DE69813149T2

DE69813149T2 - Verfahren und Zwischenprodukte zur Herstellung von Pyrrolo(3,2-b)pyridine

Info

Publication number: DE69813149T2
Application number: DE69813149T
Authority: DE
Inventors: Vincent Mancuso; Freddy Andre Napora; Uko Effiong Indianapolis Udodong; Daniel Edward Clinton Verral
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1997-11-14
Filing date: 1998-11-11
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2018-11-12
Also published as: AR013761A1; WO1999025708A1; NO20002407L; ES2196503T3; JP2001523677A; BR9814158A; NO20002407D0; ATE236903T1; DK0916669T3; HUP0100429A2; KR20010024610A; PT916669E; HUP0100429A3; ZA989389B; PL340421A1; HRP20000296A2; CN1278814A; TR200001329T2; NZ503616A; CA2309860A1

Description

Die Erfindung betrifft die Gebiete der pharmazeutischen Chemie und der synthetischen organischen Chemie und liefert Verfahren und Schlüsselzwischenprodukte zur Synthese von N-Propionyl-5-amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin, einem selektiven 5-HT_1F Agonisten.
Serotonin (5-HT) zeigt diverse physiologische Wirkungen, die durch mindestens sieben Rezeptorklassen vermttelt werden, wobei die heterogenste hiervon 5-HT₁ zu sein scheint. Ein humanes Gen, das einen dieser 5-HT₁ Subtypen exprimiert, nämlich 5-HT_1F, wurde von Kao und Mitarbeitern isoliert (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 408–412 (1993)). Dieser 5-HT1F Rezeptor zeigt ein pharmakologisches Profil, das sich von allen bisher beschriebenen serotonergen Rezeptoren unterscheidet.
Moskowitz hat vorgeschlagen, daß derzeit unbekannte Auslöser für Schmerz die trigeminalen Ganglien stimulieren, die die Gefäße innerhalb des cephalen Gewebes innervieren, was zu der Freisetzung von vasoaktiven Neuropeptiden aus den Axonen auf den Gefäßen führt. Die freigesetzten Neuropeptide aktivieren dann eine Reihe an Vorgängen, deren Folge der Schmerz ist. Diese neurogene Entzündung wird durch Sumatriptan und Ergotalkaloide durch Mechanismen gehemmt, die 5-HT Rezeptoren einbeziehen, welche nahe mit dem 5-HT_1D Subtyp verwandt sein dürften und auf den trigeminovaskulären Fasern liegen (Neurology, 43 (Supplement 3), S16–S20 1993)). Es wurde gezeigt, daß Agonisten des 5-HT_1F Rezeptors die Peptidextravasation aufgrund der Stimulierung der trigeminalen Ganglien hemmen (Audia und Nissen, US 5 521 196 A ).
Verbindungen, die eine Affinität für den 5-HT_1F Rezeptor zeigen, liefern einen neuen Ansatz zur Behandlung der Erkrankungen, die mit einer abnormalen serotonergen Neurotransmission verbunden sind. Ferner sind Verbindungen, die für den 5-HT_1F Rezeptorsubtyp selektiv sind, potentiell zur Behandlung solcher Erkrankungen brauchbar, wobei sie weniger unerwünschte Nebenwirkungen aufweisen. N-[Propionyl]-5-amio-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin ist ein selektiver 5-HT_1F Agonist, der durch die Acylierung von 5-Amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]piperidin hergestellt werden kann.
Die vorliegende Erifndung liefert ein Verfahren zur Herstellung von 5-Amino-3-(1-metlylpiperidin-4-yl)pyrrolo-[3,2-b]pyridin (A), gekennzeichnet durch folgende Schritte

i) Kondensation von 1-Hydroxy-5-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridin (F) mit 1-Methyl-4-piperidinon in Gegenwart einer Base unter Bildung von 1-Hydroxy-5-(dimethylaminomethylenimino)-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (J),
ii) wahlweise Entfernung der Schutzgruppen von (J) unter Bildung von 1-Hydroxy-5-amino-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)pyrrolo-[3,2-b]pyridin (N), und
iii) Hydrierung von entweder (J) oder (H).

Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung von 5-Amino-3-(1-methylpiperdin-4-yl)pyrrolo(3,2-b]pyridin (A), gekennzeichnet durch folgende Schritte:

i) Kondensation von 1-Hydroxy-5-animopyrrolo[3,2-b]pyridin (G) mit 1-Methyl-4-piperidinon in Gegenwart einer Base unter Bildung von 1-Hydroxy-5-amino-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetralydropyridin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (H), und
ii) Hydrierung von (H).

Die vorliegende Erfindung liefert zusätzlich ein Verfahren zur Herstellung von 5-Amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (A), gekennzeichnet durch folgende Schritte

i) Nitrierung von 6-Amino-2-picolin unter Bildung eines mononitrierten 6-Amino-2-picolins, das aus einem Gemisch aus 3-Nitro- und 5-Nitro-6-amino-2-picolin (B) besteht,
ii) wahlweise Trennung des Gemisches aus 3-Nitro- und 5-Nitro-6-aminopicolin (B) unter Bildung eines mononitrierten 6-Amino-2-picolns, das im wesentlichen aus reinem 3-Nitro-6-amino-2-picolin (C) besteht,
iii) Umsetzung eines mononitrierten 6-Amino-2-picolins, ausgewählt aus (B) oder (C) mit einem Dimethylaminoformylierungsmittel unter Bildung von 2-(2-Dimethylaminoethen-1-yl)-3-nitro-6-(dimethylaminomethylenimino)pyridin (E),
iv) Hydrierung von (E) in Gegenwart einer Säure unter Bildung von 1-Hydroxy-5-dimethylaminomethyleniminopyrrolo[3,2-b]pyridin (F),
v) Uhsetzung von (F) mit 1-Methyl-4-piperidinon in Gegenwart einer Base unter Bildung von 1-Hydroxy-5-(dimethylamnomethylenimino)-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (J),
vi) wahlweise Entfernung der Schutzgruppen von (J) unter Bildung von 1-Hydroxy-5-amino-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)pyrrolo-[3,2-b]pyridin (H), und
vii) Hydrierung von entweder (J) oder (H).

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Endung ist ein Verfahren zur Herstellung von N-[Propionyl]-5-amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin, das die Acylierung von 5-Amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (A) umfaßt, was durch eines der vorher beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.
Die vorliegende Endung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung von 1-Hydroxy-5-dimethylaminomethylenimnopyrrolo[3,2-b]pyridin (F), gekennzeichnet durch die folgenden Schritte

i) Nitrierung von 6-Amino-2-picolin unter Bildung von mononitriertem 6-Amino-2-picolin, das aus einem Gemisch aus 3-Nitro- und 5-Nitro-6-amino-2-picolin (B) besteht,
ii) wahlweise Trennung des Gemsches aus 3-Nitro- und 5-Nitro-6-aminopicolin (B) unter Bildung eines mononitrierten 6-Amino-2-picolins, das im wesentlichen aus reinem 3-Nitro-6-amino-2-picolin (C) besteht,
iii) Umsetzung eines mononitrierten 6-Amino-2-picolins, ausgewählt aus (B) oder (C) mit einem Dimethylaminomethylierungsmittel unter Bildung von 2-(2-Dimethylaminoethen-1-yl)-3-nitro-6-(dimethylaminomethylenimino)pyridin (E), und
iv) Hydrierung von (E) in Gegenwart einer Säure.

Ferner liefert die vorliegende Efindung 1-Hydroxypyrrolo[3,2-b]pyridine der Formel I
worin
X für Amino oder (CH₃)₂NCH=N- steht, und
R für Wasserstoff oder 1-Methyl-1,2,3,4-tetrahydropyridin-4-yl steht und Säureadditionssalze hiervon.
Das Zwischenprodukt 1-Hydroxy-5-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridin (F) wird ausgehend von 6-Amino-2-picolin (6-Amino-2-methylpyridin) durch das in Syntheseschema I gezeigte Verfahren hergestellt.
Syntheseschema I
Herstellung von mononitriertem 6-Amino-2-picolin
Die Nitrierung von 6-Amino-2-picolin (6-Amino-2-methylpyridin) kann durch Standardnitrierungsverfahren ausgeführt werden (Parker und Shive, Journal of the American Chemical Society, 69, 63–67 (1947)). Vorzugsweise wird etwa 1 Äquivalent an konzentrierter Salpetersäure in etwa einem gleichen Volumen konzentrierter Schwefelsäure zu einer Lösung aus 6-Amino-2-picolin in etwa 2,5 bis etwa 10 Volumina konzentrierter Schwefelsäure relativ zum Volumen der Salpetersäurelösung gegeben. Es ist besonders bevorzugt, daß das 6-Amino-2-picolin in etwa 5 Volumina konzentrierter Schwefelsäure relativ zum Volumen der Salpetersäurelösung gelöst wird.
Die Temperatur der Lösung des 6-Amino-2-picolins beträgt vor der Zugabe der Salpetersäurelösung etwa –15°C bis etwa –5°C. Bevorzugt beträgt die Temperatur dieser Lösung vor der Zugabe der Salpetersäurelösung etwa –15°C bis –10°C. Es ist speziell bevorzugt, daß die Temperatur dieser Lösung etwa –15°C beträgt. Die Salpetersäurelösung wird in einer Geschwindigkeit zugegeben, so daß die Temperatur des Reaktionsgemisches zwischen etwa - 15°C bis etwa 160°C gehalten wird. Vorzugsweise wird die Temperatur des Reaktionsgemisches von etwa –15°C bis etwa Umgebungstemperatur während der Zugabe der Salpetersäurelösung gehalten. Es ist bevorzugter, daß die Temperatur des Reaktionsgemiscles zwischen etwa –15°C und etwa 0°C während der Zugabe der Salpetersäurelösung gehalten. Es ist speziell bevorzugt, daß die Temperatur des Reaktionsgemisches zwischen etwa –1°C und etwa –2°C wähend der Zugabe der Salpetersäurelösung gehalten wird. Es ist auch bevorzugt, daß die Salpetersäurelösung vor der Zugabe zur Lösung des 6-Amino-2-picolins auf etwa 0°C vorgekühlt wird.
Wenn die Zugabe der Salpetersäurelösung vollständig ist, kann sich das Reaktionsgemisch graduell auf Raumtemperatur erwärmen, typischerweise über etwa 2 Stunden, und wird dann für etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es ist bevorzugt, daß der Erwärmungsprozeß abgestuft ist, wobei die Temperatur des Reaktionsge misches etwa –1°C bis 0°C für etwa 1 Stunde beträgt, nachdem die Zugabe vollständig ist, wobei dann das Reaktionsgemisch über etwa 1 Stunde auf etwa 10°C gelalten wird, dann die Temperatur des Reaktionsgemisches für etwa 1 Stunde aus etwa 10°C gehalten wird, wobei das Reaktionsgemisch sich dann über eine Stunde aus etwa 20°C erwärmen kann und die Temperatur des Reaktionsgemisches für etwa 1 Stunde aus 20°C gehalten wird.
Wenn die Reaktion vollstädig ist, wird der pH des Reaktionsgemisches durch die Zugabe von Base aus mindestens 9 eingestellt. Vorzugsweise wird das Reaktionsgemisch aus einen pH von etwa 9 eingestellt. Die Base kann jede wasserlösliche Base sein, die zur Neutralisierung der Säure und zur Einstellung des pH des Reaktionsgemisches aus den erforderlichen Bereich fähig ist. Typischerweise ist die Base eine Hydroxidbase, wie Lithium-, Kalium-, Natrium- oder Aminoniumhydroxid. Vorzugsweise ist die Base Aminoniumhydroxid. Das Produkt (B) wird typischerweise durch Standardtechniken isoliert, vorzugsweise durch Filtration.
Der Nitrierungsschritt liefert ein Gemisch, typischerweise im Bereich von etwa 2 : 1 3-Nitro-G-amino-2-picolin : 5-Nitro-6-amino-2-picolin. Diese Isomere können erforderlichenfalls unter Bildung des im wesentlichen reinen 3-Nitro-G-amino-2-picolins (C) vor dessen Einsatz in anschließenden Reaktionen getrennt werden.
Der Ausdruck "mononitriertes G-Amino-2-picolin", wie dies in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, soll ein Gemisch aus 3-Nitro-G-amino-2-picolin und 5-Nitro-G-amino-2-picolin oder im wesentlichen reines 3-Nitro-6-amino-2-picolin bezeichnen.
Der Ausdruck "im wesentlichen reines 3-Nitro-6-amino-2-picolin", wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, soll 3-Nitro-6-amino-2-picolin bezeichnen, das etwa 0% bis etwa 2% 5-Nitro-6-amino-2-picolin enthält.
Im wesentlichen reines 3-Nitro-G-amino-2-picolin kann aus dein Gemisch der Nitrierungsprodukte durch Dampfdestillation isoliert werden, wie dies von Parker und Shive, siehe obige Literaturstelle, beschrieben ist. Alternativ dazu kann das 3-Nitroisomer durch Sublimation isoliert werden. Vorzugsweise kann im wesentlichen reines 3-Nitro-G-amino-2-picolin aus dem Gemisch aus mononitrierten Isomeren durch Umkristallisation aus einem geeigneten Lösemittel isoliert werden. Geeignete Lösemittel zur Umkristallisation umfassen Methanol und Toluol. Das bevorzugte Umkristallisationslösemittel ist Toluol.
Herstellung von 2-(2-Dimethylaminoethylen-1-yl)-3-nitro-6-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridin (E)
Mononitriertes 6-Amino-2-picolin wird mit einem Dimethylaminoformylierungsmittel, typischerweise Dimethylformamiddimethylacetal oder Tris(dimethylamino)methan in einem geeigneten Lösemittel umgesetzt, typischerweise Dimethylformamid. Das Reaktionsgemisch wird etwa aus dessen Rückflußtemperatur für etwa 2 Tage erhitzt, wonach das Reaktionsgemisch auf Umgebungstemperatur abgekühlt wird.
Wenn das mononitrierte 6-Amino-2-picolin im wesentlichen reines 3-Nitro-G-amino-2-picolin (C) ist, kann das Produkt durch eine Verdampfung des Dimethylformamids gefolgt von mehrfachen Co-Verdampfungszyklen mit Toluol isoliert werden. Vorzugsweise wird das Produkt aus dem Reaktionsgemisch durch die Zugabe von etwa 2 Volumina Isopropanol gefällt, nachdem das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt wurde.
Wenn das mononitrierte 6-Amino-2-picolin ein Gemisch aus 3-Nitro- und 5-Nitro-G-amino-2-picolin (B) ist, wird das gekühlte Gemisch in etwa 20 Volumina Wasser bei etwa 10°C unter starkem Rühren gegossen. Nach dem Rühren für mindestens 10 Minuten wird das Reaktionsgemisch unter Bildung von 2-(2-Dimethylaminoethylen-1-yl)-3-nitro-6-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridin (E) filtriert.
Es ist bevorzugt, daß das mononitrierte 6-Amino-2-picolin, das im Dimethylaminoformylierungsschritt verwendet wird, im wesentlichen reines 3-Nitro-6-amino-2-picolin (C) ist.
Hydrierung
Das 2-(2-Dimethylaminoethylen-1-yl)-3-nitro-6-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridin (E) wird über einen Edelmetallkatalysator in Gegenwart einer Säure unter Bildung von 1-Hydroxy-5-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridin (F) hydriert. Das Substrat (E) wird in einem geeigneten Lösemitel gelöst, das einen Edelmetallkatalysator enthält. Geeignete Lösemittel umfassen die Niederalkanole, wie Methanol, Ethanol, Propanol und Isopropanol und Gemische hiervon. Bevorzugte Lösemitel umfassen Methanol, Ethanol und Gemische hiervon. Methanol und Gemische aus Methanol und Ethanol sind besonders bevorzugte Lösemittel.
Der Fachmann erkennt, daß mehrere herkömmlich verwendete Edelmetallkatalysatoren bei der Hydrierung des Substrats (E) wirksam sind. Geeignete Katalysatoren umassen Platin und Palladium. Der bevorzugte Katalysator ist Palladium. Wenn der Edehnetallkatalysator Palladium ist, ist es bevorzugt, daß der Edelmetallkatalysator auf Kohle geträgert ist. Typischerweise enthält der auf Kohle geträgerte Katalysator etwa 5 bis etwa 10% Palladium. Es ist speziell bevorzugt, daß der Edelmetallkatalysator 10% Palladium auf Kohle ist.
Wenn das Substrat im Lösenitel gelöst wurde, wird das Reaktionsgemisch mit etwa 2 bis etwa 10 Äguivalenten Säure behandelt. Jede Säure, die zur ausreichenden Protonierung des Substrats ohne Wechselwirkung mit der Produktbildung fähig ist, ist für das erfindungsgemäße Verfahren brauchbar. Brauchbare Säuren umfassen unter anderem Trifluoressigsäure, Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure, Chlorwasserstoff, Bromwasserstoff und dergleichen. Es ist bevorzugt, daß die Säure Chlorwasserstoff ist. Es ist auch bevorzugt, daß etwa 5 bis etwa 10 Äquivalente an Säure zum Reaktionsgemisch gegeben werden. Es ist besonders bevorzugt, daß etwa 9 bis etwa 10 Äquivalente an Säure zum Reaktionsgemisch gegeben werden.
Das Reaktionsgemisch wird dann bei einem anfänglichen Druck von etwa 10 bis etwa 50 psi bei einer anfänglichen Temperatur von etwa Umgebungstemperatur hydriert, typischerweise bei etwa 20°C. Es ist bevorzugt, daß der anfängliche Wasserstoffdruck etwa 30 psi beträgt. Die Reaktion ist exotherm und kann von der anfänglichen Temperatur von etwa 20°C bis etwa 40°C reichen. Es ist bevorzugt, daß die Temperatur im Bereich von etwa 20°C bis etwa 27°C gehalten wird.
Nachdem die Hydrierung vollständig ist, wird das Reaktionsgemisch mit Ethanol verdünnt und das feste Produkt wird unter Standardbedingungen, wie Filtration oder Zentrifugation isoliert. Das Produkt kann von einem unlöslichen Katalysator durch Umkristallisation aus einem geeigneten Lösemittel abgetrennt werden, vorzugsweise Methanol. Das Produkt kann weiter durch Rühren in einem Gemisch aus Methanol und Ethanol in Gegenwart einer Säure für etwa 4 Stunden bei etwa Umgebungstemperatur gereinigt werden. Das 1-Hydroxy-5-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridin (F) wird durch Standardtechniken isoliert, vorzugsweise durch Filtration oder Zentrifugation.
Die Herstellung von 5-Amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (A), die von 1-Hydroxy-5-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridin (F) ausgeht, ist im Syntheseschema II gezeigt.
Syntheseschema II
Eine Lösung aus 1-Hydroxy-5-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridin (F) und 1-Methyl-4-piperidinon wird in einem geeigneten Lösemittel mit einer geeigneten Base unter Bildung von 1-Hydroxy-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)-5-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridin (J) behandelt. Geeignete Lösemittel umfassen die Niederalkanole wie Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol und Gemische hiervon. Bevorzugte Lösemittel umfassen Methanol, Ethanol und Gemische hiervon. Ethanol ist ein besonders bevorzugtes Lösemittel.
Zumindest etwa 1 bis etwa 5 Äquivalente an 1-Melhyl-4-piperidinon werden zum Reaktionsgemisch gegeben. Vorzugsweise werden etwa 2 bis etwa 3 Äquivalente zugegeben. Es ist besonders bevorzugt, daß etwa 3 Äquivalente an 1-Methyl-4-piperidinon zum Reaktionsgemisch gegeben werden.
Geeignete Basen sind alle Basen, die zur Erleichterung der Reaktion ohne Wechselwirkung mit der Bildung des Produkts fähig sind. Geeignete Basen umfassen Hydroxide und Amine von Lithium-, Kalium- oder Natrium. Es ist bevorzugt, daß wenn die Base ein Amin ist, diese ein sekundäres Dialkylamin oder ein sekundäres cyclisches Amin ist. Sekundäre Dialkylamine umfassen Dimethylamin, Diethylamin, Methylethylamin und dergleichen. Cyclische sekundäre Amine umfassen Pyrrolidin, Piperidin, Piperazin, Morpholin und dergleichen. Eine bevorzugte Base ist ein sekundäres Amin und Dimethylamin ist besonders bevorzugt.
Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur gerührt, bis die Reaktion vollständig ist. Nachdem die Reaktion vollständig ist, wird das Produkt durch Standardverfahren isoliert, vorzugsweise durch Filtration oder Zentrifugation.
Die Umwandlung von 1-Hydroxy-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)-5-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridin (J) zu 5-Amino-3-(piperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (A) wird durch Hydrierung in Gegenwart eines Edehnetallkatalysators ausgeführt. Das Substrat (J) wird in einem geeigneten Lösemttel gelöst, das den Edelmetallkatalysator enthält. Geeignete Lösemittel umfassen die Niederalkanole, wie Methanol, Ethanol, Propanol und Isopropanol. Das bevorzugte Lösemittel ist Methanol. Edehnetallkatalysatoren sind die oben beschriebenen, wobei 10% Palladium auf Kohle bevorzugt ist. Das Reaktionsgemisch wird bei einem anfänglichen Druck von etwa 10 bis etwa 50 psi hydriert. Vorzugsweise beträgt der anfägliche Druck etwa 30 bis etwa 50 psi. Das Reaktionsgemisch wird bei etwa Umgebungstemperatur hydriert. Das Produkt wird durch Standardisolierungstechniken isoliert.
Der Fachmann erkennt, daß alternative Verfahren zur Herstellung von 5-Amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (A) durch wahlweise Modifizierung des 5-Dimethylaminomethyleniminorests der Verbindungen (F) oder (J) unter Bildung der entsprechenden 5-Aminoverbindungen (G) oder (H) erforderlichenfalls vor anschließenden Reaktionen verfügbar sind. Die Verbindung (F) kann einem Niederalkanol am Rückfluß, vorzugsweise Methanol oder Ethanol, unter Bildung von 1-Hydroxy-5-aminopyrrolo[3,2-b]pyridin (G) unterzogen werden. Die Verbindung (H), nämlich 1-Hydroxy-3-(1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)-5-aminopyrrolo[3,2-b]pyridin kann entweder durch Umsetzung von (G) mit 1-Methyl-4-piperidinon unter den vorher beschriebenen Bedingungen hergestellt werden, oder indem man (J) sauren Hydrolysebedingungen unterzieht. Die Verbindung (H) wird dann durch die Hydrierung in Wasser unter den oben beschriebenen Bedingungen in (A) umgewandelt. Es ist bevorzugt, daß der 5-Dimethylaminomethyleniminorest der Verbindungen (F) oder (J) in den entsprechenden Aminorest vor der Hydrierung umgewandelt werden kann, um 5-Amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (A) zu erhalten.
Die 1-Hydroxypyrrolo[3,2-b]pyridine (F), (G), (H) und (J) werden durch die Formel I umaßt:
worin
X für Amino oder (CH₃)₂NCH=N- steht, und
R für Wasserstoff oder 1-Methyl-1,2,3,4-tetrahydropyridin-4-yl steht und Säureadditionssalze hiervon. Die Verbindungen der Formel I sind neu und stellen eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
Der 5-HT_1F Agonist N-[Propionyl]-5-amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin wird durch Umsetzung des 5-Aminopyrrolo[3,2-b]pyridins (A) mit einem geeigneten Propionylchlorid, -bromid, -iodid oder - anhydrid walilweise in Gegenwart eines Acylierungskatalysators hergestellt, wie Dimethylaminopyridin in Gegenwart einer geeigneten Base. Geeignete Basen umfassen Amine, die typischerweise als Säurefänger verwendet werden, wie Pyridin oder Triethylamin oder im Handel erhältliche polymergebundene Basen, wie Polyvinylpyridin. Alternativ dazu kann die Umsetzung in Pyridin ausgeführt werden, das als Lösemittel und Base dient. Typischerweise kann das Produkt durch Waschen des Reaktionsgemisches mit Wasser und einer Konzentrierung der verbleibenden organischen Bestandteile unter verringertem Druck isoliert werden. Wenn ein Überschuß eines Acylierungsmittels verwendet wurde kann jedoch ein polymergebundenes primäres oder sekundäres Amin, wie ein aminomethyliertes Polystyrol, bequemerweise zugegeben werden, um mit dem überschüssigen Reagenz zu reagieren. Die Isolierung der Produkte aus Reaktionen, worin ein polymergebundenes Reagenz verwendet wurde, wird stark vereinfacht und erfordert nur die Filtration des Reaktionsgemisches und die anschließende Konzentrierung des Filtrats unter verringertem Druck. Das Produkt aus diesen Reaktionen kann erforderlichenfalls chromatographisch gereinigt oder aus einem geeigneten Lösemittel umkristallisiert werden. Unter bestimmten Bedingungen kann eine Diacylierung des 5-Aminorests auftreten. Wenn man das diacylierte Produkt entweder basischen oder sauren Hydrolysebedingungen bei Raumtemperatur unterzieht, erhält man N-[Propionyl]-5 amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin.
Das 5-Aminopyrrolo[3,2-b]pyridin (A) kann auch mit Propansäure in Gegenwart von typischen Peptidkupplungsreagenzien umgesetzt werden, wie N,N'-Carbonyldiimidazol (CDI), N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC). Eine polymergeträgerte Form von EDC wurde beschrieben (Tetrahedron Letters, 34 (48), 7685 (1993)) und ist zur Herstellung von N-[Propionyl]-5-amino-3-(piperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]piperidin sehr brauchbar, das wie vorher beschrieben isoliert und gereinigt wird.
Beispiel 1
Mononitriertes 6-Amino-2-picolin
Es werden 110 g (1,02 mol) geschmolzenes 6-Amino-2-picolin derartig tropfenweise zu 500 ml konzentrierter Schwefelsäure gegeben, die auf –15°C vorgekühlt wurde, daß die Temperatur der Schwefelsäurelösung unter 20°C gehalten wird. Die Lösung wird dann auf etwa –6°C gekühlt und dann wird eine Lösung aus 49 ml an 90% Salpetersäure (1,16 mol) in 49 ml Schwefelsäure, die auf 0°C vorgekühlt wurde, tropfenweise über 30 Minuten zugegeben, wobei die Temperatur auf etwa 0°C gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird bei etwa 0°C für eine Stunde gerührt und kann sich dann auf etwa 10°C für eine Stunde erwärmen. Die Temperatur des Reaktionsgetnisches wird auf etwa 10°C für eine Stunde gehalten und kann sich dann auf etwa 20°C für eine Stunde erwärmen. Das Reaktionsgemisch wird bei etwa 20°C für 2 Stunden gehalten. Das Reaktionsgemisch wird unter kräftigem Rühren in 8 l Eis gegossen. Das Reaktionsgemisch wird dann auf pH ~9 durch die Zugabe von 1,5 lkonzentriertem Ammoniumhydroxid eingestellt, wobei die Temperatur des Reaktionsgemisches bei etwa 24°C durch die Zugabe von Eis gehalten wird, wenn dies benötigt wird. Die entstehende Aufschlämmung wird filtriert und der Feststoff wird mehrere Male mit Wasser gewaschen. Der Feststoff wird bei 70°C unter Vakuum für 3 Tage unter Bildung von 135,5 g (87%) eines 2 : 1 Gemisches an 3-Nitro- : 5-Nitro-6-amino-2-picolin (B), getrocknet.
Sublimierung
Es werden 20 g Ansätze des Nitrierungsgemisches zweimal unter Vakuum bei 125°C für jeweils 6 Stunden sublimiert. Das 5-Nitroisomer wird als ein hellgelbes Pulver sublimiert und verworfen. Das 3-Nitroisomer, das am Boden des Sublimierungsapparates verbleibt, wird gesammelt. Eine Gesamtmenge von 121 g wird unter Bildung von 60,9 g (75,5%) des rohen 3-Nitroisomers sublimert. Es werden 58 g des rohen 3-Nitroisomers in 200 ml heißem 95 : 5 Ethanol : Wasser aufgeschlämmt. Das Gemisch wird auf Raumtemperatur gekühlt und mit 200 ml Wasser verdünnt. Nach zwei Stunden wird der Niederschlag durch Filtration gesammelt und mehrmals mit Wasser gewaschen. Der Feststoff wird unter Vakuum bei Raumtemperatur unter Bildung von 38 g (65% basierend auf 58 g Rohprodukt) an 3-Nitro-6-amino-2-picolin (C) getrocknet.
MS (m/e): 153 (M⁺)
Berechnet für C₆H₇N₃O₂: Theorie: C 47,05, H 4,61, N 27,44. Gefunden: C 47,08, H 4,53, N 27,53.
Umkristallisation
Alternativ dazu wird ein Gemisch aus 20 g des Nitrierungsgemisches und, 800 ml Toluol bei Rückfluß für 15 Minuten erhitzt. Das Gemisch wird bei 95°C filtriert und die Mutterlauge kann sich auf Raumtemperatur abkühlen. Nach 4 Stunden wird der kristalline Feststoff gesammelt, mit 100 ml Toluol gewaschen und unter verringertem Druck bei 50°C für 16 Stunden unter Bildung von 13,7 g (68%) des im wesentlichen reinen 3-Nitro-6-amino-2-picolins (C) getrocknet.
Smp. = 190,4°C.
Beispiel 2
2-(2-Dimethylaminoethen-1-yl)-3-nitro-6-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridin (E)
Ein Gemisch aus 60 g (0,39 mol) an 3-Nitro-6-amino-2-picolin (C) in 260 ml Dimethylformamid wird mit 260 ml (1,83 mol) an 94% Dimethylformamiddimethylacetal behandelt und die Lösung wird für 48 Stunden am Rückfluß erhitzt. Die Reaktion wird unter verringertem Druck konzentriert und der übrige Feststoff wird mit Toluol aufgeschlämmt. Das Toluol wird unter verringertem Druck eingedampft. Dieses Verfahren wird 5 mal wiederholt. Der schließliche Rückstand wird mit 300 ml Methyl-tert-butylether aufgeschlämmt und dann filtriert. Dieser Feststoff wird 3 ml mit 300 ml Methyl-tert-butylether gewaschen und der schwarze Feststoff wird schließlich unter verringertem Druck unter Bildung von 90,6 g (88%) der gewünschten Verbindung getrocknet.
MS (m/e): 263,1 (M⁺)
Berechnet für C₁₂H₁₇N₅O₂: Theorie: C 54,74, H 6,51, N 26,60. Gefunden: C 54,84, H 6,49, N 26,79.
Isolierung durch Kristallisation
Eine Lösung aus 38,8 g (0,25 mol) an 3-Nitro-6-amino-2-picolin (C) in 172 ml Dimethylformamid wird mit 172 ml Dimethylformamiddimethylacetal behandelt und das Gemisch wird bei etwa 97°C für 42 Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird dann auf Raumtemperatur gekühlt und mit 650 ml Isopropanol verdünnt. Das Reaktionsgemisch kann für 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen und wird dann auf 3–5°C unter Rühren für weitere 2 Stunden gekühlt. Die Aufschlämmung wird filtriert, der Feststoff wird mit 2 × 75 ml Isopropanol gewaschen und unter verringertem Druck bei 45°C für 16 Stunden unter Bildung von 58,9 g (88%) der Titelverbindung getrocknet.
Beispiel 3
Alternative Synthese von 2-(2-Dimethylaminoethen-1-yl)-3-nitro-6-(dimethylaminoethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridin (E)
Ein Gemisch aus 133 g (0,86 mol) an mononitriertem 6-Amino-2-picolin (B) in 500 ml Dimethylfonnamid wird mit 500 ml(3,5 mol) an 94% Dimethylformamiddimethylacetal behandelt und für 40 Stunden am Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch in zwei Hälften aufgeteilt und jede Hälfte wird in 10 1 Wasser bei 0°C unter kräftigem Rühren gegossen. Nach 10 Minuten wird das Gemisch filtriert und der Feststoff wird aufgeschlämmt/gewaschen mit 3 × 1 l Wasser. Der Feststoff wird unter Vakuum bei 65°C für 2,5 Tage unter Bildung von 183 g (81%) der Titelverbindung als roter Feststoff, getrocknet.
Beispiel 4
1-Hydroxy-5-(dimetylaminomethylimino)pyrrolo-[3,2-b]pyridindihydrochlorid (F)
Ein Gemisch aus 23,4 g (89 mol) an 2-(2-Dimethylaminoethen-2-yl)-3-nitro-5-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]-pyridin (E) und 0,7 g an 10% Palladium auf Kohle in 234 ml wasserfreiem Methanol wird mit 140 ml an 5,9 N ethanolischem Chlorwasserstoff behandelt. Das entstehende Gemisch wird für 1,5 Stunden unter anfänglichem Wasserstoffdruck von 30 psi hydriert. Die Reaktion wird exotherm, wobei eine Temperatur von 42°C erreicht wird. Das Reaktionsgemisch wird mit 585 ml Ethanol verdünnt und wird bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Der Niederschlag wird filtriert und mit 50 ml Ethanol gewaschen. Der Feststoff wird in 1,1 l Methanol aufgenommen, filtriert und dann unter verringertem Druck konzentriert. Der übrige Feststoff wird unter verringertem Druck unter Bildung von 20,5 g (83%) der gewünschten Verbindung (enthält 5% an 5-(Dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridin) als gelber Feststoff getrocknet.
Eine Menge von 3,6 g der gewünschten Verbindung wird in 36 ml Methanol suspendiert, gefolgt von der anschließenden Zugabe von 90 ml wasserfreiem Ethanol und 10,8 ml in 5,9 N Chlorwasserstoff in Ethanol. Das Gemisch wird für 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und wird dann filtriert und der Feststoff wird mit 2 × 5 ml Ethanol gewaschen. Der entstehende gelbe Feststoff wird unter verringertem Druck bei 45°C unter Bildung von 3,39 g (94,2%) der Titelverbindung (enthält 3% an 5-(Dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridin) getrocknet.
Smp. = 213-214°C
MS (m/e) = 205 (M + 1)
Beispiel 5
Alternatives Verfahren zur Herstellung von 1-Hydroxy-5-(dimethylaminomethylimino)pyrrolo[3,2-b]pyridindihydrochlorid (F)
Ausgehend von 1,0 g (3,8 mmol) an 2-(2-Dimethylaminoethen-2-yl)-3-nitro-5-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]-pyridin (E) werden die Reaktionsbedingungen von Beispiel 4 dupliziert, mit der Ausnahme, daß die Reaktionstemperatur derartig kontrolliert wird, daß sie nicht über 27°C steigt. Es werden 0,95 g (90%) der Titelverbindung gewonnen.
Beispiel 6
1-Hydroxy-5-aminopyrrolo[3,2-b]pyridinhydrochlorid (G)
Ein Gemisch aus 0,06 g an 10% Palladium auf Kohle, 2 g (0,76 mmol) an 1-Hydroxy-5-(dimethylaminomethylimino)pyrrolo[3,2-b]-pyridin (F)dihydrochlorid und 7,5 ml an 9,1 N ethanolischem Chlorwasserstoff in 40 ml Methanol wird für 1,5 Stunden einer katalytischen Hydrierung bei einem anfänglichen Wasserstoffdruck von 10 psi unterzogen. Nachdem die Hydrierung vollständig ist, wird das Reaktionsgemisch für 3 Stunden auf 70°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert. Der übrige Feststoff wird mit Methanol gewaschen und das Filtrat wird unter verringertem Druck konzentriert. Der übrige Feststoff wird unter Vakuum bei 50°C für 6 Stunden unter Bildung von 2,64 g (80%) der Titelverbindung als hellbrauner Feststoff getrocknet. Eine analytische Probe wird aus ethanolischem Chlorwasserstoff umkristallisiert.
Smp. = 227–228°C.
MS (m/e) = 150 (M + 1)
Berechnet für C₇H₇N₃₀ – HCl: Theorie: C 45,40, H 4,32, N 22,70, O 8,65, Cl 19,10. Gefunden: C 45,49, H 4,26, N 22,63, O 8,47, Cl 18,90.
Beispel 7
1-Hydroxy-5-amino-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (H)
Zu einer Lösung aus 31,4 g (169 mmol) 1-Hydroxy-5-aminopyrrolo[3,2-b]pyridinhydrochlorid (G) in 1,33 1 Wasser werden 100 g Kaliumcarbonat in Teilen zugegeben, wobei die Temperatur des Reaktionsgemisches unter 25°C mit einem Eisbad gehalten wird. Zu dieser Lösung werden dann 150 ml an N-methyl-2-piperidinon gegeben und das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 6 Stunden kräftig gerührt. Das Reaktionsgemisch wird dann filtriert und der Filterkuchen wird zweimal mit 100 ml Wasser gewaschen. Der Feststoff wird unter Vakuum bei 50°C für 90 Stunden unter Bildung von 20,8 g (63%) der Titelverbindung als gelber Feststoff getrocknet. Das Dihydrochloridsalz wird für die Analyse gebildet.
Smp. = 282–283°C (Zersetzung)
MS (m/e) = 245 (M + 1)
Berechnet für C₁₃H₁₆N₄O – 2 HCl: Theorie: C 49,37, H 5,70, N 17,72, O 5,06, Cl 22,35, Gefunden: C 49,27, H 5,71, N 17,39, O 5,38, Cl 21,70.
Beispiel 8
1-Hydroxy-5-(dimethylaminomethylenimino)-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (n
Ein Gemisch aus 13,5 g (48,7 mmol) 1-Hydroxy-5-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridindihydrochlorid (F) und 17,5 g (155 mmol) 1-Methyl-4-piperidon in 270 ml wasserfreiem Ethanol wird bis zw Homogenität gerührt. Dann werden 19,4 ml (109 mmol) an 5,6 N Dimethylamin in Ethanol zugegeben und das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt. Der gelbe Niederschlag wird filtriert, mit 2 × 27 ml Ethanol gewaschen und unetr verringertem Druck bei 45°C unter Bildung von 13,4 g (92%) der gewünschten Verbindung als gelber Feststoff getrocknet.
Smp. = 212–213°C
MS(m/e) = 300 (M + 1).
Beispiel 9
Ein Gemisch aus 0,28 g (0,94 mmol) an 1-Hydroxy-5-(dimethylaminomethylenimino)-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (J) und 0,10 g an 10% Palladium auf Kohle in 20 ml Methanol wird für etwa 18 Stunden unter einem anfänglichen Wasserstoffdruck von 50 psi hydriert. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und das Filtrat wird unter verringertem Druck unter Bildung von 0,21 g (96%) der Titelverbindung konzentriert.
Beispiel 10
Alternative Synthese von 1-hydroxy-5-amino-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridindihydrochlorid (H)
Eine Suspension aus 0,85 g (2,8 mmol) 1-Hydroxy-5-(dimethylaminomethylenimino)-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (J) in 18 ml Ethanol, worin 1,2 ml (14,5 mmol) konzentrierte Chlorwasserstoffsäure enthalten sind, wird für 7 Stunden auf Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch kann sich auf Raumtemperatur abkühlen und wird dann für etwa 18 Stunden gerührt. Die Suspension wird filtriert, der Feststoff wird mit 2 × 1,8 ml wasserfreiem Ethanol gewaschen und dann unter verringertem Druck bei 45°C unter Bildung von 0,84 g (93%) der Titelverbindung getrocknet.
Beispiel 11
Alternative Synthese von 5-Amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (A)
Eine Suspension aus 1 g (3,15 mmol) an 1-Hydroxy-5-amino-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridindihydrochlorid (H) und 0,20 g an 10% Palladium auf Kolhe in 10 ml entmineralisiertem Wasser wird bei Umgebungstemperatur mit einem anfänglichen Wasserstoffdruck von 45 psi hydriert. Nach vier Stunden wird das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat wird mit 6 ml an 2 N wäßrigem Natriumhydroxid behandelt. Nach der Zugabe von 0,2 ml Tetrahydrofuran wird das Reaktionsgemisch für 3 Stunden gerührt und der entstehende Niederschlag wird durch Filtration gesammelt. Der Feststoff wird unter verringertem Druck bei 50°C unter Bildung von 0,59 g (94%) der Titelverbindung getrocknet.
Beispiel 12
N-[Propionyl]-5-amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]piperidin
Eine Suspension aus 0,5 g (2,17 mmol) an 5-Amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (A) und 0,30 g (2,27 mmol) Propionsäureanhydrid in 3,5 ml Tetrahydrofuran wird bei Umgebungstemperatur für etwa 18 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wird dann mit entmineralisiertem Wasser verdünnt und die Lösung wird unter verringertem Druck unter Bildung des wäßrigen Rückstands mit einem Gewicht von 7,5 g konzentriert. Zu dieser gelben Lösung werden nacheinander 1,4 ml an 2 N wäßrigem Natriumhydroxid und 1 ml Tetrahydrofuran gegeben. Das Gemisch wird für 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und die entstehende Suspension wird filtriert. Der Feststoff wird mit 4 ml Wasser gewaschen und unter verringertem Druck bei 55°C unter Bildung von 0,59 g (94%) der Titelverbindung getrocknet.
Die Fähigkeit von n-[Propionyl]-5-amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin zur Bindung an den 5-HT_1F Rezeptorsubtyp wird im wesentlichen gemessen, wie dies in US 5 521 196 A beschrieben ist.
Membranpräparation
Es werden Membranen aus transfizierten Ltk^– Zellen präpariert, die bis zu 100% Konfluenz angezogen werden. Diese Zellen werden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, in 5 ml eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung aus den Kulturschalen geschabt und bei 200 × g für etwa 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wird in 2,5 ml eiskaltem Tris Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 bei 23°C, 5 mM EDTA) resuspendiert und mit einem Wheaton Gewebezerkleinerer homogenisiert. Das Lysat wird anschließend bei 200 × g für fünf Minuten bei 4°C zentrifugiert, um die großen Fragmente zu pelletieren, die verworfen werden. Der Überstand wird dann bei 40 000 × g für etwa 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das aus dieser Zentrifugation resultierende Pellet wird einmal in eiskaltem Tris-Waschpuffer gewaschen und schließlich in einem Puffer resuspendiert, der 50 mM Tris-HCl und 0,5 mM EDTA enthält und pH = 7,4 bei 23°C aufweist. Die Membranpräparationen werden auf Eis gehalten und innerhalb von zwei Stunden für die radioaktiv markierten Bindungstests verwendet. Die Proteinkonzentrationen werden durch das Verfahren von Bradford (Anal. Biochem., 72, 248–254 (1976)) bestimmt.
Bindung radioaktiv markierter Liganden
Die [³H-5-HT] Bindung wird mittels leichter Modifikationen der 5-HT_1D Testbedingungen, die von Herrick-Davis und Titeler (J. Neurochem., 50, 1624–1631 (1988)) beschrieben wurden, unter Weglassen der maskierenden Liganden durchgeführt. Die Bindungsstudien mit radioaktiv markierten Liganden werden bei 37°C in einem Gesamtvolumen von 250 μl Puffer (50 mM Tris, 10 mM MgCl₂, 0,2 mM EDTA, 10 μM Pargylin, 0,1% Ascorbat, pH = 7,4 bei 37°C) in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen ausgeführt. Die Sättigungsstudien werden mittels [³H]5-HT bei 12 verschiedenen Konzentrationen von 0,5 nM bis 100 nM ausgeführt. Die Verdrängungsstudien werden mittels 4,5-5,5 nM [³H]5-HT ausgeführt. Das Bindungsprofil der Arzneimittel in den Kompetitionsexperimenten wird mittels 10–12 Konzentrationen der Verbindung erreicht. Die Inkubationszeiten betragen 30 Minuten sowohl für die Sättigungs- als auch Verdrängungsstudien, die auf anfänglichen Untersuchungen basieren, welche die Gleichgewichtsbedungsbedingungen bestimmen. Die unspezifische Bindung wird in Gegenwart von 10 μM 5-HT definiert. Die Bindung wird durch die Zugabe von 50 μl Membranhomogenaten (10–20 μg) ausgelöst. Die Reaktion wird durch schnelle Filtration durch vorbenetzte (0,5% Polyethylenimin) Filter mittels 48R Cell Brandel Harvester (Gaithersburg, MD) bestimmt. Anschließend werden die Filter für 5 Sekunden mit eiskaltem Puffer (50 mM Tris HCl, pH = 7,4 bei 4°C) gewaschen, getrocknet und in Gläschen gegeben, die 2,5 ml Readi-Safe (Beckman, Fullerton, CA) enthalten und die Radioaktivität wird mittels eines Beckman LS 5000 TA Flüssigscintillationszählers gemessen. Die Effizienz der Zählung von [3H]5-HT liegt im Mittel zwischen 45–50%. Die Bindungsdaten werden mittels computerunterstützter nicht-linearer Regressionsanalyse (Accufit and Accucomp, Lunden Software, Chagrin Falls, OH) analysiert. Die HK₅₀ Werte werden mittels der Cheng-Prusoff Gleichung in die K_i Werte umgewandelt (Biochem. Pharmacol., 22, 3099–3108 (1973)). Alle Experimente werden dreifach ausgeführt.
N-[Propionyl]-5-amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin hat eine Affinität für den 5-HT_1F Rezeptor, wie dies durch das oben beschriebene Verfahren gemessen wird.
Wie es von R. L. Weinshank et al in WO 93/14201 berichtet wurde, ist der 5-HT_1F Rezeptor funktionell an ein G-Protein gekuppelt, wie dies durch die Fähigkeit von Serotonin und serotonergen Arzneimitteln zur Hemmung der durch Forskolin stimulierten cAMP Bildung in NIH3T3 Zellen gemessen wird, die mit dem 5-HT_1F Rezeptor transfiziert sind. Die Agonistenaktivierung der G-Protein-gekuppelten Rezeptoren führt auch zur Freisetzung von GDP aus der α-Untereinheit des G-Proteins und der anschließenden Bindung von GTP. Die Bindung des stabilen Analogons [³⁵S]GTPyS ist ein Indikator dieser Rezeptoraktivierung.
Membranpräparation
Maus LM (tk-) Zellen, die stabil mit dem humanen 5-HT_1F Rezeptor transfiziert sind und in Suspension angezogen werden, werden durch Zentrifugation gewonnen, in 50 mM Tris-HCl pH 7,4 in Aliquots von 2 × 10⁸ Zellen resuspendiert und bei –70°C bis zum Tag des Tests eingefroren. Am Tag des Tests wird ein Aliquot der Zellen aufgetaut, in 35 ml an 50 mM Tris-HCl mit pH 7,4 resuspendiert und bei 39 800 x g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das entstehende Pellet wird in 50 mM Tris-HCl mit pH 7,4 resuspendiert, für 10 Minuten bei 37°C inkubiert und bei 39 800 x g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wird resuspendiert und ein weiteres mal zentrifugiert, wobei das schließliche Pellet in 4 mM MgCl₂, 160 mM NaCl, 0,267 mM EGTA, 67 mM Tris-HCl, pH 7,4 so resuspendiert wird, daß ein 200 μl Aliquot etwa 15–25 μg Protein enthält.
[³⁵S]GTPγS Bindung
Alle Inkubationen werden dreifach in einem Gesamtvolumen von 800 μl ausgeführt. Eine Arzneimittelverdünnung in 200 μl Wasser, die 6 Logaritmunuseinheiten umfaßt, wird zu 400 μl Tris-HCl mit pH 7,4 gegeben, worin 3 mM MgCl₂, 120 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 10 μM GDP und 0,1 nM [³⁵S]GTPγS enthalten sind. Das Membranhomogenat mit 200 μl wird zugegeben und dann werden die Röhrchen für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Mittels eines Brandel Zellerntegeräts (Modell MB-48R, Brandel, Gaithersburg, MD) werden die Inkubationen durch Vakuumfiltration durch Whatman GF/B Filter beendet, die mit Wasser oder 20 mM Na₄P₂O₇, benetzt wurden und mit 4 ml eiskaltem 50 mM Tris-HCl mit pH 7,4 vorgekühlt wurden. Die Filter werden dann schnell mit. 4 ml eiskaltem 50 mM Tris-HCl pH 7,4 gewaschen. Die Menge an Radioaktivität, die auf den Filtern zurückgehalten wird, wird durch Flüssigscintillationsspektrometrie mittels eines LS6000IC (Beckman Instruments, Fullerton, CA) bestimmt. 10 μM GTPγS definiert die unspezifische Bindung. Das Protein wird durch das Verfahren von Bradford (Anal. Biochem. 72, 248–254 (1976)) bestimmt.
Statistische Analyse
Die Wirksamkeitswerte für die Testverbindungen werden als prozentuale Bindung relativ zu 10 μM 5-HT ausgedrückt. Es werden nicht-lineare Regressionsanalysen mit den Konzentrations-Antwort-Kurven für eine von De Lean et al (Mol. Pharmacol., 21, 5–16, (1982)) beschriebene Gleichung mit vier Parametern ausgefiihrt. Eine Varianzanalyse, gefolgt vom Tukey-Kramer Honestly Signifikanzunterschiedstest (JMP, SAS Institute Inc., Cary, NC) wird mit den pEC₅₀ Werten und den E_max Werten ausgeführt. N-[Propionyl]-5-amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin ist gemäß dem oben beschriebenen Test ein Agonist des 5-HT_1F Rezeptors.

Claims

Verfahren zur Herstellung von 5-Amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo-[3,2-b]pyridin (A), gekennzeichnet durch folgende Schritte i) Kondensation von 1-Hydroxy-5-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridin (F) mit 1-Methyl-4-piperidinon in Gegenwart einer Base unter Bildung von 1-Hydroxy-5-(dimethylaminomethylenimino)-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (J), ii) wahlweise Entfernung der Schutzgruppen von (J) unter Bildung von 1-Hydroxy-5-amino-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)pyrrolo-[3,2-b]pyridin (H), und iii) Hydierung von entweder (J) oder (H).
Verfahren nach Anspruch 1, worin 1-Hydroxy-5-(dimethylaminomethylenimino)-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (J) unter Bildung von 1-Hydroxy-5-amino-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)pyrrolo-[3,2-b]pyridin (H) von den Schutzgruppen befreit wird.
Verfahren zur Herstellung von 5-Amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (A), gekennzeichnet durch folgende Schritte: i) Kondensation von 1-Hydroxy-5-aminopyrrolo[3,2-b]pyridin (G) mit 1-Methyl-4-piperidinon in Gegenwart einer Base unter Bildung von 1-Hydroxy-5-amino-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (H), und ii) Hydrierung von (H).
Verfahren zur Herstellung von 5-Amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (A), gekennzeichnet durch folgende Schritte i) Nitrierung von 6-Amino-2-picolin unter Bildung eines mononitrierten 6-Amino-2-picolins, das aus einem Gemisch aus 3-Nitro- und 5-Nitro-6-amino-2-picolin (B) besteht, ii) wahlweise Trennung des Gemisches aus 3-Nitro- und 5-Nitro-6-aminopicolin unter Bildung eines mononitrierten 6-Amino-2-picolins, das im wesentlichen aus reinem 3-Nitro-6-amino-2-picolin (C) besteht, iii) Umsetzung eines mononitrierten 6-Amino-2-picolins, ausgewählt aus (B) oder (C) mit einem Dimethylaminoformylierungsmittel unter Bildung von 2-(2-Dimethylaminoethen-1-yl)-3-nitro-6-(dimethylaminomethylenimino)pyridin (E), iv) Hydrierng von (E) in Gegenwart einer Säure unter Bildung von 1-Hydroxy-5-dimethylaminomethyleniminopyrrolo[3,2-b]pyridin (F), v) Umsetzung von (F) mit 1-Methyl-4-piperidinon in Gegenwart einer Base unter Bildung von 1-Hydroxy-5-(dimethylaminomethylenimino)-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (J), vi) wahlweise Entfernung der Schutzgruppen von (n unter Bildung von 1-Hydroxy-5-amino-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl)pyrrolo-[3,2-b]pyridin (H), und vii) Hydrierung von entweder (J) oder (H).
Verfahren nach Anspruch 4, worin das mononitrierte 6-Amino-2-picolin im wesentlichen reines 3-Nitro-6-amino-2-picolin (C) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, worin (H) in Schritt vii) hydriert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 das ferner den Acylierungsschritt von 5-Amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin (A) unter Bildung von N-[Propionyl]-5-amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridin umfaßt.
Verfalhren zur Herstellung von 1-Hydroxy-5-dimethylaminomethyleniminopyrrolo[3,2-b]pyridin (F), gekennzeichnet durch die folgenden Schritte i) Nitrierung von 6-Amino-2-picolin unter Bildung von mononitriertem 6-Amino-2-picolin, das aus einem Gemisch aus 3-Nitro- und 5-Nitro-6-amino-2-picolin (B) besteht, ii) wahlweise Trennung des Gemisches aus 3-Nitro- und 5-Nitro-6-aminopicolin unter Bildung eines mononitrierten 6-Amino-2-picolins, das im wesentlichen aus reinem 3-Nitro-6-amino-2-picolin (C) besteht, iii) Umsetzung eines mononitrierten 6-Amino-2-picolins, ausgewählt aus (B) oder (C) mit einem Dimethylaminoformylierungsmittel unter Bildung von 2-(2-Dimethylaminoethen-1-yl)-3-nitro-6-(dimethylaminomethylenimino)pyridin (E), iv) Hydrierung von (E) in Gegenwart einer Säure.
1-Hydroxypyrrolo[3,2-b]pyridin der Formel I
worin X für Amino oder (CH₃)₂NCH=N- steht, und R für Wasserstoff oder 1-Methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl steht oder ein Säureadditionssalz hiervon.
Verbindung nach Anspruch 4, worin X für Amino steht.
Verbindung nach einem der Ansprüche 9 oder 10, worin R für Wasserstoff steht.
Verbindung nach einem der Ansprüche 9 oder 10, worin R für 1-Methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4-yl steht.