DE69732374T2 - Verfahren zur bestimmung der möglichkeit eines ausbruchs der rinderleukämie sowie der widerstandskraft dagegen - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der möglichkeit eines ausbruchs der rinderleukämie sowie der widerstandskraft dagegen Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beurteilung der Möglichkeit des Ausbruchs einer durch bovines Leukämievirus BLV verursachten Rinderleukämie sowie einer Resistenz gegen den Ausbruch der Leukämie.
  • Technischer Hintergrund
  • Die Haupthistokompatibilitätsantigene (MHC-Antigene) sind Moleküle, die bei der Unterscheidung Selbst/Nichtselbst im Abwehrmechanismus des lebenden Körpers gegen Infektionen mitwirken. Sie werden eingeteilt in Klasse I-Moleküle, die aus einer α-Kette und β2M zusammengesetzt sind, und Klasse II-Moleküle, die aus einer α-Kette und einer β-Kette zusammengesetzt sind. Eine Vertiefung zum Abfangen eines Antigen-Peptids ist auf den Domänen α1 und α2 sowie auf den Domänen α1 und β1 vorhanden. Sie weisen das Merkmal auf, dass sie den T-Zellen-Rezeptor dazu veranlassen, nur ein fragmentiertes Peptid zu erkennen, das in der Vertiefung abgefangen wurde, und führen so den Zelltod (zelluläre Immunität) mittels CD8+ Zellen herbei, welche die Klasse I-Antigene erkannt haben, und dass sie hauptsächlich die Antikörper-Produktion (humorale Immunität) mittels CD4+ Zellen induzieren, welche die Klasse II-Antigene erkannt haben.
  • Die MHC-Gene bilden eine Gengruppe mit stark ausgeprägtem Polymorphismus, und die Positionen der Taschen, die Formen, Größen und Eigenschaften der die Peptide abfangenden Vertiefungen sind unter den Haplotypen unterschiedlich. Man geht davon aus, dass die Assoziationsbedingungen der abgefangenen Fragmentpeptide in Abhängigkeit von diesen Unterschieden, die über die Immunantwort und die Krankheitsanfälligkeit des jeweiligen Individuums ent scheiden, verschieden sein können. Über die Korrelation zwischen den MHC-Haplotypen und der Resistenz gegen eine Krankheit (Nichtanfälligkeit für Krankheit) bzw. der Möglichkeit des Ausbruchs einer Krankheit (Krankheitsanfälligkeit) wurde zum Beispiel beim Human-Immunschwäche-Virus (HIV), Human-T-Zellen-Leukämie-Virus (HTLV) und bei Malaria berichtet.
  • Was die bovinen MHC(BoLA)-Klasse II-Gene anbetrifft, so wurde die Existenz der Gene DQA, DQB, DRA, DRB, DNA, DOB, DYA und DCB nachgewiesen. Unter anderem ist von DRB3 – eines der drei Gene (DRB1 bis B3), die auf dem DRB-Genlocus identifiziert wurden – bekannt, dass es für ein funktionelles Protein codiert, und bislang wurde die Existenz von 73 Allelen gezeigt. Allerdings gibt es kaum Berichte über die Korrelation zwischen Infektionskrankheiten bei Rindern und den bovinen MHC(BoLA)-Haplotypen.
  • Was insbesondere das bovine Leukämievirus (BLV) anbetrifft, das das Gen PX aufweist, welches die Virus-Vermehrung in der gleichen Weise wie beim Human-Immunschwäche-Virus (HIV) regelt, und ein Retrovirus ist, das mit HTLV-I sehr nahe verwandt ist, so berichtet eine Forschungsgruppe in den Vereinigten Staaten über dessen Beziehung zu den bovinen MHC(BoLA)-Haplotypen, wobei hauptsächlich auf die Resistenz gegen Krankheiten eingegangen wird; es wird jedoch nichts über dessen Beziehung zu einem möglichen Ausbruch der Leukämie berichtet. Der Anteil des mit diesem Virus infizierten Viehs (Infektionsrate in Japan) beträgt 10–20%, und 1–2% des infizierten Viehs entwickelt eine äußerst bösartige endemische Rinderleukämie und verstirbt nach einer langen Latenzzeit von 10 bis 15 Jahren. Der durch das Virus verursachte wirtschaftliche Verlust bei Viehzüchtern ist daher sehr schwerwiegend. Falls die Möglichkeit eines Ausbruchs bei Vieh nach BLV-Infektion durch Analyse der bovinen MHC(BoLA)-Haplotypen beurteilt werden kann, so wird es möglich, krankheitsresistentes Vieh für die Zucht vorher zu selektieren, und es wird erwartet, dass eine äußerst sichere Viehzucht fortgeführt werden kann.
  • Die Druckschrift WO 93/19204 offenbart, dass das Motiv VDTY in den Positionen 75 bis 78 des DRB3-Gens Anfälligkeit für PL (persistierende Lymphozytose) bei Vieh anzeigt. Das Verfahren der WO 93/19204 umfasst einen DNA-Amplifikationsschritt mittels PCR, und die Allele werden anhand der Produktlängen der amplifizierten DNA bestimmt. Nach WO 93/19204 wird das Vorhandensein des VDTY-Markers in den Positionen 75 bis 78 anhand der Produktion eines 249 bp-PCR-Produkts durch Verwendung eines speziellen Primers nachgewiesen. Falls das Sequenzmotiv VDTY nicht vorhanden ist, so ist ein solches PCR-Produkt unter stringenten Reaktionsbedingungen nicht erhältlich. Dies bedeutet, dass durch eine Fehlpaarung zwischen den verwendeten Primern und der DNA in der Probe eine PCR-Verlängerung unter stringenten Reaktionsbedingungen nicht möglich ist. Mit dem Assay im Stand der Technik wird folglich beurteilt, ob überhaupt ein PCR-Produkt auftritt. Zur Unterscheidung der Sequenz VDTY von VDTY ist dieses Verfahren jedoch nicht sicher.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist demnach die Aufklärung der Beziehung zwischen dem bovinen Leukämievirus (BLV) und den bovinen MHC(BoLA)-Haplotypen sowie die Bereitstellung eines Verfahrens zur mühelosen Beurteilung der Möglichkeit des Ausbruchs einer durch bovines Leukämievirus (BLV) verursachten Leukämie bei Vieh und einer Resistenz gegen den Ausbruch der Leukämie mit Hilfe gentechnischer Methoden. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Primer-Satzes, der für das oben genannte Beurteilungsverfahren brauchbar ist.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Die bei der vorliegenden Erfindung tätigen Erfinder analysierten bereits früher die Struktur des DRB-Genlocus bei den bovinen MHC(BoLA)-Klasse II-Genen und berichteten die Struktur des DRB3-Gens (BoLA-DRB3) und des Gen-Produkts desselben (Biochem. Biophys. Res. Commun. 209, S. 981–988, 1995). Die Erfinder untersuchten ferner die Funktion des Gens und fanden, dass ein Teil, dessen Aminosäuresequenz bei Vieh, das die Leukämie entwickelt, deutlich anders ist als bei Vieh, das die Krankheit nicht entwickelt, im Gen-Produkt vom zweiten Exon (β1-Domäne) von BoLA-DRB3 vorhanden ist, das besonders gut erkennbaren Polymorphismus zeigt. Auch fanden sie, dass die Aminosäure-Substitutionen mit der Krankheitsanfälligkeit für BLV und der Krankheitsresistenz direkt korrelierten. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Befunde verwirklicht.
  • Die vorliegende Erfindung macht somit ein Verfahren zur Beurteilung der Möglichkeit des Ausbruchs einer durch bovines Leukämievirus BLV verursachten Rinderleukämie verfügbar, umfassend die Schritte
    • (1) Amplifizieren genomischer DNA, die aus einem Einzelrind isoliert wurde, mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um ein PCR-Produkt herzustellen, das eine DNA enthält, die für einen Teil oder die volle Länge der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC codiert, und
    • (2) Beurteilen, dass bei dem Einzelrind, bei dem die den Aminosäuren Nr. 75 bis 78 (Aminosäurepositionen gemäß 1B) der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse-II-MHC entsprechende Aminosäuresequenz in der von der im PCR-Produkt enthaltenen DNA codierten Aminosäuresequenz Val-Asp-Thr-Tyr ist, die Möglichkeit des Ausbruchs der Leukämie besteht,
    wobei das Verfahren auch einen Schritt des Verdaus des PCR-Produkts unter Verwendung von PstI umfasst.
  • Bereitgestellt als bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden das oben genannte Verfahren, das bei Vieh angewandt wird, das mit dem bovinen Leukämievirus BLV infiziert ist, sowie das oben genannte Verfahren, wobei ein Einzelrind, bei dem die durch die Aminosäuren Nr. 75–78 der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC definierte Aminosäuresequenz in beiden Allelen Val-Asp-Thr-Tyr ist, so beurteilt wird, dass ein Ausbruchsrisiko besteht.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Beurteilung einer Resistenz gegen den Ausbruch einer durch bovines Leu kämievirus BLV verursachten Rinderleukämie bereitgestellt, umfassend die Schritte
    • (1) Amplifizieren genomischer DNA, die aus einem Einzelrind isoliert wurde, mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um ein PCR-Produkt herzustellen, das eine DNA enthält, die für einen Teil oder die volle Länge der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC codiert, und
    • (2) Beurteilen, dass das Einzelrind, bei dem die der Aminosäure Nr. 78 (Aminosäureposition gemäß 1B) der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC entsprechende Aminosäure in der von der im PCR-Produkt enthaltenen DNA codierten Aminosäuresequenz Val ist, Resistenz gegen den Ausbruch der Leukämie aufweist,
    wobei das Verfahren auch einen Schritt des Verdaus des PCR-Produkts unter Verwendung von PstI umfasst.
  • Bereitgestellt als bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden das oben genannte Verfahren, das bei Vieh angewandt wird, das mit dem bovinen Leukämievirus BLV infiziert ist; das oben genannte Verfahren, wobei das Einzelrind, bei dem die durch Aminosäure Nr. 78 der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC näher beschriebene Aminosäure in wenigstens einem der Allele Val ist, so beurteilt wird, dass es Resistenz gegen den Ausbruch aufweist; sowie das oben genannte Verfahren, wobei das Einzelrind, bei dem die durch Aminosäure Nr. 78 der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC näher beschriebene Aminosäure in beiden Allelen Val ist, so beurteilt wird, dass es hohe Resistenz gegen den Ausbruch aufweist.
  • Gemäß bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung werden die jeweils nachstehend angegebenen Primer-Sätze zur Verwendung bei dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bereitgestellt, vorzugsweise bei den Verfahren, die bei Vieh angewandt werden, das mit dem bovinen Leukämievirus BLV infiziert ist. Die vorliegende Erfindung macht die folgenden Primer-Sätze (1) bis (3) verfügbar, jeweils bestehend aus einem Primer A und einem Primer B, die verwendet werden zur Beurteilung der Möglichkeit des Ausbruchs einer durch bovines Leukämievirus BLV verursachten Rinderleukämie oder einer Resistenz dagegen.
    Primer-Satz (1)
    Primer A: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3' (SEQ ID NR. 1),
    Primer B: 5'-CAGGAAACAGCTATGACCCGCCGCTGCACAGTGAAACTC-3' (SEQ ID NR. 2);
    Primer-Satz (2)
    Primer A: 5'-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3' (SEQ ID NR. 3),
    Primer B: 5'-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3' (SEQ ID NR. 4);
    Primer-Satz (3)
    Primer A: ein Primer, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
    5'-GAGTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3' (SEQ ID NR. 5),
    5'-GGAGAAGAGTTCGTGCGCTTCGA-3' (SEQ ID NR. 6) und
    5'-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3' (SEQ ID NR. 3),
    Primer B: 5'-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3' (SEQ ID NR. 4).
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Struktur der DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC. In der Figur zeigt (A) die Struktur der mRNA der DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC, und (B) zeigt in voller Länge die cDNA, die für die DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC codiert, sowie die Aminosäuresequenz des Gen-Produkts. Die β1-Domäne ist ein Teil, der definiert ist durch die Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nummer 1 bis 94.
  • Die 2(A) bis (C) zeigen die Ergebnisse des Vergleichs der Aminosäuren der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC (Aminosäuresequenzen, die definiert sind durch die Aminosäuren Nummer 9 bis 86), die von Vieh stammen, das mit dem bovinen Leukämievirus BLV infiziert ist, jedoch die Krankheit nicht entwickelt ((A): 7 Rinder, die Lymphozytose entwickeln; (B) und (C): 24 Antikörper-positive gesunde Rinder, die die Krankheit nicht entwickeln). Die Zahlen am linken Rand sind die ID-Nummern der einzelnen Rinder, und die Aminosäuren sind als Einbuchstabensymbole in der Figur angegeben.
  • Die 3(A) und (B) zeigen die Ergebnisse des Vergleichs der Aminosäuren der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC (Aminosäuresequenzen, die definiert sind durch die Aminosäuren Nummer 9 bis 86), die von Vieh stammen, das die Leukämie entwickelt (24 Rinder). Die Zahlen am linken Rand sind die ID-Nummern der einzelnen Rinder, und die Aminosäuren sind als Einbuchstabensymbole in der Figur angegeben.
  • Beste Art der Durchführung der Erfindung
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird angewandt bei Einzelrindern, darunter Rinder, die mit dem bovinen Leukämievirus BLV infiziert sind, sowie Rinder, die nicht mit dem Virus infiziert sind, um die Möglichkeit eines Ausbruchs der Leukämie bei den Individuen zu beurteilen. Ein weiteres Verfahren der vorliegenden Erfindung wird angewandt bei Einzelrindern, darunter Rinder, die mit dem bovinen Leukämievirus BLV infiziert sind, sowie Rinder, die nicht mit dem Virus infiziert sind, um eine Resistenz gegen den Ausbruch der Leukämie bei den Individuen zu beurteilen.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die genomische DNA eines Einzelrinds isoliert, und ein Gen, das für einen Teil oder die volle Länge der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC codiert (das zweite Exon des DRB3-Gens) wird mit Hilfe der PCR-Methode amplifiziert, und anschließend wird das resultierende PCR-Produkt sequenziert, um die Aminosäuresequenz abzuleiten, die durch die Aminosäuren Nummer 75 bis 78 der β1-Domäne definiert ist. Wenn ein Einzelrind, bei dem diese Aminosäuresequenz (Aminosäuren Nummer 75 bis 78) Val-Asp-Thr-Tyr ist (dargestellt als VDTY mit den Einbuchstabensymbolen), bereits eine Infektion mit dem bovinen Leukämievirus BLV aufweist, bzw. wenn das Individuum eine Infektion mit bovinem Leukämievirus BLV erleiden wird, so besteht bei dem Einzelrind die Möglichkeit des Ausbruchs der Leukämie. Ob ein Einzelrind mit dem bovinen Leukämievirus BLV infiziert ist oder nicht lässt sich ohne weiteres mit Hilfe eines Tests unter Verwendung eines Antikörpers verifizieren, der das bovine Leukämievirus BLV erkennt.
  • Um zu einer genaueren Beurteilung zu kommen, ist es bevorzugt, die vorstehend erwähnten Aminosäuresequenzen in den Allelen (Haplotypen) zu vergleichen. Ist die Aminosäuresequenz (Aminosäuren Nummer 75 bis 78) gemäß 1B in beiden Allelen Val-Asp-Thr-Tyr (d. h., VDTY-homozygot), so besteht bei dem Einzelrind ein hohes Risiko des Ausbruchs der Leukämie, wenn das Individuum bereits mit dem bovinen Leukämievirus BLV infiziert ist oder eine Infektion mit dem Virus erleiden wird. Sind andererseits die Aminosäuresequenzen in den Allelen heterozygot bezüglich Val-Asp-Thr-Tyr (VDTY) und Val-Asp-Thr-Val (VDTV); heterozygot bezüglich Val-Asp-Thr-Tyr (VDTY) und Val-Asp-Arg-Val (VDRV); homozygot bezüglich Val-Asp-Thr-Val (VDTY); homozygot bezüglich Val-Asp-Arg-Val (VDRV); heterozygot bezüglich Val-Asp-Arg-Val (VDRV) und Val-Asp-Thr-Val (VDTY) oder dergleichen, so besteht bei dem Einzelrind eine sehr geringe Wahrscheinlichkeit des Ausbruchs der Leukämie, selbst wenn das Einzelrind bereits mit dem bovinen Leukämievirus BLV infiziert ist oder eine Infektion mit dem Virus erleiden wird.
  • Vom Gesichtspunkt der Resistenz gegen einen Ausbruch der Leukämie kann zudem die durch die Aminosäure Nummer 78 der β1-Domäne definierte Aminosäure abgeleitet werden. Ist ein Einzelrind, das Val (dargestellt als V mit dem Einbuchstabensymbol) als Aminosäure aufweist (d. h., die Aminosäure Nummer 78), bereits mit dem bovinen Leukämievirus BLV infiziert oder wird eine Infektion mit dem Virus erleiden, so ist das Einzelrind resistent gegen den Ausbruch der Leukämie. Auch bei der Beurteilung der Resistenz wird die oben genannte Aminosäure vorzugsweise in den Allelen (Haplotypen) verglichen. Ist die durch die Aminosäure Nummer 78 der β1-Domäne definierte Aminosäure in wenigstens einem der Allele Val, so besitzt das Individuum Resistenz gegen den Ausbruch der Leukämie, und wenn die obige Aminosäure in beiden Allelen Val ist, so weist das Individuum hohe Resistenz gegen den Ausbruch der Leukämie auf.
  • Die Aminosäuresequenz der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC wurde von Aida et al. berichtet (Aida, Y., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 209, S. 981–988, 1995). Die Struktur der mRNA der DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC (A), die cDNA in voller Länge und die Aminosäuresequenz des Gen-Produkts (B) sind in 1 gezeigt. In der Figur ist die β1-Domäne ein Teil, der definiert ist durch die Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nummer 1 bis 94, und es ist die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz gezeigt, wobei die Peptidsequenz der Aminosäuren Nummer 75 bis 78 Val-Asp-Thr-Tyr (VDTY) ist.
  • Das mit Hilfe des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung zu beurteilende Vieh unterliegt keinen speziellen Einschränkungen. Das Verfahren kann bei jeglicher Art von Vieh angewandt werden, darunter Milchvieh, Milch- und Fleischvieh, Fleischvieh, Arbeitsvieh, Arbeits- und Fleischvieh und dergleichen, solange das Vieh mit dem bovinen Leukämievirus BLV infizierbar ist und aufgrund der Infektion die Möglichkeit besteht, dass es die Leukämie entwickelt. Zu den Beispielen zählen insbesondere japanisches Vieh wie etwa Japanese Black und Japanese Shorthorn oder Rassen wie z. B. Holstein, Jersey, Hereford, Aberdeen Angus und Friesian. Die Rassen sind jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
  • Als Proben für die Herstellung genomischer DNA aus Einzelrindern können peripheres Blut, Organe und dergleichen herangezogen werden. Als Organ kann zum Beispiel ein Gewebeschnitt des Lymphknotens und anderes verwendet werden. Als Methoden zur Herstellung der genomischen DNA aus den Proben können alle Methoden herangezogen werden, die dem Fachmann zur Verfügung stehen. Werden zum Beispiel Leukozyten des peripheren Blutes oder Lymphozyten des peripheren Blutes als Probe eingesetzt, so kann die Methode von Hughes et al. (Hughes, S. H., Cell 15, S. 1397–1410, 1978) angewandt werden. Wird zum Beispiel ein Organ verwendet, so kann ein gefrorener Gewebeschnitt mit einer Schere geschnitten und anschließend zur Gewinnung der genomischen DNA mit der Methode Natrium-dodecylsulfat und Phenol/Chloroform behandelt werden (McKnight, G. S., Cell 14, S. 403–413, 1978). Es kann auch die vereinfachte Gewinnung genomischer DNA aus Zellen angewandt werden, deren Einzelheiten in den Beispielen beschrieben werden.
  • Als Primer, die zur Amplifikation der resultierenden genomischen DNA mit Hilfe der PCR-Methode verwendet werden, können alle Primer verwendet werden, solange sie eine DNA amplifizieren können, die ein Gen enthält, das für eine partielle Aminosäuresequenz aus den Aminosäuren Nummer 75 bis 78 der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC oder die volle Länge der β1-Domäne codiert.
  • Ein Beispiel für einen Primer-Satz, der in sehr zweckmäßiger Weise bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, umfasst den Primer-Satz (1):
    Primer A: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3' (SEQ ID NR. 1) und
    Primer B: 5'-CAGGAAACAGCTATGACCCGCCGCTGCACAGTGAAACTC-3' (SEQ ID NR. 2),
    mit dem direkte Sequenzierungsverfahren möglich sind wie zum Beispiel die zyklische Sequenzierung und die direkte DNA-Sequenzierung mit Dynabeads. Als Primer-Sätze, in die eine Restriktionsendonuclease-Spaltstelle eingeführt wurde, können der Primer-Satz (2):
    Primer A: 5'-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3' (SEQ ID NR. 3) und
    Primer B: 5'-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3' (SEQ ID NR. 4)
    oder der Primer-Satz (3):
    Primer A: ein Primer, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
    5'-GAGTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3' (SEQ ID NR. 5),
    5'-GGAGAAGAGTTCGTGCGCTTCGA-3'(SEQ ID NR. 6), und
    5'-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3' (SEQ ID NR. 3), und
    Primer B: 5'-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3' (SEQ ID NR. 4),
    verwendet werden. Insbesondere kann durch Verdau der PCR-Allele mit PstI, die unter Verwendung des Primer-Satzes (3) amplifiziert werden, und anschließendes Beobachten der resultierenden Spaltungsmuster ohne weiteres beurteilt werden, ob das Einzelrind gegen die Leukämie resistent ist oder nicht, oder ob bei dem Individuum die Möglichkeit des Ausbruchs der Leukämie besteht oder nicht. Die Primer und Primer-Sätze, die bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind jedoch nicht auf die obigen Beispiele beschränkt.
  • Die für das PCR-Verfahren eingesetzte Menge DNA kann in geeigneter Weise gewählt werden. Bei Verwendung von Leukozyten des peripheren Blutes oder peripheren Lymphozyten kann die Menge zum Beispiel etwa 0,1 bis 0,5 μg betragen. Als Sequenzierungsverfahren, die auf die wie vorstehend beschrieben amplifizierte DNA (das PCR-Produkt) anwendbar sind, können alle Verfahren herangezogen werden, die dem Fachmann zur Verfügung stehen. Zum Beispiel kann die direkte Sequenzierung bevorzugt angewandt werden, deren spezielle Beispiele in den Beispielen beschrieben werden. Die meisten Rinder sind Heterozygoten, und wenn die von Vater- und Mutterrind stammenden Allele unterschiedliche Nucleotidsequenzen haben können, ist es möglich, dass sich mit der direkten Sequenzierung nicht bestimmen lässt, welches der Allele der Zielsequenz entspricht. In diesem Fall kann das mit dem obigen Primer-Satz (2) amplifizierte PCR-Produkt mit der Restriktionsendonuclease EcoRI und SalI verdaut und anschließend in einen Vektor subkloniert werden, um die Sequenzierung nur eines der Allele durchzuführen, und die Ergebnisse können zum Vergleich herangezogen werden, um eine eindeutige Sequenzierung des anderen Allels zu ermöglichen. Um zu präziseren genetischen Informationen zu kommen, ist es bevorzugt, dass beide Allele vom PCR-Produkt subkloniert werden und jede der Nucleotidsequenzen bestimmt wird. Das spezielle Verfahren und die verwendbaren Primer werden in den folgenden Beispielen ausführlicher behandelt.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung soll nun anhand von Beispielen näher erklärt werden. Allerdings ist der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf die nachstehend ausgeführten Beispiele beschränkt.
  • Beispiel 1
  • Untersuchung der Möglichkeit des Ausbruchs der Leukämie
  • Mit einer Spritze, die ein Antikoagulationsmittel enthielt, wurde einem Einzelrind peripheres Blut als Probe entnommen und unter Bedingungen von 4°C und 3000 U/min 20 Minuten zentrifugiert, um eine Leukozyten-Schicht zu ergeben. Die abgetrennte Leukozyten-Schicht wurde mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und zentrifugiert, so dass ein Pellet erhalten wurde, das als Probe der Leukozyten des peripheren Blutes verwendet wurde. Mit Hilfe des Verfahrens von Miyasaka et al. (Miyasaka, M. und Trnka, Z., Immunological Methods, Bd. 3, S. 403–423, 1985, Academic Press, NY) wurden auch Lymphozyten des peripheren Blutes aus peripherem Blut erhalten, das in der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben gewonnen worden war, und es wurde eine Probe peripherer Lymphozyten hergestellt durch Gewinnung eines Pellets wie vorstehend beschrieben. Eine BLV-infizierte Zellsuspension wurde unter Bedingungen von 4°C und 1100 U/min 5 Minuten zentrifugiert, um das Kulturmedium zu entfernen, und die Zellen wurden mit PBS gewaschen und zentrifugiert, um ein Pellet als Probe zu ergeben. Des weiteren wurden Gewebeschnitte aus Lymphknoten und einem Tumorgewebe eines Rinds, das ein Lymphosarkom durch BLV-Infektion entwickelt hatte, isoliert und ohne Immobilisierung schnell in flüssigem Stickstoff gefroren und dann als Gewebeschnitt-Proben bei –80°C gelagert.
  • Die obigen Probenzellen wurden jeweils zweimal in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS gewaschen, und die präzipitierten Zellen wurden mit einem Wirbelmischer in PBS resuspendiert. Zu 1·106 Zellen wurden 200 μl 1 × PCR-Puffer [10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,5% Tween-20] und 1 μl Proteinase K (20 mg/ml) gegeben, und die Zellen wurden mit einem Wirbelmischer resuspendiert und 45 bis 60 Minuten bei 56°C inkubiert. Die Mischung wurde zehn Minuten bei 95°C weiter behandelt und 5 Minuten oder länger auf Eis gekühlt. Etwa 5 bis 10 μl der Reaktionsmischung wurden für die Amplifikation mittels PCR eingesetzt.
  • Die genomische DNA wurde gelöst in 50 μl 1 × PCR-Puffer [10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,001% (Gew./Vol.) Gelatine], enthaltend 200 μM des jeweiligen dNTP, 0,2 bis 0,4 μM der Primer und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Gene Amp Kit, Perkin-Elmer Cetus), und anschließend durch 25 Zyklen amplifiziert, wobei jeder Zyklus aus 1-minütiger Behandlung bei 94°C, 1 Minute bei 61°C und 1 Minute bei 72°C und einer weiteren 5-minütigen Behandlung bei 72°C bestand. Als Primer wurden die folgenden Primer eingesetzt:
    Primer A: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3' (SEQ ID NR. 1) und
    Primer B: 5'-CAGGAAACAGCTATGACCCGCCGCTGCACAGTGAAACTC-3' (SEQ ID NR. 2),
    die mit Hilfe des PCR-Verfahrens die β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC (β1-Domäne von BoLA-DRβ: zweites Exon des DRB3-Gens) spezifisch amplifizieren können. Am 5'-Ende des Primers B wurde eine spezifische Biotinylierung eingeführt. Diese Primer können in geeigneter Weise für die zyklische Sequenzierung verwendet werden.
  • 20 μl DYNABEADS M 280 Streptavidin (Dynal A. S., N-0212, Oslo, Norwegen) wurden mit 100 μl 2 × Bindungs- und Waschpuffer (B&W-Puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1,0 mM EDTA, 2 M NaCl, 0,1% Tween-20) gewaschen, und die Kügelchen wurden in 80 μl 2 × B&W-Puffer resuspendiert. Das obige PCR-Produkt (50 μl) wurde zu der Suspension der Kügelchen gegeben, durch Pipettieren behutsam gemischt und anschließend unter langsamer Drehung unter Verwendung eines Radrotors 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Röhrchen mit dem immobilisierten PCR-Produkt wurde auf einen Magneten gesetzt (Dynal MPC), der Überstand wurde mit einer Pipette entfernt, und anschließend wurden 100 μl 2 × B&W-Puffer zugesetzt, um die Kügelchen zu waschen. Mit einem Magneten wurde der Überstand abermals entfernt, und der Rückstand wurde in 50 μl 0,1 M NaOH suspendiert, die kurz vor Gebrauch hergestellt wurde.
  • Die Kügelchen, die die biotinylierten Ketten immobilisieren, wurden mit einem Magnet an der Wandung des Röhrchens angesammelt, der Überstand wurde entfernt, und dann wurden die Kügelchen einmal mit 50 μl 0,1 M NaOH, dreimal mit 100 μl 1 × B&W-Puffer und einmal mit 50 μl TE-Puffer gewaschen. Bei jedem Arbeitsgang wurden die Kügelchen unter leichtem Aufschütteln resuspendiert. Nach Waschen mit 100 μl destilliertem Wasser wurde der Überstand entfernt, und der Rückstand wurde mit destilliertem Wasser versetzt, um das Volumen für die Verwendung bei der Sequenzierung einzustellen. Die Sequenzierung wurde mit einem BcaBEST Dideoxy Sequencing Kit (Takara Biomedicals) gemäß den in den beigefügten Anweisungen beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Die folgenden Primer wurden als Sequenzierungsprimer eingesetzt:
    Forward-Primer: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'
    Reverse-Primer: 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'
  • Die Ergebnisse sind in 2 und 3 gezeigt (in den Figuren sind die Aminosäuren Nummer 9 bis 86 der β1-Domäne von DRβ des bovinen Klasse II-MHC gezeigt, und die Zahlen am linken Rand sind die ID-Nummern der einzelnen Rinder). Durch Vergleichen der Aminosäuren der β1-Domäne von DRβ des bovinen Klasse II-MHC, das von Rindern stammte, die mit dem bovinen Leukämievirus infiziert waren, jedoch keine Leukämie entwickelten [7 Rinder mit Lymphozytose (präkanzeröses Stadium) und 24 Rinder, die keine Leukämie entwickelten (Antikörper-positive gesunde Rinder, die die Krankheit nicht entwickelten), oben bzw. unten in 2], und von Rindern, die bereits Leukämie entwickelt hatten (24 Rinder, 3), ergab sich das deutliche charakteristische Ergebnis, dass die Rinder mit der entwickelten Leukämie das Motiv Val-Asp-Thr-Tyr (VDTY) als Sequenz der Aminosäuren Nummer 75 bis 78 in beiden Allelen aufwiesen. Der Teil der Aminosäuren 75 bis 78 befindet sich auf einer α-Helix der β1-Domäne und könnte die Funktion einer T-Zellen-Erkennungsstelle haben. Durch eine Analyse mit Hilfe eines Computers wurde des weiteren gezeigt, dass dieses Motiv nur im pol-Protein des bovinen Leukämievirus BLV vorliegt.
  • Die obigen Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Darstellung des Genotyps, etwa VDTY/VDTY, in der Tabelle gibt die Aminosäuresequenzen beider Allele (Aminosäuren Nummer 75 bis 78 der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC) als Einbuchstabensymbole an. Der Infektionsstatus der BLV-infizierten Rinder wurde gemäß den Kriterien von Levy et al. klassifiziert (Levy, D., et al., Int. J. Cancer 19, S. 822–827, 1977) und Aida et al. (Aida, Y., et al., Cancer Res. 52, S. 6463–6470, 1992).
  • Tabelle 1
    Figure 00160001
  • Beispiel 2
  • Untersuchungen zur Resistenz gegen den Ausbruch der Leukämie
  • In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurde die Art der Aminosäure Nummer 78 der β1-Domäne von DRβ des bovinen Klasse II-MHC bei Rindern bestimmt, die Leukämie entwickelten (24 Rinder), bei Rindern, die keine Leukämie entwickelten (Rinder mit Lymphozytose und gesunde Rinder, insgesamt 31 Individuen), und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Art der Aminosäuren Nummer 71 und 74 wurde ebenfalls bestimmt (in der Tabelle sind die Aminosäuren als Einbuchstabensymbole angegeben; Y: Tyr; V: Val; R: Arg; E: Glu; K: Lys; und N: Asn). Im Ergebnis wurde gezeigt, dass die Individuen, bei denen die Aminosäure 78 heterozygot bezüglich Valin und Tyrosin ist, und die Individuen, bei denen die Aminosäure 78 homozygot bezüglich Valin ist, resistent gegen den Ausbruch der Leukämie waren, und dass insbesondere die Individuen, bei denen die Aminosäure 78 homozygot bezüglich Valin ist, in hohem Maße resistent gegen den Ausbruch der Leukämie waren. Da überdies bei den Rindern, die keine Leukä mie entwickelten, die Aminosäure 74 durchweg Gln oder Asn war und der Aminosäurerest 71 Lys oder Arg war, wurde darauf geschlossen, dass die Individuen mit dem Allel, bei dem die 71. Aminosäure Lysin oder Arginin ist, die 74. Aminosäure Glutaminsäure oder Asparagin ist und die 78. Aminosäure Valin ist, hohe Resistenz gegen den Ausbruch der Leukämie aufweisen.
  • Tabelle 2
    Figure 00170001
  • Beispiel 3
  • Verfahren zur schnellen Beurteilung der Möglichkeit eines Ausbruchs und der Resistenz dagegen
  • Wie vorstehend beschrieben, sind die Individuen mit dem Gen, das für Val als Aminosäure Nummer 78 der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse II-MHC codiert, gegen die durch das bovine Leukämievirus verursachte Leukämie resistent, während bei den Individuen, bei denen die 78. Aminosäure in beiden Allelen Tyr ist, die Möglichkeit eines Ausbruchs der Leukämie besteht. Ob ein Einzelrind gegen Leukämie resistent ist oder nicht oder ob oder bei einem Individuum die Möglichkeit des Ausbruchs der Leukämie besteht oder nicht kann daher ohne weiteres beurteilt werden durch Nutzung der Spaltungsstelle der Restriktionsendonuclease PstI, die in einem Gen vorhanden ist, bei dem das 78. Allel Val ist, jedoch abwesend ist in einem Gen, bei dem das 78. Allel Tyr ist, d. h., durch Verdau der PCR-amplifizierten Allele und Unterscheidung des Spaltungsmusters.
  • Als PCR-Primer wurden die folgenden Primer eingesetzt:
    Primer A:
    DRB40: 5'-GAGTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3' (SEQ ID NR. 5),
    DRB100: 5'-GGAGAAGAGTTCGTGCGCTTCGA-3' (SEQ ID NR. 6),
    ERB3: 5'-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3' (SEQ ID NR. 3),
    Primer B:
    SRB3: 5'-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3' (SEQ ID NR. 4).
  • Die Bedingungen der PCR waren ähnlich den Bedingungen von Beispiel 1. Im Einzelnen wurde die Amplifikation mittels 35 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus je nach Kombination der Primer aus den folgenden Schritten bestand, gefolgt von einer 10-minütigen Behandlung bei 72°C. Die genomische DNA wurde in einer Menge von 100 ng auf 100 μl PCR-System eingesetzt.
    DRB40/SRB3: 1 Minute 94°C, 2 Minuten 63°C, 2 Minuten 72°C;
    DRB100/SRB3: 1 Minute 94°C, 2 Minuten 66°C, 2 Minuten 72°C;
    ERB3/SRB3: 1 Minute 94°C, 2 Minuten 61°C, 2 Minuten 72°C.
  • Das PCR-Produkt wurde einer 2% Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und anschließend mit Restriktionsendonuclease PstI gespalten (1,2 μl 10 × Restriktionsendonuclease-Puffer, 6,7 μl DNA nach Amplifikation, 2 Einheiten Restriktionsendonuclease PstI und H2O im Gesamtvolumen von 12 μl). Nach Beendigung der Reaktion mit der Restriktionsendonuclease wurde jede Probe mittels 3% Agarose-Gelelektrophorese für die Beurteilung untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
  • Tabelle 3
    Figure 00190001
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung lässt sich bei einem Einzelrind die Möglichkeit des Ausbruchs einer durch das bovine Leukämievirus (BLV) verursachten Leukämie und die Resistenz dagegen verlässlich abschätzen. Die Erfindung ermöglicht daher sichere Viehzucht und verhindert wirtschaftliche Verluste von Viehzüchtern.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00200001
  • Figure 00210001
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Claims (7)

  1. Verfahren zur Beurteilung der Möglichkeit des Ausbruchs einer durch bovines Leukämievirus BLV verursachten Rinderleukämie, umfassend die Schritte (1) Amplifizieren genomischer DNA aus einem Einzelrind mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um ein PCR-Produkt herzustellen, das eine DNA enthält, die für einen Teil oder die volle Länge der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse-II-MHC codiert, und (2) Beurteilen, dass bei dem Einzelrind, bei dem die den Aminosäuren Nr. 75 bis 78 (Aminosäurepositionen gemäß 1B) der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse-II-MHC entsprechende Aminosäuresequenz in der von der im PCR-Produkt enthaltenen DNA codierten Aminosäuresequenz Val-Asp-Thr-Tyr ist, die Möglichkeit des Ausbruchs der Leukämie besteht, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren auch einen Schritt des Verdaus des PCR-Produkts unter Verwendung von PstI umfaßt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Einzelrind, bei dem die durch die Aminosäuren Nr. 75–78 der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse-II-MHC definierte Aminosäuresequenz in beiden Allelen Val-Asp-Thr-Tyr ist, so beurteilt wird, dass ein Ausbruchsrisiko besteht.
  3. Verfahren zur Beurteilung einer Resistenz gegen den Ausbruch einer durch bovines Leukämievirus BLV verursachten Rinderleukämie, umfassend die Schritte (1) Amplifizieren genomischer DNA aus einem Einzelrind mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion, um ein PCR-Produkt herzustellen, das eine DNA enthält, die für einen Teil oder die volle Länge der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse-II-MHC codiert, und (2) Beurteilen, dass das Einzelrind, bei dem die der Aminosäure Nr. 78 (Aminosäureposition gemäß 1B) der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse-II-MHC entsprechende Aminosäure in der von der im PCR-Produkt enthaltenen DNA codierten Aminosäuresequenz Val ist, Resistenz gegen den Ausbruch der Leukämie aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren auch einen Schritt des Verdaus des PCR-Produkts unter Verwendung von PstI umfaßt.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei ein Einzelrind, bei dem die durch die Aminosäure Nr. 78 (Aminosäureposition gemäß 1B) der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse-II-MHC definierte Aminosäure Val ist, so beurteilt wird, dass es Resistenz gegen den Ausbruch der Leukämie aufweist.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Einzelrind, bei dem die durch Aminosäure Nr. 78 (Aminosäureposition gemäß 1B) der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse-II-MHC näher beschriebene Aminosäure in wenigstens einem der Allele Val ist, so beurteilt wird, dass es Resistenz gegen den Ausbruch aufweist.
  6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Einzelrind, bei dem die durch Aminosäure Nr. 78 (Aminosäureposition gemäß 1B) der β1-Domäne der DRβ-Kette des bovinen Klasse-II-MHC näher beschriebene Aminosäure in beiden Allelen Val ist, so beurteilt wird, dass es eine hohe Resistenz gegen den Ausbruch aufweist.
  7. Primer-Satz zur Verwendung bei dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Beurteilung der Möglichkeit des Ausbruchs einer durch bovines Leukämievirus BLV verursachten Rinderleukämie oder einer Resistenz dagegen, dadurch gekennzeichnet, dass der Primer-Satz in einer 1. Alternative einen Primer-Satz I umfaßt: (a) Primer A: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3' (SEQ ID NR. 1) und (b) Primer B: 5'-CAGGAAACAGCTATGACCCGCCGCTGCACAGTGAAACTC-3' (SEQ ID NR. 2); oder in einer 2. Alternative einen Primer-Satz II: (a) Primer A: 5'-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3' (SEQ ID NR. 3) und (b) Primer B: 5'-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3' (SEQ ID NR. 4); oder in einer 3. Alternative einen Primer-Satz III: (a) einen Primer, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 5'-GAGTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3' (SEQ ID NR. 5), 5'-GGAGAAGAGTTCGTGCGCTTCGA-3'(SEQ ID NR. 6), und 5'-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3' (SEQ ID NR. 3), und (b) Primer B: 5'-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3' (SEQ ID NR. 4).
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