend werden zwei Paare an bilateralen Löchern durch den Schädel gebohrt (6 mm posterior, 2,0 und 4,0 mm lateral für Ratten und 4 mm posterior und 3,2 und 5,2 mm lateral für Meerschweinchen, wobei alle Koordinaten sich auf die Scheitelhöhe beziehen). Es werden Paare von stimulierenden Edelstahlelektroden, die bis auf die Spitzen isoliert sind, durch die Löcher in beide Hemisphären bis auf eine Tiefe von 9 mm (Ratten) oder 10,5 mm (Meerschweinchen) von der Dura abgesenkt.
Die femorale Vene wird freigelegt und eine Dosis der Testverbindung wird intravenös injiziiert (1 ml/kg). Etwa sieben Minuten später wird eine 50 mg/kg Dosis Evans Blau, ein fluoreszierender Farbstoff, ebenfalls intravenös injiziiert. Das Evans Blau komplexiert mit Proteinen im Blut und funktioniert als Marker für die Proteinextravasation. Exakt zehn Minuten nach der Injektion der Testverbindung wird das linke trigeminale Ganglion für drei Minuten bei einer gleichförmigen Intensität von 1,0 mA (5 Hz, 4 msec Dauer) mit einem Potentiostat/Galvanostat stimuliert.
Fünfzehn Minuten nach der Stimulierung werden die Tiere getötet und mit 20 ml Kochsalzlösung ausgeblutet. Die Oberseite des Schädels wird entfernt, um die Gewinnung der Duralmembranen zu erleichtern. Die Membranproben werden von beiden Hemisphären entfernt, mit Wasser gewaschen und flach auf Mikroskopobjektträger verteilt. Einmal getrocknet werden die Gewebe mit einer 70% Glycerin/Wasser Lösung mit Deckgläschen bedeckt.
Ein Fluoreszenzmikroskop, das mit einem Gittermonochromator und einem Spektrometer ausgestattet ist, wird zur Quantifizierung der Menge an Evans Blau Farbstoff in jeder Gewebeprobe verwendet. Eine Anregungswellenlänge von etwa 535 nm wird verwendet und es wird die Emissionsintensität bei 600 nm bestimmt. Das Mikroskop ist mit einem motorisierten Objekttisch ausgestattet und mit einem Personalcomputer verbunden. Dies erleichtert die Computerkontrollierte Bewegung des Tisches bei Fluoreszenzmessungen an 215 Punkten (500 um Schritte) auf jeder Duraprobe. Der Mittelwert und die Standardabweichung der Messungen werden vom Computer bestimmt.
Die durale Extravasation, die durch die elektrische Stimulation des trigeminalen Ganglions induziert wird, ist ein ipsilateraler Effekt (das heißt tritt nur auf der Seite der Dura auf, auf der das trigeminale Ganglion stimuliert wurde). Dies erlaubt es, die andere unstimulierte Hälfte der Dura als Kontrolle zu verwenden. Es wird das Verhältnis der Menge an Extravasation in der Dura von der stimulierten Seite im Vergleich zur unstimulierten Seite errechnet. Kochsalzkontrollen ergeben ein Verhältnis von etwa 2,0 in Ratten und 1,8 in Meerschweinchen. Im Gegensatz dazu würde eine Verbindung, die die Extravasation in der Dura der stimulierten Seite verhindert, ein Verhältnis von etwa 1,0 aufweisen. Es wird eine Dosis-Reaktions-Kurve erzeugt und die Dosis, die die Extravasation um 50% hemmt (HD&sub5;&sub0;), wird abgeschätzt.
Eine solche typische Dosis-Antwort-Kurve ist in Fig. 1 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen einen deutlichen Vorteil für die Kombination des Serotoninagonisten mit einem Tachykininrezeptorantagonisten gegenüber jeder alleinigen therapeutischen Strategie. Der Verlauf des Experiments, worin die Konzentration des Tachykininrezeptorantagonisten auf einem konstanten Niveau gehalten wird und unterschiedliche Konzentrationen des Serotoninagonisten verabreicht werden, zeigt sehr ähnliche Ergebnisse.
Die Vorteile dieser synergistischen Kombinationstherapie sind offensichtlich. Neben anderen Vorteilen erhöht diese Kombinationstherapie deutlich den therapeutischen Index einer Zusammensetzung zur Behandlung von Migräne. Es kann nun eine deutlich verringerte Menge an Serotoninagonisten einem Patienten verabreicht werden, was vermutlich die Wahrscheinlichkeit und die Schwere von Nebenwirkungen stark verringert. Die verringerte Menge an Wirkstoff die für eine therapeutische Wirkung notwendig ist, macht andere Formulierungsrouten möglich, als die, die derzeit verwendet werden. Jetzt können schnell wirkende Formulierungen, wie bukkal oder sublingual, entwickelt werden. Verzögert freisetzende Formulierungen sind nun aufgrund der geringeren Mengen an notwendigem Wirkstoff realisierbarer.
Ein Vergleich der Bindung von Serotoninagonisten an die einzelnen Rezeptorsubtypen mit der Wirksamkeit einer Verbindung im duralen Extravasationsmodell der Migräne zeigt, daß die Effizienz der Bindung an eine Untergruppe an Rezeptorsubtypen für die Wirksamkeit im Migränemodell vorhersagbarer ist. Diese Analyse zeigt deutlich, daß die 5-HT&sub1; Rezeptorreihe die ist, die primär in der Modulierung der Migräne einbezogen ist. Bevorzugte Rezeptorsubtypen sind 5-HT1B, 5-HT1D und 5-HT1F. Daher folgt, daß die bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren die Verfahren sind, die eine Verbindung verwenden, welche eine Affinität für einen dieser Rezeptorsubtypen aufweist.
Beim Vergleich des Schutzes eines Serotoninagonisten im duralen Extravasationsmodell der Migräne mit seiner Bindungsstärke an verschiedene Serotoninrezeptoren, wurde beobachtet, daß man durch die Effizienz der Bindung an den 5-HT1F Rezeptorsubtyp die Wirksamkeit beim Schutz gegen Migränekopfschmerzen im duralen Extravasationsmodell direkt vorhersagen konnte. Diese Ergebnisse legen stark nahe, daß der 5-HT1F Subtyp der Serotoninrezeptoren am direktesten mit der Migräne und der Linderung der Migräne in Verbindung steht. Aus diesem Grund sind die Serotoninagonisten, die in den erfindungsgemäßen Verfahren am bevorzugtesten verwendet werden die Agonisten, die eine Affinität für den 5-HT1F Rezeptorsubtyp aufweisen.
Während es möglich ist, eine in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Verbindung direkt ohne Formulierung zu verwenden, werden die Verbindungen gewöhnlich in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht, die zumindest einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff und zumindest einen Wirkstoff enthalten. Diese Zusammensetzungen können auf eine Vielzahl an Arten verabreicht werden, einschließlich oral, rektal, transdermal, subkutan, intravenös, intramuskulär und intranasal. Viele der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen sind sowohl als injizierbare als auch als orale Zusammensetzungen wirksam. Solche Zusammensetzungen werden auf eine Weise hergestellt, die in der pharmazeutischen Technik gut bekannt ist und enthalten mindestens einen Wirkstoff. Siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, (16. Ausgabe 1980).
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wird der Wirkstoff gewöhnlich mit einem Träger gemischt oder mit einem Träger verdünnt oder in einem Träger eingeschlossen, der in Form einer Kapsel, eines Sachets, eines Papiers oder eines anderen Behälters vorliegen kann. Wenn der Träger als Verdünnungsmittel dient, kann dies ein festes, halbfestes oder flüssiges Material sein, das als Vehikel, Hilfsstoff oder Medium für den Wirkstoff dient. Daher können die Zusammensetzungen vorliegen in Form von Tabletten, Pillen, Pulvern, Lonzetten, Sachets, Cachets, Elixieren, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupen, Aerosolen (als Feststoff oder in einem flüssigen Medium), Salben, die beispielsweise bis zu 10 Gewichtsprozent des Wirkstoffs enthalten, Weich- und Hartgelatinekapseln, Zäpfchen, sterilen injizierbaren Lösungen und sterilen verpackten Pulvern.
Bei der Herstellung einer Formulierung kann es notwendig sein, den Wirkstoff zu mahlen, um die geeignete Partikelgröße vor der Kombination mit den anderen Inhaltsstoffen bereitzustellen. Falls der Wirkstoff im wesentlichen unlöslich ist, wird er gewöhnlich auf eine Partikelgröße von weniger als 200 Mesh gemahlen. Falls der Wirkstoff im wesentlichen wasserlöslich ist, wird die Partikelgröße normalerweise durch Mahlen eingestellt, um eine im wesentlichen gleichförmige Verteilung in der Formulierung bereitzustellen, beispielsweise etwa 40 Mesh.
Einige Beispiele für geeignete Hilfsstoffe sind unter anderem Lactose, Glucose, Saccharose, Sorbit, Mannit, Stärkearten, Akaziengummi, Calciumphosphat, Alginate, Tragacanth, Gelatine, Calciumsilicat, mikrokristalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose, Wasser, Sirup und Methylcellulose. Die Formulierungen können zusätzlich enthalten: Gleitmittel, wie Talkum, Magnesiumstearat und Mineralöl, Netzmittel, Emulgier- und und Suspendiermittel, Konservierungsmittel, wie Methyl- und Propylhydroxybenzoate, Süßstoffe und Geschmacksstoffe. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können so formuliert werden, daß sie eine schnelle, anhaltende oder verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs nach der Verabreichung an den Patienten durch Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren bereitstellen.
Die Zusammensetzungen werden vorzugsweise in einer Einheitsdosierungform formuliert, wobei jede Dosierung normalerweise etwa 0,05 mg bis etwa 100 mg, gewöhnlicher etwa 1,0 bis etwa 30 mg des Wirkstoffs enthält. Der Ausdruck "Einheitsdosierungsform" bezieht sich auf physikalisch getrennte Einheiten, die als einmalige Dosierungen für den Menschen oder andere Säuger geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an Wirkstoff, die zur Herstellung des gewünschten therapeutischen Effekts berechnet wurde, zusammen mit einem geeigneten pharmazeutischen Hilfsstoff enthält.
Die Wirkstoffe sind im allgemeinen über einen breiten Dosierungsbereich wirksam. Beispielsweise liegen Tagesdosierungen normalerweise im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 30 mg/kg Körpergewicht. Bei der Behandlung von erwachsenen Menschen ist ein Bereich von etwa 0,1 bis etwa 15 mg/kg/Tag in einer einzelnen oder in aufgeteilten Dosierungen besonders bevorzugt. Es ist jedoch verständlich, daß die Menge an tatsächlich zu verabreichender Verbindung von einem Arzt in Anbetracht der relevanten Umstände bestimmt wird, einschließlich des zu behandelnden Zustands, des gewählten Verabreichungswegs, der tatsächlich verabreichten Verbindung oder Verbindungen, dem Alter, Gewicht und der Reaktion des einzelnen Patienten und der Schwere der Symptome des Patienten und daher sollen die oben angegebenen Dosierungsbereiche den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise beschränken. In manchen Fällen können Dosierungsmengen unter dem unteren Limit des oben erwähnten Bereichs passender sein, während in anderen Fällen noch höhere Dosierungen verwendet werden können, ohne schädliche Nebenwirkungen hervorzurufen, vorausgesetzt, daß solche höheren Dosen zuerst in mehrere kleinere Dosen zur Verabreichung über den Tag aufgeteilt werden.

Formulierungspräparation 1

Hartgelatinekapseln werden unter Verwendung folgender Inhaltsstoffe hergestellt:
Menge
Inhaltsstoff (mg/Kapsel)
Wirkstoff(e) 30,0
Stärke 305,0
Magnesiumstearat 5,0
Die obigen Inhaltsstoffe werden gemischt und in Hartgelatinekapseln in Mengen von 340 mg gefüllt.

Formulierungspräparation 2

Eine Tablette wird unter Verwendung der folgenden Inhaltsstoffe hergestellt:
Menge
Inhaltsstoff (mg/Tablette)
Wirkstoff(e) 25,0
mikrokristalline Cellulose 200,0
kolloidales Siliciumdioxid 10,0
Stearinsäure 5,0
Die Bestandteile werden vermischt und unter Bildung von Tabletten gepreßt, wobei jede 240 mg wiegt.

Formulierungspräparation 3

Es wird eine Trockenpulverformulierung zur Inhalation hergestellt, die die folgenden Bestandteile enthält:
Inhaltsstoff Gewicht %
Wirkstoff(e) 5
Lactose 95
Der Wirkstoff wird mit der Lactose gemischt und das Gemisch wird in eine Vorrichtung zur Trockenpulverinhalation gegeben.

Formulierungspräparation 4

Tabletten, die jeweils 30 mg des Wirkstoffs enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Menge
Inhaltsstoff (mg/Tablette)
Wirkstoff(e) 30,0 mg
Stärke 45,0 mg
Mikrokristalline Cellulose 35,0 mg
Polyvinylpyrrolidon (als 10% Lösung in Wasser) 4,0 mg
Natriumcarboxymethylstärke 4,5 mg
Magnesiumstearat 0,5 mg
Talkum 1,0 mg
Gesamt 120 mg
Der Wirkstoff, die Stärke und die Cellulose werden durch ein Nr. 20 Mesh U. S. Sieb gegeben und sorgfältig vermischt. Die Polyvinylpyrrolidonlösung wird mit den entstehenden Pulvern vermischt, die dann durch ein Nr. 16 Mesh U. S. Sieb gegeben werden. Die so hergestellten Granula werden bei 50-60ºC getrocknet und durch ein Nr. 16 Mesh U. S. Sieb gegeben. Die Natriumcarboxymethylstärke, das Magnesiumstearat und das Talkum werden, nachdem sie vorher durch ein Nr. 30 Mesh U. S. Sieb gegeben wurden, zu den Granula gegeben und nach dem Mischen in einer Tablettenmaschine unter Bildung von Tabletten gepreßt, die jeweils 120 mg wiegen.

Formulierungspräparation 5

Kapseln, die jeweils 40 mg Arzneimittel enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Menge
Inhaltsstoff (mg/Kapsel)
Wirkstoff(e) 40,0 mg
Stärke 109,0 mg
Magnesiumstearat 1,0 mg
Gesamt 150,0 mg
Der Wirkstoff, die Cellulose, die Stärke und das Magnesiumstearat werden gemischt, durch ein Nr. 20 Mesh U. S. Sieb gegeben und in Hartgelatinekapseln in 150 mg Mengen abgefüllt.

Formulierungspräparation 6

Zäpfchen, die jeweils 25 mg des Wirkstoffs enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Inhaltsstoff Menge
Wirkstoff(e) 25 mg
Gesättigte Fettsäureglycerideauf 2 000 mg
Der Wirkstoff wird durch ein Nr. 60-Mesh U. S. Sieb gegeben und in den gesättigten Fettsäureglyceriden suspendiert, die vorher bei möglichst geringer Hitze geschmolzen werden. Das Gemisch wird anschließend in eine Zäpfchenform mit einer nominalen Kapazität von 2,0 g gegossen und abgekühlt.

Formulierungspräparation 7

Suspensionen, die jeweils 50 mg Arzneimittel pro 5,0 ml Dosis enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Inhaltsstoff Menge
Wirkstoff(e) 50,0 mg
Xanthangummi 4,0 mg
Natriumcarboxymethylcellulose (11%)
Mikrokristalline Cellulose (89%) 50 mg
Saccharose 1,75 g
Natriumbenzoat 10,0 mg
Geschmacksstoff und Farbstoff q. v.
Gereinigtes Wasser auf 5,0 ml
Das Arzneimittel, die Saccharose und das Xanthangummi werden vermischt, durch ein Nr. 10 Mesh US Sieb gegeben und dann mit einer vorher hergestellten Lösung der mikrokristallinen Cellulose und der Natriumcarboxymethylcellulose in Wasser gemischt. Das Natriumbenzoat, der Geschmacksstoff und der Farbstoff werden mit etwas Wasser vermischt, und unter Rühren zugegeben. Anschließend wird ausreichend Wasser zugegeben, um das erforderliche Volumen zu erhalten.

Formulierungspräparation 8

Kapseln, die jeweils 15 mg Arzneimittel enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Menge
Inhaltsstoff (mg/Kapsel)
Wirkstoff(e) 15,0 mg
Stärke 407,0 mg
Magnesiumstearat 3,0 mg
Gesamt 425,0 mg
Der Wirkstoff(e), die Cellulose, die Stärke und das Magnesiumstearat werden gemischt, durch ein Nr. 20 Mesh U. S. Sieb gegeben und in Hartgelatinekapseln in 425 mg Mengen abgefüllt.

Formulierungspräparation 9

Eine intravenöse Formulierung kann folgendermaßen hergestellt werden:
Inhaltsstoff Menge
Wirkstoff(e) 250,0 mg
Isotonische Kochsalzlösung 1 000 ml

Formulierungspräparation 10

Eine topische Formulierung kann folgendermaßen hergestellt werden:
Inhaltsstoff Menge
Wirkstoff(e) 1-10 g
Emulgierwachs 30 g
Flüssiges Paraffin 20 g
Weißes Weichparaffin auf 100 g
Das weiße Weichparaffin wird erhitzt, bis es geschmolzen ist. Das flüssige Paraffin und das Emulgierwachs werden eingearbeitet und gerührt, bis sie gelöst sind. Der Wirkstoff wird zugegeben und das Rühren wird fortgesetzt, bis dieser dispergiert ist. Das Gemisch wird dann gekühlt, bis es fest ist.

Formulierungspräparation 11

Sublinguale oder bukkale Tabletten, die jeweils 10 mg Wirkstoff enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Inhaltsstoff Menge pro Tablette
Wirkstoff(e) 10,0 mg
Glycerin 210,5 mg
Wasser 143,0 mg
Natriumcitrat 4,5 mg
Polyvinylalkohol 26,5 mg
Polyvinylpyrrolidon 15,5 mg
Gesamt 410,0 mg
Das Glycerin, das Wasser, das Natriumcitrat, der Polyvinylalkohol und das Polyvinylpyrrolidon werden durch kontinuierliches Rühren und Halten der Temperatur bei etwa 90ºC zusammengemischt. Wenn die Polymere in Lösung gegangen sind, wird die Lösung auf etwa 50-55ºC abgekühlt und das Arzneimittel wird langsam zugemischt. Das homogene Gemisch wird in Formen aus inertem Material unter Bildung einer Arzneimittelenthaltenden Diffusionsmatrix mit einer Dicke von etwa 2-4 mm gegossen. Diese Diffusonsmatrix wird dann unter Bildung von einzelnen Tabletten mit der geeigneten Größe ausgeschnitten.
Eine weitere bevorzugte Formulierung, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, verwendet Transdermalverabreichungsvorrichtungen ("Patches"). Solche Transdermalpatches können zur Bereitstellung einer kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Infusion der erfindungsgemäßen Verbindungen in kontrollierten Mengen verwendet werden. Die Konstruktion und die Verwendung von Transdermalpatches zur Verabreichung von pharmazeutischen Mitteln ist in der Technik gut bekannt. Siehe beispielsweise US 5 023 252 A vom 11. Juni 1991, das hiermit eingeführt ist. Solche Patches können zur kontinuierlichen, pulsartigen oder bedarfsabhängigen Abgabe von pharamzeutischen Mitteln konstruiert werden.
Häufig ist es erwünscht oder notwendig die pharmazeutische Zusammensetzung entweder direkt oder indirekt in das Gehirn einzuführen. Direkte Techniken umfassen gewöhnlich die Plazierung eines Arzneimittelabgabekatheters in das Ventrikulärsystem des Patienten, um die Blut-Hirn-Schranke zu umgehen. Ein solches implantierbares Abgabesystem, das für den Transport von biologischen Faktoren an bestimmte anatomische Regionen des Körpers verwendet wird, ist in US 5 011 472 A vom 30. April 1991 beschrieben, das hiermit eingeführt ist. Indirekte Techniken, die allgemein bevorzugt sind, umfassen gewöhnlich die Formulierung der Zusammensetzungen, um für eine Arzneimittelfreisetzungsverzögerung durch die Umwandlung von hydrophilen Arzneimitteln in lipidlösliche Arzneimittel oder Prodrugs zu sorgen. Die Freisetzungsverzögerung wird im allgemeinen durch die Blockierung der Hydroxy-, Carbonyl-, Sulfat- und primären Amingruppen erreicht, die am Arzneimittel vorhanden sind, um das Arzneimittel lipidlöslicher und zugänglicher für den Transport über die Blut- Hirn-Schranke zu machen. Alternativ dazu kann die Abgabe von hydrophilen Arzneimitteln durch eine intraarterielle Infusion von hypertonen Lösungen erhöht werden, die vorrübergehend die Blut-Hirn-Schranke öffnen können.
Der zur Verabreichung der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen verwendete Formulierungstyp kann durch die bestimmten verwendeten Verbindungen, dem Typ des durch die Verabreichungsart gewünschten pharmakokinetischen Profils und der Verbindung(en) und dem Zustand des Patienten vorgegeben werden.
Die Verabreichung des Serotoninagonisten kann gleichzeitig, vor oder nach der Verabreichung des Tachykininrezeptorantagonisten stattfinden. Falls es erwünscht ist, den Serotoninagonisten gleichzeitig mit dem Tachykininrezeptorantagonisten zu verabreichen, können die zwei Wirkstoffe in einer pharmazeutischen Formulierung kombiniert werden oder es können zwei Formulierungen an den Patienten verabreicht werden.
Viele Faktoren können die Verabreichungsreihenfolge des Serotoninagonisten und des Tachikininrezeptorantagonisten vorgeben. Einige dieser Betrachtungen umfassen: Die bestimmten verwendeten Verbindungen, die Art, auf die jeder Wirkstoff formuliert ist, ob die Verabreichung von der Art her prophylaktisch oder heilend ist und der Zustand des Patienten.

Claims

1. Verwendung einer wirksamen Menge eines Tachykininrezeptorantagonisten und eines Serotoninagonisten zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur Behandlung oder Prävention von Migräne brauchbar ist.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Serotoninagonist Sumatriptan, (S)-4-[[3-[2-(Dimethylamino)ethyl]- 1H-indol-5-yl]methyl]-2-oxazolidinon oder Dihydroergotamin ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin der Tachikininrezeptorantagonist ist (R)-2-[N-(2-((4- Cyclohexyl)piperazin-1-yl)acetyl)amino-3-1H-indol-3-yl)-1-[N-(2-methoxybenzyl)acetylamino]propan, (R)-3-(1H- Indol-3-yl)-1-[N(2-methoxybenzyl)acetylamino]-2-[N-(2-(4-(piperidin-1-yl)piperidin-1-yl)acetyl)amino]propan, 1- (2-Brombenzyl)-2-(3,5-dimethylphenyl)6-[2-(N,N-dimethylamino)ethoxy]benzimidazol, RP 67580, (±) CP 96345, 5-(3,5-Bistrifluormethylphenyl)-1-(3-indolyl)2-((4-methylpiperazin-1-yl)acetamido)-3-pentanon, (4-Methy1phenyl)methyl-[R-(R*, S*)]-[1-(1H-indol-3-ylmethyl)-1-methyl-2-oxo-2-[(1-phenylethyl)amino]ethyl]- carbamat oder 1-(3,5-Dimethylbenzyloxy)-2-amino-2-phenylcyclohexan oder ein Salz oder Solvat hiervon.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Tachykininrezeptorantagonist und der Serotoninagonist in einer Form sind, um gleichzeitig verabreicht zu werden.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin eine Zusammensetzung mit Tachykininrezeptorantagonistaktivität in einer Form ist, um verabreicht zu werden, bevor eine Zusammensetzung mit Serotoninagonistaktivität verabreicht wird.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin eine Zusammensetzung mit Serotoninagonistaktivität in einer Form ist, um verabreicht zu werden, bevor eine Zusammensetzung mit Tachykininrezeptoragonistaktivität verabreicht wird.