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Technisches Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein die rekombinante DNA-Technologie; und
spezifischer die Entwicklung von rekombinanten Vektoren, die für das Lenken
der Expression von einem oder mehreren heterologen Genprodukten
nützlich
sind.
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Hintergrund der Erfindung
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Alphaviren
umfassen einen Satz von serologisch verwandten, durch Arthropoden übertragenen
Viren der Togaviridae-Familie. Diese Viren sind weltweit verbreitet
und persistieren in der Natur durch einen Stechmücke-zu-Vertebraten-Zyklus. Vögel, Nager,
Pferde, Primaten und Menschen sind unter den definierten Alphavirus-Vertebraten-Reservoirs/Wirten.
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bekannte Viren und Virus-Subtypen sind innerhalb der Alphavirus-Gattung
unter Anwendung des Hämagglutinin-Inhibitions
(HI)-Tests klassifiziert worden. Dieser Test trennt die 26 Alphaviren
in drei Hauptkomplexe auf: den Venezuelanischen Pferde-Encephalitis
(VEE)-Komplex, den Semliki Forest (SF)-Komplex und den westlichen Pferde-Encephalitis
(WEE)-Komplex. Zusätzlich
erhalten vier andere Viren, östliche
Pferde-Encephalitis (EEE), Barmah Forest, Middelburg und Ndumu eine
individuelle Klassifizierung basierend auf dem serologischen HI-Test.
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Mitglieder
der Alphavirus-Gattung werden auch basierend auf ihren relativen
klinischen Eigenschaften in Menschen klassifiziert: Alphaviren,
die primär
mit einer Encephalitis assoziiert sind, und Alphaviren, die primär mit Fieber,
Hautausschlag und Polyarthritis assoziiert sind. Eingeschlossen
in die erstere Gruppe sind die VEE- und WEE-Komplexe und EEE. Im Allgemeinen
kann eine Infektion mit dieser Gruppe in permanenten Folgekrankheiten,
einschließlich
Verhaltensstörungen
und Lernschwierigkeiten oder Tod, resultieren. In der letzteren
Gruppe ist der SF-Komplex,
der die individuellen Alphaviren Semliki Forest, Sindbis, Ross River,
Chikungunya, O'nyony-nyong
und Mayaro umfasst. In Bezug auf diese Gruppe ist die Infektion,
obwohl schwere Epidemien berichtet worden sind, im Allgemeinen selbst-limitierend
ohne permanente Folgekrankheiten.
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Das
Sindbis-Virus ist das Prototyp-Mitglied der Alphavirus-Gattung der
Togaviridae-Familie. Seine Replikationsstrategie nach der Infektion
von Zellen (siehe 1) ist in Hühnerembryofibroblasten (CEF)
und Babyhamsternieren (BHK)-Zellen,
wo das Sindbis-Virus schnell zu einem hohen Titer anwächst, gut
charakterisiert worden und dient als ein Modell für andere
Alphaviren. Kurz, das Genom des Sindbis-Virus (wie von anderen Alphaviren)
ist ein ungefähr
12 kb großes,
einzelsträngiges
Positivsense-RNA-Molekül,
das mit einer Kappenstruktur versehen und polyadenyliert und in
einer Virus-codierten Capsid-Proteinhülle enthalten ist. Das Nucleocapsid
wird weiterhin von einer Wirts-abstammenden Lipidhülle umgeben,
in die die zwei viral-spezifischen Glycoproteine E1 und E2 inseriert
und am Nucleocapsid verankert sind. Bestimmte Alphaviren (z. B. SF)
bewahren auch ein zusätzliches
Protein, E3, das ein Spaltungsprodukt des E2-Vorläuferproteins
PE2 ist. Nach der Viruspartikel-Absorption an Zielzellen, Penetration
und dem Entfernen der Hülle
des Nucleocapsids, um die virale genomische RNA in das Cytoplasma
freizusetzen, wird der replikative Vorgang durch die Translation
der Nichtstrukturproteine (nsPs) von den 5'-gelegenen zwei Dritteln des viralen
Genoms initiiert. Die vier nsPs (nsP1–nsP4) werden direkt von der
genomischen RNA-Matrize als eines von zwei Polyproteinen (nsP123
oder nsP1234) translatiert und post-translationell durch eine aktive
Protease in der C-terminalen Domäne
nsP2 in monomere Einheiten prozessiert. Ein durchlässiges Opal
(UGA)-Codon, das
zwischen nsP3 und nsP4 der meisten Alphaviren vorhanden ist, macht
einen 10 bis 20% Überfluss
des nsP1234-Polyproteins im Vergleich zum nsP123-Polyprotein aus. Beide Nichtstrukturpolyproteine
und ihre abgeleiteten monomeren Einheiten können am replikativen RNA-Vorgang
teilnehmen, der die Bindung an die konservierten Nucleotidsequenz-Elemente
(CSEs), die an den 5'-
und 3'-Enden vorhanden
sind, und einen subgenomischen Verbindungsregion-Promotor, der innen
im Genom gelegen ist (was weiter unten diskutiert wird), involviert.
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Die
genomische Positivstrang-RNA dient als eine Matrize für die nsP-katalysierte Synthese
eines komplementären
Volllängen-Negativstrangs.
Die Synthese des komplementären
Negativstrangs wird nach der Bindung des nsP-Komplexes an das 3'-terminale CSE der genomischen Positivstrang-RNA
katalysiert. Der Negativstrang dient wiederum als eine Matrize für die Synthese
von zusätzlicher
genomischer Positivstrang-RNA und einer abundant exprimierten subgenomischen
26S-RNA, intern initiiert am Verbindungsregion-Promotor. Die Synthese
einer zusätzlichen
genomischen Positivstrang-RNA erfolgt nach der Bindung des nsP-Komplexes an das
3'-terminale CSE
der komplementären
genomischen Negativstrang-RNA-Matrize. Die Synthese der subgenomischen
mRNA von der genomischen Negativstrang-RNA-Matrize wird vom Verbindungsregion-Promotor
initiiert. Daher sind die 5'-End-
und die Verbindungsregion-CSEs der genomischen Positivstrang-RNA
nur funktionell, nachdem sie in das genomische Negativstrang-RNA-Komplement transkribiert werden
(d. h. das 5'-End-CSE
ist funktionell, wenn es das 3'-Ende
des genomischen negativ-strängigen
Komplements ist). Die Strukturproteine (sPs) werden von der subgenomischen
26S-RNA translatiert, die ein Drittel des Genoms im 3'-Bereich repräsentiert,
und werden wie die nsPs posttranslationell in die individuellen
Proteine prozessiert.
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Einige
Gruppen haben das Ausnutzen von bestimmten Mitgliedern der Alphavirus-Gattung
als einen Expressionsvektor vorgeschlagen, einschließlich zum
Beispiel Sindbis-Virus (Xiong et al., Science 243: 1188-1191, 1989;
Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2679-2683, 1992; Dubensky
et al., J. Virol 70: 508-519, 1996), Semliki Forest-Virus (Liljestrom,
Bio/Technology 9: 1356-1361, 1991) und Venezuelanisches Pferde-Encephalitis-Virus
(Davis et al., J. Cell. Biochem. Ergänz. 19A: 10, 1995). Zusätzlich hat
eine Gruppe das Verwenden von Alphavirus-abgeleiteten Vektoren für die Abgabe
von therapeutischen Genen in vivo vorgeschlagen. Eine Schwierigkeit
mit den oben in Bezuggenommenen Vektoren ist jedoch, dass die Inhibition der
wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese
(d. h. Protein- oder RNA-Synthese) innerhalb weniger Stunden nach
der Infektion beginnt, und cytopathische Effekte (CPE) treten innerhalb
von 12 bis 16 Stunden nach der Infektion (hpi) auf. Die Inhibition
und das Abschalten der Wirtszell-Proteinsynthese beginnt in der
Anwesenheit oder Abwesenheit einer Strukturproteinexpression in
BHK-Zellen, die mit rekombinanten viralen Partikeln infiziert wurden,
innerhalb von 2 hpi, was nahe legt, dass die frühen Vorgänge nach der Virusinfektion
(z. B. die Synthese von nsPs und der Minusstrang-RNA) die Inhibition
der Wirtszell-Proteinsynthese
und die folgende Entwicklung von CPE und Zelltod direkt beeinflussen
können.
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SN-1
ist ein varianter Stamm, der von Wildtyp-Sindbis abgeleitet wurde,
und er wurde von einer Kultur von BHK-Zellen, die über einen
Zeitraum von einem Monat persistent mit Sindbis-Virus infiziert
wurden, isoliert (Weiss et al., J. Virol. 33: 463-474, 1980). Ein reiner
SIN-1-Virusbestand, der durch Expansion von einem einzelnen Plaque
erhalten wurde, tötet
die BHK-Zellen, die er infiziert, nicht. Wichtig ist, dass die Viruserträge (> 103 PbE/Zelle)
in BHK-Zellen, die mit Wildtyp-Sindbis-Virus oder dem varianten SIN-1-Virus
infiziert wurden, dieselben sind. Daher wird der Hauptphänotyp von
SIN-1 in infizierten BHK-Zellen durch die Produktion von Wildtyp-Spiegeln des infektiösen Virus
in der Abwesenheit von virusinduziertem Zelltod charakterisiert.
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Die
vorliegende Erfindung liefert rekombinante Vektoren mit ausgewählten wünschenswerten
Phänotypen
für die
Verwendung in einer Vielfalt von Anwendungen, einschließlich zum
Beispiel der Gentherapie und rekombinanten Proteinproduktion, und
liefert weiterhin andere in Beziehung stehende Vorteile. Aspekte
der folgenden Offenbarung, die nicht spezifisch mit der beanspruchten
Erfindung in Beziehung stehen, sind nur zum Vergleich und zur Veranschaulichung
eingeschlossen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Kurz
angegeben betrifft die vorliegende Erfindung RNA-Vektor-Replikons,
Alphavirus-Vektorkonstrukte, eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme
und rekombinante Alphaviruspartikel, die eine reduzierte, verzögerte oder
keine Inhibition der zellulären
Makromolekülsynthese
(z. B. Protein- oder RNA-Synthese) zeigen, wobei die Verwendung
dieser Vektoren für
die Proteinexpression, Gentherapie und dergleichen mit reduzierter,
verzögerter
oder ohne Entwicklung von CPE oder Zelltod ermöglicht wird. Solche Vektoren
können aus
einer weiten Vielfalt von Alphaviren (z. B. Semliki Forest-Virus,
Ross River-Virus, Venezuelanisches Pferde-Encephalitisvirus oder
Sindbis-Virus) konstruiert und gestaltet werden, um zahlreiche heterologe
Sequenzen zu exprimieren (z. B. eine Sequenz, die einem Protein
entspricht, eine Sequenz, die einer Antisense-RNA entspricht, eine
Sequenz, die einer nicht-codierenden Sense-RNA entspricht, oder
eine Sequenz, die einem Ribozym entspricht).
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Hierin
werden isolierte Nucleinsäuremoleküle offenbart,
umfassend ein verändertes
Alphavirus-Nichtstrukturprotein-Gen, das, wenn es funktionell in
ein rekombinantes Alphavirus inkorporiert werden, die Zeit verlängert, die
benötigt
wird, um 50% Inhibition der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese
nach der Expression in Säugerzellen
im Vergleich zu einem Wildtyp-Alphavirus zu erreichen. Wie im Zusammenhang mit
der vorliegenden Offenbarung angewendet, bezeichnet ein „verändertes
Alphavirus-Nichtstrukturprotein-Gen" ein Gen, das, wenn es funktionell in
ein Alphavirus-RNA-Vektor-Replikon, ein rekombinantes Alphaviruspartikel
oder ein eukaryontisches geschichtetes Vektorinitiationssystem inkorporiert
wird, den erwünschten Phänotyp (z.
B. eine reduzierte, verzögerte
oder keine Inhibition der zellulären
Makromolekülsynthese)
produziert. Solche veränderten
Alphavirus-Nichtstrukturprotein-Gene
werden eine oder mehrere Nucleotid-Substitutionen, -Deletionen oder
-Insertionen haben, die die Nucleotidsequenz von jener des Wildtyp-Alphavirusgens verändern. Das
Gen kann entweder künstlich
(z. B. aus gelenkten Selektionsvorgehensweisen; siehe Beispiel 2
unten) oder von natürlich
vorkommenden viralen Varianten (siehe Beispiel 1 unten) abstammen.
Zusätzlich sollte
verstanden werden, dass, wenn die hierin offenbarten, isolierten
Nucleinsäuremoleküle in ein
Alphavirus-RNA-Vektor-Replikon, ein rekombinantes Alphaviruspartikel
oder ein eukaryontisches geschichtetes Vektorinitiationssystem,
wie oben diskutiert, inkorporiert werden, sie die Zeit, die benötigt wird,
um eine 50% Inhibition der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese
zu erreichen, wesentlich verlängern
können,
bis zu und einschließlich
im Wesentlichen keiner nachweisbaren Inhibition der wirtszellgelenkten
Makromolekülsynthese. Tests,
die für
das Nachweisen der Inhibition der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese
in Prozent geeignet sind, schließen zum Beispiel jene ein,
die im Beispiel 1 beschrieben sind.
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Hierin
sind auch isolierte Nucleinsäuremoleküle offenbart,
umfassend ein verändertes
Alphavirus-Nichtstrukturprotein-Gen, das, wenn es funktionell in
ein rekombinantes Alphaviruspartikel, ein eukaryontisches geschichtetes
Vektorinitiationssystem oder ein RNA-Vektor-Replikon inkorporiert
wird, in einem reduzierten Spiegel (z. B. 2-fach, 5-fach, 10-fach,
50-fach oder mehr als 100-fach) der vektorspezifischen RNA-Synthese
im Vergleich zum Wildtyp und demselben oder einem höheren Spiegel
des Proteins, das durch die RNA, die vom viralen Verbindungsregion-Promotor
transkribiert wird, codiert wird, im Vergleich zu einem rekombinanten
Wildtyp-Alphaviruspartikel, einem eukaryontischen geschichteten
Wildtyp-Vektorinitiationssystem oder einem Wildtyp-RNA-Vektor-Replikon
resultiert. Repräsentative
Tests für
das Quantifizieren von RNA-Spiegeln schließen [3H]-Uridin-Inkorporierung, wie
im Beispiel 1 beschrieben, oder eine RNA-Akkumulierung, wie durch
Northern-Blot-Analyse nachgewiesen (Siehe Beispiel 4), ein. Repräsentative
Tests für
das Quantifizieren von Proteinspiegeln schließen Raster-Densitometrie (siehe
Beispiel 4) und verschiedene enzymatische Tests (siehe Beispiele
3–5) ein.
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In
einem Aspekt der obigen Offenbarung codiert das isolierte Nucleinsäuremolekül das Nichtstrukturprotein
2 (nsP2). In einem weiteren Aspekt hat das isolierte Nucleinsäuremolekül eine Mutation
im LXPGG-Motiv von nsP2.
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Hierin
werden auch Expressionsvektoren offenbart, umfassend einen Promotor,
der mit einem der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle funktionell verknüpft ist.
In einem Aspekt umfasst der Expressionsvektor weiterhin eine Polyadenylierungssequenz
oder eine Transkriptions-Terminierungssequenz 3' des Nucleinsäuremoleküls.
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Die
Erfindung liefert Alphavirusvektoren, wie in den Ansprüchen definiert.
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In
einem Aspekt liefert die Erfindung einen Alphavirusvektor, umfassend
ein verändertes
Alphavirus-Nichtstrukturprotein 2 (nsP2)-Gen, das, wenn es in eine
Wirtszelle eingebracht wird, die Zeit, die benötigt wird, um eine 50% Inhibition
der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese zu erreichen, im
Vergleich zu einem Vektor verlängert,
der ein Wildtyp-Alphavirus-nsP2-Gen hat, und das in Spiegeln der
heterologen Genexpression resultiert, die äquivalent oder höher im Vergleich
zu den Expressionsspiegeln eines Vektors sind, der ein Wildtyp-Alphavirus-nsP2-Gen
aufweist, wobei das veränderte
Alphavirus-Nichtstrukturprotein 2 (nsP2)-Gen eine oder mehrere Nucleotid-Substituionen,
-Deletionen oder -Insertionen aufweist, die die Nucleotidsequenz von
jener des Wildtyp-Alphavirus-nsP2-Gens verändern, wobei das veränderte Alphavirus-Nichtstrukturprotein 2
(nsP2)-Gen ein biologisch aktives nsP2-Protein bereitstellt.
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In
einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Alphavirus-Vektorkonstrukte
geliefert, umfassend einen 5'-Promotor,
der die Synthese von viraler RNA in vitro aus cDNA initiiert, eine
5'-Sequenz, die
die Transkription von Alphavirus-RNA nach dem 5'-Promotor initiiert, ein Nucleinsäuremolekül, das alle
vier alphaviralen Nichtstrukturproteine funktionell codiert, einschließlich eines
veränderten
nsP2-Gens, wie oben beschrieben, eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz,
einen 3'-Polyadenylat-Bereich
und eine ausgewählte
heterologe Sequenz stromabwärts
von und funktionell verknüpft
mit einer viralen Verbindungsregion.
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In
noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden RNA-Vektor-Replikons,
die zur Translation in einem eukaryontischen System in der Lage
sind, geliefert, umfassend eine 5'-Sequenz, die die Transkription von
Alphavirus-RNA initiiert, ein Nucleinsäuremolekül, das funktionell alle vier
alphaviralen Nichtstrukturproteine codiert, einschließlich des
veränderten
nsP2-Gens, das oben diskutiert wird, eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz
und einen 3'-Polyadenylat-Bereich
und eine ausgewählte
heterologe Sequenz stromabwärts
von und funktionell verknüpft
mit einer viralen Verbindungsregion. In weiteren Aspekten der Erfindung
werden Wirtszellen geliefert, die eines der hierin beschriebenen
RNA-Vektor-Replikons enthalten.
In zusätzlichen
Aspekten der Erfindung werden Arzneimittel geliefert, umfassend
RNA-Vektor-Replikons, wie oben beschrieben, und einen/ein pharmazeutisch
verträglichen/s
Träger
oder Verdünnungsmittel.
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In
anderen Aspekten der Erfindung werden rekombinante Alphaviruspartikel
geliefert, umfassend ein oder mehrere Alphavirus-Strukturproteine,
eine Lipidhülle
und ein RNA-Vektor-Replikon, wie hierin beschrieben. In einer Ausführungsform
werden eines oder mehrere der Alphavirus-Strukturproteine von einem
anderen Alphavirus als dem Alphavirus, von dem das RNA-Vektor-Replikon
abgeleitet wurde, abgeleitet. In anderen Ausführungsformen werden das Alphavirus-Strukturprotein
und die Lipidhüllen
von anderen Spezies abgeleitet. In anderen Aspekten werden Arzneimittel
geliefert, umfassend ein rekombinantes Alphaviruspartikel, wie oben
offenbart, und einen/ein pharmazeutisch verträglichen/s Träger oder
Verdünnungsmittel.
Weiterhin werden auch Säugerzellen,
die mit solchen rekombinanten Alphaviruspartikeln infiziert sind,
geliefert.
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In
bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung können
die oben beschriebenen Vektoren oder Partikel weiterhin einen Resistenzmarker
umfassen, der im Rahmen mit der heterologen Sequenz fusioniert worden
ist. Repräsentative
Beispiele von solchen Resistenzmarkern schließen die Hygromycin-Phosphotransferase
oder Neomycin ein.
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In
anderen Aspekten der vorliegenden Offenbarung werden Verfahren für das Selektieren
von Alphavirus- oder rekombinanten Alphavirus-Vektorvarianten offenbart,
die den hierin beschriebenen Phänotyp
einer reduzieren, verzögerten
oder keiner Inhibition der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese
zeigen. Repräsentative
Beispiele von solchen Verfahren schließen die Verwendung von selektierbaren
Arzneistoffen oder antigenen Markern ein und werden detaillierter
unten in Beispiel 2 geliefert.
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In
anderen Aspekten der vorliegenden Offenbarung werden Togavirus-Capsidpartikel offenbart,
die im Wesentlichen keine genomischen (d. h. Wildtyp-Virusgenom) oder
RNA-Vektor-Replikon-Nucleinsäuren
enthalten. Repräsentative
Beispiele von Togaviren schließen
zum Beispiel Alphaviren und Rubiviren (z. B. Rubella) ein. In bestimmten
Aspekten umfassen die Capsidpartikel weiterhin eine Lipidhülle, die
ein oder mehrere Alphavirus-Glycoproteine enthält. In anderen Aspekten umfasst
das Capsidpartikel weiterhin eine Alphavirus-Hülle (d. h. die Lipid-Doppelschicht und
das Glycoprotein-Komplement). In verwandten Aspekten der vorliegenden
Offenbarung werden Arzneimittel geliefert, umfassend die oben erwähnten Capsidpartikel
(mit oder ohne eine Lipid-Doppelschicht (z. B. eine virale Hülle, die
Alphavirus-Glycoproteine enthält))
zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
In weiteren Aspekten können
solche Capsidpartikel (mit oder ohne eine Lipid-Doppelschicht (z.
B. eine virale Hülle,
die Alphavirus-Glycoproteine enthält)) oder Arzneimittel als
ein Impfmittel angewendet werden, um eine Immunantwort gegen ein
erwünschtes
Togavirus zu induzieren.
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In
weiteren Aspekten dieser Offenbarung werden induzierbare Promotoren
offenbart, umfassend eine Kern-RNA-Polymerase-Promotorsequenz, eine
funktionell verknüpfte
Nucleinsäuresequenz,
die die DNA-Bindung eines Proteins lenkt, das die Transkription
der Kern-Promotorsequenz aktiviert, und eine funktionell verknüpfte Nucleinsäuresequenz,
die die DNA-Bindung eines Proteins lenkt, das die Transkription
der Kern-Promotorsequenz unterdrückt.
Solche Promotoren können
in den hierin beschriebenen Gen-Abgabevehikeln so wie einer weiten
Vielfalt von anderen Vektoren, die Fachleuten bekannt sind, verwendet
werden.
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In
anderen Aspekten dieser Offenbarung sind Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassetten
offenbart, umfassend einen 5'-Promotor,
der die Synthese von viraler RNA aus DNA initiiert, ein Nucleinsäuremolekül, das ein
oder mehrere funktionelle Alphavirus-Strukturproteine codiert, einen
selektierbaren Marker, der funktionell mit der Transkription der
Expressionskassette verknüpft
ist, und optionell eine 3'-Sequenz,
die die Transkriptions-Terminierung kontrolliert. In einem Aspekt
umfassen solche Expressionskassetten weiterhin eine 5'-Sequenz, die die
Transkription von Alphavirus-RNA initiiert, einen viralen Verbindungsregion-Promotor und
eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz. In einem weiteren
Aspekt umfasst die Expressionskassette weiterhin eine katalytische
Ribozym-Prozessierungssequenz,
post-translationelle transkriptionelle regulatorische Elemente,
die den RNA-Export aus dem Nukleus ermöglichen, und/oder Elemente,
die die Translation von multicistronischer mRNA erlauben, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus Internen Ribosom-Eingangsstelle-Elementen,
Elementen, die das ribosomale Durchlesen fördern, und der BiP-Sequenz.
In anderen Aspekten ist der selektierbare Marker funktionell mit
einem 5'-Promotor
verknüpft,
der zum Initiieren der Synthese von Alphavirus-RNA aus cDNA in der
Lage ist. In weiteren Aspekten wird der selektierbare Marker stromabwärts eines
Verbindungsregion-Promotors
und des Nucleinsäuremoleküls positioniert,
das Alphavirus-Strukturproteine
codiert. In noch anderen Aspekten ist der 5'-Promotor ein induzierbarer Promotor,
wie hierin beschrieben. In einem anderen Aspekt umfasst die Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassette
weiterhin ein Alphavirus-Capsidproteingen
oder eine andere Sequenz (z. B. einen Tabak-Ätz-Virus- oder „TEV"-Führer), der
zum Verstärken
der Translation von einem oder mehreren funktionellen Alphavirus-Strukturproteingenen,
die 3' der Enhancersequenz
gelegen sind, in der Lage ist. Vorzugsweise wird die Casidprotein-Gensequenz
von einem anderen Alphavirus als jenem abgeleitet, von dem die Sequenz
erhalten wird, die die Alphavirus-Strukturgene codiert.
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In
noch anderen Aspekten dieser Offenbarung werden Alphavirus-Verpackungszelllinien
offenbart, umfassend eine Zelle, die eine Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassette,
wie oben beschrieben, enthält.
In bestimmten Aspekten sind die Alphavirus-Verpackungszelllinien
stabil mit den Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassetten,
die hierin offenbart werden, transformiert. In verwandten Aspekten
werden Alphavirus-Hersteller-Zelllinien bereitgestellt, umfassend
eine Zelle, die eine stabil transformierte Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassette
enthält,
und einen Vektor, der aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus RNA-Vektor-Replikons,
Alphavirus-Vektorkonstrukten und eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystemen.
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In
noch anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung werden eukaryontische
geschichtete Vektorinitiationssysteme bereitgestellt, umfassend
einen 5'-Promotor,
der zum Initiieren der 5'-Synthese
von RNA aus cDNA in vivo in der Lage ist, eine Sequenz, die die
Transkription von Alphavirus-RNA nach dem 5'-Promotor initiiert; ein Nucleinsäuremolekül, das funktionell
alle vier alphaviralen Nichtstrukturproteine codiert, einschließlich eines
veränderten
nsP2-Gens, wie oben diskutiert, eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz,
einen 3'-Polyadenylat-Bereich
und eine heterologe Sequenz, die funktionell mit einer viralen Verbindungsregion
verknüpft
ist. Repräsentative
Beispiele von geeigneten 5'-Promotoren
schließen
RNA-Polymerase I-Promotoren, RNA-Polymerase II-Promotoren, RNA-Polymerase
III-Promotoren, den HSV-TK-Promotor, RSV-Promotor, Tetracyclin-induzierbaren
Promotor, MoMLV-Promotor, einen SV40-Promotor und einen CMV-Promotor
ein. In bevorzugten Ausführungsformen
ist der 5'-Promotor
ein induzierbarer Promotor, wie hierin beschrieben.
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In
bestimmten Ausführungsformen
werden eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme geliefert,
die weiterhin ein post-transkriptionelles regulatorisches Element
umfassen, das den RNA-Export aus dem Nukleus ermöglicht. In weiteren Ausführungsformen
können
die hierin bereitgestellten eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssysteme
weiterhin ein Transkriptions-Terminierungssignal
umfassen.
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In
verwandten Aspekten liefert die vorliegende Erfindung auch Wirtszellen
(z. B. Wirbeltier oder Insekt), enthaltend ein stabil transformiertes
eukaryontisches geschichtetes Vektorinitiationssystem, wie oben beschrieben.
In weiteren Aspekten der vorliegenden Offenbarung werden Verfahren
für das
Abgeben einer ausgewählten
heterologen Sequenz an einen Vertebraten oder ein Insekt offenbart,
umfassend den Schritt des Verabreichens eines Alphavirus-Vektorkonstrukts,
eines RNA-Vektor-Replikons, eines rekombinanten Alphaviruspartikels
oder eines eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystems,
wie hierin beschrieben, an einen Vertebraten oder ein Insekt. In
bestimmten Aspekten wird das Alphavirus-Vektorkonstrukt, das RNA-Vektor-Replikon,
das rekombinante Alphaviruspartikel oder das eukaryontische geschichtete
Vektorinitiationssysteme an Zellen des Vertebraten ex vivo verabreicht,
gefolgt von einer Verabreichung der Vektor- oder der Partikel-enthaltenden
Zellen an ein warmblütiges
Tier.
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In
anderen Aspekten werden Arzneimittel geliefert, umfassend ein eukaryontisches
geschichtetes Vektorinitiationssystem, wie oben diskutiert, und
einen/ein pharmazeutisch verträglichen/s
Träger
oder Verdünnungsmittel.
in bestimmten Ausführungsformen
wird das Arzneimittel als ein liposomales Präparat bereitgestellt.
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In
weiteren Aspekten werden Verfahren zum Herstellen von rekombinanten
Alphaviruspartikeln geliefert, umfassend die Schritte von (a) Einbringen
eines Vektors wie eines eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystems,
eines RNA-Vektor-Replikons oder eines Alphavirus-Vektorpartikels,
wie oben beschrieben, in eine Population von Verpackungszellen unter
Bedingungen und für
einen Zeitraum, die ausreichend sind, um die Produktion von rekombinanten
Alphaviruspartikeln zu ermöglichen,
und (b) Ernten der rekombinanten Alphaviruspartikel. In verwandten
Aspekten werden Verfahren zum Herstellen eines ausgewählten Proteins geliefert,
umfassend die Schritte von (a) Einbringen eines Vektors, der ein
ausgewähltes
heterologes Protein codiert, wie eines eukaryontischen geschichteten
Vektorinitiationssystems, eines RNA-Vektor-Replikons oder eines Alphavirus-Vektorpartikels,
wie oben beschrieben, in eine Population von Verpackungszellen oder
anderer Zellen unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend
sind, um die Produktion des ausgewählten Proteins zu erlauben,
und (b) Ernten des Proteins, das durch die Vektor-enthaltenden Zellen
produziert wird. In noch anderen Aspekten werden Verfahren zum Herstellen
eines ausgewählten
Proteins geliefert, umfassend den Schritt des Einbringens eines
eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystems, das zum Produzieren
eines ausgewählten
heterologen Proteins in der Lage ist, in eine Wirtszelle unter Bedingungen und
für einen
Zeitraum, die ausreichend sind, um die Expression des ausgewählten Proteins
zu erlauben. In weiteren Aspekten werden Wirtszelllinien geliefert,
die ein RNA-Vektor-Replikon, wie hierin beschrieben, enthalten.
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In
noch anderen Aspekten der vorliegenden Offenbarung werden Alphavirus-Impfstoffe offenbart,
umfassend eines der oben beschriebenen Alphavirus-Vektorkonstrukte,
RNA-Vektor-Replikons, eukaryontischen Vektorinitiationssysteme oder
rekombinanten Alphaviruspartikel, die eine der heterologen Sequenzen,
die hierin geliefert werden, exprimieren können oder nicht (z. B. können sie
nur als ein Impfstoff für
das Behandeln oder Verhindern von alphaviralen Krankheiten verwendet
werden). Zum Beispiel werden in einem Aspekt dieser Offenbarung
rekombinante Togavirus-Partikel offenbart, die im Wesentlichen keine
Nucleinsäure
oder RNA-Vektor-Replikon-Nucleinsäure aufweisen.
In einem weiteren Aspekt werden rekombinante Togavirus-Partikel
offenbart, die heterologe virale Nucleinsäuren (d. h. von einem anderen
Virus als dem Togavirus-Partikel) enthalten. In noch einem anderen
Aspekt ist das rekombinante Togavirus-Partikel T = 3 oder größer.
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In
weiteren Aspekten dieser Offenbarung werden rekombinante chimäre Togavirus-Partikel
(entweder leer oder Nucleinsäuren
enthaltend) offenbart, wobei das virale Partikel virale Strukturkomponenten
aufweist, die von anderen Togaviridae erhalten oder abgeleitet werden
(z. B. wird das Capsidprotein und Glycoprotein von verschiedenen
Alphavirus-Quellen erhalten).
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Diese
und andere Aspekte werden durch Bezugnahme auf die folgende detaillierte
Beschreibung und die angefügten
Figuren ersichtlich. Zusätzlich
sind verschiedene Bezugnahmen hierin dargelegt, die bestimmte Vorgehensweisen
oder Zusammensetzungen (z. B. Plasmide, Sequenzen usw.) detaillierter
beschreiben.
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Kurze Beschreibung der Figuren
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Die
Figuren, die sich nicht spezifisch auf die beanspruchte Erfindung
beziehen, dienen nur zum Vergleich und zur Veranschaulichung.
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1 ist
eine schematische Darstellung der Sindbis-Genom-Organisierung und
der Replikationsstrategie.
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2 ist
eine Graphik der Virusfreisetzung aus BHK-Zellen, die mit SIN-1-,
SIN-1/nsP1-4-, Toto1101- oder Sin-1/nsP2-Viren bei einer MOI von
10 infiziert wurden. Die Kulturüberstände wurden
3, 6, 9 und 12 Stunden nach der Infektion gewonnen. Die Virustiter
wurden durch Plaque-Test bestimmt.
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3 ist
eine Grafik, die die virale RNA-Synthese in BHK-Zellen nach der
Infektion durch Toto1101-, SIN-1/nsP2-, SIN-1/nsP1-4- oder SIN-1-Virus
zeigt. Die Zellen wurden bei einer MOI von 10 infiziert, und 1 Stunde
nach der Infektion wurden Actinomycin D und 3H-Uridin
zugefügt.
Die Menge der 3H-Uridin-Inkorporation wurde
3, 6, 9 und 12 hpi bestimmt.
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4 ist
eine Graphik, die die virale RNA-Synthese in BHK-Zellen zeigt, die
durch SIN-1/nsP1, SIN-1/nsP2, SIN-1/nsP3, SIN-1/nsP3-4, SIN-1/nsP4,
SIN-1/nsP2-O, SIN-1/nsP2-N,
Toto1101, SIN-1 oder SIN-1/nsP1-4 infiziert wurden. Die Spiegel
der 3H-Uridin-Inkorporation werden relativ
zur Wildtyp (Toto 1101)-Infektion ausgedrückt.
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5 ist
eine Graphik, die das Abschalten der Wirtszell-Proteinsynthese in
BHK-Zellen zeigt, die mit SIN-1nsP1-4-, SIN-1-, SIN-1nsP2- oder
Toto1101-Viren infiziert wurden.
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6 ist
die cDNA-Sequenz von 8000 Basen des SIN-1-Virus (SEQ. ID NO. 101).
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7 ist
die cDNA-Sequenz von 8000 Basen des SINCG-Virus (SEQ. ID NO. 102).
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8 ist
die cDNA-Sequenz des Toto 1101-Virus (SEQ. ID NO. 103).
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9A ist ein Northern-Blot von RNAs, die
von BHK-21-Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP- oder pBG/wt
ELVS 1.5-SEAP-Plasmid-DNAs transfiziert wurden, isoliert und mit
einer radioaktiv-markierten viralen RNA-Sonde hybridisiert wurden. 9B ist eine Graphik, die einen 7 Tage-Zeitverlauf
der alkalischen Phosphatase-Expression in BKH-Zellen zeigt, die
mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP- oder
pBG/wt ELVS 1.5-SEAP-Plasmid-DNAs transfiziert wurden.
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10 ist eine Graphik, die einen 4 Tage-Zeitverlauf
der Luciferase-Expression
in BHK-Zellen zeigt, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-luc- oder pBG/wt
ELVS 1.5-luc-Plasmid-DNAs transfiziert wurden.
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11A ist ein Northern-Blot von RNAs, die
von BHK-21-Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS-1.5-β-gal- oder pBG/wt ELVS 1.5-β-Gal-Plasmid-DNAs
transfiziert wurden, isoliert und mit einer radioaktiv markierten
viralen RNA-Sonde hybridisiert wurden. 11B ist
ein Western-Blot, der die β-Gal-Expression
in BHK-21-Zellen nachweist, die mit entweder pBG/SIN-1 ELVS-1.5-β-gal- oder
pBG/wt ELVS 1.5-R-gal-Plasmid-DNAs transfiziert
wurden. 11C ist eine Graphik, die einen
5 Tage- Verlauf der
alkalischen Phosphatase-Expression in BHK-Zellen zeigt, die mit
pBG/SIN-1 ELVS-1.5-β-gal-
oder pBG/wt ELVS 1.5-β-gal-Plasmid-DNAs transfiziert
wurden.
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12A & B
sind Graphiken, die die β-gal-Expression
in HT1080- und BHK-21-Zellen
zeigen, die mit ELVS β-gal-Vektoren
mit oder ohne HBV-PRE-Sequenzen transfiziert wurden, gemessen durch
RLU (relative Lichteinheiten).
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13 ist eine schematische Darstellung der RNA-Amplifikation,
Strukturprotein-Expression und Vektor-Verpackung durch Vektor-induzierbare
Alphavirus-Verpackungszelllinien.
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14 ist eine schematische Darstellung der Vektor-induzierbaren
Strukturprotein-Expressionskassetten, die in der Herstellung von
Alphavirus-Verpackungszelllinien
verwendet werden.
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15 ist eine Graphik, die die Luciferase-Vektor-Verpackung
(Transfer der Expression) durch verschiedene Alphavirus-Verpackungszelllinien
zeigt.
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16 ist ein Western-Blot, der die Vektor-induzierbare
Strukturprotein-Expression
durch eine Alphavirus-Verpackungszelllinie zeigt.
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17A ist eine Graphik, die die Luciferase-Vektor-Verpackung
durch C6/36-Stechmückenzellen, enthaltend
die pDCMV-intSINrbz-Strukturprotein-Expressionskassette, zeigt. 17B ist eine Graphik, die die Luciferase-Vektor-Verpackung durch
menschliche 293-Verpackungszellen zeigt, die stabil mit dem Plasmid pBGSVCMVdlneo
transformiert wurden.
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18 ist eine Graphik, die die Luciferase-Vektor-Verpackung
durch verschiedene Alphavirus-Verpackungszelllinien zeigt.
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19 ist eine RNA-Gel-Autoradiographie, die 3H-Uridin-markierte RNAs von BHK-Zellen zeigt,
die mit SINrep/LacZ-Vektorpartikeln, die von einer Alphavirus-Verpackungszelllinie
produziert wurden, infiziert wurden.
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20 ist eine Proteingel-Autoradiographie, die 35S-Methionin-markierte Proteine von BHK-Zellen zeigt,
die mit SINrep/LacZ-Vektorpartikeln, die von einer Alphavirus-Verpackungszelllinie
produziert wurden, infiziert wurden.
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21 ist ein Western-Blot, der die Vektor-induzierbare
Capsidprotein-Expression
nach einer β-Gal- oder
Glycoprotein-Vektor-Transfektion einer Capsid-Zelllinie zeigt.
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22 ist eine schematische Darstellung der Region
von Strukturprotein-Expressionskassetten,
umfassend ein Wildtyp- oder deletionsmutiertes Ross River-Virus-Capsidprotein-Gen.
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23 ist eine schematische Darstellung von Vektor-induzierbaren
Strukturprotein-Expressionskassetten, enthaltend ein Wildtyp- oder
deletionsmutiertes Ross River-Virus-Capsidprotein-Gen.
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24 ist eine schematische Darstellung der Vektor-Verpackung
durch „gespaltene" Strukturprotein-Genexpressionskassetten,
die eine Ross River-Virus-Capsidprotein-Gensequenz
stromaufwärts
der Sindbis-Virus-Glycoprotein-Gene enthalten.
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25 ist eine schematische Darstellung der Vektor-Verpackung
durch „gespaltene" Strukturprotein-Genexpressionskassetten,
die eine Ross River-Virus-Capsidprotein-Gensequenz
stromaufwärts
der Sindbis-Virus-Glycoprotein-Gene auf einer Kassette und das Sindbis-Virus-Capsidprotein-Gen
in einer getrennten Kassette enthalten.
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26 ist eine Tabelle, die die Ergebnisse der Vektorpartikel-Verpackung
unter Verwendung der obigen „gespaltenen" Strukturprotein-Genexpressionskassetten
zeigt.
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27 ist eine schematische Darstellung der Verwendung
von Alphavirus-Verpackungszelllinien
für die
Amplifizierung von verpackten Vektorpartikel-Präparaten
und die Massenproduktion von rekombinantem Protein.
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28 ist eine Graphik, die die Amplifizierung und
Produktion von β-Gal-Protein im Zeitverlauf
unter Verwendung von Alphavirus-Verpackungszelllinien zeigt.
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29 ist eine schematische Darstellung der Verwendung
eines Tetracyclin-regulierten
Promotorsystems, um die Expression der Alphavirusvektor-RNA aus
cDNA in vivo zu kontrollieren.
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30 ist eine schematische Darstellung der Verwendung
eines verknüpften
transkriptionellen Repressors und eines transkriptionellen Induktor/Aktivatorregulierten
Promotorsystems, um die Expression von Alphavirusvektor-RNA aus
cDNA in vivo zu steuern.
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31A & B
sind Autoradiographien von [3H]-Uridin-markierten
RNAs, die einer Elektrophorese auf denaturierenden Glyoxal-Gelen
unterzogen wurden und die von BHK-Zellen, welche mit SINrep/LacZ-Replikon
und DH-RNAs von verschiedenen RRV-Capsid-enthaltenden DH-Konstrukten
durch Elektroporation behandelt wurden, und von den Vektorpartikeln,
die 18 Stunden nach der Elektroporation in den Kulturflüssigkeiten
vorhanden waren, isoliert wurden.
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32A & B
sind Proteingel-Autoradiographien, die 35S-Methionin-markierte
Proteine von BHK-Zellen, die mit SINrep/LacZ-Replikon und DH-RNAs
von verschiedenen RRV-Capsid-enthaltenden DH-Konstrukten durch Elektroporation
behandelt wurden, und von den Vektorpartikeln zeigen, die 18 Stunden
nach der Elektroporation in den Kulturflüssigkeiten vorhanden sind.
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33A–D
sind Kyte-Doolittle-Hydrophobie-Diagramme von verschiedenen Ross
River-Virus (RRV)-Capsidproteinen, die vom Wildtyp-Gen (A) und den
drei Deletionsmutanten CΔ1rrv,
CΔ2rrv und
CΔ3rrv (B–D) exprimiert
wurden.
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34 ist ein Schema, das die Aminoterminus-RRV-Capsidproteine
illustriert, die vom Wildtyp-Gen (SEQ. ID NO. 114) und den drei
Deletionsmutanten CΔ1rrv
(SEQ. ID NO. 115), CΔ2rrv
(SEQ. ID NO. 116) und CΔ3rrv
(SEQ. ID NO. 117) exprimiert werden. Die Lysinreste, die in den
RRV-Capsid-Genmutanten deletiert sind, sind angezeigt.
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35 ist eine Graphik, die die relativen Spiegel
von [35S]Methionin und [3H]-Uridin illustriert,
die in die Viruspartikel in BHK-Zellen, die bei einer hohen MOI
mit Toto1101-Wildtyp-Virus infiziert wurden, inkorporiert wurden.
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36 ist eine Graphik, die die relativen Spiegel
von [35S]-Methionin und [3H]Uridin
illustriert, die in Viruspartikel in BHK-Zellen, die mit SINrep/lacZ
und DH-BB (5' tRNA) Crrv DH RNAs
durch Elektroporation behandelt wurden, inkorporiert wurden.
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37 ist eine Graphik, die die relativen Spiegel
von [35S]Methionin und [3H]Uridin
illustriert, die in Viruspartikel in BHK-Zellen, die mit SlNrep/lacZ
und den RRV-Capsid-Deletionsmutante-DH-BB (5' tRNA) CΔ3rrv DH-RNAs durch Elektroporation
behandelt wurden, inkorporiert wurden.
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38 ist eine Graphik, die die Ergebnisse, die in
den 35–37 gezeigt
werden, zusammenstellt, die die relativen Spiegel von [35S]Methionin
und [3H]Uridin zeigen, die in Viruspartikel
in BHK-Zellen, die mit SINrep/lacZ und DH-RNAs durch Elektroporation
behandelt oder mit dem Toto1101-Wildtyp-Virus infiziert wurden,
inkorporiert wurden.
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39 ist eine Graphik, die die Luciferase-Vektor-Verpackung
durch BHK-Zellen
illustriert, die stabil mit pBGSVCMVdlhyg transformiert wurden.
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Definition der Begriffe
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Die
folgenden Begriffe werden im Verlauf der Beschreibung verwendet.
Außer
wenn es anderweitig angezeigt wird, werden diese Begriffe wie folgt
definiert:
"Genomische
RNA" bezeichnet
RNA, die die gesamte genetische Information enthält, die nötig ist, um ihre eigene Amplifizierung
oder Selbstreplikation in vivo in einer Zielzelle zu lenken. Um
ihre eigene Replikation zu lenken, kann das RNA-Molekül: 1) ein oder mehrere Polymerase-,
Replikase- oder andere Proteine codieren, die mit den viralen oder
wirtszellabgeleiteten Proteinen, Nucleinsäuren oder Ribonucleoproteinen
interagieren können,
um den RNA-Amplifizierungsvorgang zu katalysieren; und 2) cis-RNA-Sequenzen
enthalten, die für die
Replikation nötig
sind und während
des Vorgangs der Replikation durch ihre selbst-codierten Proteine
oder nicht selbst-codierten zellabstammenden Proteine, Nucleinsäuren oder
Ribonucleoproteine oder Komplexe zwischen irgendwelchen dieser Komponenten
gebunden werden können.
Ein Alphavirus-abgeleitetes genomisches RNA-Molekül sollte
die folgenden geordneten Elemente enthalten: 5' virale oder defekte-interferierende RNA-Sequenz(en), die
für die
Replikation in cis benötigt
werden, Sequenzen, die, wenn sie exprimiert werden, biologisch aktive
Alphavirus-Nichtstrukturproteine
(z. B. nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) codieren, virale 3'-Sequenzen, die für die Replikation
in cis benötigt
werden, und einen Polyadenylat-Bereich. Das Alphavirus-abgeleitete
genomische RNA-Vektor-Replikon kann auch einen viralen subgenomischen „Verbindungsregion"-Promotor, der in
bestimmten Ausführungsformen
modifiziert sein kann, um die virale Transkription des subgenomischen
Fragments zu verhindern, erhöhen
oder zu reduzieren, und Sequenzen enthalten, die, wenn sie exprimiert
werden, biologisch aktive Alphavirus-Strukturproteine (z. B. C, E3, E2, 6K,
E1) codieren. Im Allgemeinen bezieht sich der Begriff genomische
RNA auf ein Molekül
von positiver Polarität
oder „Message"-Sense, und die genomische RNA kann eine
Länge haben,
die verschieden von jener von irgendeinem bekannten natürlich vorkommenden
Alphavirus ist. Vorzugsweise enthält die genomische RNA keine
Sequenzen, die irgendein (irgendwelche) alphavirales(n) Strukturprotein(e)
codieren; vielmehr werden jene Sequenzen mit heterologen Sequenzen
substituiert. In jenen Fällen,
in denen die genomische RNA in ein rekombinantes Alphaviruspartikel
verpackt werden soll, muss sie eine oder mehrere Sequenzen enthalten,
die dazu dienen, Interaktionen mit Alphavirus-Strukturproteinen zu initiieren, die
zur Partikelbildung führen,
und hat vorzugsweise eine Länge,
die durch das Verpackungssystem, das angewendet wird, wirksam verpackt
wird.
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„Subgenomische
RNA" oder „26S"-RNA bezieht sich
auf ein RNA-Molekül
mit einer Länge
oder Größe, die
kleiner ist als die genomische RNA, von der sie abgeleitet wurde.
Die subgenomische RNA sollte von einem internen Promotor transkribiert
werden, dessen Sequenzen sich in der genomischen RNA oder ihrem Komplement
befinden. Die Transkription der subgenomischen RNA kann durch viralcodierte
Polymerase(n), wirtszellcodierte Polymerase(n), Transkriptionsfaktor(en),
Ribonucleoprotein(e) oder eine Kombination davon vermittelt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen
wird die subgenomische RNA von einem Vektor gemäß der Erfindung produziert
und codiert oder exprimiert das Gen (die Gene) oder Sequenz(en)
von Interesse. Die subgenomische RNA muss nicht notwendigerweise
einen Sedimentationskoeffizienten von 26 haben.
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"Alphavirus-Vektorkonstrukt" bezieht sich auf
eine Anordnung, die zum Lenken der Expression einer Sequenz (von
Sequenzen) oder eines Gens (von Genen) von Interesse in der Lage
ist. Solche Vektorkonstrukte umfassen eine 5'-Sequenz, die zum Initiieren der Transkription
einer Alphavirus-RNA in der Lage ist (im Hintergrund auch als 5'-CSE bezeichnet),
sowie Sequenzen, die, wenn sie exprimiert werden, biologisch aktive Alphavirus-Nichtstrukturproteine
(z. B. nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) codieren, und eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz
(im Hintergrund auch als 3'-CSE
bezeichnet). Zusätzlich
sollte das Vektorkonstrukt einen viralen subgenomischen „Verbindungsregion"-Promotor, der in
bestimmten Ausführungsformen
modifiziert sein kann, um die virale Transkription des subgenomischen
Fragments zu verhindern, erhöhen
oder zu reduzieren, und auch einen Polyadenylat-Bereich einschließen. Der
Vektor kann auch Sequenzen von einem oder mehreren Strukturprotein-Genen
oder Teile davon, fremde Nucleinsäuremolekül(e), die von einer Größe sind,
die ausreicht, um die Produktion von lebensfähigem Virus zu ermöglichen,
einen 5'-Promotor,
der zum Initiieren der Synthese von viraler RNA in vitro aus cDNA
in der Lage ist, eine heterologe Sequenz, die exprimiert werden
soll, sowie eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion
von heterologen Sequenzen einschließen.
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"Alphavirus-RNA-Vektor-Replikon", "RNA-Vektor-Replikon" und "Replikon" bezieht sich auf
ein RNA-Molekül,
das zum Lenken seiner eigenen Amplifizierung oder Selbstreplikation
in vivo in einer Zielzelle in der Lage ist. Um seine eigene Amplifizierung
zu lenken, kann das RNA-Molekül:
1) ein oder mehrere Polymerase-, Replikase- oder andere Proteine
codieren, die mit den viralen oder wirtszellabgeleiteten Proteinen,
Nucleinsäuren
oder Ribonucleoproteinen interagieren können, um die RNA-Amplifizierung
zu katalysieren; und 2) cis-RNA-Sequenzen
enthalten, die für
eine Replikation benötigt
werden und die durch ihre selbstcodierten Proteine oder nicht-selbstcodierten
zellabgeleiteten Proteine, Nucleinsäuren oder Ribonucleoproteine
oder Komplexe zwischen irgendwelchen von diesen Komponenten gebunden
werden können.
In bestimmten Ausführungsformen
kann die Amplifizierung auch in vitro erfolgen. Ein Alphavirus-abgeleitetes
RNA-Vektor-Replikonmolekül sollte
die folgenden geordneten Elemente enthalten: virale 5'-Sequenzen, die für die Replikation in
cis erforderlich sind (im Hintergrund auch als 5'-CSE bezeichnet), Sequenzen, die, wenn
sie exprimiert werden, biologisch aktive Alphavirus-Nichtstrukturproteine
(z. B. nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) codieren, virale 3'-Sequenzen, die für die Replikation in cis benötigt werden
(im Hintergrund auch als 3'-CSE bezeichnet),
und einen Polyadenylat-Bereich. Das Alphavirus-abgeleitete RNA-Vektor-Replikon kann
auch einen viralen subgenomischen „Verbindungsregion"-Promotor, der in bestimmten Ausführungsformen
modifiziert sein kann, um die virale Transkription des subgenomischen
Fragments zu verhindern, steigern oder zu reduzieren, Sequenzen
von einem oder mehreren Strukturprotein-Genen oder Teile davon,
fremde Nucleinsäuremolekül(e), die
von einer ausreichenden Größe sind,
um die Produktion von lebensfähigem
Virus zu ermöglichen,
sowie heterologe Sequenz(en), die exprimiert werden soll(en), enthalten.
Die Quelle der RNA-Vektor-Replikons
in einer Zelle kann aus einer Infektion mit einem Virus oder einem
rekombinanten Alphaviruspartikel oder einer Transfektion von Plasmid-DNA
oder in vitro-transkribierter RNA stammen.
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"Rekombinantes Alphaviruspartikel" bezieht sich auf
eine Virion-Einheit, die ein Alphavirus-RNA-Vektor-Replikon enthält. Im Allgemeinen
umfasst das rekombinante Alphaviruspartikel ein oder mehrere Alphavirus-Strukturproteine,
eine Lipidhülle
und ein RNA-Vektor-Replikon. Vorzugsweise enthält das rekombinante Alphaviruspartikel
eine Nucleocapsid-Struktur, die in einer zellabstammenden Lipid-Doppelschicht wie
einer Plasmamembran, in der alphaviral-codierte Hüllen-Glycoproteine eingebettet
sind, enthalten ist. Das Partikel kann auch andere Komponenten (z.
B. Targeting-Elemente wie Biotin, andere virale Strukturproteine
oder andere Rezeptorbindungs-Liganden), die den Tropismus des Partikels,
von dem das Alphavirus abgeleitet wurde, lenken, oder andere RNA-Moleküle enthalten.
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„Strukturprotein-Expressionskassette" bezieht sich auf
ein Nucleinsäuremolekül, das zum
Lenken der Synthese von einem oder mehreren Alphavirus-Strukturproteinen
in der Lage ist. Die Expressionskassette sollte einen 5'-Promotor, der zum Initiieren der Synthese
von RNA aus cDNA in vivo in der Lage ist, sowie Sequenzen, die,
wenn sie exprimiert werden, ein oder mehrere biologisch aktive Alphavirus-Strukturproteine
(z. B. C, E3, E2, 6K, E1) codieren, und eine 3'-Sequenz,
die die Transkriptions-Terminierung kontrolliert, einschließen. Die
Expressionskassette kann auch eine 5'-Sequenz, die zum Initiieren der Transkription
einer Alphavirus-RNA in der Lage ist (im Hintergrund auch als 5'-CSE bezeichnet),
einen viralen subgenomischen „Verbindungsregion"-Promotor und eine
Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz
(im Hintergrund auch als 3'-CSE
bezeichnet) einschließen.
In bestimmten Ausführungsformen
kann die Expressionskassette auch Spleiß-Erkennungssequenzen, eine
katalytische Ribozym-Prozessierungssequenz, eine Sequenz, die einen selektierbaren
Marker codiert, ein nukleäres
Exportsignal sowie eine Polyadenylierungssequenz einschließen. Zusätzlich kann
die Expression des Alphavirus-Strukturproteins (der Alphavirus-Strukturproteine)
in bestimmten Ausführungsformen
durch die Verwendung eines induzierbaren Promotors reguliert werden.
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"Stabile Transformierung" bezieht sich auf
das Einbringen eines Nucleinsäuremoleküls in eine
lebende Zelle und eine Langzeit- oder permanente Bewahrung jenes
Nucleinsäuremoleküls in den
Nachkommen-Zellen durch aufeinanderfolgende Zyklen der Zellteilung.
Das Nucleinsäuremolekül kann in
jedem zellulären
Kompartiment bewahrt werden, einschließlich des Nukleus, der Mitochondrien
oder des Cytoplasmas, aber nicht beschränkt darauf. In bevorzugten
Ausführungsformen
wird das Nucleinsäuremolekül im Nukleus
bewahrt. Das Bewahren kann intrachromosomal (integriert) oder extrachromosomal
als ein episomales Ereignis auftreten.
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„Alphavirus-Verpackungszelllinie" bezieht sich auf
eine Zelle, die eine Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassette
enthält
und die nach dem Einbringen eines Alphavirus-Vektorkonstrukts, eines
RNA-Vektor-Replikons, eines eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystems
oder eines rekombinanten Alphaviruspartikels rekombinante Alphaviruspartikel
produziert. Die Elternzelle kann von Säuger- oder nicht-Säuger-Ursprung
sein. In bevorzugten Ausführungsformen
ist die Verpackungszelllinie stabil mit der Strukturprotein-Expressionskassette
transformiert.
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"Alphavirus-Hersteller-Zelllinie" bezieht sich auf
eine Zelllinie, die zum Herstellen von rekombinanten Alphaviruspartikeln
in der Lage ist, umfassend eine Alphavirus-Verpackungszelllinie,
die auch ein Alphavirus-Vektorkonstrukt, ein RNA-Vektor-Replikon, ein eukaryontisches
geschichtetes Vektorinitiationssystem oder ein rekombinantes Alphaviruspartikel
enthält.
Vorzugsweise ist das Alphavirus-Vektorkonstrukt
ein eukaryontisches geschichtetes Vektorinitiationssystem, und die
Hersteller-Zelllinie ist stabil mit dem Vektorkonstrukt transformiert.
In bevorzugten Ausführungsformen
erfolgt die Transkription des Alphavirus-Vektorkonstrukts und die
folgende Herstellung von rekombinanten Alphavirus-Vektorpartikeln
nur als Antwort auf einen oder mehrere Faktoren oder den Differenzierungsstatus
der Alphavirus-Hersteller-Zelllinie.
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"Defektes Helferkonstrukt" bezieht sich auf
eine Anordnung, die zur RNA-Amplifizierung
oder -Replikation und Expression von einem oder mehreren Alphavirus-Strukturproteinen
als Antwort auf biologisch aktive Alphavirus-Nichtstrukturproteine, die in trans
bereitgestellt werden, in der Lage ist. Das defekte Helferkonstrukt sollte
die folgenden geordneten Elemente enthalten: virale 5' oder defekte-interferierende
RNA-Sequenzen, die für
die Replikation in cis benötigt
werden, einen viralen subgenomischen Verbindungsregion-Promotor,
Sequenzen, die, wenn sie exprimiert werden, ein oder mehrere biologisch
aktive Alphavirus-Strukturproteine
(z. B. C, E3, E2, 6K, E1) codieren, virale 3'-Sequenzen, die für die Replikation in cis benötigt werden,
und einen Polyadenylat-Bereich. Das defekte Helferkonstrukt kann
auch einen 5'-Promtor,
der zum Initiieren der Synthese von viraler RNA aus cDNA in der
Lage ist, eine 3'-Sequenz,
die die Transkriptions- Terminierung
steuert, Spleiß-Erkennungsequenzen,
eine katalytische Ribozym-Prozessierungssequenz,
eine Sequenz, die einen selektierbaren Marker codiert, und ein nukleäres Exportsignal
enthalten.
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„Eukaryontische
qeschichtete Vektorinitiiationssysteme" beziehen sich auf eine Anordnung, die
zum Lenken der Expression einer Sequenz (von Sequenzen) oder eines
Gens (von Genen) von Interesse in der Lage ist. Das eukaryontische
geschichtete Vektorinitiationssystem sollte einen 5'-Promotor, der zum
Initiieren der Synthese von RNA aus cDNA in vivo (d. h. in einer
Zelle) in der Lage ist, und eine Nucleinsäure-Vektorsequenz, die zum
Lenken ihrer eigenen Replikation in einer eukaryontischen Zelle
und auch zum Exprimieren einer heterologen Sequenz in der Lage ist,
enthalten. Die Nucleinsäuresequenz,
die zum Lenken ihrer eigenen Amplifikation in der Lage ist, kann
von viralem oder nicht-viralem Ursprung sein. In bestimmten Ausführungsformen
ist die Nucleinsäure-Vektorsequenz
eine Alphavirus-abgeleitete
Sequenz und umfasst eine 5'-Sequenz,
die zum Initiieren der Transkription einer Alphavirus-RNA in der
Lage ist (im Hintergrund auch als 5'-CSE bezeichnet), sowie Sequenzen, die,
wenn sie exprimiert werden, biologisch aktive Alphavirus-Nichtstrukturproteine
(z. B. nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) codieren, und eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz
(im Hintergrund auch als 3'-CSE
bezeichnet). Zusätzlich
kann die Vektorsequenz auch einen viralen subgenomischen „Verbindungsregion"-Promotor, der in
bestimmten Ausführungsformen
modifiziert sein kann, um die virale Transkription des subgenomischen
Fragments zu verhindern, zu erhöhen
oder zu reduzieren, Sequenzen von einem oder mehreren Strukturprotein-Genen
oder Teile davon, fremde(s) Nucleinsäuremolekül(e), die (das) von einer ausreichenden
Größe sind
(ist), um eine optimale Amplifizierung zu erlauben, eine heterologe
Sequenz, die exprimiert werden soll, eine oder mehrere Restriktionsstellen
für die
Insertion von heterologen Sequenzen sowie eine Polyadenylierungssequenz
einschließen.
Das eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssystem kann auch
Spleiß-Erkennungssequenzen,
eine katalytische Ribozym-Prozessierungssequenz, ein nukleäres Exportsignal
und eine Transkriptions-Terminierungssequenz enthalten. In bestimmten
Ausführungsformen
kann die in vivo-Synthese der Vektor-Nucleinsäuresequenz aus cDNA durch die
Verwendung eines induzierbaren Promotors reguliert werden.
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„Alphavirus-cDNA-Vektorkonstrukt” bezieht
sich auf eine Anordnung, die zum Lenken der Expression einer Sequenz
(von Sequenzen) oder eines Gens (von Genen) von Interesse in der
Lage ist. Das Vektorkonstrukt umfasst eine 5'-Sequenz, die zum Initiieren der Transkription
einer Alphavirus-RNA in der Lage ist (auch als 5'-CSE
bezeichnet), sowie Sequenzen, die, wenn sie exprimiert werden, biologisch
aktive Alphavirus-Nichtstrukturproteine (z. B. nsP1, nsP2, nsP3,
nsP4) codieren, und eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz
(im Hintergrund auch als 3'-CSE bezeichnet).
Zusätzlich
sollte das Vektorkonstrukt einen 5'-Promotor, der zum Initiieren der Synthese
von viraler RNA aus cDNA in vitro in der Lage ist, und eine 3'-Sequenz einschließen, die die Transkriptions-Terminierung
kontrolliert. In bestimmten Ausführungsformen
kann das Vektorkonstrukt weiterhin einen viralen subgenomischen „Verbindungsregion"-Promotor umfassen,
der in bestimmten Ausführungsformen
modifiziert sein kann, um die virale Transkription des subgenomischen
Fragments zu verhindern, zu erhöhen
oder zu reduzieren. Der Vektor kann auch Sequenzen von einem oder
mehreren Strukturprotein-Genen oder Teile davon, fremde(s) Nucleinsäuremolekül(e), die
(das) von ausreichender Größe sind
(ist), um die Produktion von lebensfähigem Virus zu ermöglichen,
eine heterologe Sequenz, die exprimiert werden soll, eine oder mehrere
Restriktionsstellen für
die Insertion von heterologen Sequenzen, Spleiß-Erkennungssequenzen, eine katalytische
Ribozym-Prozessierungssequenz, ein nukleares Exportsignal sowie
eine Polyadenylierungssequenz einschließen. In bestimmten Ausführungsformen
kann die in vivo-Synthese von viraler RNA aus cDNA durch die Verwendung
eines induzierbaren Promotors reguliert werden.
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"Gen-Abgabevehikel" bezieht sich auf
ein Konstrukt, das verwendet werden kann, um ein Gen oder eine Sequenz
von Interesse abzugeben. Repräsentative
Beispiele schließen
Alphavirus-RNA-Vektor-Replikons, Alphavirus-Vektorkonstrukte, eukaryontische
geschichtete Vektorinitiationssysteme und rekombinante Alphaviruspartikel
ein.
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Zahlreiche
Aspekte und Vorteile der Erfindung werden für Fachleute bei Inbetrachtziehen
der folgenden detaillierten Beschreibung, die eine Erhellung der
Praxis der Erfindung liefert, ersichtlich werden.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Wie
oben angemerkt, liefert die vorliegende Erfindung neue Gen-Abgabevehikel, einschließlich zum Beispiel
RNA-Vektor-Replikons, Alphavirus-Vektorkonstrukte,
eukaryontischer geschichteter Vektorinitiationssysteme und rekombinanter
Alphaviruspartikel. Kurz, das Einbringen von Plasmid-DNA-, in vitro-transkribierten RNA-
oder partikelbasierten Vektoren der vorliegenden Erfindung in eine
Zelle resultiert in Spiegeln der heterologen Genexpression, die
im Vergleich zu den Expressionsspiegeln der Wildtyp-abgeleiteten
alphaviralen Vektoren äquivalent
oder höher
sind. Unerwarteterweise ist jedoch der Spiegel der synthetisierten
vektorspezifischen RNA in kultivierten Zellen, die ein Gen-Abgabevehikel
der vorliegenden Erfindung enthalten, mindestens etwa 5- bis 10-fach
niedriger im Vergleich zu Wildtyp-abgeleiteten Vektoren. Darüber hinaus
zeigen solche Gen-Abgabevehikel
im Vergleich zu Wildtyp-abgeleiteten Vektoren eine reduzierte, verzögerte oder
keine Inhibition der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese
nach dem Einbringen in eine Wirtszelle.
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Wie
unten detaillierter diskutiert wird, betrifft die vorliegende Erfindung:
(A) Quellen von Wildtyp-Alphaviren, die zum Konstruieren der Gen-Abgabevehikel
der vorliegenden Erfindung geeignet sind; (B) Verfahren zum Selektieren
von Alphaviren mit einem erwünschten
Phänotyp;
(C) Konstruktion von Alphavirus-Vektorkonstrukten
und Alphavirus-RNA-Vektor-Replikons; (D) Konstruktion von eukaryontischen
geschichteten Vektorinitiationssystemen; (E) Konstruktion von rekombinanten
Alphaviruspartikeln; (F) heterologe Sequenzen, die durch die Gen-Abgabevehikel der
vorliegenden Erfindung exprimiert werden können; (G) Konstruktion von
Alphavirus-Verpackungs- oder Helfer-Zelllinien; (H) Arzneimittel;
und (I) Verfahren zum Anwenden von Alphavirus-basierenden Vektoren.
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A. Quellen des Wildtyp-Alphavirus
-
Wie
oben angemerkt, liefert die vorliegende Erfindung eine breite Vielfalt
von Alphavirus-basierten Vektoren (z. B. RNA-Vektor-Replikons, Alphavirus-Vektorkonstrukte,
eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme und rekombinante
Alphaviruspartikel) sowie Verfahren zum Anwenden solcher Vektorkonstrukte
und Partikel. Kurz, Sequenzen, die Wildtyp-Alphaviren codieren,
die für
die Verwendung im Herstellen der oben beschriebenen Vektoren geeignet
sind, können
leicht in Anbetracht der hierin gelieferten Offenbarung aus natürlich vorkommenden
Quellen oder von Hinterlegungsstellen (z. B. der American Type Culture
Collection, Rockville, Maryland) erhalten werden. Zusätzlich können Wildtyp-Alphaviren zum Vergleichen
des Spiegels der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese in Zellen, die mit
dem Wildtyp-Alphavirus infiziert wurden, mit dem Spiegel der wirtszellgelenkten
Makromolekülsynthese
in Zellen, die die Gen-Abgabevehikel
der vorliegenden Erfindung enthalten, verwendet werden.
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Repräsentative
Beispiele von geeigneten Alphaviren schließen Aura-Virus (ATCC VR-368),
Bebaru-Virus (ATCC VR-600, ATCC VR-1240), Cabassou-Virus (ATCC VR-922),
Chikungunya-Virus (ATCC VR-64, ATCC VR-1241), östliches Pferde-Encephalomyelitis-Virus
(ATCC VR-65, ATCC VR-1242), Fort Morgan-Virus (ATCC VR-924), Getah-Virus
(ATCC VR-369, ATCC VR-1243), Kyzylagach-Virus (ATTC VR-927), Mayaro-Virus
(ATCC VR-66, ATCC VR-1277), Middelburg-Virus (ATCC VR-370), Mucambo-Virus
(ATCC VR-580, ATCC VR-1244), Ndumu-Virus (ATCC VR-371), Pixuna-Virus
(ATCC VR-372, ATCC VR-1245), Ross River-Virus (ATCC VR-373, ATCC
VR-1246), Semliki Forest-Virus (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), Sindbis-Virus
(ATCC VR-68, ATCC VR-1248; siehe auch CMCC #4640, unten beschrieben),
Tonate-Virus (ATCC VR-925), Triniti-Virus (ATCC VR-469), Una-Virus
(ATCC VR-374), Venezuelanisches Pferde-Encephalomyelitis-Virus (ATCC VR-69,
ATCC VR-923, ATCC VR-1250, ATCC VR-1249, ATCC VR-532), westliches
Pferde-Encephalomyelitis-Virus
(ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), Whataroa-Virus (ATCC VR-926)
und Y-62-33-Virus (ATCC VR-375) ein.
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Zu
Zwecken des Vergleichens von Spiegeln der zellulären Makromolekülsynthese
können
die folgenden Plasmide auch als eine Standardquelle von Wildtyp-Alphavirus-Beständen verwendet
werden. Diese Plasmide schließen
ein: für
das Semliki Forest-Virus pSP6-SFV4 (Liljestrom et al., J. Virol.
65: 4107-4113, 1991); für
das Venezuelanische Pferde-Encephalitisvirus pV2000 (Davis et al.,
Vir. 183: 20-31, 1991); für
das Ross River-Virus pRR64 (Kuhn et al., Vir. 182: 430-441, 1991).
Kurz, für
diese Plasmide kann das Virus von BHK-Zellen, die mit in vitro-transkribierter genomischer
RNA von dem Plasmid transfiziert wurden, erhalten werden. Für das Sindbis-Virus
kann das infektiöse
Virus von BHK-Zellen, die mit pVGELVIS (ATCC Nr. 75891)-Plasmid-DNA
transfiziert wurden, direkt isoliert oder alternativ als ein Wildtyp-Virusbestand
erhalten werden (siehe Hinterlegungsinformation, die unten in Bezug
auf ATCC Nr. VR-2526 geliefert wird).
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B. Selektion von Alphaviren mit einem
erwünschten
Phänotyp
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Die
Dauer der heterologen in vivo-Genexpression von Alphavirus-basierten
Vektoren wird durch einige Mechanismen beeinflusst, einschließlich Inhibition
der wirtszellgerichteten Makromolekülsynthese. Vor der vorliegenden
Erfindung hatte es jedoch kein offensichtliches Verfahren gegeben,
um auf codierende oder nicht-codierende
viralspezifische Vektorsequenzänderungen
zu selektieren oder diese zu identifizieren, die in einem nicht-cytopathischen
Phänotyp
resultieren. Daher werden in einem Aspekt der vorliegenden Offenbarung
Verfahren zum Isolieren und/oder Konstruieren von Alphavirus-abgeleiteten
Gen-Abgabevehikeln mit reduzierter oder ohne Inhibition der wirtszellgelenkten
Makromolekülsynthese
offenbart.
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1. Biologische Selektion von Virusvarianten
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a. Selektion aus Virusbeständen, die
DI-Partikel enthalten
-
Ein
Ansatz zum Isolieren von nicht-cytopathischen Alphavirusvarianten
nutzt das Vorliegen von defekten interferierenden (DI) Partikeln
in Wildtyp-Virus-Präparaten
aus. Kurz, obwohl bestimmte RNA-Viren, zum Beispiel Rhabdoviren
(z. B. vesikuläres
Stomatitisvirus) und Alphaviren (z. B. Sindbis-Virus und Semliki
Forest-Virus), hochgradig
cytopathisch sind, können
sie nichtsdestotrotz eine persistente Langzeit-Infektion in kultivierten
Zellen in der Anwesenheit von DI-Partikeln etablieren. DI-Partikel
werden definitionsgemäß vom Wildtyp-Virus
abgeleitet und enthalten eine oder mehrere Mutationen (z. B. Deletionen,
Umlagerungen, Nucleotid-Substitutionen,
usw.) vom Wildtyp-Genom, die die autonome Replikation durch das
DI verhindern. Im Allgemeinen ist das Genom der DI-Partikel kleiner
und von einer geringeren Komplexität im Vergleich zum Wildtyp-Virus,
und Protein-codierende Regionen sind deletiert, wohingegen Regionen
bewahrt werden, die für
die Replikation in cis benötigt
werden. Solche cis-Sequenzen sind oft verdoppelt und/oder umgelagert.
Im Fall von bestimmten Alphaviren (z. B. Sindbis-Virus) sind die
Sequenz und die Organisation der DI-RNA-Genome analysiert worden,
und es wurde gefunden, dass sie zusätzlich zu der viralen Sequenz
ein Minimum von 50 nt des äußersten
3'-Endes des Wildtyp-Virusgenoms
und an ihren 5'-Enden
entweder eine Wildtyp-Sequenz oder eine zelluläre tRNA (z. B. tRNA)-Sequenz
enthalten. In allen Fällen
erfordert die Vermehrung und Bewahrung der mutierten DI-Genome die
Co- Existenz eines
Eltern-Helfervirus in der infizierten Zelle. Dennoch ist die DI-Genomreplikation
als ein Ergebnis ihrer genetischen Struktur erheblich überlegen
und vergleichbar abundant gegenüber
seinem Wildtyp-Gegenstück.
Dieses Charakteristikum resultiert in einer Interferenz der Wildtyp-Genomreplikation,
dem Fehlen einer oder einem niedrigen Spiegel der Produktion von
infektiösem
Virus und der Etablierung einer persistenten Langzeit-Infektion
von Zellen.
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Daher
liefert die Fähigkeit,
eine persistente Langzeit-Infektion in permissiven Zellen (z. B.
Säugerzellen,
einschließlich
Zellen von menschlichem Ursprung) zu etablieren, wie unten in den
Beispielen 1 und 2 gezeigt, durch Infizieren mit einem gemischten
Alphavirusbestand, der eine Population von DI-Partikeln enthält, einen
Mechanismus, um im Laufe der Zeit vollkommen intakte Virusvarianten
zu isolieren, die in der Lage sind, sogar in der Abwesenheit von
DI-Partikeln eine persistente Infektion zu etablieren. Solche infektiösen Virusvarianten
können
von persistent infizierten Langzeitkulturen durch mehrere Runden
einer Plaque-Reinigung isoliert werden, und es ist gefunden wurden,
dass sie in den Wirtszellen eine produktive, persistente und nicht-cytopathische
Infektion initiieren. Darüber
hinaus ist der Spiegel des varianten Virus, das von solch einer
produktiven, persistenten und nicht-cytopathischen Infektion produziert
wird, nicht unterscheidbar von der Wildtyp-Virusinfektion. Diese Beobachtung ist
in deutlichem Kontrast zu der früheren
Voraussetzung für
die Etablierung von persistenten Infektionen mit Virusbeständen, die
ein Gemisch von DI-Partikeln enthalten.
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b. Selektion aus Virusbeständen, die
keine DI-Partikel enthalten
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Zusätzlich zur
Selektion aus Virusbeständen,
die defekte interferierende Partikel enthalten, können Virusvarianten,
die für
die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, von
gereinigten Virusbeständen
(ohne DI Partikel) erhalten werden, die entweder vor der Infektion
von empfänglichen
kultivierten Zellen einer zufälligen
Mutagenese ausgesetzt wurden oder denen erlaubt wurde, während der
RNA-Replikation mit den kultivierten Zellen nichtspezifische Mutationen
herzustellen. Kurz, der anfängliche
Virusbestand kann als ein natürliches
Isolat oder eine biologische Variante, die davon abgeleitet wurde,
erhalten werden oder kann durch Transfizieren von kultivierten Zellen
mit einem infektiösen
Nucleinsäuremolekül, das einen
genomischen cDNA-Clon oder eine in vitro-transkribierte RNA umfasst,
hergestellt werden. Wenn erwünscht,
kann der Virusbestand dann einer physikalischen oder chemischen
Mutagenese ausgesetzt werden (obwohl es bevorzugt wird, dass solch
eine Mutagenese nicht erforderlich ist). Im Fall einer chemischen
Mutagenese verwenden bevorzugte Ausführungsformen vor der Virus-Infektion
ein leicht verfügbares
mutagenes Agens, zum Beispiel salpetrige Säure, 5-Azacytidin, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
oder Ethylmethansulfonat (Sigma, St. Louis, MO). Nach der zufälligen Mutagenese
werden spezifische Selektionsvorgehensweisen angewendet, um die Virusvarianten
zu isolieren, die den gewünschten
Phänotyp
besitzen, wie detaillierter unten in Beispiel 2 beschrieben.
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2. Genetische Selektion von Virusvarianten
-
In
einem verwandten Ansatz können
Mutationen nicht unter Verwendung eines Virusbestands, sondern vielmehr
unter Verwendung von clonierter genomischer cDNA des Virus, das
danach verwendet werden kann, um infektiöse virale RNA in vitro (zum
Beispiel Sindbis-Virus (Rice et al., J. Virol. 61: 3809-3819, 1987; Dubensky
et al., J. Virol. 70: 508-519, 1996, SFV (Liljeström et al.,
J. Virol. 65: 4107-4113, 1991, VEE (Davis et al., Virology 183:
20-31, 1991), Ross River-Virus (Kuhn et al., Virology 182: 430-441,
1991), Poliovirus (Van Der Werf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83: 2330-2334, 1984)) oder in vivo zu transkribieren (Sindbis-Virus (Dubensky
et al., ebd.), Poliovirus (Racaniello und Baltimore, Science 214:
916-919, 1981)), erhalten werden. Kurz, die infektiöse Nucleinsäure wird
in empfängliche
kultivierte Zellen (z. B. Säugerzellen,
einschließlich
Zellen von menschlichem Ursprung) entweder direkt oder nach einer
Mutagenese unter Verwendung eines der oben in Bezug genommenen Verfahren
eingebracht. Alternativ kann die Vektor-Nucleinsäure anfänglich in Partikel verpackt
werden, und die Partikel können
verwendet werden, um den Vektor für eine Selektion in die Zielzell-Population
abzugeben. Danach werden spezifische Selektionsvorgehensweisen angewendet,
um die Virusvarianten zu isolieren, die den gewünschten Phänotyp besitzen, und diese sind
unten beschrieben.
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In
bestimmten Aspekten kann eine zufällige Mutagenese anfänglich durch
Vermehrung des Plasmids, das die virale cDNA im XL1-Red-Stamm von
E. coli (Stratagene, San Diego, Ka.) enthält, dem drei der primären DNA-Reparatur- Signalwege fehlen,
die aus mutS-, mutD- und mutT-Mutationen resultieren, durchgeführt werden.
Dennoch können
andere Mutagenese-Vorgehensweisen leicht unter Verwendung von veröffentlichten Protokollen
substituiert werden, einschließlich,
aber nicht limitiert auf Linker-Scanning-Mutagenese (Haltiner et
al., Nucleic Acids Res. 13: 1015, 1985; Barany, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82: 4202, 1985), zufällige
Oligonucleotid-gelenkte Mutagenese (Kunkel et al., Methods Enzymol.
155: 166, 1987; Zoller und Smith, Methods Enzymol. 154: 329, 1987;
Hill et al., Methods Enzymol. 155: 558, 1987; Hermes et al., Gene
84: 143, 1989) und PCR-Mutagenese
(Herlitze und Koenen, Gene 91: 143, 1990). Die resultierende gemischte
Population von mutierten cDNA-Clonen wird direkt oder nach einer
Transkription in vitro in empfängliche
kultivierte Zellen eingebracht. Eine Anreicherung von transfizierten
Zellen, die das mutierte Virus des erwünschten Phänotyps enthalten, wird basierend
auf einer erhöhten Überlebenszeit
gegenüber
den Wildtyp-Virus-infizierten Zellen erreicht, wie unten beschrieben.
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3. Genetische Selektion von Varianten
unter Verwendung von Virus-abgeleiteten
Vektoren
-
In
einem anderen Ansatz können
Mutationen in jeder Region eines Virus-abgeleiteten Expressionsvektors, einschließlich der
regulatorischen, nicht-translatierten
Regionen oder der Protein-codierenden Gen-Regionen, hergestellt
werden. Zum Beispiel werden in einem Aspekt dieser Offenbarung Verfahren
zum Selektieren von viralen Varianten mit reduzierter oder ohne
Inhibition der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese offenbart, umfassend
die Schritte von: (a) Einbringen eines eukaryontischen geschichteten
Vektorinitiationssystems, eines RNA-Vektor-Replikons oder eines
rekombinanten Alphaviruspartikels, das die Expression eines immunogenen
Zelloberflächenproteins
lenkt (geeignet für
den Nachweise von Vektor-enthaltenden Zellen), oder alternativ eines
selektierbaren Markers (entweder eines Wirkstoff- oder nicht-Wirkstoff-Markers,
wobei nicht-Vektor-enthaltende
Zellen bei Zugabe zum Beispiel eines Wirkstoffs wie Neomycin, Hygromycin, Phleomycin,
gpt, Puromycin oder Histidinol getötet werden), in eine Zelle;
(b) Inkubieren oder Kultivieren der Zellen unter Bedingungen und
für einen
Zeitraum, der ausreicht, um Vektor-enthaltende Zellen, die den erwünschten
Phänotyp
zeigen, zu selektieren; gefolgt von (c) Isolieren der Zellen, die
den Vektor des erwünschten
Phänotyps
enthalten, und (d) Analyse des Vektors auf die zugrunde liegende
Mutation.
-
Wie
oben angemerkt, können
die viralen Vektoren von einer breiten Vielfalt von Viren abstammen
(z. B. Sindbis-Virus (Xiong et al., Science 243: 1188-1191, 1989;
Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2679-2683, 1992; Schlesinger,
Trends Biotechnol. 11: 18-22, 1993; Dubensky et al., ebd.), Semliki
Forest-Virus (Liljestrom und Garoff, Bio/Technology 9: 1356-1361,
1991), Venezuelanisches Pferde-Encephalitisvirus (Davis et al.,
J. Cell. Biochem. Suppl. 19A: 310, 1995), Poliovirus (Choi et al.,
J. Virol. 65: 2875-2883, 1991; Ansardi et al., Cancer Res. 54: 6359-6364,
1994; und Andino et al., Science 265: 1448-1451, 1994). Repräsentative
Beispiele der oben beschriebenen Verfahren werden unten im Beispiel
2 detaillierter beschrieben.
-
4. Verwendung von viralen Varianten
-
Wie
hierin detaillierter diskutiert, können virale Varianten, die
unter Anwendung der hierin offenbarten Verfahren selektiert oder
hergestellt worden sind, angewendet werden, um eine breite Vielfalt
von rekombinanten Gen-Abgabevehikeln zu konstruieren, die den erwünschten
Phänotyp
zeigen. In bestimmten Ausführungsformen
enthält
das Gen-Abgabevehikel eine Mutation im Leu-Xaa-Pro-Gly-Gly („LXPGG")-Motiv des nsP2-Gens.
Kurz, bei Alphaviren, wobei die veröffentlichte Sequenz des nsP2-Gens
erhältlich
ist, wird ein hochgradig konserviertes Aminosäuremotiv -Leu-Xaa-Pro-Gly-Gly-
(„LXPGG") beobachtet. Wie
durch Standard-Protein-Modellierungsalgorithmen (Chou und Fasman,
Adv. Enzym. 47: 45-148, 1978) vorhergesagt, umfassen die Reste dieses
Motivs möglicherweise
eine β-Schleife
in der Struktur. Prolin 726 von nsP2 ist im Sindbis-Virus der zentrale
Rest dieses Motivs. Das entsprechende Motiv in anderen Alphaviren
wird in der Tabelle unten illustriert.
-
-
- *Alphavirusstämme
mit veröffentlichten
nsP2-Sequenzen: (1) Strauss et al., Virology 133: 92-110, 1984; (2) Simpson
et al., Virology 222: 464-469 1996; (3) Shirako et al., Virology
182: 753-764, 1991; (4) Rumenapf et al., Virology 208: 621-633,
1995; (5) Takkinen, Nucleic Acids Res. 14: 5667-5682, 1986; (6)
Kinney et al., Virology 170: 19-30, 1989; und (7) Faragher et al.
Virology 163: 509-526, 1988.
-
Daher
werden in verschiedenen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung Gen-Abgabevehikel geliefert, worin das
Gen-Abgabevehikel ein nsP2-Gen mit einer Mutation im LXPGG-Motiv
enthält.
In einer Ausführungsform
ist das Leu-Codon
zu einer anderen Aminosäure
mutiert, ausgewählt
aus der Gruppe, die aus Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu,
Glx, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val
oder einer anderen seltenen oder Nichtprotein-Aminosäure besteht
(siehe z. B. Lehninger, Biochemistry, Worth Publishers, Inc., N.
Y. N. Y., 1975). In einer anderen Ausführungsform ist das Pro-Codon
zu einer anderen Aminosäure
mutiert, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln,
Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr,
Val oder einer anderen seltenen oder Nichtprotein-Aminosäure. In
anderen Ausführungsformen
können
eines oder beide der Gly-Codons zu einer anderen Aminosäure mutiert sein,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln,
Glu, Glx, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr,
Val. oder einer anderen seltenen oder Nichtprotein-Aminosäure. In
noch anderen Ausführungsformen
können
die Xaa-Aminosäure
oder die Aminosäuren
zwischen 1 und 3 Reste stromaufwärts
oder stromabwärts
des LXPGG-Motivs von der Wildtyp-Aminosäure mutiert sein, um den Phänotyp des
resultierenden Gen-Abgabevehikels zu bewirken. In bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung kann das LXPGG-Motiv mutiert sein, um mehr als eine Codonveränderung
oder alternativ eine oder mehrere Codon-Insertionen oder -Deletionen
zu enthalten.
-
C. Alphavirus-Vektorkonstrukte und Alphavirus-RNA-Vektor-Replikons
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Wie
oben angemerkt, liefert die vorliegende Erfindung sowohl DNA- als
auch RNA-Konstrukte, die von Alphaviren stammen. Kurz, in einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Alphavirus-Vektorkonstrukte geliefert,
umfassend einen 5'-Promotor,
der die Synthese der viralen RNA aus cDNA in vitro initiiert, eine
5'-Sequenz, die
die Transkription von Alphavirus-RNA initiiert, ein Nucleinsäuremolekül, das alle
vier alphaviralen Nichtstrukturproteine, einschließlich eines
veränderten
nsP2-Gens, wie oben beschrieben, funktionell codiert, eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz
und einen 3'-Polyadenylat-Bereich. In anderen
Aspekten werden RNA-Vektor-Replikons geliefert, umfassend eine 5'-Sequenz, die die
Transkription von Alphavirus-RNA initiiert, ein Nucleinsäuremolekül, dass
alle vier alphaviralen Nichtstrukturproteine, einschließlich der oben
diskutierten veränderten
nsP2-Gene, funktionell codiert, eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz und
einen 3'-Polyadenylat-Bereich.
Die obigen Konstrukte umfassen weiterhin eine virale Verbindungsregion.
Jeder dieser Aspekte wird unten detaillierter diskutiert.
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1. 5'-Promotoren,
die die Synthese von viraler RNA initiieren
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Wie
oben angemerkt, werden in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung
Alphavirus-Vektorkonstrukte geliefert, die 5'-Promotoren enthalten, die (z. B. DNA-abhängige RNA-Polymerase-Promotoren)
die Synthese von viraler RNA aus cDNA durch einen Vorgang der in
vitro-Transkription initiieren. In bevorzugten Ausführungsformen
schließen
solche Promotoren zum Beispiel die Bakteriophage; T7-, T3- und SP6-RNA-Polymerase-Promotoren
ein. In ähnlicher
Weise werden eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme geliefert
(z. B. DNA-abhängige
RNA-Polymerase-Promotoren), die 5'-Promtoren enthalten, die die Synthese von
viraler RNA aus cDNA in vivo (d. h. in einer Zelle) initiieren.
In bestimmten Ausführungsformen
können solche
RNA-Polymerase-Promotoren (entweder für Alphavirus-Vektorkonstrukte
oder eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme) sowohl
von prokaryontischen als auch eukaryontischen Organismen abgeleitet
werden und schließen
zum Beispiel die bakteriellen β-Galactosidase- und
trpE-Promotoren und die eukaryontischen viralen Affenvirus 40 (SV40)-
(z. B. früh
oder spät),
Cytomegalievirus(CMV)- (z. B. sehr früh), murinen Moloney Leukämievirus
(MOMLV)- oder Rous-Sarcomvirus(RSV)-LTR- und Herpes simplex Virus (HSV)-(Thymidinkinase)-Promotoren
ein.
-
2. Sequenzen, die die Transkription initiieren
-
Wie
oben angemerkt, enthalten die Alphavirus-Vektorkonstrukte und RNA-Vektor-Replikons
der vorliegenden Erfindung in bevorzugten Ausführungsformen eine 5'-Sequenz, die zum
Initiieren der Transkription einer Alphavirus-RNA in der Lage ist
(auch als 5'-End-CSE
oder 5'-cis-Replikationssequenz
bezeichnet). Repräsentative
Beispiele von solchen Sequenzen schließen die Nucleotide 1-60 und
zu einem geringeren Grad die Nucleotide durch die Basen 150-210
des Wildtyp-Sindbis-Virus,
die Nucleotide 10-75 für
tRNA
Asp (Asparginsäure, Schlesinger et al.,
US-Patent Nr. 5,091,309 )
und die 5'-Sequenzen
von anderen Alphaviren, die eine Transkription initiieren, ein.
Es ist das Komplement dieser Sequenzen, das dem 3'-Ende der genomischen Minus-Strang-Kopie
entspricht, wobei die Sequenzen durch den nsP-Replikase-Komplex
und möglicherweise zusätzliche
Wirtszell-Faktoren gebunden werden, von denen die Transkription
der genomischen Positivstrang-RNA initiiert wird.
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3. Alphavirus-Nichtstrukturproteine
-
Die
Alphavirus-Vektorkonstrukte und RNA-Vektor-Replikons, die hierin
geliefert werden, benötigen auch
Sequenzen, die alle vier alphaviralen Nichtstrukturproteine, einschließlich eines
veränderten
nsP2-Gens, das den oben diskutierten erwünschten Phänotyp liefert, codieren. Kurz,
eine breite Vielfalt von Sequenzen, die Alphavirus-Nichtstrukturproteine
codieren, können
zusätzlich
zu jenen, die ausdrücklich
hierin geliefert werden, in der vorliegenden Erfindung angewendet
werden und sollen daher angesehen werden, dass sie in den Rahmen
des Ausdrucks „Alphavirus-Nichtstrukturproteine" fallen. Zum Beispiel
kann aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes mehr als
ein Codon eine gegebene Aminosäure
codieren. Daher kann eine breite Vielzahl von Nucleinsäuresequenzen,
die Alphavirus-Nichtstrukturproteine codieren, hergestellt werden. Darüber hinaus können Aminosäure-Substitutionen,
-Additionen oder -Deletionen an jeder von zahlreichen Positionen
noch funktionelle oder biologisch aktive Nichtstrukturproteine bereitstellen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gelten Alphavirus-Nichtstrukturproteine
als biologisch aktiv, wenn sie die Selbstreplikation des Vektorkonstrukts
fördern,
d. h. die Replikation von viralen Nucleinsäuren und nicht notwendigerweise
die Produktion von infektiösem
Virus, und können
leicht durch metabolisches Markieren oder RNase-Protektionstests,
die über
einen Zeitverlauf durchgeführt
werden, bestimmt werden. Verfahren zum Herstellen von solchen Derivaten
werden angesichts der hierin bereitgestellten Offenbarung leicht
durch einen Fachmann erreicht.
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Alphaviren
exprimieren vier Nichtstrukturproteine, bezeichnet als nsp1, nsp2,
nsp3 und nsp4. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung, die von
Alphaviren stammen, sollten Sequenzen enthalten, die die vier Nichtstrukturproteine
codieren. Im Wildtyp-Sindbis-Virus werden die Nichtstrukturproteine
1-3 durch die Nucleotide 60 bis 5747 codiert, während nsP4 durch die Nucleotide
5769 bis 7598 codiert wird (siehe 1). Die Nichtstrukturproteine
werden von der genomischen Positivstrang-RNA als eines von zwei großen Polyproteinen,
bekannt als P123 beziehungsweise P1234 translatiert, abhängig davon,
(i) ob es ein Opal-Terminierungs-Codon zwischen den codierenden
Regionen von nsP3 und nsP4 gibt und (ii) ob solch ein Opal-Codon vorhanden
ist, ob es eine Translations-Terminierung des entstehenden Polypeptids
an jenem Punkt oder ein Durchlesen und daher die Produktion von
P1234 gibt. Das Opal-Terminierungs-Codon ist an der nsP3/nsP4-Verbindung
der Alphaviren SIN (Stamm AR339 und der hierin beschriebene SIN-1-Stamm),
AURA, WEE, EEE, VEE und RR vorhanden, und daher werden die P123-
und P1234-Spezies
in Zellen, die mit diesen Viren infiziert sind, exprimiert. Im Gegensatz
dazu ist an der nsP3/nsP4-Verbindung der Alphaviren SIN (Stamm AR86,
SF und ONN) kein Terminierungs-Codon vorhanden, und daher wird nur
die P1234-Spezies in den Zellen exprimiert, die mit diesen Viren
infiziert sind. Sowohl das Polyprotein als auch prozessierte monomere
Formen der Nichtstrukturproteine wirken in der Replikation des Alphavirus-RNA-Genoms.
Experimente, die die Wachstums-Charakteristika von Alphavirus-Nichtstrukturprotein-Spaltungsmutanten
untersucht haben, haben darauf hingewiesen, dass die Polyproteine
in die Synthese der genomischen negativ-strängigen
RNA involviert sind, wohingegen die individuellen monomeren Proteine die
Synthese der genomischen und subgenomischen positiv-strängigen RNA-Spezies katalysieren
(Shirako und Strauss, J. Virol. 68: 1874-1885, 1994). Translationelles
Durchlesen erfolgt im Allgemeinen in etwa 10%–20% der Fälle in Zellen, die mit dem
Wildtyp-Sindbis-Virus, das das Opal-Terminierungs-Codon an der nsP3/nsP4-Verbindung
enthält,
infiziert sind. Das Verarbeiten von P123 und P1234 erfolgt durch
eine Proteinase-Aktivität,
die durch eines der Nichtstrukturproteine codiert wird, und wird
weiter unten diskutiert. Die Reihenfolge der Prozessierung, ob in
cis oder in trans, hängt
von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich des Stadiums der Infektion.
Zum Beispiel produzieren Sindbis-Virus und SFV früh in der
Infektion P123 und nsp4 und später
in der Infektion P12 und P34. Ein weiteres Prozessieren setzt dann
die individuellen Nichtstrukturproteine frei. Jedes Nichtstrukturprotein
hat einige Funktionen, wobei manche davon unten beschrieben werden.
-
a. nsP1
-
Das
Nichtstrukturprotein 1 wird für
die Initiierung der (oder das Fortsetzen der) Minusstrang-RNA-Synthese
benötigt.
Es spielt auch eine Rolle bei der Bildung der Kappenstruktur des
5'-Terminus von
genomischen und subgenomischen Alphavirus-RNAs während der Transkription, da
nsP1 sowohl eine Methyltransferase- (Mi und Stollar, Vir. 184: 423-427,
1991) als auch Guanyltransferase-Aktivität (Strauss und Strauss, Microbiol. Rev.
58(3): 491-562, 1994) besitzt. NsP1 moduliert auch die Proteinase-Aktivität von nsP2,
da Polyproteine, die nsP1 enthalten, nicht wirksam zwischen nsP2
und nsP3 spalten (de Groot et al., EMBO J. 9: 2631-2638, 1990).
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b. nsP2
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Das
Nichtstrukturprotein 2 ist ein multifunktionelles Protein, das in
die Replikation der viralen RNA und die Prozessierung des Nichtstrukturproteins
involviert ist. Es wird angenommen, dass die N-terminale Domäne des Proteins
(umspannend etwa die ersten 460 Aminosäuren) eine Helicase ist, die
in der Duplex-Entwindung während der
RNA-Replikation und Transkription aktiv ist. Die Synthese der subgenomischen
26S-mRNA, die in Vektoren gemäß der vorliegenden
Erfindung die Gene (das Gen) von Interesse codiert, erfordert funktionelles
nsP2. Die C-terminale
Domäne
von nsP2 zwischen den Aminosäureresten
460-807 des Sindbis- Virus
spaltet das Nichtstrukturprotein in trans und in cis zwischen den
nsP1/nsP2-, nsP2/nsP3- und nsP3/nsP4-Verbindungen proteolytisch.
Die Ausrichtung der primären
Sequenzen der C-terminalen Alphavirus-nsP2-Domänen legt nahe, dass nsP2 eine
Papain-ähnliche
Proteinase ist (Hardy und Strauss, J. Virol. 63: 4653-4664, 1988).
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Bis
jetzt ist anderen beobachteten Charakteristika von nsP2 keine Funktion
zugeschrieben worden, die sich direkt auf die Vermehrung von Alphaviren
bezieht. Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass nsP2 in SFV-infizierten
Zellen eng mit Ribosomen assoziiert ist und mit rRNA durch UV-Bestrahlung
vernetzt werden kann (Ranki et al., FEBS Lett. 108: 299-302, 1979).
Weiterhin sind 50% von nsP2 in der nucleären Matrix, insbesondere im
Bereich der Nucleoli von SFV-infizierten BHK-Zellen lokalisiert (Peränen et al.,
J. Virol. 64: 1888-1896, 1990). Die Lokalisierung von nsP2 in die
Nuclei erfolgt vermutlich durch aktiven Transport, da es die Größe von kleinen
Proteinen und Metaboliten (etwa 20–60 kDa), die in den Nucleus
durch Diffusion durch nucleäre
Kernkomplexe eintreten können, übersteigt
(Paine et al., Nature 254: 109-114, 1975). Mutmaßliche NLS-Sequenzen sind in
den Alphaviren SFV, SIN, RR, ONN, OCK und VEE identifiziert worden
(Rikkonen et al., Vir. 189: 462-473, 1992).
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c. nsP3
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Das
Nichtstrukturprotein nsP3 enthält
zwei deutliche Domänen,
obwohl ihre genauen Rollen in der viralen Replikation nicht gut
verstanden sind. Die N-terminale Domäne liegt in verschiedenen Alphaviren
in der Länge
im Bereich von 322 bis 329-Resten
und zeigt ein Minimum von 51% Aminosäure-Sequenzidentität zwischen
jeglichen zwei Alphaviren. Die C-terminale Domäne ist jedoch unter den bekannten
Alphaviren weder in der Länge
noch in der Sequenz konserviert, und mehrere Änderungen werden toleriert
(Li et al., Virology, 179: 416-427). Das Protein wird in Assoziation
mit Replikationskomplexen in einem stark phosphorylierten Status gefunden.
In Alphaviren, deren Genome ein Opal-Terminierungs-Codon zwischen
der nsP3/nsP4-Verbindung enthalten, werden zwei verschiedene Proteine
produziert, abhängig
davon, ob es ein Durchlesen des Opal-Terminierungssignals gibt oder
nicht. Ein Durchlesen resultiert in einem nsP3-Protein, das nach
der Spaltung des Polyproteins 7 zusätzliche carboxy-terminale Aminosäuren enthält. Es ist
klar, dass nsP3 in einer gewissen Kapazität für die virale RNA-Synthese benötigt wird,
da bestimmte Mutanten dieses Proteins RNA-negativ sind und das P123-Polyprotein
für die
Minusstrang-RNA-Synthese benötigt
wird.
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d. nsP4
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NsP4
ist die viruscodierte RNA-Polymerase und enthält das GDD-Motiv, das für solche
Enzyme charakteristisch ist (Kamer und Argos, Nucleic Acids Res.
12: 7269-7282, 1984). Daher ist nsP4 für die Alphavirus-RNA-Replikation
unentbehrlich. Die Konzentration von nsP4 wird in infizierten Zellen
streng reguliert. In den meisten Alphaviren erfordert die Translation
von nsP4 das Durchlesen eines Opal-Codons zwischen den nsP3- und
nsP4-codierenden Regionen, was im Vergleich zu anderen Nichtstrukturproteinen
in niedrigeren intrazellulären
Spiegeln resultiert. Zusätzlich
ist der Großteil
von nsP4 durch Degradierung durch den N-End Regelweg metabolisch
instabil (Gonda et al., J. Biol. Chem. 264: 16700-16712, 1989).
Dennoch ist manches nsP4 aufgrund seiner Assoziation mit Replikationskomplexen,
die Degradierungssignale verbergen, stabil. Daher kann sich die
Stabilisierung des Enzyms durch Verändern des aminoterminalen Rests
im Fördern
einer vermehrten Langzeit-Expression der Proteine, die durch die
hierin beschriebenen Vektoren codiert werden, als nützlich erweisen.
Stabilisierende aminoterminale Reste schließen Methionin, Alanin und Tyrosin
ein.
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4. Virale Verbindungsregionen
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Die
virale Alphavirus-Verbindungsregion kontrolliert normalerweise die
Transkriptions-Initiierung der subgenomischen mRNA; daher wird dieses
Element auch als der subgenomische mRNA-Promotor bezeichnet. Im
Fall des Sindbis-Virus beginnt die normale virale Verbindungsregion
typischerweise ungefähr
bei Nucleotidnummer 7579 und setzt sich bis mindestens Nucleotidnummer
7612 (und möglicherweise
darüber
hinaus) fort. Es wird angenommen, dass mindestens die Nucleotide
7579 bis 7602 (5'-ATC
TCT ACG GTG GTC CTA AAT AGT-SEQ. ID NO. 1) für die Transkription des subgenomischen
Fragments notwendig sind. Diese Region (Nucleotid 7579 bis 7602)
wird hierin nachstehend als der „minimale Verbindungsregion-Kern" bezeichnet.
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In
bestimmten Aspekten dieser Offenbarung wird die virale Verbindungsregion
inaktiviert, um die Synthese des subgenomischen Fragments zu verhindern.
Wie es im Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung angewendet
wird, bedeutet „inaktiviert", dass die Spezies,
die der subgenomischen mRNA entspricht, nicht in Autoradiogrammen
von denaturierenden Gelen von elektrophoretisch aufgetrennter RNA
beobachtet wird, die von Zellen gereinigt wurde, die diese Vektoren
enthalten und mit 1 μg/ml
Dactinomycin behandelt und mit [3H]-Uridin
markiert wurden, wie beschrieben (Frolov und Schlesinger, J. Virol.
68: 1721-1727, 1994).
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In
einer Ausführungsform
dieser Offenbarung können
die Gen-Abgabevehikel durch das Platzieren von Signalen, die entweder
ein Ribosomen-Durchlesen oder einen internen Ribosom-Eintritt unmittelbar stromabwärts des
unterdrückten
Verbindungsregion-Promotors fördern,
konstruiert werden. In dieser Vektorkonfiguration kann keine Synthese
der subgenomischen Botschaft erfolgen; die heterologen Proteine
werden jedoch von mRNA genomischer Länge entweder durch ribosomales
Durchlesen (Scanning) oder internen Ribosomen-Eintritt exprimiert.
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In
bestimmten Anwendungen der hierin beschriebenen Gen-Abgabevehikel
ist die Expression von mehr als einem heterologen Gen erwünscht. Zum
Beispiel können,
um metabolische Störungen
wie das Gaucher-Syndrom zu behandeln, mehrere Verabreichungen der
Gen-Abgabevehikel oder Partikel erforderlich sein, da die Dauer
des therapeutischen Linderungsmittels limitiert sein kann. Daher
kann es in bestimmten Aspekten dieser Offenbarung wünschenswert
sein, das Adenovirus 2-E3-Gen
in einer Zielzelle zusammen mit einem therapeutischen Linderungsmittel
wie dem Glucocerebrosidase-Gen zu co-exprimieren. Im Wildtyp-Virus
wird die polycistronische Strukturprotein (sP)-Botschaft in ein
einzelnes Polyprotein translatiert, das danach zum Teil durch die
sP-Capsid-Proteinase in individuelle Proteine prozessiert wird.
Daher erfordert die Expression von mehreren heterologen Genen von
einer polycistronischen Botschaft einen Mechanismus, der sich vom
Wildtyp-Virus unterscheidet, da die Protease-Aktivität des Capsid-sP
oder die Peptide, die für
die Spaltung erkannt werden, in der Ersatzregion der Alphavirusvektoren
nicht vorhanden sind. Daher können
in weiteren Aspekten dieser Offenbarung funktionelle Elemente, die
die Translation von mehreren unabhängigen heterologen Sequenzen,
einschließlich
des ribosomales Durchlesens, der Kappen- unabhängigen Translation, des internen
Ribosomen-Eintritts oder der minimalen Verbindungsregion-Kernsequenzen,
ermöglichen,
verwendet werden.
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5. Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz
und Poly(A)-Bereich
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Wie
oben angemerkt, sollten Alphavirus-Vektorkonstrukte oder RNA-Vektor-Replikons der vorliegenden
Erfindung auch eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz (auch „Alphavirus-Replicase-Erkennungssequenz", „3'-terminales CSE" oder „3'-cis-Replikationssequenz" genannt) einschließen. Kurz,
die Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz, die in der 3'-Endregion der genomischen
positiv-strängigen
RNA gelegen ist, liefert eine Erkennungsstelle, an der das Virus
die Replikation durch Synthese des Negativ-Strangs beginnt. Eine
breite Vielfalt von Sequenzen kann als eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz
verwendet werden. Zum Beispiel können
in einer Ausführungsform
Sindbis-Virus-Vektorkonstrukte, in denen die Polymerase-Erkennung auf die
kleinste Region, die noch als eine Erkennungssequenz wirken kann
(z. B. Nucleotide 11,684 bis 11,703), verkleinert ist, verwendet
werden. In einer anderen Ausführungsform
der Erfindung können
Sindbis-Virus-Vektorkonstrukte, in denen die gesamte nicht-translatierte
Region stromabwärts
vom E1-sP-Gen bis zum 3'-Ende
des viralen Genoms, einschließlich
der Polymerase-Erkennungsstelle (z. B. die Nucleotide 11,382 bis
11,703), verwendet werden.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung kann das Alphavirus-Vektorkonstrukt oder das RNA-Vektor-Replikon
zusätzlich
einen Poly(A)-Bereich enthalten, der den beobachteten Spiegel der
heterologen Genexpression in Zellen, die mit Alphavirus-abgeleiteten
Vektoren transfiziert sind, dramatisch steigern (siehe z. B. Dubensky
et al., vorstehend). Kurz, der Poly(A)-Bereich kann von jeder Größe sein,
die ausreicht, um die Stabilität
im Cytoplasma zu fördern,
wodurch die Wirksamkeit des Initiierens des viralen Lebenszyklus erhöht wird.
In verschiedenen Ausführungsformen
der Erfindung umfasst die Poly(A)-Sequenz mindestens 10 Adenosin-Nucleotide
und am meisten bevorzugt mindestens 25 Adenosin-Nucleotide. In einer Ausführungsform
ist die Poly(A)-Sequenz direkt an das Sindbis-Virus-Nucleotid 11,703 angeheftet.
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D. Eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme
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Aufgrund
der Größe eines
genomischen Volllängen-Alphavirus-cDNA-Clous
ist die in vitro-Transkription von mit einer Kappenstruktur versehenen
Volllängen-RNA-Molekülen ziemlich
unwirksam. Dies resultiert in einer erniedrigten Transfektionswirksamkeit,
als infektiöse
Zentren des Virus (gemessen durch Plaquebildung), im Verhältnis zur
Menge der transfizierten in vitro-transkribierten RNA. Eine solche
Unwirksamkeit ist auch relevant im Bezug auf die in vitro-Transkription von
Alphavirus-Expressionsvektoren. Das Testen von cDNA-Kandidatenclonen
und anderen Alphavirus-cDNA-Expressionsvektoren auf ihre Fähigkeit,
einen infektiösen
Zyklus zu initiieren oder die Expression einer heterologen Sequenz
zu lenken, kann daher sehr erleichtert werden, wenn ein cDNA-Clon
als ein DNA-Molekül
in empfängliche
Zellen transfiziert wird, was dann die Synthese von viraler RNA
in vivo lenkt.
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Daher
werden in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung DNA-basierte Vektoren
(als „eukaryontische
geschichtete Vektorinitiationssysteme" bezeichnet) geliefert, die zum Lenken
der Synthese von viraler RNA (genomisch oder Vektor) in vivo in
der Lage sind. Im Allgemeinen umfassen eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme
einen 5'-Promotor,
der zum Initiieren der 5'-Synthese
von RNA aus cDNA in vivo (d. h. in einer Zelle) in der Lage ist,
ein Konstrukt, das zum Lenken seiner eigenen Replikation in einer
Zelle in der Lage ist, wobei das Konstrukt auch zum Exprimieren
einer heterologen Nucleinsäuresequenz
in der Lage ist, und eine 3'-Sequenz,
die die Transkriptions-Terminierung steuert (z. B. ein Polyadenylat-Bereich). Solche
eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssysteme liefern einen
Zwei-Phasen oder „geschichteten" Mechanismus, der
die Expression von heterologen Nucleotidsequenzen kontrolliert.
Kurz, die erste Schicht initiiert die Transkription der zweiten
Schicht und umfasst einen Promotor, der zum Initiieren der 5' zu 3'-Synthese von RNA
aus cDNA in vivo in der Lage ist (z. B. einen eukaryontischen 5'-Promotor), und kann
weiterhin andere Elemente umfassen, einschließlich einer 3'-Transkriptions-Terminierungs/Polyadenylierungsstelle,
einer oder mehrerer Spleißstellen
sowie anderer nukleäre
RNA-Exportelemente, einschließlich
zum Beispiel des post-transkriptionellen Hepatitis B-Virus-Regulationselements
(PRE) (Huang et al., Mol. Cell. Biol. 13: 7476, 1993; Huang et al.,
J. Virol. 68: 3193, 1994; Huang et al., Mol. Cell. Biol., 15: 3864-3869,
1995), des konstitutiven Transportelements (CTE), des Mason-Pfizer-Affenvirus
(Brav et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1256-1260, 1994), des
responsiven HIV Rev-Elements (Malim et al., Nature 338: 254-257,
1989; Cullen et al., Trends Biochem. Sci. 16: 346, 1991) und anderer ähnlicher
Elemente, wenn erwünscht.
Repräsentative
Promotoren, die für
die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen sowohl
eukaryontische (z. B. pol I, II oder III) als auch prokaryontische
Promotoren und induzierbare oder nicht induzierbare (d. h. konstitutive)
Promotoren wie zum Beispiel die murinen Moloney-Leukämievirus-Promotoren,
Metallothionein-Promotoren,
den Glucocorticoid-Promotor, den distalen Drosophila-Actin-5C-Promotor, den SV40-Promotor,
den Hitzeschock-Protein 65-Promotor, den Hitzeschock-Protein 70-Promotor,
die Immunglobulin-Promotoren, den Maus-Polyomvirus-Promotor (Py), Rous Sarcom-Virus
(RSV), den Herpes simplex-Virus (HSV)-Promotor, die BK-Virus- und
JC-Virus-Promotoren, den Maus-Brusttumor-Virus (MMTV)-Promotor, die Alphavirus-Verbindungsregion,
den CMV-Promotor, die Adenovirus-E1- oder VA1RNA-Promotoren, die
rRNA-Promotoren, den tRNA-Methionin-Promotor,
den CaMV-35S-Promotor, den Nopalin-Synthetase-Promotor, den Tetracyclin-responsiven
Promotor und den lac-Promotor ein.
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In
noch anderen Ausführungsformen
der Erfindung können
induzierbare Promotoren verwendet werden. Zum Beispiel werden in
einer Ausführungsform
induzierbare Promotoren, die die Synthese von RNA aus DNA initiieren,
umfassend eine Kern-RNA-Polymerase-Promotorsequenz, und eine funktionell
verknüpfte
Nucleinsäuresequenz,
die die DNA-Bindung eines transkriptionellen Aktivator-Proteins lenkt, und
eine funktionell verknüpfte
Nucleinsäuresequenz,
die die DNA-Bindung
eines transkriptionellen Repressor-Proteins lenkt, bereitgestellt.
In einer weiteren Ausführungsform
ist die Nucleinsäuresequenz,
die die DNA-Bindung eines transkriptionellen Aktivator-Proteins
lenkt, eine Sequenz, die ein Tetracyclin-Repressor/VP16-Transaktivator-Fusionsprotein
bindet. In noch einer anderen Ausführungsform ist die Nucleinsäuresequenz,
die die DNA-Bindung eines Transkriptions-Repressorproteins lenkt,
eine Sequenz, die ein Lactose-Repressor/Kruppel-Domänen-Fusionsprotein
bindet.
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Die
zweite Schicht umfasst ein autokatalytisches Vektorkonstrukt, das
zum Exprimieren von einer oder mehreren heterologen Nucleotidsequenzen
und zum Lenken seiner eigenen Replikation in einer Zelle entweder
autonom oder als Antwort auf einen oder mehrere Faktoren (d. h.
induzierbar ist) in der Lage ist. Das zweite Schicht-Konstrukt ist
ein Alphavirus-Vektorkonstrukt, wie oben beschrieben.
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Eine
breite Vielfalt von Vektorsystemen kann als die erste Schicht des
eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystems verwendet
werden, einschließlich
zum Beispiel viraler Vektorkonstrukte, die von DNA-Viren entwickelt
wurden, wie jenen, die in den Poxviridae klassifiziert sind, einschließlich zum
Beispiel Kanarienpockenvirus oder Vacciniavirus (z. B. Fisher-Hoch
et al., PNAS 86: 317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N. Y. Acad.
Sci. 569: 86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8: 17-21, 1990;
US-Patent Nr. 4,603,112 ,
4,769,330 und
5,017,487 ;
WO 89/1973 ), Papoviridae wie BKV,
JCV oder SV40 (z. B. Mulligan et al., Nature 277: 108-114, 1979);
Adenoviridae wie Adenovirus (z. B. Berkner, Biotechniques 6: 616-627,
1988; Rosenfeld et al., Science 252: 431-434, 1991); Parvoviridae
wie Adeno-assoziiertes Virus (z. B. Samulski et al., J. Vir. 63:
3822-3828, 1989; Mendelson et al., Virol. 166: 154-165, 1988; PA
7/222,684), Herpesviridae wie Herpes simplex-Virus (z. B. Kit, Adv.
Exp. Med. Biol. 215: 219-236, 1989) und Hepadnaviridae (z. B. HBV)
sowie bestimmter RNA-Viren, die durch eine DNA-Zwischenstufe replizieren,
wie die Retroviridae (siehe z. B.
US-Patent
Nr. 4,777,127 ,
GB 2,200,651 ,
EP 0,345,242 und
WO 91/02805 ; Retroviridae
schließen
Leukämie-Viren
wie MoMLV und Immunschwäche-Viren
wie HIV ein, z. B. Poznansky, J. Virol. 65: 532-536, 1991).
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Die
Replikationskompetenz des autokatalytischen Vektorkonstrukts, das
in der zweiten Schicht des eukaryontischen Vektorinitiationssystems
enthalten ist, kann durch eine Vielfalt von Tests, die einer Fachperson
bekannt sind, gemessen werden, einschließlich zum Beispiel der Ribonuclease-Protektionstests,
die Anstiege sowohl von Positivsense- als auch von Negativsense-RNA
in transfizierten Zellen im Zeitverlauf in der Anwesenheit eines
Inhibitors der zellulären
RNA-Synthese wie Dactinomycin messen, und auch der Tests, die die
Synthese einer subgenomischen RNA oder die Expression eines heterologen
Reportergens in transfizierten Zellen messen.
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In
besonders bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung werden eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme
geliefert, die einen 5'-Promotor, der zum
Initiieren der in vivo-Synthese von Alphavirus-RNA aus cDNA in der
Lage ist (d. h. einen DNA-Promotor der RNA-Synthese), gefolgt von
einer 5'-Sequenz, die zum
Initiieren der Transkription einer Alphavirus-RNA in der Lage ist, einer
Nucleinsäuresequenz, die
funktionell alle vier alphaviralen Nichtstrukturproteine (einschließlich eines
veränderten
nsP2-Gens, wie oben beschrieben, das, wenn es in ein rekombinantes
Alphaviruspartikel funktionell inkorporiert wird, im erwünschten
Phänotyp
resultiert) codiert, einer Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz,
einer 3'-Sequenz,
die die Transkriptions-Terminierung/Polyadenylierung steuert, und
einer viralen Verbindungsregion verknüpft ist, die funktionell mit
einer heterologen Sequenz, die exprimiert werden soll, umfassen.
In verschiedenen Ausführungsformen
kann die virale Verbindungsregion modifiziert sein, so dass die
virale Transkription des subgenomischen Fragments eher erhöht oder
reduziert als inaktiviert ist. In anderen Ausführungsformen kann eine zweite
virale Verbindungsregion inseriert werden, die der ersten inaktivierten
viralen Verbindungsregion folgt, wobei die zweite virale Verbindungsregion
entweder aktiv oder modifiziert ist, so dass die virale Transkription
des subgenomischen Fragments erhöht
oder reduziert ist.
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Nach
der Transkription des eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystems
umfasst das resultierende Alphavirus-RNA-Vektor-Replikonmolekül eine 5'-Sequenz, die zum Initiieren der Transkription
einer Alphavirus-RNA in der Lage ist, eine Nucleotidsequenz, die
biologisch aktive Alphavirus-Nichtstrukturproteine codiert, eine
virale Verbindungsregion, eine heterologe Nucleotidsequenz, eine
Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz
und eine Polyadenylat-Sequenz.
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Verschiedene
Aspekte der Alphavirus-cDNA-Vektorkonstrukte sind oben diskutiert
worden, einschließlich
der 5'-Sequenz,
die zum Initiieren der Transkription eines Alphavirus in der Lage
ist, der Nucleotidsequenz, die Alphavirus-Nichtstrukturproteine codiert, der viralen
Verbindungsregion, einschließlich
der Verbindungsregionen, die inaktiviert worden sind, so dass die
virale Transkription des subgenomischen Fragments verhindert wird,
und der Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz.
Zusätzlich
sind auch modifizierte Verbindungsregionen und Tandem-Verbindungsregionen
oben diskutiert worden.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird das eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssystem
von einem Alphavirusvektor wie einem Sindbis-Vektorkonstrukt, das angepasst worden
ist, um in einer oder mehreren Zelllinien einer bestimmten eukaryontischen
Spezies, insbesondere einer Säugerspezies wie Menschen
zu replizieren, abgeleitet. Zum Beispiel können, wenn das Gen, das das
rekombinante Protein, das exprimiert werden soll, codiert, von menschlichem
Ursprung ist und das Protein für
eine menschliche therapeutische Verwendung vorgesehen ist, die Produktion
in einer geeigneten menschlichen Zelllinie bevorzugt werden, damit
das Protein post-translationell modifiziert wird, wie es erwartet
würde,
dass es in Menschen erfolgt. Dieser Ansatz kann im weiteren Verstärken der
rekombinanten Proteinproduktion nützlich sein (wie unten detaillierter
diskutiert). In Anbetracht der Gesamtplastizität eines alphaviralen Genoms
aufgrund der Untreue der viralen Replikase können variante Stämme mit
einer verstärkten
Fähigkeit,
eine produktive Infektion mit hohem Titer in ausgewählten eukaryontischen
Zellen (z. B. menschlichen, murinen, caninen, felinen usw.) zu etablieren,
isoliert werden. Zusätzlich
können
unter Verwendung dieses Ansatzes auch variante alphavirale Stämme isoliert
werden, die in eukaryontischen Zellen eine verstärkte Fähigkeit haben, eine persistente
Infektion mit hohem Titer zu etablieren. Alphavirus-Expressionsvektoren
können
dann aus cDNA-Clonen dieser varianten Stämme gemäß den hierin gelieferten Vorgehensweisen
konstruiert werden.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung umfasst das eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssystem
einen Promotor für
die anfängliche
alphavirale Vektortranskription, der nur in einem differenzierten
Zelltyp transkriptionell aktiv ist. Kurz, es ist gut etabliert,
dass eine alphavirale Infektion von Säugerzellen in Kultur, wie jener,
die vom Hamster (z. B. Babyhamster-Nierenzellen) oder Huhn (z. B.
Hühnerembryofibroblasten)
stammen, typischerweise in einer Cytotoxizität resultiert. Daher kann das
eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssystem, um eine stabil
transformierte oder transfizierte Wirtszelllinie zu produzieren,
in eine Wirtszelle eingebracht werden, in der der Promotor, der
die anfängliche
Vektoramplifizierung ermöglicht,
ein transkriptionell inaktiver, aber induzierbarer Promotor ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist solch ein Promotor
vom Differenzierungsstatus abhängig.
In dieser Konfiguration trifft die Aktivierung des Promotors und
die folgende Aktivierung des Alphavirus-DNA-Vektors mit der Induktion
der Zelldifferenzierung zusammen. Beim Wachstum zu einer bestimmten
Zellzahl einer solchen stabil transformierten oder transfizierten Zelllinie
wird der geeignete Differenzierungsstimulus geliefert, wodurch die
Transkription des Vektorkonstrukts und die amplifizierte Expression
des erwünschten
Gens und der codierten Polypeptide (des codierten Polypeptids) initiiert
werden. Viele solche, vom Differenzierungsstatus abhängigen Promotoren
sind Fachleuten bekannt, so wie es auch Zelllinien sind, die induziert
werden können,
um sich bei Anwendung eines spezifischen Stimulus zu differenzieren.
Repräsentative
Beispiele schließen
die Zelllinien F9 und P19, HL60 und die erythroleukämischen
Freund-Zelllinien und HEL ein, die durch Retinsäure, Pferdeserum beziehungsweise
DMSO aktiviert werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
können
solche Promotoren durch zwei getrennte Komponenten reguliert werden.
Zum Beispiel werden, wie im Beispiel 7 beschrieben, Bindungsstellen
für sowohl
einen transkriptionellen Aktivators als auch einen transkriptionellen
Repressor in einer funktionell abhängigen Weise benachbart zu
einem „Kern"-Promotor positioniert.
In dieser Konfiguration wird der nicht-induzierte Status durch Blockieren der
Fähigkeit
des transkriptionellen Aktivators, seine Erkennungsstelle zu finden,
bewahrt, während dem
transkriptionellen Repressor erlaubt wird, konstitutiv exprimiert
und an seine Erkennungsstelle gebunden zu werden. Die Induktion
wird durch Blockieren des transkriptionellen Repressors und Entfernen
der Transaktivator-Blockierung erlaubt. Zum Beispiel kann ein Tetracyclin-responsives
Promotorsystem (Gossen und Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 5547-5551,
1992) für
eine induzierbare Transkription einer Alphavirusvektor-RNA verwendet werden.
In diesem System stimuliert die Expression eines Tetracyclin-Repressors
und einer HSV-VP16-Transaktivator-Domäne als ein „Fusions" protein (rTA) die in vivo-Transkription
der Alphavirusvektor-RNA durch spezifisches Binden an eine Tetracyclin-Operator-Sequenz
(tetO), die unmittelbar benachbart zu einem minimalen „Kern"-Promotor (zum Beispiel
CMV) liegt. Der Bindungs- und Transaktivierungsvorgang wird durch
die Anwesenheit von Tetracyclin reversibel blockiert und kann durch
Entfernen von Tetracyclin aus den Kulturmedien „angeschaltet" werden. Da die nicht-induzierten
Grundspiegel der Transkription unter den verschiedenen Zelltypen
variieren werden, können
andere verschiedene minimale Kern-Promotoren (zum Beispiel HSV-tk)
mit den Tetracyclin-Operator-Sequenzen
verknüpft
werden, vorausgesetzt, dass die Transkriptionsstartstelle bekannt
ist, um eine Nebeneinanderstellung bei dem oder in der unmittelbaren
Nähe des Alphavirus-Vektornucleotid(s)
1 zu ermöglichen.
-
Der
rTA-Transaktivator kann durch eine zusätzliche Expressionskassette,
die auch stabil in dieselbe Zelllinie transformiert ist, bereitgestellt
werden; und in bestimmten Ausführungsformen
kann die rTA-Expressionskassette selbst autoregulatorisch sein.
Die Verwendung einer autoregulatorischen rTA-Expressionskassette umgeht potenzielle
Toxizitätsprobleme,
die mit konstitutiver Expression in hohem Spiegel von rTA durch
Verknüpfen
der Expression mit einer transkriptionellen Kontrolle durch denselben
tetO-verknüpften
Promotor, an den rTA selbst bindet, assoziiert sind. Dieser Typ
des Systems kreiert einen negativen Rückkopplungs-Zyklus, der sicherstellt,
dass sehr wenig rTA in der Anwesenheit von Tetracyclin produziert
wird, wird aber hochgradig aktiv, wenn das Tetracyclin entfernt
wird. Solch eine autoregulatorische rTA-Expressionskassette wird
im Plasmid pTettTAk geliefert (Shockett et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 92: 6522-6526, 1995).
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Für eine transkriptionelle
Repression kann auch die KRAB-Repressionsdomäne von bestimmten
Zinkfinger-Proteinen verwendet werden. Kurz, KRAB (Krüppel-assoziierte
Box)-Domänen
sind hochkonservierte Sequenzen, die in den aminoterminalen Regionen
von mehr als einem Drittel aller Krüppel-Klasse-Cys2His2-Zinkfinger-Proteine vorhanden sind. Die
Domänen
enthalten zwei vorhergesagte amphipathische α-Helices, und es ist gezeigt
worden, dass sie als DNA-Bindungs-abhängige transkriptionelle RNA-Polymerase
II-Repressoren wirken (zum Beispiel Licht et al., Nature 346: 76-79,
1990). Wie andere Transkriptionsfaktoren sind die aktive Repressionsdomäne und die
DNA-Bindungsdomäne verschieden
und trennbar. Daher kann die Repressionsdomäne als ein Fusionsprotein für das Targeting
mit jedem Sequenz-spezifischen DNA-Bindungsprotein verknüpft werden.
Daher kann die DNA-Bindungsprotein-Komponente in einer regulierbaren Weise
reversibel von der Bindung abgehalten werden, wodurch das transkriptionelle
Silencing „abgeschaltet" wird. Zum Beispiel
kann die KRAB-Domäne
vom menschlichen Kox1 (Thiesen, New Biol. 2: 363-374, 1990) an das
DNA-bindende Lactose(lac)-Repressorprotein fusioniert werden, wodurch
ein transkriptioneller Hybrid-Silencer mit reversibler, sequenzspezifischer
Bindung an eine lac-Operator-Sequenz, die unmittelbar benachbart
zum tet-responsiven
Promotor konstruiert wurde, gebildet wird. In dieser Konfiguration
wird die konstitutive Expression der lac-Repressor/KRAB-Domänen-Fusion
(rKR) in der Bindung an die lac-Operator-Sequenz und der Elimination
jeglicher „durchlässiger" Basaltranskription
vom nicht-induzierten tet-responsiven Promotor resultieren. Wenn
eine Vektorexpression erwünscht
wird und Tetracyclin aus dem System entfernt wird, wird IPTG zugefügt, um ein
transkriptionelles rKR-vermitteltes Silencing zu verhindern.
-
Zusätzlich können KRAB-Domänen von
anderen Zinkfinger-Proteinen, zum Beispiel ZNF133 (Tommerup et al.,
Hum. Mol. Genet. 2: 1571-1575, 1993), ZNF91 (Bellefroid et al.,
EMBO J. 12: 1363-1374, 1993), ZNF2 (Rosati et al., Nucleic Acids
Res. 19: 5661-5667, 1991), sowie andere transferierbare Repressor-Domänen, zum
Beispiel die Drosophila-en- oder -eve-Gene (Jaynes und O'Farrell, EMBO J.
10: 1427-1433, 1991; Han und Manley, Genes Dev. 7: 491-503, 1993),
das menschliche Zinkfinger-Protein YY1 (Shi et al., Cell 67: 377-388,
1991), das Wilms-Tumor-Supressorprotein
WTI (Madden et al., Science 253: 1550-1553, 1991), der Schilddrüsenhormon-Rezeptor
(Baniahmad et al., EMBO J. 11: 1015-1023, 1992), der Retinsäure-Rezeptor (Baniahmad
et al., ebd.), Kid-I (Witzgall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91: 4514-4518, 1994), gleichermaßen leicht in den hierin bereitgestellten
Gen-Abgabevehikeln verwendet werden. Darüber hinaus kann die lac-Repressor/lac-Operator-Komponente
dieses Systems durch jede Zahl von anderen regulierbaren Systemen,
die von anderen Quellen stammen, zum Beispiel die Tryptophan- und
Maltose-Operons oder GAL4, substituiert werden.
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E. Rekombinante Alphaviruspartikel und
Herstellung und Verwendung von „leeren" Togavirus-Partikeln oder Togavirus-Partikeln,
die nicht-homologe virale RNA enthalten
-
In
einem anderen Aspekt der vorliegenden Offenbarung wird die Herstellung
von rekombinanten Alphaviruspartikeln, die RNA-Alphavirusvektoren
enthalten, die zur Infektion von eukaryontischen Zielzellen in der
Lage sind, beschrieben. Kurz, solche rekombinanten Alphaviruspartikel
umfassen im Allgemeinen ein oder mehrere Alphavirus-Strukturproteine,
eine Lipidhülle
und ein RNA-Vektor-Replikon, wie hierin beschrieben.
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Verfahren
zum Herstellen von rekombinanten Alphavirus-Vektorpartikeln können leicht
zum Beispiel durch Co-Transfektion von komplementierenden Vektoren
und defekten Helfer (DH)-Molekülen,
die von in vitro-transkribierter RNA oder alternativ Plasmid-DNA
stammen, oder durch Co-Infektion mit Virus erreicht werden (siehe
Xiong et al., Science 243: 1188-1191, 1989, Bredenbeek et al., J.
Virol. 67: 6439-6446, 1993, Dubensky et al., J. Virol. 70: 508-519,
1996 und Dubensky et al.,
WO
95/07994 ).
-
In
anderen Aspekten werden Verfahren zum Herstellen von rekombinanten
Alphavirus-Vektorpartikeln von Alphavirus-abgeleiteten Verpackungs-
oder Hersteller-Zelllinien geliefert. Kurz, solche PCL und ihre
stabil transformierten Strukturprotein-Expressionskassetten können unter
Verwendung von Verfahren, die in
WO 95/07994 beschrieben
werden, oder unter Verwendung von neuen Verfahren, die in dieser
Erfindung beschrieben werden, abgeleitet werden. Zum Beispiel kann
die Produktion von rekombinanten Alphavirus-Vektorpartikeln durch
PCL nach dem Einbringen von Alphavirus-basierten Vektormolekülen mit
wünschenswerten
Eigenschaften in die PCL erreicht werden (siehe Beispiel 6), wobei
die Vektoren von in vitro-transkribierter RNA, Plasmid-DNA oder
vorher erhaltenen rekombinanten Alphaviruspartikeln abgeleitet werden.
In noch einem weiteren Beispiel wird die Produktion von rekombinanten
Partikeln von Alphavirus-Hersteller-Zelllinien beschrieben (siehe
Beispiel 7).
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In
anderen Aspekten werden Verfahren zum Produzieren von stabilen Togavirus-Capsidpartikeln
mit hohem Titer offenbart, die keine genomisch RNA (d. h. im Wesentlich
keine virale RNA enthalten) oder RNA-Vektor-Replikons enthalten.
Wie in der vorliegenden Offenbarung verwendet, sollte verstanden
werden, dass „im
Wesentlichen keine" genomische
oder RNA-Vektor-Ribonucleinsäuren
sich auf Verhältnisse
von mehr als 10:1 und vorzugsweise mehr als 15:1 von 35S-Methionin
zu 3H-Uridin-Inkorporierung in die Viruspartikel
(im Vergleich zum Wildtyp) bezieht (siehe z. B. Beispiel 8 und 38). Zum Beispiel werden in einem Aspekt leere
Capsidpartikel (vorzugsweise mit dem Lipid-Doppelschicht und Glycoprotein-Komplement) aus einem
ausgewählten
pathogenen Virus aus der Togavirus-Familie (wie einem Alphavirus
oder Rubivirus) konstruiert und als Immunogene verwendet, um eine
schützende
Immunität
gegen eine Infektion mit dem Wildtyp-Togavirus zu etablieren. Die
leeren viralen Partikel sind eine wünschenswerte immunogene Alternative, weil
sie nicht in der Lage sind, zu replizieren und Virus zu produzieren,
aber trotzdem in der Lage sind, sowohl zelluläre als auch humorale Immunantworten
zu erzeugen. Daher können
unter Anwendung der Verfahren, die detaillierter in Beispiel 8 beschrieben
werden, leere Capsidpartikel, die von Togaviren stammen (mit oder
ohne Lipid-Doppelschicht und Glycoprotein-Komplement), von einer
breiten Vielfalt von Togaviren hergestellt werden, einschließlich Alphaviren
(wie Sindbis-Virus
(z. B. SIN-1 oder Wildtyp-Sindbis-Virus), Venezuelanisches Pferde-Encephalitisvirus,
Ross River-Virus, östliches
Pferde-Encephalitisvirus, westliches Pferde-Encephalitisvirus und
Rubiviren (z. B. Rubella), aber nicht darauf limitiert.
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In
einem zweiten Aspekt können
die Sequenzen von heterologen Viren, die Peptide codieren, die an genomische
virale RNA binden, in eine defekte Helfer (DH)-Expressionskassette in die aminoterminale
Region des Alphavirus-Capsidgens inseriert werden, von dem die Sequenzen
deletiert wurden, die die Region des Proteins codieren, das an die
homologe genomische Alphavirus-RNA bindet. Zum Beispiel kann bei
BHK-Zellen mit einer Alphavirus-Replikon-RNA, einer DH-RNA, die
eine Sequenz enthält,
die ein heterologes genomisches Virus-RNA-Bindungspeptid codiert,
und einem Replikon, das von demselben heterologen Virus stammt, Elektroporation
durchgeführt
werden. Daher enthalten die produzierten Alphaviruspartikel eine
genomische RNA von einem heterologen Virus und besitzen den Wirtsbereich-Tropismus
des Alphavirus. Als ein mögliches Beispiel
sind gag-Sequenzen,
die Proteine codieren, die für
eine Retrovirus-RNA-Bindung nötig
sind, in das DH-Expressionskassetten-Konstrukt eingeschlossen. In
dieser Konfiguration würden
die resultierenden Alphaviruspartikel Retrovirus-Vektor-RNA enthalten.
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F. Heterologe Sequenzen
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Wie
oben angemerkt, kann eine breite Vielfalt von Nucleotidsequenzen
durch die Gen-Abgabevehikel der vorliegenden Erfindung getragen
und exprimiert werden. Vorzugsweise sollten die Nucleotidsequenzen eine
ausreichende Größe aufweisen,
um die Produktion von lebensfähigem
Virus zu erlauben. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung
wird die Produktion von jedem durch zum Beispiel Plaque-Test, Luciferase-Test
oder β-Galactosidase-Test
messbaren Titer von infektiösem
Virus durch rekombinante Alphaviruspartikel auf geeigneten empfänglichen
Einzelzellschichten oder die Expression von nachweisbaren Spiegeln
des heterologen Genprodukts durch RNA- oder DNA-Vektoren als „Produktion
von lebensfähigem
Virus" angesehen.
In bevorzugten Ausführungsformen
kann die heterologe Sequenz eine heterologe Sequenz von mindestens
etwa 100 Basen, 2 kb, 3,5 kb, 5 kb, 7 kb oder sogar eine heterologe
Sequenz von mindestens etwa 8 kb umfassen.
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Wie
für einen
Fachmann in Anbetracht der hierin gelieferten Offenbarung ersichtlich
werden wird, ist die Wirksamkeit der rekombinanten Alphaviruspartikel-Verpackung und daher
der viralen Titer zu einem gewissen Grad abhängig von der Größe der Sequenz,
die verpackt werden soll. Daher können, um die Wirksamkeit der
Verpackung und die Produktion von lebensfähigem Virus zu erhöhen, zusätzliche
nicht-codierende Sequenzen zum Vektorkonstrukt zugefügt werden.
Darüber
hinaus kann es in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung
wünschenswert
sein, den viralen Titer zu erhöhen
oder zu erniedrigen. Dieser Anstieg oder Abfall kann durch Erhöhen oder
Erniedrigen der Größe der heterologen
Sequenz und daher der Wirksamkeit der Verpackung erreicht werden.
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Wie
oben kurz angemerkt, kann eine breite Vielfalt von heterologen Sequenzen
in den Gen-Abgabevehikeln, die hierin beschrieben sind, eingeschlossen
werden, einschließlich
zum Beispiel Sequenzen, die Linderungsmittel wie Lymphokine oder
Cytokine, Toxine, Prodrug-konvertierende Enzyme, Antigene, die eine
Immunantwort stimulieren, Ribozyme, Proteine für eine therapeutische Anwendung
wie Wachstums- oder regulatorische Faktoren und Proteine, die eine
Immunantwort unterstützen
oder sie inhibieren, sowie Antisense-Sequenzen (oder Sense-Sequenzen
für „Antisense-Anwendungen") codieren. Zusätzlich können die
hierin gelieferten Gen-Abgabevehikel, wie oben diskutiert, zwei
oder mehrere heterologe Sequenzen enthalten (und in bestimmten Ausführungsformen
exprimieren).
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1. Lymphokine
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung codiert die heterologe Sequenz ein Lymphokin. Kurz,
Lymphokine wirken, um Immun-Effektorzellen zu proliferieren, aktivieren
oder differenzieren. Repräsentative
Beispiele von Lymphokinen schließen Gamma-Interferon, Tumornekrose-Faktor,
IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11,
IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, GM-CSF, CSF-1 und G-CSF ein.
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In
verwandten Ausführungsformen
der Erfindung codiert die heterologe Sequenz einen immunmodulatorischen
Co-Faktor. Kurz, wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung
verwendet, bezeichnet „immunmodulatorischer
Co-Faktor" Faktoren, die, wenn
sie durch eine oder mehrere der Zellen, die in eine Immunantwort
involviert sind, hergestellt werden, oder wenn sie von außen zu den Zellen
zugefügt
werden, bewirken, dass die Immunantwort in der Qualität oder Potenz
von jener, die in der Abwesenheit des Co-Faktors aufgetreten sein
würde,
verschieden ist. Die Qualität
oder Potenz einer Antwort kann durch eine Vielfalt von Tests, die
einem Fachmann bekannt sind, gemessen werden, einschließlich zum
Beispiel in vitro-Tests, die die zelluläre Proliferation messen (z.
B. 3H-Thymidin-Aufnahme), und cytotoxischer in vitro-Tests
(z. B. die eine 51Cr-Freisetzung messen)
(siehe Warner et al., AIDS Res. and Human Retroviruses 7: 645-655,
1991).
-
Repräsentative
Beispiele von immunmodulatorischen Co-Faktoren schließen Alpha-Interferon
(Finter et al., Drugs 42(5): 749-765, 1991;
US-Patent Nr. 4,892,743 ;
US-Patent Nr. 4,966,843 ;
WO 85/02862 ; Nagata et al., Nature
284: 316-320, 1980; Familletti et al., Methods in Enz. 78: 387-394,
1981: Twu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2046-2050, 1989;
Faktor et al., Oncogene 5: 867-872, 1990), Beta-Interferon (Seif
et al., J. Virol. 65: 664-671, 1991), Gamma-Interferone (Radford
et al., American Society of Hepatology: 2008-2015, 1991; Watanabe
et al., PNAS 86: 9456-9460, 1989; Gansbacher et al., Cancer Research
50: 7820-7825, 1990; Maio et al., Can. Immunol. Immunother. 30:
34-42, 1989;
US-Patent Nr. 4,762,791 und
4,727,138 ), G-CSF (
US-Patent Nr. 4,999,291 und
4,810,643 ), GM-CSF (
WO 85/04188 ), TNFs (Jayaraman
et al., J. Immunology 144: 942-951, 1990), Interleukin-2 (IL-2)
(Karupiah et al., J. Immunology 144: 290-298, 1990; Weber et al.,
J. Exp. Med. 166: 1716-1733, 1987; Gansbacher et al., J. Exp. Med.
172: 1217-1224, 1990;
US-Patent
Nr. 4,738,927 ), IL-4 (Tepper et al., Cell 57: 503-512,
1989; Golumbek et al., Science 254: 713-716, 1991;
US-Patent Nr. 5,017,691 ), IL-6 (Brakenhof
et al., J. Immunol. 139: 4116-4121, 1987;
WO 90/06370 ), IL-12, IL-15 (Grabstein
et al., Science 264: 965-968, 1994; Genbank-EBML-Zugangsnr. V03099), ICAM-1 (Altman
et al., Nature 338: 512-514, 1989), ICAM-2, LFA-1, LFA-3, MHC-Klasse
I-Moleküle,
MHC-Klasse II-Moleküle,
2-Mikroglobulin, Chaperone, CD3, B7/BB1,
MHC-verknüpfte
Transporterproteine oder Analoge davon ein.
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Die
Wahl, welcher immunmodulatorische Co-Faktor in einem Alphavirus-Vektorkonstrukt eingeschlossen
werden soll, kann auf bekannten therapeutischen Wirkungen des Co-Faktors
basieren oder experimentell bestimmt werden. Zum Beispiel ist gefunden
worden, dass Alpha-Interferon in chronischen Hepatitis B-Infektionen wirksam
im Kompensieren eines immunologischen Defizits eines Patienten ist
und dadurch die Erholung von der Krankheit unterstützt. Alternativ
kann ein geeigneter immunmodulatorischer Co-Faktor experimentell
bestimmt werden. Kurz, zuerst werden Blutproben von Patienten mit
einer Leberkrankheit genommen. Periphäre Blutlymphocyten (PBLs) werden
in vitro mit autologen oder HLA-angepassten
Zellen (z. B. EBV-transformierten Zellen) re-stimuliert und mit
einem Alphavirus-Vektorkonstrukt, das die Expression eines immunogenen
Teils eines Hepatitis-Antigens und des immunmodulatorischen Co-Faktors
lenkt, transduziert. Stimulierte PBLs werden als Effektoren in einem
CTL-Test mit den HLA-angepassten transduzierten Zellen als Ziele
verwendet. Ein Anstieg in der CTL-Antwort über jene, die in demselben
Test gesehen wird, der unter Verwendung von HLA-angepassten Stimulator-
und Zielzellen durchgeführt
wird, die mit einem Vektor transduziert wurden, der das Antigen
alleine codiert, weist auf einen nützlichen immunmodulatorischen
Co-Faktor hin. In einer Ausführungsform
der Erfindung wird der immunmodulatorische Co-Faktor Gamma-Interferon
besonders bevorzugt.
-
Ein
weiteres Beispiel eines immunmodulatorischen Co-Faktors ist der
co-stimulierende
B7/BB1-Faktor. Kurz, die Aktivierung der vollen funktionellen Aktivität von T-Zellen
erfordert zwei Signale. Ein Signal wird durch die Interaktion des
Antigen-spezifischen T-Zell-Rezeptors mit Peptiden geliefert, die
an Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex
(MHC)-Moleküle
gebunden sind, und das zweite Signal, bezeichnet als Co-Stimulation, wird
durch Antigen-präsentierende
Zellen an die T-Zelle abgegeben. Das zweite Signal wird für eine Interleukin-2
(IL-2)-Produktion
durch T-Zellen benötigt
und scheint die Interaktion des B7/BB1-Moleküls auf Antigen-präsentierenden
Zellen mit CD28 und CTLA-4-Rezeptoren auf T-Lymphocyten zu involvieren (Linsley
et al., J. Exp. Med. 173: 721-730, 1991a, und J. Exp. Med. 174:
561-570, 1991). In einer Ausführungsform
der Erfindung kann B7/BB1 in Tumorzellen eingebracht werden, um
eine Co-Stimulierung von CD8+-T-Zellen zu bewirken,
sodass die CD8+-T-Zellen genug IL-2 produzieren,
um zu expandieren und völlig
aktiviert zu werden. Diese CD8+-T-Zellen
können
Tumorzellen abtöten,
die kein B7 exprimieren, weil die Co-Stimulierung nicht mehr für eine weitere
CTL-Funktion benötigt
wird. Vektoren, die sowohl den co-stimulierenden B7/BB1-Faktor als
auch zum Beispiel ein immunogenes HBV-Kernprotein exprimieren, können unter
Anwendung der Verfahren, die hierin beschrieben werden, hergestellt
werden. Zellen, die mit diesen Vektoren transduziert wurden, werden
wirksamere Antigen- präsentierende
Zellen werden. Die HBV-kernspezifische CTL-Antwort wird von den
völlig
aktivierten CD8+-T-Zellen durch den co-stimulierenden
Liganden B7/BB1 gesteigert.
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2. Toxine
-
In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung codiert die heterologe Sequenz ein Toxin. Kurz, Toxine
wirken, um das Wachstum einer Zelle direkt zu inhibieren. Repräsentative
Beispiele von Toxinen schließen
Ricin (Lamb et al., Eur. J. Biochem. 148: 265-270, 1985), Abrin (Wood et al., Eur.
J. Biochem. 198: 723-732, 1991; Evensen et al., J. of Biol. Chem.
266: 6848-6852, 1991; Collins et al., J. of Biol. Chem. 265: 8665-8669,
1990; Chen et al., Fed. of Eur. Biochem Soc. 309: 115-118, 1992),
Diphtherie-Toxin (Tweten et al., J. Biol. Chem. 260: 10392-10394,
1985), Cholera-Toxin (Mekalanos et al., Nature 306: 551-557, 1983;
Sanchez und Holmgren, PNAS 86: 481-485, 1989), Gelonin (Stirpe et
al., J. Biol. Chem. 255: 6947-6953, 1980), Kermesbeeren (Irvin,
Pharmac. Ther. 21: 371-387, 1983), antivirales Protein (Barbieri
et al., Biochem. J. 203: 55-59, 1982; Irvin et al., Arch. Biochem. & Biophys. 200:
418-425, 1980; Irvin, Arch. Biochem. & Biophys. 169: 522-528, 1975), Tritin,
Shigella-Toxin (Calderwood et al., PNAS 84: 4364-4368, 1987; Jackson
et al., Microb. Path. 2: 147-153, 1987), Pseudomonas-Exotoxin A
(Carroll und Collier, J. Biol. Chem. 262: 8707-8711, 1987), Herpes
simplex-Virus-Thymidin-Kinase
(HSVTK) (Field et al., J. Gen. Virol. 49: 115-124, 1980) und die
E. coli-Guanin-Phosphoribosyltransferase
ein.
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3. Prodrug-konvertierende Enzyme
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In
anderen Ausführungsformen
der Erfindung codiert die heterologe Sequenz ein Prodrug-konvertierendes
Enzym. Kurz, wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung
angewendet, bezeichnet ein Prodrug-konvertierendes Enzym ein Genprodukt,
das eine Verbindung mit einer geringen oder ohne Cytotoxizität in ein
toxisches Produkt (das Prodrug) aktiviert. Repräsentative Beispiele von solchen
Genprodukten schließen
HSVTK und VZVTK (sowie Analoge und Derivate davon) ein, die selektiv
bestimmte Purin-Arabinoside und substituierte Pyrimidin-Verbindungen mono-phosphorylieren,
wobei sie diese zu cytotoxischen oder cytostatischen Metaboliten
konvertieren. Genauer, das Aussetzen der Arzneistoffe Ganciclovir,
Acyclovir oder jedes ihrer Analoge (z. B. FIAU, FIAC, DHPG) gegenüber HSVTK
phosphoryliert den Arzneistoff in seine entsprechende aktive Nucleotidtriphosphatform.
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Repräsentative
Beispiele von anderen Prodrug-konvertierenden Enzymen, die auch
im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden
können,
schließen
ein: E. coli-Guanin-Phosphoribosyltransferase, die Thioxanthin in
toxisches Thioxanthin-Monophosphat konvertiert (Besnard et al.,
Mol. Cell. Biol. 7: 4139-4141, 1987); alkalische Phosphatase, die
inaktive phosphorylierte Verbindungen wie Mitomycinphosphat und
Doxorubicinphosphat in toxische dephosphorylierte Verbindungen konvertiert;
Pilz- (z. B. Fusarium oxysporum) oder bakterielle Cytosindesaminase,
die 5-Fluorcytosin in die toxische Verbindung 5-Fluoruracil konvertiert
(Mullen, PNAS 89: 33, 1992); Carboxypeptidase G2, die die Glutaminsäure von
Para-N-bi(2-chlorethyl)-aminobenzoylglutaminsäure spaltet, wodurch eine toxischer
Benzoesäure-Senf
kreiert wird; und Penicillin-V-Amidase, die Phenoxyacetabid-Derivate
von Doxorubicin und Melphalan in toxische Verbindungen konvertiert
(siehe allgemein Vrudhula et al., J. of Med. Chem. 36(7): 919-923,
1993; Kern et al., Canc. Immun. Immunother. 31(4): 202-206, 1990).
-
4. Antisense-Sequenzen
-
In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung ist die heterologe Sequenz eine Antisense-Sequenz. Kurz,
die Antisense-Sequenzen werden gestaltet, um an RNA-Transkripte
zu binden und dadurch die zelluläre Synthese
eines bestimmten Proteins zu verhindern oder die Verwendung jener
RNA-Sequenz durch die Zelle zu verhindern. Repräsentative Beispiele von solchen
Sequenzen schließen
Antisense-Thymidinkinase,
Antisense-Dihydrofolat-Reduktase (Naher und Dolnick, Arch. Biochem. & Biophys. 253:
214-220, 1987; Bzik et al., PNAS 84: 8360-8364, 1987), Antisense-HER2
(Coussens et al., Science 230: 1132-1139, 1985), Antisense-ABL (Fainstein
et al., Oncogene 4: 1477-1481, 1989), Antisense-Myc (Stanton et
al., Nature 310: 423-425, 1984) und Antisense-ras sowie Antisense-Sequenzen
ein, die irgendeine der Zellzyklus-Signalgebungskomponenten (z.
B. Cycline, Cyclinabhängige
Kinasen, Cyclin-abhängige
Kinase-Inhibitoren) oder Enzyme im Nucleotid-Biosyntheseweg blockieren.
Zusätzlich
können
in anderen Ausführungsformen
der Erfindung Antisense-Sequenzen gegen Interferon und 2-Microglobulin verwendet
werden, um die Immunantwort zu verringern.
-
Zusätzlich kann
in einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung die Antisense-RNA als ein Anti-Tumor-Agens verwendet
werden, um eine starke Klasse I-eingeschränkte Antwort zu induzieren.
Kurz, es wird angenommen, dass zusätzlich zum Binden der RNA und
dadurch Verhindern der Translation einer spezifischen mRNA hohe
Spiegel von spezifischen Antisense-Sequenzen die erhöhte Expression
von Interferonen (einschließlich
Gamma-Interferon) aufgrund der Bildung von großen Mengen von doppelsträngiger RNA
induzieren. Die erhöhte
Expression von Gamma-Interferon
verstärkt
wiederum die Expression von MHC-Klasse I-Antigenen. Bevorzugte Antisense-Sequenzen
für die
Verwendung in dieser Hinsicht schließen Actin-RNA, Myosin-RNA und
Histon-RNA ein. Eine Antisense-RNA, die eine Fehlpaarung mit Actin-RNA
bildet, wird besonders bevorzugt.
-
5. Ribozyme
-
In
anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung werden Gen-Abgabevehikel
geliefert, die bei einer Infektion einer Wirtszelle Ribozyme produzieren.
Kurz, Ribozyme werden verwendet, um spezifische RNAs zu spalten,
und werden so gestaltet, dass sie nur eine spezifische RNA-Sequenz
beeinflussen können.
Im Allgemeinen ist das Substrat, das die Sequenz eines Ribozyms
bindet, zwischen 10 und 20 Nucleotide lang. Die Länge dieser
Sequenz ist ausreichend, um eine Hybridisierung mit einer Ziel-RNA
und das Abspalten des Ribozyms von der gespaltenen RNA zu erlauben.
-
Eine
breite Vielfalt von Ribozymen kann im Zusammenhang mit der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, einschließlich zum Beispiel der Gruppe
I-Intron-Ribozyme
(Cech et al.,
US-Patent Nr. 4,987,071 ); Haarnadel-Ribozyme
(Hampel et al., Nucl. Acids Res. 18: 299-304, 1990,
US-Patent Nr. 5,254,678 und
europäische Patent-Veröffentlichung
Nr. 0 360 257 ), Hammerkopf-Ribozyme (Rossi, J. J. et al.,
Pharmac. Ther. 50: 245-254, 1991; Forster und Symons, Cell 48: 211-220,
1987; Haseloff und Gerlach, Nature 328: 596-600, 1988; Walbot und
Bruening, Nature 334: 196, 1988; Haseloff und Gerlach, Nature 334:
585, 1988), Hepatitis delta-Virus-Ribozyme
(Perrotta und Been, Biochem. 31: 16, 1992); RNase P-Ribozyme (Takada
et al., Cell 35: 849, 1983); sowie anderer Typen von Ribozymen (siehe
z. B.
WO 95/29241 und
WO 95/31551 ). Weitere Beispiele
von Ribozymen schließen
jene ein, die in den
US-Patenten
Nr. 5,116,742 ,
5,225,337 und
5,246,921 beschrieben sind.
-
6. Proteine und andere zelluläre Bestandteile
-
In
anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung kann eine breite Vielfalt
von Proteinen oder anderen zellulären Bestandteilen durch die
hierin gelieferten Gen-Abgabevehikel
getragen und/oder exprimiert werden. Repräsentative Beispiele solcher
Proteine schließen
natürliche
oder veränderte
zelluläre
Komponenten sowie fremde Proteine oder zelluläre Bestandteile ein, die zum
Beispiel in Viren, Bakterien, Parasiten oder einem Pilz gefunden
werden.
-
a. Veränderte
zelluläre
Komponenten
-
In
einer Ausführungsform
werden Gen-Abgabevehikel geliefert, die die Expression einer immunogenen,
nicht-tumorigenen, veränderten
zellulären
Komponente lenken (siehe z. B.
WO
93/10814 ). Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „immunogen" veränderte zelluläre Komponenten,
die unter den geeigneten Bedingungen zum Bewirken einer Immunantwort
in der Lage sind. Diese Antwort muss zellvermittelt sein und kann
auch eine humorale Antwort einschließen. Der Begriff „nicht-tumorigen" bezeichnet veränderte zelluläre Komponenten,
die keine zelluläre
Transformierung bewirken oder Tumorbildung in Nacktmäusen induzieren werden.
Der Ausdruck „veränderte zelluläre Komponente" bezeichnet Proteine
und andere zelluläre
Bestandteile, die entweder damit assoziiert sind, eine Zelle tumorigen
zu machen oder mit tumorigenen Zellen im Allgemeinen assoziiert
sind, aber nicht dafür
erforderlich oder wesentlich sind, eine Zelle tumorigen zu machen.
-
Kurz,
vor der Veränderung
können
die zellulären
Komponenten für
das normale Zellwachstum und die Regulierung wesentlich sein und
schließen
zum Beispiel Proteine, die den intrazellulären Proteinabbau, die transkriptionelle
Regulierung, Zellzyklus-Kontrolle und Zell-Zell-Interaktion regulieren,
ein. Nach der Veränderung
führen
die zellulären
Komponenten nicht mehr ihre regulatorischen Funktionen aus, und
die Zelle kann daher ein unkontrolliertes Wachstum erfahren. Repräsentative
Beispiele von veränderten
zellulären
Komponenten schließen
ras*, p53*, Rb*, ein verändertes
Protein, das durch das Wilms1-Tumorgen codiert
wird, Ubiquitin*, Mucin*, das Protein, das durch die DCC-, APC-
und MCC-Gene codiert wird, das Brustkrebs-Gen BRCA1* sowie Rezeptoren
oder Rezeptor-ähnliche
Strukturen wie neu, Schilddrüsenhormon-Rezeptor,
Blutplättchen-abstammenden
Wachstumsfaktor (PDGF)-Rezeptor, Insulin-Rezeptor, epidermaler Wachstumsfaktor
(EGF)-Rezeptor und den Kolonie-stimulierenden Faktor (CSF)-Rezeptor
ein.
-
Sobald
eine Sequenz, die die veränderte
zelluläre
Komponente codiert, erhalten worden ist, ist es notwendig, sicherzustellen,
dass die Sequenz ein nicht-tumorigenes
Protein codiert. Verschiedene Tests, die die Tumorigenität einer
bestimmten zellulären
Komponente bewerten, sind bekannt und können leicht bewältigt werden.
Repräsentative
Tests schließen
einen Rattenfibroblast-Test, die Tumor-Bildung in Nacktmäusen oder -Ratten,
die Koloniebildung in weichem Agar und die Herstellung von transgenen
Tieren wie transgenen Mäusen
ein.
-
Die
Tumorbildung in Nacktmäusen
oder -Ratten ist ein besonders wichtiges und empfindliches Verfahren
zum Bestimmen der Tumorigenität
einer bestimmten zellulären
Komponente. Nacktmäusen
fehlt ein funktionelles zelluläres
Immunsystem (d. h. sie besitzen keine CTLs), und sie liefern daher
ein nützliches
in vivo-Modell, in dem das tumorigene Potenzial von Zellen getestet
wird. Normale, nicht-tumorigene Zellen zeigen keine unkontrollierten
Wachstumseigenschaften, wenn sie in Nacktmäuse infiziert werden. Die transformierten Zellen
werden jedoch schnell proliferieren und in Nacktmäusen Tumore
bilden. Kurz, in einer Ausführungsform wird
ein Alphavirus-Vektorkonstrukt an syngene murine Zellen verabreicht,
gefolgt von einer Injektion in Nacktmäuse. Die Mäuse werden für einen
Zeitraum von 2 bis 8 Wochen nach der Injektion visuell untersucht,
um ein Tumorwachstum festzustellen. Die Mäuse können auch getötet und
autopsiert werden, um festzustellen, ob Tumore vorhanden sind. (Giovanella
et al., J. Natl. Cancer Inst. 48: 1531-1533, 1972; Furesz et al.,
Abnormal Cells, New Products and Risk, Hopps und Petricciani (Hrsg.),
Tissue Culture Association, 1985; und Levenbook et al., J. Biol.
Std. 13: 135-141, 1985.) Die Tumorigenität kann auch durch Betrachten
der Koloniebildung in weichem Agar bewertet werden (Macpherson und
Montagnier, Virol. 23: 291-294, 1964). Kurz, eine Eigenschaft von
normalen nicht-tumorigenen Zellen ist die „Kontakt-Inhibition" (d. h. die Zellen
werden aufhören
zu proliferieren, wenn sie benachbarte Zellen berühren). Wenn
die Zellen in einem halbfesten Agar-Trägermedium plattiert werden,
werden normale Zellen schnell kontakt-inhibiert und hören auf
zu proliferieren, wohingegen tumorigene Zellen fortfahren werden,
zu proliferieren und Kolonien in weichem Agar zu bilden.
-
Wenn
die veränderte
zelluläre
Komponente damit assoziiert ist die Zelle tumorigen zu machen, dann ist
es notwendig, die veränderte
zelluläre
Komponente nicht-tumorigen zu machen. Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform
die Sequenz oder das Gen von Interesse, die/das die veränderte zelluläre Komponente
codiert, verkürzt,
um das Genprodukt nicht-tumorigen zu machen. Das Gen, das die veränderte zelluläre Komponente
codiert, kann auf eine Vielfalt von Größen verkürzt werden, obwohl es bevorzugt
wird, so viel der veränderten
zellulären
Komponente wie möglich
zu bewahren. Zusätzlich
ist es nötig,
dass jede Verkürzung
zumindest einige der immunogenen Sequenzen der veränderten
zellulären
Komponente intakt lässt.
Alternativ können
mehrere translationelle Stoppcodons stromabwärts der immunogenen Region
eingebracht werden. Die Insertion von Stoppcodons wird die Proteinexpression
vorzeitig beenden, was so die Expression des transformierenden Teils
des Proteins verhindert.
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Wie
oben angemerkt, muss die veränderte
zelluläre
Komponente, um eine geeignete Immunantwort herzustellen, auch immunogen
sein. Die Immunogenität
einer bestimmten Sequenz ist oft schwer vorherzusagen, obwohl T-Zell-Epitope
oft eine immunogene amphipathische Alpha-Helix-Komponente besitzen.
Im Allgemeinen ist es jedoch bevorzugt, die Immunogenität in einem
Test zu bestimmen. Repräsentative
Tests schließen
einen ELISA, der das Vorliegen von Antikörpern gegen den neu eingebrachten
Vektor nachweist, sowie Tests ein, die auf T-Helferzellen testen,
wie Gamma-Interferon-Tests, IL-2-Produktionstests und Proliferationstests.
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Wie
oben angemerkt, können
in einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung einige verschiedene
veränderte
zelluläre
Komponenten co-exprimiert werden, um ein allgemeines anti-Krebs-Therapeutikum
zu bilden. Im Allgemeinen wird es für einen Fachmann offensichtlich
werden, dass eine Vielfalt von Kombinationen gemacht werden kann.
In bevorzugten Ausführungsformen
kann dieses Therapeutikum auf einen bestimmten Typ von Krebs gerichtet
sein. Zum Beispiel besitzen beinahe alle Colon-Krebsarten Mutationen
in den ras-, p53-, CCD-, APC- oder MCC-Genen. Ein Alphavirus-Vektorkonstrukt,
das eine Reihe dieser veränderten
zellulären
Komponenten co-exprimiert, kann an einen Patienten mit Colonkrebs
verabreicht werden, um alle möglichen
Mutationen zu behandeln. Diese Methodik kann auch verwendet werden,
um andere Krebsarten zu behandeln. Daher kann ein Alphavirus-Vektorkonstrukt,
das Mucin*, ras*, neu, BRCA1* und p53* co-exprimiert, verwendet werden, um Brustkrebs
zu behandeln.
-
b. Antigene von fremden Organismen oder
anderen Pathogenen
-
In
anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung werden Vektoren geliefert,
die die Expression von immunogenen Teilen von Antigenen von fremden
Organismen oder anderen Pathogenen lenken. Repräsentative Beispiele von solchen
Antigen schließen
bakterielle Antigene (z. B. E. coli-, Streptokokken-, Staphylokokken-, Mycobakterium-
usw.), Pilz-Antigene, parasitische Antigene und virale Antigene
(z. B. Grippevirus, felines Leukämie-Virus
(„FeLV"), Immunschwächviren
wie das feline Immunschwäche-Virus
(„FIV") oder das menschliche Immunschwäche-Virus
(„HIV"), Hepatitis A-,
B- und C-Virus („HAV", „HBV" beziehungsweise „HCV"), menschliches Papillomvirus
(„HPV"), Epstein-Barr-Virus („EBV"), Herpes simplex-Virus
(„HSV"), Hantavirus, TTLV1, HTLVII
und Cytomegalie-Virus („CMV") ein. Wie im Zusammenhang
mit der vorliegenden Erfindung verwendet, bezeichnet ein „immunogener
Teil" einen Teil
des entsprechenden Antigens, das unter den geeigneten Bedingungen
zum Bewirken einer Immunantwort in der Lage ist (d. h. zellvermittelt
oder humoral). Die „Teile” können von
variabler Größe sein,
sind aber vorzugsweise mindestens 9 Aminosäuren lang und können das
gesamte Antigen einschließen.
Zellvermittelte Immunantworten können
durch eine Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex („MHC") Klasse I-Präsentierung,
MHC Klasse II-Präsentierung
oder beide vermittelt werden.
-
In
einem Aspekt der Erfindung werden Alphavirus-Vektorkonstrukte geliefert,
die die Expression von immunogenen Teilen von Hepatitis B-Antigenen
lenken (siehe z. B.
WO 93/15207 ).
Kurz, das Hepatitis B-Genom umfasst zirkuläre DNA von etwa 3,2 Kilobasen
Länge und
ist gut charakterisiert worden (Tiollais et al., Science 213: 406-411,
1981; Tiollais et al., Nature 317: 489-495, 1985; und Ganem und
Varmus, Ann. Rev. Biochem. 56: 651-693, 1987; siehe auch
EP 0 278,940 ,
EP 0 241,021 ,
WO 88/10301 und
US-Patent Nr. 4,696,898 und
5,024,938 . Das Hepatitis
B-Virus präsentiert
einige verschiedene Antigene, unter anderen einschließlich drei
HB-„S"-Antigene (HBsAgs),
eines HBc-Antigens (HBcAg), eines HBe-Antigens (HBeAg) und eines
HBx-Antigens (HBxAg) (sehe Blum et al., T/G 5(5): 154-158, 1989).
Kurz, das HBeAg resultiert aus einer proteolytischen Spaltung einer
P22-Vorkern-Zwischenstufe
und wird von der Zelle sezerniert. Das HBeAg wird im Serum als eine
17 kD-Protein gefunden. Das HBcAg ist ein Protein von 183 Aminosäuren, und
das HBxAg ist ein Protein von 145 bis 154 Aminosäuren, abhängig vom Subtyp.
-
Die
HBsAgs (bezeichnet als „groß", „mittel" und „klein") werden von drei
Regionen des Hepatitis B-Genoms codiert: S, prä-S2 und prä-S1. Das große Protein,
das eine Länge
hat, die von 389 bis 400 Aminosäuren variiert,
wird durch die prä-S1-, prä-S2- und
S-Regionen codiert und wird in glycosylierten und nicht-glycosylierten Formen
gefunden. Das mittlere Protein ist 281 Aminosäuren lang und wird durch die
prä-S2-
und S-Regionen codiert. Das kleine Protein ist 226 Aminosäuren lang
und wird durch die S-Region codiert. Es existiert in zwei Formen,
glycosyliert (GP 27S) und nicht-glycosyliert
(P24S). Wenn jede dieser Regionen getrennt
exprimiert wird, wird die prä-S1-Region
ein Protein von ungefähr
119 Aminosäuren
codieren, die prä-S2-Region wird
ein Protein von ungefähr
55 Aminosäuren
codieren, und die S-Region wird ein Protein von ungefähr 226 Aminosäuren codieren.
-
Wie
für einen
Fachmann ersichtlich sein wird, können verschiedene immunogene
Teile der oben beschriebenen S-Antigene kombiniert werden, um eine
Immunantwort zu induzieren, wenn sie durch eines der hierin beschriebenen
Alphavirus-Vektorkonstrukte verabreicht werden. Zusätzlich können aufgrund
der großen immunologischen
Variabilität,
die in verschiedenen geographischen Regionen für den offenen S-Leserahmen von
HBV gefunden wird, bestimmte Kombinationen von Antigenen für eine Verabreichung
in bestimmten geographischen Regionen bevorzugt werden.
-
Durch
HBV werden auch pol- („HBV
pol"), ORF 5- und
ORF 6-Antigene präsentiert.
Kurz, der offene Leserahmen der Polymerase von HBV codiert eine
reverse Transkriptaseaktivität,
die in Virionen und Kern-ähnlichen
Partikeln in infizierten Lebern gefunden wird. Das Polymeraseprotein
besteht aus mindestens zwei Domänen:
der aminoterminalen Domäne,
die das Protein codiert, das die reverse Transkription initiiert, und
der carboxyterminalen Domäne,
die die reverse Transkriptase und RNase H-Aktivität codiert.
Immunogene Teile von HBV pol können
unter Anwenden der hierin beschriebenen Verfahren, unter Anwenden
der unten beschriebenen Alphavirus-Vektorkonstrukte bestimmt und
verabreicht werden, um eine Immunantwort in einem warmblütigen Tier
herzustellen. In ähnlicher
Weise können
andere HBV-Antigene wie ORF 5 und ORF 6 (Miller et al., Hepatology
9: 322-327, 1989)
unter Anwenden der Alphavirus-Vektorkonstrukte exprimiert werden,
wie hierin beschrieben.
-
Wie
oben angemerkt, wird mindestens ein immunogener Teil eines Hepatitis
B-Antigens in ein Gen-Abgabevehikel inkorporiert. Der (die) immunogene(n)
Teil(e), der (die) in die Gen-Abgabevehikel inkorporiert wird (werden),
kann (können)
von variierender Länge
sein, obwohl es im Allgemeinen bevorzugt wird, dass die Teile mindestens
9 Aminosäuren
lang sind, und kann (können)
das gesamte Antigen einschließen.
Die Immunogenität
einer bestimmten Sequenz ist oft schwer vorherzusagen, obwohl die
T-Zell-Epitope unter Verwendung von Computer-Algorithmen wie TSITES (MedImmune, Maryland)
vorhergesagt werden können,
um codierende Regionen auf potenzielle T-Helferstellen und CTL-Stellen
zu scannen. Aus dieser Analyse werden Peptide synthetisiert und
als Ziele in einem cytotoxischen in vitro-Test verwendet. Andere
Tests können
jedoch auch verwendet werden, einschließlich zum Beispiel ELISA, der
das Vorliegen von Antikörpern
gegen den neu eingebrachten Vektor nachweist, sowie Tests, die auf
T-Helferzellen testen, wie die Gamma-Interferon-Tests, IL-2-Produktionstests
und Proliferationstests.
-
Immunogene
Teile können
auch durch andere Verfahren selektiert werden. Zum Beispiel ist
gezeigt worden, dass die HLA A2.1-transgene Maus nützlich als
ein Modell für
die menschliche T-Zellerkennung von viralen Antigenen ist. Kurz,
in den viralen Influenza- und Hepatitis-B-Systemen erkennt das murine
T-Zell-Rezeptorrepertoir
dieselben antigenen Determinanten, die durch menschliche T-Zellen erkannt werden.
In beiden Systemen ist die CTL-Antwort, die in der HLA A2.1-transgenen Maus hergestellt
wird, gegen nahezu dasselbe Epitop gerichtet wie jene, die durch
menschliche CTLs des HLA A2.1-Haplotyps erkannt werden (Vitiello
et al., J. Exp. Med. 173: 1007-1015, 1991; Vitiello et al., Abstract
of Molecular Biology of Hepatitis B Virus Symposia, 1992). Besonders
bevorzugte immunogene Teile für
die Inkorporation in Alphavirus-Vektorkonstrukte schließen die
HBeAg, HBcAg und HBsAgs ein. Zusätzliche
immunogene Portionen des Hepatitis B-Virus können durch Verkürzen der
codierenden Sequenz an verschiedenen Stellen erhalten werden, einschließlich zum
Beispiel der folgenden Stellen:
Bst UI, Ssp I, Ppu M1, and
Msp I (Valenzuela et al., Nature 280: 815-19, 1979; Valenzuela et
al., Animal Virus Genetics: ICN/UCLA Symp. Mol. Cell Biol., 1980,
B. N. Fields und R. Jaenisch (Hrsg.), S. 57-70, New York: Academic).
-
Wie
oben angemerkt, können
mehr als ein immunogener Teil in die Gen-Abgabevehikel inkorporiert werden. Zum
Beispiel kann ein Gen-Abgabevehikel (getrennt oder als ein Konstrukt)
alle oder immunogene Teile von HBcAg, AbeAg, HBsAgs, HBxAg sowie
immunogene Teile von HCV-Antigenen exprimieren.
-
7. Quellen für heterologe Sequenzen
-
Sequenzen,
die die oben beschriebenen Proteine codieren, können leicht von einer Vielfalt
von Quellen, einschließlich
zum Beispiel Hinterlegungsstellen wie American Type Culture Collection
(ATCC, Rockville, MD), oder von kommerziellen Quellen wie British
Bio-Technology Limited (Cowley, Oxford, England) erhalten werden.
Repräsentative
Beispiele schließen
BBG12 (enthaltend das GM-CSF-Gen, das das reife Protein von 127
Aminosäuren
codiert); BBG 6 (das Sequenzen enthält, die Gamma-Interferon codieren);
ATCC Nr. 39656 (das Sequenzen enthält, die TNF codieren), ATCC
Nr. 20663 (das Sequenzen enthält,
die alpha-Interferon codieren), ATCC Nr. 31902, 31902 und 39517
(die Sequenzen enthalten, die beta-Interferon codieren), ATCC Nr. 67024
(das eine Sequenz enthält,
die Interleukin-1b codiert); ATCC Nr. 39405, 39452, 39516, 39626
und 39673 (die Sequenzen enthalten, die Interleukin-2 codieren);
ATCC Nr. 59399, 59398 und 67326 (die Sequenzen enthalten, die Interleukin-3
codieren); ATCC Nr. 57592 (das Sequenzen enthält, die Interleukin-4 codieren),
ATCC Nr. 59394 und 59395 (die Sequenzen enthalten, die Interleukin-5
codieren) und ATCC Nr. 67153 (das Sequenzen enthält, die Interleukin-6 codieren) ein.
-
Sequenzen,
die veränderte
zelluläre
Komponenten, wie oben beschrieben, codieren, können leicht aus einer Vielfalt
von Quellen erhalten werden. Zum Beispiel können Plasmide, die Sequenzen
enthalten, die veränderte
zelluläre
Produkte codieren, von einer Hinterlegungsstelle wie der American
Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) oder von kommerziellen
Quellen wie Advanced Biotechnologies (Columbia, Maryland) erhalten
werden. Repräsentative
Beispiele von Plasmiden, die einige der oben beschriebenen Sequenzen
enthalten, schließen die
ATCC Nr. 41000 (enthaltend eine G-zu-T-Mutation im 12. Codon von
ras) und die ATCC Nr. 41049 (enthaltend eine G-zu-A-Mutation im
12. Codon) ein.
-
Alternativ
können
Plasmide, die normale zelluläre
Komponenten codieren, auch von Hinterlegungsstellen wie der ATCC
(siehe zum Beispiel ATCC Nr. 41001, das eine Sequenz enthält, die
das normale ras-Protein codiert; ATCC Nr. 57103, das abl codiert;
und ATCC Nr. 59120 oder 59121, die den bcr-Locus codieren) erhalten
und mutiert werden, um die veränderte
zelluläre
Komponente zu bilden. Verfahren zum Mutagenisieren von bestimmten
Stellen können
leicht unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind
(siehe Sambrook et al., vorstehend, 15.3 ff.), ausgeführt werden.
Insbesondere können
Punktmutationen von normalen zellulären Komponenten wie ras leicht
durch ortsgerichtete Mutagenese des bestimmten Codons, zum Beispiel
der Codons 12, 13 oder 61, erreicht werden.
-
Sequenzen,
die die oben beschriebenen viralen Antigene codieren, können ebenso
von einer Vielfalt von Quellen erhalten werden. Zum Beispiel können molekular
clonierte Genome, die das Hepatitis B-Virus codieren, von Quellen
wie der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) erhalten
werden. Zum Beispiel enthält
die ATCC Nr. 45020 die gesamte genomische DNA von Hepatitis B (extrahiert
von gereinigten Dane-Partikeln) (siehe 3 von
Blum et al., TIG 5(5): 154-158, 1989) in der Bam HI-Stelle von pBR322
(Moriarty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2606-2610, 1981).
-
Alternativ
können
cDNA-Sequenzen, die die oben beschriebenen heterologen Sequenzen
codieren, von Zellen erhalten werden, die die Sequenzen exprimieren
oder enthalten. Kurz, in einer Ausführungsform wird die mRNA von
einer Zelle, die das Gen von Interesse exprimiert, mit reverser
Transkriptase unter Verwendung von Oligonucleotid-dT oder zufälligen Primern
revers transkribiert. Die einzelsträngige cDNA kann dann durch
PCR (siehe
US-Patent Nr. 4,683,202 ;
4,683,195 und
4,800,159 . Siehe auch PCR Technology.
Principles and Applications for DNA Amplification, Ehrlich (Hrsg.),
Stockton Press, 1989) unter Verwendung von Oligonucleotid-Primern,
die komplementär
zu Sequenzen auf beiden Seiten der gewünschten Sequenzen sind, amplifiziert
werden. Insbesondere wird eine doppelsträngige DNA durch Erhitzen in
der Anwesenheit der hitzestabilen Taq-Polymerase, sequenzspezifischer DNA-Primer,
von dATP, dCTP, dGTP und dTTP denaturiert. Doppelsträngige DNA
wird produziert, wenn die Synthese vollständig ist.
-
Dieser
Zyklus kann viele Male wiederholt werden, was in einer faktoriellen
Amplifizierung der gewünschten
DNA resultiert.
-
Sequenzen,
die die oben beschriebenen Proteine codieren, können zum Beispiel auch auf
einem Applied Biosystems Inc. DNA-Synthesegerät (z. B. APB-DNA-Synthesegerät Modell
392 (Foster City, Ka.)) synthetisiert werden.
-
G. Alphavirus-Verpackungs-/Hersteller-Zelllinien
-
In
weiteren Aspekten dieser Offenbarung werden Alphavirus-Verpackungs- und Hersteller-Zelllinien offenbart.
Insbesondere werden in einem Aspekt der vorliegenden Offenbarung
Alphavirus-Verpackungszelllinien offenbart, in denen die viralen
Strukturproteine von einem oder mehreren stabil transformierten
Expressionsvektoren in trans bereitgestellt werden und zum Einkapseln
von transfizierten, transduzierten oder intrazellulär produzierten
Vektor-RNA-Transkripten im Cytoplasma und Freisetzen der infektiösen, verpackten
Vektorpartikel durch die Zellmembran in der Lage sind. In bevorzugten
Aspekten werden die für
das Verpacken notwendigen Strukturproteine nur nach Induktion durch
das RNA-Vektor-Replikon
selbst oder einem anderen bereitgestellten Stimulus in hohen Spiegeln
synthetisiert, und die Transkripte, die diese Strukturproteine codieren,
sind zur cytoplasmatischen Amplifizierung in einer Weise in der
Lage, die ausreichende Expressionsspiegel ermöglichen wird, um jene einer
natürlichen
viralen Infektion zu imitieren. Darüber hinaus ist in anderen Aspekten
die Expression eines selektierbaren Markers funktionell mit der
Strukturprotein-Expressionskassette verknüpft. Solch ein verknüpfter selektierbarer
Marker ermöglicht
eine wirksame Herstellung einer funktionellen, stabil transformierten
PCL.
-
Zum
Beispiel können
Alphavirus-RNA-Vektor-Replikonmoleküle des erwünschten Phänotyps, die verpackt werden
sollen und die selbst zur autokatalytischen Replikation im Zellcytoplasma
in der Lage sind, in die Verpackungszellen als in vitro-transkribierte
RNA, rekombinante Alphaviruspartikel oder als Alphavirus-cDNA-Vektorkonstrukte
eingebracht werden. Die RNA-Vektor-Transkripte replizieren dann zu hohen
Spiegeln, stimulieren die Amplifikation des (der) Strukturprotein-Gentranskripts
(Gentranskripte) und die folgende Proteinexpression und werden danach
durch die viralen Strukturproteine verpackt, was infektiöse Vektorpartikel
ergibt. Die intrazelluläre
Expression von Alphavirus- Proteinen
und/oder Vektor-RNA über
bestimmte Spiegel kann in cytotoxischen Wirkungen in den Verpackungs-
oder Hersteller-Zelllinien resultieren. Daher kann es in bestimmten
Aspekten dieser Offenbarung wünschenswert
sein, dass diese Elemente von Virusvarianten abgeleitet werden,
die auf eine reduzierte Cytotoxizität ihrer exprimierten Strukturproteine,
reduzierte Inhibition der Wirts-Makromolekülsynthese
und/oder die Fähigkeit,
eine persistierende Infektion zu etablieren, selektiert wurden.
-
Um
die Vektor-Verpackungszelllinien-Leistung und den endgültigen Vektortiter
zu optimieren, können aufeinanderfolgende
Zyklen des Gentransfers und der Vektor-Verpackung durchgeführt werden. Zum Beispiel können Überstände, die
infektiöse,
verpackte Vektorpartikel enthalten, die von der Vektortransfektion
der Verpackungszelllinien stammen verwendet werden, um eine frische
Einzelzellschicht von Alphavirus-Verpackungszellen zu infizieren
oder zu „transduzieren". Aufeinanderfolgende
Transduktionen mit verpackten Vektorpartikeln und frischen Verpackungszellen
können
gegenüber
einer Nucleinsäure-Transfektion
aufgrund ihrer höheren
RNA-Transfer-Wirksamkeit in Zellen, der optimierten biologischen
Platzierung des Vektors in der Zelle und der Fähigkeit, den Vorgang für die Vektorproduktion
von zunehmend größeren Zahlen
von Verpackungszellen hochzuschrauben („scale-up"), bevorzugt sein. Dies führt zu einer
höheren
Expression und einem höheren
Titer des verpackten, infektiösen
rekombinanten Alphavirusvektors.
-
In
anderen Aspekten kann ein stabil integrierter oder episomal bewahrter
DNA-Expressionsvektor verwendet werden, um das Alphavirusvektor-RNA-Molekül in der
Zelle zu produzieren. Kurz, solch ein DNA-Expressionsvektor kann
in bevorzugten Aspekten konfiguriert werden, um induzierbar zu sein,
so dass die Transkription der Alphavirusvektor-RNA nur erfolgt,
wenn die Zellen zu einer gewünschten
Dichte vermehrt worden sind und danach induziert werden. Sobald
er transkribiert ist, bewahrt der Alphavirusvektor die Fähigkeit,
selbst autokatalytisch zu replizieren, und löst eine Kaskade von Ereignissen
aus, die in einer Produktion von verpackten Vektorpartikeln gipfeln.
Dieser Ansatz erlaubt eine fortgesetzte Vektorexpression über ausgedehnte
Zeiträume
des Kultivierens, weil das integrierte DNA-Vektor-Expressionssystem
durch einen Wirkstoff oder einen anderen Selektionsmarker bewahrt
wird, und das DNA-System wird, sobald es induziert ist, die unveränderten RNA-Vektor-Replikons,
die nicht durch die defekten RNA-Kopien ausverdünnt werden können, konstitutiv
exprimieren. Die Produktion von verpacktem Alphavirusvektor mit
hohem Titer in größerem Maßstab ist
in dieser Alphavirus-„Hersteller-Zelllinie"-Konfiguration möglich, der
DNA-basierende Alphavirusvektor wird anfänglich durch Transfektion in
die Verpackungszelllinie eingebracht, weil Größenrestriktionen die Verpackung
des Expressionsvektors in ein virales Vektorpartikel für die Transduktion
verhindern könnten.
-
H. Arzneimittel
-
Wie
oben angemerkt, liefert die vorliegende Erfindung auch Arzneimittel,
umfassend die hierin beschriebenen Gen-Abgabevehikel in Kombination
mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger,
Verdünner oder
Empfänger.
Zum Beispiel können
in einer Ausführungsform
die RNA- oder DNA-Vektorkonstrukte der vorliegenden Erfindung für eine Langzeit-Lagerung
und den Transport lyophilisiert werden und können vor der Verabreichung
unter Verwendung einer Vielfalt von Substanzen rekonstituiert werden,
werden aber vorzugsweise unter Verwendung von Wasser rekonstituiert.
In bestimmten Fällen
können
auch verdünnte
Salzlösungen
verwendet werden, die das Endpräparat
zu einer Isotonie bringen. Zusätzlich
kann es vorteilhaft sein, wässrige
Lösungen
zu verwenden, die Komponenten enthalten, die die Aktivität verstärken oder
das rekonstituierte Nucleinsäure-Präparat physikalisch
schützen.
Solche Komponenten schließen
Cytokine wie IL-2, Polykationen wie Protaminsulfat, Lipidpräparate oder
andere Komponenten ein. Lyophilisierte oder entwässerte rekombinante Vektoren
können
mit jedem praktischen Volumen von Wasser oder der oben angemerkten
rekonstituierenden Mittel, die eine wesentliche und vorzugsweise
vollständige
Solubilisierung der lyophilisierten oder entwässerten Probe ermöglichen,
rekonstituiert werden.
-
Rekombinante
Alphaviruspartikel oder infektiöses
rekombinantes Virus (unten werden beide als Virus bezeichnet) können entweder
in rohen oder gereinigten Formen konserviert werden. Um das Virus
in einer rohen Form zu produzieren, können die produzierenden Zellen
zuerst in einem Bioreaktor oder einer Bestandsflachkultur kultiviert
werden, wobei die viralen Partikel von den Zellen in die Kulturmedien
freigesetzt werden. Das Virus kann dann in roher Form zuerst durch
Zufügen
einer Menge eines Präparatpuffers,
die ausreicht, um eine wässrige Suspension
zu bilden, zu den Kulturmedien, die das rekombinante Virus enthalten,
konserviert werden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
ist der Präparatpuffer
eine wässrige
Lösung,
die ein Saccharid, einen strukturellen Zusatz von hohem Molekulargewicht
und eine puffernde Komponente in Wasser enthält. Die wässrige Lösung kann auch eine oder mehrere
Aminosäuren
enthalten.
-
Das
rekombinante Virus kann auch in einer gereinigten Form konserviert
werden. Genauer kann das oben beschriebene rohe rekombinante Virus
vor der Zugabe des Präparatpuffers
durch Leiten desselben durch einen Filter geklärt und dann konzentriert werden,
wie durch ein Kreuzfluss-Konzentrierungssystem (Filtron Technology
Corp., Nortborough, MA). In einer Ausführungsform wird DNase zum Konzentrat
zugefügt,
um exogene DNA zu verdauen. Der Verdau wird dann diafiltriert, um überschüssige Medienkomponenten
zu entfernen und um das rekombinante Virus in einer wünschenswerteren
gepufferten Lösung
zu etablieren. Das Diafiltrat wird dann über eine Sephadex S-500-Gelsäule geführt, und
ein gereinigtes rekombinantes Virus wird eluiert. Eine ausreichende
Menge des Präparatpuffers
wird dann zu diesem Eluat zugefügt,
um eine erwünschte
Endkonzentration der Bestandteile zu erreichen und um das rekombinante
Virus minimal zu verdünnen.
Die wässrige
Suspension kann dann vorzugsweise bei –70°C gelagert oder sofort getrocknet
werden. Wie oben kann der Präparatpuffer
eine wässrige
Lösung
sein, die ein Saccharid, einen strukturellen Zusatz von hohem Molekulargewicht
und eine puffernde Komponente in Wasser enthält. Die wässrige Lösung kann auch eine oder mehrere
Aminosäuren
enthalten.
-
Das
rohe rekombinante Virus kann auch durch Ionenaustausch-Säulenchromatographie gereinigt
werden. Kurz, das rohe rekombinante Virus kann zuerst durch Leiten
desselben durch einen Filter geklärt werden, gefolgt von dem
Laden des Filtrats auf eine Säule,
die eine hochgradig sulfonierte Cellulosematrix enthält. Das rekombinante
Virus kann dann aus der Säule
in gereinigter Form durch Verwenden eines Hochsalzpuffers eluiert
und der Hochsalzpuffer durch Überführen des
Eluats über
eine Molekular-Ausschluss-Säule
gegen einen wünschenswerteren
Puffer ausgetauscht werden. Eine ausreichende Menge des Präparatpuffers
wird dann zum gereinigten rekombinanten Virus zugefügt, wie
oben diskutiert, und die wässrige
Suspension wird entweder sofort getrocknet oder gelagert, vorzugsweise
bei –70°C.
-
Die
wässrige
Suspension in roher oder gereinigter Form kann durch Lyophilisierung
oder Verdunstung bei Umgebungstemperatur getrocknet werden. Kurz,
die Lyophilisierung involviert die Schritte des Abkühlens der
wässrigen
Suspension unter die Gas-Übergangstemperatur
oder unter den eutektischen Temperaturpunkt der wässrigen
Suspension und Entfernen des Wassers aus der gekühlten Suspension durch Sublimierung,
um ein lyophilisiertes Virus zu bilden. In einer Ausführungsform
werden Aliquots des formulierten rekombinanten Virus in eine Edward
Refrigerated Chamber (3 Fächer-RC3S-Einheit),
die an einen Gefriertrockner (Supermodulyo 12 K) angehängt ist,
platziert. Ein Gefriertrocknungsverfahren in mehreren Schritten,
wie durch Phillips et al. (Cryobiology 18: 414, 1981) beschrieben,
wird verwendet, um das formulierte rekombinante Virus vorzugsweise
von einer Temperatur von –40°C bis –45°C zu lyophilisieren.
Die resultierende Zusammensetzung enthält weniger als 10 Gewichts-% des lyophilisierten
Virus an Wasser. Sobald es lyophilisiert ist, ist das rekombinante
Virus stabil und kann bei –20°C bis 25°C gelagert
werden, wie unten detaillierter diskutiert.
-
Im
Verdunstungsverfahren wird das Wasser aus der wässrigen Suspension durch Verdunstung
bei Umgebungstemperatur entfernt. In einer Ausführungsform wird das Wasser
durch Sprühtrocknung
entfernt (
EP 520,748 ).
Im Sprühtrocknungsvorgehen
wird die wässrige
Lösung
in einen Fluss von vorgeheiztem Gas, normalerweise Luft, abgegeben,
wodurch das Wasser schnell aus den Tropfen der Suspension verdunstet. Sprühtrockungs-Apparate
sind von einer Reihe von Herstellern (z. B. Drytec, Ltd., Tonbridge,
England; Lab-Plant, Ltd., Huddersfield, England) erhältlich.
Sobald es entwässert
ist, ist das rekombinante Virus stabil und kann bei –20°C bis 25°C gelagert
werden. In den hierin beschriebenen Verfahren kann der resultierende Feuchtigkeitsgehalt
des getrockneten oder lyophilisierten Virus durch die Verwendung
eines Karl-Fischer-Apparats
(EM Science Aquastar' V1B-volumetrischer
Titrator, Cherry Hill, NJ) oder durch ein gravimetrisches Verfahren
bestimmt werden.
-
Die
wässrigen
Lösungen,
die für
das Formulieren verwendet werden, wie vorher beschrieben, setzten sich
vorzugsweise aus einem Saccharid, einem strukturellen Zusatz mit
hohem Molekulargewicht, einer puffernden Komponente und Wasser zusammen.
Die Lösung
kann auch eine oder mehrere Aminosäuren einschließen. Die
Kombination dieser Komponenten wirkt, um die Aktivität des rekombinanten
Virus beim Frieren oder bei der Lyophilisierung oder Trocknung durch
Verdunstung zu konservieren. Obwohl ein Saccharid, das verwendet
werden kann, Lactose ist, können
andere Saccharde ebenso verwendet werden, einschließlich zum Beispiel
Saccharose, Mannit, Glukose, Trehalose, Inosit, Fructose, Maltose
oder Galactose. Zusätzlich
können Kombinationen
von Sacchariden verwendet werden, zum Beispiel Lactose und Mannit
oder Saccharose und Mannit. Eine besonders bevorzugte Konzentration
von Lactose ist 3–4
Gewichts-%. Vorzugsweise ist die Konzentration des Saccharids im
Bereich von 1 bis 12 Gewichts-%.
-
Der
strukturelle Zusatz von hohem Molekulargewicht hilft im Verhindern
einer viralen Aggregation durch das Frieren und liefert eine strukturelle
Unterstützung
im lyophilisierten oder getrockneten Zustand. Im Zusammenhang mit
der vorliegenden Erfindung werden strukturelle Zusätze als
von „hohem
Molekulargewicht" angesehen,
wenn sie mehr als 5000 MG sind. Ein bevorzugter struktureller Zusatz
von hohem Molekulargewicht ist menschliches Serumalbumin. Andere
Substanzen können
jedoch auch verwendet werden, wie Hydroxyethylcellulose, Hydroxymethylcellulose,
Dextran, Cellulose, Gelatine oder Povidon. Eine besonders bevorzugte
Konzentration von menschlichem Serumalbumin ist 0,1 Gewichts-%.
Vorzugsweise liegt die Konzentration des strukturellen Zusatzes
von hohem Molekulargewicht im Bereich von 0,1 bis 10 Gewichts-%.
-
Die
Aminosäuren,
wenn sie vorhanden sind, wirken, um die virale Infektiosität beim Abkühlen und
Auftauen der wässrigen
Suspension weiter zu konservieren. Zusätzlich wirken die Aminosäuren, um
die virale Infektiosität
weiter während
der Sublimierung der gekühlten
wässrigen
Suspension und während
des lyophilisierten Stadiums zu konservieren. Eine bevorzugte Aminosäure ist
Arginin, aber andere Aminosäuren
wie Lysin, Ornithin, Serin, Glycin, Glutamin, Aspargin, Glutaminsäure oder
Asparginsäure
können
auch verwendet werden. Eine besonders bevorzugte Arginin-Konzentration
in 0,1 Gewichts-%. Vorzugsweise liegt die Aminosäurekonzentration im Bereich
von 0,1 bis 10 Gewichts-%.
-
Die
puffernde Komponente wirkt, um die Lösung durch Bewahren eines relativ
konstanten pH-Werts zu Puffern. Eine Vielfalt von Puffern kann abhängig vom
erwünschten
pH-Bereich, vorzugsweise zwischen 7,0 und 7,8, verwendet werden.
Geeignete Puffer schließen
Phosphatpuffer und Citratpuffer ein. Ein besonders bevorzugter pH-Wert
des rekombinanten Viruspräparats
ist 7,4, und bevorzugter Puffer ist Tromethamin.
-
Zusätzlich wird
es bevorzugt, dass die wässrige
Lösung
ein neutrales Salz enthält,
das verwendet wird, um das endgültige
formulierte rekombinante Alphavirus auf eine geeignete iso-osmotische
Salzkonzentration einzustellen. Geeignete neutrale Salze schließen Natriumchlorid,
Kaliumchlorid oder Magnesiumchlorid ein. Ein bevorzugtes Salz ist
Natriumchlorid.
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Wässrige Lösungen,
die die erwünschte
Konzentration der oben beschriebenen Komponenten enthalten, können als
konzentrierte Bestandslösungen
hergestellt werden.
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Es
wird für
Fachleute angesichts der hierin bereitgestellten Offenbarung offensichtlich
werden, dass es bevorzugt werden kann, bestimmte Saccharide in der
wässrigen
Lösung
zu verwenden, wenn das lyophilisierte Virus für eine Lagerung bei Raumtemperatur
vorgesehen ist. Genauer wird es bevorzugt, Disaccharide wie Lactose
oder Trehalose zu verwenden, insbesondere für eine Lagerung bei Raumtemperatur.
-
Die
lyophilisierten oder entwässerten
Viren der gegenständlichen
Erfindung können
unter Verwendung einer Vielfalt von Substanzen rekonstituiert werden,
werden aber vorzugsweise unter Verwendung von Wasser rekonstituiert.
In bestimmten Fällen
können
auch verdünnte
Salzlösungen,
die das Endpräparat
auf Isotonie bringen, verwendet werden. Zusätzlich kann es vorteilhaft
sein, wässrige
Lösungen
zu verwenden, die Komponenten enthalten, von denen bekannt ist,
dass sie die Aktivität
des rekonstituierten Virus verstärken.
Solche Komponenten schließen
Cytokine wie IL-2, Polykationen wie Protaminsulfat oder andere Komponenten
ein, die die Transduktions-Wirksamkeit des rekonstituierten Virus
verstärken.
Das lyophilisierte oder entwässerte rekombinante
Virus kann mit jedem zweckmäßigen Volumen
von Wasser oder des oben erwähnten
rekonstituierenden Mittels rekonstituiert werden, das eine wesentliche
und vorzugsweise völlige
Solubilisierung der lyophilisierten oder entwässerten Probe erlaubt.
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1. Verfahren zum Verwenden der Gen-Abgabevehikel
-
Hierin
werden auch Verfahren für
das Abgeben einer ausgewählten
heterologen Sequenz an einen Vertebraten (z. B. einen Säuger wie
einen Menschen oder ein anderes warmblütiges Tier wie ein Pferd, Rind, Schwein,
Schaf, einen Hund, eine Katze, Ratte oder eine Maus) oder ein Insekt
offenbart, umfassend den Schritt des Verabreichens eines Gen-Abgabevehikels,
wie hierin beschrieben, das zum Exprimieren der ausgewählten heterologen
Sequenz in der Lage ist, an einen Vertebraten oder ein Insekt. Solche
Gen-Abgabevehikel können
entweder direkt (z. B. intravenös,
intramuskulär,
intraperitoneal, subcutan, oral, rektal, intraoculär, intranasal)
oder durch verschiedene physikalische Verfahren wie Lipofektion
(Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1989),
direkte DNA-Injektion (Fung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 353-357,
1983; Seeger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5849-5852; Acsadi
et al., Nature 352: 815-818, 1991); Mikroprojektil-Bombardierung (Williams
et al., PNAS 88: 2726-2730, 1991); Liposomen von einigen Typen (siehe
z. B. Wang et al., PNAS 84: 7851-7855, 1987), CaPO
4 (Dubensky
et al., PNAS 81: 7529-7533, 1984); DNA-Liganden (Wu et al., J. Biol.
Chem. 264: 16985-16987,
1989); Verabreichung von Nucleinsäuren alleine (
WO 90/11092 ); oder Verabreichung
von DNA, die mit einem abgetöteten
Adenovirus verknüpft
ist (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147-154, 1992); durch Polykationen-Verbindungen
wie Polylysin, unter Verwendung von rezeptorspezifischen Liganden;
sowie mit Psoralen-inaktivierten
Viren wie Sendai- oder Adenovirus verabreicht werden. Zusätzlich können die
Gen-Abgabevehikel entweder direkt (d. h. in vivo) oder an Zellen verabreicht
werden, die entfernt (ex vivo) und danach zurückgegeben worden sind.
-
Wie
oben detaillierter diskutiert, können
die Gen-Abgabevehikel an einen Vertebraten oder ein Insekt für eine breite
Vielfalt von therapeutischen und/oder anderen produktiven Zwecken
verabreicht werden, einschließlich
zum Beispiel zum Zweck des Stimulierens einer spezifischen Immunantwort;
des Inhibierens der Interaktion eines Mittels mit einem Wirtszellrezeptor;
um ein toxisches Linderungsmittel zu exprimieren, einschließlich zum
Beispiel bedingt toxischer Linderungsmittel; um das Immunsystem
immunologisch zu regulieren; um die Zellteilung zu verhindern, um
Marker zu exprimieren, für
eine Gen-Ersatztherapie, um die Wundheilung zu fördern und/oder um ein rekombinantes
Protein zu produzieren. Diese und andere Verwendungen werden unten
detaillierter diskutiert.
-
1. Immunstimulation
-
In
einem Aspekt der vorliegenden Offenbarung werden Zusammensetzungen
und Verfahren zum Verabreichen eines Gen-Abgabevehikels offenbart,
das zum Verhindern, Inhibieren, Stabilisieren oder Umkehren von
infektiösen,
krebsartigen, Autoimmun- oder Immunkrankheiten in der Lage ist.
Repräsentative
Beispiele von solchen Krankheiten schließen virale Infektionen wie
HIV, HBV, HCV, HTLV 1, HTLV II, CMV, EBV und HPV, Melanome, Diabetes,
Transplantat-Abstoßungskrankheit,
Alzheimer-Krankheit und Herzkrankheit ein. Genauer werden in einem
Aspekt der vorliegenden Offenbarung Zusammensetzungen und Verfahren
zum Stimulieren einer Immunantwort (entweder humoral oder zellvermittelt)
gegen ein pathogenes Agens geliefert, so dass das pathogene Agens
entweder abgetötet
oder inhibiert wird. Repräsentative
Beispiele von pathogenen Agenzien schließen Bakterien, Pilze, Parasiten,
Viren und Krebszellen ein.
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In
einem Aspekt ist das pathogene Agens ein Virus, und Verfahren zum
Stimulieren einer spezifischen Immunantwort und zum Inhibieren der
viralen Ausbreitung durch Verwenden eines Gen-Abgabevehikels werden
offenbart, das die Expression eines Antigens oder einer modifizierten
Form davon an empfängliche
Zielzellen lenkt, die entweder (1) zum Initiieren einer Immunantwort
auf das virale Antigen oder (2) zum Verhindern der viralen Ausbreitung
durch Besetzen von zellulären
Rezeptoren, die für
virale Interaktionen benötigt
werden, in der Lage sind. Die Expression des Vektornucleinsäure-codierten
Proteins kann transient oder mit der Zeit stabil sein. Wo eine Immunantwort
auf ein pathogenes Antigen stimuliert werden soll, ist das Gen-Abgabevehikel
vorzugsweise gestaltet, um eine modifizierte Form des Antigens zu
exprimieren, die eine Immunantwort stimulieren wird und die eine
reduzierte Pathogenität
im Verhältnis
zum natürlichen
Antigen hat. Diese Immunantwort wird erreicht, wenn Zellen die Antigene
in der korrekten Weise präsentieren,
d. h. im Zusammenhang mit den MHC-Klasse I- und/oder II-Molekülen zusammen
mit Hilfsmolekülen
wie CD3, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1 oder Analogen davon (z. B. Altmann
et al., Nature 338: 512, 1989). Es wird erwartet, dass Zellen, die mit
den Gen-Abgabevehikeln infiziert sind, dies wirksam zu tun, weil
sie die echte virale Infektion eng nachahmen und weil sie: (a) in
der Lage sind, nicht-replizierende Zellen zu infizieren, (b) nicht
in das Wirtszellgenom integrieren, (c) nicht mit irgendwelchen lebensbedrohlichen
Krankheiten assoziiert sind und (d) hohe Spiegel des heterologen
Proteins exprimieren. Aufgrund dieser Unterschiede können die Gen-Abgabevehikel
leicht als sichere virale Vektoren angesehen werden, die an gesunden
Individuen für
eine Impfstoff-Verwendung verwendet werden können.
-
Dieser
Aspekt der Offenbarung hat einen weiteren Vorteil gegenüber anderen
Systemen, von denen erwartet werden könnte, dass sie in einer ähnlichen
Weise wirken, nämlich
insofern, dass die Präsentator-Zellen
vollständig
lebensfähig
und gesund sind und im Vergleich zu heterologen Genen niedrige Spiegel
der viralen Antigene exprimiert werden. Dies stellt einen deutlichen
Vorteil dar, da die exprimierten antigenen Epitope durch selektives
Clonieren von Sub-Fragmenten des Gens für das Antigen in das rekombinante
Alphavirus verändert
werden können,
was zu Antworten gegen immunogene Epitope führt, die anderweitig durch
immundominante Epitope überschattet
sein können.
Solche ein Ansatz kann auf die Expression eines Peptids, das mehrere
Epitope hat, ausgedehnt werden, wobei eines oder mehrere der Epitope
von anderen Proteinen stammen. Weiterhin erlaubt dieser Aspekt der
Offenbarung eine wirksame Stimulierung von cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL),
die gegen antigene Epitope und Peptid-Fragmente von Antigenen gerichtet
sind, die durch Sub-Fragmente von Genen codiert werden, durch intrazelluläre Synthese
und Assoziation dieser Peptidfragmente mit den MHC-Klasse I-Molekülen. Dieser
Ansatz kann verwendet werden, um wichtige immundominante Epitope
für eine
CTL-Induktion zu kartieren.
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Eine
Immunantwort kann auch durch Transferieren des Gens für den spezifischen
T-Zellrezeptor, der das Antigen von Interesse erkennt (wenn nötig im Zusammenhang
mit einem geeigneten MHC-Molekül),
für ein
Immunglobulin, das das Antigen von Interesse erkennt, oder für ein Hybrid
der zwei, das eine CTL-Antwort in
der Abwesenheit des MHC-Zusammenhangs bereitstellt, an eine geeigneten
Immunzelle (wie einen T-Lymphocyten) erreicht werden. Daher können die
Gen-Abgabevehikel-Zellen als ein Immunstimulans, Immunmodulator
oder Impfstoff verwendet werden.
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In
einem anderen Aspekt dieser Offenbarung werden Verfahren zum Produzieren
von Inhibitor-Linderungsmitteln offenbart, worin die Gen-Abgabevehikel
defekte interferierende virale Strukturproteine, die eine virale
Zusammenlagerung inhibieren, abgeben und exprimieren. Solche Gen-Abgabevehikel
können
defekte gag-, pol-, env- oder andere virale Partikelproteine oder
Peptide codieren, und diese würden
in einer dominanten Weise die Zusammenlagerung von viralen Partikeln inhibieren.
Dies erfolgt, weil die Interaktion von normalen Untereinheiten des
viralen Partikels durch die Interaktion mit den defekten Untereinheiten
gestört
ist.
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In
einem anderen Aspekt dieser Offenbarung werden Verfahren für die Expression
der inhibierenden Peptide oder Proteine, die spezifisch für eine virale
Protease sind, offenbart. Kurz, die virale Protease spaltet die
viralen gag- und gag/pol-Proteine in eine Reihe von kleineren Peptiden.
Ein Versagen dieser Spaltung führt in
allen Fällen
zu einer vollständigen
Inhibition der Produktion von infektiösen retroviralen Partikeln.
Als ein Beispiel ist bekannt, dass die HIV-Protease eine Aspartyl-Protease
ist, und von diesen ist bekannt, dass sie durch Peptide inhibiert
werden, die aus Aminosäuren
vom Protein oder von Analogen gemacht sind. Gen-Abgabevehikel, die HIV inhibieren sollen,
werden eine oder mehrere fusionierte Kopien von solchen Peptid-Inhibitoren exprimieren.
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Ein
anderer Aspekt involviert die Abgabe von Suppressor-Genen, die,
wenn sie in einem Zelltyp deletiert, mutiert oder nicht exprimiert
werden, zu einer Tumorentwicklung in jenem Zelltyp führen. Das
Wiedereinbringen des deletierten Gens durch ein Gen-Abgabevehikel
führt zur
Rückbildung
des Tumor-Phänotyps
in diesen Zellen. Beispiele von solchen Krebsarten sind das Retinoblastom
und der Wilms-Tumor. Da eine Malignität als eine Inhibition der zellulären terminalen
Differenzierung im Vergleich zum Zellwachstum angesehen werden kann,
sollten die Alphavirus-Vektorabgabe und Expression von Genprodukten,
die zur Differenzierung eines Tumors führen, im Allgemeinen auch zu
einer Rückbildung
führen.
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In
noch einem anderen Aspekt liefert das Gen-Abgabevehikel eine therapeutische
Wirkung durch Transkribieren eines Ribozyms (eines RNA-Enzyms) (Haseloff
und Gerlach, Nature 334: 585, 1989), das RNA-Moleküle, die
mit einer pathogenen Funktion korrespondieren, spalten und daher
inaktivieren wird. Da Ribozyme durch Erkennen einer spezifischen
Sequenz in der Ziel-RNA wirken und diese Sequenz normalerweise 12
bis 17 bp ist, erlaubt dies eine spezifisches Erkennen einer bestimmten
RNA-Spezies wie einer RNA oder eines retroviralen Genoms. Eine zusätzliche
Spezifität
kann in manchen Fällen
dadurch erreicht werden, dass man dies zu einem bedingt toxischen
Linderungsmittel macht (siehe unten).
-
Ein
Weg des Erhöhens
der Wirksamkeit von inhibitorischen Linderungsmitteln ist es, virale
inhibitorische Gene im Zusammenhang mit der Expression von Genen, die
die Wahrscheinlichkeit einer Infektion der resistenten Zelle durch
das in Frage kommende Virus erhöhen,
zu exprimieren. Das Ergebnis ist ein nicht-produktives „Sackgassen"-Ereignis, das um
die produktiven Infektionsereignisse konkurrieren würde. Im
spezifischen Fall von HIV können
die Gen-Abgabevehikel abgegeben werden, die eine HIV-Replikation
inhibieren (durch Exprimieren von Antisense-tat usw., wie oben beschrieben)
und auch Proteine überexprimieren,
die für die
Infektion benötigt
werden, wie CD4. Auf diese Weise wirkt eine relativ kleine Zahl
von Vektor-infizierten, HIV-resistenten
Zellen als ein „Ausguss" oder ein „Magnet" für mehrere
nicht-produktive Fusionsereignisse mit freiem Virus oder viral infizierten
Zellen.
-
2. Blockierungsmittel
-
Viele
infektiöse
Krankheiten, Krebsarten, Autoimmunkrankheiten und andere Krankheiten
involvieren die Interaktion von viralen Partikeln mit Zellen, von
Zellen mit Zellen oder von Zellen mit Faktoren, die durch sich selbst
oder andere Zellen produziert werden. In viralen Infektionen treten
Viren üblicherweise
durch Rezeptoren auf der Oberfläche
von empfänglichen
Zellen in die Zellen ein. In Krebsarten oder anderen proliferativen
Zuständen
(z. B. Restenose) können
Zellen unpassend oder gar nicht auf Signale von anderen Zellen oder
Faktoren antworten, oder spezifische Faktoren können mutiert, überexprimiert
oder unterexprimiert werden, was im Verlust einer passenden Zellzyklussteuerung
resultiert. In einer Autoimmunkrankheit gibt es eine unpassende
Erkennung von „Eigen"-Markern. In der
vorliegenden Offenbarung können
solche Interaktionen durch in vivo-Produzieren eines Analogs zu
einem der Partner in einer Interaktion blockiert werden. Alternativ kann
die Zellzyklussteuerung durch Verhindern des Übergangs von einer Phase in
eine andere (z. B. G1- zu S-Phase) unter Verwendung eines blockierenden
Faktors, der fehlt oder unterexprimiert wird, wiederhergestellt werden.
Diese Blockierungsaktion kann intrazellulär, auf der Zellmembran oder
extrazellulär
erfolgen, und die Wirkung eines Alphavirusvektors, der ein Gen für ein blockierendes
Agens trägt,
kann entweder vom Inneren einer empfänglichen Zelle oder durch ,
Sezernieren einer Version des blockierenden Proteins vermittelt
werden, um die pathogene Interaktion lokal zu blockieren.
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Im
Fall von HIV sind die zwei Agentien der Interaktion das gp120/gp41-Hüllprotein und das CD4-Rezeptormolekül. Daher
würde ein
geeigneter Blocker ein Gen-Abgabevehikel sein, das entweder ein HIV-env-Analog,
das den HIV-Eintritt blockiert, ohne pathogene Wirkungen zu verursachen,
oder ein CD4-Rezeptoranalog exprimiert. Das CD4-Analog würde sezerniert
werden und würde
wirken, um benachbarte Zellen zu schützen, während das gp120/gp41 sezerniert
oder nur intrazellulär
produziert wird, um nur die Vektor-enthaltenden Zellen zu schützen. Es
kann vorteilhaft sein, menschliche schwere Immunglobulin-Ketten
oder andere Komponenten zu CD4 hinzuzufügen, um die Stabilität oder Komplement-Lyse
zu verstärken.
Die Verabreichung eines Gen-Abgabevehikels, das solch ein lösliches
Hybrid-CD4 codiert, an einen Wirt resultiert in einem kontinuierlichen
Angebot eines stabilen Hybridmoleküls. Die Wirksamkeit der Behandlung
kann durch Messen der üblichen
Indikatoren des Krankheitsfortschreitens, einschließlich des
Antikörperspiegels,
der viralen Antigenproduktion, der infektiösen HIV-Spiegel oder der Spiegel
von nicht-spezifischen Infektionen getestet werden.
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Im
Fall von unkontrollierten proliferativen Zuständen wie Krebs oder Restenose
kann das Zellzyklus-Fortschreiten durch die Expression einer Reihe
von verschiedenen Faktoren, die die Signalgebung durch Cycline oder
Cyclin-abhängige
Kinasen (CDK) beeinflussen, gestoppt werden. Zum Beispiel regulieren
die Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitoren
p16, p21 und p27 alle eine Cyclin:CDK-vermittelte Zellzyklus-Signalgebung.
Eine Überexpression
dieser Faktoren in einer Zelle durch ein Gen-Abgabevehikel resultiert
in einer cytostatischen Suppression der Zellproliferation. Andere
Faktoren, die therapeutisch verwendet werden können, wie blockierende Mittel
oder Ziele, um die Zellproliferation zu zerstören, schließen zum Beispiel Wildtyp- oder mutiertes
Rb, p53, Myc, Fos, Jun, PCNA, GAX, lentivirales vpr und p15 ein.
In verwandten Aspekten können cardiovaskuläre Krankheiten
wie Restenose oder Atherosklerose mit Vektoren behandelt oder verhindert
werden, die Produkte exprimieren, die eine Re-Endothelialisierung
oder vaskuläre
Umgestaltung fördern
(z. B. VEGF, TFPI, SOD).
-
3. Expression von Linderungsmitteln
-
Techniken,
die ähnlich
zu jenen sind, die oben beschrieben wurden, können verwendet werden, um Gen-Abgabevehikel
zu produzieren, die die Expression eines Mittels (oder „Linderungsmittels") lenken, das zum
Inhibieren einer Funktion eines pathogenen Agens oder Gens in der
Lage ist. In der vorliegenden Erfindung bedeutet „zum Inhibieren
einer Funktion in der Lage sein",
dass das Linderungsmittel entweder direkt die Funktion inhibiert
oder dies indirekt tut, zum Beispiel durch Konvertieren eines Agens,
das in der Zelle vorhanden ist, von einem, das normalerweise eine
Funktion des pathogenen Agens nicht inhibieren würde, zu einem, das dies tut.
Beispiele von solchen Funktionen für virale Krankheiten schließen Adsorption,
Replikation, Genexpression, Zusammenlagerung und Austreten des Virus
aus infizierten Zellen ein. Beispiele von solchen Funktionen für eine krebsartige
Zelle, einen Krebs-fördernden
Wachstumsfaktor oder einen unkontrollierten proliferativen Zustand
(z. B. eine Restenose) schließen
Lebensfähigkeit,
Zellreplikation, veränderte
Anfälligkeit gegenüber externen
Signalen (z. B. Kontakt-Inhibition) und Fehlen einer Produktion
oder Produktion von mutierten Formen von anti-oncogenen Proteinen
ein.
-
a. Inhibitor-Linderungsmittel
-
In
einem Aspekt der vorliegenden Erfindung lenkt das Gen-Abgabevehikel
die Expression eines Gens, das mit einer Funktion eines pathogenen
Agens interferieren kann, zum Beispiel in viralen oder malignen Krankheiten.
Eine solche Expression kann entweder im Wesentlichen kontinuierlich
oder als Antwort auf das Vorliegen eines anderen Agens, das entweder
mit dem pathogenen Zustand oder mit einem spezifischen Zelltyp assoziiert
ist (ein „identifizierendes
Agens"), in der
Zelle sein. Zusätzlich
kann die Vektorabgabe durch Lenken des Vektoreintritts spezifisch
auf den erwünschten
Zelltyp (zum Beispiel eine viral infizierte oder maligne Zelle)
gesteuert werden, wie oben diskutiert.
-
Ein
Verfahren der Verabreichung ist Leukophorese, in der etwa 20% der
PBLs eines Individuums zu irgendeinem Zeitpunkt entfernt und in
vitro manipuliert werden. So können
ungefähr
2 × 109 Zellen behandelt und ersetzt werden. Wiederholte
Behandlungen können
auch durchgeführt
werden. Alternativ kann Knochenmark behandelt und ihm erlaubt werden,
die Wirkung zu amplifizieren, wie oben beschrieben. Zusätzlich können Verpackungszelllinien,
die einen Vektor produzieren, direkt in ein Subjekt injiziert werden,
was eine kontinuierliche Produktion von rekombinanten Virionen erlaubt.
-
In
einer Ausführungsform
können
Gen-Abgabevehikel, die RNA exprimieren, die komplementär zu pathogenen
Schlüssel-Gentranskripten
sind (zum Beispiel ein virales Genprodukt oder ein aktiviertes zelluläres Oncogen),
verwendet werden, um die Translation jenes Transkripts in ein Protein
zu inhibieren, wie die Inhibition der Translation des HIV-tat-Proteins.
Da die Expression dieses Proteins für die virale Replikation wesentlich
ist, würden
Zellen, die das Gen-Abgabevehikel enthalten, resistent gegen eine
HIV-Replikation sein.
-
In
einer zweiten Ausführungsform,
wo das pathogene Agens ein einzelsträngiges Virus ist, das ein Verpackungssignal
aufweist, wird RNA, die komplementär zum viralen Verpackungssignal
ist (z. B. einem HIV-Verpackungssignal,
wenn das Linderungsmittel gegen HIV gerichtet ist), exprimiert,
so dass die Assoziation von diesen Molekülen mit dem viralen Verpackungssignal
im Fall von Retroviren die Stammschleifen-Bildung oder tRNA-Primerbindung,
die für
eine korrekte Verkapselung oder Replikation des Alphavirus-RNA-Genoms
benötigt
wird, inhibieren wird.
-
In
einer dritten Ausführungsform
kann ein Gen-Abgabevehikel eingebracht werden, das ein Linderungsmittel,
das zum selektiven Inhibieren der Expression eines pathogenen Gens
in der Lage ist, oder ein Linderungsmittel exprimiert, das zum Inhibieren
der Aktivität
eines Proteins, das durch das pathogene Agens produziert wird, in
der Lage ist. Im Fall von HIV ist ein Beispiel ein mutiertes tat-Protein, dem die
Fähigkeit
fehlt, die Expression der HIV-LTR zu transaktivieren, und das (in
einer transdominanten Weise) mit dem normalen Funktionieren des
tat-Proteins interferiert.
Solch eine Mutante ist für
das HTLV II-tat-Protein identifiziert worden ("XII Leu5"-Mutante; siehe Wachsman
et al., Science 235: 674, 1987). Ein mutiertes Transrepressor-tat
sollte die Replikation soweit inhibieren, wie es für einen
analogen mutierten Repressor in HSV-1 gezeigt worden ist (Friedmann
et al., Nature 335: 452, 1988).
-
Auf
solch ein transkriptionelles Repressorprotein kann in Gewebekultur
unter Verwendung jedes viral-spezifischen transkriptionellen Promotors
selektiert werden, dessen Expression durch ein virusspezifisches,
transaktivierendes Protein stimuliert wird (wie oben beschrieben).
Im spezifischen Fall von HIV wird eine Zelllinie, die das HIV-tat-Protein
und das HSVTK-Gen, das durch den HIV-Promotor gelenkt wird, exprimiert,
in der Anwesenheit von ACV sterben. Wenn jedoch eine Reihe von mutierten
tat-Genen in das System eingebracht wird, wird eine Mutante mit
den geeigneten Eigenschaften (d. h. welche die Transkription des HIV-Promotors
in der Anwesenheit von Wildtyp-tat unterdrückt) wachsen und selektiert
werden. Das mutierte Gen kann dann wieder von diesen Zellen isoliert
werden. Eine Zelllinie, die mehrere Kopien des bedingt letalen Vektors/tat-Systems
enthält,
kann verwendet werden, um sicherzustellen, dass überlebende Zellclone nicht durch
endogene Mutationen in diesen Genen verursacht werden. Eine Batterie
von zufällig
mutagenisierten tat-Genen wird dann unter Verwendung eines „rettungsfähigen" Alphavirusvektors
(d. h. eines, der das mutierte tat-Protein exprimiert und einen
bakteriellen Ursprung der Replikation und einen Wirkstoff-Resistenzmarker für das Wachstum
und die Selektion in Bakterien enthält) in diese Zellen eingebracht.
Dies ermöglicht
eine große
Zahl von zufälligen
Mutationen, die bewertet werden sollen, und erlaubt ein leichtes
nachfolgendes molekulares Clonieren der erwünschten mutierten Zelllinie.
Diese Vorgehensweise kann verwendet werden, um Mutationen in einer
Vielfalt von viralen transkriptionellen Aktivator-/viralen Promotorsystemen
für potenzielle antivirale
Therapien zu identifizieren und anzuwenden.
-
b. Bedingte toxische Linderungsmittel
-
Ein
anderer Ansatz für
das Inhibieren eines pathogenen Agens ist, ein Linderungsmittel
zu exprimieren, das für
die Zelle, die den pathogenen Zustand exprimiert, toxisch ist. In
diesem Fall sollte die Expression des Linderungsmittel vom Gen-Abgabevehikel
durch die Anwesenheit einer Einheit limitiert sein, die mit dem pathogenen
Agens assoziiert ist, wie einer spezifischen viralen RNA-Sequenz,
die den pathogenen Zustand identifiziert, um die Zerstörung von
nicht-pathogenen Zellen zu verhindern.
-
In
einer Ausführungsform
dieses Verfahrens kann ein Gen-Abgabevehikel verwendet werden, um
ein toxisches Gen (wie oben diskutiert) von einem zellspezifischen
responsiven Vektor zu exprimieren. In dieser Weise werden vorzugsweise
schnell replizierende Zellen, die die RNA-Sequenzen enthalten, die
zum Aktivieren der zellspezifischen responsiven Vektoren in der
Lage sind, durch das cytotoxische Agens, das durch das Gen-Abgabevehikel
produziert wird, zerstört.
-
In
einer ähnlichen
Weise zur vorhergehenden Ausführungsform
kann das Gen-Abgabevehikel ein Gen für die Phosphorylierung, Phosphoribosylierung,
Ribosylierung oder einen anderen Metabolismus eines Purin- oder
Pyrimidin-basierten
Arzneistoffes tragen. Dieses Gen muss in Säugerzellen kein Äquivalent haben
und könnte
von Organismen wie einem Virus, Bakterium, Pilz oder einem Protozoon
stammen. Ein Beispiel davon würde
das E. coli-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Genprodukt
sein, das in der Anwesenheit von Thioxanthin letal ist (siehe Besnard
et al., Mol. Cell. Biol. 7: 4139-4141, 1987). Bedingt. letale Genprodukte
dieses Typs (oben auch als „Prodrug-konvertierende
Enzyme" bezeichnet)
haben eine Anwendung in vielen derzeit bekannten Purin- oder Pyrimidin-basierten
Antikrebs-Arzneistoffen, die oft eine intrazelluläre Ribosylierung
oder Phosphorylierung benötigen,
um wirksame cytotoxische Agenzien zu werden. Das bedingt letale
Genprodukt könnte
auch einen nicht-toxischen Arzneistoff metabolisieren, der kein
Purin- oder Pyrimidin-Analog zu einer cytotoxischen Form ist (siehe
Searle et al., Brit. J. Cancer 53: 377-384, 1986).
-
Säugerviren
tendieren im Allgemeinen dazu, „sehr frühe" Gene zu haben, die für eine nachfolgende transkriptionelle
Aktivierung von anderen viralen Promotorelementen notwendig sind.
RNA-Sequenzen dieser Art sind ausgezeichnete Kandidaten für das Aktivieren
von intrazellulären
Signalen von Alphavirusvektoren (oder „identifizierenden Agenzien") einer viralen Infektion.
Daher könnten
bedingt letale Gene von zellspezifischen Alphavirus-Vektoren, die
auf diese viralen „sehr
frühen" Genprodukten responsiv
sind, spezifisch Zellen abtöten,
die mit irgendeinem bestimmten Virus infiziert sind. Zusätzlich könnte, da
die menschlichen und Interferon-Promotorelemente als Antwort auf
eine Infektion durch eine breite Vielfalt von nicht verwandten Viren transkriptionell
aktiviert werden, das Einbringen von Vektoren, die ein bedingt letales
Genprodukt wie HSVTK zum Beispiel als Antwort auf eine Interferonproduktion
exprimieren, in der Zerstörung
von Zellen resultieren, die mit einer Vielfalt von verschiedenen
Viren infiziert sind.
-
In
einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Gen-Abgabevehikel geliefert,
die die Expression eines Genprodukts lenken, das zum Aktivieren
eines andernfalls inaktiven Vorläufers
in einen aktiven Inhibitor des pathogenen Agens in der Lage ist.
Zum Beispiel kann das HSVTK-Genprodukt verwendet werden, um potenziell
antivirale Nucleosidanaloge wie AZT oder ddC wirksamer zu metabolisieren.
Das HSVTK-Gen kann unter der Kontrolle eines zellspezifischen responsiven
Vektors exprimiert und in diese Zelltypen eingebracht werden. AZT
(und andere antivirale Nucleosidagenzien) müssen durch zelluläre Mechanismen
zu der Nucleosidtriphosphat-Form metabolisiert werden, um die retrovirale
reverse Transkriptase und so die HIV-Replikation spezifisch zu inhibieren
(Furmam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8333-8337, 1986).
Die konstituive Expression von HSVTK (einer Nucleosid- und einer
Nucleosidkinase mit sehr breiter Substratspezifität) resultiert
in einem wirksameren Metabolismus dieser Arzneistoffe in ihre biologisch
aktive Nucleotidtriphosphat-Form. Eine AZT- oder ddC-Therapie wird
dadurch wirksamer, was niedrigere Dosen, eine weniger generalisierte
Toxizität
und eine höhere
Potenz gegen eine produktive Infektion ermöglicht. Zusätzliche Nucleosid-Analoge,
deren Nucleotidtriphosphat-Formen eine Selektivität für eine retrovirale
reverse Transkriptase zeigen, die aber als ein Ergebnis der Substratspezifität der zellulären Nucleosid-
und Nucleotidkinasen nicht phosphoryliert sind, werden wirksamer
gemacht werden.
-
Die
Verabreichung dieser Gen-Abgabevehikel an menschliche T-Zell- und
Makrophagen/Monocyten-Zelllinien kann ihre Resistenz gegen HIV in
der Anwesenheit von AZT und ddC im Vergleich zu denselben Zellen
ohne retrovirale Vektorbehandlung erhöhen. Die Behandlung mit AZT
würde bei
niedrigeren als den normalen Spiegeln erfolgen, um toxische Nebenwirkungen
zu vermeiden, aber die Verbreitung von HIV noch wirksam zu inhibieren.
Der Verlauf der Behandlung würde
sein, wie für
den Blocker beschrieben.
-
In
einer Ausführungsform
trägt das
Gen-Abgabevehikel ein Gen, das ein Produkt spezifiziert, das selbst
nicht toxisch ist, aber wenn es prozessiert oder durch ein Protein
wie eine Protease, die spezifisch für ein virales oder anderes
Pathogen ist, modifiziert wird, in eine toxische Form konvertiert
wird. Zum Beispiel könnte
das Gen-Abgabevehikel ein Gen tragen, das ein Pro-Protein für die Ricin
A-Kette codiert, die bei Prozessierung durch die HIV-Protease toxisch
wird. Genauer, eine synthetische inaktive Pro-Proteinform des Toxins
Ricin oder von Diphtherie A-Ketten könnte dadurch, dass bei der
HIV-viral-codierten Protease bewirkt wird, dass sie ein geeignetes „Pro"-Element erkennt
und abspaltet, in die aktive Form gespalten werden.
-
In
einer anderen Ausführungsform
kann das Gen-Abgabevehikel ein „berichtendes Produkt" auf der Oberfläche der
Zielzellen als Antwort auf das Vorliegen eines identifizierenden
Agens in den Zellen (wie der Expression eines viralen Gens) exprimieren.
Dieses Oberflächenprotein
kann durch ein cytotoxisches Agens wie Antikörper gegen das berichtende
Protein oder durch cytotoxische T- Zellen erkannt werden. In einer ähnlichen
Weise kann solch ein System als ein Nachweissystem verwendet werden
(siehe unten), um einfach jene Zellen zu identifizieren, die ein
bestimmtes Gen aufweisen, das ein identifizierendes Protein exprimiert.
-
In ähnlicher
Weise könnte
in einer anderen Ausführungsform
ein Oberflächenprotein
exprimiert werden, das selbst therapeutisch vorteilhaft sein würde. Im
bestimmten Fall von HIV kann die Expression des menschlichen CD4-Proteins spezifisch
in HIV-infizierten Zellen in zwei Hinsichten vorteilhaft sein:
- 1. Die intrazelluläre Bindung von CD4 an HIV-env
könnte
die Bildung von lebensfähigen
viralen Partikeln so weit inhibieren, wie gezeigt worden ist, dass
lösliches
CD4 dies für
freies Virus tut, aber ohne das Problem der systematischen Beseitigung
und möglichen
Immunogenität,
da das Protein membrangebunden bleiben wird und strukturell identisch
zu endogenem CD4 ist (gegen das der Patient immunologisch tolerant sein
sollte).
- 2. Da der CD4/HIV-env-Komplex als eine Ursache des Zelltods
angenommen worden ist, führt
eine zusätzliche
Expression von CD4 (in der Anwesenheit eines Überschusses von HIV-env, das
in HIV-infizierten Zellen vorhanden ist) zu schnellerem Zelltod
und inhibiert so die virale Ausbreitung. Dies kann besonders auf Monocyten
und Makrophagen anwendbar sein, die als ein Reservoir für die Virusproduktion
als ein Ergebnis ihrer relativen Unbeeinflussbarkeit gegenüber der
HIV-induzierten Cytotoxizität
(die wiederum offenbar aufgrund des relativen Fehlens von CD4 auf
ihren Oberflächen
vorliegt) wirken.
-
In
einer anderen Ausführungsform
kann das Gen-Abgabevehikel ein Ribozym liefern, das RNA-Moleküle, die
für die
Lebensfähigkeit
der vektorinfizierten Zelle wesentlich sind, spalten und inaktivieren
wird. Durch Abhängigmachen
der Ribozymproduktion von einer spezifischen RNA-Sequenz, die mit
dem pathogenen Zustand korrespondiert, wie HIV-tat, ist die Toxizität spezifisch
für den
pathogenen Zustand.
-
4. Expression von Markern
-
Die
oben beschriebene Technik des Exprimierens eines Linderungsmittels
in einer Zelle als Antwort auf eine spezifische RNA-Sequenz kann
auch modifiziert werden, um einen Nachweis eines bestimmten Gens in
einer Zelle, die ein identifizierendes Protein exprimiert (zum Beispiel
ein Gen, das durch ein bestimmtes Virus getragen wird), zu ermöglichen
und daher den Nachweis von Zellen, die jenes Virus tragen, zu ermöglichen.
Zusätzlich
ermöglicht
diese Technik den Nachweis von Viren (wie HIV) in einer klinischen
Probe von Zellen, die ein identifizierendes Protein tragen, das
mit dem Virus assoziiert ist.
-
Diese
Modifizierung kann durch Bereitstellen eines Genoms, das ein Produkt
codiert, dessen Vorliegen leicht identifiziert werden kann (das „Markerprodukt"), in einem Gen-Abgabevehikel
erreicht werden, das auf das Vorliegen des identifizierenden Proteins
in den infizierten Zellen reagiert. Zum Beispiel produziert HIV, wenn
es geeignete Zellen infiziert, tat und rev. Die Indikatorzellen
können
daher mit einem Genom geliefert werden (wie durch Infektion mit
einem geeigneten rekombinanten Alphavirus), das ein Markergen wie
das alkalische Phosphatase-Gen, das β-Galactosidase-Gen oder das
Luciferase-Gen codiert, das nach Aktivierung durch das tat- und/oder
rev-RNA-Transkript durch das rekombinante Alphavirus exprimiert
wird. Im Fall der β-Galactosidase
oder alkalischen Phosphatase resultiert das Aussetzen der Zellen
gegenüber
den Substratanalogen in einer Farb- oder Fluoreszenzänderung,
wenn die Probe positiv für
HIV ist. Im Fall der Luciferase wird das Aussetzen der Probe gegenüber Luciferin
in einer Lumineszenz resultieren, wenn die Probe positiv für HIV ist.
Für intrazelluläre Enzyme
wie die β-Galactosidase
kann der virale Titer direkt durch Zählen der gefärbten oder
fluoreszierenden Zellen oder durch Herstellen von Zellextrakten
und Durchführen
eines geeigneten Tests gemessen werden. Für die Membranbindungsform der
alkalischen Phosphatase kann der Virustiter auch durch Durchführen von
Enzymtests auf der Zelloberfläche
unter Verwenden eines fluoreszierenden Substrats gemessen werden.
Für sezernierte
Enzyme wie eine manipulierte Form der alkalischen Phosphatase werden
kleine Proben des Kulturüberstandes
auf die Aktivität
getestet, was ein kontinuierliches Überwachen einer einzelnen Kultur
im Zeitverlauf ermöglicht.
Daher können
verschiedene Formen dieses Markersystems für verschiedene Zwecke verwendet
werden. Diese schließen
das Zählen
von aktivem Virus oder empfindliches und einfaches Messen der viralen
Ausbreitung in einer Kultur und der Inhibition dieser Ausbreitung
durch verschiedene Arzneistoffe ein.
-
Eine
weitere Spezifität
kann durch Testen auf das Vorliegen des Virus entweder mit oder
ohne neutralisierende(n) Antikörper(n)
gegen jenes Virus in das vorhergehende System inkorporiert werden.
Zum Beispiel können
in einem Teil der klinischen Probe, die getestet wird, neutralisierende
Antikörper
gegen HIV vorhanden sein; wohingegen es in einem anderen Teil keine
neutralisierenden Antikörper
geben würde.
Wenn die Tests in dem System, wo es Antikörper gab, negativ waren und
positiv, wo es keine Antikörper
gab, würde
dies beim Bestätigen
des Vorliegens von HIV behilflich sein.
-
In
einem analogen System für
einen in vitro-Test kann das Vorliegen eines bestimmten Gens wie
eines viralen Gens in einer Zellprobe bestimmt werden. In diesem
Fall sind die Zellen der Probe mit einem geeigneten Gen-Abgabevehikel
infiziert, das das Reportergen trägt, das nur in der Anwesenheit
des geeigneten viralen RNA-Transkripts exprimiert wird. Das Reportergen
wird nach Eindringen in die Probenzellen sein berichtendes Produkt
(wie β-Galactosidase
oder Luciferase) nur exprimieren, wenn die Wirtszelle die geeigneten
viralen Proteine exprimiert.
-
Diese
Tests sind schneller und empfindlicher, da das Reportergen eine
größere Menge
des berichtenden Produkts als des vorhandenen identifizierenden
Agens exprimieren kann, was in einer amplifizierenden Wirkung resultiert.
-
5. Immun-Herunterregulierung
-
Wie
oben beschrieben, liefert die vorliegende Erfindung auch Gen-Abgabevehikel, die
zum Unterdrücken
von einem oder mehreren Elementen des Immunsystems in Zielzellen,
die mit dem Alphavirus infiziert sind, in der Lage sind. Kurz, eine
spezifische Herunterregulierung von ungeeigneten oder unerwünschten
Immunantworten wie bei chronischer Hepatitis oder in Transplantaten
von heterologem Gewebe wie Knochenmark kann unter Verwendung von
immunsuppressiven viralen Genprodukten hergestellt werden, die die
Oberflächenexpression
von Transplantations(MHC)-Antigen unterdrücken. Die Gruppe C-Adenoviren
Ad2 und Ad5 besitzen ein 19 kd-Glycoprotein (gp19), das in der E3-Region
des Virus codiert wird. Dieses gp19-Molekül bindet an Klasse I-MHC-Moleküle im endoplasmatischen
Retikulum von Zellen und verhindert eine terminale Glycosylierung
und Translozierung von Klasse I-MHC an die Zelloberfläche. Zum
Beispiel können
vor einer Knochenmark-Transplantation Spender-Knochenmarkzellen mit einem gp19-codierenden
Gen-Abgabevehikel infiziert werden, das nach Expression des gp19
die Oberflächenexpression
von MHC-Klasse I-Transplantationsantigenen inhibiert. Diese Spenderzellen
können
mit einem geringen Risiko einer Transplantatabstoßung transplantiert
werden und können
einen minimalen immunsuppresiven Behandlugsplan für den Transplantat-Patienten
erfordern. Dies kann einen annehmbaren chimären Spender-Empfänger-Zustand
ermöglichen, um
mit wenigeren Komplikationen zu existieren. Ähnliche Behandlungen können verwendet
werden, um den Bereich der sogenannten Autoimmunkrankheiten, einschließlich Lupus
erythromiatis, multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis oder chronischer
Hepatitis B-Infektion, zu behandeln.
-
Ein
alternatives Verfahren involviert die Verwendung von Antisense-Botschaft,
Ribozym oder einem anderen spezifischen Genexpressionsinhibitor,
der spezifisch für
T-Zellclone ist, die im Wesen autoreaktiv sind. Diese blockieren
die Expression des T-Zell-Rezeptors von bestimmten unerwünschten
Clonen, die für eine
Autoimmun-Antwort verantwortlich sind. Das Antisense-, Ribozym-
oder andere Gen kann unter Verwendung des viralen Vektor-Abgabesystems
eingebracht werden.
-
6. Ersatz- oder Steigerungs-Gentherapie
-
Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft transformierte
Zellen eines Vertebraten oder eines Insekts mit einem Gen-Abgabevehikel,
das genetische Sequenzen bereitstellt, die zum Exprimieren eines therapeutischen
Proteins in der Lage sind. In einer Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist das Gen-Abgabevehikel
gestaltet, um ein therapeutisches Protein zu exprimieren, das zum
Verhindern, Inhibieren, Stabilisieren oder Umkehren eines vererbten
oder nicht-vererbten
genetischen Defekts in Metabolismus, der Immunregulierung, der hormonellen
Regulierung, einer enzymatischen oder membranassoziierten strukturellen
Funktion in der Lage ist. Diese Ausführungsform beschreibt auch
das Gen-Abgabevehikel, das zum Transduzieren von individuellen Zellen
in der Lage ist, wobei das therapeutische Protein in der Lage ist,
systemisch oder lokal von einer spezifischen Zelle oder einem spezifischen
Gewebe exprimiert zu werden, wodurch das therapeutische Protein
(a) zum Ersatz eines fehlenden oder defekten zellulären Proteins
oder Enzyms oder (b) zur ergänzenden
Produktion eines defekten oder niedrig exprimierten zellulären Proteins
oder Enzyms in der Lage ist. Solche Krankheiten können zystische
Fibrose, Parkinson-Krankheit, Hypercholesterinämie, Adenosindesaminase-Mangel, β-Globin-Störungen,
Hämophilie
A & B, Gaucher-Krankheit, Diabetes
und Leukämie einschließen.
-
Als
ein Beispiel der vorliegenden Erfindung kann ein Gen-Abgabevehikel
konstruiert und verwendet werden, um die Gaucher-Krankheit zu behandeln.
Kurz, die Gaucher-Krankheit ist eine genetische Störung, die
durch den Mangel des Enzyms Glucocerebrosidase charakterisiert ist.
Dieser Typ der Therapie ist ein Beispiel einer Einzelgen-Ersatztherapie
durch Bereitstellen eines funktionellen zellulären Enzyms. Dieser Enzymmangel
führt zu
der Akkumulierung von Glucocerebrosid in den Lysosomen von allen
Zellen im Körper.
Dennoch ist der Krankheits-Phänotyp
außer
in sehr seltenen neuropathischen Formen der Krankheit nur in den Makrophagen
manifestiert. Diese Krankheit führt
normalerweise zur Vergrößerung der
Leber und Milz und zu Läsionen
in den Knochen. (Für
eine Literaturübersicht
siehe Science 256: 794, 1992 und The Metabolic Basis of Inherited
Disease, 6. Aufl. Scriver et al., Bd. 2, S. 1677).
-
Gen-Abgabevehikel
können
in ähnlicher
Weise verwendet werden, um eine breite Vielfalt von therapeutischen
Proteinen abzugeben, um eine Krankheit und einen Krankheitsvorgang
zu behandeln, zu heilen, zu verhindern. Repräsentative Beispiele von solchen
Genen schließen
Insulin (siehe
US 4,431,740 und
BE 885196 A ), Hämoglobin
(Laven et al., Cell 21: 647-51, 1980), Erythropoietin (EPO; siehe
US 4,703,008 ), Megakaryocyten-Wachstums-
und Differenzierungsfaktor (MGDF), Stammzell-Faktor (SCF), G-CSF
(Nagata et al., Nature 319: 415-418, 1986), GM-CSF, M-CSF (siehe
WO 8706954 ), den flt3-Liganden
(Lyman et al. (1993), Cell 75: 1157-1167), EGF, sauren und basischen
FGF, PDGF, Mitglieder der Interleukin- oder Interferonfamilien,
vorstehend, neurotropische Faktoren (z. B. BDNF; Rosenthal et al.,
Endocrinology 129: 1289-1294, 1991, NT-3; siehe
WO 9103569 , CNTF; siehe
WO 9104316 , NGF; siehe
WO 9310150 ), Gerinnungsfaktoren (z.
B. Faktoren VIII und IX), thrombolytische Faktoren wie t-PA (siehe
EP 292009 ,
AU 8653302 und
EP 174835 ) und Streptokinase (siehe
EP 407942 ), das menschliche
Wachstumshormon (siehe
JP 94030582 und
US 4,745,069 ) und andere
Tier-Somatotropine,
Integrine und andere Zell-Adhäsionsmoleküle wie ICAM-1
und ELAM (siehe auch oben diskutierte andere „heterologe Sequenzen") und andere Wachstumsfaktoren
wie IGF-I und IGF-II, TGF-β,
osteogenes Protein-1 (Ozkaynak et al., EMBO J. 9: 2085-2093, 1990)
und andere Knochen-morphogenetische Proteine (z. B. BMP-4, Nakase
et al., J. Bone Miner. Res. 9: 651-659, 1994) ein, sind aber nicht
darauf limitiert.
-
7. Lymphokine und Lymphokin-Rezeptoren
-
Wie
oben angemerkt, liefert die vorliegende Erfindung auch Gen-Abgabevehikel, die
unter anderen Funktionen die Expression von einem oder mehreren
Cytokinen oder Cytokin-Rezeptoren lenken können. Kurz, zusätzlich zu
ihrer Rolle als Krebs-Therapeutika können Cytokine negative Wirkungen
haben, die in bestimmten pathologischen Zuständen resultieren. Zum Beispiel
exprimieren die meisten ruhenden T-Zellen, B-Zellen, großen granulären Lymphocyten
und Monocyten keinen IL-2R (Rezeptor). Im Gegensatz zum Fehlen der
IL-2R-Expression
auf normalen ruhenden Zellen wird IL-2R von abnormalen Zellen in
Patienten mit bestimmten Leukämien
(ATL, Hairy-Zell-, Hodgkin-, akute und chronische granulocytäre), Autoimmunkrankheiten exprimiert
und ist mit der Allotransplantat-Abstoßung assoziiert. Interessanterweise
ist in den meisten dieser Patienten die Serumkonzentration einer
löslichen
Form von IL-2R erhöht.
Daher kann die Therapie mit bestimmten Ausführungsformen der Erfindung
durch Erhöhen
der Serumkonzentration der löslichen
Form des Cytokin-Rezeptors beeinflusst werden. Zum Beispiel kann
im Fall von IL-2R ein Gen-Abgabevehikel gestaltet werden, um sowohl
löslichen
IL-2R als auch IL-2R zu produzieren, was einen löslichen Rezeptor mit hoher
Affinität
kreiert. In dieser Konfiguration würden die IL-2R-Serumspiegel sinken, was die parakrine
Schleife inhibiert. Dieselbe Strategie kann auch gegen Autoimmunkrankheiten
wirksam sein. Insbesondere weil manche Autoimmunkrankheiten (z.
B. rheumatoide Arthritis, SLE) auch mit abnormaler Expression von
IL-2 assoziiert sind, kann ein Blockieren der Wirkung von IL-2 durch
Erhöhen
des Serumspiegels des Rezeptors auch angewendet werden, um solche
Autoimmunkrankheiten zu behandeln.
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In
anderen Fällen
kann das Inhibieren der Spiegel von IL- vorteilhaft sein. Kurz,
IL-1 besteht aus zwei Polypeptiden, IL-1 und IL-1, wovon jedes pleiotrope
Wirkungen hat. IL-1 wird vorwiegend durch mononukleäre Phagocyten
als Antwort auf eine Stimulation durch mikrobielle Produkte oder
eine Entzündung
synthetisiert. Es gibt einen natürlich
vorkommenden Antagonisten des IL-1R, bezeichnet als der IL-1-Rezeptor-Antagonist („IL-1Ra"). Dieser IL-1R-Antagonist
hat dieselbe molekulare Größe wie das
reife IL-1 und ist strukturell mit demselben verwandt. Dennoch initiiert
eine Bindung von IL-1Ra an den IL-1R keine Rezeptor-Signalgebung. Daher
hat dieses Molekül
einen anderen Wirkungsmechanismus als ein löslicher Rezeptor, der einen
Komplex mit dem Cytokin bildet und so die Interaktion mit dem Rezeptor
verhindert. IL-1 scheint keine wichtige Rolle in der normalen Homöostase zu
spielen. In Tieren reduzieren Antikörper gegen IL-1-Rezeptoren eine Entzündung und
Anorexie aufgrund von Endotoxinen und anderen Entzündungs-induzierenden
Agenzien.
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Im
Fall eines septischen Schocks induziert IL-1 sekundäre Verbindungen,
die starke Vasodilatoren sind. In Tieren senkt exogen bereitgestelltes
IL-1 den mittleren arteriellen Druck und induziert eine Leukopenie. Ein
neutralisierender Antikörper
gegen IL-1 reduziert Endotoxin-induziertes Fieber in Tieren. In
einer Untersuchung von Patienten mit septischem Schock, die für drei Tage
mit einer konstanten Infusion von IL-1R behandelt wurden, war die
28-Tage-Mortalität
16% im Vergleich zu 44% in Patienten, die Placebo-Infusionen erhielten.
Im Fall einer Autoimmunkrankheit reduziert ein Reduzieren der Aktivität von IL-1
eine Entzündung.
In ähnlicher
Weise kann das Blockieren der Aktivität von IL-1 mit rekombinanten
Rezeptoren in einem erhöhten
Allotransplantat-überleben
in Tieren resultieren, wieder mutmaßlich durch Senken der Entzündung.
-
Diese
Krankheiten liefern weitere Beispiele, wo Gen-Abgabevehikel gestaltet
werden können,
um einen löslichen
Rezeptor oder genauer das IL-1Ra-Molekül zu produzieren. Zum Beispiel
könnte
in Patienten, die einen septischen Schock durchmachen, eine einzelne
Injektion von IL-1Ra-produzierenden Vektorpartikeln den derzeitigen
Ansatz ersetzen, der eine konstante Infusion von rekombinantem IL-1R erfordert.
-
Cytokin-Antworten
oder genauer inkorrekte Cytokin-Antworten können auch in das Versagen,
infektiöse
Krankheiten zu kontrollieren oder zu lösen, involviert sein. Nicht-heilende
Formen von Leishmaniose in Mäusen
und Menschen, die starke, aber kontraproduktive TH2-dominierte
Antworten haben, ist das vielleicht am besten untersuchte Beispiel.
In ähnlicher
Weise ist leprotomatöse
Lepra mit einer dominanten, aber unpassenden TH2-Antwort
assoziiert. In diesen Zuständen
können
Gen-Abgabevehikel für
das Steigern der zirkulierenden Spiegel von IFN-Gamma nützlich sein,
im Gegensatz zum ortsgerichteten Ansatz, der für eine Therapie von festem
Tumor vorgeschlagen wurde. IFN-Gamma wird durch TH-1-T-Zellen
produziert und wirkt als ein negativer Regulator der TH-2-Subtyp-Proliferation.
IFN-Gamma antagonisiert
auch viele der IL-4-vermittelten Wirkungen auf B-Zellen, einschließlich des
Isotyp-Umschaltens zu IgE.
-
IgE,
Mastzellen und Eosinophile sind in das Vermitteln einer allergischen
Reaktion involviert. IL-4 wirkt auf differenzierende T-Zellen, um
die TH-2-Entwicklung zu stimulieren, während es TH-1-Antworten
inhibiert. Daher kann eine Alphavirus-basierte Gentherapie auch im Zusammenhang
mit traditionellen Allergie-Therapeutika
erreicht werden. Eine Möglichkeit
ist es, ein Gen-Abgabevehikel abzugeben, das IL4R mit kleinen Mengen
des angreifenden Allergens produziert (d. h. traditionelle Allergieschüsse). Lösliches
IL-4R würde
die Aktivität
von IL-4 verhindern und so die Induktion einer starken TH-2-Antwort verhindern.
-
B. Suizid-Vektoren
-
Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Offenbarung betrifft die Verwendung
von Gen-Abgabevehikel-Suizid-Vektoren, um die Verbreitung von Wildtyp-Alphavirus
in den Verpackungs-/Hersteller-Zelllinien zu limitieren. Kurz, in
einer Ausführungsform
umfasst das Gen-Abgabevehikel eine Antisense- oder Ribozym-Sequenz,
die spezifisch für
die Wildtyp-Alphavirussequenz ist, die von einem RNA-Rekombinationsereignis
zwischen den 3'-Sequenzen
der Verbindungsregion des Vektors und den 5'-Alphavirus-Struktursequenzen des Verpackungszelllinien-Expressionsvektors
hergestellt wurde. Das Antisense- oder Ribozym-Molekül würde nur
in der Anwesenheit der spezifischen Rekombinationssequenz hitzestabil
sein und würde
keine andere Wirkung in der Alphavirus-Verpackungs-/Hersteller-Zelllinie
haben. Alternativ kann auch ein toxisches Molekül (wie jene, die hierin beschrieben
werden) im Zusammenhang mit einem Vektor exprimiert werden, der
nur in der Anwesenheit von Wildtyp-Alphavirus exprimieren würde.
-
9. Gen-Abgabevehikel, um die Ausbreitung
von metastatischen Tumoren zu verhindern
-
Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Offenbarung betrifft die Verwendung
von Gen-Abgabevehikeln für
das Inhibieren oder Reduzieren der Invasivität von malignen Neoplasmen.
Kurz, das Ausmaß der
Malignität bezieht
sich typischerweise auf die Vaskularisierung des Tumors. Eine Ursache
für die
Tumor-Vaskularisierung ist die Produktion von löslichen Tumor-Angiogenese-Faktoren
(TAF) (Paweletz et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 9: 197, 1989),
die durch manche Tumoren exprimiert werden. In einem Aspekt kann
die Tumor-Vaskularisierung unter Anwenden von Gen-Abgabevehikeln, um
Antisense- oder Ribozym-RNA-Moleküle, die spezifisch für TAF sind,
zu exprimieren, verlangsamt werden. Alternativ können Anti-Angiogenese-Faktoren (Moses et
al., Science 248: 1408, 1990; Shapiro et al., PNAS 84: 2238, 1987)
entweder alleine oder in Kombination mit den oben beschriebenen
Ribozymen oder Antisense-Sequenzen exprimiert werden, um die Tumor-Vaskularisierung
zu verlangsamen oder zu inhibieren. Alternativ können die Gen-Abgabevehikel
auch verwendet werden, um einen Antikörper zu exprimieren, der spezifisch
für die
TAF-Rezeptoren auf
umgebenden Geweben ist.
-
10. Verabreichung von Gen-Abgabevehikeln
-
In
anderen Aspekten der vorliegenden Offenbarung werden Verfahren zum
Verabreichen eines Gen-Abgabevehikels an einen Vertebraten oder
ein Insekt offenbart. Kurz, die endgültige Art der Gen-Abgabevehikel-Verabreichung
beruht normalerweise auf der spezifischen therapeutischen Anwendung,
der besten Weise des Erhöhens
der Vektorpotenz und dem praktischsten Weg der Verabreichung. Im
Allgemeinen schließt
dieser Aspekt Gen-Abgabevehikel ein, die gestaltet werden können, um
zum Beispiel durch (1) direkte Injektion in die Blutbahn; (2) direkte
Injektion in ein spezifisches Gewebe oder einen Tumor; (3) orale
Verabreichung; (4) nasale Inhalation; (5) direkte Anwendung auf
Schleimhautgewebe; oder (6) ex vivo-Verabreichung von transduzierten autologen
Zellen in den Vertebraten oder das Insekt abgegeben zu werden. In
bestimmten Aspekten können
für ex
vivo-Anwendungen
Zellen zuerst von einem Wirt entfernt, positiv und/oder negativ
selektiert, um eine Population von Zellen zu erhalten, die mindestens
teilweise gereinigt ist (z. B. CD34+-Stammzellen,
T-Zellen oder dergleichen), mit einem der Gen-Abgabevehikel der
vorliegenden Erfindung transduziert, transfiziert oder infiziert
und in entweder denselben Wirt oder ein anderes Individuum wieder eingebracht
werden.
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Daher
kann das therapeutische Gen-Abgabevehikel auf solche Weise verabreicht
werden, dass der Vektor (a) eine normale gesunde Zelle transduzieren und
die Zelle in einen Hersteller eines therapeutischen Proteins oder
Agens, das systemisch oder lokal sezerniert wird, transformieren,
(b) eine abnormale oder defekte Zelle transformieren, wobei die
Zelle in einen normalen funktionierenden Phänotyp transformiert wird, (c) eine
abnormale Zelle transformieren, sodass sie zerstört wird, und/oder (d) Zellen
transduzieren kann, um die Immunantwort zu manipulieren.
-
11. Modulierung der Transkriptionsfaktor-Aktivität
-
In
noch einem anderen Aspekt können
die Gen-Abgabevehikel angewendet werden, um die Wachstums-Kontrollaktivität von Transkriptionsfaktoren
in der infizierten Zelle zu regulieren. Kurz, Transkriptionsfaktoren
beeinflussen das Muster der Genexpression durch sequenzspezifische
Trans-Aktivierung oder Unterdrückung
direkt (Karin, New Biologist 21: 126-131, 1990). Daher ist es nicht überraschend,
dass mutierte Transkriptionsfaktoren eine Familie von Oncogenen
repräsentieren.
Gen-Abgabevehikel können
verwendet werden, um zum Beispiel die Kontrolle an Tumorzellen,
deren unreguliertes Wachstum durch oncogene Transkriptionsfaktoren
aktiviert wird, und Proteine, die zusammenwirkend die Bindung bei
der Bildung von trans-aktivierenden oder unterdrückenden Transkriptionsfaktor-Homo-
und Heterodimer-Komplexen fördern
oder inhibieren, zurückzugeben.
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Ein
Verfahren zum Umkehren der Zellproliferation würde sein, das trans-aktivierende Potenzial
des c-myc/Max-Heterodimer-Transkriptionsfaktor-Komplexes zu inhibieren.
Kurz, das nukleare Oncogen c-myc wird durch proliferierende Zellen
exprimiert und kann durch einige ausgeprägte Mechanismen aktiviert werden, einschließlich einer
retroviralen Insertion, Amplifizierung und chromosomalen Translozierung.
Das Max-Protein wird in ruhenden Zellen exprimiert und wirkt unabhängig von
c-myc entweder alleine oder im Zusammenhang mit einem nicht identifizierten
Faktor, um die Expression derselben Gene, die durch das myc/Max-Heterodimer aktiviert
werden, zu unterdrücken
(Cole, Cell 65: 715-716, 1991).
-
Die
Inhibition der c-myc- oder c-myc/Max-Proliferation von Tumorzellen
kann durch die Überexpression
von Max in Zielzellen, gesteuert durch Gen-Abgabevehikel, erreicht werden. Das
Max-Protein ist nur 160 Aminosäuren
lang (entsprechend einer 480 Nucleotid-RNA-Länge) und wird leicht in ein
Gen-Abgabevehikel entweder
unabhängig
oder in Kombination mit anderen Genen und/oder Antisense/Ribozym-Einheiten,
die Faktoren anzielen, die die Wachstumskontrolle der Zelle freisetzen,
inkorporiert.
-
Eine
Modulierung der Homo/Hetero-Komplex-Assoziierung ist ein weiterer
Ansatz, um eine Transkriptionsfaktor-aktivierte Genexpression zu
kontrollieren. Zum Beispiel wird der Transport des trans-aktivierenden Transkriptionsfaktors
NF-B vom Cytoplasma zum Nucleus verhindert, während er in einem Heterodimer-Komplex
mit dem Inhibitorprotein IB ist. Nach der Induktion durch eine Vielfalt
von Mitteln, einschließlich
bestimmter Cytokine, wird IB phosphoryliert und NF-B wird freigesetzt
und zum Nucleus transportiert, wo es seine sequenzspezifische trans-aktivierende
Funktion ausüben
kann (Baeuerle und Baltimore, Science 242: 540-546, 1988). Die Dissoziierung
des NF-B/IB-Komplexes kann durch Maskieren der Phosphorylierungsstelle
von IB mit einem Antikörper
verhindert werden. Dieser Ansatz würde die Trans-Aktivierungsaktivität des NF-IB-Transkriptionsfaktors
durch Verhindern seines Transports in den Nucleus wirksam verhindern.
Die Expression des IB-Phosphorylierungsstelle-spezifischen Antikörpers oder
Proteins in Zielzellen kann mit einem Alphavirus-Gentransfervektor
erreicht werden. Ein Ansatz, der ähnlich zu dem hier beschriebenen
ist, könnte
verwendet werden, um die Bildung des trans-aktivierenden Heterodimer-Transkriptions-Faktors
AP-1 (Turner und Tijan, Science 243: 1689-1694, 1989) durch Inhibieren
der Assoziation zwischen den jun- und
fos-Proteinen zu verhindern.
-
12. Produktion von rekombinanten Proteinen
-
In
einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können Alphavirus-Gen-Abgabevehikel angewendet
werden, um die Expression eines oder mehrerer rekombinanter Proteine
in eukaryontischen Zellen (ex vivo, in vivo oder etablierten Zelllinien)
zu lenken. Wie hierin verwendet, betrifft ein „rekombinantes Protein" ein Protein, Polypeptid,
Enzym oder Fragment davon. Unter Verwendung dieses Ansatzes können Proteine,
die therapeutische oder andere kommerzielle Anwendungen haben, kostengünstiger
produziert werden. Darüber hinaus
können
Proteine, die in eukaryontischen Zellen produziert werden, im Vergleich
zu Proteinen, die in prokaryontischen Zellen produziert werden,
authentischer post-translationell modifiziert werden (z. B. glycosyliert, sulfatiert,
acetyliert usw.). Zusätzlich
können solche
Systeme in der in vivo-Produktion von verschiedenen chemischen Verbindungen,
z. B. Fein- oder Spezial-Chemikalien, angewendet werden.
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In
diesem Aspekt wird das Gen-Abgabevehikel, das das erwünschte Protein,
Enzym oder den Enzymweg codiert (wie es für die Produktion einer erwünschten
Chemikalie nötigt
sein kann), in eine passende eukaryontische Zelle transformiert,
transfiziert, transduziert oder anderweitig eingebracht. Repräsentative
Beispiele von Proteinen, die unter Verwendung eines solchen Systems
produziert werden können,
schließen
Insulin (siehe
US 4,431,740 und
BE 885196 A ), Hämoglobin
(Laven et al., Cell 21: 647-51, 1980), Erythropoietin (EPO; siehe
US 4,703,008 ), Megakaryocyten-Wachstums- und Differenzierungsfaktor
(MGDF), Stammzell-Faktor (SCF), G-CSF (Nagata et al., Nature 319:
415-418, 1986), GM-CSF, M-CSF (siehe
WO
8706954 ), den flt3-Liganden (Lyman et al. (1993), Cell
75: 1157-1167), EGF, sauren und basischen FGF, PDGF, Mitglieder der
Interleukin- oder Interferon-Familien, vorstehend, neurotrope Faktoren
(z. B. BDNF; Rosenthal et al., Endocrinology 129: 1289-1294, 1991,
NT-3; siehe
WO 9103569 ,
CNTF, siehe
WO 9104316 ,
NGF; siehe
WO 9310150 ),
Gerinnungsfaktoren (z. B. die Faktoren VIII und IX), thrombolytische
Faktoren wie t-PA (siehe
EP 292009 ,
AU 8653302 und
EP 174835 ) und Streptokinase (siehe
EP 407942 ), menschliches
Wachstumshormon (siehe
JP 94030582 und
US 4,745,069 ) und andere
Tier-Somatotropine, Integrine und andere Zelladhäsionsmoleküle wie ICAM-1 und ELAM (siehe
auch die oben diskutierten anderen „heterologen Sequenzen") und andere Wachstumsfaktoren
wie IGF-I und IGF-II, TGF-β,
osteogenes Protein-1 (Ozkaynak et al., EMBO J. 9: 2085-2093, 1990)
und andere Knochen-morphogene Proteine (z. B. BMP-4, Nakase et al.,
J. Bone Miner. Res. 9: 651-659, 1994) ein, sind aber nicht darauf
limitiert. Wie Fachleute anerkennen werden, kann jedes Gen, sobald
es charakterisiert ist, leicht in Gen-Abgabevehikel gemäß der vorliegenden Erfindung
cloniert werden, gefolgt von Einbringen in eine geeignete Wirtszelle
und Expression des erwünschten
Gens.
-
Verfahren
zum Produzieren von rekombinanten Proteinen unter Verwendung der
Vektoren und Alphavirus-Verpackungszelllinien, die hierin beschrieben
sind, werden offenbart (siehe Beispiele 6 und 7). Kurz, die Gen-Abgabevehikel
können
in der Form von in vitro-transkribierter RNA, Plasmid-DNA oder rekombinanten Vektorpartikeln,
die rekombinante Proteine codieren, (durch Transfektion oder Infektion)
in Alphavirus-Verpackungszelllinien (PCLs) eingebracht werden, sodass nur
eine kleine Fraktion der kultivierten Zellen (≤ 1%) Vektormoleküle enthält. Vektor-Replikons werden
durch die sPs verpackt, die durch die PCL in trans bereitgestellt werden,
gefolgt von Vektor-RNA-Amplifizierung, die gemäß der Sindbis-Virus-Replikationsstrategie
abläuft.
Im Gegenzug infizieren die produzierten rekombinanten Vektorpartikel
die verbleibenden Zellen der Kultur. Daher resultiert ein Aufblühen der
rekombinanten Proteinexpression im Zeitablauf, da rekombinante Vektorpartikel produziert
werden und danach alle Zellen in der PCL-Kultur infizieren. In ähnlicher
Weise kann die Amplifizierung von Vektorpartikeln mit PCL verwendet
werden, um große
Partikelbestände
mit hohem Titer für
andere Anwendungen herzustellen. In noch einem anderen Aspekt wird
eine rekombinante Proteinexpression von Hersteller-Zelllinien beschrieben
(siehe Beispiel 7). Kurz, Zelllinien werden abgeleitet, die alle
die genetischen Elemente, einschließlich der Vektor-Replikon- und defekten Helfer-Expressionskassetten,
enthalten, von denen die Produktion der Vektorpartikel durch Zugabe
eines extrazellulären
Stimulus zu der Kultur induziert werden kann. Daher erfolgt die
Expression des Vektor-codierten rekombinanten Proteins als ein Ergebnis
der Induktion der Alphavirus-Vektorpartikel-Hersteller-Zelllinien. In noch
einem weiteren Aspekt wird eine rekombinante Proteinexpression von
Zelllinien, die stabil mit eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystemen transformiert
sind, beschrieben (siehe Beispiel 7). Kurz, Zelllinien werden abgeleitet,
die mit einer induzierbaren eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystem-Kassette stabil transformiert
sind, die ein rekombinantes Protein von Interesse codiert. Daher
erfolgt die Expression des Vektor-codierten rekombinanten Proteins
als ein Ergebnis der Induktion der eukaryontischen geschichteten
Vektorinitiationssystem-Kassette.
-
Wie
leicht in Anbetracht der hierin gelieferten Offenbarung verstanden
werden sollte, kann eine Proteinproduktion unter Anwendung von RNA-Vektoren-Replikons,
eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystemen oder rekombinanten
Vektorpartikeln auch durch andere Verfahren als das Einbringen in
Verpackungs- oder
Hersteller-Zelllinien erreicht werden. Zum Beispiel können solche
Vektoren in eine breite Vielfalt von anderen eukaryontischen Wirtszelllinien
(z. B. COS, BHK, CHO, 293 oder HeLa-Zellen) eingebracht werden,
sowie direkt in vivo oder an ex vivo-Zellen verabreicht werden,
um das erwünschte
Protein zu produzieren.
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J. Hinterlegungs-Information
-
Die
folgenden Materialien sind bei der American Type Culture Collection
hinterlegt worden:
Hinterlegung | Bezeichnung | Hinterlegungsdatum | Zugangs-Nr. |
Wild
typ-Sindbis-Virus | CMCC
#4639 | April
2, 1996 | VR-2526 |
SIN-1
Sindbis-Virus | CMCC
#4640 | April
2, 1996 | VR-2527 |
pBG-SIN1
ELVS1.5 SEAP | CMCC
#4641 | April
2, 1996 | 97502 |
-
Die
obigen Materialien wurden durch Chiron Corporation bei der American
Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklaven Drive, Rockville,
Maryland, unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die
internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
zu Zwecken eines Patentverfahrens hinterlegt. Die Zugangsnummer
ist von der ATCC unter der Telefonnummer (301) 881-2600 erhältlich.
-
Diese
Hinterlegungen werden als Annehmlichkeit für Fachleute bereitgestellt
und sind kein Zugeständnis,
dass eine Hinterlegung unter 35 U. S. C. § 112 benötigt wird. Im Fall eines Fehlers
in der hierin beschriebenen Sequenz sollte auf die Nucleinsäuresequenz
dieser Hinterlegungen sowie die Aminosäuresequenz der Polypeptide,
die dadurch codiert werden, Bezug genommen werden. Eine Lizenz kann
erforderlich sein, um die hinterlegten Materialen herzustellen,
zu verwenden oder zu verkaufen, und hiermit wird keine solche Lizenz gewährt.
-
Die
folgenden Beispiele sind eingeschlossen, um die vorliegende Erfindung
vollständiger
zu illustrieren. Zusätzlich
liefern diese Beispiele bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
und sind nicht gedacht, den Rahmen davon zu limitieren. Standardverfahren
für viele
der Vorgehensweisen, die in den folgenden Beispielen beschrieben
werden, oder geeignete alternative Vorgehensweisen werden in weitreichend
umorganisierten Handbüchern
der Molekularbiologie wie zum Beispiel „Molecular Cloning", zweite Auflage
(Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1987) und „Current
Protocols in Molecular Biology" (Ausubel
et al., Hrsg. Greene Associates/Wiley Interscience, NY, 1990) bereitgestellt.
-
BEISPIELE
-
Beispiele,
die sich nicht spezifisch auf die beanspruchte Erfindung beziehen,
werden nur zur Illustration geliefert.
-
BEISPIEL 1
-
ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON SINI
-
Unten
wird die Identifizierung und molekulare Charakterisierung eines
positiv-strängigen RNA-Virus, das
eine reduzierte Inhibition der Wirts-Makromolekülsynthese zeigt und zum Etablieren
einer persistierenden Infektion in Vertebratenzellen in der Lage
ist, im Vergleich zu lytischen, cytopathogenen Wildtyp-Stämmen desselben
Virus beschrieben. Zum Beispiel wird das Sindbis-Virus als ein Prototyp
verwendet, der für
die Alphavirus-Gattung repräsentativ
ist.
-
A. Isolierung, Plaque-Reinigung und Charakterisierung
von SIN-1 aus einem Wildtyp-Sindbis-Virusbestand
-
Die
Isolierung, das molekulare Clonieren und die Charakterisierung eines
varianten Sindbis-Virus-Stamms wird beschrieben. Dieser Stamm ist
in der Lage, eine produktive persistierende Infektion in der Abwesenheit
einer Cytopathie zu etablieren, produziert aber Spiegel des Virus,
die äquivalent
zu jenem des Wildtyp-Virus
sind.
-
Ein
Wildtyp-Bestand mit hohem Titer (> 108 PbE/ml), der durch Infektion von BHK-Zellen
(ATCC Nr. CCL-10) mit Sindbis-Virus (CMCC #4639) bei einer niedrigen
MOI (≤ 0,1)
erhalten wurde. Um eine Infektion zu ermöglichen, war das Virus-Inokulum in einem
Volumen enthalten, das gerade ausreicht, um die Einzelzellschicht
zu bedecken, wenn es zu den Zellen zugefügt wird. BHK-Zellen werden
bewahrt, und alle Virusverdünnungen
wurden in minimalem essenziellem Eagle-Medium, ergänzt mit
10% fötalem
Kälberserum,
durchgeführt.
Die Zellen wurden bei 37°C
in einer 5% CO2-Atmosphäre kultiviert. Ein ausgedehnter
CPE, gezeigt durch „Abrunden", Verlust der Adhäsion und
erhöhte
Lichtbrechung der individuellen Zellen in der Einzelzellschicht, und
zusätzlich
die verminderte Gesamt-Zelldichte
der Einzelzellschicht wurden innerhalb von 48 Stunden nach der Infektion (hpi)
beobachtet. Die Zellkultur-Flüssigkeiten
wurden gesammelt, Zelltrümmer
wurde durch eine Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (4000
UpM für
10 min bei Zimmertemperatur) entfernt, und der Virusbestand wurde
aliquotiert und bei –70°C gelagert.
Der Titer des Sindbis-Virusbestands wurde durch Plaque-Test bestimmt,
wie früher
beschrieben (Strauss et al., Virology 74: 154-168, 1976). Kurz,
Hühnerembryofibroblasten
(CEF)-Einzelzellschichten wurden mit verschiedenen Verdünnungen
des Virusbestands infiziert, und die Einzelzellschicht wurde mit
Medien, angereichert mit 0,75% Agarose, überschichtet. Nach 24–48 hpi
wurden Plaques aufgrund der Zell-Lyse gesehen und entweder direkt
oder alternativ durch Färben
mit Kristallviolett nach Entfernen der Agaroseüberschichtung quantifiziert.
Der Virustiter wurde aus Proben bestimmt, die mit Virusverdünnungen
infiziert wurden, in denen die Plaques genau quantifiziert wurden.
-
Ein
Sindbis-Virusbestand, der mit DI-Partikeln angereichert ist, wurde
durch wiederholte Passage mit hoher MOI (≥ 5) auf BHK-Zellen erhalten.
BHK-Einzelzellschichten
wurden anfänglich
mit dem Sindbis-Virussaatbestand bei einer MOI = 5 infiziert. Das
Kulturmedium wurde gewonnen und durch Niedriggeschwindigkeits-Zentrifugation
geklärt,
nachdem eine vollständige
Zell-Lyse der infizierten Kultur beobachtet wurde (normalerweise
innerhalb von 24 hpi). Das geklärte
Medium, das von der infizierten Kultur gewonnen wurde, wurde dann
verwendet, um eine frische BHK-Einzelzellschicht zu infizieren.
Zum Beispiel wurden 2 ml des Virus-Inokulums zu einer frischen BHK-Einzelzellschicht
in einer 10 cm-Petrischale
zugefügt.
Nach 1 hpi wurden 8 ml frisches Medium zu der Virusinfizierten Kultur
zugefügt.
Wie oben beschrieben, wurde das Kulturmedium gewonnen und nach der
Beobachtung einer vollständigen
Zell-Lyse der Kultur geklärt.
Dieser Vorgang wurde wiederholt, bis die Rate, bei der sich nach
der Infektion eine Cytopathogenität in der BHK-Einzelzellschicht
entwickelte, bis mindestens 4 Tage verzögert war. Die Verzögerung im
Beginn der Cytopathogenität
nach der Infektion kennzeichnet das Vorliegen eines hohen Spiegels
von DI-Partikeln in der Viruspräparation.
-
Das
Vorliegen eines hohen Spiegels von DI-Partikeln in der Viruspräparation,
die von mehreren unverdünnten
Reihenpassagen von infiziertem Zellmedium stammt, wurde durch einen
Interferenz-Test oder durch RNA-Analyse von infizierten BHK-Zellen
bestimmt. Im ersten Verfahren wurde ein homologer Interferenz-Test als ein
Maß des
Vorliegens von DI-Partikeln durchgeführt. Kurz, BHK-Zellen wurden
alleine bei einer MOI = 10 mit dem Hoch-Titer (> 108 PbE/ml)-Wildtyp-Bestand,
der, wie oben beschrieben, hergestellt wurde, infiziert. Nach 16
hpi wurde der Virusertrag durch Plaque-Test bestimmt, wie oben beschrieben.
Der Virusertrag aus diesem Experiment war typischerweise 1 × 109 bis 1 × 1010 PbE/ml. In einer anderen Versuchsgruppe
wurden die BHK-Zellen simultan mit dem Wildtyp-Bestand (MOI = 10)
und dem Virusbestand, der von mehreren unverdünnten Reihenpassagen des infizierten
Zellmediums hergestellt wurde (MOI = 5), co-infiziert. Wie vorher wurde
der Virusertrag 16 hpi durch Plaque-Test bestimmt. Wenn der Virusbestand
von der zweiten Versuchsgruppe einen hohen Spiegel an DI-Partikeln
enthält,
wird der Virusertrag mindestens 2–3 Größenordnungen niedriger sein
als das erste Experiment (z. B. ≤ 1 × 107 PbE/ml).
-
Als
ein maßgeblicheres
Verfahren zum Zeigen des Vorliegens von DI-Partikeln in der Viruspräparation wurde
die virusspezifische RNA in infizierten BHK-Zellen 16 hpi analysiert. Kurz, die
BHK-Zellen wurden mit dem Hoch-Titer (> 108 PbE/ml)-Wildtyp-Bestand
oder mit dem Virusbestand, der DI-Partikel enthält, infiziert (MOI = 10). Schein-infizierte
Kontrollen und infizierte Zellen wurden von 1 bis 16 hpi mit Dactinomycin
(1 mg/ml) behandelt und mit [3H]Uridin (20
mCi/ml) markiert. RNA wurde von infizierten und Kontrollzellen durch Verwenden
von RNAzol B isoliert isoliert, wie vom Hersteller (Tel-Test, Inc.,
Friendswood, Texas) beschrieben. Alternativ wurde RNA mit Tri-Reagent
(Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, Ohio) oder durch konventionelle
Verfahren unter Verwendung der Phenol-Extraktion von Zellen, die
in einem Puffer (0,05 M Tris, 0,1 M NaCl, 0,001 M EDTA, pH 7,5),
enthaltend 0,5% Triton und 0,5% rekristallisiertes Naphthalendisulfonat,
lysiert wurden, isoliert, wie von Weiss et al. (J. Virol. 14: 1189-1198,
1974) beschrieben. Die RNAs wurden mit Glyoxal denaturiert und durch
horizontale 1,1% Agarosegele, die in 0,01 M Natriumphosphatpuffer
(pH 7,0) hergestellt wurden, bei 5 V/cm einer Elektrophorese unterzogen
(McMaster und Carmichael, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 4835-4838,
1977). Alternativ kann die RNA durch Formaldehydgele einer Elektrophorese
unterzogen werden. Nach der Elektrophorese wurde jede Feuchtigkeit
von den Gelen unter Vakuum mit einem Geltrockner entfernt, und die
getrockneten Gele wurden für
eine Fluorographie behandelt und einem Film ausgesetzt. Zwei RNAs,
die den genomischen und subgenomischen Spezies entsprechen (42S
beziehungsweise 26S), wurden in den Proben von BHK-Zellen, die mit
dem Wildtyp-Virusbestand infiziert wurden, beobachtet. Im Gegensatz dazu
wurde eine große
Zahl von RNA-Spezies, die verschieden von den viralen 42S- und 26S-Standard-RNAs sind,
in Proben von BHK-Zellen beobachtet, die mit dem Virusbestand infiziert
wurden, der DI-Partikel enthält. Mehrere
RNAs, die den DI-RNAs
entsprechen, wanderten vorwiegend bei molekularen Gewichten, die
kleiner als die 26S-RNA-Spezies vom Wildtyp-Virus waren. Ein Beispiel
von mehreren RNAs zusätzlich
zu den 42S- und 26S-Spezies, die in BHK-Zellen beobachtet wurden,
die mit einem Virusbestand, enthaltend DI-Partikel, infiziert wurden,
kann in 3, Bahn 3, von Weiss et al.
(J. Virol. 33: 463-474, 1980) gesehen werden.
-
Ein
varianter Sindbis-Virusstamm, der in der Lage ist, eine produktive
persistente Infektion mit verminderter Cytopathogenität zu etablieren,
wurde isoliert und von einem Virusbestand, der mit DI-Partikeln
angereichert war, molekular cloniert. BHK-Zellen wurden bei einer
hohen Multiplizität
(MOI = 5) mit dem Sindbis-Virusbestand,
der mit DI-Partikeln angereichert war, infiziert. Die Cytopathogenität entwickelte
sich im Vergleich zur Infektion von BHK-Zellen mit dem Wildtyp-Virus
langsam; dennoch wurden die meisten Zellen schlussendlich lysiert
und hoben sich von der Platte ab. Zelltrümmer und nicht-anhaftende Zellen
wurden alle zwei Tage durch Mediumwechsel entfernt. Innerhalb von
zwei Wochen nach der anfänglichen
Infektion wurden getrennte und deutliche Kolonien beobachtet. Diese
Kolonien gediehen und zeigten im Vergleich zu nicht-infizierten BHK-Zellkontrollen
keinen morphologischen Hinweis auf CPE. Innerhalb von 3–4 Wochen
wurden die Zellkolonien groß und
mit dem nackten Auge wahrnehmbar. Die Kolonien wurden mit Clonierungsringen
isoliert, und die Zellen wurden entweder mit 3 mM EDTA oder Trypsin
dispergiert. Die dispergierten Zellen von jeder Kolonie wurden ohne
Verdünnung
wieder plattiert. Danach wurden die Zellen beim Erreichen der Konfluenz,
im Allgemeinen innerhalb von vier Tagen, in einer 1:10-Verdünnung subkultiviert.
Aliquots der Zellen, bezeichnet als BHK(SIN-1), wurden nach der
fünften
Passage für
eine Langzeit-Lagerung in flüssigem
Stickstoff in Kryoröhrchen
präpariert.
BHK(Sin-1)-Zellen waren von den ursprünglichen, nicht-infizierten
BHK-Zellen in Bezug
auf die Wachstumsrate oder Morphologie nicht unterscheidbar.
-
B. Molekulares Clonieren von SIN-1
-
Um
die Mutation(en) im Sindbis-Genom zu charakterisieren, die mit der
Entwicklung der wesentlich reduzierten Cytopathogenität von SIN-1
korrelieren, wurde genomische RNA von SIN-1-Virionen isoliert, revers
transkribiert, und die resultierende cDNA, die die Nichtstrukturprotein-Gene
umspannt, sequenziert, wie unten vollständiger beschrieben.
-
Kurz,
das SIN-1-Virus wurde vor der Herstellung eines Bestands, der für die Isolierung
von RNA verwendet wurde, dreimal plaquegereinigt. Die BHK(SIN-1)-Zellen wurden, wie
oben beschrieben, gezüchtet,
die Kulturflüssigkeit
wurde gewonnen, und verschiedene Verdünnungen wurden verwendet, um
primäre
Hühnerembryofibroblasten-Einzelzellschichten
(CEF, gezüchtet
in minimalem essenziellem Medium, angereichert mit 3% fötalem Kälberserum)
zu infizieren. Nach der Infektion wurde Medium, enthaltend 0,5%
Edelagar, zu den Einzelzellschichten zugefügt. Zusätzlich kann DEAE-Dextran (100 μg/ml) in
das Agar-Überschichtungsmedium
eingeschlossen werden, um die Größe der SIN-1-Plaques
zu erhöhen.
Individuelle, diskrete Plaques wurden nach 3 Tagen der Inkubation
bei 30°C
in Platten, die mit geeignet verdünnten Inokula der BHK(SIN-1)-Kulturflüssigkeit
infiziert wurden, beobachtet. Nach der dritten Runde der Reinigung
wurde das clonierte SIN-1-Virus einmal bei 30°C in CEF-Zellen passagiert,
die bei einer MOI = 0,1 infiziert wurden. Es wurde durch den Interferenz-Test
und eine RNA-Analyse in infizierten BHK-Zellen, wie oben beschrieben,
festgestellt, dass die Plaque-gereinigten
SIN-1-Virus-Präparationen
frei von DI-Partikeln waren.
-
Die
BHK-Zellen wurden mit dem Plaque-gereinigten SIN-1-Bestand infiziert
(MOI = 10), um die Fähigkeit
dieses varianten Wildtyp-Sindbis-Virusstamms, eine Persistenz zu
etablieren, zu bestimmen. Wie oben beschrieben, erfordert das Etablieren
einer persistenten Infektion in BHK-Zellen mit Wildtyp-Sindbis-Virus
das Vorliegen von DI-Partikeln in der Viruspräparation und eine beträchtliche
Zeit, um jenen wenigen überlebenden Zellen
zu erlauben, auszuwachsen. Im Gegensatz dazu wurde in BHK-Zellen,
die bei 37°C
mit der SIN-1-Variante infiziert wurden, leicht eine persistente
Infektion etabliert, ob DI-Partikel im Virus-Inokulum vorhanden waren
oder nicht. Sechs Tage nach der Infektion mit SIN-1 waren die BHK-Zellen
vollständig
resistent gegen eine Superinfektion mit Wildtyp-Sindbis-Virus, was
die Etablierung einer persistenten Infektion zeigt. Dennoch waren
diese Zellen empfänglich
für eine
Infektion durch das heterologe Virus VSV, was zeigt, dass Interferon nicht
in die Etablierung einer persistenten SIN-Infektion involviert ist.
-
Die
CEF-Zellen wurden mit dem Plaque-gereinigten SIN-1-Bestand infiziert
(MOI = 10), um einen Hoch-Titer-Bestand des Virus für die Isolierung
von RNA herzustellen. 90 ml Kulturflüssigkeit (2 × 1010 PbE/ml) wurden durch Zentrifugation für 5 min
bei 2500 UpM in einem Sorvall GSA-Rotor geklärt. Das SIN-1-Virus wurde von
der geklärten
Kulturflüssigkeit
durch Zentrifugation in einem SW27.1-Rotor für 2 h bei 24000 UpM bei 4°C pelletiert.
Das Viruspellet wurde dann in 3 ml Kulturmedien resuspendiert, durch
wiederholtes Pipettieren homogenisiert und oben auf einen 25–40% (Gew./Gew.)
Saccharose-Gradienten geschichtet. Diesem folgte eine Zentrifugation
in einem SW27.1-Rotor für
4 h bei 24000 UpM bei 4°C.
Die Virusbande wurde mit Glühlampenlicht-Beleuchtung
betrachtet und mit einer 22 Gauge-Nadel/Spritze gewonnen. Die RNA
wurde weiter durch Proteinase K (Boehringer Mannheim, Indianapolis,
Indiana)-Verdau (56°C,
1 h) gereinigt, gefolgt von einer Extraktion mit einem gleichen
Volumen von H2O-gesättigtem Phenol:Chloroform (1:1
V/V, pH 7,0), gefolgt von einer Präzipitation mit 2 Volumina Ethanol
und 0,3 M Natriumacetat, pH 5,2.
-
Alternativ
kann das SIN-1-Virus weiter durch Polyethylenglycol-Präzipitation
von infizierten BHK-Zellkulturmedien (Strauss et al. Virology 133:
154-168, 1976) oder alternativ durch Pelletieren durch ein Saccharosekissen
gereinigt werden (Polo et al. J. Virol. 62: 2124-2133, 1988).
-
Zwei
Runden der Erststrang-cDNA-Synthese wurden mit der gereinigten viralen
RNA unter Verwendung des murinen Moloney-Leukämievirus oder der reversen
SuperScript II-Transkriptase (Gibco-BRL, Gaithersburg, Maryland)
gemäß den empfohlenen
Bedingungen des Herstellers durchgeführt. Sechs getrennte Reaktionen
wurden unter Verwendung der Sindbis-Virus-spezifischen Primer, die
komplementär
zum unten gezeigten positiven Strang sind (die Primer werden mit
R bezeichnet), durchgeführt.
Alle mit R bezeichneten Primer wurden vor der Synthesereaktion des
ersten Strangs an ihrem 5'-Ende
mit Polynucleotidkinase (New England Biolabs) phosphoryliert, um
das Clonieren zu ermöglichen.
-
-
Die
Synthese des zweiten Strangs der cDNA-Matrize oben wurde in sechs
getrennten Reaktionen mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase
I (New England Biolabs, Beverly, MA) gemäß den empfohlenen Bedingungen
des Herstellers erreicht. Sindbis-Virus-spezifische Primer, die
komplementär
zum negativen Strang sind (die Primer mit F bezeichnet, oben gezeigt)
sind, wurden verwendet. Die doppelsträngigen DNA-Produkte wurden
stufenweise für
die entsprechenden Regionen im Plasmid Toto1101 substituiert, das das
Volllängen-Sindbis-Virusgenom
enthält
(Rice et al., J. Virol, 61: 3809-3819, 1987). Zum Beispiel wurde
das T7/1F-1465R-Produkt mit SacI und Eco47III verdaut und in das
SacI/Eco47III-verdaute und CIAP-behandelte Toto1101-Plasmid inseriert,
das vom kleinen SacI/Eco47III-Fragment (SP6-Promotor, Sindbis-Virus
nt, 1-1407) durch 1% Agarose/TAE (50X/Liter: 242 g Tris-Base/57,1
ml Eisessig/100 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0)-Elektrophorese und GENECLEAN
II weggereinigt wurde. Dieses Konstrukt wurde dann mit Eco47III
und AvrII (Sindbis-Virus nt-Nr. 1407 beziehungsweise 4281) verdaut,
mit CIAP behandelt, worauf eine Insertion des 3300 bp-Fragments
folgte, das vom 1003F-4303R-Produkt isoliert wurde, das mit Eco47III
und AvrII verdaut wurde. Der vollständig zusammengesetzte Clon
wird als pRSIN-1g bezeichnet (g als eine Bezugnahme zum genomischen Volllängen-Clou)
und enthielt alle 11703 bp des viralen Genoms. Eine Untergruppe
der Primer, die in der Tabelle oben aufgelistet sind, stellt überflüssige doppelsträngige DNA-Reaktionsprodukte
im SIN-1-Genom her. Zum Beispiel liegen die Sequenzen im 4051F/8115R-Produkt
innerhalb des 1680F/8115R-Produkts. Diese überflüssigen Produkte werden als
Konstruktions-Alternativen
für den
genomischen SIN-1-Clon bereitgestellt; d. h. im Allgemeinen ist
die Wirksamkeit des cDNA-Clonierens umgekehrt proportional zu der
Länge des
erwünschten
Fragments.
-
Um
Teile des viralen Genoms, die nicht durch das obige Verfahren erhalten
werden, zu clonieren, wurde das virale SIN-1-RNA-Genom durch reverse
Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) cloniert. Die Synthese
des ersten Strangs wurde erreicht, wie oben beschrieben. PCR-Amplifikationen
der Sindbis-cDNA mit den oben gezeigten Primerpaaren wurden als
getrennte Reaktionen unter Verwendung des Klentaql-Enzyms und den
Reaktionsbedingungen, wie in Barnes (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91: 2216-2220, 1940) beschrieben, durchgeführt. Alternativ wurde das Klentaq
1-Enzym unter Verwendung eines Puffers, enthaltend 1,5 mM MgCl
2, der durch den Vertreiber bereitgestellt
wurde, mit der hitzestabilen Thermalase-DNA-Polymerase (Amresco
Inc., Solon, OH) substituiert. Alternativ wurde die hitzestabile
Vent
R-DNA-Polymerase (New England Biolabs,
Beverly, MA) in den Amplifizierungsreaktionen verwendet. Zusätzlich enthielten
die Reaktionen 5% DMSO und „HOT
START WAX"-Kugeln
(Perkin-Elmer). Das verwendete PCR-Amplifizierungsprotokoll ist unten
gezeigt (Die 72°C-Extensionsinkubationsperiode
wurde auf 1 min pro 1 kb der Matrizen-DNA angepasst):
| Temperatur
(°C) | Zeit
(Min.) | Anzahl
d. Zyklen |
(a) | 95 | 2 | 1 |
(b) | 95
55
72 | 0.5
0.5
3.5 |
35
|
(c) | 72 | 10 | 1 |
-
Alternativ
kann das Clonieren des Volllängen-SIN-1-RNA-Genoms ähnlich zu
den Verfahren, die früher
beschrieben worden sind (Dubensky et al., J. Virol. 70: 508-519, 1996) durchgeführt werden.
Kurz, die Synthese des ersten Strangs der cDNA wird mit einem Gemisch
von zufälligen
Hexamer-Primern (50 ng/ml Reaktionskonzentration) (Invitrogen, San
Diego, Kalifornien) und Primer 4B erreicht, dessen Sequenz in der
Tabelle unten gezeigt ist. Die Sindbis-Virus-SIN-1-Varianten-cDNA von genomischer
Länge wird
dann durch PCR amplifiziert. Sechs deutliche Segmente unter Verwendung
von sechs Paaren von überlappenden
Primern sind ausreichend, um das gesamte Genom zu clonieren. Zusätzlich zu
den viralen komplementären
Sequenzen enthält
der Vorwärtsprimer
des SIN-1-5'-Endes
eine 19 Nucleotid-Sequenz, die dem bakteriellen SP6-RNA-Polymerase-Promotor
entspricht, und die ApaI-Restriktionsendonuclease-Erkennungssequenz, verknüpft mit
seinem 5'-Ende.
Die bakterielle SP6-RNA-Polymerase wird so eingesetzt, dass eine
Transkription in vitro im Einschließen von nur einem einzelnen
nicht-viralen G-Ribonucleotid
resultiert, das mit dem A-Ribonucleotid, welches dem authentischen
Sindbis-Virus-5'-Ende
entspricht, verknüpft
ist. Der Einschluss der ApaI-Erkennungssequenz
ermöglicht
die Insertion des PCR-Amplikons in die Plasmidvektor pKS II+ (Stratagene, La Jolla, Kalifornien)-Polylinkersequenz.
Eine 5 Nucleotid-„Puffersequenz"-Ausdehnung ist auch
stromaufwärts
der ApaI-Erkennungssequenz
gebunden, um einen wirksamen Enzymverdau zu ermöglichen.
-
Die
Sequenzen des SP6-5'-SIN-1-Vorwärtsprimers
und aller Primerpaare, die nötig
sind, um das gesamte SIN-1-Genom zu amplifizieren, sind in der Tabelle
unten gezeigt. (Merke, dass „nt” und „nts", wie hierin nachstehend
angewendet, „Nucleotid" beziehungsweise „Nucleotide" bezeichnen). Die
Bezugssequenz (GenBank- Zugangsnr.
J02363, Locus: SINCG) stammt von Strauss et al., Virology 133: 92-110,
1984).
-
-
PCR-Amplifikationen
von Sindbis-cDNA mit den oben gezeigten Primerpaaren werden als
getrennte Reaktionen unter Verwendung der Thermalase oder VentR-DNA-Polymerase
(oben zitiert), der Reaktionsbedingungen und der PCR-Amplifizierungsbedingungen,
wie oben beschrieben, durchgeführt.
-
Die
Regionen der Sequenzüberlappung
zwischen den Amplifikationsprodukten entsprechen einmaligen Enzym-Erkennungsstellen
im PCR-Amplikon. Die PCR-Produkte
werden gereinigt (QIAquick PCR-Reinigungskit, Qiagen, Chatsworth,
Kalifornien) und schrittweise in den pKS II+-Vektor
zwischen die ApaI- und XbaI-Stellen
inseriert. Der vollständig
zusammengesetzte Clon wird als pKSRSIN-1g bezeichnet (g als eine Bezugnahme
zum genomischen Volllängen-Clon)
und enthält
alle 11703 bp des viralen Genoms.
-
C. Sequenz des SIN-1-Phänotyps
-
Die
SIN-1-spefizifischen Nucleotidsequenzen des pRSIN-1g-Clons wurden
durch das Didesoxy-Kettenterminierungsverfahren bestimmt. Ein Sequenzvergleich von
8000 bp der viralen Sequenz ergab mehrere Unterschiede zwischen
dem hierin beschriebenen SIN-1-Clon und der Sindbis-Virus (Stamm
HRsp)-Sequenz, die in GenBank bereitgestellt wird (GenBank-Zugangsnr.
J02363, Locus: SINCG). Unterschiede in der Sequenz zwischen SIN-1
(
6), SINCG (
7) und
Toto1101 (
8) werden unten präsentiert.
nt.
Position | Gen | SINCG | Toto1101 | SIN-1 |
| | nt | aa | nt | aa | nt | aa |
45 | 5'NTR | T | - | T | - | C | - |
120 | nsP1 | C | Gln | C | Gln | A | Lys |
1775 | nsP2 | G | null | G | null | A | null |
1971 | nsP2 | T | Phe | T | Phe | C | Leu |
2992 | nsP2 | C | Pro | T | Leu | T | Leu |
3579 | nsP2 | A | Lys | G | Glu | G | Glu |
3855 | nsP2 | C | Pro | C | Pro | T | Ser |
3866 | nsP2 | C | null | C | null | T | null |
4339 | nsP3 | A | Glu | A | Glu | T | Val |
4864 | nsP3 | C | Ser | C | Ser | T | Phe |
5702 | nsP3 | A | null | T | null | T | null |
5854* | nsP4 | G | Arg | G | Arg | A | His |
7612 | Verbindung | A | - | A | - | T | - |
7837 | Capsid | C | Arg | C | Arg | T | Cys |
-
- *Diese Mutation wurde in einem cDNA-Clon gefunden. Sie wurde
nicht nachgewiesen, wenn die Sin-1-Virus-RNA sequenziert wurde.
Sie repräsentiert
wahrscheinlich eine unbedeutende Spezies in der RNA-Population.
-
Die
Bestätigung,
dass die Sequenzänderungen
einmalig für
den hierin beschriebenen Clon waren (und nicht ein Ergebnis eines
Clonierungs-Artefakts), wurde durch Amplifizieren der SIN-1-Virion-RNA
durch RT-PCR, wie oben beschrieben, Erstellen der Sequenz, die die
in Frage kommenden Nucleotide enthält, durch direktes Sequenzieren
des RT-PCR-Amplikon-Produkts und Vergleichen der Sequenz mit der
entsprechenden SIN-1-Sequenz bestimmt.
-
D. Charakterisierung und genetisches Kartieren
des SIN-1-Phänotyps
mit molekularen Clonen:
-
Verschiedene
Regionen des SIN-1-Genoms wurden für die entsprechenden Wildtyp-Sindbis-Virusregion
im Toto1101-Plasmid substituiert (Rice et al., J. Virol. 61: 3809-3819,
1987), um die Lokalisation des Phänotyps für die Etablierung der Persistenz
zu kartieren. Die verschiedenen SIN-1-nsP-Gene wurden in den Toto 1101-Wildtyp-Sindbis-Virus-Hintergrund
unter Verwendung von Restriktionsenzym-Fragmenten substituiert, die von pRSIN-1g
gereinigt wurden, wie in der Tabelle unten illustriert.
nsP-Gen | Restriktionsfragment | Nucleotid-Koordinaten | Clon-Bezeichnung |
nsP1 | PleI/Eco
47III | 98-1407 | pRSIN-1nsP1 |
nsP2 | Eco47III/AvrII | 1407-4281 | pRSIN-1nsP2 |
nsP2-N-Terminus | Eco47III/BglII | 1407-2289 | pRSIN-1nsP2-N |
nsP2-C-Terminus | BglII/AvrII | 2289-4281 | pRSIN-1nsP2-C |
nsP3-4 | AvrII/EcoRI | 4281-5870 | pRSIN-1nsP3 |
nsP3 | AvrII/SpeI | 4281-5262 | pRSIN-1nsP3 |
nsP4 | SpeI/AatII | 5263-5870 | pRSIN-1nsP4 |
nsP1-4 | PleI/AatII | 98-8000 | pRSIN-1nsP1-4 |
-
Die
Koordinaten der Nichtstrukturgen-codierenden Regionen werden in
der folgenden Tabelle geliefert:
nsP-Gen | Koordinaten
des Sindbis-Virusgenoms
(nt. Nr.) |
nsP1 | 60-1680 |
nsP2 | 1680-4101 |
nsP3 | 4101-5769 |
nsP4 | 5769-7597 |
nsP1-4 | 60-7597 |
-
Die
verschiedenen SIN-1-, Toto- und chimären SIN-1/Toto-Clone pRSIN-1g,
Toto, pRSIN-1nsP1, pRSIN-1nsP2, pRSIN-1nsP2-N, pRSIN-1nsP2-C, pRSIN-1nsP3, pRSIN-1nsP4
und pRSIN-1nsP1-4 wurden durch Verdau mit XhoI linearisiert, das
in den cDNA-Clonen einen einzigen Schnitt unmittelbar benachbart
und stromabwärts
eines 21 Nucleotid-Poly-dA:dT-Bereichs, der dem Sindbis-Virus-3'-Ende folgt (virales
nt. 11703) macht. Die linearisierten Clone wurden mit GENECLEAN
II (BIO 101, La Jolla, Kalifornien) gereinigt und auf eine Konzentration
von 0,5 μg/μl eingestellt.
Die Transkription der linearisierten Clone wurde in vitro bei 40°C für 90 Minuten
gemäß den folgenden
Reaktionsbedingungen durchgeführt:
2 μl DNA/4,25 μl H
2O; 10 μl
2,5 mM NTPs (UTP, ATP, GTP, CTP); 1,25 μl 20 mM Me7G(5')ppp(5')G-Kappen-Analog; 1,25 μl 100 mM
DTT; 5 μl
5 × Transkriptionspuffer
(Promega, Madison, Wisconsin); 0,5 μl RNasin (Promega); 0,25 μl 10 μg/μl Rinderserumalbumin;
und 0,5 μl
T7-RNA-Polymerase (Promega). Die in vitro-Transkriptions-Reaktionsprodukte
wurden mit DNase I (Promega) verdaut, durch sequenzielle Phenol:CHCl
3- und Ether-Extraktion gereinigt, gefolgt
von Ethanol-Präzipitation.
Alternativ können
die in vitro-Transkriptions-Reaktionsprodukte direkt für die Transfektion
verwendet werden. Die in vitro-Transkriptions-Reaktionsprodukte
oder gereinigte RNA bildeten mit einer kommerziellen kationischen
Lipidverbindung (LIPOFECTIN, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) einen
Komplex und wurden auf Baby-Hamsternieren-21 (BHK-21)-Zellen aufgetragen,
die in einer 60 mm-Petrischale bei 75% Konfluenz gehalten wurden.
Alternativ wurden BHK-Zellen mit den in vitro-Transkriptions-Reaktionsprodukten oder
der gereinigten RNA durch Elektroporese behandelt, genau wie früher beschrieben
(Liljestrom, Bio/Technology 9: 1356-1361, 1991). Die transfizierten
Zellen wurden bei 37°C
inkubiert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Kulturmedien
gewonnen, und der Titer jedes Virus wurde durch Plaque-Test bestimmt, wie oben
beschrieben. Der titrierte Virusbestand, der von diesen in vitro-Transkription-Reaktionen
abgeleitet wurde, wurde bezeichnet, wie in der Tabelle unten gezeigt.
Clon-Bezeichnung | Virus-Bezeichnung |
pRSIN-1nsP1 | SIN-1nsP1 |
pRSIN-1nsP2 | SIN-1nsP2 |
pRSIN-1nsP2-N | SIN-1nsP2-N |
pRSIN-1nsP2-C | SIN-1nsP2-C |
pRSIN-1NSp3-4 | SIN-1nsP3-4 |
pRSIN-1nsP3 | SIN-1nsP3 |
pRSIN-1nsP4 | SIN-1nsP4 |
pRSIN-1nsP1-4 | SIN-1nsP1-4 |
Toto
1101 | Toto |
-
Um
den persistenten SIN-1-Phänotyp
zu kartieren, wurden 8 × 105 BHK-Zellen mit jedem der oben hergestellten
Virusbestände
infiziert (MOI = S). Drei Tage nach der Infektion wurde die Kultur-Lebensfähigkeit durch
Trypanblau-Farbstoff-Ausschluss bestimmt. Die Ergebnisse dieses
Experiments (unten gezeigt) zeigen, dass der SIN-1-Phänotyp
des Etablierens von persistenten, nicht zellzerstörenden Infektionen
auf die Nichtstrukturgene und insbesondere auf das nsP2-Gen kartiert.
Die Zahl der Zellen in der Schein-infizierten Kultur repräsentiert
ein fortgesetztes Wachstum dieser Zellen, bis sie die stationäre Phase
erreichten. 3 dpi waren alle Zellen, die mit SIN-1nsP1, SIN-1nsP3,
SIN-1nsP3-4 und SIN-1nsP4 infiziert wurden, abgestorben.
-
Die
Zellen, die die Infektion mit SIN-1nsP2 und SIN-1nsP1-4 überlebten,
fuhren fort zu wachsen und waren basierend auf der Färbung mit
Antikörpern,
die spezifisch für
Sindbis-Virus sind, persistent infiziert.
Virus | Anzahl
der Zellen 3 dpi |
SIN-1nsP1 | 0 |
SIN-1nsP2 | 3 × 105 |
SIN-1nsP3-4 | 0 |
SIN-1nsP3 | 0 |
S1N-1nsP4 | 0 |
SIN-1nsP1-4 | 5 × 105 |
Toto | 0 |
Schein | 1 × 107 |
-
Wie
oben gezeigt, kartiert der beobachtete SIN-1-Phänotyp, der nicht zellzerstörende persistente
Infektionen etabliert, auf die viralen nsPs im Gegensatz zu den
sPs. Diese Schlussfolgerung wurde deutlich durch den Vergleich der
Zell-Überlebensspiegel
zwischen Kulturen, die mit den Toto- oder SIN-1nsP1-4-Virusbeständen infiziert
wurden, gezeigt. Sowohl die Toto- als auch die SIN-1nsP1-4-Viren enthalten die
Wildtyp-sPs; ein Zell-Überleben
wurde jedoch nur in jenen Kulturen beobachtet, die mit dem Virus
(SIN-1nsP1-4) infiziert wurden, das nsPs enthält, die vom SIN-1-Clon stammten.
In diesen Experimenten war das Zell-Überleben
nicht abhängig
von der Quelle der Sindbis-Virus-sPs. Es ist wichtig, dass der SIN-1-Phänotyp weiter
auf nsP2 kartiert wurde. Der Spiegel des Zell-Überlebens war vergleichbar
zwischen den Kulturen, die mit den SIN-1nsP1-4- oder SIN-1nsP2-Viren infiziert wurden.
Weiterhin ist ein C → T-Übergang
beim Nucleotid 3855 im SIN-1 nsP2-Gen verantwortlich für den charakteristischen
Phänotyp,
der eine persistente Infektion etabliert, in Zellen, die mit dem
SIN-1-Virus infiziert wurden. Die einzelne Prolin zu Serin-Änderung
im nsP2-Protein, das in Zellen produziert wird, die mit dem chimären Virus
SIN-1nsP2-C infiziert wurden, war das einzige, das benötigt wurde,
um den Wildtyp-Sindbis-Virus (Toto 1101) von einem Virus, das alle
infizierten Zellen abtötete,
zu einem Virus zu konvertieren, das es vielen der infizierten Zellen
erlaubte, zu überleben
und fortzufahren, Virus zu produzieren. Die Phänotypen von chimären Viren,
die von der Insertion der SIN-1 nsP1-, nsP3- oder nsP4-Gene in den
Toto-Hintergrund stammten, waren nicht unterscheidbar vom Wildtyp,
und eine vollständige Lyse
wurde in Kulturen beobachtet, die mit diesen Viren infiziert wurden.
-
Die
mögliche
Wirkung von Aminosäure-Änderungen
in den SIN-1 nsPs auf den Spiegel einer produktiven Infektion in
BHK-Zellen wurde durch Vergleichen des Virusertrags im Zeitverlauf
in BHK-Zellen, die mit den verschiedenen SIN-1-, Wildtyp (Toto)-
oder chimären
SIN-1/Toto-Stämmen
beimpft wurden, bestimmt. Kurz, BHK-Zellen wurden mit SIN-1 (oben beschriebener
Plaque-gereinigter Bestand)-, Toto-, SIN-1nsP1-4- oder SIN-1nsP2-Viren
infiziert (MOI = 20), und die Kulturflüssigkeiten wurden 3, 6, 9,
und 12 Stunden nach der Infektion gewonnen. Die Titer des Virus
in den Kulturflüssigkeiten
wurden dann durch Plaque-Test bestimmt, wie oben beschrieben. Die
Ergebnisse dieser Untersuchung, die in
2 gezeigt
sind, zeigen, dass äquivalente
Spiegel des Virus in BHK-Zellen, die mit den Wildtyp- oder SIN-1-Stämmen infiziert
wurden, produziert wurden. Die tatsächlichen Virustiter zum 12
hpi-Zeitpunkt sind in der Tabelle unten dargelegt. Mehr als die
Hälfte
der BHK-Zellen überlebte
die Infektion mit dem SIN-1-Virus (und den chimären Viren, die SIN-1nsPs1-4 oder SIN-1
nsP2 enthielten) in Kombination mit Spiegeln der Virusproduktion,
die äquivalent
zu den Wildtyp-Stämmen
waren.
Virus | Titer
PbE/ml) bei 12 hpi (× 109) |
SIN-1 | 3.6 |
Toto | 2.7 |
SIN-1nsP1-4 | 1.8 |
SIN-1nsP2 | 2.6 |
-
Die
mögliche
Wirkung von Aminosäure-Änderungen
in den SIN-1 nsPs auf den Spiegel der viral-spezifischen RNA-Synthese
wurde durch Vergleichen des Spiegels der [
3H]Uridin-Inkorporation
im Zeitverlauf in BHK-Zellen, die mit den verschiedenen SIN-1-,
Wildtyp (Toto)- oder chimären
SIN-1/Toto-Stämmen
beimpft wurden, bestimmt. BHK-Zellen (3 × 10
5 Zellen/35
mm-Schale) wurden bei 37°C
gemäß den hierin
beschriebenen Bedingungen gezüchtet.
Die Zellen wurden mit SIN-1-, Toto1101-, SIN-1nsP1-4- oder SIN-1nsP2-Viren
infiziert (MOI = 20). 30 min nach der Infektion wurde das Kulturmedium
auf 1 μg/ml
Actinomycin D angepasst. Nach einer Inkubation für weitere 30 min wurde das
Kulturmedium auf 10 μCi/ml
[
3H]Uridin eingestellt. Bei 3, 6, 9 und
12 hpi wurden die behandelten Zellen mit PBS gewaschen und durch
Zugabe von 200 μl
TTE-Puffer (0,2% Triton X-100, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA)
lysiert. Die RNA wurde bei 4°C
durch Zugabe von 200 μl
einer 25% Trichlor-Essigsäure(TCA)-Lösung präzipitiert.
Die RNA wurde durch Mikrozentrifugation für 5 min bei 14000 UpM pelletiert,
einmal mit 5% TCA gespült
und in einer Lösung,
bestehend aus 50 mM NaOH/0,1% SDS, bei 55°C gelöst. Die Lösung, enthaltend die gelöste RNA,
wurde in Szintillationsröhrchen übertragen,
und der Spiegel des inkorporierten [
3H]Uridin
wurde unter Verwendung einer EcoLume (ICN, Irvine, Ka.)-Szintillationsflüssigkeit
bestimmt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung, gezeigt in
3,
zeigen, dass die Spiegel der virus-spezifischen RNA in BHK-Zellen,
die mit SIN-1 infiziert wurden, im Vergleich zum Wildtyp-Virus dramatisch
niedriger waren. Dieser Phänotyp
des niedrigen Spiegels von virus-spezifischer
RNA-Synthese kartiert auf die nsPs, wie durch die äquivalent
niedrigen Spiegeln von RNA, die in BHK-Zellen produziert werden,
die mit den SIN-1- oder SIN-1nsP1-4-Stämmen infiziert wurden, im Vergleich
zum Wildtyp gezeigt wurde.
Virus | [3H]Uridin-Inkorporation (× 103 ZpM) |
SIN-1 | 22 |
Toto1101 | 86 |
SIN-1nsP1-4 | 28 |
SIN-1nsP2 | 62 |
Schein | 8 |
-
Die
virusspezifische RNA-Synthese in infizierten BHK-Zellen wurde auch
unter Verwendung eines jeden der SIN-1-, Toto- und chimären SIN-1/Toto-Stämme bestimmt.
Die Spiegel der [
3H]Uridin-Inkorporation
im Vergleich zur Wildtyp-Infektion (Toto) bei 9 hpi sind in
4 gezeigt
und in der Tabelle unten angegeben.
Virus | Zahl
der Experimente | Relative
RNA-Synthese-Spiegel | Standardabweichung |
Toto1101 | 9 | 1.0 | |
SIN-1 | 9 | 0.1 | ±0.1 |
STN-1nsP1-4 | 8 | 0.2 | ±0.1 |
SIN-1nsP1 | 7 | 1.0 | ±0.2 |
SIN-1nsP2 | 8 | 0.6 | ±0.1 |
SIN-1nsP3 | 4 | 1.0 | ±0.0 |
SIN-1nsP3-4 | 7 | 0.4 | ±0.1 |
SIN-1nsP4 | 6 | 0.8 | ±0.1 |
SIN-1nsP2-N | 1 | 0.9 | |
SIN-1nsP2-C | 3 | 0.6 | ±0.2 |
Schein | 9 | 0.0 | |
-
Daher überleben
BHK-Zellen eine Infektion mit SIN-1-Virus (und den chimären Viren,
die SIN-1nsP1-4 oder SIN-1nsP2 enthalten), werden in BHK-Zellen
SIN-1-Virusspiegel,
die äquivalent
zu den Wildtyp-Stämmen sind,
produziert, und ist der Spiegel der synthetisierten viral-spezifischen
RNA 10-fach niedriger im Vergleich zum Wildtyp-Virus.
-
Die
mögliche
Wirkung von Aminosäure-Änderungen
in den SIN-1 nsPs auf den Spiegel der Inhibition der Wirtszell-Proteinsynthese
wurde durch Vergleichen des Spiegels der Proteinsynthese im Verhältnis zu nicht-infizierten
Zellen über
einen Zeitraum in BHK-Zellen, die mit den verschiedenen SIN-1-,
Wildtyp (Toto)- oder chimären
SIN-1/Toto-Stämmen
beimpft wurden, bestimmt. Kurz, 35 mm-Schalen, in die 2 × 105 BHK-Zellen ausgesät wurden, wurden mit den verschiedenen
Sindbis-Virusstämmen in
einem 0,5 ml-Virusinokulum in einem Puffer, bestehend aus PBS/1%
fötales
Kälberserum,
infiziert (MOI = 20). Die Platten wurden bei 4°C für 1 h unter kontinuierlichem,
sanftem Schwenken inkubiert. Das Inokulum wurde durch 2 ml Medium,
das vorher beschrieben wurde, enthaltend 10% fötales Kälberserum, ersetzt, und die
Schalen wurden in einen CO2-Brutschrank
bei 37°C
platziert. 5, 8 und 11 h später
wurden die Medien durch 2 ml MEM ohne Methionin (Met-) mit 2% fötalem Kälberserum
ersetzt und 30 min inkubiert. Das Medium wurde dann durch 1 ml MEM
(Met-), enthaltend 2% fötales
Kälberserum
und 10 μCi/ml
[35S]Methionin, ersetzt. Nach einer 30 min-Inkubationsdauer
bei 37°C
wurde 1 ml Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum, zu jeder Vertiefung
zugefügt,
und die Schalen wurden für
weitere 30 min bei 37°C
inkubiert. Diese Verdünnung
ist ausreichend, um eine weitere Inkorporation der radioaktiven
Markierung in das Protein zu inhibieren, und senkt den Hintergrund
des freien [35S]-Methionins, der in Polyacrylamid-Gelen
nachgewiesen wird, signifikant. Das Medium wurde dann von der Vertiefung entfernt.
Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen, von der Schale in PBS
geschabt, durch Zentrifugation pelletiert und in 25 μl Ladepuffer
(0,06 M Tris-HCl, pH 6,7, 2% SDS, 5% β-Mercaptoethanol, 5% Glycerin, 0,05%
Bromphenolblau) gelöst.
Ein Fünftel
der Probe wurde auf dem Gel analysiert. Nach der Elektrophorese wurden
die Gele mit Coomassie-Brilliantblau R gefärbt, getrocknet und autoradiographiert.
Die Raten der Inhibition der Wirtszellen-Proteinsynthese wurden
durch Quantifizieren der Menge der Radioaktivität im Abschnitt des Gels, der
nur Wirts-Proteine enthielt, verglichen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung
sind in 5 gezeigt und zeigen, dass
der Spiegel der Inhibition der Wirtszellen-Proteinsynthese in SIN-1-Virus-infizierten Zellen
im Vergleich zu Wildtyp-Virus-infizierten Zellen signifikant niedriger
ist, insbesondere bei den früheren
6 und 9 Stunden-Zeitpunkten nach der Infektion.
-
Zusammenfassend überleben
BHK-Zellen eine SIN-1-Infektion, Virusspiegel, die äquivalent
zu Wildtyp-Stämmen
sind, werden in BHK-Zellen produziert, der Spiegel der synthetisierten
viral-spezifischen RNA ist zehnfach niedriger als Wildtyp-Virus, und der Spiegel
der Inhibition der Wirtszellen-Proteinsynthese in SIN-1-Virus-infizierten Zellen
ist im Vergleich zu Wildtyp-Virus-infizierten Zellen signifikant
niedriger. Die Phänotypen
des hierin beschriebenen SIN-1-Virus kartieren auf die viralen nsP-Gene.
-
BEISPIEL 2
-
ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON POSITIVSTRANG-RNA-VIREN,
DIE EINE REDUZIERTE INHIBITION DER WIRTS-MAKROMOLEKÜLSYNTHESE
ZEIGEN
-
Das
Ableiten von Virusvarianten, die die erwünschten Phänotypen einer reduzierten,
verzögerten
oder keiner Inhibition der Wirtszell-Makromolekülsynthese zeigen, ist abhängig von
der Herstellung, Charakterisierung und Isolierung von Sequenzen,
die sich von jenen des Wildtyp-Virus unterscheiden. Mit der Ausnahme von
Beispiel 1 gibt es jedoch keine offensichtlichen oder früher offenbarten
Verfahren, um auf codierende oder nicht-codierende virale Sequenzänderungen
zu selektieren oder diese zu identifizieren, die in einer Änderung dieser
Virus-basierten Inhibition der Makromolekülsynthese oder der Herstellung
von Viren resultieren, die zu einer persistenten und nicht zu einer
lytischen Infektion führen.
Dieses Beispiel liefert spezifische Verfahren, die es einem ermöglichen,
diese Hindernisse zu überwinden.
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A. Biologische Selektion von Virusvarianten
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Das
biologische Ableiten von Virusvarianten, die in einer reduzieren,
verzögerten
oder keiner Inhibition der Wirts-Makromolekülsynthese resultieren oder
die persistente Infektionen etablieren, kann durch Erlauben einer
natürlichen,
spontanen Mutation in einer Zelle oder zuerst Aussetzen des erwünschten
Virusbestands gegenüber
einer physikalischen, chemischen oder anderen künstlichen Mutagenese, gefolgt
von einer Infektion von empfänglichen
Zellen und schrittweisen Anreicherungen auf jene Zellpopulationen,
die das mutierte Virus beherbergen, durchgeführt werden. Es ist möglich, dass
eine vorherige Mutagenese, obwohl sie nicht notwendig ist, die Herstellung
von geeigneten Mutationen erleichtern wird. Die Selektion basiert
auf der Fähigkeit
der Zellen, die mit der erwünschten
Variante infiziert werden, für
signifikant längere
Zeiträume
als die Wildtyp-Virus-infizierten
Zellen zu überleben.
Das folgende Beispiel liefert detailliert Verfahren unter Verwendung des
Sindbis-Virus als ein Beispiel; dennoch kann es leicht durch andere
Viren substituiert werden, wie in der detaillierten Beschreibung
angemerkt.
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Genau
wird im Fall einer chemischen Mutagenese eine Sindbis-Virusbestands-Suspension
mit einem Titer von mehr als oder gleich 109 PbE/ml
mit Nitrosoguanidin in einer Endkonzentration von 100 μg/ml behandelt.
Nach 15 Minuten bei Zimmertemperatur wird das Nitrosoguanidin durch
Dialyse bei 4°C
entfernt, und der mutagenisierte Bestand wird danach für eine Infektion
verwendet. Ungefähr
5 × 106 Zellen des erwünschten Typs (zum Beispiel
BHK-21), gezüchtet
in einer flachen Bestandskultur, werden mit dem mutagenisierten
Virus bei einer Multiplizität
der Infektion (M. O. I.) von ungefähr 5 infiziert, um sicherzustellen,
dass jede Zelle infiziert wird. 12, 24, 36 und 48 Stunden nach der
Infektion wird die Zelleinzelschicht zweimal mit frischem Medium gewaschen,
um tote Zellen zu entfernen, und durch Medien, bestehend aus einem
Gemisch von 50% frischen Medien und 50% konditionierten Medien,
ersetzt. Zu einer gewünschten
Zeit nach der Infektion (zum Beispiel 72 Stunden) werden die verbleibenden
Zellen sanft trypsinisiert, um sie von der Kulturschale zu lösen und
jegliches zellassoziierte extrazelluläre Virus zu entfernen, das
dann von den Zellen durch Differenzial-Zentrifugation getrennt wird. Die verbleibenden
Zellen werden dann direkt wieder in eine Gewebekulturschale, enthaltend eine
semi-konfluente, nicht-infizierte Zelleinzelschicht, in einem Verhältnis von
1 infizierten Zelle pro alle 103 nicht-infizierten Zellen
ausgesät.
Zusätzliche
Runden der Selektion werden durch Aussäen auf nicht-infizierte Zellen
zur Amplifizierung, gefolgt von den obigen Wasch- und Ernteschritten,
durchgeführt.
Alternativ können die
anfänglichen
Infektionen unter Verwendung eines Wildtyp-Virusbestands bei einer
niedrigen M. O. I. durchgeführt
werden, was eine spontane Mutation während der Replikation in der
Zelle erlaubt. Unter Verwendung dieses Ansatzes wird eine heterogene
Population von mutiertem Virus durch die infizierten Zellen produziert. In
jenen Fällen,
in denen die Population der infizierten Zellen, die nach der Trypsinierung
gewonnen wird, eine signifikante Zahl von nicht lebensfähigen oder
schwer geschädigten
Zellen enthält,
wird eine kurze Behandlung (5 Minuten bei Zimmertemperatur) mit
0,75% NH4Cl in 17 mM Tris (pH 7,65 mit HCl)
oder eine Zentrifugation durch PercollTM,
um verbleibende tote oder geschädigte
Zellen zu entfernen, vor dem Wieder-Aussäen auf nicht-infizierte Zelleinzelschichten
eingeschlossen. Nach einem Minimum von zwei aufeinanderfolgenden Runden
der Selektion werden Virusvarianten, die den erwünschten Phänotyp zeigen, durch limitierende
Verdünnung
oder Plaque-Reinigung
isoliert und, wie im Beispiel 1 beschrieben, einer cDNA-Clonierung
unterzogen. Die Isolierung und Charakterisierung von spezifischen
Sequenzen, die für
den varianten Phänotyp
verantwortlich sind, werden durch Substitution von definierten Regionen
der cDNA in einen genomischen Clon oder Expressionsvektor und Testen
auf die begleitende phänotypische Änderung
erreicht, wie in den Beispielen behandelt.
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B. Genetische Selektion von Virusvarianten
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In
einem verwandten Ansatz wird eine natürliche Mutation oder zufällige Mutagenese
nicht bei einem Virusbestand, sondern vielmehr unter Verwendung
von clonierter genomischer cDNA des Virus, das in vitro oder in
vivo in infektiöse
virale RNA transkribiert werden kann, durchgeführt. Zum Beispiel wird im Fall
einer früheren
Mutagenese das Plasmid pRSINg, das eine genomische Volllängen-Sindbis-cDNA, funktionell
verknüpft
mit einem Bakteriophagen SP6-Promotor (Dubensky et al., J. Virol.
70: 508-519, 1996), enthält,
in kompetente E. coli XL-1-Red-Mutatorzellen
transformiert und auf Ampicillin-Platten plattiert, um Kolonien
zu erhalten. Mindestens 200 Kolonien werden zufällig ausgewählt, gepoolt und für eine über Nacht-Kultur
in eine 10 ml-Brühe-Kultur,
enthaltend Ampicillin, eingeimpft. Plasmid-DNA wird von der Kultur
hergestellt, um eine heterogene Population von pRSINg, das verschiedene
Mutationen beherbergt, zu erhalten. Die DNA wird mit XbaI linearisiert
und in vitro unter Verwendung der SP6-Polymerase transkribiert,
wie früher
beschrieben (Rice et al., J. Virol. 61: 3809-3819, 1987). Die RNA-Transkripte
werden danach durch Elektroporation (Liljestrom und Garoff, Bio/Technology
9: 1356-1361, 1991)
für die
Initiierung des Sindbis-Virus-Infektionszyklus in den erwünschten
Zelltyp (zum Beispiel BHK-Zellen) transfiziert. Alternativ kann
auch in vitro-transkribierte
RNA von einer nicht-mutagenisierten Matrize transfiziert werden.
Die Selektion von Virusmutanten, die eine persistente Infektion
etablieren oder eine reduzierte, verzögerte oder keine Inhibition
der Wirts-Makromolekülsynthese
zeigen, wird wie oben durchgeführt.
Die selektierten Virusmutanten mit dem erwünschten Phänotyp werden durch limitierende
Verdünnung
oder Plaquereinigung isoliert, einer cDNA-Clonierung unterzogen,
und die Sequenzen, die für
den varianten Phänotyp
verantwortlich sind, werden isoliert und charakterisiert, wie vorher
beschrieben.
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C. Genetische Selektion von Varianten
unter Verwendung von Virus-abgeleiteten Vektoren
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1. Vektoren, die ein immunogenes Protein
exprimieren
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In
einem anderen Ansatz wird eine spontane intrazelluläre Mutation
oder eine zufällige
Mutagenese bei Virus-abgeleiteten Sequenzen eines viral-basierten
Expressionsvektors durchgeführt.
Diese Sequenzen schließen
nicht-codierende und regulatorische Regionen sowie Nichtstrukturprotein-codierende
Regionen ein. In bestimmten Fällen
können
auch Strukturprotein-codierende Sequenzen eingeschlossen sein. Eine
solche zufällige
Mutagenese oder spontane intrazelluläre Mutation kann unter Verwendung
irgendeiner der in dieser Erfindung beschriebenen Techniken zusammen
mit der clonierten cDNA eines Virus-abgeleiteten Vektors, der in
vitro oder in vivo in RNA transkribiert werden kann, durchgeführt werden.
Zum Beispiel kann ein Replikations-kompetenter Sindbis-Virus-Expressionsvektor
verwendet werden, um ein immunogenes Zelloberflächenprotein oder anderes Peptid
zu exprimieren, das durch spezifische Antikörper, die zu den infizierten
Zellen zugefügt
werden, gebunden werden kann. Zellen, die einen funktionellen Vektor
enthalten, werden durch ihre Expression des Vektor-codierten heterologen
Antigens und die Fähigkeit,
durch einen Antikörper
gebunden zu werden, der spezifisch für das codierte Antigen ist,
identifiziert. Durch Limitieren des Selektionsvorgangs auf Zellen,
die über
ausgedehnte Zeiträume
(siehe oben) überleben,
werden nur jene, die Vektorvarianten enthalten, die den erwünschten
Phänotyp
zeigen, angereichert.
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Genau
wird das Plasmid pTE3'2J
(Hahn et al., J. Virol. 89: 2679-2683, 1992), umfassend einen SP6-Promotor,
der funktionell mit einer genomischen Volllängen-Sindbis-cDNA mit einem verdoppelten
subgenomischen Promotor für
die Expression von heterologen Genen verknüpft ist, einer zufälligen Mutagenese, wie
oben beschrieben, ausgesetzt. Dieser Vorgang resultiert in der Isolierung
einer Population eines heterogenen Plasmids, das die zufälligen Mutationen
enthält.
Parallel wird das erwünschte
heterologe Zelloberflächenprotein-
oder Markerpeptid-Gen in einen Shuttlevektor für die Insertion in den mutagenisierten pTE3'2J-Vektor cloniert.
Bevorzugte Zelloberflächenproteine
für die
Verwendung als Marker schließen menschliches
B7.1 (Freeman et al., J. Immunol. 143: 2714-2722, 1989) und das
murine H-2Kb-Klasse I-Molekül (Song
et al., J. Biol. Chem. 269: 7024-7029, 1994) ein. Das menschliche
B7.1-Gen wird durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer 1,5 Minuten-Extension
von einem pCDM8-Vektor, enthaltend die Volllängen-cDNA-Sequenz (Freeman et al., ebd.) unter
Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer, die gestaltet sind,
um flankierende XbaI- und BamHI-Stellen zu enthalten, amplifiziert.
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Nach
der Amplifizierung wird das ungefähr 875 bp-DNA-Fragment unter
Verwendung eines QIAquick-spin PCR-Reinigungskits (Qiagen, Chatsworth,
Ka.) gereinigt, mit XbaI und BamHI verdaut und in den Sindbis-Shuttlevektor
pH3'2J1 (Hahn et
al., ebd.) ligiert, der auch mit XbaI und BamHI verdaut und mit
intestinaler alkalischer Kälber-Phosphatase
behandelt worden ist, um das Konstrukt pH3'B7.1 zu bilden.
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Nach
einer zufälligen
Mutagenese des subgenomischen pTE3'2J-Doppelvektors,
wie oben beschrieben, werden das Plasmid pH3'B7.1 und die mutierte Population des
Plasmids pTE3'2J
mit ApaI und XhoI verdaut, von 0,7% Agarosegelen unter Verwendung
von GENECLEAN II IITM (Bio101, Vista, Ka.)
gereinigt und ligiert, um eine heterogene Population eines B7.1-Expressionsvektors,
bezeichnet pTE3'B7.1,
zu bilden. Ohne E. coli zu transformieren und individuelle Clone
zu isolieren, wird die gesamte Population des ligierten Vektors mit
XhoI linearisiert und als Matrize für in vitro-SP6-Transkriptionsreaktionen
verwendet, wie oben beschrieben. Die heterogene Population von zufällig mutagenisierten
B7.1-Vektortranskripten
wird dann in den erwünschten
Zelltyp (zum Beispiel BHK-Zellen) für die Initiierung des Sindbis-Replikationszyklus
durch Elektroporation eingebracht. Die Selektion auf Virusmutanten,
die eine persistente Infektion etablieren oder eine reduzierte,
verzögerte
oder keine Inhibition der Wirts-Makromolekülsynthese zeigen, wird unter
Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, der spezifisch für B7.1 ist
(Pharmingen, San Diego, Ka.); und von entweder Magnet- oder Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierungs-Protokollen
durchgeführt.
Die bevorzugten sekundären Antikörper-Marker
schließen
Ratte-anti-Maus-IgG, konjugiert mit magnetischen Mikroperlen für ein magnetisches
Zellsortieren (miniMACS Magnetic Separation System, Miltenyi Biotech,
Auburn, Ka.; Miltenyi et al., Cytometry 11: 231-238, 1990), und
FITC-konjugiertes Ratte-anti-Maus-IgG (Pharmingen, San Diego, Ka.)
für Fluoreszenz-aktiviertes
Zellsortieren ein. Unter Verwendung eines solchen Ansatzes und des
Erntens der Zellen nach einem ausgedehnten Zeitraum (siehe oben)
werden nur lebensfähige
Zellen, die einen funktionellen Virus-abgeleiteten Vektor enthalten
(wie durch B7.1-Expression gezeigt), der den erwünschten Phänotyp zeigt, angereichert.
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Genau
wird die heterogene Population von zufällig mutagenisierten B7.1-Vektortranskripten
in 5 × 107 Zellen gemäß dem Verfahren von Liljestrom
und Garoff (1991, ebd.) durch Elektroporation eingebracht und als eine
flache Bestandskultur plattiert. 12, 24, 36 und 48 Stunden nach
der Infektion wird die Zelleinzelschicht zweimal mit frischen Medien
gewaschen, um toten Zellen zu entfernen, und durch Medien ersetzt,
die aus einem Gemisch von 50% frischen Medien und 50% konditionierten
Medien bestehen. Zu einer erwünschten
Zeit nach der Infektion (zum Beispiel 72 Stunden) werden die verbleibenden
Zellen sanft trypsinisiert, um sie von der Kulturschale abzulösen, und
durch Zentrifugation bei 1000 UpM, 4°C pelletiert. Die Zellen werden
in 2 ml Blockierungslösung
(PBS + 10% fötales
Kälberserum
+ 1% BSA) resuspendiert, auf Eis für 10 Minuten inkubiert und
wieder pelletiert. Als Nächstes
werden die Zellen in 200 μl
der primären
anti-B7.1-Antikörperlösung (verdünnt in PBS
+ 0,5% BSA) resuspendiert und für
30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen werden zweimal mit PBS
+ 0,5% BSA gewaschen, pelletiert und in 200 μl magnetischer Perlenlösung (200 μl gewaschene
magnetische Ratte-anti-Maus-beschichtete
Perlen in PBS + 0,5% BSA + 5 mM EDTA) resuspendiert. Nach einer Inkubation
für 30
Minuten bei 4°C
werden die Perlen-gebundenen Zellen zweimal mit PBS + 0,5% BSA +
5 mM EDTA gewaschen und in 1 ml desselben Puffers resuspendiert.
Die Perlen-gebundenen Zellen werden dann unter Verwendung der MiniMacs-Magnetsäule gemäß den Anweisungen
des Herstellers gereinigt. Die eluierten positiven Zellen werden
dann direkt in eine Gewebekulturschale, enthaltend eine semi-konfluente, nicht-infizierte
Zelleinzelschicht, in einem Verhältnis
von 1 infizierten Zelle pro alle 104 nicht-infizierten
Zellen wieder ausgesät.
Zusätzliche
Runden der Selektion werden wie oben für die Amplifizierung/Anreicherung durchgeführt. Die
selektierten Vektorvarianten mit dem erwünschten Phänotyp werden durch limitierende
Verdünnung
oder Plaquereinigung isoliert, einer cDNA-Clonierung unterworfen, und die Sequenzen,
die für
den varianten Phänotyp
verantwortlich sind, werden isoliert und charakterisiert, wie früher beschrieben.
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Alternativ
kann der B7.1-Expressionsvektor pTE3'B7.1 direkt für eine in vitro-Transkription ohne
vorherige Mutagenese verwendet werden. Nach der Transfektion dieser
RNA-Transkripte wird eine Selektion auf Mutanten des erwünschten
Phänotyps
durchgeführt,
wie oben beschrieben.
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2. Vektoren, die einen selektierbaren
Marker exprimieren
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Alternativ
kann ein Antibiotikum-Resistenzmarker für die Selektion von Virus-Vektorvarianten,
die den erwünschten
Phänotyp
zeigen, verwendet werden. Zum Beispiel wird der Sindbis-Vektor pRSIN-luc
(Dubensky et al., ebd.) einer zufälligen Mutagenese ausgesetzt,
wie oben beschrieben, und eine Population von heterogenem Plasmid,
enthaltend die zufälligen
Mutationen, wird isoliert. Zusätzlich
wird das Gen, das die Neomycin (G418)-Resistenz codiert, durch Standard-drei-Zyklus-PCR-Amplifizierung
mit 1,5 Minuten Extension vom Plasmid pcDNA3 (Invitrogen, San Diego,
Ka.) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer isoliert, die
gestaltet sind, um flankierende XhoI- und NotI-Restriktionsstellen
zu enthalten:
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Nach
der Amplifizierung wird das DNA-Fragment mit QIAquick-spin gereinigt,
mit XhoI und NotI verdaut und in die mutierte Population des pRSIN-luc-Vektors
ligiert, der auch mit XhoI und NotI verdaut, mit intestinaler alkalischer
Kälber-Phosphatase behandelt,
und von einem 0,7% Agarosegel von seiner vorherigen Luciferase-Insertion
unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden ist. Die Ligierung
des Neomycin-Resistenzmarkers in den mutierten pRSIN-Vektor bildet
eine heterogene Population eines neor-Expressionsvektors,
bezeichnet pRSIN-neo. Ohne E. coli zu transformieren und individuelle
Clone zu isolieren, wird die gesamte Population des ligierten Vektors
mit SacI linearisiert und als Matrize für in vitro-SP6-Transkriptionsreaktionen
verwendet, wie oben beschrieben. Die heterogene Population von zufällig mutagenisierten
neor-Vektortranskripten wird in den erwünschten
Zelltyp (zum Beispiel BHK-Zellen) für die Initiierung des Sindbis-Replikationszyklus
und der heterologen Genexpression durch Elektroporation eingebracht.
Ungefähr
12–24
Stunden nach der Transfektion werden die Zellen trypsinisiert und
wieder in Medien, enthaltend G418, plattiert. Danach werden die
Medien in ungefähr
24 Stunden-Intervallen gewechselt, um tote Zellen zu entfernen,
und durch G418-enthaltende Medien, bestehend aus einem Gemisch von
50% frischen Medien und 50% konditionierten Medien, ersetzt. Die
Medienwechsel werden reduziert, nachdem die Mehrheit der toten Zellen
weggewaschen ist und Zellfoci beginnen, sich zu bilden. Unter Verwendung
dieser Selektion werden nur lebensfähige Zellen, die einen funktionellen
Virus-abgeleiteten Vektor enthalten, der den erwünschten Phänotyp zeigt (gezeigt durch
Neomycin-Resistenz), angereichert. Mutierte Vektorvarianten-Genome,
die den erwünschten
Phänotyp
zeigen, werden durch Ernten der RNA direkt aus den Zelllysaten unter
Verwendung von RNAzol B (Tel-Test, Friedswood, TX) isoliert. Alternativ
werden die Zellen mit einer defekten Helfer-Sindbis-RNA (pR-dlnsPSIN,
Dubensky et al., ebd.) transfiziert, was in der Produktion von verpackten
pRSIN-neo-Vektor-enthaltenden Partikeln im Kulturüberstand
resultiert, die durch Zentrifugation für eine folgende Vektor-RNA-Isolierung wie oben
konzentriert werden können.
In jedem Fall wird die Vektor-RNA einer cDNA-Clonierung unterworfen, und
die Sequenzen, die für
den varianten Phänotyp
verantwortlich sind, werden isoliert und charakterisiert, wie vorher
beschrieben.
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Alternativ
kann der pRSIN-Vektor mit einem Neomycin-Resistenzmarker direkt
für die
in vitro-Transkription ohne vorherige Mutagenese verwendet werden.
Nach der Transfektion dieser RNA-Transkripte wird die Selektion
auf Mutanten des erwünschten
Phänotyps
durchgeführt,
wie oben beschrieben.
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In
einem anderen Beispiel wird ein Semliki Forest-Virus-abgeleiteter
Vektor, pSFV-1 (GIBCO/BRL), für die
Insertion des Antibiotikum-Resistenzmarkers und die folgende Selektion
des erwünschten
Phänotyps
verwendet. Das Gen, das die Neomycin (G418)-Resistenz codiert, wird
durch Standard-drei-Zyklus-PCR-Amplifizierung
mit 1,5 Minuten Extension vom Plasmid pcDNA3 (Invitrogen, San Diego,
Ka.) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer isoliert,
die gestaltet sind, um flankierende BamHI-Restriktionsstellen zu
enthalten:
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Nach
der Amplifizierung wird das DNA-Fragment mit QIAquick-spin gereinigt,
mit BamHI verdaut und in den Wildtyp oder eine vorher mutierte Population
des pSFV-1-Vektors, der auch mit BamHI verdaut, mit intestinaler
alkalischer Kälber-Phosphatase behandelt
und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN 11
gereinigt worden ist. Die Transkription der RNA-Vektoren und die
Selektion auf Mutanten des erwünschten
Phänotyps
werden im Wesentlichen ausgeführt,
wie oben für
das Sindbis-Virus beschrieben.
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BEISPIEL 3
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HERSTELLUNG VON SIN-1-BASIERTEN RNA-VEKTOR-REPLIKONS
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A. Konstruktion des SIN-1-Basisvektors
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SIN-1-abstammende-Vektor-Gerüste wurden
konstruiert und in eine Plasmid-DNA
inseriert, die einen Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor enthielt,
so dass die Transkription in vitro ein RNA-Molekül produzierte, das beim Einbringen
in empfängliche
Zellen als ein selbst-replizierendes Molekül (Replikon) wirkt. Das Basis-SIN-1-RNA-Vektor-Replikon
umfasste die folgenden geordneten Elemente: SIN-1nsPs-Gene, eine subgenomische
RNA-Promotorregion, eine Polylinkersequenz, die heterologe Sequenzinsertionen
enthalten kann, die nicht translatierte SIN-1-3'-Region (NTR) und eine Polyadenylat-Sequenz.
Nach der Transfektion in empfängliche
Zellen erfolgt eine autonome Replikation des RNA-Vektor-Replikons wie für ein Virus,
und die heterologen Sequenzen werden als hochgradig abundante subgenomische
mRNA-Moleküle
synthetisiert, die wiederum als die translationelle Matrize für das heterologe
Genprodukt dienen.
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Die
5'-Region des Vektors,
der die SIN-1 nsP-Gene und den subgenomischen Promotor umfasst,
erstreckt sich zwischen zwei Nucleotiden des translationellen Capsid-Gen-Initiationspunkts.
Diese Region wurde zuerst in das pKSII+-Plasmid (Stratagene) zwischen
die ApaI- und XhoI-Stellen inseriert. Die 5'-Region des Vektors wurde durch PCR
vom pRSIN-1g-Plasmid in zwei überlappenden Fragmenten
amplifiziert. Das erste Fragment wurde in einer PCR-Reaktion mit
dem folgenden Primerpaar hergestellt:
-
Das
zweite Fragment wurde in einer PCR-Reaktion mit dem folgenden Primerpaar
hergestellt:
-
Die
zwei PCR-Reaktionen wurden mit den oben gezeigten Primerpaaren unter
Verwendung der hitzestabilen Thermalase- (Amresco, Solon, OH), Vent-
(New England Biolabs, Beverly, MA) oder KlenTaq-DNA-Polymerasen
durchgeführt.
Zusätzlich
enthielten die Reaktionen 5% DMSO und „HOT START WAX"-Perlen (Perkin-Elmer,
Foster City, Ka.). Das unten gezeigte PCR-Amplifizierungsprotokoll
wurde verwendet. Die Extensionsdauer war 5 Minuten oder 2,5 Minuten
für Reaktionen
mit den SP6-1F/SIN5160R- beziehungsweise 5079F/SIN7643R-Primerpaaren.
Temperatur
(°C) | Zeit
(Min) | Anzahl
der Zyklen |
95 | 2 | 1 |
95
55
72 | 0.5
0.5
5.0
or 2.5 |
35
|
72 | 10 | 10 |
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Nach
der PCR wurden die zwei amplifizierten Produkte von 5142 bp (SP6-1F/SIN5160R-Primerpaar) und
2532 bp (5079F/SIN7643R-Primerpaar) gereinigt (PCR-Reinigungskit,
Qiagen, Chatsworth, Ka.) und mit ApaI und SfiI (5142 bp-Amplikonprodukt)
oder SfiI und XhoI (2532 bp-Amplikonprodukt) verdaut. Die verdauten Produkte
wurden mit GENECLEAN II (Bio 101, Vista, Ka.) gereinigt und mit
pKS+-Plasmid (Stratagene, La Jolla, Ka.) zusammen ligiert, das durch
Verdau mit ApaI und XhoI hergestellt wurde und mit CIAP Phosphatase behandelt
wurde. Diese Konstruktion ist als pKSSIN-1-BV5' bekannt.
-
Die
3'-Region des Vektors,
die das virale 3'-Ende
umfasst, ein Polyadenylat-Bereich
und eine einmalige Restriktions-Erkennungssequenz wurden zwischen
die NotI- und SacI-Stellen des Plasmids pKSSIN-1-BV5' inseriert. Die 3'-Region des Vektors
wurde durch PCR vom pRSIN-1g-Plasmid in einer Reaktion, die das
folgende Primerpaar enthielt, amplifiziert:
-
Zusätzlich zu
den oben gezeigten Primerpaaren enthielt die PCR-Reaktion die hitzestabilen
Thermalase-, Vent- oder die KlenTaq-DNA-Polymerasen, 5% DMSO und „Hot Start
Wax"-Perlen (Perkin-Elmer).
Das Amplifizierungsprotokoll war, wie oben gezeigt, aber mit einer
72°C-Extensionsdauer
von 30 Sekunden.
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Das
amplifizierte 377 bp-Produkt, das dem 3'-Vektorende entsprach, wurde gereinigt,
mit NotI- und SacI verdaut, gereinigt und in pKSSIN-1-BV5' ligiert, das durch
Verdau mit Not' und
SacI und Behandlung mit CIAP hergestellt wurde. Dieses Plasmid ist
als pKSSIN-1-BV bekannt.
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Unter
Verwendung der oben beschriebenen Techniken wurde das lacZ-Gen,
das das β-Galactosidase-Reporterprotein
codiert, mit BamHI und HindIII vom Plasmid pSV-β-Galactosidase (Promega Corp.,
Madison, WI) freigesetzt und in pKS+ an den entsprechenden Enzym-Erkennungsstellen
inseriert. Das lacZ-Gen wurde aus diesem Plasmid, pKS-β-gal, mit
XhoI und NotI verdaut und in pKSSIN-1-BV zwischen die XhoI- und NotI-Stellen
inseriert. Dieses Plasmid ist als SINrep/SIN-1 nsP1-4/LacZ bekannt.
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Alternativ
wurde das Leuchtkäfer-Luciferasegen,
das das Luciferase-Reporterprotein
codiert, vom Plasmid pT3/T7-LUC (Clontech, Palo Alto, Ka.) durch
Verdau mit HindIII freigesetzt und in pKS+ (Stratagene, La Jolla,
Ka.) an den entsprechenden Enzym-Erkennungsstellen, die in der mehrfachen
Clonierungssequenz enthalten sind, inseriert, um pKS-luc herzustellen.
Das Luciferase-Gen wurde von pKS-luc durch Verdau mit XhoI und NotI
freigesetzt und in XhoI/NotI-verdautes pKSSIN-1-BV inseriert. Dieses
Plasmid ist als SINrep/SIN-1nsP1-4/luc
bekannt.
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Zusätzlich wurde
das Gen, das die sezernierte Form der alkalischen Phosphatase (SEAP)
codiert, in pKSSIN-1-BV inseriert. Kurz, das SEAP-Gen wurde vom
Plasmid pCMV/SEAP (Tropix, Redford, MA) durch Verdau mit HindIII
und XbaI freigesetzt und in pKS+ (Stratagene, La Jolla, Ka.) an
den entsprechenden Erkennungsstellen, die in der mehrfachen Clonierungssequenz
enthalten sind, inseriert, um pSK-SEAP herzustellen. Das SEAP-Gen
wurde dann durch Verdau mit XhoI und NotI von pSK-SEAP freigesetzt
und in die entsprechenden Enzym-Erkennungsstellen
von pKSSIN-1-BV inseriert. Dieses Plasmid ist als SINrep/SIN-1nsP1-4/SEAP bekannt.
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Die
individuellen SIN-1 nsP-Gene werden in die entsprechende Wildtyp-Virusregion des Sindbis-Virus-basierenden
lacZ-Replikons, das früher
beschrieben wurde (Bredenbeek et al., J. Virol. 67: 6439-6446, 1993),
substituiert, um die Expressionseigenschaften der SIN-1- und Wildtyp-Expressionsvektoren
zu vergleichen. Die Substitution der SIN-1nsP-Gene in das Toto1101-abgeleitete
lacZ-Replikon wurde
erreicht, wie im Beispiel 1 beschrieben. Diese Vektoren wurden bezeichnet,
wie in der Tabelle unten gezeigt.
| Ursprung
der nsP-Gene |
Replikon-Bezeichnung | Toto1101 | SIN-1 |
SINrep/lacZ | nsP1-4 | |
SINrep/SIN-1nsP2/lacZ | nsP1,3-4 | nsP2 |
SINrep/SIN-1nsP3/lacZ | nsP1-2,4 | nsP3 |
SINrep/SIN-1nsP1-4/lacZ | | nsP1-4 |
-
Die
SP6-Transkripte wurden von den in der obigen Tabelle gezeigten Replikons
nach einer Linearisierung mit XhoI hergestellt, wie im Beispiel
1 beschrieben. Die RNA-Transkripte enthielten eine 5'-Sequenz, die zum
Initiieren der Transkription des Sindbis-Virus in der Lage ist,
die Sindbis-Virus-Nichtstrukturprotein-Gene 1-4,
RNA-Sequenzen, die für
das Verpacken benötigt
werden, eine Sindbis-Virus-Verbindungsregion, das lacZ-Gen und die
proximalen Sindbis-Virus-3'-End-Sequenzen,
die für
die Synthese der Minusstrang-RNA benötigt werden.
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Die
in vitro-Transkriptions-Reaktionsprodukte oder die gereinigte RNA
wurden in Babyhamster-Nieren-21 (BHK-21)-Zellen durch Elektroporation
eingebracht, wie früher
beschrieben (Liljestrom und Garoff, Bio/Technology 9: 1356-1361,
1991).
-
Alternativ
wurde ein Komplex von BHK-21-Zellen mit einer kommerziellen kationischen
Lipidverbindung gebildet, wie im Beispiel 1 beschrieben, und auf
BHK-21-Zellen, die
bei 75% Konfluenz gehalten wurden, aufgetragen. Die transfizierten
Zellen wurden in 35 mm-Schalen vermehrt und bei 37°C inkubiert.
-
Die
Wirksamkeit der Transfektion von BHK-21-Zellen mit SINrep/lacZ-RNAs
wurde nach 9 Stunden durch zwei alternative Verfahren bestimmt.
Im ersten Verfahren wurden die transfizierten Zellen, die β-Galactosidase
exprimieren, durch direktes Färben
mit X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-b-D-galactopyranosid) bestimmt,
nachdem die Zellen zuerst mit 2% kaltem Methanol fixiert wurden,
wie früher
beschrieben (MacGregor et al., Cell Mol. Genet. 13: 253-265, 1987).
Im zweiten Verfahren wurde die Expression von β-Galactosidase durch Immunfluoreszenz
unter Verwendung eines Kaninchen-anti-β-Galactosidase-Antikörpers bestimmt.
Ein Teil der Zellen, die durch eines der oben beschriebenen Verfahren
transfiziert wurden, wurde auf runden Deckgläsern vermehrt, die in 35 mm-Schalen
enthalten waren. 9 Stunden nach der Transfektion (hpt) wurden die Medien
durch Aspiration entfernt, und die Zellen wurden zweimal mit PBS
gewaschen und durch Inkubation mit Methanol über Nacht bei –20°C fixiert.
Das Methanol wurde durch Aspiration entfernt, die Zellen wurden dreimal
mit PBS gewaschen, dann mit 2% BSA (Fraktion V, Sigma, St. Louis,
MO) für
30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach der Inkubation mit
BSA, um eine nicht-spezifische Antikörperbindung zu verhindern,
wurden die Zellen mit dem primären
anti-β-Galactosidase-Antikörper (1:800
in 0,1% BSA/PBS verdünnt) für 1 Stunde
bei Zimmertemperatur inkubiert. Überschüssiger primärer Antikörper wurde
dann durch Aspiration und dreimaliges Spülen mit 0,1% BSA in PBS entfernt.
Nach einer 1:100-Verdünnung
in 2% BSA in PBS wurden 100 ml Ziege-anti-Kaninchen-FITC-konjugierter
sekundärer
Antikörper
(Sigma, St. Louis, MO) zu den Deckgläsern zugefügt und für 45 Minuten bei Zimmertemperatur
im Dunkeln inkubiert. Überschüssiger sekundärer Antikörper wurde
durch zweimaliges Abspülen
der Deckgläser
mit 0,1% BSA in PBS und einmal mit PBS entfernt. Die Deckgläser wurden
dann mit der Zellseite nach unten auf einen Tropfen Cytoseal 60-Befestigungsmedium
(Stephens Scientific, Riverdale, NJ), der auf einem Objektträger platziert
wurde, befestigt. Fluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um die
Frequenz der Zellen, die β-Galactosidase
exprimieren, zu bestimmen, um die Transfektionswirksamkeit zu bestimmen.
-
Der
Spiegel von β-Galactosidase
in transfizierten Ganzzell-Lysaten wurde bei 9 hpt durch zwei alternative
Verfahren bestimmt. Im ersten Verfahren wurden die transfizierten
Zellen nach der Aspiration der Medien mit PBS gespült, und
250 μl Reporter-Lysepuffer
(Promega, Madison, WI) wurden pro 106 Zellen
zu jeder Schale zugefügt.
Die β-Galactosidase-Expressionsspiegel
wurden durch Mischen der Überstandsfraktion
von den Zelllysaten, die durch Mikrozentrifugation bei 14000 UpM für 1 Minute
bei Zimmertemperatur verarbeitet wurden, mit einen kommerziell erhältlichen
Substrat-Nachweissystem (Lumi-gal, Clontech, Palo Alto, Ka.), gefolgt
von einer Luminometrie (Analytical Luminescence Laborstory, San
Diego, Ka.), bestimmt. Im zweiten Verfahren wurde die Aktivität der β-Galactosidase
bestimmt, wie früher
durch Sambrook und Maniatis (1989, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laborstory
Press, NY) beschrieben. Kurz, die transfizierten Zellen wurden nach
Aspiration der Medien mit PBS gespült, und 200 μl TTE-Lysepuffer
(10 mM Tris-HCl pH 8,0/1 mM EDTA/0,2% Triton X-100) wurden pro 106 Zellen zu jeder Schale hinzugefügt. Nach
Pelletieren des Zelltrümmer
vom Zell-Lysat durch Mikrozentrifugation bei 14000 UpM für 1 Minuten
bei Zimmertemperatur wurden 50 μl
des Überstands
zu 0,5 ml Z-Puffer, pH 7,0 (60 mM Na2HPO4/40 mM NaH2PO4/10 mM KCl/10 mM MgSO4/50
mM 2-Mercaptoethanol), zugefügt
und bei 37°C
für 5 Minuten
inkubiert. Die β-Galactosidase-Aktivität in den
Proben wurde dann nach Zugabe von 0,2 ml einer Lösung, enthaltend 4 mg/ml des
chromogenen Substrats o-Nitrophenyl-b-D-galactopyranosid
(ONPG; SIGMA, St. Louis, MO) in Z-Puffer, durch Spektrophotometrie
(420 nm) bestimmt. Die Proben wurden bei 37°C inkubiert, bis sich die gelbe
Farbe entwickelte (ungefähr
5 Minuten), und die Reaktionen wurden durch Zugabe von 0,5 ml 0,5
M Na2CO3 gestoppt.
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Der
Spiegel der β-Galactosidase-Expression
in transfizierten BHK-21-Zellen wurde gemäß den oben beschriebenen Verfahren
bestimmt und ist in der unten gezeigten Tabelle illustriert. Die
angezeigten Daten sind auf variierende Transfektionswirksamkeiten
normalisiert, wie oben beschrieben.
Transfiziertes
Replikon | Expression
von β-Gal
relativ zu SINrep/lacZ | Standardabweichung |
SINrep/lacZ | 1.0 | |
SINrep/SIN-1nsP2/lacZ | 3.2 | ±0.4 |
SINrep/SIN-1nsP3/lacZ | 0.2 | ±0.0 |
SINrep/SIN-1nsP1-4/lacZ | 5.2 | ±1.3 |
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass die Replikon-Vektoren, die von dem varianten
SIN-1-Stamm abgeleitet sind, in der Tat funktionell sind. Wenn in
BHK-21-Zellen transfiziert, ist der Spiegel des exprimierten Reporterproteins
höher als
jener, der in Wildtyp-Virus-abgeleiteten, Vektor-transfizierten
Zellen beobachtet wird. Darüber
hinaus kartierte der höhere
Spiegel der β-Galactosidase-Expression
in BHK-21-Zellen,
die mit den SIN-1-abgeleiteten Replikon-Vektoren transfiziert wurden,
wie der Phänotyp
für die
Etablierung einer produktiven persistenten Infektion vorwiegend
auf das nsP2-Gen.
-
BEISPIEL 4
-
HERSTELLUNG VON SIN-1-BASIERTEN DNA-VEKTOREN
-
A. Konstruktion von Plasmid-DNA-SIN-1-abgeleiteten
Expressionsvektoren
-
Eine
wirksame Initiierung des infektiösen
Sindbis-Virus-Zyklus kann in vivo von einem genomischen cDNA-Clon
erfolgen, der in einer RNA-Polymerase II-Expressionskassette (Dubensky et al.,
J. Virol. 70: 508-519, 1996) enthalten ist. Die Fähigkeit,
funktionelle Alphavirus-Gene von einem DNA-Format zu exprimieren,
hat ermöglicht,
dass zwei neue Alphavirus-basierende Gen-Expressionssysteme entwickelt
werden: (1) ein Plasmid DNA-basierter Vektor mit Anwendungen für eine genetische
Immunisierung und (2) die Produktion von verpackten Alphaviruspartikeln
in Zellen, die mit Vektor-Replikon- und DH-Plasmid-DNAs co-transfiziert wurden.
Früher
waren molekulare Ansätze,
um infektiöse
Sindbis-Virus-RNA und ihre abgeleiteten komplementären Vektoren
zu produzieren, vorwiegend auf eine in vitro-Transkription von cDNA-Clonen von einem Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor, gefolgt
von Transfektion in permissive Zellen beschränkt.
-
Der
Plasmid-DNA-basierte Alphavirus-abgeleitete Expressionsvektor ist
als ELVSTM (eukaryontisches geschichtetes
Vektorsystem, „Eukaryotic
Layered Vector System")
bekannt. Der ELVSTM-Plasmid-DNA-Vektor involviert
die Konversion einer selbst-replizierenden Vektor-RNA (eines Replikons)
in ein geschichtetes, DNA-basiertes
Expressionssystem. In bestimmten Ausführungsformen hat die erste
Schicht eine eukaryontische (z. B. RNA-Polymerase II) Expressionskassette,
die die Transkription einer zweiten Schicht initiiert, die dem RNA-Vektor-Replikon
entspricht. Nach dem Transport des Replikons, das von der ersten
Schicht exprimiert wird, vom Nukleus in das Cytoplasma schreitet
die autokatalytische Amplifizierung des Vektors gemäß dem viralen
(z. B. Alphavirus) Replikationszyklus fort, was in der Expression
des heterologen Gens resultiert.
-
Die
Konstruktion von SIN-1-Virus-abgeleiteten Plasmid-DNA-Expressionsvektoren
wurde mit Modifikationen der früher
beschriebenen Verfahren (Dubensky et al., J. Virol. 70: 508-519,
1996) durchgeführt.
Der Expressionsvektor wurde auf dem Plasmidvektor pBGS131 (ATCC
Nr. 37443) zusammengefügt,
der ein Kanamycin-resistentes Analog von pUC9 ist (Spratt et al.,
Gene 41: 337-342, 1986). pBGS131 und seine abgeleiteten Plasmide
wurden in LB-Medium, enthaltend 20 μg/ml Kanamycin, vermehrt.
-
Um
die Insertion von heterologen Sequenzen in den Expressionsvektor
zu ermöglichen,
wurde die XhoI-Erkennungssequenz, die im translationellen Leserahmen
des Kanamycin-Gens in pBGS131 gelegen ist, durch Inserieren eines
teilweise komplementären
12-mer-Oligonucleotidpaars, das klebende XhoI-Enden enthielt, entfernt.
Die XhoI-Erkennungsstelle wurde als ein Ergebnis der Insertion verloren,
wie unten gezeigt:
-
- XhoI-Stelle: CTCGAG) (SEQ. ID NOS. 33-36 und 104).
-
Das
Oligonucleotid wird in gleichen molaren Konzentrationen in der Anwesenheit
von 10 mM MgCl2 im Gel aneliert, für 5 min
auf 100°C
aufgeheizt, langsam auf Zimmertemperatur abgekühlt und mit Polynucleotidkinase
phosphoryliert. Das Oligonucleotid wurde in einem 200:1-Verhältnis von
Insertion:Plasmidvektor an pBGS131 ligiert, das durch XhoI-Verdau
und CIAP- Behandlung
hergestellt wurde. Das resultierende Plasmid wird pBGS131 dlXhoI
genannt. Die Wachstumsraten von XL1-Blue (Stratagene), das mit den
pBGS131- oder pBGS131
dlXhoI-Plasmiden in LB-Medium, enthaltend 20 μg/ml Kanamycin, transformiert
wurde, war über
einen Zeitraum zwischen 1,5 und 8 Stunden nicht unterscheidbar.
-
Das
Rinder-Wachstumshormon (BGH)-Transkriptions-Terminierungs-/Polyadenylierungssignal
wurde zwischen die SacI- und EcoRI-Stellen von pBGS131 dlXhoI inseriert.
Die BGH-Transkriptions-Terminierungssequenzen wurden durch PCR-Amplifizierung
unter Verwendung des unten gezeigten Primerpaars und des pCDNA3-Plasmids
(Invitrogen, San Diego, Ka.) als Matrize isoliert.
-
-
Die
oben gezeigten Primer wurden in einer PCR-Reaktion mit einem drei-Temperatur-Zyklusprogramm
unter Verwendung einer 30 Sek.-Extensionsdauer verwendet. Das amplifizierte
58 bp-Produkt wurde mit dem PCR-Reinigungskit (Qiagen, Chatsworth,
Ka.) gereinigt, mit SacI und EcoRI verdaut, mit GENECLEAN II gereinigt
und in SacI/EcoRI-verdautes, CIAP-behandeltes pBGS131 ligiert. Das
Plasmid ist als pBGS131 dlXhoI-BGHTT bekannt.
-
Das
3-Ende des Sindbis-Virus-abgeleiteten Plasmid-DNA-Expressionsvektors
wurde dann in das pBGS131 dlXhoI-BGHTT-Konstrukt inseriert. Diese
Region des Vektors enthält
die folgenden geordneten Elemente: die nicht translatierte Sindbis-Virus-3'-End-Region (3'-NTR); eine 40-mer
poly(A)-Sequenz; das antigenomische Hepatitis Delta-Virus (HDV)-Ribozym;
und eine SacI-Erkennungssequenz. Die Konstruktion dieser geordneten
Elemente wurde durch geschachtelte PCR unter Verwendung der unten
gezeigten Primer und des pKSSIN-1-BV-Plasmids (Beispiel 4) als Matrize
erreicht.
-
-
Die
oben gezeigten Primer wurden in einer PCR-Amplifizierung gemäß den Reaktionsbedingungen und
dem drei-Temperatur-Zyklussystem, das im Beispiel 4 beschrieben
ist, mit einer Extensionszeit von 30 Sek. verwendet. Das amplifizierte
422 bp-Produkt wurde mit einem PCR-Reinigungskit (Qiagen, Chatsworth, Ka.)
gereinigt, mit NotI und SacI verdaut, mit GENECLEAN II gereinigt
und in NotI/SacI-verdautes,
CIAP-behandeltes pKSSIN-1-BV ligiert. Dieses Konstrukt ist als pKSSIN-1BV/HDVRBZ bekannt
und enthält
Sindbis-Virus-abgeleitete Plasmid-DNA-Expressionsvektorsequenzen von der BglII-Stelle
bei Sindbis-nt. 2289, die sich durch das 3'-Ende des Vektors, einschließlich der
HDV-Ribozymsequenz, ausdehnen.
-
Das
Plasmid pKSSIN-1BV/HDVRBZ wurde dann mit BglII und SacI verdaut,
das 5815 bp-Fragment wurde durch 1% Agarose/TBE-Gelelektrophorese
isoliert, mit GENECLEAN II gereinigt und wurde in BglII/SacI-verdautes,
CIAP-behandeltes pBGS131 dlXhoI-BGHTT inseriert, um das Plasmidkonstrukt
herzustellen, das als pBG/SIN-1BglLF bekannt ist. Dieses Konstrukt
enthält
die Region des Sindbis-Virus-Expressionsvektors
vom oben beschriebenen Plasmid pKSSIN-1BV/HDVRBZ, wobei das 3'-Ende an die BHG-Transkriptions-Terminierungssequenz
auf dem pBGS131 dlXhoI-Plasmid fusioniert ist.
-
Der
Zusammenbau des Sindbis-Virus-Plasmid-DNA-Vektors wurde durch Insertion
des CMV-Promotors, nebeneinandergestellt mit den ersten 2289 nts.
des Sindbis-Virusgenoms (das das virale 5'-Ende und einen Teil der nsPs-Gene einschließt), in
das pBG/SIN-1BglLF-Plasmid vollendet. Unter Verwendung eines überlappenden
PCR-Ansatzes wurde der CMV-Promotor am viralen 5'-Ende positioniert, so dass die Transkriptionsinitiierung
in der Zugabe eines einzelnen, nicht-viralen Nucleotids am 5'-Ende der Sindbis-Virusvektor-Replikon-RNA
resultierte. Der CMV-Promotor wurde in einer ersten PCR-Reaktion
von pCDNA3 (Invitrogen, San Diego, Ka.) unter Verwendung des folgenden
Primerpaars amplifiziert:
-
Die
oben gezeigten Primer wurden in einer PCR-Reaktion gemäß den Reaktionsbedingungen
und dem drei-Temperatur-Zyklusprogramm, beschrieben in Beispiel
4, mit einer Extensionszeit von 1 min verwendet.
-
Das
SIN-1-5'-Ende wurde
in einer zweiten PCR-Reaktion vom pKSRSIN-1g-Clon (Beispiel 1) unter Verwendung des
folgenden Primerpaars amplifiziert:
-
Die
oben gezeigten Primer wurden in einer PCR-Reaktion mit einem drei-Temperatur-Zyklusprogramm
unter Verwendung einer 3 min-Extensionsdauer verwendet.
-
Die
amplifizierten 930 bp- und 3200 bp-Produkte wurden mit einem PCR-Reinigungskit (Qiagen)
gereinigt und zusammen in einer PCR-Reaktion mit dem folgenden Primerpaar
verwendet.
-
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Die
oben gezeigten Primer wurden in einer PCR-Reaktion mit einem drei-Temperatur-Zyklusprogramm
unter Verwendung einer 3,5 min-Extensionsdauer verwendet.
-
Die
26 3'-terminalen
Basen des amplifizierten ersten PCR-Produkts überlappen mit den 26 5'-terminalen Basen
des amplifizierten zweiten PCR-Produkts;
das resultierende, 3200 bp-überlappende,
amplifizierte sekundäre
PCR-Produkt wurde
durch 1% Agarose/TBE-Elektrophorese gereinigt, mit BglII verdaut
und in BglII-verdautes, CIAP-behandeltes pBG/SIN-1BglLF ligiert.
Dieses Konstrukt wird pBG/SIN-1 ELVS 1.5 genannt.
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Wie
im Beispiel 1 diskutiert, resultieren relativ wenige Nucleotid-Punktänderungen
in der nsP-Gensequenz des Wildtyp-Sindbis-Virus im Phänotyp, der
charakteristisch für
SIN-1 ist. Keine neuen Restriktionsenzym-Erkennungsstellen werden
als ein Ergebnis dieser Nucleotidänderungen hergestellt, was
es ermöglicht, Clone,
die vom Wildtyp stammen, und SIN-1-Genotypen leicht zu unterscheiden.
Ein PCR-basierter diagnostischer Test wurde daher als ein schnelles
Verfahren für
die Identifizierung von SIN-1-abgeleiteten Clonen entwickelt. Kurz,
Vorwärtsprimer
wurden gestaltet, so dass eine bestimmte Basenänderung zwischen SIN-1 und Wildtyp
an der 3'-terminalen
Base des Primers positioniert wurde. Ein Primer enthielt das SIN-1-Nucleotid, während ein
anderer das Wildtyp-Nucleotid enthielt. Ein Rückwärtsprimer in einer stromabwärts liegenden
Region, die zwischen beiden Genotypen konserviert war, wurde in
Kombination mit jedem Vorwärtsprimer
verwendet. Bei der korrekten Anlagerungstemperatur wurden die SIN-1-Matrizen
nur in Reaktionen amplifiziert, die SIN-1-Vorwärtsprimer enthielten. Die Primersequenzen,
die verwendet wurden, um zwischen Wildtyp- und SIN-1-Genotypen zu unterscheiden,
sind unten angegeben. Die Reaktionsbedingungen waren, wie es im
Verlauf der Beispiele, die hierin enthalten sind, beschrieben wird.
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Reporterprotein-Expressionsvektoren
wurden durch Inserieren der lacZ-, SEAP- oder Luciferase-Reportergene
in das pBG/SIN-1 ELVS 1.5-Vektorgerüst konstruiert. In getrennten
Reaktionen wurden die pKS-β-gal-,
pSK-SEAP- und pKS-luc-Plasmide
(Beispiel 4) mit XhoI und NotI verdaut. Die Fragmente, die die lacZ-,
SEAP- oder Luciferase-Gene enthielten, wurden durch 1% Agarose/TBE-Gelelektrophorese
isoliert und danach mit GENECLEAN II gereinigt. Diese Reportergene
wurden dann in getrennten Reaktionen mit XhoI/NotI-verdautem, CIAP-behandeltem
pBG/SIN-1 ELVS 1.5-Plasmid ligiert. Diese Konstrukte sind als pBG/SIN-1
ELVS 1.5-β-gal,
pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP und pBG/SIN-1-ELVS 1.5-luc bekannt.
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B. Expression von heterologen Proteinen
in Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP-, pBG/SIN-1 ELVS 1.5-luc- oder
pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal-Expressionsvektoren
transfiziert wurden
-
Das
Muster der sezernierten alkalischen Phosphatase-, Luciferase- und β-Galactosidase-Reportergenexpression
in BHK-Zellen, die mit den pBG/SIN-1 ELVS 1.5- oder pBG/wt ELVS
1.5-Vektoren transfiziert wurden, wurde verglichen. Das pBG/wt ELVS
1.5-Plasmid enthält
Sequenzen, die vielmehr vom Wildtyp-Sindbis-Virus stammen als von der SIN-1-Variante.
Die Konstruktion der pBG/wt ELVS 1.5-Expressionsvektoren war genau, wie hierin
für die
pBG/SIN-1 ELVS 1.5-Expressionsvektoren
beschrieben, mit der Ausnahme, dass genomische Volllängen-cDNA, die vom Wildtyp-Sindbis-Virus
stammt (Dubensky et al.,
WO
95/07994 ), als die Matrize für die Vektorkonstruktion verwendet
wurde. Die Konstruktion des pBG/wt ELVS 1.5-Expressionsvektors ist
früher
beschrieben worden (Dubensky, vorstehend); daher sind, obwohl die
Stämme
und daher die Sequenzen verschieden sind, die Sindbis-Virus-spezifischen
Regionen, die in den pBG/wt ELVS 1.5- und pBG/SIN-1 ELVS 1.5-Expressionsvektoren
enthalten sind, dieselben.
-
Babyhamster-Nieren-21
(BHK-21)-Zellen, die in 12 mm-Schalen bei einer Konfluenz von 75%
gehalten wurden, wurden mit 1,0 μg
pBG/SIN-1 ELVS 1.5- oder pBG/wt ELVS 1.5-Expressionsvektor-Plasmid-DNAs transfiziert,
die mit 4,0 μl
eines kommerziell erhältlichen
Lipids (Lipofectamin, GIBCO-BRL) einen Komplex bildeten. Ansonsten
waren die Transfektionsbedingungen, wie durch den Lipid-Hersteller
vorgeschlagen. Minimales essenzielles Eagle-Medium, angereichert
mit 5% fötalen
Rinderseren, wurde 4 Stunden nach der Transfektion (hpt) zu den
Zellen zugefügt,
außer
wenn es anderweitig angezeigt ist. Die transfizierten Zellen wurden bei
37°C inkubiert.
Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transfektion wurden, wie unten
angezeigt, einige Tests durchgeführt,
um die Vektor-spezifische RNA-Synthese und die Expression der sezernierten
alkalischen Phosphatase-, Luciferase- oder β-Galactosidase-Reportergene in Zellen,
die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5- oder pBG/wt ELVS 1.5-Plasmid-DNAs transfiziert
wurden, zu vergleichen.
-
Die
Spiegel der alkalischen Phosphatase, die in das Kulturmedium von
BHK-Zellen sezerniert
wurden, die mit pBG/SIN-1 ELVS-1 1.5-SEAP- oder pBG/wt ELVS 1.5-SEAP-Plasmid-DNA
transfiziert wurden, wurden verglichen. Das Zellkultur-Medium wurde auf
das Vorliegen der alkalischen Phosphatase mit dem chemilumineszierenden
Phospha-Light
TM Reportergen-Test gemäß den Anweisungen
des Herstellers (Tropix, Inc., Redford, MA) getestet. Kurz, 10 μl des Zellkultur-Überstands
wurden mit 30 μl
Verdünnungpuffer
gemischt und für 30
Minuten bei 65°C
inkubiert. Die Probe wurde vor dem Mischen mit 40 μl Testpuffer
auf Zimmertemperatur abkühlen
gelassen. Die Probe wurde für
fünf Minuten
bei Zimmertemperatur inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 40 μl Reaktionspuffer.
Die Proben wurden für
20 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Gesamtluminiszenz
wurde auf einem ML3000-Mikrotiterplatten-Luminometer (Dynatech,
Inc., Chantilly, VA) in Zyklus-Betrieb gemessen; und die alkalische
Phosphatase (AP) im Kulturmedium von BHK-Zellen, die mit pBG/SIN-1
ELVS-1 1.5-SEAP-
oder pBG/wt ELVS 1.5-SEAP-Plasmid-DNAs transfiziert wurden, wurde
bei 48 hpt bestimmt, und die Ergebnisse sind in der Tabelle unten
gezeigt.
Transfiziertes
Plasmid | RLU,
48 hpt |
pBG/SIN-1
ELVS 1.5SEAP | 18 ± 1.7 |
pBG/wt
ELVS 1.5-SEAP | 94 ± 10.7 |
pCDNA3 | 0.13 ± 0.04 |
-
Zusätzlich wurden
die Spiegel der Vektor-spezifischen RNAs, die in BHK-21-Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS
1.5-SEAP- oder pBG/wt ELVS 1.5-SEAP-Plasmiden transfiziert wurden,
synthetisiert wurden, 48 Stunden nach der Transfektion durch Northern-Blot-Analyse
bestimmt, genau wie früher
beschrieben (Dubensky, vorstehend). Die Ergebnisse dieses Experiments
sind in 9A gezeigt. Die zelluläre Gesamt-RNA
wurde von transfizierten BHK-Zellen mit Tri-Reagent isoliert, wie
vom Hersteller (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH)
beschrieben.
-
Die
zellulären
Gesamt-RNA-Konzentrationen, die in Proben von transfizierten BHK-Zellen vorhanden waren,
wurden spektrophotometrisch bestimmt. Zusätzlich wurde durch Elektrophorese
von 0,5 μg
zellulärer Gesamt-RNA
auf 0,7% Agarose/TBE-Minigelen,
die mit 10 μl/ml
Ethidiumbromid gefärbt
wurden, bestimmt, dass Material, das von transfizierten Zellen isoliert
wurde, intakt war. Eine Northern-Blot-Analyse wurde gemäß Sambrook
und Maniatis (1989, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laborstory, Cold
Spring Harbor, N. Y.) durchgeführt. Damit
RNA von allen transfizierten Proben auf einem Autoradiogramm von
einer einzelnen Northern-Blot-Analyse beobachtet werden konnte,
wurden 2,5 μg
und 30 μg
RNA pro Spur von pBG/wt ELVS 1.5-SEAP-
beziehungsweise pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP-transfizierten Zellen aufgetragen.
Vier Proben der RNA von den individuellen Transfektionen mit beiden
getesteten Plasmiden wurden durch 0,7% Formaldehyd-Agarosegele einer
Elektrophorese unterzogen und auf eine Zeta-probe Membran (Bio-Rad,
Richmond, Ka.) transferiert. Der Blot wurde mit zufällig geprimten
Sonden, die dem alkalischen Phosphatase-Gen entsprachen, hybridisiert. Die
Ergebnisse dieses Experiments, in dem die Spiegel der Vektor-spezifischen
RNA-Synthese und der AP-Expression in transfizierten BHK-Zellen
bei 48 hpt verglichen wurden, zeigen, dass, während der Spiegel der Vektor-spezifischen
RNA, die in Zellen synthetisiert wurde, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP-DNA
transfiziert wurden, mindestens 100-fach niedriger war als in pBG/wt
ELVS 1.5-SEAP-transfizierten Zellen, die Spiegel von AP in Zellen,
die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP-DNA im Vergleich zu pBG/wt ELVS
1.5-SEAP-DNA transfiziert
wurden, nur fünffach
niedriger waren.
-
Die
Spiegel der alkalischen Phosphatase, die in das Kulturmedium von
BHK-Zellen, die
mit pBG/SIN-1 ELVS-1 1.5-SEAP- oder pBG/wt ELVS 1.5-SEAP-Plasmid-DNA transfiziert
wurden, sezerniert wurden, wurden auch über einen 7 Tage-Zeitablauf verglichen.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung, die in 9B illustriert sind,
zeigen, dass die Spiegel von AP, die im Kulturmedium zu den frühen Zeitpunkten
vorhanden waren, in Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS-1 1.5-SEAP-Plasmid im Vergleich
zum pBG/wt ELVS 1.5-SEAP-Plasmid transfiziert wurden, viel niedriger
waren. Dennoch stieg der Spiegel der AP, der in Zellen, die mit
den von dem varianten SIN-1-Sindbis-Virus-Stamm abgeleiteten Vektoren
transfiziert wurden, exprimiert wurde, schnell und war zum 96 hpt-Zeitpunkt
höher als
in Zellen, die mit Wildtyp-Virus-abgeleiteten Vektoren transfiziert
wurden.
-
Die
Luciferase-Spiegel, die in BHK-Zellen vorhanden waren, die mit pBG/SIN-1 ELVS-1 1.5-luc-
oder pBG/wt ELVS 1.5-luc-Plasmid-DNA transfiziert wurden, wurden
bei 24, 48 und 72 hpt verglichen. Die Luciferase-Expressionsspiegel
wurden durch Zugeben von 250 μl
Reporter-Lysepuffer (Promega, Madison, WI) pro 106 transfizierte
Zellen, Zentrifugieren des Lysats bei 14000 UpM für 1 min
und dann Mischen der Überstandsfraktion
von den Zelllysaten mit einem kommerziell erhältlichen Substrat-Nachweissystem
(Promega, Madison, WI), gefolgt von Luminometrie (Analytical Luminescence
Laboratory, San Diego, Ka.) quantifiziert.
-
Die
Ergebnisse dieses Experiments (gezeigt in der Tabelle unten), in
10 graphisch dargestellt, laufen parallel zu den
Ergebnissen, die mit den alkalische Phosphatase-Expressionsvektoren
beobachtet wurden. Zu frühen
Zeitpunkten nach der Transfektion waren die Luciferase-Expressionsspiegel
niedriger in BHK-Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-luc-Plasmid
im Vergleich zum pBG/wt ELVS 1.5-luc-Plasmid transfiziert wurden. Dennoch
waren die Luciferase-Spiegel bei den 48 und 72 hpt-Zeitpunkten ähnlich in
BHK-Zellen, die mit den von dem varianten Sindbis-Virus-SIN-1-Stamm
und vom Wildtyp abgeleiteten Expressionsvektoren transfiziert wurden.
Transfiziertes
Plasmid | H
nach der Transfektion | Relative
Lichteinheiten (Mittelw. ±SA) |
pBG/SIN-1
ELVS 1.5-luc | 24 | 1.2 × 109 |
pBG/wt
ELVS 1.5-luc | | 2.1 × 108 |
pBG/SIN-1
ELVS 1.5-luc | 48 | 3.3 × 109 |
pBG/wt
ELVS 1.5-luc | | 4.1 × 109 |
pBG/SIN-1
ELVS 1.5-luc | 72 | 1.8 × 109 |
pBG/wt
ELVS 1.5-luc | | 5.8 × 109 |
pCDNA3 | 48 | 482 |
-
Die
Wirksamkeit der Transfektion der pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal- und
pBG/wt ELVS 1.5-β-gal-Plasmide
in BHK-Zellen bei 48 hpt wurde durch direkte X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-b-D-galactopyranosid)-Färbung der
Zelleinzelschicht bestimmt (MacGregor, Cell Mol. Genet. 13: 253-265,
1987), um die Zahl der Zellen, die β-Galactosidase exprimieren, direkt zu
messen. Die Transfektionswirksamkeiten waren äquivalent und sind in der Tabelle
unten gezeigt.
Transfiziertes
Plasmid | Zahl
blauer Zellen/100X Feld |
pBG/SIN-1
ELVS 1.5-β-gal | 24 ± 3 |
pBG/wt
ELVS 1.5-β-gal | 26 ± 7 |
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Die
Spiegel der Vektor-spezifischen RNAs, die in BHK-21-Zellen, die
mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal- oder
pBG/wt ELVS 1.5-β-gal-Plasmiden
transfiziert wurden, synthetisiert wurden, wurden 48 und 72 Stunden nach
der Transfektion durch Northern-Blot-Analyse bestimmt, genau wie
früher
beschrieben (Dubensky, vorstehend). Die zelluläre Gesamt-RNA wurde von transfizierten
BHK-Zellen mit Tri-Reagent
isoliert, wie vom Hersteller (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati,
OH) beschrieben. Die zellulären
Gesamt-RNA-Konzentrationen, die in den Proben von BHK-Zellen vorhanden
waren, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal- oder pBG/wt ELVS 1.5-β-gal-Plasmiden
transfiziert wurden, wurden spektrophotometrisch bestimmt. Zusätzlich wurde
durch Elektrophorese von 0,5 μg
zellulärer
Gesamt-RNA auf 0,7% Agarose/TBE-Minigelen, die mit 10 μl/ml Ethidiumbromid
gefärbt
wurden, bestimmt, dass Material, das von transfizierten Zellen isoliert
wurde, intakt war. Eine Northern-Blot-Analyse wurde gemäß Sambrook
und Maniatis (1989, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laborstory, Cold
Spring Harbor, N. Y.) durchgeführt.
Damit RNA von allen transfizierten Proben auf einem Autoradiogramm
von einer einzelnen Northern-Blot-Analyse
visualisiert werden konnte, wurden 2,5 μg und 5 μg RNA von pBG/wt ELVS 1.5-β-gal- beziehungsweise
pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal-transfizierten
Zellen pro Spur aufgetragen. Zwei Proben der RNA von individuellen
Transfektionen mit beiden bei 48 und 72 hpt getesteten Plasmiden
wurden auf 0,7% Formaldehyd-Agarosegelen
einer Elektrophorese unterzogen und auf eine Zeta-probe-Membran
(Bio-Rad, Richmond, Ka.) transferiert. Der Blot wurde mit zufällig geprimten
Sonden, die dem β-Galactosidase-Gen
entsprachen, hybridisiert. Die Ergebnisse dieses Experiments, gezeigt
in 11A, zeigen, dass der Spiegel der
Vektor-spezifischen RNA, der in Zellen synthetisiert wurde, die
mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal-DNA
transfiziert wurden, 48 und 72 Stunden nach der Transfektion mindestens
100-fach niedriger war als der Spiegel der RNA, der in pBG/wt ELVS
1.5-β-gal-transfizierten
Zellen nachgewiesen wurde.
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Zusätzlich wurden
die β-Galactosidase-Expressionsspiegel
in transfizierten Ganzzell-Lysaten durch Zugeben von 250 μl Reporter-Lysepuffer
(Promega, Madison, WI) pro 10
6 transfizierte
Zellen, Zentrifugieren des Lysats bei 14000 UpM für 1 min
und dann Mischen der Überstandsfraktion
von den Zelllysaten mit einem kommerziell erhältlichen Substrat-Nachweissystem
(Clontech, Palo Alto, Ka.), gefolgt von Luminometrie (Analytical
Luminescence Laborstory, San Diego, Ka.), quantifiziert. Die Ergebnisse
dieses Experiments (gezeigt in der Tabelle unten und graphisch in
19C) zeigen, das die β-Galactosidase-Expressionsspiegel
zu frühen Zeitpunkten
nach der Transfektion signifikant niedriger in BHK-Zellen, die mit
pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal-Plasmid
transfiziert wurden, im Vergleich zum pBG/wt ELVS 1.5-β-gal-Plasmid
waren. Dennoch stieg die Reporterexpression im Zeitablauf schnell
in pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal-transfizierten
Zellen, so dass die β-Galactosidase-Spiegel
zum 120 h-Endzeitpunkt höher
waren als in Wildtyp-Virus-transfizierten
Zellen.
Transfiziertes
Plasmid | H
nach der Transfektion | Relative
Lichteinheiten (Mittelw. ±SA) |
pBG/SIN-1
ELVS 1.5-β-gal | 24 | 54030 ± 7348 |
pBG/wt
ELVS 1.5-β-gal | | 4801590 ± 74,425 |
pBG/SIN-1
ELVS 1.5-β-gal | 48 | 310830 ± 31083 |
pBG/wt
ELVS 1.5-β-gal | | 2214921 ± 248071 |
pBG/SIN-1
ELVS 1.5-β-gal | 72 | 1443474 ± 98156 |
pBG/wt
ELVS 1.5-β-gal | | 3793524 ± 857336 |
pBG/SIN-1
ELVS 1.5-β-gal | 96 | 2232585 ± 299166 |
pBG/wt
ELVS 1.5-β-gal | | 3514262 ± 548225 |
pBG/SIN-1
ELVS 1.5-β-gal | 120 | 3200910 ± 128036 |
pBG/wt
ELVS 1.5-β-gal | | 1986537 ± 166869 |
pCDNA3 | | 3637 |
-
Die
Expression der β-Galactosidase
in Zellen, die mit den pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal- oder pBG/wt ELVS 1.5-β-gal-Plasmid-DNAs
transfiziert wurden, wurde zum 120 hpt-Endzeitpunkt auch direkt
durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, der
spezifisch für
das Reporterprotein ist (Boehringer Mannheim), gemessen. Parallel
mit der Reporterprotein-Aktivität,
die 120 hpt bestimmt wurde, war der Spiegel des β-Galactosidase-Proteins in BG/SIN-1
ELVS 1.5-β-gal-transfizierten
BHK-Zellen im Vergleich zu pBG/wt ELVS 1.5-β-gal im selben Bereich oder
höher und
ist in 11C gezeigt.
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Zusammengefasst
zeigen die hierin beschriebenen Ergebnisse, dass der Spiegel von
Vektor-spezifischer, synthetisierter RNA in pBG/SIN-1 ELVS-transfizierten Zellen
mindestens 100-fach niedriger ist im Vergleich zu pBG/wt ELVS-transfizierten Zellen.
Wichtig ist jedoch, dass die Spiegel der Reportergen-Expression nach einer
48-72 Stunden-Verzögerung
in pBG/SIN-1 ELVS-transfizierten
Zellen äquivalent
oder höher
sind im Vergleich zu pBG/wt ELVS-transfizierten
Zellen. Der Phänotyp
von pBG/SIN-1 ELVS, charakterisiert durch hohe Expressionsspiegel
in Kombination mit niedriger Vektor-spezifischer RNA-Synthese in
transfizierten Zellen, liegt wahrscheinlich aufgrund einer verminderten
oder fehlenden Inhibition der Wirtszell-Proteinssynthese vor. Diese
Eigenschaft von pBG/SIN-1 ELVS resultiert daher in viel höheren Spiegeln
des exprimierten Reporterproteins pro subgenomischer mRNA-Translationsmatrize
in transfizierten Zellen im Vergleich zu pBG/wt ELVS. Zusammengefasst
folgt der Phänotyp
der Plasmid-DNA-Expressionsvektoren, die von den varianten SIN-1-Stämmen abgeleitet
sind, in Vergleich zu Wildtyp-Virus-abgeleiteten Vektoren dem Elternvirus
in Bezug auf äquivalente
Expressionsspiegel, kombiniert mit relativ niedrigen Spiegeln der
RNA-Synthese. Da Vektoren keines der Sindbis-Virus-Strukturproteine
enthalten, muss dieser Phänotyp
auf die Nichtstrukturgene der SIN-1-Virusvariante kartieren.
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BEISPIEL 5
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MODIFIZIERUNGEN VON PLASMID-DNA-SIN-1-ABGELEITETEN
EXPRESSIONSVEKTOREN
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Die
Expressionsspiegel der heterologen Gene in Zielzellen von Alphavirus-basierten Vektoren
werden durch einige Faktoren beeinflusst, einschließlich der
Wirtsgattung und der Vektorkonfiguration. Zum Beispiel sind die β-Galactosidase-Expressionsspiegel
in BHK-Zellen 10- bis 100-fach höher
im Vergleich zu manchen menschlichen Zellen wie HT1080, die mit
pBG/ELVS-Vektoren transfiziert sind. Die Spiegel der Reportergen-Expression
in BHK- und einigen menschlichen Zelllinien, die mit pBG/wt ELVS
1.5-βgal-Plasmid-DNA transfiziert
sind (siehe Beispiel 4), wurden verglichen, um den relativen Spiegel
der Vektor-spezifischen Expression in Zelltypen, die von der beabsichtigten
in vivo-Zielgattung stammen, zu etablieren. Die Spiegel der β-Galactosidase-Expression
in BHK-Zellen und HT1080 (ATCC CCL 121)-Zellen, einer menschlichen
Fibrosarkom-Linie, transfiziert mit dem pBG/wt ELVS 1.5-βgal-Plasmid
oder mit einem konventionellen Plasmid-Expressionsvektor, wurden
bestimmt. Der konventionelle Plasmidvektor wurde durch Insertion
des lacZ-Gens (Promega,
Madison, WI) in die mehrfache Clonierungsstelle des CMV-Promotor-gelenkten
pUC-abgeleiteten Expressionsplasmids (Invitrogen, San Diego, Ka.)
konstruiert und ist als pCMV-β-gal
bekannt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung, angegeben in 12A, zeigen, dass der Spiegel der β-Galactosidase-Expression
in HT1080-Zellen, die mit der pBG/wt ELVS 1.5-βgal-Plasmid-DNA transfiziert wurden, im
Vergleich zu BHK-Zellen beinahe 100-fach niedriger war. Die Zellen
wurden auch mit pCMV-β-gal
transfiziert, um die RNA-Polymerase
II-Expression von der Sindbis-Virusvektor-Replikonexpression zu
trennen. Während
die Expression in HT1080-Zellen, transfiziert mit pCMV-β-gal-Plasmid, im Vergleich
zu BHK-Zellen 5- bis 10-fach abnahm, sank in diesem Experiment die
Expression in HT 1080-Zellen, die mit der pBG/wt ELVS 1.5-βgal-Plasmid-DNA transfiziert
wurden, beinahe 100-fach. Daher weisen die Ergebnisse darauf hin,
dass das dramatische Absinken der Reportergen-Expression in HT1080-Zellen, die mit pBG/wt
ELVS 1.5-βgal-Plasmid-DNA
transfiziert wurden, zum Teil aufgrund der verminderten Aktivität des Sindbis-Virusvektor-Replikons
in diesen menschlichen Zellen vorliegt.
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In
Anbetracht der Gesamtplastizität
des alphaviralen RNA-Genoms und der Vermehrung des Virus in BHK-Zellen
ist es nicht überraschend,
dass die Expressionsspiegel der heterologen Gene in den Wirtszelllinien,
von denen die Vektoren abgeleitet wurden, am höchsten sind. Daher kann die
Selektion von Alphaviren mit dem SIN-1-Phänotyp (wie in den Beispielen
1 und 2 beschrieben), der durch vergleichbar niedrige virale RNA-Spiegel
und äquivalente
Virus-Produktionsspiegel,
kombiniert mit einer verzögerten
oder fehlenden Inhibition der Wirtszell-Proteinsynthese charakterisiert
ist, in allen menschlichen primären
oder diploiden oder polyploiden menschlichen Zellen durchgeführt werden.
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Zusätzlich zum
Selektieren von Alphaviren mit erwünschten Phänotypen in Zellen (z. B. menschlich), die
in vivo mehr vergleichbar mit Zielzellen sind, können auch einige alternative
Modifikationen der Prototyp-Plasmid-DNA-Expressionskassetten-Komponenten durchgeführt werden.
Zum Beispiel verstärkt
die Substitution des MoMLV-RNA-Polymerase II-Promotors mit dem stärkeren sehr
frühen
(IE) CMV-Promotor signifikant den Spiegel der heterologen Genexpression
in transfizierten Zellen (Dubensky et al., J. Virol. 70: 508-519, 1996,
und Dubensky et al.,
WO 95/07994 ).
Weiterhin kann die Nebeneinanderstellung von Introns, zum Beispiel
des kleinen SV40-t-Antigens oder von CMV-Intron A, entweder stromaufwärts oder
stromabwärts
vom heterologen Gen den Spiegel der heterologen Genexpression in
einigen transfizierten Zelltypen steigern (Dubensky et al., vorstehend).
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Einige
weitere alternative Modifikationen der Prototyp-Plasmid-DNA-Expressionskassetten-Komponenten
können
auch angewendet werden, um die Gesamtexpression in transfizierten
Zellen in vitro oder in vivo zu verstärken. In einer Modifikation
wurde das post-transkriptionelle Hepatitis B-Virus (HBV)-regulatorische Element
(PRE) in die pBG/wt ELVS 1.5-βgal-Plasmid-DNA
inseriert. Die PRE-Sequenz
aktiviert den Transport der HBV-S-Transkripte in cis vom Nukleus
zum Cytoplasma. Die PRE-Sequenz scheint unabhängig von Spleiß-Donor-
und Akzeptorstellen zu wirken, und es ist gezeigt worden, dass sie
die cytoplasmatische Expression eines β-Globin-Transkripts, das keine
Introns enthält,
aktiviert. Es ist vorgeschlagen worden, dass die PRE in cis wirkt,
um den Export von nukleären
Transkripten zu erlauben, die nicht wirksam mit dem Spleißweg interagieren
und daher nicht gut aus dem Nukleus exportiert werden (Huang et
al., Molecular and Cellular Biology 15: 3864-3869, 1995).
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Die
PRE-Sequenz wurde durch zuerst Isolieren eines PCR-hergestellten
564 bp-Fragments von HBV vom genomischen Volllängen-Clou des ADW-Virusstamms
pAM6 (ATCC Nr. 39630) in pBG/SIN-1 ELVS 1.5-βgal cloniert. Das amplifizierte Fragment
erstreckt sich von Base 1238-1802 des HBV-Genoms. Die Primersequenzen
sind unten angegeben.
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-
Die
Primer bringen eine NotI-Erkennungsstelle am 5'-Ende des Fragments und eine EaeI-Erkennungsstelle
am 3'-Ende ein.
NotI und EaeI haben kompatible klebende Enden. Die EaeI-Erkennungsstelle
liegt intern zur NotI-Stelle, daher schneidet EaeI beide Stellen.
-
Das
PCR-Fragment wurde mit EaeI verdaut und in NotI-verdautes/CIAP-behandeltes pBG/wt
ELVS 1.5-βgal
cloniert. Der korrekte Clon bewahrt die NotI-Stelle am 5'-Terminus der PRE und wird pBG/wt ELVS/PRE
1.5-βgal
bezeichnet.
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Die
mögliche
Wirkung der PRE-Sequenz, die in den ELVS-Plasmiden enthalten ist,
auf eine heterologe Genexpression in transfizierten Zellen wurde
bestimmt. Kurz, BHK- und HT1080-Zellen wurden in 12 mm-Schalen zu
75% Konfluenz kultiviert und mit 500 ng pCMV-β-gal-, pBG/wt ELVS 1.5-βgal- oder
pBG/wt ELVS/PRE 1.5-βgal-Plasmid-DNA
im Komplex mit Lipofectamin (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) transfiziert, und
der Spiegel der β-Galactosidase-Expression
wurde 48 h später
bestimmt. Die Transfektionswirksamkeiten wurden durch direkte X-Gal-Färbung der
transfizierten Einzelzellschichten bestimmt, wie im Beispiel 4 beschrieben,
und sind in der Tabelle unten gezeigt.
| Zahl blauer
Zellen/12 mm-Schale |
Konstrukt | BHK | HT1080 |
pCMV-β-gal | 549 | 42 |
pBG/wt
ELVS 1.5-βgal | 146 | 1 |
pBG/wt
ELVS/PRE 1.5-βgal | 334 | 33 |
Schein | 0 | 0 |
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Die
Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Zahl der BHK- oder HT1080-Zellen,
die mit ELVS-Plasmiden, exprimierend β-Galactosidase, transfiziert
wurden, durch den Einschluss der RNA-Transport-PRE-Sequenz in den
Vektor dramatisch erhöht
wurde. Weiterhin weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass eine Ursache
für die verminderten
Expressionsspiegel heterologer Gene in HT1080-Zellen im Vergleich
zu BHK-Zellen, die mit ELVS-Plasmid-DNA transfiziert wurden, der
ineffiziente Transport des primären
Transkripts aus dem Nukleus ist.
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Parallel
mit der höheren
Frequenz der Reporterprotein-exprimierenden HT1080-Zellen, die mit
den ELVS-Plasmiden, enthaltend die PRE-Sequenz, transfiziert sind,
waren die Spiegel der β-Galactosidase
in Lysaten von HT1080-Zellen,
die mit ELVS-Vektoren, enthaltend die PRE-Sequenz, transfiziert
sind, dramatisch höher.
Diese Ergebnisse sind in 12B illustriert
und zeigen zusammengefasst mit den Ergebnissen, die oben in der
Tabelle gezeigt sind, dass funktionelle Vektor-Replikons in menschlichen
Zellen, die mit ELVS-Plasmiden transfiziert sind, ineffizient aus
dem Nukleus transportiert werden. Weiterhin erhöht der Einschluss der PRE-Sequenz
im ELVS-Plasmidkonstrukt den Spiegel der heterologen Genexpression
in allen getesteten Zellen, was eine deutliche Beziehung zwischen
der Wirksamkeit des cytoplasmatischen Vektor-Replikontransports
und dem Gesamt-Expressionsspiegel heterologer Gene zeigt.
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Einige
andere virale Sequenzelemente, die in cis wirken, um nicht-gespleißte RNA
zu transportieren, sind auch identifiziert worden. Zum Beispiel
ist gezeigt worden, dass eine 219 bp-Sequenz, die zwischen den nts.
8022 und 8240 nahe dem 3'-Ende
des Mason-Pfizer-Affenvirus (MPMV)-Genoms liegt, eine Rev-unabhängige menschliche
Immunschwächevirus
Typ 1 (HIV-1)-Replikation ermöglicht
(Brav et al., PNAS 91: 1256-1260, 1994). Das MPMV-RNA-Transportelement,
bekannt als das konstitutive Transportelement (CTE), wird zuerst
durch Isolieren eines PCR-erzeugten
219 bp-Fragments von MPSV von der genomischen Volllängen-Clon-Matrize (Sonigo et
al., Cell 45: 375-385, 1985) oder dem subgenomischen MPSV-Clon pGEM7FZ(–)MPSV 8007-8240
(D. Rekosh, Ham-Rek Laborstories, SUNY in Buffalo, 304 Foster Hall,
Buffalo, New York) in das pBG/SIN-1 ELVS 1.5-βgal-Plasmid inseriert. Das amplifizierte
Fragment erstreckt sich von Base 8022-8240 des MPSV-Genoms. Die
Primersequenzen sind unten angegeben.
-
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Die
Primer bringen eine NotI-Erkennungsstelle am 5'-Ende des Fragments und eine EaeI-Erkennungsstelle
am 3'-Ende ein.
NotI und EaeI haben kompatible klebende Enden. Die EaeI-Erkennungsstelle
liegt intern zur NotI-Stelle, daher schneidet EaeI beide Stellen.
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Das
PCR-Fragment wird mit EaeI verdaut und in NotI-verdautes/CIAP-behandeltes pBG/wt
ELVA 1.5-βgal
cloniert. Der korrekte Clon bewahrt die NotI-Stelle am 5'-Terminus der PRE und wird pBG/wt ELVS/CTE
1.5-βgal
genannt.
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Zusätzlich zu
den HBV-PRE- und MPSV-CTE-Sequenzen können einige RNA-Transportelemente
von anderen viralen oder zellulären
Quellen in die ELVS-Plasmidkonstrukte
inseriert werden, wie oben beschrieben. Zum Beispiel schließen einige
dieser Elemente das HIV-Rev-responsive Element (Malim et al., Nature, 338:
254-257, 1989), das HTLV 1-Rex-Element (Ahmed et al., Genes Dev.
4: 1014-1022, 1990)
und eine andere cis-wirkende Sequenz vom Affen-Retrovirus Typ 1
(Zolotukhin et al., J. Virol. 68: 7944-7952, 1994) ein. Zusätzlich kann
auch jedes der obigen RNA-Transportelemente in die Strukturprotein-Expressionskassetten, Verpackungszelllinien
oder Hersteller-Zelllinien, die in den Beispielen 6 und 7 beschrieben
sind, inkorporiert werden.
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In
noch einer anderen Modifikation der Prototyp-ELVS-Vektoren kann
die Expression der Alphavirus-Replikons von einem RNA-Polymerase
I-Promotor gelenkt werden. Kurz, weil die RNA-Polymerase I-Promotoren
nicht gewebespezifisch sind und im Wesentlichen in allen menschlichen
Zellen im Körper
exprimiert werden, liefern sie eine attraktive Alternative für eine Plasmid-DNA-gelenkte
Alphavirus-Replikon-Expression in
transfizierten Zellen. Zum Beispiel ist der menschliche rDNA-Promotor (Plasmid
prHU3, Learned und Tjian, J. Mol. Appl. Gen., 1: 575-584, 1982) verwendet
worden, um einen Vektor für
eine heterologe Genexpression zu konstruieren (Palmer et al., Nucl.
Acids Res. 21: 3451-3457, 1993).
-
Daher
kann in einer Ausführungsform
der Erfindung ein RNA-Polymerase I-Promotor nebeneinandergestellt mit dem
5'-Ende der Replikon-cDNA
sein, so dass das erste Nucleotid, das in transfizierten Zellen
transkribiert wird, dem authentischen Alphavirus-5'-Ende entspricht.
Die Identifizierung des RNA-Polymerase I-Promotor (z. B. Plasmid
prHU3)-Nucleotids, an dem die Transkriptionsinitiierung erfolgt,
wird bestimmt, wie früher
beschrieben (Dubensky et al.,
WO
95/07994 ).
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Alle
hierin beschriebenen Modifikationen können mit ELVS-Konstrukten,
enthaltend die Sindbis-Virus-Wildtyp- oder -SIN-1nsPs- oder -nsP-Gene
von jedem Alphavirus, durchgeführt
werden. Zum Beispiel können
auch alle der in Beispiel 5 bereitgestellten Konstruktionen mit
dem Plasmid pBG/SIN-1 ELVS 1.5-βgal, dessen
Konstruktion in Beispiel 4 beschrieben ist, durchgeführt werden.
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BEISPIEL 6
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KONSTRUKTION VON ALPHAVIRUS-VERPACKUNGSZELLLINIEN
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In
der vorliegenden Offenbarung werden Alphavirus-Verpackungszelllinien
(PCL) offenbart, wobei die Virus-abgeleiteten Strukturproteine,
die für
die RNA-Verpackung
und die Bildung von rekombinanten Alphavirus-Vektorpartikeln notwendig
sind, durch eine oder mehrere stabil transformierte Strukturprotein-Expressionskassetten
codiert werden. Die Synthese dieser Proteine erfolgt vorzugsweise
in einer induzierbaren Weise und in besonders bevorzugten Ausführungsformen
durch Transkription von subgenomischer mRNA von ihren natürlichen „Verbindungsregion"-Promotoren. Eine
induzierbare subgenomische Transkription wird durch die eingesetzte
Alphavirus-Vektor-RNA selbst vermittelt (
13).
Nach einer primären
Transkription der Strukturprotein-Expressionskassette(n) wird die cytoplasmatische
Amplifizierung des RNA-Transkripts
durch Vektor-codierte Nichtstrukturproteine initiiert und führt schlussendlich
zur Transkription des Verbindungsregion-Promotors und zu einer Strukturprotein-Expression
in hohem Spiegel. Die Strukturprotein-Expressionskassetten können jedes
der vorher beschriebenen Elemente der vorliegenden Erfindung einschließen, einschließlich der RNA-Transportelemente (z.
B. HBV-PRE und MPMV-CTE) und Spleißsequenzen. Solche PCL und
ihre stabil transformierten Strukturprotein-Expressionskassetten
können
unter Verwendung der Verfahren, die in der PCT-Anmeldung
WO 95/07994 beschrieben
sind, oder unter Verwendung neuer Ansätze, die hierin beschrieben
werden, abgeleitet werden. Die PCL können von beinahe jedem existierenden
Eltern-Zelltyp, einschließlich
sowohl Säuger-
als auch nicht-Säugerzellen,
abgeleitet werden. Bevorzugt für
das Ableiten von PCL sind Zelllinien von menschlichem Ursprung.
-
A. Konstruktion von Vektor-induzierbaren
Alphavirus-PCL
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Zum
Beispiel wurde eine Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassette
konstruiert, wobei die primäre
Transkription von einem sehr frühen
CMV-Promotor ein RNA-Molekül
produziert, das zu einer wirksamen cytoplasmatischen Amplifizierung
und Strukturprotein-Expression nur nach der Translation von nichtstrukturellen
Replikase-Proteinen von der Vektor-RNA in der Lage ist. Genau wurde
das Plasmid pDCMV-dlnsPSIN (Dubensky et al., J. Virol. 70: 508-519,
1996), ein DNA-basierter defekter Sindbis-Helfer (DH)-Vektor, modifiziert, um
sowohl eine antigenomische Hepatitis Delta-Virus (HDV)-Ribozym-Sequenz
(Perotta und Been, Nature 350: 434-436, 1991) für die 3'-End-RNA-Prozessierung als auch ein
kleines t-Antigen-Intron
von SV40, inseriert in die Region der Nichtstrukturprotein-Gendeletion, zu enthalten.
Aufgrund von Restriktionsstellen-Verdoppelungen, die mit der Insertion
der HDV-Ribozymsequenz assoziiert sind, wurde ein zusätzliches
Plasmid von Dubensky et al., (ebd.), pDLTRSINgHDV, als Ausgangsmaterial
verwendet, um das modifizierte CMV-basierte DH-Konstrukt zu rekonstruieren.
Das Plasmid pDLTRSINgHDV, ein LTR-basierter genomischer Sindbis-Clon,
enthaltend das HDV-Ribozym, wurde mit BglII verdaut, um den existierenden
LTR-Promotor und die Sindbis-Nucleotide 1-2289 (Nummerierung gemäß Strauss
et al., Virology 133: 92-110, 1984) zu entfernen, mit intestinaler
alkalischer Kälber-Phosphatase
behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN
IITM (Bio101, San Diego, Ka.) gereinigt.
Das entsprechende 5'-End-Fragment
mit einem CMV-Promotor wurde durch BglII-Verdau des genomischen
Sindbis-Clons pDCMVSINg (Dubensky et al., ebd.) und Reinigung von
einem 1% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II erhalten und
dann in den BglII-deletierten pDLTRSINgHDV-Vektor ligiert, um das
Konstrukt pDCMVSINgHDV herzustellen. Es wurde gezeigt, dass dieses
CMV-basierte genomische Plasmid mit einem HDV-Ribozym innerhalb von 24 h nach der
Transfektion in BHK-Zellen infektiöses Sindbis-Virus und eine cytopathische Wirkung
produziert. Das defekte Helferplasmid pDCMVdlnsPSINgHDV, enthaltend
das HDV-Ribozym, wurde dann durch BspEI-Verdau und Re-Ligierung unter verdünnten Bedingungen
konstruiert, um Nichtstrukturgen-Sequenzen zwischen den Nucleotiden
422 und 7054 zu entfernen. Danach wurde das SV40-Intron durch PCR
synthetisiert und in die Region der Nichtstrukturprotein-Gendeletion
inseriert. Die Amplifizierung der SV40-Intronsequenz wurde durch Standard-drei-Zyklus-PCR
mit einer 30 Sekunden-Extensionsdauer
unter Verwendung des Plasmids phBR322/SV40 (Stamm 776, ATCC #45019)
als Matrize und der folgenden Oligonucleotidprimer, die gestaltet wurden,
um flankierende BspEI- oder BamHI-Stellen zu enthalten, erreicht.
-
-
Nach
der Amplifikation wurde das DNA-Fragment unter Verwendung eines
QIAquickspin PCR-Reinigungskits (Qiagen, Chatsworth, Ka.) gereinigt,
mit BspEI und BamHI verdaut, von einem 1,2% Agarosegel unter Verwendung
von MermaidTM (Bio101, San Diego, Ka.) gereinigt
und in das defekte Helferplasmid pDCMV-dlnsPSIN ligiert, das auch
mit BspEI und BamHI verdaut, mit intestinaler alkalischer Kälber-Phosphatase behandelt
und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II
gereinigt wurde, um das Konstrukt pDCMV-intSINrbz herzustellen (14). Das Plasmid pDCMV-intSINrbz, das auch einen
selektierbaren, SV40-Promotor
gelenkten Neomycin-Resistenzmarker auf einem anderen Teil des Plasmids
enthält, wurde
unter Verwendung von LipofectamineTM (Gibco/BRL,
Gaithersburg, MD) in BHK-Zellen transfiziert, wie durch den Hersteller
beschrieben. Ungefähr
24 h nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert und in Medien,
enthaltend 600 μg/ml
0418 (Neomycin), re-plattiert. Die Medien wurden periodisch durch
frische G418-enthaltende Medien ausgetauscht, und Foci von resistenten
Zellen wurden wachsen gelassen. Die Zellen wurden trypsinisiert
und durch limitierende Verdünnung
in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle
Clone wurde gezüchtet
und für
das Screenen expandiert.
-
Eine
positive Verpackungsaktivität
für die
individuellen Clone wurde durch LipofectinTM (Gibco/BRL, Gaithersburg,
MD)-Transfektion mit Sindbis-Vektor-RNA, die ein Luciferase-Reportergen
exprimiert (beschrieben in Dubensky et al., ebd.), Ernten der Kulturüberstände ungefähr 24 h
nach der Transfektion und Testen auf das Vorliegen von verpackten
Sindbis-Luciferase-Vektorpartikeln identifiziert. Zusätzlich wurden
die anfänglichen
Transfektionsspiegel durch Ernten der transfizierten Zelllysate
unter Verwendung des Reporter-Lysepuffers (Promega, Madison, WI)
und Testen auf das Vorliegen einer Luciferase-Aktivität durch
Verwenden des Luciferin-Substrats (Promega), wie vom Hersteller
beschrieben, bestimmt. Um auf verpackte Vektorpartikel in den Kulturüberständen zu
testen, wurde 1 ml unverdünnter
geklärter Überstand
verwendet, um frische BHK-Zelleinzelschichten
für ungefähr 18 h
zu infizieren. Die Zellen wurden danach wie oben lysiert, und die Luciferase-Aktivität wurde
bestimmt. Das Vorliegen der Luciferase-Aktivität in den infizierten BHK-Zellen
war eine Bestätigung
von verpackten Vektorpartikeln in den transfizierten Zell-Überständen. Einige
positive Zellclone, die integrierte Kopien der pDCMV-intSINrbz-Strukturprotein-Expressionskassette
beherbergen und als PCL wirken, wurden identifiziert. Verpackungsdaten
für zwei
der individuellen PCL-Clone (#10s-19 und #10s-22), die repräsentativ
für die
Gruppe waren, sind in 15 gezeigt. Zusätzlich wurde
der Titer der verpackten Vektorpartikel, die produziert wurden,
durch Transfizieren eines individuellen PCL-Clons (#10s-22) mit SIN-β-gal-Vektor-RNA
(beschrieben in Dubensky et al., ebd.) bestimmt. Der Kulturüberstand
wurde 48 h nach der Transfektion gewonnen, durch Passage durch einen
0,45 mm-Filter geklärt,
und frische BHK-Einzelzellschichten wurden mit 10-fachen Verdünnungen
des Überstands
infiziert. Ungefähr
14 h nach der Infektion wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit
2% Formaldehyd fixiert, wieder mit PBS gewaschen und mit X-Gal gefärbt. Die
Vektorpartikel-Einheiten wurden dann durch Zählen der individuellen blaugefärbten Zellen
bestimmt. Die verpackten β-gal-Vektortiter
von diesem PCL-Clon
waren ungefähr
106 infektiöse Einheiten/ml Überstand. Eine
Vektor-kontrollierte Induzierbarkeit der Sindbis-Strukturprotein-Expression
wurde durch Western-Blot-Analyse
unter Verwendung eines polyclonalen Kaninchen-Antiserums, das spezifisch
für die
Strukturproteine ist, gezeigt. Positive 10s-22-PCL- und Negativkontroll-BHK-Zelllysate wurden
in Lameli-Probenpuffer entweder vor (U; nicht-induziert) oder nach
(I: induziert) der Transfektion mit der SIN-β-gal-Vektor-RNA erzeugt. Wie
in 16 gezeigt, war das einzige Zell-Lysat, das eine
Expression von Sindbis-Strukturproteinen zeigte,
der 10s-22-PCL-Clon nach Transfektion mit der Vektor-RNA. Unterschiede
in den ersichtlichen Spiegeln der Expression zwischen dem Capsidprotein
und den Hüll-Glycoproteinen
reflektieren nicht die tatsächlichen
Mengen des Proteins, die hergestellt werden, sondern vielmehr die
niedrigere Stabilität
der Hüll-Glycoproteine
während
des Zell-Lysevorgangs, der in diesem bestimmten Experiment verwendet
wurde.
-
Die
Verpackungsaktivität
des CMV-basierten DH-Konstrukts war in nicht-Säugerzellen,
zum Beispiel C6/36-Stechmückenzellen,
auch sehr wirksam. Die Verwendung eines solchen nicht-Säuger-Elternzelltyps
für das
Ableiten von PCL kann besonders vorteilhaft sein, wenn die PCL für eine folgende
Verwendung als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Vektor-Hersteller-Zelllinien
gedacht sind. Der Vorteil dieses Zelltyps ist die natürliche Fähigkeit
von Alphaviren, eine persistente Infektion ohne den Säugerzell-assoziierten
Phänotyp der
Inhibition der Wirts-Makromolekülsynthese
und die resultierende cytopathische Wirkung (CPE) zu etablieren.
Daher kann ein DNA-basierter Alphavirus-Vektor (Beispiele 4 und
5) mit einem geeigneten selektierbaren Marker stabil in Stechmücken- oder
andere nicht-Säugerzell-abgeleitete
PCL transformiert werden. 17A zeigt,
dass sowohl ein DNA-basierter Luciferase-Reportervektor als auch
DH-Helfervektor, die Sindbis-Strukturproteine
unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimieren, in C6/36-Zellen vollständig funktionell
waren, wie durch Luciferase-Vektor-Verpackung gezeigt.
-
B. Konstruktion von PCL mit einem funktionell
verknüpften
Selektionsmarker
-
In
anderen Aspekten dieser Offenbarung ist ein selektierbarer Marker
funktionell mit der Transkription der Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassette
verknüpft.
In bevorzugten Ausführungsformen
wird diese funktionelle Verknüpfung
entweder durch Insertion des Markers in die Region der Nichtstrukturprotein- Gendeletion als eine
Fusion mit den verbleibenden nsP1-Aminosäuren oder durch Insertion stromabwärts der
Strukturprotein-Gene unter der translationellen Kontrolle einer
internen ribosomalen Eintrittsstellen (IRES)-Sequenz erreicht. Wieder
wird die Amplifizierung des primären
Strukturprotein-Gen-mRNA-Transkripts und die Induktion der Strukturprotein-Expression
durch das eingesetzte Vektor-RNA-Molekül und seine synthetisierten Nichtstrukturproteine
gesteuert.
-
Genau
wurde für
die Konstruktion der Strukturprotein-Expressionskassette das Plasmid
pBGS131 (Spratt et al., Gene 41: 337-342, 1986; ATCC #37443) modifiziert,
um irrelevante Sequenzen zu entfernen und um eine vorhandene XhoI-Stelle im Kanamycin-Resistenzgen
nicht-funktionell zu machen. Das Plasmid pBGS131 wurde mit XhoI
verdaut, und ein synthetischer doppelsträngiger Oligonucleotid-Linker
mit XhoI-kompatiblen Enden wurde in die Stelle ligiert. Das synthetische
12-mer-Oligonucleotid, das unten gezeigt ist, wurde als ein teilweises
Palindrom gestaltet, das an sich selbst anlagern würde, was
klebende XhoI-Enden für
die Ligierung herstellt und den offenen Leserahmen des Kanamycin-Resistenzgens durch
Inserieren von vier Aminosäuren
im Leserahmen bewahrt.
-
-
Die
Insertion dieses Oligonucleotids resultierte in einem XhoI-Stelle-deletierten
Plasmid, bezeichnet als pBGS131dlXhoI. Das Plasmid wurde als Nächstes mit
BspHI verdaut und mit sich selbst unter verdünnten Bedingungen re-ligiert,
um 829 bp der irrelevanten Sequenz zwischen dem ColE1-Replikon und
dem Kanamycinresistenz-Marker
zu entfernen, was das Plasmid pBGS131dlB herstellte. Als Nächstes wurde
die BspHI-Stelle durch Verdauen von pBGS131dlB mit BspHI, Erzeugen
von stumpfen Enden mit dem Klenow-Enzym und dNTPs und Ligieren mit
einem Überschuss
an PacI-Linker in eine PacI-Stelle geändert.
-
-
Dieses
neue Konstrukt, bezeichnet als pBGS131dlB-P, wurde weiter durch
Verdauen mit FspI und PvuII, um zusätzliche 472 bp, einschließlich der
mehrfachen Clonierungsstelle (MCS), zu entfernen, und Reinigen des
verbleibenden Vektors von einem 1% Agarosegel unter Verwendung von
GENECLEAN II modifiziert. Eine Ersatz-MCS wurde in den modifizierten
Vektor durch Aneinanderlagern von zwei komplementären Oligonucleotiden,
PME.MCSI und PME.MCSII, und Ligieren mit dem linearen Plasmid inseriert.
-
-
Der
neue, ungefähr
2475 bp lange Clonierungsvektor wurde pBGSVG bezeichnet und enthielt
die folgende mehrfache Clonierungsstelle: <PmeI-BglII-XhoI-NotI-EcoRI-PmeI>. Die Insertion der Strukturprotein-Expressionskassette,
die einen funktionell verknüpften
selektierbaren Marker enthält,
wurde schrittweise fortgeführt,
wie folgt: Ein DNA-Fragment, umfassend das 3'-Ende von Sindbis-Virus, ein synthetischer
A40-Bereich, das antigenomische HDV-Ribozym
und ein BGH-Transkriptions-Terminierungssignal,
wurde durch Verdau mit NotI und EcoRI und Reinigung von einem 1%
Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II vom Plasmid pBG/SIN-1
ELVS 1.5 (Beispiel 5) entfernt. Das Plasmid pBGSVG wurde auch mit
NotI und EcoRI verdaut, von einem 1% Agarosegel unter Verwendung
von GENECLEAN gereinigt und mit dem gereinigten 3'-Ende/A40/HDV/BGH-Fragment
ligiert, um das Konstrukt pBGSV3' herzustellen.
Als Nächstes
wurde ein ungefähr 9250
bp-Sindbis-cDNA-Fragment, enthaltend die Strukturprotein-Gene und
einen großen
Teil der Nichtstrukturprotein-codierenden Region, von Plasmid pDLTRSINg
(Dubensky et al., ebd.) durch Verdau mit BglII und FspI entfernt
und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II
gereinigt. Das Sindbis-cDNA-Fragment
wurde dann in das Plasmid pBGSV3' ligiert,
das auch mit BglII und FspI verdaut, mit alkalischer Phosphatase
behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN
II gereinigt wurde. Das neue Konstrukt wurde pBGSV3'BF bezeichnet. In
der Folge wurde dieses Konstrukt für die Insertion des verbleibenden
5'-Endes und der
Nichtstrukturgen-Sequenzen zusammen mit einem CMV-IE-Promotor mit
BglII verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und mit GENECLEAN
II gereinigt. Die verbleibenden Sequenzen wurden durch Verdau des
Plasmids pDCMVSINg (Dubensky et al., ebd.) mit BglII, Reinigung
des Fragments von einem 1% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN
II und Ligierung mit dem linearen pBGSV3'BF-Vektor erhalten, um das CMV-gelenkte
genomische Sindbis-Konstrukt pBGSVCMVgen zu bilden. Die Funktionalität dieses
Konstrukts für
die Initiierung des Sindbis-Virus-Replikationszyklus wurde durch
Lipofectamin-vermittelte
Transfektion des pBGSVCMVgen-Plasmids in BHK-Zellen und die Beobachtung
eines CPE innerhalb von 24 h nach der Transfektion bestimmt.
-
Das
Plasmid pBGSVCMVgen wurde danach verwendet, um eine DH-Strukturprotein-Expressionskassette
durch Deletieren des Großteils
der Nichtstrukturprotein-Gensequenzen und Inserieren eines Neomycin-Resistenzgens
als eine Fusion im Leserahmen mit den verbleibenden Codons des offenen
nsP1-Leserahmens
zu konstruieren. Kurz, das Neomycin-Resistenzgen wurde durch Standard-drei-Zyklus-PCR
vom pcDNA3-Vektor (Invitrogen, San Diego, Ka.) unter Verwendung
der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet wurden,
um flankierende BspEI- und BamHI-Stellen zu enthalten.
-
-
Nach
der Amplifizierung wurde das DNA-Fragment mit QIAquick-spin gereinigt,
mit BspEI und BamHI verdaut, unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt
und in das Plasmid pBGSVCMVgen ligiert, das auch mit BspEI und BamHI
verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7%
Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden war.
Das resultierende Konstrukt wurde pBGSVCMVdlneo bezeichnet und ist
schematisch in 14 gezeigt. Die Konfiguration
von pBGSVCMVdlneo schließt
als Teil der Strukturprotein- Expressionskassette
und gesteuert durch denselben CMV-Promotor ein Fusionsprotein ein, umfassend
das Initiator-Methionin und die 121 aminoterminalen Aminosäuren von
nsP1 und das Neomycin-Resistenzgen, dem sein Methionin-Initiator-Codon und
die nächsten
zehn Aminosäuren
fehlen.
-
Das
Plasmid pBGSVCMVdlneo wurde unter Verwendung von Lipofectamin, wie
vom Hersteller beschrieben, in BHK-Zellen transfiziert. Ungefähr 24 h
nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert und in Medien,
enthaltend 600 μl/ml
des Wirkstoffs G418 (Neomycin), re-plattiert. Die Medien wurden
periodisch mit frischen G418-enhaltenden Medien ausgetauscht, und
Foci von resistenten Zellen wurde erlaubt, zu wachsen. Die Zellen
wurden trypsinisiert und durch limitierende Verdünnung in Gewebekulturschalen
mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle Zellclone wurden
gezüchtet
und für
ein Screenen expandiert. Eine positive Verpackungsaktivität für die individuellen
Clone wurde durch Transfizieren mit Sindbis-Luciferase-Vektor-RNA und
Testen auf das Vorliegen von verpackten Sindbis-Luciferase-Vektorpartikeln,
wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, identifiziert. Einige positive
Zellclone, die integrierte Kopien der pBGSVCMVdlneo-Strukturprotein-Genexpressionskassette
beherbergten und als PCL wirkten, wurden identifiziert. SNBSTM-Luciferase-Vektor-Verpackungsdaten für individuelle
Clone (F11, F13, F15), die repräsentativ
für die
Gruppe sind, sowie der vorher beschriebenen 10s-22-PCL-Linie sind
in 18 gezeigt.
-
Zusätzlich zum
Zeigen der funktionellen Verpackungsaktivität mit Sindbis-Luciferase-Vektoren
zeigten zusätzliche
Experimente, die unter Verwendung derselben PCL durchgeführt wurden,
auch, dass Vektoren, die von anderen Alphaviren stammten, auch verpackt
werden konnten. Zum Beispiel wurden sowohl Sindbis- (Dubensky et
al., ebd.) als auch Semliki Forest- (pSFV3-lacZ; GIBCO BRL, Gaithersburg,
MD) Vektor-RNAs, die β-Galactosidase
exprimieren, in die F15-Verpackungszelllinie
transfiziert. Ungefähr
48 h nach der Transfektion wurden die Kulturüberstände geerntet, geklärt, reihen-verdünnt und
verwendet, um frische BHK-Zelleinzelschichten
für die
Bestimmung der Vektorpartikel-Titer zu infizieren. 18 h nach der
Infektion wurden die BHK-Zellen fixiert, mit X-Gal gefärbt, und
die blaugefärbten
Zellen wurden gezählt,
wie früher
beschrieben. Die für
Sindbis-β-gal
erhaltenden Vektortiter waren ungefähr 5 × 106 IE/ml,
während
die Titer für
SFV-β-gal
ungefähr
4 × 106 IE/ml waren. Diese Daten zeigen, dass die
zwei verschiedenen Alphaviren und ihre entsprechenden Vektoren ähnliche
Verpackungssignale haben und dass PCL, die von den hierin beschriebenen
Sindbis-Systemen stammen, vollständig
funktionell sind, wenn sie mit einem anderen Alphavirus verwendet
werden.
-
Die
Verpackungsaktivität
des pBGSVCMVdlneo-Konstrukts war auch in Zellen von menschlichem
Ursprung, zum Beispiel in 293-Zellen, sehr wirksam. Die Verwendung
eines solchen menschlichen Elternzelltyps für die Ableitung von PCL kann
in der Herstellung von Komplement-resistenten rekombinanten Alphaviruspartikeln
besonders vorteilhaft sein. 17B zeigt,
dass sowohl RNA- als auch DNA-basierte Luciferase-Reportervektoren
nach einer Transfektion in G418-resistente,
pBGSVCMVdlneo-transformierte 293-PCL wirksam verpackt wurden, gezeigt
durch Überstandstransfer
der Luciferase-Expression in BHK-Zellen.
-
Es
ist auch gezeigt worden, dass ein weiterer selektierbarer Wirkstoff-Resistenzmarker in
einer ähnlichen
PCL-Konfiguration wie ein Fusionsprotein mit verbleibenden nsP1-Aminosäuren an
seinem N-Terminus wirkt. Kurz, das Hygromycinphosphotransferase-Gen
(Hygromycin-Resistenzmarker, hygror) wurde
anstelle des existierenden Neomycin-Resistenzmarkers in das Plasmid
pBGSVCMVdlneo substituiert. Das hygror-Gen wurde
durch Standard-drei-Zyklus-PCR
vom Plasmid p3'SS
(Stratagene, La Jolla, Ka.) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer
amplifiziert, die gestaltet wurden, um flankierende EcoRV- und BamHI-Stellen zu
enthalten.
-
-
Nach
der Amplifizierung wurde das DNA-Fragment mit QIAquick-spin gereinigt,
mit EcoRV und BamHI verdaut, unter Verwendung von GENECLEAN gereinigt
und in das Plasmid pBGSVCMVdlneo ligiert, das mit BspEI verdaut,
mit Klenow glattendig gemacht wurde, weiter mit BamHI verdaut, mit
alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel
unter Verwendung von Geneclean gereinigt worden war. Das resultierende
Konstrukt wurde pBGSVCMVdlhyg bezeichnet.
-
Das
Plasmid pBGSVCMVdlhyg wurde unter Verwendung von Lipofectamin, wie
vom Hersteller beschrieben, in BHK-Zellen transfiziert. Ungefähr 24 h
nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert und in Medien,
enthaltend 1,2 mg/ml des Wirkstoffs Hygromycin (Boehringer Mannheim),
re-plattiert. Die Medien wurden periodisch durch frisches Hygromycin-enthaltende
Medien ausgetauscht, und Foci von resistenten Zellen wurde erlaubt,
zu einem Pool zu wachsen. Die Funktionalität der selektierten Verpackungszellen
wurde durch Transfizieren mit Sindbis-Luciferase-Vektor-RNA und Testen auf
das Vorliegen von verpackten Sindbis-Luciferase-Vektorpartikeln, wie im vorherigen
Abschnitt beschrieben, gezeigt. Positive Ergebnisse von diesen Verpackungs-Experimenten
sind in 39 gezeigt.
-
In
einer alternativen Verpackungszelllinien-Strukturprotein-Expressionskassette
wurde der selektierbare Marker (in diesem Fall Neomycin-Resistenz) stromabwärts der
Sindbis-Strukturprotein-Gene und unter der translationellen Kontrolle
einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) inseriert. Daher
erfolgt die Transkription der mRNA, die die Neomycin-Resistenz codiert,
sowohl auf der genomischen Ebene (vom RSV-Promotor) als auch vom
subgenomischen Verbindungsregion-Promotor. Zusätzliche Eigenschaften, die
einmalig für
dieses Konstrukt sind, schließen
den Rous-Sarkom-Virus (RSV)-LTR-Promotor
für die
primäre
Transkription und eine tRNAAsp 5'-End-Sequenz, die
vom defekten-interferierenden Sindbis-RNA-Clon DI25 stammt (Monroe
und Schlesinger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3279-3283, 1983),
ein. Diese bestimmte PCL-Expressionskassetten-Konfiguration
wurde 987DHBBNeo bezeichnet und ist schematisch in 14 gezeigt. Genau wird das Plasmid 987DHBBNeo
schrittweise unter Verwendung des modifizierten Plasmidvektors pBGS131dlB-P
(oben beschrieben) als Ausgangsmaterial konstruiert. Ein cDNA-Fragment,
das den Verbindungsregion-Promotor, die Strukturprotein-Gensequenzen
und die nicht-translatierte
3'-Region + polyA
enthält,
wird durch Verdau des Volllängen-Sindbis-cDNA-Clons pRSINg
(Dubensky et al., ebd.) mit BamHI und XbaI und Reinigung von einem
0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II erhalten. Das
Sindbis-cDNA-DNA-Fragment wird mit dem Plasmidvektor pBGS131dlB-P
ligiert, der auch mit BamHI und XbaI verdaut, mit alkalischer Phosphatase
behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN
II gereinigt worden ist, um das Konstrukt pBGSINsp herzustellen.
-
Als
Nächstes
wird das Transkriptions-Terminierungssignal von der frühen SV40-Region
zwischen die SacI- und EcoRI-Stellen von pBGSINsp unmittelbar stromabwärts der
Sindbis-Sequenz inseriert. Die viralen SV40-Nucleotide 2643 bis
2563, enthaltend die Transkriptions-Terminierungssequenzen der frühen Region, werden
durch PCR-Amplifizierung unter Verwendung des unten gezeigten Primerpaars
und des pBR322/SV40-Plasmids (ATCC # 45019) als Matrize isoliert.
-
-
Die
Primer werden in einer Standard-drei-Zyklus-PCR-Reaktion mit einer
30 Sekunden-Extensionsdauer verwendet. Die Amplifizierungsprodukte
werden mit QIAquick-sein gereinigt, mit SacI und EcoRI verdaut,
wieder mit dem Mermaid-Kit gereinigt, und das 90 bp-Fragment wird
in das Plasmid pBGSINsp ligiert, das auch mit SacI und EcoRI verdaut,
mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter
Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden ist. Dieses Konstrukt
ist als pBGSINspSV bekannt.
-
Als
Nächstes
werden die RSV-Promotor- und Sindbis-5'-End-Sequenzen, einschließlich der DI-tRNAAsp-Struktur, durch überlappende PCR zusammengefügt, und
das gesamte Fragment wird in den Strukturprotein-Genvektor pBGSINspSV
inseriert. In der PCR Reaktion #1 wird das RSV-Promotor-Fragment durch
Standard-drei-Zyklus-PCR
mit 1 Minute Extension unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer
amplifiziert, die gestaltet sind, um auch eine flankierende BglII-Stelle in einem Primer
und Sequenzen, die das tRNA-5'-Ende überlappen,
im anderen zu enthalten. Das Sindbis-tRNA-5'-Ende ist unmittelbar angrenzend an
die RSV-Promotor-Transkriptions-Startstelle positioniert.
-
-
In
der PCR-Reaktion #2 wird das Sindbis-5'-Ende plus die tRNA-Sequenz durch Standard-drei-Zyklus-PCR
mit 1 Minute Extension vom Matrizenplasmid Toto1101 (5'tRNAAsp)
(Bredenbeek et al., J. Virol. 67: 6439-6446, 1993) unter Verwendung
der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet sind,
um auch eine flankierende BamHI-Stelle in einem Primer und Sequenzen,
die den 3'RSVtR-Primer überlappen,
im anderen zu enthalten.
-
-
Nach
der Amplifizierung werden die DNA-Fragmente mit QIAquick-spin gereinigt
und zusammen als Matrizen in einer nachfolgenden drei-Zyklus-PCR-Reaktion
mit 2 Minuten Expansion unter Verwendung von zusätzlichen 5'RSVpro- und 3'SinBam-Primern verwendet. Das resultierende überlappende
PCR-Amplikon wird unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt, mit
BglII und BamHI verdaut und in das Plasmid pBGSINspSV ligiert, das
auch mit BglII und BamHI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt
und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENFCLEAN II
gereinigt worden ist. Das resultierende Strukturprotein, das den
defekten Helfer exprimiert, wird 987DHBB bezeichnet.
-
Als
Nächstes
wird die IRES-Sequenz des Encephalomyocarditis-Virus (EMCV) durch überlappende PCR
unmittelbar stromaufwärts
des Neomycinphosphotransferase-Gens als ein selektierbarer Marker
positioniert, und das gesamte Amplikon wird in die NsiI-Stelle von
987DHBB inseriert. Die Insertion an der NsiI-Stelle wird den selektierbaren
Marker unmittelbar stromabwärts
des Strukturprotein-ORF positionieren. In der PCR-Reaktion #1 wird
das EMCV-IRES-Fragment
(Nucleotide 260-827) durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer 30
Sekunden-Extension vom Matrizenplasmid pBS-ECAT (Jang et al., J.
Virol. 63: 1651, 1989) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer
amplifiziert, die gestaltet sind, um auch eine flankierende NsiI-Stelle
in einem Primer und Sequenzen, die das neo-Gen überlappen, im anderen zu enthalten.
-
-
In
der PCR-Reaktion #2 wird der neo-Resistenzmarker durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer 1,5 Minuten-Extension
vom Matrizenplasmid pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Ka.) unter Verwendung
der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet sind,
um auch eine flankierende NsiI-Stelle in einem Primer und Sequenzen,
die den 3'EMCVIRES-Primer überlappen,
im anderen zu enthalten.
-
-
Nach
der Amplifizierung werden die DNA-Fragmente mit QIAquick-sein gereinigt
und zusammen als Matrizen in einer nachfolgenden drei-Zyklus-PCR-Reaktion
mit 2 Minuten Extension unter Verwendung von zusätzlichen 5'EMCVIRES- und 3'Neo/pcDNA-Primern verwendet. Das resultierende überlappende
PCR-Amplikon wird unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt, mit
NsiI verdaut und in das Plasmid 987DHBB ligiert, das auch mit NsiI
verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7%
Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden ist.
Das resultierende Strukturprotein-Expressionskonstrukt mit der IRES/neo-Insertion
in der nicht translatierten Sindbis-3'-Region wird 987DHBBNeo bezeichnet.
-
Um
stabile Verpackungszelllinien herzustellen, wurden BHK-Zellen mit
10 μg des
Plasmids 987DHBBNeo unter Verwendung eines Calciumphosphat-Präzipitations-Standardprotokolls
transfiziert. Ungefähr
24 h nach der Transfektion wurden die Medien durch frische Medien,
enthaltend 1 mg/ml des Wirkstoffs G418 ersetzt. Nach einem weiteren
Tag wurden die Zellen trypsinisiert und in einer 1/10-Dichte in Medien,
enthaltend 500 μg/ml
G418, re-plattiert. Nach einigen weiteren Passagen wurden die Zellen
einer Verdünnungs-Clonierung
unterzogen, und die individuellen Clone wurden expandiert. Die Fähigkeit
von individuellen Clonen, als Verpackungszelllinien zu wirken, wurde
durch Calciumphosphat-Transfektion des Plasmids RSV/Sinrep/LacZ,
einem Sindbis-DNA-Vektor, der β-Gal
exprimiert, und Testen auf das Vorliegen von verpackten Vektorpartikeln
in den Überständen nach
48 h bestimmt. Die verpackten Vektor-Replikons wurden durch den
CPE-Test, beschrieben in Frolov und Schlesinger (J. Virol. 68: 1721-1727,
1994), titriert, und eines, das hohe Titer von verpackten Partikeln
ergab, genannt 987DH-BBNeo, wurde für eine weitere Charakterisierung verwendet.
Die Titer des verpackten Vektors wurden nach der Transfektion von
entweder RNA- oder DNA-basierten Sindbis-Vektoren, die β-Gal exprimieren, unter Verwendung
von einigen unterschiedlichen Transfektionstechniken nach 48 h bestimmt.
Die Ergebnisse waren wie folgt:
Transfektions-Vorgehen | zugefügte Nucleinsäure | Titer
(infektiöse
Einheiten/ml) |
Elektroporation | RSVSINrep/LacZ
DNA (2.5 μg) | 1.5 × 109/ml |
Elektroporation | SINrep/LacZ
RNA (2.5 μg) | 6 × 109/ml |
Lipofectamin | RSVSINrep/LacZ
DNA (2 μg) | keine
verpackten Partikel |
Lipofectin | SINrep/LacZ
RNA (2 μg) | 5-6 × 107/ml |
Calciumphosphat | RSVSINrep/LacZ
DNA (10 μg) | 1.5 × 109/ml |
-
Zusätzlich wurden
SINrep/LacZ-Partikel, die unter Verwendung von 987DH-BB-Zelllinien verpackt wurden,
danach verwendet, um frische BHK- Zelleinzelschichten
zu infizieren und sowohl RNA- als auch Proteinexpressionsmuster
zu untersuchen. 19 zeigt das RNA-Muster, nachdem
BHK-Zellen mit zwei verschiedenen Präparationen von Sinrep/LacZ-Partikeln
bei einer MOI von 150 infektiösen
Einheiten pro Zelle (Bahnen 1 und 2) oder Wildtyp-Sindbis-Virus (Bahn
3) als eine Kontrolle infiziert wurden. Sieben Stunden nach der
Infektion wurden Dactinomycin (1 μg/ml)
und [3H]Uridin (20 μCi/ml) zugefügt, gefolgt von Ernten und
Analyse der RNA nach 4 h gemäß Bredenbeek
et al. (J. Virol. 67: 6439-6446, 1993). Die hohe MOI wurde verwendet,
um mögliche
Rekombinanten nachzuweisen. Horizontale Linien rechts der Gelbahnen
zeigen die Sindbis- und β-Gal-RNAs von Interesse
an. Die Bande mit dem höchsten
Molekulargewicht zeigt die genomische RNA des Replikons oder Virus
an (Bahnen 1 und 2, SINrep/LacZ; Bahn 3 Sindbis-Virus). Die nächsten zwei
angezeigten RNAs sind die genomische RNA der 987DH-BBNeo-PCL-Expressionskassette
und die induzierbare subgenomische Strukturprotein-mRNA derselben
987DH-BBNeo-PCL-Kassette. Das Vorliegen der letzteren zwei Banden
zeigt, dass die genomische Helfer-RNA, die von der Verpackungszelllinie
stammt, auch mit verpackt wird. Die nächsten RNA-Banden, jene, die
in der größten Menge
vorliegen, sind die subgenomischen RNAs, die entweder von SINrep/LacZ
(Bahnen 1 und 2) oder dem Sindbis-Virusgenom (Bahn 3) stammen.
-
Eine
Proteinanalyse wurde nach der Infektion von BHK-21-Zellen mit verpackten
SINrep/LacZ-Replikons bei einer MOI von 20 infektiösen Einheiten/Zelle
durchgeführt.
15 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen mit [35S]-Methionin
für 30
Minuten markiert, Lysate gemacht und die Proteine durch SDS-PAGE
analysiert. Wie in 20 (Bahnen 2 und 3) gezeigt,
sind sowohl die beta-Galactosidase als auch das Sindbis-Virus-Capsidprotein
in den Vektorpartikel-infizierten Zellen, aber nicht in nicht-infizierten
Zellen (Bahn 1) markiert. Das Vorliegen des Capsids zeigt, dass
manche der verpackten Partikel auch Strukturprotein-Gen-RNA-Transkripte
von den PCL enthalten.
-
C. Konstruktion von PCL-Konfigurationen
mit "gespaltenen
Strukturgenen"
-
In
anderen Aspekten dieser Offenbarung werden PCL offenbart, in denen
die Alphavirus-Strukturproteine nicht als ein Polyprotein von einer
einzelnen mRNA mit seiner natürlichen
post-translationellen Prozessierung, sondern vielmehr als getrennte
Proteine von unabhängigen
mRNAs, die durch mehrere Kassetten transkribiert werden, exprimiert
werden. Solch eine Konfiguration minimiert die Möglichkeit einer Rekombination
oder von gemeinsamen Verpackungs-Ereignissen, die zur Bildung von
Replikations-kompetentem oder infektiösem Virus führen, stark. In bevorzugten
Aspekten wird das Caspidprotein von einer stabil transformierten Kassette
exprimiert, und die Hüll-Glycoproteine
werden zusammen von einer zweiten stabil transformierten Kassette
exprimiert, und jedes wird in einer Vektor-induzierbaren Weise vom Verbindungsregion-Promotor (oben
beschrieben) exprimiert.
-
Zum
Beispiel wurde das Sindbis-Virus-Capsidprotein-Gen vom Plasmid pDLTRSINg
(Dubensky et al., ebd.) durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer
1,5 Minuten-Extension unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer
amplifiziert, die gestaltet wurden, um eine flankierende XhoI-Stelle
und ein Capsidprotein-Gen-Startcodon oder eine flankierende NotI-Stelle
und ein Translations-Stoppcodon zu enthalten.
-
-
Nach
der Amplifizierung wurde das Capsid-Fragment mit QIAquick-spin gereinigt,
mit XhoI und NotI verdaut, unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt
und in den DNA-basierten Sindbis-Expressionsvektor pDCMVSIN-luc
(Dubensky et al., ebd.) ligiert, der auch mit XhoI und NotI verdaut,
um seine Luciferase-Reportergen-Insertion
zu entfernen, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem
0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN 11 gereinigt worden
war. Das resultierende Capsidprotein-Expressionskonstrukt wurde
pDCMVSIN-C bezeichnet. Das Plasmid pDCMVSIN-C wurde danach mit BspEI
verdaut, um die meisten Nichtstrukturprotein-Gensequenzen zu entfernen,
und mit sich selbst unter verdünnten
Bedingungen re-ligiert, um das DH-Vektorkonstrukt pDCMVSINdl-C zu
bilden.
-
Das
Plasmid pDCMVSINdl-C, das auch eine Neomycin-Resistenzkassette enthält, wurde
unter Verwendung von Lipofectamin, wie durch den Hersteller beschrieben,
in BHK-Zellen transfiziert. Ungefähr 24 h nach der Transfektion
wurden die Zellen trypsinisiert und in Medien, enthaltend 600 μg/ml des
Wirkstoffs G418 (Neomycin) re-plattiert. Die Medien wurden periodisch
durch frische, G418-enthaltenden
Medien ausgetauscht, und Foci von resistenten Zellen wurde erlaubt,
zu wachsen. Die Zellen wurden trypsinisiert und durch limitierende
Verdünnung
in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle
Zellclone wurden gezüchtet
und für
das Screenen expandiert. Zellen, die das Caspidprotein induzierbar
als Antwort auf den eingebrachten Vektor exprimierten, wurden durch
Transfizieren mit Sindbis-Luciferase-Vektor-RNA, Herstellen von
Zelllysaten ungefähr
15 h nach der Transfektion und Durchführen einer Western-Blot-Analyse
mit einem polyclonalen Kaninchen-anti-Sindbis-Antikörper identifiziert.
Einige positive Zellclone, die integrierte Kopien der Capsidprotein-Genexpressionskassette
beherbergten und das Protein induzierbar exprimierten, wurden identifiziert.
-
Um
sowohl die Induzierbarkeit als auch die Funktionalität des exprimierten
Capsids im Zusammenhang mit Kassetten mit „gespaltenen Strukturgenen" zu zeigen, wurde
ein zusätzliches
Konstrukt, das die Sindbis-Virus-Hüll-Glycoproteine exprimiert,
von pDCMVSIN-luc hergestellt. Kurz, die Sindbis-Hüll-Glycoproteingene
wurden vom Plasmid pDLTRSINg durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit
einer 2,5 Minuten-Extension und unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer
amplifiziert, die gestaltet werden, um eine flankierende XhoI-Stelle
und ein Translations-Startcodon in gutem Kozak-Zusammenhang oder
eine flankierende NotI-Stelle und das Translations-Stoppcodon zu
enthalten.
-
-
Nach
der Amplifizierung wurde das Glycoproteingen-DNA-Fragment mit QIAquick-spin gereinigt, mit XhoI
und NotI verdaut, unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt und
in den DNA-basierten Sindbis-Expressionsvektor pDCMVSIN-luc ligiert,
das auch mit XhoI und NotI verdaut, um seine Luciferase-Reportergen-Insertion
zu entfernen, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem
0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden
war. Das resultierende Glycoprotein-Expressionskonstrukt wurde pDCMVSIN1.5PE
bezeichnet.
-
21 ist ein Western-Blot, der die Vektor-kontrollierte
Induzierbarkeit von zwei unterschiedlichen clonalen Capsidlinien
(9-3 und 9-9)-Zelllinien zeigt, die unter Verwendung von Lipofectamin
mit Sindbis-DNA-Vektoren, die die Hüll-Glycoproteine (1.5PE-Bahnen)
oder einen β-Galactosidase-Reporter,
pDCMVSIN-β-gal (Dubensky
et al., ebd.; 1.5β-gal-Bahnen),
exprimieren oder „Schein"-transfiziert wurden
(M-Bahnen). Zelllysate
wurden 48 h nach der Transfektion hergestellt, durch SDS-PAGE aufgetrennt
und auf Membranen transferiert, wo sie mit einer Kombination von
Antikörpern,
die spezifisch für
Sindbis-Strukturproteine und β-Galactosidase
sind, sondiert wurden. Der Blot zeigt deutlich die Induzierbarkeit
des Capsidproteins als Antwort auf die Nichtstrukturproteine, die
durch einen Vektor bereitgestellt wurden, sowie die Expression von β-Galactosidase und
der Hüll-Glycoproteine.
Die Funktionalität
der Capsid-Zelllinien mit „gespaltenen
Strukturgenen" durch Komplementierung
und Vektorpartikel-Verpackung wurde durch Co-Transfizieren der β-Galactosidase-
und Hüll-Glycoprotein-Vektoren
in eine Capsid-Zelllinie unter Verwendung von Lipofectamin und Testen
auf verpackte Partikel in den Kulturüberständen gezeigt. Ungefähr 48 h
nach der Transfektion wurden die Überstände geerntet und für die Verpackungs-Tests
und die Vektortiter-Bestimmung geklärt. Zusätzlich wurden die Zellen unter
Verwendung von Lameli-Probenpuffer lysiert und durch Western-Blot-Analyse
mit polyclonalem anti-Sindbis-Antikörper untersucht, wobei die
Expression sowohl des Capsidproteins als auch durch den Vektor- bereitgestellten
Hüll-Glycoproteine
gezeigt wurde. Die Überstände wurden
dann auf das Vorliegen von verpackten Vektorpartikeln durch Infizieren
von natürlichen
BHK-Zellen für
ungefähr
18 h und Färben
auf β-gal-Reportergenexpression,
wie vorher in diesem Beispiel beschrieben, getestet. Die Funktionalität der Zelllinien
für eine
Komplementierung und Verpackung wurde durch Beobachtung von blaugefärbten β-Gal-exprimierenden
Zellen gezeigt.
-
Um
stabile PCL mit „gespaltenen
Strukturgenen" herzustellen,
die getrennte Vektor-induzierbare Expressionskassetten für sowohl
das Capsidprotein als auch die Hüllen-Glycoproteine
haben, werden die oben beschriebenen Capsid-Zelllinien in Verbindung
mit einem zusätzlichen
Hüll-Glycoprotein-Expressionskonstrukt
verwendet, das einen anderen selektierbaren Marker (zum Beispiel
die Hygromycin B-Resistenz) enthält. Kurz,
das Plasmid pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal
(Beispiel 5) wird mit BamHI und FspI verdaut, um die Sequenzen,
umfassend den Verbindungsregion-Promotor,
das β-gal-Reportergen
und manche 3'-End-Sequenzen,
zu isolieren. Das erwünschte
Fragment wird von einem 1% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN
II gereinigt und wird in das Plasmid pBGSVCMVdlneo (siehe oben)
ligiert, das auch mit BamHI und FspI verdaut, um alle Strukturprotein-Gensequenzen
zu eliminieren, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7%
Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden ist.
Das resultierende Konstrukt wird als pBGSVCMVdlsP-luc bezeichnet.
Das Plasmid pBGSVCMVdlsP-luc wird als Nächstes mit XhoI und NotI verdaut,
um das Luciferase-Reportergen zu entfernen, mit alkalischer Phosphatase
behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN
II gereinigt, und das XhoI- und NotI-verdaute Hüll-Glycoprotein-PCR-Amplikon
von oben wird danach in den verdauten pBGSVCMVdlsP-luc-Vektor ligiert, um
das Hüll-Glycoprotein-exprimierende DH-Konstrukt
pBGSVCMVdl-G herzustellen. Die Insertion einer Hygromycin-Resistenzmarker-Kassette
sowie eines flankierenden HSV-TK-Promotors
und von Polyadenylierungs-Sequenzen in dieses Plasmid wird durch
PCR-Amplifizierung unter Verwendung eines Standard-drei-Zyklus-Protokolls
mit 2,5 Minuten Extension, des Plasmids pDR2 (Clontech, Palo Alto,
Ka.) als Matrize und der folgenden Oligonucleotidprimer erreicht,
die gestaltet werden, um flankierende PacI-Stellen zu enthalten.
-
-
Nach
der Amplifizierung wurde das DNA-Fragment mit QIAquick-spin gereinigt,
mit PacI verdaut, unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt und
in das Plasmid pBGSVCMVdl-G ligiert, das auch mit PacI verdaut,
mit alkalischer Phosphatase behandelt und unter Verwendung von GENECLEAN
II gereinigt worden ist. Das resultierende Konstrukt wird als pBGSVhygro-G
bezeichnet.
-
Das
Plasmid pBGSVhygro-G, das jetzt auch eine Hygromycin-Resistenzkassette
enthält,
wird unter Verwendung von Lipofectamin, wie vom Hersteller beschrieben,
in die Capsid-Zelllinie transfiziert. Ungefähr 24 h nach der Transfektion
werden die Zellen trypsinisiert und in Medien, enthaltend 1200 μg/ml Hygromycin
(Calbiochem, La Jolla, Ka.), re-plattiert. Die Medien werden periodisch
mit frischen Hygromycin-enthaltenden Medien ausgetauscht, und Foci
von resistenten Zellen werden wachsen gelassen. Die Zellen werden
trypsinisiert und durch limitierende Verdünnung in Gewebekulturschalen
mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle Zellclone werden
gezüchtet
und für
das Screenen expandiert. Zellen, die biologisch aktives Capsidprotein
und Hüllen-Glycoproteine
als Antwort auf den eingesetzten Vektor induzierbar exprimieren,
werden auf zwei Wegen identifiziert: zuerst durch Lipofectin-vermittelte
Transfektion mit Sindbis-Luciferase-Vektor-RNA und Sondieren der
Lysate 15 Stunden nach der Transfektion in Western-Blots, wie oben
beschrieben; und zweitens durch ähnliche
Sindbis-Luciferase-Vektor-Transfektion,
aber Ernten der Überstände 24 h
nach der Transfektion und Testen auf den Transfer der Luciferase-Expression
auf frische BHK-Zellen durch Infektion mit den Überständen (siehe oben). PCT mit
gespaltenen Strukturgenen, die auf diese Weise abgeleitet werden,
werden C/GLYCO-PCL bezeichnet.
-
D. Konstruktion von PCL mit „Hybrid"-Strukturproteinen
-
Ein
zusätzlicher
Ansatz, der angewendet werden kann, um den Spiegel der gemeinsamen
Verpackung oder Rekombination zwischen DH- und Vektor-RNA-Molekülen zu senken,
um die Translation der Glycoproteingene zu verstärken oder um die Zell- oder
Gewebespezifität
der verpackten rekombinanten Alphavirus-Vektorpartikel zu verändern, nutzt
Strukturprotein-Gene, die von anderen Alphaviren oder Yogaviren
stammen. Genauer, zahlreiche Kombinationen von Alphavirus- und Yogavirus-Strukturprotein-Genen
für die
Verwendung mit Sindbis-Virus- oder anderen Alphavirusvektoren können vorgesehen
werden. Zum Beispiel kann das Capsidprotein-Gen des Ross River-Virus
(RRV) in Verbindung mit den Hüll-Glycoproteingenen
von Sindbis-Virus (exprimiert von demselben oder einem anderen Konstrukt)
verwendet werden, um einen Sindbis-Virus-abgeleiteten Vektor, beschrieben
in den Beispielen 3, 4 oder 5, zu verpacken. Zusätzlich kann eine deletierte
Form des RRV-Capsidprotein-Gens unmittelbar stromaufwärts der
Sindbis-Glycoprotein-Gensequenzen
positioniert werden, um als translationelle Enhancer-Elemente zu dienen.
Als ein anderes Beispiel können
die Strukturproteine von Sindbis-Virus verwendet werden, um Semliki
Forest-Virus-RNA-Vektoren zu verpacken.
-
Genau
gesagt wurden defekte Helfer (DH)-Strukturprotein-Konstrukte, die
eine intakte oder deletierte Form des RRV-Capsidgens (22) plus die Sindbis-Glycoprotein-Gene enthielten, durch
PCR-Amplifizierung von Sindbis-Virus- oder Ross River-Virus-Sequenzen
von den Plasmid-Matrizen Toto1101 (Rice et al., J. Virol. 61: 3809-3819,
1987) beziehungsweise RR6415 (Kuhn et al., Virology 182: 430-441, 1991) und Inkorporierung
jener Sequenzen in die vorher beschriebenen DH-Konstrukte DH-BB oder DH-BB(5'SIN) (Bredenbeek et
al., J. Virol. 67: 6439-6446, 1993) für die Transkription in vitro
mit SP6-Polymerase konstruiert. Die DH-Konstrukte DH-BB oder DH-BB(5'SIN) unterscheiden
sich durch das Vorliegen (DH-BB)
oder Fehlen (DH-BB(5'SIN))
einer DI-abgeleiteten tRNAAsp-Sequenz am
Sindbis-5'-Ende. Die folgende
Tabelle zeigt die spezifischen PCR-Primersequenzen und ihre entsprechenden
Sindbis- oder Ross River-Nucleotidpositionen an, wobei Großbuchstaben
virale Nucleotide anzeigen und Kleinbuchstaben zusätzliche
Nucleotide von Restriktionsstellen, die in den Clonierungsschritten
verwendet werden, oder spezifische Punktmutationen anzeigen. Punktmutationen
im Primer 6 (RRV Bsp) änderten
die resultierenden Aminosäuresequenzen
nicht.
-
Primer,
die für
die PCR verwendet wurden:
-
Die
PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung der unten angezeigten Primerpaare
in einem Standard-drei-Zyklus-Protokoll mit 30 Sek. Extension und
Vent-Polymerase durchgeführt,
um die entsprechenden DNA-Fragmente zu produzieren, die auch unten
angezeigt sind.
-
PCR-Fragmente: Primerpaare, Plasmid-Matrizen
-
- Fragment 1: pr1 + pr2, RRV6415-Plasmid
- Fragment 2: pr3 + pr4, RRV6415-Plasmid
- Fragment 3: pr5 + pr6, RRV6415-Plasmid
- Fragment 4: pr3 + pr7, RRV6415-Plasmid
- Fragment 5: vr4 + pr8, RRV6415-Plasmid
- Fragment 6: pr9 + pr10, Toto1101-Plasmid
- Fragment 7: pr11 + pr12, Toto1101-Plasmid
-
Nach
der Amplifikation wurden die PCR-Produkte mit den angezeigten Enzymen
verdaut und in das pUC18-Plasmidanalog pRS2 ligiert, das zusätzliche
Polylinkerstellen enthält
und das auch mit denselben Enzymkombinationen verdaut worden war:
Fragment 1 wurde mit EcoRI + HindIII geschnitten; Fragment 2 mit BamHI
+ HindIII; Fragment 3 mit BamHI + HindIII; Fragment 4 mit BamHI
+ AflII; Fragment 5 mit HindIII + AflII; Fragment 6 mit BamHI +
HindIII; und Fragment 7 mit BamHI + Bsu361. Alle Insertionen wurden
sequenziert, um zu bestätigen,
dass keine Artefakte während
der PCR erworben wurden.
-
Danach
wurden die Fragmente unter Verwendung der unten angezeigten Enzyme
von den pRS2-Plasmiden freigesetzt und ligiert, genau wie es angezeigt
wurde, um den nächsten
Satz von Konstrukten herzustellen. Um FR8 herzustellen, wurde das
Fragment 6 (geschnitten durch BamHI und AvaII) mit dem Fragment
1 (geschnitten durch AvaII und NciI), Fragment 2 (geschnitten durch
NciI und HindIII) und Plasmid pRS2 (geschnitten mit BamHI und HindIII)
ligiert. Um FR9 herzustellen, wurde das Fragment 6 (geschnitten
durch BamHI und AvaII) mit dem Fragment 1 (geschnitten durch AvaII
und NciI), Fragment 4 (geschnitten durch NciI und AflI) und Plasmid
pRS2 (geschnitten mit BamHI und AflII) ligiert. Um FR10 herzustellen,
wurde das Fragment 5 (geschnitten durch AflII und ApaLI) mit dem
Fragment 3 (geschnitten durch ApaLI und HindIII) und Plasmid pRS2
(geschnitten mit AflII und HindIII) ligiert. Nach der Transformierung
von E. coli wurden die Plasmide durch Restriktionsanalyse analysiert,
und ihre Insertionen wurden wieder durch Verdau isoliert und für die nächsten Schritte
der Clonierung verwendet.
-
Die
FR8-Insertion (geschnitten durch BamHI und ApaLI) wurde mit dem
Fragment 3 (geschnitten durch ApaLI und BspMII), dem Fragment 7
(geschnitten durch BspMII und Bsu36I) und Plasmid DH-BB (geschnitten
mit BamHI und Bsu36I ligiert. Dieselben Fragmente wurden auch verwendet,
um das BamHI-Bsu36I-Fragment
des Plasmids DH-BB(5'SIN)
zu ersetzen. Die resultierenden Plasmide wurden DH-BB Crrv beziehungsweise
DH-BB(5'SIN) Crrv
bezeichnet (siehe 23). Die FR9-Insertion (geschnitten
durch BamHI und AflII) wurde mit der FR10-Insertion (geschnitten durch AflII und
BspMII), Fragment 7 (geschnitten durch BspMII und Bsu36I) und Plasmid
DH-BB (geschnitten mit BamHI und Bsu36I) ligiert. Dieselben Fragmente
wurden auch verwendet, um das BamHI-Bsu36I-Fragment von Plasmid
DH-BB(5'-SIN) zu
ersetzen. Die resultierenden Plasmide wurden DH-BB CΔrrv und DH-BB(5'SIN) CΔrrv bezeichnet
(siehe 23).
-
Mehrere
Verwendungen für
DH-Konstrukte, die chimäre
Strukturprotein-Gene enthalten, sind möglich, und zwei solche Ansätze sind
in den 24 und 25 illustriert.
In 24 ist das intakte Ross River-Capsidprotein mit
den Sindbis-Glycoprotein-Gensequenzen
(DH-BB Crrv oder DH-BB(5'SIN)
Crrv) als Teil eines defekten Helferkonstrukts verknüpft und
wird mit einem Sindbis-Reporter-RNA-Vektor-Replikon co-transfiziert, um
die Verpackung in rekombinante Alphavirus-Partikel zu zeigen (26). In 25 wird
die deletierte Form des Ross River Capsidprotein-Gens mit den Sindbis-Glycoprotein-Gensequenzen
(DH-BB CΔrrv
und DH-BB(5'SIN)
CΔrrv) als
ein translationeller Enhancer und Teil des DH-Konstrukts verknüpft, während das Sindbis-Capsidprotein-Gen
von einem zweiten DH-Konstrukt exprimiert wird. Beide DH-Konstrukte
werden mit einem Sindbis-Reporter-RNA-Vektor-Replikon co-transfiziert, um
die Verpackung in rekombinante Alphaviruspartikel zu zeigen (26). Zusätzlich
kann für
die Verwendung in der Verpackung das Ross River-Capsidprotein-Gen
alleine von einem DH-Konstrukt exprimiert werden, während die
Sindbis-Glycoproteine von einem anderen exprimiert werden. Unter
Verwendung dieses Wissens und der Verfügbarkeit von einigen anderen
Alphaviren, von denen Strukturprotein-Gensequenzen abgeleitet werden
sollen, kann in ähnlichen
Ansätzen eine
große
Zahl von verschiedenen Proteinkombinationen hergestellt werden.
-
Alternativ
kann das gesamte Komplement der Strukturprotein-Gene von einem Alphavirus
oder anderen Mitgliedern der Togaviridae (z. B. Rubella-Virus) verwendet werden,
um einen RNA-Vektor, der von einem anderen stammt, zu verpacken,
wie oben für
SFV-Vektoren und Sindbis-Strukturproteine gezeigt. In einer Alternative
können
die Strukturprotein-Gene des Venezuelanischen Pferde-Encephalitis
(VEE)-Virus verwendet werden,
um einen Sindbis-Virus-abgeleiteten Vektor (Wildtyp oder einen,
der den Phänotyp
zeigt, der in Beispiel 4 oder 5 beschrieben ist) zu verpacken. Solch
ein Verfahren liefert rekombinante Alphaviruspartikel, enthaltend
Vektor-RNAs, die die erwünschten
Eigenschaften der vorliegenden Erfindung wie verzögerte, reduzierte
oder keine Inhibition der Wirts-Makromolekülsynthese zeigen, plus Strukturproteine,
die den Tropismus des rekombinanten Partikels umlenken. Das Venezuelanische
Pferde-Encephalitisvirus (VEE) ist ein Alphavirus, das im Gegensatz
zu seinem Sindbis-Virus-Gegenstück
einen Tropismus für
Zellen von lymphoidem Ursprung zeigt. Daher werden Sindbis-abgeleitete
Vektorkonstrukte, die durch eine Zelllinie verpackt werden, die
die VEE-Strukturproteine exprimiert, dieselben lymphotropen Eigenschaften
wie das VEE-Elternvirus zeigen, von dem die Verpackungszelle-Strukturprotein-Genkassette
erhalten wurde.
-
Genau
gesagt wird der Trinidad-Eselstamm des VEE-Virus (ATCC #VR-69) in
BHK-21-Zellen vermehrt, und Virion-RNA wird unter Verwendung von ähnlichen
Vorgehensweisen wie jenen, die im Beispiel 1 beschrieben sind, extrahiert.
Die gesamte Strukturprotein-codierende Region wird durch PCR mit
einem Primerpaar, dessen 5'-Enden
auf die authentische AUG-Translations-Startstelle einschließlich der
umgebenden Kozak-Konsenssequenz bzw. die translationelle UAG-Stoppstelle
kartieren, amplifiziert. Der Vorwärtsprimer ist komplementär zu den
VEE-Nucleotiden 7553-7579, und der Rückwärtsprimer ist komplementär zu den VEE-Nucleotiden
11206-11186 (Sequenz von Kinney et al., Virology 170: 19-30, 1989).
Die PCR-Amplifikation der
VEE-cDNA, die den Strukturprotein-Genen entspricht, wird unter Verwendung
eines reverse Transkriptase-PCR-Protokolls in zwei Schritten, wie
oben beschrieben, der VEE-Genom-RNA als Matrize und des folgenden
Oligonucleotidpaars, das flankierende XhoI- und NotI-Stellen enthält, erreicht:
-
Nach
der PCR-Amplifizierung wurde das ungefähr 3800 bp-Fragment unter Verwendung
von GENECLEAN II von einem 0,7% Agarosegel gereinigt und mit XhoI
und NotI verdaut. Das resultierende Fragment wird dann in den DNA-basierten
Sindbis-Expressionsvektor pDCMVSIN-luc (siehe oben) ligiert, der
auch mit XhoI und NotI verdaut, um seine Liciferase-Reportergen-Insertion
zu entfernen, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem
0,7%-Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden
ist. Das resultierende VEE-Strukturprotein-Expressionskonstrukt wird pDCMV-VEEsp
bezeichnet. Das Plasmid pDCMV-VEEsp wird danach unter limitierenden
teilweisen Verdau-Bedingungen mit BspEI verdaut, um die meisten
Nichtstrukturprotein-Gensequenzen zu entfernen, und re-ligiert,
um das Strukturprotein-exprimierende DH-Vektorkonstrukt pDCMV-VEEdl
zu bilden.
-
Das
Plasmid pDCMV-VEEdl, das auch einen Neomycin-Resistenzmarker enthält, wird
unter Verwendung von Lipofectamin, wie durch den Hersteller beschrieben,
in BHK-Zellen transfiziert. Ungefähr 24 h nach der Transfektion
werden die Zellen trypsinisiert und in Medien, enthaltend 600 μg/ml des
Wirkstoffs G418 replattiert. Die Medien werden periodisch durch
frische G418-enthaltenden Medien ausgetauscht, und Foci von resistenten
Zellen werden wachsen gelassen. Die Zellen werden trypsinisiert
und durch limitierende Verdünnung
in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle
Zellclone werden gezüchtet
und für das
Screenen expandiert. Zellen, die induzierbar VEE-Strukturproteine
als Antwort auf den eingesetzten Vektor exprimieren, werden durch
Transfizieren mit Sindbis-Luciferase-Vektor-RNA
und Testen auf eine VEE-Strukturprotein-Expression in den Zelllysaten
oder den verpackten Luciferase-Vektor in den Überständen identifiziert, wie vorher
beschrieben. Strukturprotein-Gene, die von Varianten von VEE oder
anderen Alphaviren und ihren Varianten, die sich im Gewebetropismus
unterscheiden, erhalten wurden, sind auch nützlich, wenn dieser Ansatz
befolgt wird.
-
Zusätzlich kann
jede der verschiedenen Strukturproteingen-Expressionskassetten-Konfigurationen, die
in diesem Beispiel beschrieben werden, verwendet werden.
-
E. Produktion von verpacken Alphavirusvektoren
von PCL
-
Alphavirus-abgeleitete
PCL, die im Verlauf dieses Beispiel beschrieben werden, können in
einer Reihe von unterschiedlichen Arten verwendet werden, um rekombinante
Alphavirus-Partikelbestände
zu produzieren, und schließen
das Einbringen des Vektors entweder durch Transfektion von RNA-
oder DNA-Molekülen, Infektion
mit vorher produzierten verpackten Vektor-enthaltenden Partikeln
oder die intrazelluläre
Produktion von Vektor von stabil transformierten Expressionskassetten
ein. Die Nützlichkeit
von Alphavirus-PCL für
die Produktion von Vektorpartikeln wird zuerst mit einem Reportervektor-Konstrukt
gezeigt und kann später
auf alle anderen Vektorkonstrukte angewendet werden, die eine erwünschte heterologe
Sequenz exprimieren. Zum Beispiel wird ein Bestand von verpackten
Sindbis-β-gal-Vektorpartikeln durch
Elektroporation von ungefähr
107 Alphavirus C/GLCYO- oder anderen PCL-Zellen
(siehe oben und zum Beispiel 15, 17, 18)
mit 50 μg
pKSSIN-1-BV-β-gal-
oder -Luciferase-RNA (Beispiel 4) oder pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal- oder -Luciferase-DNA
(Beispiel 5) unter Verwendung der Vorgehensweise, die in (Liljestrom
und Garoff, Bio/Technology 9: 1356-1361, 1991) beschrieben ist,
erhalten. Die transfizierten PCL werden bei einer erwünschten
Temperatur (z. B. 37°C)
inkubiert, und ungefähr
48 h nach der Transfektion werden die Überstände geerntet und durch Passage
durch einen 0,45 Mikron-Filter geklärt. Eine zusätzliche
Präparation
kann unter Verwendung der Parameter, die in der detaillierten Beschreibung
hierin illustriert ist, durchgeführt
werden.
-
Alternativ
wird ein Bestand von verpackten rekombinanten Alphaviruspartikeln
(erhalten unter Verwendung von PCL, wie oben, oder durch Co-Transfektion
von Vektor und DH-Konstrukten) verwendet, um eine naive Kultur von
PCL für
eine weitere Amplifizierung zu infizieren. Zum Beispiel werden 5 × 107 Alphavirus C/GLYCO- oder andere PCL-Zellen
mit einem Bestand von verpacktem pKSSIN-1-BV-β-gal-Vektor
bei einer ungefähren
Multiplizität
der Infektion (MOI) von 1 infektiösen Einheit/Zelle infiziert.
Bei Erreichen des Zellcytoplasmas wird der Partikelabgeleitete RNA-Vektor
autokatalytisch amplifiziert und in zusätzliche Nachkommenpartikel
verpackt. Nach einer Inkubation bei der erwünschten Temperatur (z. B. 37°C) für ungefähr 48 h
werden die Kulturüberstände geerntet,
durch Passage durch einen 0,45 Mikron-Filter geklärt und präpariert,
wie erwünscht.
-
In
noch einem anderen Verfahren, das die Fähigkeit der PCL ausnutzt, um
verpackte rekombinante Alphavirus-Vektorpartikel weiter zu amplifizieren,
werden Bestände
von verpackten Partikeln verwendet, um naive Kulturen von PCL zu
infizieren, um eine Arbeits-Zellbank von Vektor-enthaltenden PCL
(Vektor-produzierende
Zellen, 27) zu bilden, die danach verwendet
werden kann, um eine andere naive Kultur von PCL auszusäen. Zum
Beispiel wird solch eine Arbeitszellbank durch Infektion von Alphavirus
C/GLYCO- oder anderen PCL-Zellen mit dem verpackten Vektorbestand
bei einer M. O. I. = 5 erreicht. Ungefähr 2–3 h nach der Infektion werden
die Vektor-enthaltenden PCL sanft abgelöst, und die Zellzahl wird bestimmt.
Die Vektor-enthaltenden PCL können
jetzt direkt verwendet oder aliquotiert und in flüssigem N2 als eine Vektor-produzierende Zellbank
gelagert werden. Wenn erwünscht,
werden die Zellen direkt in eine vorher wachsende Kultur von naiven
Alphavirus C/GLYCO- oder anderen PCL in einem Verhältnis von
ungefähr
1 Vektor-produzierenden Zelle pro 1000 frische PCL für die Produktion
von großen
Mengen an verpackten Vektorpartikeln mit hohem Titer ausgesät. Aliquots
des Kulturüberstands
werden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der gemeinsamen Kultur
geerntet, um den Zeitpunkt der maximalen rekombinanten Alphavirus-Partikelproduktion
zu bestimmen, und jene Zeit wird für ein weiteres Ernten, Reinigen
und Präparieren
ausgewählt,
wie oben beschrieben. Dieselbe sequenzielle Amplifizierungsmethodik
unter Verwendung von Vektor-produzierenden Zellen ist auch für eine Produktion
in großem
Maßstab
von jedem erwünschten
rekombinanten Protein nützlich
(27). Für
die Produktion eines rekombinanten Proteins können abhängig vom Wesen des rekombinanten
Proteins die Überstände oder
Zelllysate geerntet werden.
-
In
noch einem anderen Verfahren für
das Produzieren von Beständen
von verpackten rekombinanten Alphaviruspartikeln mit hohem Titer
oder in großem
Maßstab
wird der erwünschte
Expressionsvektor in 1–5% einer
naiven Alphavirus-PCL-Kultur
durch Transfektion von in vitro-transkribierter RNA oder eines Plasmid-DNA-Vektors unter
Verwendung eines allgemein verträglichen
Reagenzes oder Verfahrens (zum Beispiel Lipofectin beziehungsweise
Lipofectamin oder Infektion mit Vektorpartikeln bei niedriger MOI
[≤ 0,1]),
wie hierin beschrieben eingebracht. Die rekombinanten Vektorpartikel,
die durch die anfänglichen
Zellen, in die der Vektor eingebracht wurde, produziert werden,
infizieren danach andere naive Verpackungszellen in der Kultur, die
wiederum noch mehr verpackte Partikel produzieren. Dieser Vorgang
der zeitlichen Amplifizierung fährt fort,
bis die verpackten rekombinanten Alphaviruspartikel in allen Zellen
der PCL-Kultur produziert werden. Dieser Amplifikationsvorgang wird
in 28 gezeigt. ELVS 1.5-β-gal-Plasmid-DNA
wurde in 987DHBBNeo-Verpackungszellen oder in BHK-21-Zellen transfiziert,
und die Spiegel der β-Galactosidase,
die in den Zelllysaten vorhanden waren, wurden zu den angezeigten
Zeitpunkten nach der Transfektion gemessen, wie vorher beschrieben.
In BHK-21-Zellen erreichte der Spiegel der β-Galactosidase-Expression nach ungefähr 48 hpt
ein Maximum und blieb gleich. Im Gegensatz dazu fuhr der Spiegel
der β-Galactosidase-Expression
in der ELVS 1.5-β-gal-transfizierten
987DHBBNeo-PCL-Kultur über
einen längeren
Zeitraum fort, anzusteigen, was den rekombinanten Vektorpartikel-Amplifizierungsvorgang
und die schlussendliche Expression der β-Galactosidase in allen Zellen
der Kultur reflektiert. In allen Fällen können Bestände von rekombinanten Alphavirus-Vektorpartikeln
unter Verwendung jedes der hierin beschriebenen Verfahren so formuliert
werden, dass sie pharmazeutisch verträglich sind.
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BEISPIEL 7
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KONSTRUKTION VON ALPHAVIRUS-HERSTELLER-ZELLLINIEN
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Die
Herstellung von Alphavirus-PCL, wie oben beschrieben, gekoppelt
mit der Konstruktion von DNA-basierenden Alphavirus-Vektoren, die
eine reduzierte, verzögerte
oder keine Inhibition der Wirtszell-Makromolekülsynthese zeigen (Beispiele
1, 2, 4 und 5), liefert einen relativ geradlinigen Mechanismus,
um Alphavirusvektor-Hersteller-Zelllinien abzuleiten. In bestimmten
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung enthalten die Vektor-Hersteller-Zelllinien
eine oder mehrere stabil transformierte Strukturprotein-Genexpressionskassetten
und auch Alphavirus-RNA-Expressionsvektormoleküle mit dem obigen Phänotyp, die
transfiziert, transduziert oder intrazellulär produziert werden, was zu
der Produktion der verpackten Vektorpartikeln führt. In bevorzugten Ausführungsformen
wird ein RNA-Vektor-Replikon intrazellulär von einem stabil transformierten
DNA-Molekül produziert
(einem eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystem), das
entweder in einer integrierten Form oder als eine episomale DNA
vorliegt, wobei die Transkription der Vektor-RNAs induzierbar durch
einen oder mehrere Stimuli, die zu einer erwünschten Zeit geliefert werden,
kontrolliert wird. Dieser Typ einer Alphavirus-Hersteller-Zelllinienkonfiguration
liefert im Wesentlichen eine Kaskade von Ereignissen, die einschließen: induzierbare
Produktion von Vektor-RNA und resultierende autokatalytische cytoplasmatische
Amplifizierung der RNA, die Induktion einer Strukturproteinexpression
in hohem Spiegel durch Vektor-bereitgestellte
Nichtstrukturproteine, die Verpackung der Vektor-RNA durch die exprimierten
Strukturproteine und die Freisetzung der verpackten Vektorpartikel.
Die eng regulierte, induzierbare Expression der Vektor-RNA von dem
DNA-Molekül
wird, sobald die Hersteller-Zellpopulation die erwünschte Zahl
erreicht, aufgrund des Potenzials für eine geringe Cytotoxizität der Vektor-Replikation
oder der Notwendigkeit, eine Nichtstrukturprotein-Synthese zu kontrollieren,
da sie mit der Regulierung der Positivstrang- gegenüber der Negativstrang-Vektor-RNA-Verhältnisse
in Beziehung steht, bevorzugt.
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A. Alphavirus-DNA-Vektoren mit Regulierung
auf einer Ebene
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In
bestimmten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung wird ein DNA-basierender Alphavirusvektor bereitgestellt,
worin die in vivo-Transkription eines Alphavirusvektor-RNA-Moleküls, das
zur autokatalytischen Amplifizierung in der Lage ist, von einem
Promotor erfolgt, der durch Anwenden eines Stimulus zu einer gewünschten
Zeit regulierbar ist. Solch ein DNA-basierter Alphavirusvektor kann
danach stabil in eine Alphavirus-Verpackungszelllinie (PCL) transformiert
werden, um eine induzierbare Alphavirus-Hersteller-Zelllinie zu kreieren.
Die hierin beschriebene Hersteller-Zelllinienkonfiguration ist daher
ein „Vorwärtsschub"-System, in dem: 1) ein Stimulus auf
die Zelle angewendet wird, was in einer wirksamen Transkription
von Alphavirusvektor-RNA resultiert; 2) die Vektor-RNA autokatalytisch
repliziert und Nichtstrukturproteine produziert; 3) die Nichtstrukturproteine
die Amplifizierung der Strukturprotein-Expressionskassetten-mRNAs und eine Strukturproteinexpression
in hohem Spiegel stimulieren; und 4) die Strukturproteine mit der
Vektor-RNA interagieren und in der nachfolgenden Verpackung von
rekombinanten Alphaviruspartikeln resultieren, die in die Kulturmedien
freigesetzt werden. Jede früher
beschriebene Alphavirus-PCL, die stabil mit einer oder mehreren
induzierbaren Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassetten transformiert ist,
kann als die Elternlinie dienen, mit der die Hersteller-Zelllinie
abgeleitet wird.
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Zum
Beispiel kann ein Tetracyclin-responsives Promotorsystem (Gossen
und Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 5547-5551, 1992) für die induzierbare
Transkription einer Alphavirusvektor-RNA angewendet werden, wie
in 29 dargestellt. In diesem System stimuliert die
Expression eines Tetracyclin-Repressors und der HSV-VP16-Transaktivator-Domäne als ein „Fusions"-Protein (rTA) die
in vivo-Transkription der Alphavirusvektor-RNA durch spezifisches
Binden an eine Tetracyclin-Operatorsequenz
(tetO), die unmittelbar angrenzend an einen minimalen „Kern"-Promotor (zum Beispiel CMV) gelegen
ist. Das Bindungs- und das Transaktivierungsereignis wird reversibel
durch das Vorliegen von Tetracyclin blockiert und kann durch Entfernen
von Tetracyclin aus den Kulturmedien „angeschaltet" werden. Da die nicht-induzierten
Grundspiegel der Transkription unter verschiedenen Zelltypen variieren
werden, können
andere verschiedene minimale Kern-Promotoren (zum Beispiel HSV-tk)
mit den Tetracyclin-Operator-Sequenzen verknüpft werden, vorausgesetzt,
dass die Transkriptions-Startstelle bekannt ist, um eine Nebeneinanderstellung
beim oder in der unmittelbaren Nähe des
Alphavirusvektor-Nucleotid(s) 1 zu erlauben.
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Der
rTA-Transaktivator wird durch eine zusätzliche Expressionskassette
geliefert, die auch stabil in dieselbe Zelllinie transformiert wird;
und in bestimmten Ausführungsformen
kann die rTA-Expressionskassette selbst autoregulatorisch sein.
Die Verwendung einer autoregulatorischen rTA-Expressionskassette
umgeht die potenziellen Toxizitätsprobleme,
die mit einer konstitutiven Expression von rTA in hohem Spiegel
assoziiert sind, durch Verknüpfen
der Expression mit der transkriptionellen Kontrolle durch denselben
tetO-verknüpften Promotor,
an den rTA selbst bindet. Dieser Systemtyp kreiert einen negativen
Rückkopplungszyklus,
der sicherstellt, dass sehr wenig rTA in der Anwesenheit von Tetracyclin
produziert wird, der aber sehr aktiv wird, wenn das Tetracyclin
entfernt wird (29). Solch eine autoregulatorische
rTA-Expressionskassette wird im Plasmid pTet-tTAk geliefert (Shockett
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6522-6526, 1995).
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Die
Funktionalität
eines solchen Tetracyclin-regulierten, DNA-basierenden Alphavirusvektors
wird durch Konstruieren eines modifizierten SIN-1-abgeleiteten Luciferase-Plasmidvektors
gezeigt, der durch einen Tetracyclin-Operator/CMV-Minimal-Promotor
gelenkt wird. Unter Verwendung der Plasmide pBG/SIN-1 ELVS1.5-luc
(Beispiel 4) und pBGSV3' (Beispiel
6) als Ausgangsmaterial wird ein ungefähr 7200 bp-Fragment, einschließlich eines
Großteils
der SIN-1-Nichtstruktur-codierenden
Region, des Verbindungsregion-Promotors und Luciferase-Reportergens, und
ein Teil der 3'-UTR
durch Verdau von pBG/SIN-1 ELVS1.5-luc mit BglII und FspI und Reinigung
von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II isoliert.
Das 7200 bp-Fragment wird danach in das Plasmid pBGSV3' ligiert, das auch
mit BglII und FspI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt
und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II
gereinigt worden ist. Das resultierende Konstrukt wird als pBGSVdlB/SIN1-luc
bezeichnet. Die Insertion der verbleibenden Sequenzen, die den heptamerisierten
Tetracyclin-Operator und den minimalen CMV-Promotor (tetO/CMV) verknüpft mit
den Sindbis-Nucleotiden 1-2289 einschließen, so dass die Transkription
mit einem zusätzlichen nicht-viralen
Nucleotid 5' des
Sindbis-Nucleotids 1 beginnen wird, wird durch überlappende PCR erreicht. In der
PCR-Reaktion #1 wird der ungefähr
370 bp lange tetO/CMV-Teil der Sequenz durch Standard-drei-Zyklus-PCR
mit einer 30 Sekunden-Extension von dem Matrizenplasmid pUHC13-3
(Gossen und Bujard, ebd.) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer
amplifiziert, die gestaltet sind, um auch flankierende BglII- und
AscI-Stellen auf einem Primer und Sequenzen, die 5'-Sindbis-Nucleotide überlappen,
auf dem anderen zu enthalten.
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In
der PCR-Reaktion #2 wird der 2289 bp-Sindbis-5'-Endteil der Sequenz wird durch Standard-drei-Zyklus-PCR
mit einer drei Minuten-Extension von dem Matrizenplasmid pKSRSIN-1
(Beispiel 1) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer
amplifiziert, die gestaltet sind, um auch Sequenzen, die die CMV-Promotornucleotide überlappen,
auf einem Primer zu enthalten.
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Nach
der Amplifizierung werden die DNA-Fragmente mit QIAquick-spin gereinigt
und zusammen als Matrizen in einer nachfolgenden drei-Zyklus-PCR-Reaktion
mit 3,5 Minuten Extension unter Verwendung von zusätzlichen
5'BAtetOF- und SIN2400R-Primern verwendet.
Das resultierende überlappende
PCR-Amplikon von ungefähr
2660 bp wird unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt, mit BglII
verdaut und in das Plasmid pBGSVdlB/SIN1-luc ligiert, das auch mit
BglII verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem
0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden
ist. Das resultierende Konstrukt wird ptetSIN1-luc bezeichnet. Vektorkonstrukte,
die andere heterologe Sequenzen von Interesse enthalten, werden
unter Verwendung eines ähnlichen
Ansatzes oder durch direktes Clonieren in die XhoI- und/oder NotI-Stellen
hergestellt. Danach wird eine selektierbare E. coli-gpt-Gen (Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase)-Expressionskassette
hergestellt und in die einmalige PacI-Stelle des Plasmids ptetSIN1-luc
inseriert, um einen zusätzlichen
selektierbaren Marker bereitzustellen. Zuerst wird ein Fragment,
enthaltend den SV40-Promotor verknüpft mit einem offenen Leserahmen
des gpt-Gens, von dem Plasmid pMAM (Clontech, Palo Alto, Ka.) durch
Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer 2 Minuten-Extension und unter
Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die
gestaltet sind, um stromaufwärts
flankierende SacI- und PacI-Stellen und eine stromabwärts-liegende
SacI-Stelle zu enthalten.
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Nach
der Amplifizierung wird das SV40-Promotor/gpt-Gen-DNA-Fragment mit
QIAquick-sein gereinigt, mit SacI verdaut, unter Verwendung von
GENECLEAN II gereinigt und in das Plasmid pBGS131 dlXhoI-BGHTT (Beispiel
5) ligiert, das auch mit SacI verdaut, mit alkalischer Phosphatase
behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN
II gereinigt worden war. Clone mit der korrekten Orientierung der
Insertion werden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Diese
Konfiguration positioniert den Promotor und das gpt-Gen unmittelbar
benachbart zu einem Rinder-Wachstumshormon-Transkriptions-Terminierungssignal.
Das resultierende gpt-Expressionskonstrukt wird pBG131 dlXhoI-gpt
bezeichnet. Als Nächstes wird
die gesamte Expressionskassette vom Plasmid pBGS131 dlXhoI-gpt durch
Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer 2 Minuten-Extension und unter Verwendung der folgenden
Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet sind, um flankierende
PacI-Stellen zu enthalten.
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Nach
der Amplifizierung wird das gpt-Gen-Expressionskassetten-Fragment
mit QIAquick-spin gereinigt, mit PacI verdaut, unter Verwendung
von GENECLEAN II gereinigt und in das tet-induzierbare Alphavirus-Vektorkonstrukt
ptetSIN1-luc ligiert, das auch mit PacI verdaut, mit alkalischer
Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung
von GENECLEAN II gereinigt worden war. Das resultierende Konstrukt
wird ptetSIN1gpt-luc bezeichnet.
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Für die Konstruktion
einer anfänglichen
Tetracyclin-induzierbaren Alphavirus-Vektor-Hersteller-Zelllinie werden das
ptetSIN1gpt-luc-Konstrukt und eine Tetracyclin-Repressor/VP16-Transaktivator
(rTA)-Expressionskassette stabil in die erwünschte Alphavirus-PCL transformiert.
Zum Beispiel werden Alphavirus C/GLYCO-PCL-Zellen (von oben) durch
Co-Transfektion mit einem anderen Plasmid, das einen selektierbaren
Marker codiert, stabil mit dem Plasmid pTet-tTAk (siehe oben) transformiert.
Die Plasmide pTet-tTAk und pSV2-His, das einen Histidinoldehydrogenase-Marker
codiert (Schatz et al., 1989, Cell 59: 1035-1048), werden in einem molaren
Verhältnis
von 40:1 unter Verwendung von Lipofectamin, wie durch den Hersteller
beschrieben, in C/GLYCO-PCL-Zellen (oder andere PCL) transfiziert.
Ungefähr
24 Stunden nach der Transfektion werden die Zellen trypsinisiert
und in Medien, enthaltend Histidinol und 0,5 μg/ml Tetracyclin, re-plattiert. Die Medien
werden periodisch durch frische Wirkstoff-enthaltenden Medien ausgetauscht,
und Foci von resistenten Zellen werden wachsen gelassen. Die Zellen
werden trypsinisiert und durch limitierende Verdünnung in Gewebekulturschalen
mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle Zellclone werden
gezüchtet
und werden für
das Screenen expandiert. Positive pTet-tTAk-enthaltende Verpackungszellclone,
bezeichnet als C/GLYCO/TAk-Zellen, werden durch Transfizieren des
Luciferase-Reporterplasmids
pUHC13-3 (Gossen und Bujard, ebd.) unter der Kontrolle eines tetO/Promotors
sowohl in der Anwesenheit als auch in der Abwesenheit von Tetracyclin
identifiziert. In der Abwesenheit von Tetracyclin werden positive
C/GLYCO/TAk-PCL-Zellen eine Induktion vom tetO/Promotor und induzierbare
hohe Spiegel der Luciferase liefern.
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Danach
wird das DNA-basierte Alphavirus-Vektorkonstrukt ptetSIN1gpt-luc
unter Verwendung von Lipofectamin, wie durch den Hersteller beschrieben,
stabil in die C/GLYCO/TAk-Zellen transfiziert. Ungefähr 24 Stunden
nach der Transfektion werden die Zellen trypsinisiert und in Selektionsmedien,
die für
den bestimmten Zelltyp optimiert sind (DMEM + 10% dialysiertes fötales Kälberserum;
250 μg/ml
Xanthin; 15 μg/ml
Hypoxanthin; 10 μg/ml
Thymidin; 2 μg/ml
Aminopterin; 25 μg/ml
Mycophenolsäure)
und 0,5 μg/ml
Tetracyclin enthalten, re-plattiert. Die Medien werden periodisch
durch frische Selektionsmedien ausgetauscht, und Foci von resistenten
Zellen werden wachsen gelassen. Die Zellen werden trypsinisiert
und durch limitierende Verdünnung
in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle
Zellclone werden gezüchtet
und werden für das
Screenen expandiert. Positive Hersteller-Zelllinien, die stabil
mit ptetSIN1gpt-luc transformiert wurden, werden durch Entfernen
des Tetracyclins für
mindestens 24 h aus den Medien und Testen auf Luciferase in den
Zelllysaten und auch Testen auf den verpackten Luciferase-Vektor
in den Kulturüberständen, wie
vorher beschrieben, identifiziert.
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B. Alphavirus-DNA-Vektoren mit einer Regulierung
auf zwei Ebenen
-
In
bevorzugten Ausführungsformen
kann es wünschenswert
sein, einen DNA-basierten
Alphavirus-Vektor (Wildtyp oder mit dem erwünschten Phänotyp der reduzierten, verzögerten oder
ohne Inhibition der Wirts-Makromolekülsynthese) zu konstruieren,
worin die Transkription des RNA-Vektormoleküls, das zur autokatalytischen
Amplifizierung in der Lage ist, von einem Promotor erfolgt, der
durch zwei Ebenen der Regulierung streng kontrolliert wird, um alle
Grundspiegel der Transkription zu eliminieren. Solch ein Ansatz
kann eine induzierbare Komponente (z. B. das tet-System von oben)
mit einer reversiblen transkriptionellen Silencing-Komponente kombinieren.
Zum Beispiel kann die KRAB-Expressionsdomäne eines bestimmten Zinkfinger-Proteins
verwendet werden.
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Kurz,
KRAB (Krüppel-assoziierte
Box)-Domänen
sind hochkonservierte Sequenzen, die in den aminoterminalen Regionen
von mehr als einem Drittel aller Krüppel-Klasse-Cys2His2-Zinkfinger-Proteine vorhanden sind. Die
Domänen
enthalten zwei vorhergesagte amphipathische α-Helices, und es ist gezeigt
worden, dass sie als DNA-Bindungs-abhängige, RNA-Polymerase II-transkriptionelle
Repressoren wirken (zum Beispiel Licht et al., Nature 346: 76-79,
1990). Wie andere Transkriptionsfaktoren sind die aktive Repressionsdomäne und die
DNA-Bindungsdomäne ausgeprägt und trennbar.
Daher kann die Repressionsdomäne
als ein Fusionsprotein für
ein Targeting mit jedem sequenzspezifischen DNA-Bindungsprotein verknüpft werden.
Idealerweise kann die DNA-Bindungsprotein-Komponente in einer regulatorischen
Weise reversibel von der Bindung abgehalten werden, wodurch das
transkriptionelle Silencing „ab" geschaltet wird.
Zum Beispiel wird in einer Ausführungsform
die KRAB-Domäne
von menschlichem Kox1 (Thiesen, New Biol. 2: 363-374, 1990) an das DNA-bindende
Lactose (lac)-Repressorprotein fusioniert, was einen transkriptionellen
Hybrid-Silencer mit reversibler, sequenzspezifischer Bindung an
eine lac-Operator-Sequenz bildet, der unmittelbar benachbart zum tet-responsiven
Promotor konstruiert wird (30).
In dieser Konfiguration wird die konstitutive Expression der lac-Repressor/KRAB-Domänen-Fusion (rKR) in der
Bindung an die lac-Operator-Sequenz und der Eliminierung jeglicher
durchlässigen
(„leaky") Grundtranskription
vom nicht-induzierten tet-responsiven
Promotor resultieren. Wenn die Vektorexpression erwünscht wird
und Tetracyclin aus dem System entfernt wird, wird IPTG zugefügt, um ein
rKR-vermitteltes
transkriptionelles Silencing zu verhindern.
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Zusätzlich werden
die KRAB-Domänen
von anderen Zinkfinger-Proteinen, zum Beispiel ZNF133 (Tommerup
et al., Hum. Mol. Genet. 2: 1571-1575, 1993), ZNF91 (Bellefroid
et al., EMBO J. 12: 1363-1374, 1993), ZNF2 (Rosati et al., Nucleic
Acids Res. 19: 5661-5667, 1991) und anderen, sowie andere transferierbare
Repressor-Domänen,
zum Beispiel Drosophila en- oder eve-Gene (Jaynes und O'Farrell, EMBO J.
10: 1427-1433, 1991; Han und Manley, Genes Dev. 7: 491-503, 1993),
menschliches Zinkfinger-Protein YY1 (Shi et al., Cell 67: 377-388,
1991), das Wilms-Tumor-Suppressor-Protein WT1 (Madden et al., Science
253: 1550-1553, 1991), der Schilddrüsenhormon-Rezeptor (Baniahmad
et al., EMBO J. 11: 1015-1023,
1992), der Retinsäure-Rezeptor
(Baniahmad et al., ebd.), Kid-1 (Witzgall et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91: 4514-4518, 1994), leicht in solch einem System verwendet.
Darüber
hinaus kann die lac-Repressor/lac-Operator-Komponente dieses Systems
durch jede Zahl von anderen regulierbaren Systemen, die von anderen
Quellen abstammen, substituiert werden, zum Beispiel die Tryptophan-
und Maltose-Operons,
GAL4 usw.
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Genau
gesagt wird eine Expressionskassette, die das lac-Repressor (lacI)-Protein, fusioniert
an die KRAB-Domäne
von menschlichem Kox1, mit einer verknüpften nuklearen Lokalisationssequenz
(NLS; Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys (SEQ. ID. NO. 100); Kalderon et al.,
Cell 39: 499-509, 1984) enthält,
um das Protein wirksamer zurück
in den Nukleus zu leiten, durch überlappende
PCR konstruiert. In der PCR-Reaktion #1 wird die ungefähr 1100
bp lange lacI-Sequenz durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer 1,5
Minuten-Extension von dem Matrizenplasmid p3'SS (Stratagene, La Jolla, Ka.) unter
Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die
gestaltet sind, um auch eine flankierende XhoI-Stelle und ein AUG-Startcodon
in gutem Translationsinitiation- Zusammenhang
auf dem Stromaufwärts-Primer
und die große
T-Antigen-nukleäre
Lokalisierungssequenz von SV40 auf dem anderen zu enthalten.
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In
der PCR-Reaktion #2 wird ein ungefähr 400 bp langes Amplikon,
umfassend die aminoterminale KRAB-Domäne mit 121 Resten von menschlichem
Kox1, durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer Ein-Minuten-Extension
von dem Matrizenplasmid pKox1 (Thiesen, New Biol. 2: 363-374, 1990)
unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert,
die gestaltet sind, um auch Sequenzen, die NLS und lacI überlappen,
auf einem Primer und eine SacI-/-Restriktionsstelle und ein Stoppcodon
auf dem anderen zu enthalten.
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Nach
der Amplifizierung werden die DNA-Fragmente mit QIAquick-spin gereinigt
und zusammen als Matrizen in einer nachfolgenden drei-Zyklus-PCR-Reaktion
mit 2,5 Minuten Extension unter Verwendung von zusätzlichen
LacI5'F- und KRAB3'R-Primern verwendet. Das resultierende überlappende
PCR-Amplikon von ungefähr
1500 bp wird unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt, mit XhoI
und SacI verdaut und in das eukaryontische Expressionsvektor-Plasmid
pEUK-C1 (Clontech, Palo Alto, Ka.) ligiert, das auch mit XhoI und SacI
verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7%
Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden ist.
Das resultierende lacI/KRAB-Expressionskonstrukt
wird pEUK-rKR bezeichnet.
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Um
stabile PCL-Transformanten, enthaltend die lacI/KRAB-Expressionskassette,
herzustellen, wird eine Alphavirus-PCL, die bereits auf die Transformation
mit einer rTA tet/Transaktivator-Fusionsprotein-Kassette selektiert
worden ist, als Ausgangsmaterial verwendet. Zum Beispiel werden
Alphavirus C/GLYCO/TAk-PCL-Zellen (von oben) durch Co-Transfektion
mit einem anderen Plasmid, codierend einen selektierbaren Marker,
mit dem Plasmid pEUK-rKR stabil transformiert. Die Plasmide pEUK-rKR
und pPUR, codierend einen selektierbaren Puromycin-Acetyltransferase-Marker
(Clontech), werden in C/GLYCO/TAk-PCL-Zellen (oder andere PCL) in einem molaren
Verhältnis
von 40:1 unter Verwendung von Lipofectamin, wie durch den Hersteller
beschrieben, co-transfiziert. Ungefähr 24 Stunden nach der Transfektion
werden die Zellen trypsinisiert und in Medien, enthaltend 0,5 μg/ml Puromycin
und 0,5 μg/ml
Tetracyclin, re-plattiert. Die Medien werden periodisch durch frische,
Wirkstoff-enthaltende Medien ausgetauscht, und Foci von resistenten
Zellen werden wachsen gelassen. Die Zellen werden trypsinisiert
und durch limitierende Verdünnung
in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle
Zellclone werden gezüchtet
und werden für
das Screenen expandiert. Positive pEUK-rKR-enthaltende Verpackungszellclone,
bezeichnet als C/G/TAk/rKR-Zellen, werden durch Immunfärben mit
einem polyclonalen Antiserum, das spezifisch für lacI ist (Stratagene, La
Jolla, Ka.), identifiziert.
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Als
Nächstes
müssen
spezifische lac-Operator (lacO)-Sequenzen in den erwünschten
ptet-basierenden Alphavirusvektor (siehe oben) inseriert werden.
Zum Beispiel wird das Vektorkonstrukt ptetSIN1gpt-luc durch Verwenden
eines synthetischen Oligonucleotid-Linkers modifiziert, um mehrere
Kopien von lacO zu enthalten. Das lacO-Oligonucleotid ist gestaltet,
um eine symmetrische lacO-Sequenz,
einschließlich
der vollständigen
22 bp-Palindrom-Operatorsequenz (Simons et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81: 1624-1628, 1984; Sadler et al., Proc. Natl. Acad. Sci
USA 80: 6785-6789, 1983), und flankierende AscI-Stellen zu enthalten,
wenn es sich selbst zu einem doppelsträngigen Molekül aneinanderlagert.
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Das
LacOsymA-Oligo ist an sich selbst angelagert, um ein „klebrig-endendes" AscI-DNA-Fragment zu bilden,
und wird dann in das Plasmid ptetSIN1gpt-luc ligiert, das mit AscI
verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7%
Gel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden ist. Clone,
die eine, zwei, drei oder mehrere Tandem-Kopien der lacO-Sequenz
enthalten, werden durch Sequenzanalyse identifiziert, und es wird
ihnen die Bezeichnung pOItetSIN1gpt-luc, pOIltetSIN1gpt-luc, pOIIltetSIN1gpt-luc, usw.
gegeben. Individuelle Clone mit verschiedenen lacO-Kopienzahlen
werden dann transfiziert, wie unten im Detail beschrieben, und auf
die engste Ebene der transkriptionellen Regulierung getestet.
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Um
eine Alphavirusvektor-Hersteller-Zelllinie herzustellen, werden
die DNA-basierten pOtetSIN1gpt-luc-Vektorkonstrukte
unter Verwendung von Lipofectamin, wie durch den Hersteller beschrieben,
stabil in C/G/TAk/rKR-Zellen transfiziert. Ungefähr 24 Stunden nach der Transfektion
werden die Zellen trypsinisiert und in Selektionsmedien, die für den bestimmten
Zelltyp optimiert sind (DMEM + 10% dialysiertes fötales Kälberserum;
250 μg/ml
Xanthin; 15 μg/ml
Hypoxanthin; 10 μg/ml
Thymidin; 2 μg/ml
Aminopterin; 25 μg/ml
Mycophenolsäure)
und 0,5 μg/ml
Tetracyclin enthalten, re-plattiert. Die Medien werden periodisch
durch frische Selektionsmedien ersetzt, und Foci von resistenten
Zellen werden wachsen gelassen. Die Zellen werden trypsinisiert
und durch limitierende Verdünnung
in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle
Zellclone werden gezüchtet
und werden für
ein Screenen expandiert. Positive Hersteller-Zelllinien, die stabil
mit den pOtetSIN1gpt-luc-Konstrukten transformiert sind, werden
durch die Expression der Luciferase (vorher beschrieben) mindestens
24 h nach dem Entfernen von Tetracyclin aus den Medien und der Zugabe von
20 mM IPTG für
die Induktion identifiziert. Die Luciferase-Aktivität wird sowohl
an Hersteller-Zelllysaten als auch nach Experimenten zur Übertragung
der Expression unter Verwendung der Kulturüberstände bestimmt.
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Zusätzliche
Ebenen der Kontrolle können
durch Zufügen
einer dritten oder sogar vierten Ebene der Regulation des Promotors,
der für
die Transkription des Alphavirus-Vektormoleküls verantwortlich ist, inkorporiert
werden. Solch eine zusätzliche
Ebene der Regulation kann in den minimalen Promotor inkorporiert
werden und kann andere induzierbare Systeme und/oder eine Zelldifferenzierungs-Kontrolle involvieren.
In jedem der obigen Fälle
kann eine stabile Transformierung als eine Integration in das Wirtszell-Chromosom
oder als ein extrachromosomales Episom unter Verwendung zum Beispiel
des episomal-basierten EBV-Vektorpromotors (für nicht-integrierte)
erreicht werden.
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BEISPIEL 8
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VERFAHREN FÜR DIE HERSTELLUNG VON ALPHAVIRUS-ABGELEITETEN
LEEREN ODER CHIMÄREN VIRALEN
PARTIKELN
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Wie
im Beispiel 6 illustriert, können
individuelle defekte Helfer (DH)-Expressionskassetten
konstruiert werden, um Elemente von mehreren Alphaviren oder ihren
Varianten zu enthalten. Daher können,
wie im Beispiel 6 beschrieben, DH-Kassetten mit gespaltenen Strukturgenen
für die
Expression der viralen Glycoproteine konstruiert werden, um die
Capsid- und Glycoproteingene von anderen Alphavirusspezies zu enthalten.
Zum Beispiel könnte
eine solche heterologe Alphavirus-Glycoprotein-DH-Kassette das Capsidgen
des Ross River-Virus (RRV) und die Glycoprotein-Gene des Sindbis-Virus
enthalten. In dieser Konfiguration dient das RRV-Capsidgen, um den
Spiegel der Translation der Glycoprotein-Gene zu verstärken.
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Die
hierin beschriebenen Konfigurationen für die heterologen Alphavirus-Glycoprotein-DH-Kassetten sind
gestaltet, um die Verpackung von Vektor-Replikons in Alphaviruspartikel
zu verbessern, verringern jedoch die Möglichkeit der Rekombination,
was in der Bildung eines replikationskompetenten Alphavirus resultiert.
Die heterologe Alphavirus-Glycoprotein-DH-Expressionskassette ist
ein Ersatz des Sindbis-Virus-Capsidgens in den DH-Expressionskassetten,
die im Beispiel 6 beschrieben sind („genomische” Strukturprotein-Gen-PCL), mit
einem heterologen Alphavirus-Capsidgen (z. B. RRV). Die zweite DH-Expressionskassette
in der PCL mit gespaltenen Strukturgenen enthält zum Beispiel das Sindbis-Virus-Capsidgen. Daher
kann eine PCL mit gespaltenen Strukturgenen für die Herstellung von rekombinanten
Alphavirus-Vektorpartikeln, die Sindbis-Virus-Strukturproteine aufweisen,
abgeleitet werden, zum Beispiel mit den Sindbis-Virus-Glycoproteingenen
und den Capsidgenen auf individuellen DH-Expressionskassetten.
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Es
ist kürzlich
gezeigt worden, dass chimäre
Viren, die alle Gene von RRV, aber mit dem Capsidgen des Sindbis-Virus
oder des reziproken chimären
Virus enthalten, sich nicht zu infektiösen Viruspartikeln zusammenlagern
(Lopez et al., J. Virol. 68: 1316-1323, 1994). Die Autoren schlossen
in diesem Bericht, dass die Interaktion zwischen dem Carboxyterminus
des Glycoproteins E2 und dem Capsidprotein in der Viruszusammenlagerung
nicht zwischen den Strukturproteinen von heterologen Alphaviren
erfolgen kann. Daher sollten rekombinante Genome, die aus den Alphavirus-PCLs
mit gespaltenen Strukturgenen, die in Beispiel 6 beschrieben sind,
hervorgehen, bestehend aus den Sindbis-Virus-Nichtstrukturprotein-Genen (die vom
Vektor-Replikon stammen), dem RRV-Capsidgen und den Sindbis-Virus-Glycoprotein-Genen,
nicht replikationskompetent sein, was in der Vermehrung des Virus
resultiert (replikationskompetentes Sindbis-Virus, RCSV). Die Verpackungs-Einschränkung zwischen
heterologen Alphavirus-Spezies
erlaubt die Konstruktion von DH-Kassetten, die das Capsidgen, einschließlich des
translationellen Enhancer-Elements, von einem Alphavirus und die
Glycoprotein-Gene von einem anderen Alphavirus umfassen.
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Wie
jedoch in 31 gezeigt, ist die Beobachtung
von Lopez et al. (ebd.), dass zwischen den Strukturproteinen von
heterologen Alphaviren keine Zusammenlagerung erfolgen kann, nicht
korrekt. In der Tat produziert eine DH-Kassette, bestehend aus dem RRV-Capsidgen
und dem Sindbis-Virus-Glycoprotein-Gen, infektiöse Viruspartikel. Kurz, in
BHK-Zellen wurden SINrep/LacZ-Replikon (Bredenbeek et al., J. Virol.,
67: 6439-6446, 1993) und DH-BB (5' tRNA/SIN) Crrv (Beispiel 6 und 24; RRV-Capsid/Sindbis-Virus-Glycoproteine) in
vitro-transkribierten
RNAs durch Elektroporation gemeinsam eingeführt. Die Elektroporation und
in vitro-Transkriptionen wurden, wie im Beispiel 1 beschrieben,
durchgeführt.
Nach der Elektroporation wurden die BHK-Zellen mit Dactinomycin
behandelt und mit [3H]Uridin markiert, genau
wie im Beispiel 1 beschrieben. 18 Stunden nach der Elektroporation
wurde das Kulturmedium gewonnen und durch Zentrifugation bei 6000
UpM für
10 min geklärt.
Die Vektorpartikel, die im Überstand
verblieben, wurden nach vorherigem Überschichten über ein
Saccharose-Polster durch Ultrazentrifugation pelletiert. Die RNA
wurde 18 Stunden nach der Elektroporation von den BHK-Zellen und
vom Viruspellet isoliert, auf denaturierenden Glyoxal-Agarosegelen
einer Elektrophorese unterzogen und durch Autoradiographie sichtbar
gemacht, genau wie im Beispiel 1 beschrieben. Die viralen RNAs,
die in den BHK-Zellen, die mit SINrep/LacZ- und DH-BB Crrv-RNAs
durch Elektroporation behandelt wurden, und in Viruspartikeln vorhanden
sind, sind in 31 gezeigt (Bahn 1, Feld A
und Bahn 1, Feld B). Die RNAs, die den genomischen und subgenomischen
replikativen Spezies für
SINrep/LacZ- und DH-BB Crrv-RNAs entsprachen, waren sowohl in durch
Elektroporation behandelten BHK-Zellen als auch den produzierten
Viruspartikeln vorhanden. Die Ergebnisse zeigen im Gegensatz zu
Lopez et al. (ebd.) die Bildung von chimären Alphaviruspartikeln, die
aus einem RRV-Capsidprotein und Sindbis-Virus-Glycoproteinen bestehen.
Weiterhin weist die unterschiedslose Verpackung von genomischen
und subgenomischen SINrep/LacZ- und DH-BB Crrv-RNAs in chimären Alphaviruspartikeln
auf die Unfähigkeit
des Ross River-Capsidproteins hin, spezifisch die Sindbis-Virus-Verpackungssequenz,
die im nsP1-Gen des SINrep/LacZ-Vektor-Replikons vorhanden ist, zu erkennen.
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Die
viralen Proteine, die in BHK-Zellen vorhanden sind, die mit SINrep/LacZ- und DH-BB Crrv-RNAs durch
Elektroporation behandelt wurden, 18 Stunden nach der Elektroporation
und die produzierten Viruspartikel sind in 32 (Bahn
1, Feld A, und Bahn 1, Feld B) angegeben. Die viral-spezifischen
Strukturproteine in durch Elektroporation behandelten Zellen und
die produzierten chimären
Alphaviruspartikel waren nicht unterscheidbar. Das heißt, 32 zeigt deutlich, dass Viruspartikel, die von
BHK-Zellen produziert werden, die mit SINrep/LacZ- und DH-BB Crrv-RNAs
durch Elektroporation behandelt wurden, das RRV-Capsid und die Sindbis-Virus-Glycoproteine E1
und E2 enthielten. Dieses Ergebnis liefert einen unumstrittenen
Hinweis, dass es im Gegensatz zu Lopez et al. (ebd.) keine Einschränkung in
der Zusammenlagerung zwischen heterologen Alphavirus-Capsid- und
Glycoproteinen gibt, die die Bildung von chimären viralen Partikeln verhindert.
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Daher
ist der Aminoterminus des RRV-Capsidproteins in starkem Kontrast
zu den Ergebnissen und der Diskussion von Lopez et al. in der Lage,
mit dem heterologen Sindbis-Virusgenom zu binden und infektiöse chimäre Alphaviruspartikel
zu bilden. Wichtig ist, dass die frühere Schlussfolgerung, dass
es eine Einschränkung
der Viruszusammenlagerung zwischen heterologen Alphavirus- Capsidproteinen und
Glycoproteinen gibt, nicht korrekt ist. Die Herstellung von chimären Alphaviruspartikeln,
wie hier beschrieben, würde
dann auch in der Bildung von RCSV in den oben beschriebenen PCLs
mit gespaltenen Strukturgenen resultieren, da ein rekombinantes
Genom, das aus den Sindbis-Virus-Nichtstrukturprotein-Genen
(die vom Vektor-Replikon stammen), dem RRV-Capsidgen und den Sindbis-Virus-Glycoprotein-Genen
besteht, infektiöses
Virus erstellen würde.
Alternativ erlaubt dieses Fehlen der Einschränkung der Verpackung zwischen
verschiedenen Alphavirus-Strukturproteinen und Vektor-Replikons,
dass der Tropismus der Vektorpartikel modifiziert wird. Zum Beispiel
können
Sindbis-Virus-Replikons
mit den Venezuelanischen Pferde-Encephalitis-Virus-Strukturproteinen
verpackt werden, um ein lymphotropes rekombinantes Vektorpartikel
herzustellen.
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Die
in zwei getrennten, früheren
Untersuchungen beschriebenen Ergebnisse haben gezeigt, dass eine in
vitro-Verminderung der Interaktion zwischen dem Capsidprotein und
dem positiven RNA-strängigen
Genom von zwei ikosaederförmigen
Viren, die die Triangulationsnummern (T) = 3 haben, Rüben-Knittervirus (turnip crinkle
virus, TCV) und südliches
Bohnen-Mosaikvirus (SBMV), in der Disassoziierung der Viruspartikel
und der Bildung von Nucleinsäure-freien
T = 1-Partikeln
resultierte (Sorger et al. J. Mol. Biol., 191: 639-656, 1986, und
Erickson und Rossmann, Virology 116: 128-136, 1982). In der Abwesenheit
einer Nucleinsäure
wurden in vitro keine T = 3-Partikel, die ähnlich zum Wildtyp-Virus sind,
gebildet. Owen und Kuhn (J. Virol., 70: 2757-2763, 1996) untersuchten
die Verpackungseigenschaften von Sindbis-Virusgenomen, die Deletionen
im Capsid enthielten, um die Region des Capsidproteins zu identifizieren,
die für
das Bestimmen der Spezifität der
Verkapselungsreaktion in vivo benötigt wird. Ein mutiertes Virus
[CD(97-106)], das eine Deletion enthält, die den Resten 97-106 des
Capsids entspricht, verkapselte sowohl genomische als auch subgenomische RNAs,
was die Domäne
des Capsidproteins anzeigte, die für die spezifische Erkennung
des genomischen RNA-Verpackungssignals erforderlich war. In noch
einem anderen Bericht wurden die Verpackungseigenschaften von Aura-Alphavirus
untersucht (Rumenapf et al. J. Virol., 69: 1741-1746, 1995). In
dieser Untersuchung wurde ein Mechanismus für die Alphavirus-Verpackung
vorgeschlagen, der einen Capsidprotein-Verkapselungssequenz-Interaktions-Initiierungskomplex
involviert.
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Dieser
vorgeschlagene Mechanismus basiert auf Beobachtungen durch die Autoren
und andere (einschließlich
Owen und Kuhn, ebd.), in denen 26S- und 49S-Alphavirus-RNAs in T = 1-, T = 3-, T
= 4- und T = 7-Viruspartikel verpackt werden, wobei über leere
Capside, die während
der Infektion mit Alphaviren entstehen, nicht berichtet worden ist.
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Basierend
auf der oben präsentierten
Literatur und den darin enthaltenen Diskussionen sollte ein RRV-Capsidgen,
von dem die Region, die der Capsidprotein-Domäne
entspricht, die für
das Bestimmen der Spezifität
der Verkapselungsreaktion benötigt
wird, und zusätzlich
umgebende basische Reste, die elektrostatisch mit viraler RNA binden,
deletiert wurden, nicht in der Lage sein, stabile Capsidpartikel
zu bilden, die virale RNAs enthalten. Daher sollten sich die Alphavirus-Strukturproteine,
die von einer heterologen Alphavirus-DH-Kassette exprimiert werden,
die aus diesem deletierten RRV-Capsidgen und den Sindbis-Virus-Glycoprotein-Genen
besteht, nicht zu stabilen chimären
Alphaviruspartikeln zusammenlagern. Daher konnte in der PCL mit
gespaltenen Strukturgenen, die oben und im Beispiel 6 diskutiert
wurde, ein rekombinantes Genom, das aus den Sindbis-Virus-Nichtstrukturprotein-Genen,
dem RRV-Capsidgen (von dem die Region, die der Verpackungsspezifität entspricht,
und die umgebenden basischen Reste deletiert wurden) und den Sindbis-Virus-Glycoprotein-Genen
besteht, kein infektiöses
Virus herstellen. Wie im Beispiel 6 beschrieben, wird das Sindbis-Virus-Capsidprotein
von einer getrennten DH-Expressionskassette
exprimiert; daher werden die drei Sindbis-Virus-Strukturproteine
in toto exprimiert, was in der Produktion von rekombinanten Vektorpartikeln
resultiert.
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Die
Nucleotide des RRV-Capsidgens, die den vorhergesagten Regionen des
exprimierten Proteins entsprechen, das an die Sindbis-Virus-Verpackungssequenz
bindet (Weiss et al., Nuc. Acids Res., 22: 780-786, 1994, und Lopez
et al., ebd.), einschließlich
der basischen Reste, die elektrostatisch mit der viralen RNA binden,
wurden deletiert, um ein heterologes Alphavirus-Capsid-Glycoprotein-DH
zu konstruieren, das eine translationelle Steigerung und korrekte
pE2-6K-E1-Polyprotein-Prozessierung
durch post-translationelle Spaltung lieferte, jedoch keine stabilen
chimären
RRV/Sindbis-Viruspartikel zusammenlagern konnte.
33 illustriert die Hydrophobieprofile (Kyte-Dolittle)
des RRV-Capsidproteins und des Capsidproteins, das von 3 individuellen
RRV-Capsid-Genmutanten (CΔ1rrv,
CΔ2rrv und
CΔ3rrv)
exprimiert wird, in dem variierende Mengen des Capsidgens, das ein Lysin-reiches
Protein codiert, das mit der viralen Verpackungssequenz-RNA interagiert,
deletiert wurden. Die Lysin-reiche basische Region des RRV-Capsidproteins ist
in
33 gezeigt. Weiterhin zeigen die Hydrophobieprofile,
dass diese Lysin-reiche basische Region in den 3 individuellen RRV-Capsid-Genmutanten
CΔ1rrv,
CΔ2rrv und
CΔ3rrv fortscheitend
eliminiert wird.
34 zeigt die Lysin-Reste, die im exprimierten
RRV-Capsidprotein als ein Ergebnis der Deletionen in den Mutanten
CΔ1rrv, CΔ2rrv und
CΔ3rrrv
eliminiert wurden. Die unten gezeigte Tabelle gibt die Nucleotide
an, die im RRV-Genom der Konstrukte CΔ1rrv, CΔ2rrv und CΔ3rrv deletiert wurden.
Konstrukt | Deletierte
RRV-Genom-Nts. |
CΔ1rrv | 7841-7891 |
CΔ2rrv | 7796-7891 |
CΔ3rrv | 7760-7891 |
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Die
RRV-Capsidgen-Deletionen wurden auf der DH-BB Crrv-Plasmid-DNA,
illustriert in 23, konstruiert und im Beispiel
6 beschrieben. Die angezeigten RRV-Capsidgen-Sequenzen wurden durch PCR
unter Verwendung der Primer und anderer Clonierungsschritte, die
im Beispiel 6 angegeben sind, deletiert.
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Die
oben diskutierten 31 und 32 illustrieren
die virusspezifischen RNAs (31)
und Proteine (32), die in BHK-Zellen synthetisiert
wurden, die mit SINrep/LacZ und den DH-BB CΔ1rrv-, CΔ2rrv- oder CΔ3rrv-RNAs durch Elektroporation
behandelt wurden, und in viralen Partikeln vorliegen, die in den
Kulturflüssigkeiten
dieser Zellen enthalten sind. Die genomischen und subgenomischen
Spezies wurden in den durch Elektroporation behandelten Zellen für sowohl
das SINrep/LacZ-Replikon als auch alle drei DH-BB CΔ1rrv-, CΔ2rrv- oder
CΔ3rrv-DH-RNAs
nachgewiesen (31, Feld A). Dennoch wurde
das SINrep/lacZ-Replikon in Zellen, die mit den DH-RNA-enthaltenden
Deletionen im RRV-Capsidgen durch Elektroporation behandelt wurden,
nicht in Vektorpartikel verpackt, gezeigt durch das Fehlen von genomischer
Replikon-RNA in den Viruspartikeln (31,
Feld B). Weiterhin wurden genomische und subgenomische Helfer-RNAs
sehr unwirksam verpackt und waren in den Autoradiogrammen der denaturierenden
Gele kaum sichtbar (31, Feld B, Bahnen 3 und 4),
wenn die Zellen mit den DH-Molekülen
durch Elektroporation behandelt wurden, die größere Deletionen des RRV-Capsid
enthielten (CΔ2rrv
oder CΔ3rrv).
Während
genomische SINrep/lacZ-RNA (und DH-RNA in den Elektroporationen
mit CΔ2rrv
oder CΔ3rrv)
nicht in den viralen Partikeln von BHK-Zellen nachgewiesen wurde,
die mit den DHs, die Deletionen im RRV-Capsidgen enthielten, durch
Elektroporation behandelt wurden, wurden im Gegensatz dazu äquivalente
RRV-Capsidprotein- und Sindbis-Virus-Glycoprotein-Spiegel
in Viruspartikeln von Zellen beobachtet, die mit allen DH-RNAs durch Elektroporation
behandelt wurden, unabhängig
davon, ob das RRV-Capsidgen
Deletionen enthielt (32, Felder A und B). Dieses
Ergebnis zeigt, dass stabile chimäre Viruspartikel, die kein
Vektor-Replikon oder andere viralspezifische RNAs enthielten, in
BHK-Zellen gebildet wurden, die mit genomischer SINrep/lacZ-RNA
und DH-RNA durch Elektroporation behandelt wurden, wovon das Capsidprotein,
das nicht in der Lage war, an die genomische RNA zu binden, exprimiert
wurde. Die Bildung von stabilen leeren heterologen Alphaviruspartikeln ist
basierend auf den Ergebnissen und Diskussionen von früheren Untersuchern
(Lopez et al., J. Virol. 68: 1316-1323, 1994, Sorger et al. J. Mol.
Biol., 191: 639-656, 1986, Erickson und Rossmann, Virology 116: 128-136,
1982 und Rumenapf et al. J. Virol., 69: 1741-1746, 1995) unerwartet
und nicht vorhergesagt.
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Um
die Zusammensetzung der produzierten Viruspartikel zu bestimmen,
wurden BHK-Zellen mit SINrep lacZ- und den DH-RNAs, die verschiedene
RRV-Capsidgen-Konfigurationen
enthielten, wie hierin beschrieben, durch Elektroporation behandelt
und wurden danach mit Dactinomycin behandelt und mit [35S]Methionin
und [3H]Uridin markiert, wie im Beispiel
1 beschrieben. Die Konfiguration der produzierten viralen Partikel
wurde durch Ultrazentrifugation der geklärten Zellkulturmedien für 2 h bei
35000 UpM in einem SW-41-Rotor über
einen 20%–40%
(Gew./Gew.)-Saccharosegradienten bestimmt. Die Ergebnisse dieser
Untersuchung sind in den 35–37 gezeigt
und demonstrieren wieder die Bildung von stabilen, leeren heterologen
Alphaviruspartikeln. 35 zeigt die relativen Spiegel
von [35S]Methionin und [3H]Uridin,
die in Partikel inkorporiert wurden, die in BHK-Zellen, die bei hoher MOI (5) mit dem
Wildtyp-Virus Toto1101 infiziert wurden, synthetisiert wurden. 36 zeigt, dass die relativen Spiegel von [35S]Methionin und [3H]Uridin,
die in die Partikel inkorporiert wurden, die in BHK-Zellen, die
mit SINrep/lacZ- und DH-BB (5' tRNA)
Crrv(23)-RNAs durch Elektroporation behandelt
wurden, synthetisiert wurden, dieselben waren wie in Zellen, die
mit dem Wildtyp-Virus infiziert wurden. Im Gegensatz dazu zeigt 37, dass die Partikel, die in BHK-Zellen, die
mit SINrep/lacZ und DH-BB (5' tRNA)
CΔ3rrv durch
Elektroporation behandelt wurden, produziert wurden, sehr niedrige
Spiegel an inkorporiertem [3H]Uridin enthielten. 38 ist eine Zusammenstellung der 35–37 und
illustriert deutlich, dass, während
die relativen Spiegel von [35S]Methionin
und [3H]Uridin, die in die Partikel inkorporiert
wurden, in BHK-Zellen, die mit RNAs infiziert oder durch Elektroporation
behandelt wurden, die Wildtyp-Alphavirus-Capsidgene enthielten, ähnlich waren,
BHK-Zellen, die mit DH-RNA durch Elektroporation behandelt wurden,
die Deletionen der nts. 7760-7891 des RRV-Capsidgens enthielten, stabile, chimäre, leere
Alphaviruspartikel bildeten, denen SINrep/LacZ-RNA fehlte. Die Titer
der leeren Alphaviruspartikel, produziert in den Zelllinien, die
mit in vitro-transkribierten SINrep/LacZ-RNA und DH-BB CD3rrv-RNAs
durch Elektroporation behandelt und mit [35S]Methionin
markiert wurden, wurden durch Vergleich mit BHK-Zellen, die mit
dem Toto 1101-Wildtyp-Virus infiziert und mit [35S]Methionin
markiert wurden, bestimmt. Der Spiegel der Radioaktivität, der in
den Virus-enthaltenden Saccharosegradienten-Fraktionen von Toto
1101-infizierten Zellen vorhanden war, wurde quantifiziert und zu
dem Virustiter, der in diesen selben Fraktionen vorhanden war, bestimmt
durch Plaque-Test gemäß den Verfahren,
die im Beispiel 1 beschrieben sind, in Beziehung gestellt. Für Titerbestimmungen
leerer Alphaviruspartikel wurde der Spiegel der Radioaktivität, die in
Viruspartikel-enthaltenden
Saccharosegradienten-Fraktionen von BHK-Zellen vorhanden war, die
mit in vitro-transkribierten SINrep/LacZ-RNA und DH-BB CD3rrv-RNAs
durch Elektroporation behandelt wurden, quantifiziert und zu dem [35S]Methionin/Virustiter von Toto 1101-infizierten
Zellen in Beziehung gestellt. Der Titer der leeren, chimären Viruspartikel,
enthaltend das deletierte Ross River-Virus-Capsid und die Sindbis-Virus-Glycoproteine,
die in Zellen produziert wurden, die mit in vitro-transkribierter
SINrep/LacZ-RNA- und DH-BB CD3rrv-RNA durch Elektroporation behandelt
wurden, war 1 × 109 Partikel/ml.
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Während die
vorliegende Erfindung oben sowohl allgemein als auch durch bevorzugte
Ausführungsformen
beschrieben worden ist, wird verstanden, dass Variationen und Modifikationen
für Fachleute
angesichts der vorstehenden Beschreibung auftreten werden. Daher
sollen die angefügten
Ansprüche
alle solchen Variationen abdecken, die innerhalb des Rahmens der
Ansprüche
liegen.
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