DE69735419T2

DE69735419T2 - Zusammensetzungen und verfahren für taxol-biosynthese

Info

Publication number: DE69735419T2
Application number: DE69735419T
Authority: DE
Inventors: R. Mark Colfax WILDUNG; B. Rodney Pullman CROTEAU
Original assignee: University of Washington; Washington State University Research Foundation
Current assignee: University of Washington; Washington State University Research Foundation
Priority date: 1996-04-15
Filing date: 1997-04-15
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2017-04-16
Also published as: ES2259190T3; EP0907312B1; WO1997038571A1; EP0907312A4; US6114160A; CA2250693C; US6610527B1; AU2922597A; EP0907312A1; JP2000508902A; DE69735419D1; ATE319297T1; AU710405B2; CA2250693A1; US5994114A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Detektion der Diterpenoid-Biosynthese, insbesondere auf die Biosynthese von Taxoid-Verbindungen, wie zum Beispiel Taxol.
DANKSAGUNG FÜR DIE HILFE DURCH DIE REGIERUNG
Diese Erfindung wurde mittels Regierungshilfe unter dem „National Instititues of Health Grant" Nr. CA-55254 durchgeführt. Die Regierung hat bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
STAND DER TECHNIK
Das stark funktionalisierte Diterpenoid Taxol (Wani et al., J. Am. Chem. Soc. 93:2325-2327, 1971) ist als ein potentes chemotherapeutisches Mittel bekannt (Holmes et al., in Taxane Anticancer Agents: Basic Science and Current Status, Georg et al., Hrsg., S. 31–57, American Chemical Society, Washington, DC., 1995; Arbuck and Blaylock, in Taxol: Science and Applications, Suffness, Hrsg., S. 379–415, CRC Press, Boca Raton, FL, 1995). (Paclitaxel ist der generische Name für Taxol, eine registrierte Marke von Bristol-Myers Squibb.) Die Bereitstellung von Taxol aus der originalen Quelle, der Rinde der pazifischen Eibe (Taxus brevifolia Nutt.; Taxaceae) ist limitiert. Als ein Ergebnis gab es intensive Anstrengungen, um alternative Mittel zur Herstellung zu entwickeln, einschließlich der Isolierung aus dem Laub und anderen erneuerbaren Geweben von Taxus-Spezies, die in Plantagen gezüchtet werden, der Biosynthese in Gewebekultur-Systemen und der Semi-Synthese von Taxol und seinen Analoga aus fortgeschrittenen Taxan-Diperpenoid (Taxoid)-Metaboliten, welche leichter erhältlich sind (Cragg et al., J. Nat. Prod. 56:1657-1668, 1993). Die Totalsynthese von Taxol ist derzeit nicht kommerziell praktikabel (Borman, Chem. Eng. News 72(7):32-34, 1994), und es ist klar, daß in der vorhersehbaren Zukunft die Bereitstellung von Taxol und seinen synthetisch nützlichen Vorläufern auf biologischen Verfahren zur Herstellung angewiesen sein wird, und zwar entweder in Taxus-Pflanzen oder in Zellkulturen, die davon abgeleitet wurden (Suffness, in Taxane Anticancer Agents: Basic Science and Current Status, Georg et al., Hrsg., American Chemical Society, Washington, DC., 1995, S. 1–17).
Die Biosynthese von Taxol schließt die initiale Zyklisierung von Geranylgeranyldiphosphat ein, dem universalen Vorläufer der Diterpenoide (West, in Biosynthesis of Isoprenoid Compounds. Porter and Spurgeon, Hrsg., Vol. 1, S. 375–411, Wiley & Sons, New York, NY, 1981), zum Taxa-4(5),11(12)-dien (Koepp et al., J. Biol. Chem. 270:8686–8690, 1995), gefolgt von der umfassenden oxidativen Modifizierung dieses Olefins (Koepp et al., J. Biol.Chem. 270:8686–8690, 1995; Croteau et al., in Taxane Anticancer Agents: Basic Science and Current Status, Georg et al., Hrsg., S. 72–80, American Chemical Society, Washington, DC, 1995) und Ausarbeitung („elaboration") der Seitenketten (1) (Floss and Mocek, in Taxol: Science and Applications, Suffness, Hrsg., S. 191–208, CRC Press, Boca Raton, FL, 1995).
Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase („Taxadien-Synthase"), das Enzym, welches für die initiale Zyklisierung von Geranylgeranyldiphosphat verantwortlich ist, um das Taxan-Skelett zu entwerfen, wurde aus Stammgewebe von T. brevifolia isoliert, teilweise gereinigt und charakterisiert (Hezari et al., Arch. Biochem. Biophys. 322:437–444, 1995).
Obwohl Taxadien-Synthase anderen Pflanzen-Terpenoid-Zyklasen in Bezug auf die allgemeinen enzymatischen Eigenschaften ähnelt (Hezari et al., Arch. Biochem. Biophys. 322:437–444, 1995), ist es erwiesenermaßen extrem schwierig, sie in ausreichenden Mengen für die Antikörper-Präparation oder Mikrosequenzanalyse zu reinigen, was diesem Ansatz in Richtung der cDNA-Klonierung entgegenwirkt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Wir haben das Gen der Taxadien-Synthase aus pazifischer Eibe kloniert und sequenziert.
Eine Ausführungsform dieser Offenbarung schließt isolierte Polynukleotide ein, die mindestens 15 aufeinander folgende Nukleotide, bevorzugterweise mindestens 20, weiter bevorzugt mindestens 25 und am meisten bevorzugt mindestens 30 aufeinander folgende Nukleotide eines nativen Gens der Taxadien-Synthase umfassen, d. h. des Gens der Taxadien-Synthase aus pazifischer Eibe. Solche Polynukleotide sind zum Beispiel als Sonden und Primer für das Erhalten von Homologen des Gens der Taxadien-Synthase aus pazifischer Eibe nützlich, zum Beispiel durch das in Kontakt bringen einer Nukleinsäure eines Taxoidproduzierenen Organismus mit solch einer Sonde oder einem Primer unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, um der Sonde oder dem Primer zu erlauben, an ein Gen der Taxadien-Synthase des Organismus zu hybridisieren, danach isolieren des Gens der Taxadien-Synthase des Organismus, an welches die Sonde oder der Primer hybridisiert.
Eine andere Ausführungsform der Offenbarung schließt isolierte Polynukleotide ein, die eine Sequenz umfassen, welche ein Polypeptid kodiert, welches die biologische Aktivität von Taxadien-Synthase aufweist. Bevorzugterweise hat die Polypeptid-kodierende Sequenz mindestens 70%, bevorzugterweise mindestens 80% unter weiter bevorzugt mindestens 90% Nukleotidsequenz-Ähnlichkeit mit einem nativen Polynukleotidgen der Taxadien-Synthase aus pazifischer Eibe.
In bevorzugten Ausführungsformen solcher Polynukleotide kodiert die Polypeptid-kodierende Sequenz ein Polypeptid, welches nur konservative Aminosäure-Substitutionen gegenüber dem nativen Polypeptid der Taxadien-Synthase aus pazifischer Eibe aufweist, außer in einigen Ausführungsformen von Aminosäure-Substitutionen an einem oder mehreren: Cystein-Resten 329, 650, 719 und 777; Histidin-Resten 370, 415, 579 und 793; einem DDXXD-Motiv; einem DXXDD-Motiv; einem konserviertes Arginin und einem RWWK-Element. Bevorzugterweise hat das kodierte Polypeptid nur konservative Aminosäure-Substitutionen gegenüber dem Polypeptid der Taxadien-Synthase aus pazifischer Eibe oder ist vollständig homolog damit. Zusätzlich fehlt dem kodierten Polypeptid bevorzugterweise mindestens ein Teil des Transit-Peptids. Zellen, insbesondere Pflanzenzellen und transgene Pflanzen, welche solche Polynukleotide und die kodierten Polypeptide einschließen, sind ebenso beinhaltet.
Eine andere Ausführungsform der Offenbarung schließt isolierte Polypeptide ein, welche Taxadien-Synthase-Aktivität aufweisen, welche bevorzugterweise mindestens 70%, weiter bevorzugt mindestens 80% und am meisten bevorzugt mindestens 90% Homologie mit einem nativen Polypeptid der Taxadien-Synthase aufweisen. Ebenso eingeschlossen sind isolierte Polypeptide, welche mindestens 10, bevorzugterweise mindestens 20, weiter bevorzugt mindestens 30 aufeinander folgende Aminosäuren einer nativen Taxadien-Synthese aus pazifischer Eibe und am meisten bevorzugt das reife Polypeptid der Taxadien-Synthase aus pazifischer Eibe (d. h. es fehlt nur das Transit-Peptid) umfassen.
Eine andere Ausführngsform der Offenbarung der Erfindung schließt Antikörper ein, welche spezifisch für ein natives Polypeptid der Taxadien-Synthase aus pazifischer Eibe sind.
Eine andere Ausführungsform der Offenbarung schließt Verfahren zur Expression eines Polypeptids von Taxadien-Synthese in einer Zelle ein, z. B. eine Taxoid-produzierende Zelle und zwar durch Kultivieren einer Zelle, welche ein exprimierbares Polynukleotid einschließt, welches ein Polypeptid von Taxadien-Synthase kodiert, unter Bedingungen, welche für die Expression des Polypeptids geeignet sind, was bevorzugterweise zur Produktion des Taxoids in Spiegeln führt, die höher sind, als diejenigen, welche von einer andererseits ähnlichen Zelle erwartet werden würde, welcher das exprimierbare Polynukleotid fehlt.
Die vorhergehenden und andere Ausgaben und Vorteile der Offenbarung der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den beiliegenden Zeichnungen weiter offensichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Schritte in der Biosynthese von Taxol, einschließlich der initialen Zyklisierung von Geranylgeranyldiphosphat zu Taxa-4(5),11(12)-dien, gefolgt von der umfassenden oxidativen Modifizierung und Ausarbeitung der Seitenketten.
2 zeigt die Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des Taxadien-Synthase-Klons aus pazifischer Eibe pTb 42.1. Die Start- und Stop-Kodons sind unterstrichen. Die Orte der Regionen, welche für die Primer-Synthese verwendet wurden, sind doppelt unterstrichen. Die DDMAD- und DSYDD-Motive sind in Fettschrift. Konservierte Histidine (H) und Cysteine (C) und ein RWWK-Element sind durch Kästen angezeigt. Trunkierungsstellen für die Entfernung von einem Teil oder dem gesamten Transit-Peptid sind durch ein Dreieck
angezeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Eine auf Homologie basierende Klonierungsstrategie unter der Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde verwendet, um eine cDNA zu isolieren, welche die Taxadien-Synthase kodiert. Ein Satz von degenerativen Primern wurde basierend auf einer Konsensus-Sequenz von verwandten Monoterpen-, Sesquiterpen- und Diterpen-Zyklasen konstruiert. Zwei dieser Primer amplifizierten ein Fragment von 83 Basenpaaren (bp), welches Zyklaseähnlich in der Sequenz war und welches als eine Hybridisierungssonde verwendet wurde, um eine cDNA-Bibliothek zu durchsuchen, welche aus Poly(A)⁺-RNA konstruiert wurde, welche aus Stämmen pazifischer Eiben extrahiert wurde. 12 unabhägige Klone mit einer Insert-Größe mit Überschuß von 2 Kilobasen-Paaren (kb) wurden isoliert und teilweise sequenziert.
Eines dieser cDNA-Isolate wurde funktional in Escherichia coli exprimiert, was zu einem Protein führte, welches katalytisch aktiv bei der Umwandlung von Geranylgeranyldiphosphat in ein Diterpen-Olefin war, von dem durch komprimierte Kapillaren-Gaschromatographie-Massenspektrometrie (Satterwhite and Croteau, J. Chromatography 452:61–73, 1988) bestätigt wurde, daß es Taxa-4(5),11(12)-dien war.
Die cDNA-Sequenz von Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase spezifiziert einen offenen Leserahmen von 2.586 Nukleotiden. Die abgeleitete Polypeptidsequenz enthält 862 Aminosäurereste und hat ein molekulares Gewicht von 98.303 im Vergleich zu ungefähr 79.000, was zuvor für das reife native Enzym bestimmt wurde. Es scheint daher Vollänge zu sein und schließt ein langes mutmaßliches plastidisches („plastidial") Zielpeptid ein. Sequenzvergleiche mit Monoterpen, Sesquiterpen- und Diterpen-Zyklasen von pflanzlichem Ursprung zeigen ein signifikantes Maß an Ähnlichkeit zwischen diesen Enzymen ein; die Taxadien-Synthase ist der Abietadien-Synthase, einer Diterpen-Zyklase aus der Riesentanne („grand fir"), am ähnlichsten (46% Identität, 67% Ähnlichkeit).
Verwendungen des Gens der Taxadien-Synthase
Erhöhung der Taxol-Biosynthese in transformierten Zellen. Die Schlüsselreaktion („commited step") der Taxol (Paclitaxel)-Biosynthese ist die initiale Zyklisierung von Geranylgeranyl- Diphosphat, eines ubiquitären Isoprenoid-Intermediats, katalysiert von der Taxadien-Synthase, einer Diterpen-Zyklase. Das Produkt dieser Reaktion ist das Eltern-Olefin mit einem Taxan-Skelett, Taxa-4(5),11(12)-dien. Für einen Überblick über die Taxoide und Taxoid-Biochemie siehe z. B. Kingston et al., "The Taxane Diterpenoids" Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, Vol. 61, Springer Verlag, New York, 1993, S. 1–206.
Der Schlüssel-Zyklisierungsschritt („committed cyclization step") des Zielweges ist ein langsamer Schritt in der erweiterten biosynthetischen Sequenz, welche zu Taxol und verwandten Taxoiden führt (Koepp et al., J. Biol. Chem. 270:8686–8690, 1995; Hezari et al., Arch. Biochem. Biophys. 322:437–444, 1995). Die Ausbeute von Taxol und von verwandten Taxoiden (z. B. Cephalomannin, Baccatine, Taxinine unter anderem) in den Zellen eines Organismus, welcher zur Taxoid-Biosynthese in der Lage ist, wird durch die Expression in solchen Zellen eines rekombinanten Gens der Taxadien-Synthase erhöht.
Dieser Ansatz zur Erhöhung der Taxoid-Biosynthese kann in jedem Organismus verwendet werden, welcher zur Taxoid-Biosynthese in der Lage ist. Es ist bekannt, daß Taxol-Synthese zum Beispiel in den Taxaceae stattfindet, einschließlich Taxus-Spezies weltweit (einschließlich, aber nicht limitiert auf, T. brevifolia, T. baccata, T. x media, T. cuspidata, T. canadensis und T. chinensis) sowie in bestimmten Mikroorganismen. Taxol kann auch durch einen Pilz produziert werden, Taxomyces andreanae (Stierte et al., Science 260:214, 1993).
Durch Agrobacrerium tumefaciens vermittelte Transformation von Taxus-Spezies wurde beschrieben und von den resultierenden Kallus-Kulturen wurde gezeigt, daß sie Taxol produzieren (Han et al., Plant Sci. 95:187–196, 1994).
Taxol kann aus den Zellen, welche mit dem Gen der Taxadien-Synthase transformiert wurden, durch konventionelle Methoden isoliert werden. Die Produktion von Kallus- und Suspensions-Kulturen von Taxus und die Isolierung von Taxol und verwandten Verbindungen aus solchen Kulturen ist beschrieben worden (z. B. in Fett-Netto et al., Bio/Technology 10:1572–1575, 1992).
Biosynthese der Taxoide in Mikroorganismen. Wie unten diskutiert, wurde Aktivität von Taxadien-Synthese in transformierten E. coli Wirtszellen beobachtet, welche rekombinante Taxadien-Synthase exprimieren. Taxadien-Synthase benötigt für die enzymatische Funktion keine umfassende post-translationale Modifikation, wie es zum Beispiel in Säugetierzellen zur Verfügung gestellt wird. Im Ergebnis kann funktionale Taxadien-Synthase in einer großen Vielfalt von Wirtszellen exprimiert werden.
Geranylgeranyldiphosphat, ein Substrat der Taxadien-Synthase, wird in einer großen Vielfalt von Organismen produziert, einschließlich Bakterien und Hefe, welche Carotenoid-Pigmente synthetisieren (z. B. Serratia spp. und Rhodotorula spp.). Die Einführung von Vektoren, welche zur Expression von Taxadien-Synthase in der Lage sind, in solche Mikroorganismen erlaubt die Produktion von großen Mengen an Taxa-4(5),11(12)-dien und verwandten Verbindungen, welche das Taxan-Rückgrat aufweisen. Das Taxan-Rückgrat, was somit produziert wird, ist nützlich als ein chemisches Ausgangsmaterial. Einfache Taxoide würden zum Beispiel als Parfüm-Fixiermittel nützlich sein.
Klonierung von Homologen der Taxandien-Synthase und verwandter Gene. Die Verfügbarkeit des Gens der Taxadien-Synthase aus pazifischer Eibe macht die Klonierung von Homologen der Taxadien-Synthase aus anderen Organismen, welche zur Taxoid-Biosynthese in der Lage sind, insbesondere Taxus spp., möglich. Obwohl der Anteil üblicher Taxoide in den Spezies oder Sorten von Eibe, welche untersucht wurden, variiert, synthetisieren alle Taxus-Spezies offensichtlich Taxoide, einschließlich Taxol, in einem gewissen Ausmaß (siehe z. B. Mattina and Palva, J. Environ. Hort. 10:187–191, 1992; Miller, J. Natural Products 43:425–437, 1980). Taxol kann auch durch einen Pilz Taxomyces andreanae, produziert werden (Stierte et al., Science 260:214, 1993).
Ein Gen der Taxadien-Synthase kann durch konventionelle Methoden durch die Verwendung von Primern oder Sonden, die auf der Gensequenz der Taxadien-Synthase aus pazifischer Eibe basieren, oder durch Antikörper, welche für Taxadien-Synthase spezifisch sind, aus jedem Organismus isoliert werden, welcher zur Produktion von Taxol oder verwandten Taxoiden in der Lage ist.
Modifizierte Formen des Gens und des Polypeptids der Taxadien-Synthase. Die Kenntnis der Gensequenz von Taxadien-Synthase erlaubt die Modifizierung der Sequenz, wie ausführlicher unten beschrieben, um Variantenformen des Gens und des Polypeptid-Genproduktes zu produzieren. Zum Beispiel kann das plastidische („plastidial") Transit-Peptid entfernt werden und/oder kann durch andere Transit-Peptide ersetzt werden, um dem Genprodukt zu erlauben, daß es in verschiedene intrazelluläre Kompartimente geleitet wird oder aus einer Wirtszelle exportiert wird.
DEFINITIONEN UND METHODEN
Die folgenden Definitionen und Methoden werden zur Verfügung gestellt, um die vorliegende Offenbarung besser zu definieren und die Durchschnitts-Fachleute auf dem Gebiet bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung zu leiten. Definitionen für übliche Begriffe in der Molekularbiologie können ebenso in Rieger et al., Glossary of Genetics. Classical and Molecular, 5. Auflage, Springer-Verlag, New York, 1991 und Lewin, Genes V, Oxford University Press, New York, 1994 gefunden werden.
Der Begriff „Pflanze" umfaßt jede Pflanze und deren Abkömmlinge. Der Begriff umfaßt auch Teile von Pflanzen, einschließlich Samen, Ausschnitte, Knollen, Früchte, Blüten etc.
Eine „reproduktive Einheit" einer Pflanze ist jeder totipotente Teil oder jedes totipotente Gewebe der Pflanze, von welchem man einen Abkömmling der Pflanze erhalten kann, einschließlich zum Beispiel Samen, Ausschnitte, Knospen, Zwiebeln, somatische Embryos, kultivierte Zelle (z. B. Kallus- oder Suspensions-Kulturen) etc.
Nukleinsäuren
Nukleinsäuren (ein Begriff, welcher hierin austauschbar mit „Polynukleotiden" verwendet wird), die bei der Umsetzung der vorliegenden Offenbarung nützlich sind, schließen das isolierte Gen der Taxadien-Synthase, seine Homologe in anderen Pflanzenspezies und Fragmente und Varianten davon ein.
Der Begriff „Gen der Taxadien-Synthase" bezieht sich auf eine Nukleinsäure, welche eine Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthasesequenz enthält, bevorzugterweise eine Nukleinsäure, welche ein Polypeptid kodiert, das enzymatische Aktivität der Taxadien-Synthase aufweist. Dieser Begriff bezieht sich primär auf die isolierte Vollängen-cDNA der Taxadien-Synthase aus pazifischer Eibe, welche oben diskutiert wurde und in 2 gezeigt ist, und die korrespondierende genomische Sequenz, einschließlich flankierende oder interne Sequenzen, die damit funktionsfähig verbunden sind, einschließlich regulatorische Elemente und/oder Intron-Sequenzen.
Dieser Begriff umfaßt auch Allele des Gens der Taxadien-Synthase aus pazifischer Eibe.
„Nativ". Der Begriff „nativ" bezieht sich auf eine natürlich vorkommende („Wildtyp"-) Nukleinsäure oder Polypeptid.
„Homolog". Ein „Homolog" des Gens der Taxadien-Synthase ist eine Gensequenz, die für eine Taxadien-Synthase kodiert, welche aus einem anderen Organismus als der pazifischen Eibe isoliert wurde.
„Isoliert". Eine „isolierte" Nukleinsäure ist eine, die im wesentlichen von anderen Nukleinsäuresequenzen in der Zelle des Organismus, in welchem die Nukleinsäure natürlicherweise vorkommt, d. h. anderer chromosomaler und extra-chromosomaler DNA und RNA, separiert oder gereinigt wurde durch konventionelle Nukleinsäure-Reinigungsmethoden. Der Begriff bezieht auch rekombinante Nukleinsäuren und chemisch synthetisierte Nukleinsäuren ein.
Fragmente, Sonden und Primer. Ein Fragment einer Nukleinsäure der Taxadien-Synthase gemäß der vorliegenden Offenbarung ist ein Teil der Nukleinsäure, welcher weniger als Vollänge ist und mindestens eine minimale Länge umfaßt, die zur spezifischen Hybridisierung mit der Nukleinsäure der Taxadien-Synthase aus 2 unter stringenten Hybridisierungsbedingungen in der Lage ist. Die Länge eines solchen Fragments ist bevorzugterweise 15 bis 17 Nukleotide oder mehr.
Nukleinsäure-Sonden und -Primer können basierend auf der Gensequenz der Taxadien-Synthase, welche in 2 zur Verfügung gestellt wird, präpariert werden. Eine „Sonde" ist eine isolierte DNA oder RNA, welche an eine detektierbare Markierung oder ein Reportermolekül, z. B. ein radioaktives Isotop, ein Ligand, ein chemolumineszierendes Mittel oder Enzym, angehängt ist. „Primer" sind isolierte Nukleinsäuren, im allgemeinen DNA-Oligonukleotide von einer Länge von 15 Nukleotiden oder mehr, welche an einen komplementären Ziel-DNA-Strang durch Nukleinsäure-Hybridisierung angelagert sind, um einen Hybrid zwischen dem Primer und dem Ziel-DNA-Strang zu bilden, und welche dann entlang des Ziel-DNA-Stranges durch eine Polymerase, z. B. eine DNA-Polymerase, verlängert werden. Primer-Paare können für die Amplifizierung einer Nukleinsäure-Sequenz verwendet werden, z. B. durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder andere konventionelle Nukleinsäure-Amplifizierungsmethoden.
Methoden für die Präparation und Verwendung von Sonden und Primern werden zum Beispiel beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Vol. 1–3, Hrsg. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987 (mit periodischen Aktualisierungen) und Innis et al., PCR-Protokolle. A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. PCR-Primer-Paare können von einer bekannten Sequenz zum Beispiel unter der Verwendung von Computerprogrammen, welche für diesen Zweck entwickelt wurden, wie zum Beispiel Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA) abgeleitet werden.
Nukleotidsequenz-Ähnlichkeit. Nukleotidsequenz-„Ähnlichkeit" ist ein Maß des Grades, mit welchem zwei Polynukleotid-Sequenzen identische Nukleotidbasen in korrespondierenden Positionen in ihrer Sequenz aufweisen, wenn sie optimal abgeglichen sind (mit geeigneten Nukleotid-Insertionen oder -Deletionen). Sequenz-Ähnlichkeit kann unter der Verwendung von Sequenzanalyse-Software bestimmt werden, wie zum Beispiel dem Sequence Analysis Software Package der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI. Bevorzugterweise hat eine Varianten-Form eines Polynukleotids der Taxadien-Synthase mindestens 70%, weiter bevorzugt mindestens 80% und am meisten bevorzugt mindestens 90% Nukleotidsequenz-Ähnlichkeit mit einem nativen Gen der Taxadien-Synthase, insbesondere mit einer nativen Taxadien-Synthase aus pazifischer Eibe, wie in 2 zur Verfügung gestellt.
Funktionsfähig verbunden. Eine erste Nukleinsäure-Sequenz ist „funktionsfähig" verbunden mit einer zweiten Nukleinsäure-Sequenz, wenn die erste Nukleinsäure-Sequenz in einer funktionelle Beziehung mit der zweiten Nukleinsäure-Sequenz angeordnet ist. Zum Beispiel ist ein Promoter funktionsfähig verbunden mit einer kodierenden Sequenz, wenn der Promoter die Transkription oder Expression der kodierenden Sequenz beeinflußt. Im allgemeinen sind funktionsfähig verbundene DNA-Sequenzen zusammenhängend und, wo notwendig, um zwei Protein-kodierende Regionen zu verbinden, im Leserahmen.
„Rekombinant". Eine „rekombinante" Nukleinsäure ist ein isoliertes Polypeptid, welches durch eine künstliche Kombination von zwei andererseits separierten Segmenten der Sequenz hergestellt wird, zum Beispiel durch chemische Synthese oder durch die Manipulation von isolierten Segmenten von Nukleinsäuren mittels Gentechnik-Verfahren.
Verfahren für die Nukleinsäure-Manipulation werden im allgemeinen in zum Beispiel Sambrook et al. (1989) und Ausubel et al. (1987, mit periotischen Aktualisierungen) beschrieben. Methoden für die chemische Synthese von Nukleinsäuren werden zum Beispiel diskutiert in: Beaucage and Carruthers, Tetra. Letts. 22:1859–1862, 1981 und Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185, 1981. Die chemische Synthese von Nukleinsäuren kann zum Beispiel an kommerziellen automatisierten Oligonukleotid-Synthesizern durchgeführt werden.
Präparation von rekombinanten oder chemisch synthetisierten Nukleinsäuren Vektoren Transformationen, Wirtszellen. Natürliche oder synthetische Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung können in rekombinante Nukleinsäure-Konstrukte eingefügt werden, typischerweise DNA-Konstrukte, welche zur Einführung und zur Replikation in einer Wirtszelle in der Lage sind. Solch ein Konstrukt ist bevorzugterweise ein Vektor, welcher ein Replikationssystem und Sequenzen einschließt, welche zur Transkription und Translation einer für ein Polypeptid kodierenden Sequenz in einer gegebenen Wirtszelle in der Lage sind. Für die Anwendung der vorliegenden Erfindung werden konventionelle Zusammensetzungen und Methoden für die Präparation und Verwendung von Vektoren und Wirtszellen verwendet, wie diskutiert inter alia in Sambrook et al., 1989 oder Ausubel et al. 1987.
Eine „transformierte" oder „transgene" Zelle, ein „transformiertes" oder „transgenes" Gewebe, Organ oder „transformierter" oder „transgener" Organismus ist eine/eines/einer, in welcher) eine fremde Nukleinsäure eingeführt wurde. Eine „transgene" oder „transformierte" Zelle oder Organismus schließen ebenso ein (1) Nachkommen der Zelle oder des Organismus und (2) Nachkommen, welche mittels eines Zuchtprogramms produziert werden, das eine „transgene" Pflanze als ein Elternteil in einer Kreuzung verwendet und einen veränderten Phenotyp zeigt, was von der Anwesenheit des „Transgens" resultiert, d. h. der rekombinanten Nukleinsäure der Taxadien-Synthase.
Nukleinsäure-Hybridisierung; „stringente Bedingungen"; „spezifisch". Die Nukleinsäure-Sonden und -Primer der vorliegenden Erfindung hybridisieren unter stringenten Bedingungen an eine Ziel-DNA-Sequenz, zum Beispiel an das Gen der Taxadien-Synthase.
Der Begriff „stringente Bedingungen" wird funktional definiert in Bezug auf die Hybridisierung einer Nukleinsäure-Sonde an eine Ziel-Nukleinsäure (d. h. an eine bestimmte Nukleinsäure-Sequenz von Interesse) durch die Hybridisierungs-Prozedur, die in Sambrook et al., 1989, in 9.52 bis 9.55 diskutiert wird. Siehe auch Sambrook et al., 1989 in 9.47 bis 9.52, 9.56 bis 9.58; Kanehisa, Nucl. Acids Res. 12:203–213, 1984 und Wetmur and Davidson, J. Mol. Biol. 31:349–370, 1968.
In Bezug auf die Amplifizierung einer Target-Nukleinsäure-Sequenz (z. B. durch PCR) unter der Verwendung eines bestimmten Amplifizierungs-Primer-Paares sind stringente Bedingungen die Bedingungen, welche dem Primer-Paar erlauben, nur an die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz zu hybridisieren, an die ein Primer, der die korrespondierende Wildtyp-Sequenz (oder sein Komplement) aufweist, binden würde, und welche bevorzugterweise ein einzigartiges Amplifizierungs-Produkt produzieren.
Der Begriff „spezifisch für (eine Ziel-Sequenz)" zeigt an, daß eine Sonde oder ein Primer unter stringenten Bedingungen nur an die Ziel-Sequenz in einer Probe hybridisiert, welche die Zielsequenz umfaßt.
Nukleinsäure-Amplifizierung. Wie hierin verwendet, bezieht sich „amplifizierte DNA" auf das Produkt der Nukleinsäure-Amplifizierung einer Ziel-Nukleinsäure-Sequenz. Die Nukleinsäure-Amplifizierung kann durch jede der verschiedenen Nukleinsäure-Amplifizierungsmethoden, die im Stand der Technik bekannt sind, ausgeführt werden, einschließlich der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Eine Vielfalt von Amplifizierungsmethoden sind im Stand der Technik bekannt und werden beschrieben, inter alia, in U.S. Patent Nr. 4,683,195 und Nr. 4,683,202 und in PCR-Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Hrsg., Academic Press, San Diego, 1990.
Methoden zur Herstellung von cDNA-Klonen, welche Taxadien-Synthase oder deren Homologe kodieren. Basierend auf der Verfügbarkeit der cDNA der Taxadien-Synthase, wie hierin offenbart, können andere Gene der Taxadien-Synthase (z. B. Allele und Homologe der Taxadien-Synthase) leicht aus einer großen Vielfalt von Pflanzen durch Klonierungsmethoden, die im Stand der Technik bekannt sind, erhalten werden.
Ein oder mehrere Primer-Paare, die auf der Sequenz der Taxadien-Synthase basieren, können verwendet werden, um die Gene der Taxadien-Synthase oder deren Homologe durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder andere konventionelle Amplifizierungsmethoden zu amplifizieren. Alternativ dazu kann die offenbarte cDNA der Taxadien-Synthase oder Fragmente davon verwendet werden, um eine cDNA- oder genomische Bibliothek zu sondieren, welche aus einer gegebenen Pflanzen-Spezies durch konventionelle Methoden hergestellt wurde.
Klonierung der genomischen Sequenz der Taxadien-Synthase und Homologen davon. Die Verfügbarkeit der cDNA-Sequenz der Taxadien-Synthase befähigt die Fachleute, einen genomischen Klon zu erhalten, welcher mit der cDNA der Taxadien-Synthase korrespondiert (einschließlich des Promoters und anderer regulatorischer Regionen und Intron-Sequenzen), und die Bestimmung seiner Nukleotid-Sequenz mittels konventioneller Methoden.
Nahezu alle Taxus-Spezies synthetisieren Taxoide, einschließlich Taxol, zu einem gewissen Grad (siehe z. B. Mattina and Palva, J. Environ. Hort. 10:187–191, 1992; Miller, J. Natural Products 43:425–437, 1980). Von jedem Organismus, der Taxoide produziert, würde erwartet werden, daß er ein Homolog der Taxadien-Synthase exprimiert. Gene der Taxadien-Synthase können durch Hybridisierung einer Sonde der Taxadien-Synthase der pazifischen Eibe an eine cDNA oder genomische Bibliothek einer Ziel-Spezies erhalten werden. Solch ein Homolog kann auch durch PCR oder andere Amplifizierungsmethoden aus genomischer DNA oder RNA einer Ziel-Spezies erhalten werden unter der Verwendung von Primern, die auf der Sequenz der Taxadien-Synthase, wie in 2 gezeigt, basieren. Genomische und cDNA- Bibliotheken von der Eibe oder anderen Pflanzen-Spezies können mittels konventioneller Methoden präpariert werden.
Primer und Sonden, die auf der in 2 gezeigten Sequenz basieren, können verwendet werden, um die Sequenz der Taxadien-Synthase mittels konventioneller Methoden zu bestätigen (und, wenn notwendig, zu korrigieren).
Nukleotidsequenz-Varianten der cDNA der Taxadien-Synthase und Aminosäuresequenz-Varianten des Proteins der Taxadien-Synthale. Unter der Verwendung der Nukleotid- und der Aminosäuresequenz des Proteins der Taxadien-Synthase, die hierin offenbart sind, können die Fachleute DNA-Moleküle und Polypeptide schaffen, welche geringfügige Variationen in ihrer Nukleotid- oder Aminosäuresequenz aufweisen.
„Varianten"-DNA-Moleküle sind DNA-Moleküle, die geringfügige Veränderungen in der nativen Sequenz der Taxadien-Synthase enthalten, d.h. Veränderungen, in welchen eines oder mehrere Nukleotide der nativen Sequenz der Taxadien-Synthase deletiert, addiert und/oder substituiert sind, während bevorzugterweise die Aktivität der Taxadien-Synthese aufrechterhalten wird. Varianten-DNA-Moleküle können zum Beispiel mittels Standard-DNA-Mutagenese-Verfahren oder durch chemische Synthese der Varianten-DNA-Moleküle oder eines Teiles davon produziert werden. Solche Varianten verändern bevorzugterweise nicht den Leserahmen der Protein-kodierenden Region der Nukleinsäure und kodieren bevorzugterweise ein Protein, welches keine Veränderung, nur eine geringfügige Reduktion oder einen Anstieg in der biologischen Funktion der Taxadien-Synthase aufweist.
Aminosäure-Substitutionen sind bevorzugterweise Substitutionen von einzelnen Aminosäureresten. DNA-Insertionen sind bevorzugterweise von ungefähr 1 bis 10 zusammenhängenden Nukleotiden und Deletionen sind bevorzugterweise von ungefähr 1 bis 30 zusammenhängenden Nukleotiden. Insertionen und Deletionen sind bevorzugterweise Insertionen oder Deletionen von einem Ende der Protein-kodierenden oder nicht-kodierenden Sequenz und werden bevorzugterweise in benachbarten Basenpaaren gemacht. Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder jede Kombination davon können kombiniert werden, um bei einem endgültigen Konstrukt anzukommen.
Bevorzugterweise sind Varianten-Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung „stille" oder „konservative" Varianten. „Stille" Varianten sind Varianten einer nativen Sequenz der Taxadien-Synthase oder eines Homologs davon, in der eine Substitution von einem oder mehreren Basenpaaren aber keine Veränderung in der Aminosäure-Sequenz des Polypeptids stattfand, das von der Sequenz kodiert wird. „Konservative" Varianten sind Varianten der nativen Sequenz der Taxadien-Synthase oder eines Homologs davon, in der mindestens ein Kodon in der Protein-kodierenden Region des Gens verändert wurde, was zu einem konservativen Wechsel in einer oder mehreren Aminosäure-Resten des Polypeptids resultiert, das von der Nukleinsäure-Sequenz kodiert wird, d. h. eine Aminosäure-Substitution. Eine Reihe von konservativen Aminosäure-Substitionen ist unten aufgelistet. Zusätzlich können eines oder mehrere Kodons, welche für Cystein-Reste kodieren, substituiert werden, was zum Verlust zum Cystein-Restes führt und die Disulfid-Brücken in dem Polypeptid in der Taxadien-Synthase beeinflusst.
Substantielle Veränderungen in der Funktion können hergestellt werden durch die Selektion von Substitutionen, welche weniger konservativ sind, als diejenigen, die oben aufgelistet sind, was zum Beispiel zu Veränderungen führt in: (a) der Struktur des Polypeptid-Rückgrates in dem Gebiet der Substitution; (b) der Ladung oder der Hydrophobizität des Polypeptids an der Zielstelle oder (c) der Größe („bulk") einer Aminosäure-Seitenkette. Substitutionen, von denen im allgemeinen erwartet wird, daß sie die größten Veränderungen in den Proteineigenschaften produzieren, sind diejenigen, in welchen: (a) ein hydrophiler Rest, z. B. Seryl oder Threonyl, substituiert wird für (oder durch) einen hydrophoben Rest, z. B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl; (b) ein Cystein oder Prolin substituiert wird für (oder durch) einen anderen Rest; (c) ein Rest, welcher eine elektropositive Seitenkette aufweist, z. B. Lysyl, Arginyl oder Histadyl, substituiert wird für (oder durch) einen elektronegativen Rest, z. B. Glutamyl oder Aspartyl; oder (d) ein Rest, welcher eine massive Seitenkette aufweist, z. B. Phenylalanin, substituiert wird für (oder durch) einen Rest, welcher keine Seitenkette aufweist, z. B. Glycin.
Die Gensequenz der Taxadien-Synthase kann wie folgt modifiziert werden:

(1) Um die Expressionseffizienz zu verbessern und das Abzielen des exprimierten Polypeptids umzuleiten („redirect"): Für die Expression in nicht-pflanzlichen Wirten (oder um das exprimierte Polypeptid zu einem verschiedenen intrazellulären Kompartiment in einem Pflanzenwirt zu dirigieren) kann die native Gensequenz von dem 5'-Ende trunkiert werden, um die Sequenz zu entfernen, welche das plastidische („plastidial") Transit-Peptid kodiert, auf ungefähr 137 Aminosäuren (d. h. auf ungefähr 138S), was die Sequenz, welche das reife Polypeptid der Taxadien-Synthase kodiert, auf ungefähr 725 Aminosäuren belässt. Zusätzlich können eines oder mehrere Kodons verändert werden, um zum Beispiel das Gen auf die Vorliebe der Kodon-Verwendung („codon usage bias") der Wirtszelle für verbesserte Expression abzustimmen. Enzymatische Stabilität kann durch das Entfernen oder Addieren von einem oder mehreren Cystein-Resten verändert werden, wobei eine oder mehrere Disulfidbrücken entfernt oder addiert werden.
(2) Um die katalytische Effizienz zu verändern: Wie unten diskutiert, ist das Aspartat-reiche, welches eine Rolle bei der Substratbindung spielt, auch in der Taxadien-Synthase vorhanden, wie es auch das verwandte DXXDD-Motiv ist (2). Histidin- und Cystein-Reste wurden mit den aktiven Stellen von verschiedenen Terpenoid-Zyklasen mit pflanzlichem Ursprung in Zusammenhang gebracht. Histidin-Reste 370, 415 und 793 und Cysteine an den Resten 329, 650 und 777 der Taxadien-Synthase sind unter den Genen der Pflanzen-Terpenoid-Zyklasen konserviert. Eines oder mehrere konservierte Histidin- und Cystein-Reste (wie unten diskutiert), oder semi-konservierte Reste, wie zum Beispiel konservierte Cystein-Reste (z. B. Reste 329, 650, 719 und 777) und Histidin-Reste (z. B. Reste 370, 415, 579 und 793) können mutagenisiert werden, um die enzymatischen Kinetiken zu verändern. Zusätzlich können Reste, die zu diesen konservierten Histidin- und Cystein-Resten benachbart sind, ebenso verändert werden, um den Cystein- oder Histidin-Gehalt zu erhöhen, um die Ladungs-Stabilisierung zu verbessern. Durch die Erhöhung des Aspartat-Gehaltes der DDXXD- und DXXDD-Motive (wo D Aspartat ist und X jede Aminosäure ist), welche wahrscheinlich in die Substrat/Intermediat-Bindung involviert sind, ist es möglich, die enzymatische Rate zu erhöhen (d. h. den Geschwindigkeits-bestimmenden Ionisationsschritt der enzymatischen Reaktion). Arginine wurden in Zusammenhang mit der Bindung oder der Katalyse gebracht und konservierte Arginin-Reste sind auch gute Ziele für die Mutagenese. Die Veränderung der konservierten DDXXD und/oder DXXDD-Motive (d. h. die Aspartat-Reste davon) durch konventionelle Orts-gerichtete Mutagenese-Methoden, um sie an diejenigen von anderen bekannten Enzymen anzugleichen, können auch zu Veränderungen in den Kinetiken oder der Substrat-Spezifität von Taxadien-Synthase führen. Zusätzlich kann die Produktbildung durch Mutagenese des RWWK-Elementes (Reste 564 bis 567) verändert werden, welches aromatische Reste einschließt, die eine Rolle bei der Stabilisierung von Carbo-kationischen Reaktionsintermediaten spielen können.
(3) Um die Substrat-Verwertung zu modifizieren: Das Enzym, insbesondere die aktive Stelle, kann modifiziert werden, um dem Enzym zu erlauben, kürzere (z. B. C₁₀) oder längere (z. B. C₂₅) Ketten als Geranylgeranyldiphosphat zu binden. Die Verwertung der Substratgröße kann durch die Erhöhung oder Erniedrigung der Größe der hydrophoben Stellen („hydrophobic patches") verändert werden, um die Größe der hydrophoben Tasche des Enzyms zu modifizieren. Ähnliche Effekte können durch Domänen-Tauschen („domain swapping") erreicht werden.
(4) Um das Produkt-Ergebnis zu verändern: Gerichtete Mutagenese der konservierten Aspartat- und Arginin-Reste kann verwendet werden, um dem Enzym zu erlauben, verschiedene Diterpen-Skelette mit zum Beispiel einem, zwei oder drei Ringen zu produzieren.

Siehe z. B. Cane et al., Biochemistry 34:2480–2488, 1995; Joly and Edwards, J. Biol. Chem. 268:26983–26989, 1993; Marrero et al., J. Biol. Chem. 267:533–536, 1992 und Song and Poulter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3044–3048, 1994).
Expression der Nukleinsäuren der Taxadien-Synthase in Wirtszellen. DNA-Konstrukte, welche ein Gen der Taxadien-Synthese oder ein Fragment davon gemäß der vorliegenden Erfindung aufnehmen, platzieren die Protein-kodierende Sequenz der Taxadien-Synthase bevorzugterweise unter die Kontrolle eines funktionsfähig verbundenen Promoters, welcher zur Expression in einer Wirtszelle in der Lage ist. Verschiedene Promotoren, welche für die Expression von heterologen Genen in Pflanzenzellen geeignet sind, sind im Stand der Technik bekannt, einschließlich konstitutiver Promotoren, z. B. der Blumenkohlmosaik-Virus (CaMV) 35S-Promotor, welcher in vielen Pflanzengeweben exprimiert wird, Organ- oder Gewebespezifische Promotoren und Promotoren, welche durch Chemikalien induziert werden, wie zum Beispiel Methyljasminat, Salicylsäure oder Safener, zum Beispiel. Eine Vielfalt anderer Promotoren oder anderer Sequenzen, welche bei der Konstruktion von Expressionsvektoren nützlich sind, sind für die Expression in bakteriellen, Hefe-, Säugetier-, Insekten-, amphibischen, Vogel- oder anderen Wirtszellen erhältlich.
Nukleinsäuren, die an einen festen Träger angehängt sind. Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können frei in Lösung sein oder mittels konventioneller Mittel an einen festen Träger angeknüpft sein, wie zum Beispiel eine Hybridisierungsmembran (z. B. Nitrozellulose oder Nylon), ein Kügelchen oder andere im Stand der Technik bekannte feste Träger.
Polypetpide
Der Begriff „Protein der Taxadien-Synthase" (oder Polypeptid) bezieht sich auf ein Protein, welches durch ein Gen der Taxadien-Synthase kodiert wird, einschließlich Allele, Homologe und Varianten davon, zum Beispiel. Ein Polypeptid der Taxadien-Synthase kann durch die Expression einer rekombinanten Nukleinsäure der Taxadien-Synthase produziert werden oder kann chemisch synthetisiert werden. Verfahren für die chemische Synthese von Polypeptiden werden zum Beispiel beschrieben in Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149–2156, 1963.
Polypeptidsequenz-Identitiät und Ähnlichkeit. Gewöhnlich haben die Polypeptide der Taxadien-Synthase, welche von der vorliegenden Offenbarung umfasst werden, mindestens ungefähr 70% Aminosäuresequenz-„Identität" (oder Homologie) im Vergleich zu einem nativen Polypeptid der Taxadien-Synthase, bevorzugterweise mindestens ungefähr 80% Identität und weiter bevorzugt mindestens ungefähr 90% Identität zu einem nativen Polypeptid der Taxadien-Synthase. Bevorzugterweise besitzen solche Polypeptide auch die charakteristischen strukturellen Merkmale und die biologische Aktivität eines nativen Polypeptids der Taxadien-Synthase.
Aminosäuresequenz-„Ähnlichkeit" ist ein Maß des Grades, mit welchem abgeglichene Aminosäuresequenzen identische Aminosäuren oder konservative Aminosäure-Substitutionen in korrespondierenden Positionen besitzen.
Eine „biologische Aktivität" der Taxadien-Synthase schließt die enzymatische Aktivität der Taxadien-Synthase ein, wie sie durch konventionelle Protokolle bestimmt wird (z. B. das Protokoll, das in Hezari et al., Arch. Biochem. Biophys. 322:437–444, 1995, eingefügt hierin durch Referenz, beschrieben wird). Andere biologische Aktivitäten der Taxadien-Synthase schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Substratbindung, immunologische Aktivität (einschließlich die Kapazität, die Produktion von Antikörpern auszulösen, welche spezifisch für Taxadien-Synthase sind) etc.
Polypeptid-Identität (Homologie) oder Ähnlichkeit wird typischerweise unter der Verwendung von Sequenzanalyse-Software analysiert, wie zum Beispiel des Sequence Analysis Software Package der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI. Polypeptid-Sequenzanalyse-Software stimmt Polypeptidsequenzen unter der Verwendung von Maßen der Identität ab, die verschiedenen Substitutionen, Deletionen, Substitutionen und anderen Modifikationen zugeordnet sind.
"Isolierte", „gereinigte", „homogene" Polypetide. Ein Polypeptid ist „isoliert", wenn es von den zellulären Komponenten (Nukleinsäuren, Lipiden, Kohlenhydraten und anderen Polypeptiden), welche es natürlicherweise begleiten, separiert wurde. Solch ein Polypeptid kann auch als „rein" oder „homogen" oder „im wesentlichen" rein oder homogen bezeichnet werden. Daher wird ein Polypeptid, welches chemisch synthetisiert wurde oder rekombinant ist (d. h. das Produkt der Expression einer rekombinanten Nukleinsäure ist, auch wenn es in einem homologen Zelltyp exprimiert wird), als isoliert erachtet. Ein monomeres Polypeptid ist isoliert, wenn sich mindestens 60 bis 90 Gew.% einer Probe aus dem Polypeptid zusammensetzt, bevorzugterweise 95% oder mehr und weiter bevorzugt mehr als 99%. Protein-Reinheit oder Homologenität wird zum Beispiel angezeigt mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese einer Proteinprobe, gefolgt durch Visualisierung einer einzelnen Polypeptid-Bande nach der Färbung des Polyacrylamidgels, Hochdruck-Flüssigchromatographie oder anderen konventionellen Methoden.
Protein-Reinigung. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch jedes Mittel, welches im Stand der Technik bekannt ist, gereinigt werden. Verschiedene Methoden zur Proteinreinigung sind beschrieben, z. B. in Guide to Protein Purification, Hrsg. Deutscher, Meth. Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, 1990; und Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, New York, 1982.
Varianten-Formen von Polypeptiden der Taxadien-Synthase; Markierung Von den Polypeptiden der Taxadien-Synthase gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung werden Varianten-Polypeptide umfasst, in welchen es Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder andere Modifikationen eines nativen Polypeptids der Taxadien-Synthase gab. Die Varianten bewahren im wesentlichen die strukturellen und/oder biologischen Eigenschaften und sind bevorzugterweise stille oder konservative Substitutionen von einer oder einer kleinen Anzahl von zusammenhängenden Aminosäure-Resten. Bevorzugterweise sind solche Varianten-Polypeptide mindestens 70%, weiter bevorzugt mindestens 80% und am meisten bevorzugt mindestens 90% homolog zu einem nativen Polypeptid der Taxadien-Synthase. Die native Polypeptidsequenz der Taxadien-Synthase kann durch konventionelle Methoden modifiziert werden, z. B. durch Acetylierung, Carboxylierung, Phosphorylierung, Glycosylierung, Ubiquitinylierung und Markierung, was entweder durch in vivo oder in vitro enzymatische Behandlung eines Polypeptids der Taxadien-Synthase oder durch die Synthese eines Polypeptids der Taxadien-Synthase unter der Verwendung von modifizierten Aminosäuren erreicht wird.
Es gibt eine Vielfalt von konventionellen Methoden und Reagenzien für die Markierung von Polypeptiden und deren Fragmenten. Typische Markierungen schließen radioaktive Isotope, Liganden oder Ligand-Rezeptoren, Fluorophore, chemilumineszierende Mittel und Enzyme ein. Methoden für die Markierung und Anleitung bei der Auswahl der Markierungen, die für verschiedene Zwecke geeignet sind, werden zum Beispiel in Sambrook et al. (1989) und Ausubel et al. (1987, mit periodischen Aktualisierungen) diskutiert.
Polypeptid-Fragmente. Die vorliegende Offenbarung umfaßt auch Fragmente der Polypeptide der Taxadien-Synthase, denen mindestens ein Rest eines nativen Vollängen-Polypeptids der Taxadien-Synthese fehlt, die aber dennoch mindestens eine der biologischen Aktivitäten, die charakteristisch für Taxadien-Synthase sind, behalten, zum Beispiel die enzymatische Aktivität der Taxadien-Synthase oder der Besitz einer charakteristischen immunologischen Determinante. Als ein zusätzliches Beispiel ist ein immunologisch aktives Fragment eines Polypeptids der Taxadien-Synthase in der Lage, für Taxadien-Synthase spezifische Antikörper in einem Ziel-Immunsystem (z. B. Maus oder Kaninchen) zu verursachen oder mit Taxadien-Synthase um die Bindung an für Taxadien-Synthase spezifische Antikörper zu konkurrieren, und es ist daher nützlich in Immunoassays für die Anwesenheit von Polypeptiden der Taxadien-Synthase in einer biologischen Probe. Solche immunologisch aktiven Fragmente haben typischerweise eine minimale Größe von 7 bis 17 Aminosäuren. Fragmente umfassen bevorzugterweise mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 20 und am meisten bevorzugt mindestens 30 aufeinander folgende Aminosäuren eines nativen Polypeptids der Taxadien-Synthase.
Fusions-Polypeptide. Die vorliegende Offenbarung stellt auch Fusions-Polypeptide zur Verfügung, einschließlich zum Beispiel heterologe Fusions-Polypeptide, d. h. eine Polypeptid-Sequenz der Taxadien-Synthase oder eines Fragmentes davon und eine heterologe Polypeptid-Sequenz, z. B. eine Sequenz eines unterschiedlichen Polypeptids. Solche heterologen Fusions-Polypeptide zeigen daher biologische Eigenschaften (wie zum Beispiel Ligandenbindung, Katalyse, Sekretionssignale, antigene Determinanten etc.), welche von jeder der fusionierten Sequenzen abgeleitet werden. Fusionspartner schließen zum Beispiel Immunoglobuline, Beta-Galaktosidase, trpE, Protein A, Beta-Lactamase, Alpha-Amylase, Alkoholdehydrogenase, Hefe-Alpha-Paarungsfaktor und verschiedene Signal- und Leitsequenzen ein, welche zum Beispiel die Sekretion des Polypeptids leiten können. Fusions-Polypeptide werden typischerweise durch die Expression der rekombinanten Nukleinsäuren oder durch chemische Synthese hergestellt.
Polypeptidsequenz-Bestimmung. Die Sequenz eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung kann mittels verschiedener Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind, bestimmt werden. Um die Sequenz eines Polypeptids zu bestimmen, wird das Polypeptid typischerweise fragmentiert, die Fragmente werden separiert und die Sequenz jedes Fragments wird bestimmt. Um Fragmente eines Polypeptids der Taxadien-Synthase zu erhalten, wird das Polypeptid mit einem Enzym, wie zum Beispiel Trypsin, Clostripain oder Staphylococcus-Protease oder mit chemischen Mitteln, wie zum Beispiel Cyanogenbromid, o-Jodosobenzoat, Hydroxylamin oder 2-Nitro-5-thiocyanobenzoat, verdaut. Peptid-Fragmente können separiert werden, zum Beispiel mittels reverser Phase-Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) und mittels Gasphasen-Sequenzierung analysiert werden.
Antikörper
Die vorliegende Offenbarung umfaßt auch polyklonale und/oder monoklonale Antikörper, welche für Taxadien-Synthase spezifisch sind, d. h. an Taxadien-Synthase binden und in der Lage sind, das Polypeptid der Taxadien-Synthase von anderen Polypeptiden unter Standardbedingungen zu unterscheiden. Solche Antikörper werden mittels konventioneller Methoden produziert und untersucht.
Für die Präparation und Verwendung von Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung, einschließlich verschiedener Immunoassay-Techniken und Anwendungen, siehe zum Beispiel Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2. Aufl., Academic Press, New York, 1986 und Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988. Für Taxadien-Synthase spezifische Antikörper sind zum Beispiel nützlich bei: der Reinigung von Polypeptiden der Taxadien-Synthase; der Klonierung von Homologen der Taxadien-Synthase aus pazifischer Eibe oder anderen Pflanzen-Spezies aus einer Expressions-Bibliothek; für Antikörper-Sonden für Proteinblots und Immunoassays etc.
Polypeptide der Taxadien-Synthase und Antikörper können mittels konventioneller Verfahren markiert werden. Geeignete Markierungen schließen Radionuklide, Enzyme, Substrate, Kofaktoren, Inhibitoren, fluoreszierende Mittel, chemilumineszierende Mittel, magnetische Partikel etc. ein.
Pflanzen-Transformation und Regeneration. Jede gut bekannte Methode kann verwendet werden für Pflanzenzell-Transformation, Kultur und Regeneration kann verwendet werden in der Umsetzung der vorliegenden Erfindung. Methoden für die Einfügung von fremder DNA in Pflanzenzellen schließen ein, sind aber nicht limitiert auf: den Transfer, der die Verwendung von Agrobacterium tumefaciens und geeignete Ti-Vektoren involviert, einschließlich binäre Vektoren; chemisch induzierter Transfer (z. B. mit Polyethylenglycol); Biolistik und Mikroinjektion. Siehe zum Beispiel An et al., Plant Molecular Biology Manual A3:1-19, 1988.
Die Erfindung wird besser durch die Referenz auf die folgenden Beispiele verstanden werden, welche dazu gedacht sind, den besten Modus, der jetzt für die Umsetzung der Erfindung bekannt ist, lediglich zu illustrieren. Der Umfang der Erfindung soll jedoch dadurch nicht limitiert werden.
BEISPIEL 1: Klonierung und Sequenzierung einer cDNA, welche Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase kodiert
MATERIALIEN UND METHODEN
Pflanzen, Substrate und Standards. Vier Jahre alte Bäumchen von T. brevifolia im aktiven Wachstum wurden in einem Gewächshaus gehalten. [1-³H]-Geranylgeranyldiphosphat (120 Ci/mol) wurde, wie vorher beschrieben, präpariert (LaFever et al., Arch. Biochem. Biophys. 313:139–149, 1994) und authentisches (±)-Taxa-4(5),11(12)-dien wurde durch Totalsynthese präpariert (Rubenstein, J. Org. Chem. 60:7215–7223, 1995).
Konstruktion der Bibliothek. Gesamt-RNA wurde aus dem Stamm von T. brevifolia unter der Verwendung der Prozeduren von Lewinsohn und Mitarbeitern (Lewinsohn et al., Plant Mol. Biol. Rep. 12:20–25, 1991), welche für holziges Gymnosperm-Gewebe entwickelt wurden, extrahiert. Poly(A)⁺-RNA wurde mittels Chromatographie an Oligo(dT)-Cellulose (Pharmacia) gereinigt und 5 μg der resultierenden mRNA wurden verwendet, um eine λZAP II cDNA-Bibliothek gemäß der Instruktionen des Herstellers (Stratagene) zu konstruieren.
Generierung der PCR-basierenden Sonde und Durchsuchen der Bibliothek. Der Vergleich von sechs erhältlichen Sequenzen für Monoterpen-, Sesquiterpen und Diterpen-Zyklasen aus höheren Pflanzen (Facchini and Chappell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11088–11092, 1992; Colby et al., J. Biol. Chem. 268:23016–23024, 1993; Mau and West, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8497–8501, 1994; Back and Chappell, J. Biol. Chem. 270:7375–7381, 1995; Sun and Karmiya, Plant Cell 6:1509–1518, 1994 und Bensen et al., Plant Cell 7:75–84, 1995) erlaubte die Definition von elf homologen Regionen, für welche Konsensus-degenerierte Primer synthetisiert wurden. Alle zwanzig Primer (der am meisten Carboxy-terminale Primer, der am meisten Amino-terminale Primer und neun interne Primer in beiden Richtungen) wurden in allen möglichen Kombinationen über einen weiten Bereich von Amplifizierungsbedingungen unter der Verwendung einer CsCl-gereinigten T. brevifolia Stamm-Bibliothek-Phagen-DNA als Matrize eingesetzt (Innis and Gelfand, in PCR Protocols (Innis et al., Hrsg.), S. 3–12, 253–258, Academic Press, San Diego, CA, 1990; Sambrook et al., 1989).
Die Analyse der PCR-Produkte mittels Gelelektrophorese (Sambrook et al., 1989) zeigte an, daß nur die Kombination der Primer CC7.2F und CC3R (siehe 2) ein spezifisches DNA-Fragment (~80 bp) generierte. Dieses DNA-Fragment wurde in pT7Blue (Novagen) kloniert und sequenziert (DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing, Applied Biosystems) und es wurde gezeigt, daß es eine Länge von 83 by hat. PCR wurde verwendet, um ungefähr 1 μg dieses Materials für Zufalls-Hexamer-Markierung mit [α-³²P]dATP (Tabor et al., in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Abschnitte 3.5.9 bis 3.5.10, 1987) und für die Verwendung als eine Hybridierungs-Sonde zu präparieren, um Filter-Lifter („filter lifts") von 3 × 10⁵ Plaques, welche in E. coli LE392 aufgezogen wurden, unter der Verwendung von Standardprotokollen zu durchsuchen (Britten and Davidson, in Nucleic Acid Hybridisation, Hames and Higgins, Hrsg., S. 3–14, IRL Press, Oxford, 1988).
Von den Plaques, welche positive Signale hervorbrachten (insgesamt 102), wurden 50 durch zwei zusätzliche Zyklen der Hybridisierung gereinigt. 38 reine Klone wurden in vivo als Bluescript-Phagemiden ausgeschnitten. Die Insert-Größe wurde mittels PCR unter der Verwendung von T3 und T7-Promotor-Primern bestimmt und die zwölf größten Klone (Insert > 2 kb) wurden partiell sequenziert.
cDNA-Expression in E. coli. Alle partiell sequenzierten, Vollängen-Inserte waren entweder außerhalb des Rahmens oder trugen vorzeitige Stop-Stellen unmittelbar stromauf von dem mutmaßlichen Methionin-Startcodon. Die spätere Komplikation resultierte wahrscheinlich aus Haarnadel-vorbereiteter („hairpin-primed") zweiter Strang-cDNA-Synthese (Old and Primrose, Principles of Gene Manipulation, 4. Aufl., S. 3435, Blackwell Scientific, London, 1989). Das 2,7 kb Insert von pTb42 wurde in den Rahmen durch PCR unter der Verwendung von thermostabiler, hohe Genauigkeit, Abstumpfung-Polymerase Pful (Stratagene) und des FRM42-Primers (stromab der falschen Stopkodons) und des T7-Promotor-Primers kloniert. Das resultierende stumpfe Fragment wurde in mit EcoRV verdauten pBluescript SK(-) (Stratagene) ligiert, was zu pTb42.1 führte und in E. coli XL1-Blue (Stratagene) transformiert.
Um die funktionale Expression von Terpen-Zyklase-Aktivität zu evaluieren, wurden E. coli XL1-Blue Zellen, welche pTb42.1 beherbergen, auf 5 ml LB-Medium, supplementiert mit 100 μg/m1 Ampicillin und 12,5 μg Tetracyclin, gewachsen (bis auf A₆₀₀ = 0,4) vor der Induktion mit 200 μM IPTG und nachfolgendem Wachstum für 4 h bei 25°C. Bakterien wurden mittels Zentrifugation (1800 g, 10 Min.) geerntet, in Taxadien-Synthase-Assaypuffer resuspendiert (Hezari et al., Arch. Biochem. Biophys. 322:437–444, 1995), mittels kurzer Sonifizierung bei 0 bis 4°C unterbrochen und die resultiuerende Suspension zentrifugiert (18.000 g, 10 Min.), um Zelltrümmer zu pelletieren. Der Überstand wurde auf Aktivität der Taxadien-Synthase mittels eines etablierten Protokolls untersucht (Hezari et al., Arch. Biochem. Biophys. 322:437–444, 1995) bei Anwesenheit von 15 μM [1-³H] Geranylgeranyldiphosphat und 1 mM MgCl₂ mit Inkubation bei 31°C für 4 h. Die Reaktionsprodukte wurden mit Pentan extrahiert und das Extrakt mittels Säulenchromatographie an Silicagel, wie zuvor beschrieben (Hezari et al., Arch. Biochem. Biophys. 322:437–444, 1995) gereinigt, um die Olefin-Fraktion zu schaffen, von welcher ein Aliquot mittels Flüssig-Szintillation-Spektrometrie gezählt wurde, um den Einbau von ³H zu bestimmen. Kontrollexperimente mit transformiertem E. coli, welche das Plasmid mit Inserten tragen, die außerhalb des Rahmens sind, wurden ebenso durchgeführt.
Die Identität des Olefin-Produktes des rekombinanten Enzyms wurde verifiziert mittels Kapillar-Radio-Gaschromatographie („capillary radio-GC") (Croteau and Satterwhite, J. Chromatogr. 500:349–354, 1990) sowie mit Kapillar-Gaschromatographie-Massenspektrum/Spektrometrie („capillary GC-MS") mittels der Methoden, die kürzlich beschrieben wurden (Koepp et al., J. Biol. Chem. 270:8686–8690, 1995), und authentischem Taxa-4(5),11(12)-dien (Rubenstein, J. Org. Chem. 60:7215–7223, 1995). Für GC-MS-Analyse (Hewlett-Packard 6890 GC-MSD), wurden selektierte diagnostische Ionen aufgezeichnet: m/z 272 [P⁺]; 257 [P⁺-15(CH₃)]; 229 [P⁺-43(C₃H₇)]; 121, 122, 123 [C-Ringfragment-Cluster] und 107 [m/z 122 Basispeak-15(CH₃)]. Der Ursprung des stark charakteristischen C-Ring Doppelspaltungs-Fragmentions [Basispeak, m/z 122(C₉H₁₄)] ist beschrieben worden (Koepp et al., J. Biol. Chem. 270:8686–8690, 1995).
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
cDNA-Isolierung und Charakterisierung. Bei allgemeinen Eigenschaften (molekulares Gewicht, Erfordernis divalenter Metallionen, kinetische Konstanten etc.) ähnelt Taxadien-Synthase anderen Terpenoid-Zyklasen aus höheren Pflanzen. Jedoch behinderten die niedrigen Gewebetiter des Enzyms und seine Instabilität unter einem breiten Bereich von Fraktionierungs-Bedingungen die Reinigung des Proteins bis zur Homogenität (Hezari et al., Arch. Biochem. Biophys. 322:437–444, 1995). Eine 10 μg Probe der elektrophoretisch gereinigten Zyklase, welche mittels analytischen Standardprozeduren präpariert wurde (Schagger and von Jagow, Anal. Biochem. 166:368–379, 1987; Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:350–4354, 1979) versagte dabei, die Amino-terminale Sequenz mittels Edman-Abbau zur Verfügung zu stellen. Wiederholte Versuche durch Trypsinisierung und CNBr-Spaltung von vergleichbaren Proteinproben schlugen auch fehl, um sequenzierbare Peptide zur Verfügung zu stellen, zum Großteil aufgrund sehr niedriger Ausbeuten.
Als ein alternativer Ansatz zum Durchsuchen von cDNA-Bibliotheken unter der Verwendung von Protein-basierenden Oligonukleotid-Sonden, wurde eine PCR-basierende Strategie entwickelt, welche auf einem Satz von degenerativen Primern für die PCR-Amplifizierung begründet wurde, welche ausgeführt waren, um hoch konservierte Regionen von sechs Terpen-Zyklasen höherer Pflanzen zu erkennen, deren Nukleotidsequenzen bekannt sind. Drei dieser Zyklasen, (-)-Limonen-Synthase (eine Monoterpen-Zyklase aus grüner Minze) (Colby et al., J. Biol. Chem. 268:23016–23024, 1993), epi-Aristolochen-Synthase (eine Sesquiterpen-Zyklase aus Tabak) (Facchini and Chappell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11088–11092, 1992; Back and Chappell, J. Biol. Chem. 270:7375–7381, 1995) und Casben-Synthase (eine Diterpen-Cylase aus Rizinussamen) (Mau and West, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 91:8497– 8501, 1994) nutzen einen Reaktionsmechanismus aus, der ähnlich zu dem der Taxadien-Synthase bei der Zyklisierung des respektiven Geranyl (C₁₀), Farnesyl (C₁₅) und Geranylgeranyl (C₂₀)-diphosphat-substrates ist (Lin et al., Biochemistry, im Druck). Kauren-Synthase A aus Arabidopsis thaliana (Sun and Karmiya, Plant Cell 6:1509–1518, 1994) und Mais (Bensen et al., Plant Cell 7:75–84, 1995) und (-)-Abietadien-Synthase aus der Riesentanne („grand fir") (Abies grandis; Stofer Vogel, Wildung, Vogel, und Crotean, Manuskript in Präparation) nutzen einen recht verschiedenen Mechanismus aus, welcher die Protonierung der terminalen Doppelbindung von Geranylgeranyldiphosphat involviert, um die Zyklisierung des Intermediats Copalyldiphosphat zu initieren, gefolgt im Falle der Abietadien-Synthase von der typischeren Ionisierung der Diphosphat-Esterfunktion, um eine zweite Zyklisierungssequenz zum Produkt-Olefin zu initieren (LaFever et al., Arch. Biochem. Biophys. 313:139–149, 1994). Die spätere repräsentiert die einzige Sequenz einer Gymnosperm-Terpen-Zyklase, die derzeit verfügbar ist.
Der Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen zwischen allen Zyklasen zielte auf 11 Regionen für PCR-Primer-Konstruktion ab. Die Testung aller 20 Primer in allen Kombinationen über einen weiten Bereich von Amplifikationsbedingungen, gefolgt von Produktanalyse mittels Gelelektrophorese deckte auf, daß nur eine Kombination von Primern [CC7.2 (vorwärts) mit CC3 (rückwärts) siehe 2 für die Positionen] zu einem spezifischen DNA-Fragment (83 bp) unter der Verwendung der Bibliothek-Phage von T. brevifolia als Matrize führte. Der Primer CC3 beschreibt eine Region von starker Homologie zwischen (-)-Limonen-Synthase (Colby et al., J. Biol. Chem. 268:23016–23024, 1993), epi-Aristolochen-Synthase (Facchini and Chappell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11088–11092, 1992) und Casben-Synthase (Mau and West. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8497–8501, 1994). Primer CC7.2 wurde basierend auf dem Sequenzvergleich der Angiosperm-Diterpen-Zyklasen (Mau and West, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91:8497–8501, 1994; Sun and Karmiya, Plant Cell 6:1509–1518, 1994; Bensen et al., Plant Cell 7:75–84, 1995) mit dem kürzlich erhaltenen cDNA-Klon selektiert, welcher für eine Gymnosperm-Diterpen-Zyklase kodiert, (-)-Abietadien-Synthase aus der Riesentanne („grand fir") (Stofer Vogel, Wildung, Vogel und Croteau, Manuskript in Präparation).
Das 83 bp-Fragment wurde kloniert und sequenziert und es wurde demonstriert, daß es Zyklase ähnlich ist. Dieses PCR-Produkt wurde ³²P-markiert zur Verwendung als eine Hybridisierungs-Sonde und in einer Durchsuchung mit hoher Stringenz von 3 × 10⁵ Plaques verwendet, was 102 positive Signale ergab. 50 dieser Klone wurden durch zwei zusätzliche Runden des Screenings gereinigt, in vivo ausgeschnitten und die Inserts ausgemessen. Die zwölf Klone, welche die größten Inserts (> 2,0 kb) trugen, wurden partiell sequenziert, was anzeigte, daß sie alle Repräsentationen desselben Gens waren. Vier dieser Inserts erschienen Vollängen zu sein.
cDNA-Expression in E. coli. Alle vier der Vollängen-Klone, welche gereinigt wurden, waren außerhalb des Rahmens oder hatten Stop-Stellen unmittelbar stromauf von dem Start-Methionin-Kodon, welches aus Haarnadel-vorbereiteter („hairpin-primed") zweiter Strang cDNA-Synthese resultierte. Das Insert von pTb42 wurde im Rahmen mittels PCR-Methoden kloniert, das stumpfe Fragment wurde in die EcoRV-Stelle von pBluescript SK(-) ligiert, was zu pTb42.1 führte, und in E. coli XL1-Blue transformiert.
Transformierte E. coli wurden in LB-Medium, supplementiert mit Antibiotika, gewachsen und mittels IPTG induziert. Die Zellen wurden geerntet und homogenisiert und die Extrakte wurden auf Aktivität der Taxadien-Synthase unter der Verwendung von Standard-Protokollen mit [1-³H]Geranylgeranyldiphosphat als Substrat untersucht (Hezari et al., Arch. Biochem. Biophys. 322:437–444, 1995). Die Olefin-Fraktion, welche aus der Reaktionsmischung isoliert wurde, enthielt ein radioaktives Produkt (~1 nmol], welches auf Kapillar-Radio-GC mit authentischem Taxa-4(5),11(12)-dien koinzident war (Rt = 19,40 + 0,13 min).
Die Identifizierung dieses Diterpen-Olefins wurde mittels Kapillar-GC-MS-Analyse bestätigt. Die Retentionszeit (12,73 min gegenüber 12,72 min) und das selektierte Ionen-Massenspektrum (Tabelle I) des Diterpen-Olefin-Produktes waren identisch mit dem von authentischem (±)-Taxa-4(5),11(12)-dien (Rubenstein, J. Org. Chem. 60:7215–7223, 1995). Der Ursprung der selektierten diagnostischen Ionen, welche in Tabelle I gezeigt sind, welche auf das meiste der Vollspektrum-Abundanz entfallen, werden hierin und anderswo beschrieben (Koepp et al., J. Biol. Chem. 270:8686–8690, 1995). Aufgrund der verschiedenen Probengrößen war die Gesamt-Abundanz des authentischen Standards (2,96 E⁵) ungefähr zweimal von derjenigen des biosynthetischen Olefins (1,42 E⁵). Dies und die Variation im Hintergrund zwischen den Läufen erklärt möglicherweise die geringfügigen Unterschiede in den relativen Abundanzen der hohen Masse-Fragmente. Tabelle I: GC-MS-Analyse des Diterpen-Olefins, welches von rekombinanter Taxadien-Synthase synthetisiert wurde („Produkt"), verglichen mit authentischem Taxa-4(5),11(12)-dien („Standard")
Da identisch präparierte Extrakte von Kontrollkulturen von E. coli, welche mit pBluescript transformiert wurden, der ein Insert trägt, das außerhalb des Rahmens ist, nicht in der Lage waren, Geranylgeranyldiphosphat in detektierbaren Spiegeln in das Diterpen-Olefin zu tranformieren, bestätigen diese Ergebnisse, daß der Klon pTb42.1 die Taxadien-Synthase aus pazifischer Eibe kodiert.
Sequenzanalyse. Beide Stränge des Inserts von pTb42 und pTb42.1 wurden sequenziert. Durch die Pfu-Polymerase wurden keine Fehler eingefügt. Die pTb42.1 Taxadien-Synthase cDNA hat eine Länge von 2700 Nukleotiden und enthält einen vollständigen offenen Leserahmen von 2586 Nukleotiden (2). Die abgeleitete Aminosäure-Sequenz zeigt die Anwesenheit eines mutmaßlichen plastidischen („plastidial") Transit-Peptids von ungefähr 137 Aminosäuren und ein reifes Protein von ungefähr 725 Resten (82,5 kDa) an, basierend auf der Größe des nativen (reifen) Enzyms (~79 kDa), wie es mittels Gel-Permeations-Chromatographie und Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese („SDS-PAGE") geschätzt wurde (Hezari et al., Arch. Biochem. Biophys. 322:437–444, 1995), den charakteristischen Aminosäure-Gehalt und strukturelle Merkmale solcher aminoterminalabzielenden Sequenzen und deren Spaltstellen (Keegstra et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40:471–501, 1989; von Heijne et al., Eur. J. Biochem. 180:535–545, 1989), und die Tatsache, daß die Diterpen-Biosynthese exklusiv innerhalb von Plastiden lokalisiert ist (West et al., Rec. Adv. Phytochem. 13:163–198, 1979; Kleinig, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40:39–59, 1989). Die Verbindungsstelle von Transit-Peptid und reifem Protein und daher die genaue Länge beider Reste sind unbekannt, weil der Aminoterminus des reifen Proteins offensichtlich blockiert ist und bisher nicht identifiziert wurde.
Paarweiser Sequenzvergleich (Feng and Doolittle, Methods Enzymol. 183:375–387, 1990; Genetics Computer Group, Program Manual for the Wisconsin Packet, Version 8, Genetics Computer Group Madison, WI, 1994) mit anderen Terpen-Zyklasen aus höheren Pflanzen offenbarte einen signifikanten Grad an Sequenz-Ähnlichkeit auf der Ebene der Aminosäuren. Die Taxadien-Synthase aus der Eibe zeigte 32% Identität und 55% Ähnlichkeit mit der (-)-Limonen-Synthase aus grüner Minze (Colby et al., J. Biol. Chem. 268:23016–23024, 1993), 30% Identität und 54% Ähnlichkeit mit der epi-Aristolochen-Synthase aus Tabak (Facchini and Chappell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11088–11092, 1992), 31% Identität und 56% Ähnlichkeit mit der Cashen-Synthase aus Rizinussamen (Mau and West, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8497–8501, 1994) und 33% Identität und 56% Ähnlichkeit mit Kauren-Synthase A aus Arabidopsis thaliana und Mais (Sun and Karmiya, Plant Cell 6:1509–1518, 1994; Bensen et al., Plant Cell 7:75–84, 1995) und 45% Identität und 67% Ähnlichkeit mit der (-)-Abietadien-Synthase aus der Riesentanne („grand fir") (Stofer Vogel, Wildung, Vogel und Croteau, Manuskript in Präparation). Paarweiser Vergleich von anderen Mitgliedern innerhalb dieser Gruppe zeigte annähernd vergleichbare Niveaus an Identität (30–40%) und Ähnlichkeit (50–60%). Diese Terpenoid-Synthasen repräsentieren einen breiten Bereich von Zyklase-Typen aus diversen Pflanzenfamilien, was den Vorschlag einer gemeinsamen Abstammung für diese Klasse der Enzyme unterstützt (Colby et al., J. Biol. Chem. 268:23016–23024, 1993; Mau and West, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91:8497–8501, 1994; Back and Chappell, J. Biol. Chem. 270:7375-7381, 1995; McGarvey and Crotean, Plant Cell 7:1015–1026, 1995; Chappell, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46:521–547, 1995).
Die Aminosäuresequenz der Taxadien-Synthase ähnelt nicht sehr (Identität ~20%; Ähnlichkeit ~40%) derjenigen von irgendeiner der mikrobiellen Sesquiterpen-Zyklasen, welche kürzlich bestimmt wurden (Hohn and Beremand, Gene (Amst.) 79:131–136, 1989; Proctor and Hohn, J. Biol. Chem. 268:4543–4548, 1993; Cane et al., Biochemistry 33:5846–5857, 1994), noch ähnelt die Taxadien-Synthase-Sequenz irgendeiner der publizierten Sequenzen für Prenyl-Transferasen (Chen et al., Protein Sci. 3:600–607, 1994; Scolnik and Bartley, Plant Physiol. 104: 1469–1470, 1994; Attucci et al. Arch. Biochem. Biophys. 321:493–500, 1995), eine Gruppe von Enzymen, welche wie die Terpenoid-Zyklasen Allyldiphosphat-Substrate verwenden und ähnliche elektrophile Reaktionsmechanismen ausnutzen (Poulter and Rilling, in Biosynthesis of Isoprenoid Compounds, Porter and Spurgeon, Hrsg., Vol. 1, S. 161–224, Wiley & Sons, New York, NY, 1981). Das Aspartatreiche (I,L,V)XDDXX(XX)D-Motiv(e), welches in den meisten Phenyl-Transferasen und Terpenoid-Zyklasen gefunden wird (Facchini and Chappell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11088–11092, 1992; Colby et al., J. Biol. Chem. 268:23016–23024, 1993; Mau and West, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8497–8501, 1994; Back and Chappell, J. Biol. Chem. 270:7375–7381, 1995; Hohn and Beremand, Gene (Amst.) 79: 131–136, 1989; Proctor and Hohn, J. Biol. Chem. 268:4543–4548, 1993; Cane et al., Biochemistry 33:5846–5857, 1994; Chen et al., Protein Sci. 3:600–607, 1994; Scolnik and Bartley, Plant Physiol. 104:1469–1470, 1994; Attucci et al. Arch. Biochem. Biophys. 321:493–500, 1995; Abe and Prestwich, J. Biol. Chem. 269:802–804, 1994), und von dem gedacht wird, daß es eine Rolle bei der Substratbindung spielt (Chen et al., Protein Sci. 3:600–607, 1994; Abe and Prestwich, J. Biol. Chem. 269:802–804, 1994; Marrero et al., J. Biol. Chem. 267:21873–21878, 1992; Joly and Edwards, J. Biol. Chem. 268:26983–26989, 1993; Tarshis et al., Biochemistry 33:10871–10877, 1994), ist auch in der Taxadien-Synthase vorhanden, sowie es auch das verwandte DXXDD-Motiv ist (2). Histidin- und Cystein-Reste wurden mit den aktiven Stellen von verschiedenen Terpenoid-Zyklasen von pflanzlichem Ursprung in Zusammenhang gebracht (Rajaonarivony et al., Arch. Biochem. Biophys. 299:77–82, 1992; Savage et al., Arch. Biochem. Biophys. 320:257–265, 1995). Eine Suche der abgeglichenen Sequenzen offenbarte, daß drei Histidine (in Positionen 370, 415 und 793) und drei Cysteine (in Positionen 329, 650 und 777) der Taxadien-Synthase unter den pflanzlichen Genen der Terpenoid-Zyklase konserviert sind. Die Taxadien-Synthase aus der Eibe ähnelt am meisten der Abietadien-Synthase aus der Riesentanne („grand fir") eher als der Casben-Synthase aus Rizinussamen (Mau and West, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:8497–8501, 1994), die einen ähnlichen Typ der Zyklisierungsreaktion katalysiert, aber phylogenetisch recht entfernt ist. Die Abietadien-Synthase aus der Riesentanne ist die einzige andere Sequenz einer Terpenoid-Zyklase aus einem Gymnosperm, die jetzt verfügbar ist (Stofer Vogel, Wildung, Vogel und Croteau, in Präparation). Und diese zwei Diterpen-Zyklasen aus den Koniferen teilen verschiedene Regionen mit signifikanter Sequenzhomologie, von denen eine zufällig für die Primer-Konstruktion ausgewählt wurde und sich als hilfreich bei der Anschaffung einer PCR-abgeleiteten Sonde zeigte, welche zur Klonierung der Taxadien-Synthase führte.
BEISPIEL 3: Expression von Genen der Taxadien-Synthase welche trunkiert sind um Transit-Peptid-Sequenzen zu entfernen
Die native Gensequenz der Taxadien-Synthase wurde von dem 5'-Ende trunkiert, um Teile oder die gesamte Sequenz zu entfernen, welche das plastidische („plastidial") Transit-Peptid von ungefähr 137 Aminosäuren kodiert (das reife Polypeptid der Taxadien-Synthase ist ungefähr 725 Aminosäuren). Deletions-Mutanten wurden produziert, welche Aminosäure-Reste vom Aminoterminus bis zum Rest 31 (Glu), 39 (Ser), 49 (Ser), 54 (Gly), 79 (Val) oder 82 (Ile) entfernten. Diese Mutanten wurden in E. coli Zellen exprimiert und die Zellextrakte wurden auf Aktivität von Taxadien-Synthase untersucht, wie oben beschrieben. In vorgelagerten Experimenten war die Expression der Trunkierungs-Mutanten im Vergleich zur Wildtyp-Taxadien-Synthase um bis zu ungefähr 50% erhöht, wobei eine weitere Trunkierung jenseits der Reste 83 bis 84 offensichtlich zur Erniedrigung der Aktivität der Taxadien-Synthase führte.
Trunkierung von mindestens einem Teil des plastidischen Transit-Peptides verbesserte die Expression der Taxadien-Synthase. Darüberhinaus verbesserte die Entfernung dieser Sequenz die Reinigung der Taxadien-Synthase, weil das Transit-Peptid von E. coli Chaperoninen erkannt wird, welche mit dem Enzym ko-reinigen und die Reinigung komplizieren, und weil das Präprotein der Taxadien-Synthase dazu tendiert, Einschlußkörper zu bilden, wenn es in E. coli exprimiert wird.
Die tatsächliche Spaltstelle für die Entfernung des Transit-Peptids könnte nicht an der vorhergesagten Spaltstelle zwischen den Resten 136 (Ser) und dem Rest 137 (Pro) sein. Ein Transit-Peptid von 136 Resten erscheint recht lang und andere (Monoterpen)-Synthasen haben ein Tandem-Paar von Argininen (Arg-Arg) bei ungefähr Rest 60 (Met). Eine Trunkierung unmittelbar aminoterminal zu dem Tandem-Paar der Arginine dieser Synthasen resultierte in exzellenter Expression in E. coli. Taxadien-Synthase fehlt ein Arg-Arg-Element. Auch die Trunkierung oberhalb der Reste 83–84 führt zu einer niedrigeren Aktivität.
Diese Erfindung wurde im Detail jeweils durch Beispiel und durch direkte Beschreibung dargestellt. Es sollte offensichtlich sein, daß ein Durchschnittsfachmann auf dem relevanten Gebiet der Technik in der Lage sein würde, Äquivalente zu der Erfindung, wie sie in deqn Ansprüchen beschrieben wird, welche folgen, zu vermuten, aber welche innerhalb des Geistes der vorangehenden Beschreibung wären. Diese Äquivalente sollen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung eingeschlossen sein. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polynukleotid umfassend eine für ein Polypeptid kodierende Sequenz, die für ein Polypeptid mit Taxadiensynthase biologischer Aktivität kodiert, wobei die für ein Polypeptidkodierende Sequenz mindestens 70% Nukleotid-Sequenzidentität mit der Polynukleotidsequenz der 2 (SEQ ID NO: 1) aufweist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei die für ein Polypeptid kodierende Sequenz mindestens 80% Nukleotid-Sequenzidentität mit der Polynukleotidsequenz der 2 (SEQ ID NO: 1) aufweist.
Polynukleotid nach Anspruch 2, wobei die für ein Polypeptid kodierende Sequenz mindestens 90% Nukleotid-Sequenzidentität mit der Polynukleotidsequenz der 2 (SEQ ID NO: 1) aufweist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei die für ein Polypeptid kodierende Sequenz für ein Polypeptid kodiert, das lediglich konservative Aminosäuresubstitutionen gegenüber der Taxadiensynthase-Polypeptidsequenz der 2 (SEQ ID NO: 2) aufweist, mit der Ausnahme einer Aminosäuresubstitution an mindestens einer Stelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Cysteinresten 329, 650, 719 und 777; Histidinresten 370, 415, 579 und 793; einem DDXXD Motiv; einem DXXDD Motiv; einem konservierten Arginin; und einem RWWK Element.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei die für ein Polypeptid kodierende Sequenz für ein Polypeptid kodiert, das lediglich konservative Aminosäuresubstitutionen gegenüber der Polypeptidsequenz wie in 2 (SEQ ID NO: 2) angegeben aufweist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei die für ein Polypeptid kodierende Sequenz für eine native Taxadiensynthase (SEQ ID NO: 2) kodiert, der die Aminosäurenreste vom Aminoterminus bis zum Rest 82 (Ile) fehlen.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei die für ein Polypeptid-kodierende Sequenz für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz wie in 2 (SEQ ID NO: 2) angegeben aufweist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei die für ein Polypeptid kodierende Sequenz für ein Polypeptid kodiert, dem das gesamte Transitpeptid fehlt.
Antikörper, spezifisch für ein Polypeptid, das aus einer wie in 2 (SEQ ID NO: 2) angegeben Aminosäuresequenz besteht.
Verfahren zur Expression eines Taxadiensynthase-Polypeptids in einer Zelle, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt von: Zur Verfügung stellen einer Zelle, die ein exprimierbares Polynukleotid umfaßt, das für ein Taxadiensynthase-Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert; und Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die für die Expression des Polypeptids geeignet sind.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Zelle eine Taxoid-produzierende Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Expression des Polynukleotids in der Zelle zu der Produktion eines höheren Spiegels an Taxoid führt als in einer andererseits ähnlichen Zelle, der das exprimierbare Polynukleotid fehlt.
Verfahren zum Erhalt eines Taxadiensynthasegens, umfassend die Schritte von: In Kontakt bringen einer Nukleinsäure eines Taxoid-produzierenden Organismus mit einer Sonde oder Primer, umfassend ein Polynukleotid nach Anspruch 1, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, wodurch eine Hybridisierung der Sonde oder des Primers an ein Taxadiensynthasegen des Organismus verursacht wird; und Isolieren des Taxadiensynthasegens des Organismus.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei die für ein Polypeptid kodierende Sequenz die Polynukleotidsequenz wie in 2 (SEQ ID NO: 1) angegeben umfaßt.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Promotorsequenz, die operativ mit dem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 verbunden ist.
Vektor, umfassend das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1.
Zelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 16.
Zelle nach Anspruch 17, wobei die Zelle eine Pflanzenzelle ist.
Transgene Pflanze, umfassend den Vektor nach Anspruch 16.