ES2201440T3

ES2201440T3 - S-2'-(2-(1-metil-2-piperidil)etil)cinnamanilida como antagonista del receptor 5-ht2.

Info

Publication number: ES2201440T3
Application number: ES98903668T
Authority: ES
Inventors: M. Samir Amer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-02-28
Filing date: 1998-01-23
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2018-01-23
Also published as: WO1998038165A1; EP0973741B1; US5780487A; NO318443B1; KR20000075696A; AU750603B2; JP3492378B2; DE69815518D1; AU6037798A; DE69815518T2; CA2282840C; ATE242765T1; CA2282840A1; NO994181L; NO994181D0; JP2001527521A; EP0973741A1

Abstract

El efecto antagosnista contra el receptor de 5-HT2 de la 2''-[2-(1-metil-2-piperidil)etil] cinamanilida, que es una mezcla racémica (R S-MPEC) de los isómeros S-MPEC y R-MPEC, se debe prácticamente por completo al isómero S-MPEC, siendo el isómero R-MPEC una impureza. Se describen isómeros puros S-MPEC, mezclas de los mismos con hasta un 10% de R-MPEC, un procedimiento nuevo para la resolución del isómero S-MPEC que implica un nuevo compuesto intermedio, composiciones terapéuticas que contienen S-MPEC, y la utilización de todos ellos para administración a animales, especialmente humanos, que necesiten bloquear el receptor de 5HT2, como para tratar hemorroides, venas varicosas, insuficiencias venosa y coronaria, curación de heridas y agentes anestésicos o analgésicos locales.

Description

S-2'-(2-(1-metil-2-piperidil)etil)cinnamanilida como antagonista del receptor 5-HT_{2}.

Esta invención se refiere a la preparación de un isómero específico, es decir, un isómero S (o (-) o 1 o levo) específico, en particular el compuesto S-2'-[2-(1-metil-2-piperidil)etil]cinnamanilida o su sal de ácidos.

En la patente de EEUU nº 5.266.571, fechada el 30 de noviembre, 1993, el inventor describe y reivindica un método para tratar o prevenir las hemorroides en animales mediante la administración de un antagonista del receptor 5-HT_{2} basándose en el descubrimiento de que la 5-HT (5-hidroxitriptamina o serotonina) desempeña un papel importante en la mediación del aumento de la presión venosa y/o la agrupación de plaquetas que conduce a la congestión de las venas en el plexo hemorroidal, en la que están implicados los receptores 5-HT_{2}, en lugar de los receptores 5-HT_{1}, y de que los antagonistas del receptor 5-HT_{2}, por tanto, inhiben las hemorroides. Entre estos antagonistas preferidos se menciona el hidrocloruro de 2'-[2-(1-metil-2-piperidil)etil]cinnamanilida (MPEC) y otros dos compuestos.

En la patente de EEUU 5.605.902, fechada el 25 de febrero, 1997, de la cual la presente solicitud es una continuación en parte, cuya solicitud de EEUU anterior se corresponde con el documento PCT WO94/18958, publicado el 1 de septiembre, 1994, el inventor describe y reivindica además el uso de los mismos antagonistas del receptor 5-HT_{2} para tratar o prevenir las venas varicosas, la insuficiencia venosa o para tratar heridas.

Objetos de la invención

Un objeto de esta invención es proporcionar un método para la preparación de una forma mejorada, más pura, no adulterada y/o más eficaz de sMPEC, así como un nuevo compuesto intermedio para fabricar dicho producto.

Caso: Amer 11

Otros objetos y ventajas surgirán a medida que avanza la descripción.

Sumario de la invención

El logro de uno o más de los objetos anteriores es posible separando la mezcla racémica (RS) de MPEC empleada en las invenciones de las anteriores dos aplicaciones de EEUU mencionadas, en sus isómeros S y R (o (+) o d), y descubriendo que el isómero R está total o sustancialmente exento de cualquier actividad como antagonista del receptor 5-HT_{2} y es, en cuanto a esto, un adulterante o impureza en cualquier mezcla con el isómero S, en cuya mezcla el isómero S es el único antagonista activo del receptor 5-HT_{2}, y que el isómero S (S-MPEC) es, por tanto, y de forma inesperada, al menos dos veces tan eficaz como antagonista del receptor 5-HT_{2} como la mezcla racémica de MPEC (RS-MPEC). Por tanto, el efecto de bloqueo del receptor 5-HT_{2} que se logra con cualquier cantidad dada de RS-MPEC puede alcanzarse con, por ejemplo, la mitad de esa cantidad de S-MPEC. Otras desventajas serán inherentes a cualquier composición terapéutica que contenga una cantidad igual del ingrediente activo y adulterante. Las formas isómeras y racémicas de MPEC tienen en común la fórmula empírica C_{23}H_{28}N_{2}O (P.M. 348,49).

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un método para preparar S-MPEC según se define en la reivindicación 1 adjunta. En la presente se describe el uso, en composiciones terapéuticas y en el tratamiento de animales que necesitan un efecto bloqueante del receptor 5-HT_{2}, de compuestos o sus mezclas seleccionados del grupo que consiste en S-2'-[2-(1-metil-2-piperidil)etil]cinnamanilida (S-MPEC) exenta del isómero R, su sal de ácidos farmacéuticamente aceptable, y cualquier mezcla de éstos con hasta aproximadamente 10% de cualquiera de sus correspondientes isómeros R (R-MPEC) y sus sales.

Las mezclas mencionadas contienen preferiblemente no más de aproximadamente 4%, más preferiblemente no más de aproximadamente 1% de la impureza R-MPEC, la S-MPEC es preferiblemente la sal hidrocloruro y/o la S-MPEC está preferiblemente exenta de R-MPEC. La expresión "sustancialmente exento del isómero R" (o equivalente) pretende abarcar las mezclas que contienen desde aproximadamente 0,0001% a aproximadamente 10% del isómero R (estereoisómero).

La invención también comprende la producción de un intermedio nuevo, la S-[sal piperidindibenzoil-L-tartrato de 2-(o-aminofenetil)-1-metilo] (S-APEMP.DBLT (o .L-DBT)), que comprende hacer reaccionar 1 mol de 2-nitrobenzaldehído con 1 mol de 2-picolina en presencia de anhídrido acético, y tratar la 2-(o-nitroestiril)piridina resultante con un agente metilante cuaternizante para producir la correspondiente sal de 2-(o-nitroestiril)-1-metilpiridinio (NSMP), reducir la sal de piridinio mediante hidrogenación catalítica para producir la correspondiente sal hidrato de RS-2-(o-aminofenetil)-1-metilpiperidina (RS-APEMP), tratar la sal hidrato con un agente alcalino para liberar la base libre (RS-APEMP) y tratar la base libre con ácido dibenzoil-L-tartárico (DBLT o L-DBT) para producir la nueva S-APEMP.DBLT. Ésta se trata entonces con un agente alcalino para la liberar la base libre (S-APEMP) que entonces se hace reaccionar con una cantidad equimolar de cloruro de cinnamoílo para producir S-MPEC.

\newpage

En el anterior proceso, las etapas iniciales para producir la sal NSMP se describen en Dykstra et al., J. Med. Chem., 16, 1015 (1973), y L. Horwitz, J. Org. Chem., 21, 1039 (1956), y la siguiente etapa para producir la sal hidrato de APEMP se describe en Dykstra et al., patente de EEUU nº 4.064.254, en especial en el ejemplo 1. Los ejemplos 1, 25 y 141 de esta última patente describen la producción de "1"-MPEC y "d"-MPEC por separado, utilizando procedimientos bastante similares al proceso del solicitante descrito anteriormente, excepto que la separación se logra con ácido d-canfórico en etanol al 95% (en lugar del ácido dibenzoil-L-tartárico del solicitante) y requiere una cristalización fraccionaria que es ineficaz. Además, la rotación óptica de -42,8º que aparece en la patente para "1"-MPEC indica una eficacia reducida (comparada con el producto S-MPEC del solicitante, con una rotación óptica de -46º).

Además, resulta significativo que esta patente 4.064.254 no describe el reconocimiento de cualquier posibilidad de que las propiedades de los isómeros S y R de MPEC puedan diferir, y mucho menos de que un isómero pueda ser completamente inactivo en un campo en el que el otro isómero es muy activo, y mucho menos cuando esta actividad es para bloquear los receptores 5-HT_{2}, y mucho menos para tratar o prevenir las hemorroides, las venas varicosas o la insuficiencia venosa o coronaria, o para tratar heridas, o como agentes analgésicos o anestésicos locales. Los solicitantes de la patente de EEUU nº 5.266.571 analizan la insuficiencia de la técnica anterior, sugiriendo la actividad antiserotonina de forma amplia como base para instar la anticipación de una invención basada en el antagonismo del receptor 5-HT_{2}. En la presente se produce una situación similar, siendo la única actividad descrita en la patente 4.064.254 la actividad antiarritmia y antiserotonina.

La S-MPEC (o su sal) en forma pura, o que contiene la pequeña cantidad indicada de la impureza del isómero R inactivo, puede proporcionarse y utilizarse en forma pura, o en un vehículo sólido, líquido o en partículas farmacéuticamente aceptable no tóxico, o con éste, en forma de una composición en pasta, ungüento, crema o gel adecuada para la administración tópica o rectal, de forma deseable con un agente gelificante, ligante o espesante, para proporcionar la viscosidad deseada, o en forma de un comprimido, cápsula, goma de mascar, pastilla, polvo, pulverizado, aerosol, enema, supositorio, jarabe, elixir, suspensión acuosa u oleosa, emulsión o disolución, pasta, ungüento, crema o gel adecuado para la administración sistémica oral, rectal o parenteral, como mediante inyección subcutánea, intraperitoneal, intramuscular o intravenosa, o mediante una terapia transdérmica o por inhalación.

La S-MPEC puede emplearse en forma libre, o como una sal de adición de ácidos en general farmacéuticamente aceptable no tóxica soluble en agua, con ácidos orgánicos o inorgánicos relativamente no tóxicos como ácido sulfúrico, sulfónico, fosfórico, fosfónico, bromhídrico, clorhídrico, yodhídrico, sulfámico, metansulfónico, bencensulfónico, para-toluensulfónico, acético, láctico, succínico, málico, múcico, tartárico, cítrico, glucónico, benzoico, cinámico, isetiónico y similares.

De forma adecuada, las composiciones comprenden suficiente material S-MPEC activo para proporcionar una dosis de 0,05-10 mg por kg de peso corporal, de forma más adecuada 0,2-6 mg/kg de peso corporal. Estas composiciones pueden tomarse de 1-3 veces diarias o según se necesite, hasta que el síntoma o trastorno que se está tratando disminuye o se corrige.

Las composiciones pueden contener el ingrediente activo en cantidades que varían desde menos de 1% hasta más de 99%, siendo el resto un vehículo sólido o líquido farmacéuticamente aceptable, que puede contener otros excipientes convencionales. Los ejemplos de estos vehículos y excipientes incluyen cargas, ligantes, aromas, edulcorantes, agentes de relleno y colorantes, antioxidantes, detergentes tensioactivos aniónicos, no iónicos, catiónicos, bipolares y anfóteros, agentes espumantes, dispersantes y emulsionantes, agentes tamponantes y ajustadores del pH, agua y disolventes orgánicos, humectantes, espesantes, conservantes, estabilizantes, agentes de liberación del molde, disgregantes, antidisgregantes, lubricantes y similares. Los ejemplos de vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables convencionales se analizan con profusión en la técnica anterior, incluyendo los análisis en la patente de EEUU nº 4.515.772 (Parran et al., Procter & Gamble), patente de EEUU nº 4.966.777 (Gaffar et al., Colgate-Palmolive Company), y la patente de EEUU nº 4.728.512 (Mehta et al., American Home Products).

Los siguientes ejemplos son sólo ilustrativos de ciertas realizaciones preferidas de esta invención. Todas las partes y proporciones indicadas en la presente, y en las reivindicaciones adjuntas, son en peso, y las temperaturas están en grados centígrados, a menos que se indique lo contrario.

El ejemplo 1 a continuación ilustra, mediante una descripción y ecuación, una realización preferida de un método para fabricar S-MPEC, con datos de apoyo que caracterizan, identifican y/o corroboran las propiedades de los intermedios, productos finales, etc.

Ejemplo 1 Preparación y confirmación de S-MPEC I

1

1. 2-nitrobenzaldehído

2. 2-picolina

3. 2-(o-nitroestiril)piridina (NSP)

4. yoduro de 2-(o-nitroestiril)-1-metilpiridinio

5. RS-2-(o-aminofenetil)-1-metilpiperidina.HI

6. S-[2-(o-aminofenetil)-1-metilpiperidindibenzoil-L-tartrato] (S-APEMP.DBLT o .L-DBT)

7. S-2'-[2-(1-metil-2-piperidil)etil]cinnamanilida (S-MPEC)

7a. cloruro de cinnamoílo

Proceso químico de S-MPEC (A) Yoduro de 2-(o-nitroestiril)-1-metilpiridinio (NSMP-I)

A un matraz de fondo redondo de 50 l se le añadió 2-nitrobenzaldehído (3.500 g, 23,2 moles), 2-picolina (3,2 l, 32,8 moles) y anhídrido acético. La mezcla se agitó de forma eficaz bajo una atmósfera inerte (nitrógeno o cualquier otro gas inerte) y se calentó a reflujo durante 27 horas. La mezcla se enfrió hasta por debajo de 100ºC, para una manipulación segura, y se extinguió en un recipiente adecuado equipado con enfriamiento externo y agitación eficaz sobre 10,5 kg de hielo. El pH se ajustó a 11 con hidróxido de sodio acuoso al 45% añadido a una velocidad para mantener la temperatura por debajo de 50ºC. Después de enfriar hasta 20-30ºC, el sólido granular se recogió mediante filtración y se lavó bien con agua. Rendimiento: 6572 g de 2-(o-nitroestiril)piridina (NSP) bruta.

Este sólido se trasladó a un matraz de fondo redondo de 50 l, se disolvió en acetona (14 l) y se añadió yodometano (2,94 l, 47,7 moles) (agente metilante cuaternizante) (pueden utilizarse otros agentes (alquilantes) parecidos, que, en general, tienen la fórmula CH_{3}X, siendo X un anión como sulfato, metilsulfato, haluro (Cl, Br, I), etc.). La mezcla se calentó a reflujo bajo una atmósfera inerte (nitrógeno u otro gas inerte) durante 18 hr. Después de enfriar hasta 20ºC, el precipitado se recogió mediante filtración y se lavó con acetona o una mezcla 1:1 de acetona:acetato de etilo (3 x 3,5 l). Un secado hasta lograr un peso constante a 50-60ºC produjo 6,839 g (80%) de NSMP.I.

(B) Hidroyoduro de RS-2-(o-aminofenetil)-1-metilpiperidina (RS-APEMP.HI)

En un reactor de 18,9 l se redujo una disolución de NSNP.I (935 g, 2,5 moles) en metanol (14 l) en una atmósfera de hidrógeno de 378,95 kPa en presencia de PdC (al 5 ó 10%, 98 g). Después de la eliminación del catalizador y la evaporación del filtrado de la manera habitual, el residuo se disolvió en metanol caliente (2,8 l). Se añadió acetato de etilo (2,8 l) a la mezcla caliente para inducir la cristalización. Rendimiento 516,3 g (59%) de RS-APEMP.HI.

(C) S-[dibenzoil-L tartrato de 2-(o-aminofenetil-1-metilpiperidina] (S-APEMP.DBLT)

Una disolución de RS-APEMP.HI (516 g, 1,5 mol) y acetato de etilo (5,5 g) (u otro disolvente inmiscible en agua de bajo punto de ebullición, como benceno, tolueno, etc.) se extrajo con hidróxido de sodio acuoso al 5% para liberar la base libre (fase orgánica), se lavó la fase orgánica con agua, se secó sobre un agente secante adecuado (como sulfato de sodio, sulfato de magnesio, carbonato de potasio anhidro, etc.). Después de separar el disolvente del agente secante, la disolución se evaporó al vacío y la base libre de RS-APEMP residual se disolvió en metanol (1,0 l) y se añadió una disolución de ácido dibenzoil-L-tartárico (540 g, 1,5 moles) en metanol (2,3 l). La mezcla se mantuvo durante la noche a temperatura ambiente. El precipitado cristalino se recogió y se recristalizó en metanol (3,4 l). Rendimiento 246 g de S-APEMP.DBLT (28,6% en peso; 57,2% de S -APEMP).

(D) S-2'-[2-(1-metil-2-piperidil)etil]cinnamanilida (S-MPEC)

Una disolución de S-APEMP.DBLT (287 g, 0,5 mol) en acetato de etilo (3,2 l) (u otro disolvente inmiscible en agua de bajo punto de ebullición) se extrajo con bicarbonato de sodio acuoso al 7,5% (3,2 l) para liberar la S-APEMP. Después de un lavado con agua y un secado sobre un agente secante adecuado, el disolvente se eliminó al vacío. El residuo oleoso, S-APEMP, se disolvió en acetato de etilo (1,0 l) y se añadió carbonato de potasio anhidro (412 g, 3,0 mol) (u otro aceptor de ácidos adecuado, como trietilamina, piridina, etc.). Se añadió lentamente cloruro de cinnamoílo (143 g, 0,7 mol) en 700 ml de acetato de etilo. Después de la reacción inicial, la mezcla se sometió a reflujo durante 14 horas. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, la mezcla se extrajo con agua (1,7 l) y se secó sobre un agente secante adecuado. Después de eliminar el agente secante, el disolvente se eliminó al vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo caliente (280 ml) y se permitió que se enfriase lentamente hasta la temperatura ambiente. Una filtración produjo S-MPEC (136 g, rendimiento 79%). Análisis: calculado para C,H,N: C, 79,27; H, 8,10; N, 8,04. Encontrado: C, 79,27; H, 8,06; N, 8,07. Pureza (quiral) mediante HPLC: 99,5%, [\alpha]_{D25^{o}} = -46º (c = 0,01, EtOH). Punto de fusión: 128ºC.

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Configuración absoluta de 1-MPEC Sumario

Se determinó que la configuración absoluta de 1-MPEC era S mediante cristalografía de rayos X de 1-APEMP\cdotL-DBT\cdot2H_{2}O, que es un intermedio de 1-MPEC.

Puesto que la elaboración para hacer crecer cristales de 1-MPEC no produjo resultados acertados, se intentó entonces la recristalización de cristales finos de 1-APEMP\cdotL-DBT, que es un intermedio de 1-MPEC. La recristalización lenta de 1-APEMP\cdotL-DBT produjo cristales lo suficientemente grandes del correspondiente dihidrato.

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+  Recristalización \+\cr 
1-APEMP \cdot L-DBT \+  - - - - - -
- - - - - -> \+ 1-APEMP \cdot L-
DBT \cdot 2H _{2} O\cr  \+ MeOH-agua
(1/1)\+\cr}

Se determinó que la configuración absoluta de 1-APEMP\cdotL- DBT\cdot2H_{2}O era S mediante cristalografía de rayos X. La configuración de 1-APEMP\cdotL-DBT se mantuvo bajo las condiciones de reacción para la conversión a 1-MPEC, porque el cloruro de cinnamoílo sólo reacciona con el grupo amino del anillo de benceno, y no afecta a ninguna otra parte de la molécula. Por consiguiente, se determinó que la configuración absoluta de 1-MPEC era S.

Sección experimental

Se disolvieron 500 mg de cristales finos de 1-APEMP\cdotL-DBT, cuya pureza estereoquímica es > 99,5% d.e., en 10 ml de metanol/agua (1/1), y los cristales se hicieron crecer durante 7 días a temperatura ambiente para producir cristales de 1-APEMP\cdotL-DBT\cdot2H_{2}O. Los detalles experimentales y resultados de la cristalografía de rayos X se resumen en la tabla 1.

El equipo utilizado para el análisis de la estructura de los cristales mediante rayos X de la sal 1-APEMP\cdotL-DBT es el siguiente:

Dispositivo de medida: ENRAF NONIUS CAD4 (un difractómetro de rayos X automático para cristales únicos)

Programa informático de medida: Express®

Ordenador para el análisis: DEC VAX3100

Programa informático para el análisis: Molen®

TABLA 1

Cristalografía de rayos X de 1-ADEMP.L-DBT\cdot2H_{2}O
Nombre de la muestra	1-ADEMP\cdotL-DBT\cdot2H_{2}O
Fórmulas moleculares	C_{32}H_{36}N_{2}0_{8}\cdot2H_{2}O
Rayos X	CuK \alpha (\lambda = 1,54184 \ring{A})**
Tamaño del cristal (mm)	0,4 x 0,3 x 0,3
Sistema cristalino	Ortorrómbico
Grupo espaciador	P2_{1}2_{1}2_{1}
a (\ring{A})**	13,3583 (7)
b (\ring{A})**	30,298 (2)
c (\ring{A})**	7,8105 (6)
vol. (\ring{A})**	3161,2 (5)
z	4
2\theta (grados)	6,4 < 2\theta < 150
D (calculado)	1,287
R*	0,052
Número de reflexiones	3724
Número del parámetro usado	518

TABLA (continuación)

Cristalografía de rayos X de 1-ADEMP.L-DBT\cdot2H_{2}O
\mu (CuK \alpha) (cm^{-1})	1,89
Número de I > 3 \sigma (I)	3476
e/ \ring{A}^{3} máximo	0,239
Reflexión estándar	24 puntos (8 < \theta < 14)
Método de corrección de datos	Efecto Lorentz y polarización
Recogida de datos de reflexión	Sistema Enraf Nonius CAD-4
Determinación de la estructura	Programa Enraf Nonius MoIEN
*R = (\Sigma II F0 I - I Fe II)/\Sigma I F0 I
**1 \ring{A} = 1 x 10^{-10} m

TABLA 2

Certificado de análisis
Nombre del compuesto: (-)-2'-[2-(1-metil-2-piperidil)etil]cinnamanilida (I-MPEC, S-MPEC)
Ensayo	Especificación	Resultados
Descripción física	Solido blanco a blancuzco	Solido blanco a blancuzco
	sin contaminantes visibles	sin contaminantes visibles
RMN de ^{1}H (CDCl_{3}), 300 MHz	Se ajusta al espectro nº	El espectro nº B3-16514
	B3-13055	se ajusta al espectro nº
		B3-13055
FTIR (puro, acetona)	Se ajusta al espectro nº	El espectro nº FT0712 se
	FT0155	ajusta al espectro nº
		FT0155
R.O.I.	\leq 0,1%	0%
Punto de fusión	Registro	128ºC
HPLC (química)	Pureza química \geq 98% sin	Lo mismo
	impurezas individuales
	mayores que 0,5%
HPLC (quiral)	Pureza quiral \geq 99,5%	> 99,5%
CG (disolventes	Acetona \leq 0,2%	< 0,1%
residuales)
	Acetato de etilo \leq 0,2%	=0,13%
	Metanol \leq 0,2%	< 0,1%
	Hexano \leq 0,2%	< 0,1%
Contenido en agua (Karl	\leq 5,0%	0,2%
Fisher)
Metales pesados	\leq 0,005%	< 0,005%
Rotación óptica (EtOH)	Registro	-46º
Análisis elemental	C 79,27 \pm 0,4	79,27
	H, 8,10 \pm 0,4	8,06
	N, 8,04 \pm 0,4	8,07

TABLA 3

Certificado de análisis
Nombre del compuesto: d-2'-[2-(1-metil-2-piperidil)etil]cinnamanilida (R-MPEC, (+)-MPEC)
Ensayo	Resultados
Descripción física	Sólido blanco, sin contaminantes visibles
RMN de ^{1}H (CDCl_{3}), 300 MHz	El espectro nº B3-16942 se ajusta a la estructura
FTIR (puro, acetona)	El espectro nº FTO798 se ajusta a la estructura
Punto de fusión	128ºC
Análisis elemental	C = 79,19%
	H = 8,09%
	N = 8,03%
HPLC (química)	99,8% sin impurezas individuales > 0,5%
HPLC (quiral)	99,9%
R.O.I.	< 0,1%
GC (disolventes residuales)	Acetona < 0,2%
	Acetato de etilo = 0,3%
	Metanol < 0,2%
	Hexano < 0,2%
Contenido en agua (Karl Fischer)	0,4%
Metales pesados	< 0,005%
Otros ensayos
Rotación óptica (c = 0,01, EtOH)	+41º

Ejemplo de referencia 2

Efectos de MPEC en vena de colon humana aislada contraída con 5-hidroxitriptamina (5-HT)

El objetivo de este estudio es determinar la IC_{50} de MPEC en vena de colon humana aislada contraída con 5-hidroxitriptamina. La MPEC se ensayó en tres formas: el racemato, el isómero R y el isómero S, para identificar el isómero activo. Se prepararon disoluciones madre de MPEC (10^{-2} M) (racemato, isómeros R y S) en agua acidificada (agua-ácido clorhídrico, 99,50-0,50%) y posteriormente se diluyeron en agua.

La 5-HT (5-hidroxitriptamina o serotonina) se disolvió en agua a 10^{-2} M y posteriormente se diluyó en agua.

El agua utilizada en este estudio se obtuvo a partir de un aparato Milli Q (Millipore).

Las venas de colon humanas se obtuvieron de pacientes (4 hombres y 2 mujeres, 60 \pm 7 años) que sufrieron la extirpación de una parte del colon debido a una malignidad del colon o poliposis. Inmediatamente después de la retirada quirúrgica, se tomó un espécimen de vena de colon e inmediatamente se trasladó al laboratorio en disolución salina acuosa fisiológica con la siguiente composición (en mM): NaCl (112), KCl (5), NaHCO_{3} (25), glucosa (11,5), KH_{2}PO_{4} (1,2), CaCl_{2} (2,5) y MgSO_{4} (1,2), pH 7,4. Esta disolución se mantuvo a 37ºC (caja con termostato portátil, Veba Meditemp) y se gasificó con oxígeno. Bajo un microscopio binocular se prepararon y montaron anillos de venas de colon humanas (3-5 mm, 9,6 \pm 1,1 mg, n = 25) sin grasa, con 500 mg de tensión de reposo, en una baño de órganos de 25 ml que contiene disolución salina fisiológica mantenida a 37ºC (termostato de baja temperatura Lauda RCS6) y se gasificaron con 95% de O_{2} y 5% de CO_{2}. La tensión se midió isométricamente con un transductor (Grass FT 03) conectado a un amplificador (acoplador de puente de tipo 570, Hugo Sach Electronic) acoplado a un registrador oscilográfico (registrador lineal Graphtec de marca VII WR 3101, Hugo Sach Elektronik) y un ordenador para la toma de datos y el control de las electroválvulas (Amstrad PC 1512SD equipado con una tarjeta AD/AD y una tarjeta IO).

Se dejó que cada anillo se equilibrase durante 60 min en disolución salina fisiológica. Después de este periodo, la vena de colon humana se estimuló con 5-HT (3 x 10^{-6} M, concentración que induce una contracción fásica submáxima). Cuando se observó la tensión máxima, la vena de colon se lavó con disolución salina fisiológica cada 10minutos durante 40 minutos. Cuando se han obtenido las contracciones control reproducibles las preparaciones se incubaron durante 60 min con MPEC (la forma racemato, el isómero S o R) a una concentración fija: 10^{-9}, 3 x 10^{-9} ó 10^{-8} M, o como agua como control antes de la última inducción de la contracción con 5-HT 3 x 10^{-6} M. Sólo se utilizaron las preparaciones en las que las contracciones control estaban equipadas. Las preparaciones que desarrollaron una tensión menor que 250 mg o que pesaban menos de 2 mg se desecharon. No se observó una diferencia estadística en los valores de los parámetros control entre los diferentes grupos experimentales.

La inhibición observada inducida con MPEC se expresó como porcentaje de la última contracción control. El pD'_{2} (el logaritmo negativo de la concentración molar de un antagonista capaz de reducir en 50% la respuesta máxima provocada por un agonista) se calculó mediante el método de Van Rossum (1963). Sólo se utilizaron los datos relativos a la concentración del inhibidor que producían una inhibición media entre 10 y 90%. Se calculó la IC_{50} como el antilogaritmo de pD'_{2}.

Los resultados se expresan como media \pm error estándar de la media. La comparación entre dos medias se realizó utilizando el ensayo de la t de Student después de comprobar la homogeneidad de la varianza mediante el ensayo de la X^{2}. La comparación entre las diferentes medias se realizó utilizando un ensayo de la F (análisis de la varianza con un parámetro de clasificación) después de comprobar la homogeneidad de las varianzas utilizando un ensayo de Bartlett (Lambert, 1963).

TABLA 4

	RS-MPEC	S-MPEC	R-MPEC	Selectividad*	Significación
pD'_{2}	8,35	8,77	7,23	34,67	P < 0,001
*La selectividad se calcula como el antilogaritmo de la diferencia entre los dos valores pD'_{2} (Furchgolt, 1972).
Por tanto, MPEC presenta una actividad estereoselectiva.

Los resultados anteriores indican que S-MPEC es 34,67 veces tan activo como R-MPEC (dos veces tan activo como RS-MPEC) para bloquear los receptores 5- HT_{2} en venas de colon humanas. Este es el principal mecanismo de la actividad de MPEC contra las hemorroides, venas varicosas e insuficiencia coronaria, la curación de heridas y otros síntomas inducidos por el receptor 5-HT_{2}. En este caso se demuestra que la R-MPEC es esencialmente inactiva y, en efecto, una impureza.

Ejemplo de referencia 3

Efectos de MPEC sobre el retorcimiento inducido por fenilquinona en ratones

Ratones dosificados por vía oral con ciertos analgésicos, tranquilizantes o ansiolíticos no responden de manera típica a una dosis intraperitoneal (2,5 mg/kg) de fenil-p-benzoquinona (PPB). La respuesta normal es retorcerse, caracterizada por extensiones y torsiones del cuerpo. El bloqueo de esta respuesta se mide comparando el número de episodios de retorcimiento observados con diferentes niveles de dosis del compuesto de ensayo, con los observados en animales con vehículo control. Los episodios de retorcimiento en cinco animales se cuentan simultáneamente con un contador de laboratorio de 5 teclas. Se cuenta el número total de episodios de retorcimiento para cada animal durante exactamente 10 minutos, después de la inyección de PPB.

Los resultados del ensayo de RS-, R- y S-MPEC con el procedimiento anterior con un control de disolución salina y un analgésico conocido, la indometacina, aparecen en la siguiente tabla:

TABLA 5

	Dosis (mg/kg)	N	nº de retorcimientos
Disolución salina		10	21,4\pm4,6
Indometacina	5	9	12,8\pm3,5
RS-MPEC	2,5	9	15,3\pm4,1
R-MPEC	2,5	9	25,3\pm4,2
S-MPEC	2,5	9	11,4\pm3,2

Los resultados anteriores demuestran que la R-MPEC que produce 25,3 retorcimientos es sustancialmente inactiva como analgésico, y que la S-MPEC que produce sólo 11,4 retorcimientos proporciona sustancialmente toda la actividad analgésica de la mezcla de S-MPEC y R-MPEC en la RS-MPEC que produce 15,3 retorcimientos. La actividad analgésica sorprendentemente elevada de S-MPEC es una propiedad importante en el tratamiento de las hemorroides, heridas y venas varicosas, y también resulta útil para tratar insuficiencias venosas y coronarias.

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Ejemplo de referencia 4

Bloqueo de los receptores 5-HT_{2} en el prosencéfalo de rata

Se sacrificaron ratas mediante decapitación para retirar la corteza cerebral, a la cual se añadió un volumen de 10 veces de una disolución de sacarosa 0,32 M para homogeneizar con un POLYTRON (ajuste: 6 y 30 segundos, KINEMATICA AG, Suiza). Posteriormente se realizó una centrifugación durante 10 minutos a 1.000 x g. El sobrenadante resultante se sometió a una centrifugación durante 20 minutos a 35.000 x g, y se añadió un volumen de 10 veces de tampón Tris 50 nM (pH: 7,4; 25ºC) al precipitado obtenido antes de realizar la resuspensión. Esta suspensión se sometió a una incubación durante 10 minutos a 37ºC antes de realizar una recentrifugación durante 20 minutos a 35.000 x g. El precipitado final se suspendió en un volumen de 40 veces de tampón para la medida (Tris 50 mM, CaCl_{2} 4 mM, pargilina 10 \muM, ácido ascórbico al 0,1%, pH: 7,7, 25ºC), y esta suspensión se utilizó como la preparación de membranas en el experimento de unión. Se añadió 0,1 ml de ^{3}H-quetanserina (concentración final: 0,4 nM) y 0,4 ml de la preparación de membranas al fármaco de ensayo (S-MPEC y R-MPEC), y a 0,5 ml de tampón para la medida, en el cual se disolvió la concentración final (1 \muM) de metisergida. La disolución se preparó para alcanzar un volumen total de 1,0 ml y se permitió que reaccionase a 37ºC durante 20 minutos. Después de terminar la reacción, la disolución reactiva se filtró mediante aspiración bajo presión reducida utilizando un filtro Whatmann GF/C impregnado con una disolución de polietilenimina al 0,1%, y el filtro se lavó tres veces con 5 ml de tampón Tris 50 mM (pH: 7,4, 25ºC) que se enfrió inmediatamente con hielo, al cual se le añadieron 5 ml de escintisol para medir la radiactividad del filtro con un contador de centelleo líquido. Se determinó que el volumen de unión específica es el valor obtenido después de restar el volumen de unión no específica en presencia de metisergida 1 \muM del volumen de unión total. El experimento se realizó por triplicado. El ensayo de proteínas de la preparación de membranas se realizó según el método de Lowry et al.

Los resultados del ensayo de S-MPEC y R-MPEC con el anterior procedimiento aparecen en la siguiente tabla:

TABLA 6

	S-MPEC	R-MPEC
IC_{50} (MM)	1,73	116

Los resultados anteriores demuestran que S-MPEC es 67 veces (116/1,73) tan potente como R-MPEC para bloquear los receptores 5-HT_{2} de prosencéfalo de rata.

Ejemplo de referencia 5

Efecto de la MPEC sobre la muerte tromboembólica pulmonar inducida por serotonina más colágeno en ratones Objetivo

La serotonina desempeña un papel importante en la formación de trombos. Se investiga la actividad antiserotonérgica de la MPEC mediante la inhibición de la muerte tromboembólica.

Animales

Ratones macho de raza ddY.

Fármaco de referencia

Ticlopidina, utilizada de forma clínica como antitrombótico.

Fármacos de ensayo

S-MPEC, R-MPEC

Método

Se utilizan los ratones después de una noche en ayunas. Se induce una tromboembolia pulmonar aguda mediante una inyección rápida de una mezcla de serotonina (50 \mug/10 g de peso corporal) y colágeno (10 \mug/10 g de peso corporal) en la cola y después se determina la mortalidad de los ratones a los 10 minutos. Se administran los fármacos por vía intrarrectal 1 hora, o por vía oral 3 horas antes de la inyección de serotonina y colágeno. Para la administración oral, el fármaco se suspende en Tween 80/H_{2}O destilada (al 0,5% volumen/volumen), y para la administración intrarrectal se dispersa en vaselina blanca.

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En este modelo de trombosis se seleccionó la dosis de cada estímulo que produce una mortalidad de 0-15% por cada estímulo individual, y aproximadamente una mortalidad de 80% por la combinación de ambos estímulos.

Los resultados se tabulan como sigue:

TABLA 7

	Dosis mg/kg	Vía	% de protección (%
			de ratones vivos)
Control			0
Ticlopidina	100	oral	78
S-MPEC	1	oral	40
S-MPEC	3	oral	50
S-MPEC	10	oral	80
S-MPEC	2,5	intrarrectal	60
S-MPEC	5	intrarrectal	90
S-MPEC	10	intrarrectal	90
R-MPEC	10	oral	25

Estos resultados sugieren que la MPEC puede absorberse a través del intestino y ejercer un efecto antitrombótico. Con una dosis oral de 10 mg por kg de peso corporal, la S-MPEC, con una protección de 80%, proporciona más del triple de la protección de 25% de la R-MPEC. La actividad antitrombótica expresada en este caso puede ser crucial para los efectos positivos de S-MPEC en la curación de heridas. Parte del problema de este trastorno es la liberación de serotonina que provoca dos efectos principales: 1) produce vasoconstricción (en un intento de reducir la pérdida de sangre) que antagoniza la S-MPEC, y 2) produce una trombosis (de nuevo para reducir la pérdida de sangre) que antagoniza la S-MPEC.

Una buena circulación es esencial para la curación de heridas.

Ejemplo de referencia 6

Efecto de la S-MPEC sobre la inhibición del flujo sanguíneo de la mucosa rectal provocado por la serotonina (5-HT) Método experimental

Se fijaron ratas macho de raza SD (388-588 g de peso corporal) en posición dorsal con anestesia de pentobarbital-Na (45 mg/kg, intraperitoneal). Después de exfoliar el tejido de la circunferencia rectal se sacó hacia el exterior la superficie de la mucosa y se fijó sobre el corcho con un alfiler. Se colocó una cánula en la vena femoral derecha, y se fijaron a la mucosa rectal la arteria carótida total para la administración de 5-HT y la hemodinamometría, respectivamente, y una sonda de caudalímetro de láser Doppler (PeriFlux, Suecia). Se administró la S-MPEC suspendida en Tween 80 al 0,5% en el recto después de comprobar que la presión sanguínea era estable. Se inyectaron 10 \mug/kg de 5-HT 15 minutos después de la administración de S-MPEC. Se midió el flujo sanguíneo de la mucosa 5 minutos y 1 minuto después de la inyección de 5-HT. Los resultados del ensayo se tabulan como sigue:

TABLA 8

	Solo 5-HT	5-HT+S-MPEC	% de
			antagonismo
Reducción en la presión sanguinea (mm Hg)	60	60	0
Reducción en el flujo sanguíneo de la mucosa	3,9	1,3	67
rectal - salida del caudalímetro (voltios)

Estos resultados demuestran que la S-MPEC antagoniza el efecto de 5-HT para disminuir el flujo sanguíneo de la mucosa rectal en ratas (receptor 5-HT_{2}), pero no antagoniza los efectos de disminución de la presión sanguínea de 5-HT sobre la presión sanguínea arterial (receptor 5-HT_{1}).

Los siguientes ejemplos ilustran formulaciones que contienen S-MPEC pura, opcionalmente mezclada con hasta aproximadamente 10%, preferiblemente por debajo de aproximadamente 4% de R-MPEC, adecuadas para tratar animales, en especial seres humanos, que necesitan un efecto de bloqueo del receptor 5-HT_{2}.

Ejemplo de referencia 7

Crema hemorroidal o tópica

La base de la crema contiene:

Vaselina blanca	71,0 g
Vaselina líquida	25,0 g
Cera de abejas blanca	3,0 g
Agua	1,0 g
Total	100,0 g

La base se prepara triturando todos los ingredientes juntos hasta la homogeneidad.

Crema activa:
S-MPEC	1,0 g
Crema base	99,0 g
Total	100,0 g

Estabilidad de MPEC en la crema base (crema activa)

Se estudió la estabilidad de la crema activa conservando muestras de la crema a temperatura ambiente (24-27ºC), 50ºC y 80ºC, y bajo luz fluorescente intensa durante 6 y 12 semanas, y ensayando el porcentaje de S-MPEC inicial que permanece después del tiempo de conservación indicado.

Los resultados aparecen en la siguiente tabla:

TABLA 9

Condición	Tiempo	Ensayo
	0	101,0
temperatura ambiente	12 semanas	100,0
		101,1
50ºC	6 semanas	100,3
		100,9
	12 semanas	99,9
		100,4
80ºC	6 semanas	99,9
		100,2
	12 semanas	100,3
		101,1

TABLA 9 (continuación)

luz fluorescente	6 semanas	98,0
		99,3
	12 semanas	97,8
		96,5

Ejemplo de referencia 8

Comprimido

Material	Cantidad
S-MPEC	50,0 g
Estearato de magnesio	1,3 g
Almidón de maíz	12,4 g
Almidón de maíz pregelatinizado	1,3 g
Lactosa	185,0 g

Los anteriores materiales se mezclan en un mezclador de doble revestimiento y después se granulan y se comprimen para formar comprimidos que pesan 250 mg cada uno. Cada comprimido contiene 50 miligramos del ingrediente activo. Se pueden hacer marcas en el comprimido para dividirlo en cuatro partes, de forma forma que puede obtenerse, de forma conveniente, una dosis de 12,5 mg del ingrediente activo.

Ejemplo de referencia 9

Cápsula

Materiales	Cantidad
S-MPEC	125 g
Lactosa	146,0 g
Estearato de magnesio	4,0 g

Los anteriores materiales se mezclan en un mezclador de doble revestimiento y se introducen después en cápsulas de gelatina dura nº1 de forma que cada cápsula contiene 12,5 mg de ingrediente activo.

Ejemplo de referencia 10

Disolución intravenosa

Se prepara una disolución estéril disolviendo 10,0 g de S-MPEC en una cantidad mínima de ácido clorhídrico 0,5 N. Esta disolución se ajusta a un pH de 4,3 con hidróxido de sodio 0,1 N y se diluye hasta un volumen total de 1.000 ml con disolución salina. La disolución se esteriliza haciéndola pasar a través de un filtro bacteriológico.

Esta invención se ha descrito con respecto a ciertas realizaciones preferidas, y se entiende que las modificaciones y variaciones de ésta, que son obvias para los expertos en la técnica, se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Un método para preparar S-2'-[2-(1-metil-2-piperidil)etil]cinnamanilida (S-MPEC) que comprende hacer reaccionar 2-nitrobenzaldehído y 2-picolina en presencia de anhídrido acético, en el que el 2-nitrobenzaldehído y la 2-picolina se encuentran en una proporción molar 1:1, para producir 2-(o-nitroestiril)piridina, tratar la 2-(o-nitroestiril)piridina con un agente metilante cuaternizante para producir la sal de 2-(o-nitroestiril)-1-metilpiridinio, reducir la sal de piridinio mediante hidrogenación catalítica para producir la sal hidrato de 2-(o-aminofenetil)-1-metilpiperidina (RS-APEMP), tratar la sal hidrato con un agente alcalino para liberar la base libre (RS-APEMP), tratar la base libre con ácido dibenzoil-L-tartárico para producir S-APEMP.DBLT, tratar S-APEMP.DBLT con un agente alcalino para producir S-APEMP, y hacer reaccionar S-APEMP con una cantidad equimolar de cloruro de cinnamoílo para producir S- MPEC.

2. S-[sal 2-(o-aminofenetil)-1-metilpiperidin-dibenzoil-L-tartrato] (S- APEMP.DBLT).

3. Un método para preparar S-[sal 2-(o-aminofenetil)-1-metilpiperidindibenzoil-L-tartrato] (S-APEMP.DBLT) que comprende hacer reaccionar 2-nitrobenzaldehído y la 2-picolina en presencia de anhídrido acético, en el que el 2-nitrobenzaldehído y 2-picolina se encuentran en una proporción molar 1:1, para producir 2-(o-nitroestiril)piridina, tratar la 2-(o-nitroestiril)piridina con un agente metilante cuaternizante para producir la sal de 2-(o-nitroestiril)-1-metilpiridinio, reducir la sal de piridinio mediante hidrogenación catalítica para producir la sal hidrato de 2-(o-aminofenetil)-1-metilpiperidina (RS-APEMP), tratar la sal hidrato con un agente alcalino para liberar la base libre (RS-APEMP), y tratar la base libre con ácido dibenzoil-L-tartárico para producir S-APEMP.DBLT.