DE69729303T2

DE69729303T2 - Verfahren zur schnellen quantifizierung von mikrobieller kontamination von flüssigkeiten und apparat dafür

Info

Publication number: DE69729303T2
Application number: DE69729303T
Authority: DE
Inventors: F. Jeffrey KANE; Tod Noel BORTON
Original assignee: Pall Corp
Current assignee: Pall Corp
Priority date: 1996-07-29
Filing date: 1997-07-25
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2017-07-26
Also published as: GB2329394A; US5979668A; US5820767A; EP0915964B1; EP0915964A2; AU3968297A; DE69729303D1; GB9828769D0; CA2264958A1; WO1998004675A3; WO1998004675A2; AU723744B2; JP2000517171A; GB2329394B; KR20000029540A; CA2264958C

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffangen, Wiederfinden und Quantifizieren der Mikroorganismenkontamination von Flüssigkeiten sowie eine Vorrichtung, welche zur Verwendung für das Verfahren geeignet ist. Im Besonderen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Quantifizieren von Mikroorganismen, welche in Wasserquellen vorhanden sind, durch die Anwendung von Filtration und Elution mit einer bislang unerreichten Wegwerf-Filtrationskapsel. Im Besonderen ist das Verfahren anwendbar auf die Quantifizierung von pathogenen Cryptosporidium- und Giardia-Keimen aus Seen, Flüssen, Trinkwassersystemen und dergleichen.
Hintergrund der Erfindung
Dem Schutz des Trinkwassers nach hygienischer Beschaffenheit kommt weltweite Bedeutung zu. Zwar existiert eine Vielzahl von Quellen für mikrobielle Kontamination, ein besonderer Anlass zur Besorgnis ist jedoch der Eintrag von pathogenen Intestinalprotozoen, wie Cryptosporidium und Giardia, in die Wasserversorgung. Diese Mikroorganismen sind besonders besorgniserregend, weil sie häufig in Form von Cysten und Oocysten vorhanden sind. Der Zystenbildungsprozess macht die Organismen widerstandsfähig gegen Umwelteinflüsse. Derartige intestinale Krankheitserreger gelangen häufig durch direkte Deposition von Fäkalien menschlicher oder tierischer Herkunft (sowohl von Haustieren als auch von wildlebenden Tieren) oder durch gezielte oder unbeabsichtigte Einleitung von Schmutz- oder Abwasser in den See, Fluss oder Aquifer, welcher das Rohwasser liefert, das behandelt werden soll, um es trinkbar zu machen. Zusätzlich zu der Untersuchung des Trinkwassers auf das Vorhandensein von Mikroorganismen kann man in vielen Fällen mit stromaufwärts durchgeführten Untersuchungen die Kontaminationsquelle identifizieren. Neben Trinkwasseruntersuchungen sind vielfach auch Untersuchungen von Wasser notwendig, welches erwartungsgemäß zum Schwimmen oder Baden benützt wird, um die Ausbreitung von Krankheiten zu vermeiden; als Beispiel hierfür sei angeführt die Schließung eines großen Teils des westlichen Ufers des Lake Saint Clair in Michigan im Sommer 1993 infolge fäkaler Kontamination durch Abwasserüberlauf und gleichzeitigem Auftreten von Wetterbedingungen, welche die Kontamination in windseitigen Gebieten aufrechterhielten, anstatt sie zu bessern.
Der derzeit vorgeschlagene Test auf Cryptosporidium und Giardia ist in ASTM D-19 Proposal P229, "Proposed Test method for Giardia Cysts and Cryptosporidium Oocysts in Low-Turbidity Water by a Fluorescent Antibody Procedure" dargelegt. Die vorgeschlagene Untersuchungsmethode der Umweltschutzbehörde der vereinigten Staaten (Environmental Protection Agency (EPA)) wurde in 59 Fed. Register No. 28, 6416–6427 (10. Februar 1994) veröffentlicht und ist im Wesentlichen ähnlich dem Verfahren nach ASTM P229.
Bei dem Verfahren nach ASTM P229 wird das zu untersuchende Wasser durch ein Patronenfilter geleitet, welches ein spiralgewickeltes Tiefenfilter mit einer Länge von 25,4 cm (10 Inch) enthält. Das empfohlene Wasservolumen beträgt 380 l (100 gal.) und wird durch die Filterpatrone geleitet, wobei das spiralgewickelte Filterelement mit einer nominalen Porengröße von 1 μm das suspendierte Material zurück hält (siehe jedoch unten) und das Wasser, in dem das Sediment suspendiert ist, hindurchlässt. Wenn die erforderliche Wassermenge das Filter passiert hat, wird die Patrone auseinandergebaut und das Wasser, welches in dem Patronengehäuse und in der Patrone selbst vorhanden ist, wird für den Transport ins Labor in einen Kunststoff-Probenbeutel überführt, z. B. in einen versiegelbaren (Zip-Lock^TM-)Beutel, wobei es bevorzugt doppelt eingebeutelt wird.
Im Labor wird die Filterpatrone mit einem Messer oder einem Skalpell aufgetrennt und Garnhülle und Sediment werden in drei Teile aufgeteilt, nämlich einen inneren, relativ sedimentfreien Teil, einen dazwischenliegenden Teil und einen äußeren, stark sedimentierten Teil. Das Garn in jedem dieser Teile wird sukzessive mit den gleichen drei 1,0 l-Volumina Elutionslösung gewaschen, wobei das innerste Garn zuerst gewaschen wird. Der Waschschritt besteht darin, das Garn in den Elutionslösungen von Hand zu massieren; alternativ wird das Garn in einen Stomacherbeutel gegeben (alternative EPA-Vorgehensweise) und in einem Stomacher homogenisiert und im Anschluss daran von Hand massiert und ein zweites Mal homogenisiert.
Das Eluat, welches Sediment und Mikroorganismen, die von dem Filter aufgefangen wurden, enthält, wird 10 Minuten bei 1050 × g in 250 ml-Zentrifugenflaschen in einer Schwingbecherzentrifuge zentrifugiert, der Überstand als Abfall verworfen und die Feststoffe zusammengeführt, resuspendiert und rezentrifugiert, um ein Pellet herzustellen, dessen Volumen gemessen wird und von dem ein Teil resuspendiert und auf das Vorhandensein von Cryptosporidium und Giardia nach Standard-Molekularmethoden untersucht wird, in diesem Fall mittels Fluoreszenz-Antikörper-Techniken. Weitere Information bezüglich dieser molekularen Verfahren sowie anderer Verfahren, welche allgemein von Nutzen sein mögen, sind bei Abdallah M. Isa, "Elisa Technology", Encyclopedia of Microbiology, Vol. 2, pp. 59–62 (1992); J. Lederberg, Ed., "Indirect Fluorescent Antibody Tests and other Immunomicroscopic Methods", Encyclopedia of Microbiology, Vol. 2, pp. 163–164 (1992); E. Baron, L. Peterson and S. Finegold, Diagnostic Microbiology, Bailey & Scott's; pp. 1015–1018; D. Jones, "Polymerase Chain Reaction (PCR)", Encyclopedia of Microbiology, Vol. 3, pp. 443–449 (1992); and J. Conroy, R. Stevens and K. Hechemy, "Enzyme Immunoassay", Encyclopedia of Microbiology, Vol. 3, pp. 87–92 (1992) offenbart.
Die Untersuchungsmethoden nach dem Stand der Technik lassen viel zu wünschen übrig. Zu den Unzulänglichkeiten zählt folgendes:
die Filterpatronen und -gehäuse von verschiedenen Herstellern sind untereinander nicht voll austauschbar;
die Filterpatronen können falsch installiert werden;
die Filtergehäuse müssen zwischen den Einsätzen gereinigt werden, was sowohl zeitaufwändig ist als auch die Gefahr einer Kreuzkontamination birgt;
die Filter-"Porengröße", obschon nominal 1 μm, überspannt einen weiten Bereich, was gegebenenfalls eine erhebliche Passage von Sediment und Mikroorganismen erlaubt;
Gehäusewasser und Filterpatrone werden in Plastikbeuteln aufbewahrt, die leckanfällig infolge Beschädigung oder unsachgemäßen Verschluss sind und somit sowohl ein Kreuzkontaminations-, Transport- als auch Probenverlustrisiko darstellen;
Installation und Entnahme muss mit Schutzausrüstung erfolgen (Latexhandschuhe).
Die vorstehenden Unzulänglichkeiten sind mit der grundlegenden Beschaffenheit der Filterpatrone und des Filtergehäuses und deren Feldeinsatz assoziiert. Bei Ankunft im Labor ergeben sich jedoch weitere schwerwiegende Unzulänglichkeiten. Beispielhaft sei angeführt:
das Filterelement muss mit einem Messer oder Skalpell manuell aufgetrennt werden, was ein Infektionsrisiko für den Techniker birgt, selbst wenn er Latexhandschuhe trägt;
der Waschvorgang ist zeitaufwändig und verlangt große Eluatmengen;
der Waschvorgang ist ineffizient, was zu einer relativ geringen Wiederfindung der Mikroorganismen führt, und ist ferner sehr veränderlich;
die Eluatzentrifugation verlangt große Zentrifugenflaschen, welche nach Gebrauch bevorzugt weggeworfen werden, um eine Kreuzkontamination zu verhindern; und
die Zusammenführung von zentrifugierten Proben für weitere Aufkonzentrierungsläufe birgt das Risiko des Probenverlusts und/oder der Kontamination.
Die vorstehende Aufzählung zeigt nur ein paar der Unzulänglichkeiten auf, die mit dem Verfahren nach dem Stand der Technik verbunden sind. Als ein Hinweis darauf, wie groß die Auswirkung dieser Unzulänglichkeiten auf die Mikroorganismenquantifizierung sein kann, sei angeführt, dass in einem Ringversuch, bei dem eine bekannte Menge an Challenge-Mikroorganismen enthaltendes Wasser unter Anwendung des vorgeschlagenen ASTM-Verfahrens "quantifiziert" wurde, im Mittel weniger als 3% Cryptosporidium-Mikroorganismen wiedergewonnen wurden (EPA Contract No. 68-C3-0365, WA No. 2-2, p. 21).
Es wäre wünschenswert, ein Verfahren zum Isolieren von Mikroorganismen aus Flüssigkeiten bereitzustellen, welches das Kontaminations- und Kreuzkontaminationsrisiko minimiert; welches eine Leckage während des Transports im Wesentlichen verhindert; welches die Rückhaltung von Sediment und Mikroorganismen maximiert; welches sparsamer bezüglich Zeit- und Kapitalaufwand ist; welches das Infektionsrisiko für das Laborpersonal im Wesentlichen vermindert; welches eine Quantifizierung mit kleineren Probengrößen erlaubt; welches mit kleineren Eluatmengen arbeiten kann und welches die Gelegenheit zu mehr Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Quantifizierung bietet.
Die WO 94/28110 betrifft eine Testvorrichtung, umfassend ein Gehäuse mit zwei Kammern, von denen jede teilweise durch ein Filtermaterial definiert ist und von denen jede einen Flüssigkeitseinlass aufweist. Es sind Mittel vorgesehen zum Halten des Filtermaterials in einer ersten oder zweiten Position, derart, dass die Kammern entweder getrennt voneinander oder in Verbindung miteinander sind.
Die JP 05 306 978 A betrifft eine Mikrobentestvorrichtung, welche Mikroben durch die Verwendung von Kontrollmitteln automatisch wiederfinden kann. Die Vorrichtung umfasst ferner Probenwasserzuflussmittel, Mittel zum Einspritzen einer mikrobenfragmentierenden Flüssigkeit, eine Filterpatrone, eine Filterpatronenversorgungseinrichtung, eine Transporteinrichtung, eine Mikrobenfragmentierungseinrichtung und eine Probenwasserextraktionseinrichtung.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Quantifizierung von Mikroorganismen in einer Fluidprobe, die verdächtig ist, Mikroorganismen zu enthalten, wobei das Verfahren umfasst: a) Verbinden einer Quelle, die die mikroorganismenverdächtige Probe enthält, mit einem Probeneinlass einer Wegwerf-Filtrationskapsel; b) Durchfließenlassen eines bekannten Volumens der mikroorganismenverdächtigen Fluidprobe durch die Wegwerf-Filtrationskapsel, wobei die Wegwerf-Filtrationskapsel ein Polymer-Gehäuse mit einem Probeneinlass und einem Auslass umfasst, wobei zwischen dem Probeneinlass und dem Auslass ein nicht-eingeschlossenes Filterelement angeordnet ist, welches eine Membran umfasst, so dass jegliches Fluid, welches von dem Probeneinlass zu dem Auslass fließt, durch die Membran hindurchtreten muss, und worin Mikroorganismen enthaltendes Sediment auf der Aufstromseite der Membran aufgefangen wird, wobei die Kapsel ein elutionswirksames Hohlraumvolumen aufweist; c) Dekantieren von Flüssigkeit und Sediment von der Aufstromseite der Wegwerf-Filtrationskapsel durch den Probeneinlass in Form eines Anfangseluates; d) Zugabe von mindestens einem Volumen an Elutionslösung zu der Aufstromseite der Wegwerf-Filtrationskapsel, Bewegen der Wegwerf-Filtrationskapsel, um mindestens einen Teil von jeglichem zurückbleibenden Sediment zu resuspendieren, und Dekantieren eines Sedimenteluates; e) gegebenenfalls Wiederholung von Schritt d) und Dekantieren von einem oder mehreren weiteren Eluaten; f) gegebenenfalls Zusammenführen von einem oder mehreren der Anfangseluate und des oder der Folgeeluate, um ein kombiniertes Eluat zu bilden; g) gegebenenfalls Konzentrieren des einen oder der mehreren Anfangseluate, des oder der Folgeeluate und/oder des kombinierten Eluates, um ein konzentriertes Eluat zu bilden; und h) Quantifizieren von einem oder mehreren Ziel-Mikroorganismen aus dem Anfangseluat, dem oder den Folgeeluaten, dem oder den kombinierten Eluaten und/oder dem oder den konzentrierten Eluaten.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird eine Wegwerf-Filtrationskapsel bereitgestellt, geeignet zur Verwendung bei der Quantifizierung von Mikroorganismen in einer Mikroorganismen enthaltenden Fluidprobe, wobei die Filtrationskapsel umfasst: a) ein Polymer-Gehäuse mit mindestens einem versie gelbaren Einlass und einem versiegelbaren Auslass; b) ein gefaltetes Filterelement, umfassend eine Membran mit einer Porengröße derart, dass ein interessierender Mikroorganismus im Wesentlichen von der Membran zurückgehalten wird, wobei die Membran eine aufstromseitige Seite und eine abstromseitige Seite aufweist, wobei die Membran zwischen dem Einlass und dem Auslass angeordnet ist, so dass Fluid, welches durch den Einlass eintritt und durch den Auslass austritt, durch die Membran hindurch fließen muss, wobei die Aufstromseite der Membran im Wesentlichen frei von einer Einschluss-Struktur ist, welche eine Resuspendierung der Mikroorganismen, welche auf der Membran während des Filterns abgelagert wurden, stören würde; und worin die Filtrationskapsel ein für eine Elution wirksames Hohlraumvolumen aufweist, welches in der Lage ist, ein ausreichendes Volumen an Elutionslösung aufzunehmen und eine ausreichende Bewegung zum Resuspendieren der Mikroorganismen, welche auf der Membran während der Filtration abgelagert werden, zu ermöglichen.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 zeigt eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Wegwerfkapsel sowie den Fluss des Fluids durch die Vorrichtung.
2a ist eine querschnittliche Darstellung einer Endabdeckung entlang der Linie 2-2 von 1.
2b ist eine querschnittliche Darstellung einer alternativen Endabdeckung, auf der Probeneinlässe und Auslässe angeordnet sind.
2c zeigt die Endabdeckung von 2b in der Draufsicht von oben (außen).
2d zeigt eine entfernbare Endabdeckung im Querschnitt.
3a zeigt die enge Faltenanordnung, welche mit traditionellen großvolumigen Membranfiltern assoziiert ist, vom Ende des Membranfilterelementes aus gesehen.
3b zeigt eine Ausführungsform eines locker gefalteten Membranfilters.
3c zeigt eine weitere Ausführungsform eines locker gefalteten Membranfilters.
3d zeigt eine typische Faltenkonfiguration in der Nähe von aneinander gebundenen Falten.
4 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform des Quantifizierungsverfahrens in Einklang mit der vorliegenden Erfindung.
5a zeigt eine alternative Ausführungsform der erfindungsgemäßen Patrone, während 5b einen Querschnitt der erfindungsgemäßen Patrone entlang der Linie 5b-5b von 5a zeigt.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung verwendet eine bislang unerreichte Wegwerf-Filtrationskapsel, um sowohl Sediment und Mikroorganismen aufzufangen wie auch ein diese enthaltendes Eluat bereitzustellen zur weiteren Untersuchung, um gegebenenfalls vorhandene Ziel-Mikroorganismen zu quantifizieren. Die neuartigen Aspekte des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen also die Schritte eines kompletten Quantifizierungsprotokolls vom Auffangen bis zur Elution und/oder Zentrifugation/Aufkonzentrierung.
Die Filtrationskapsel in Einklang mit der vorliegenden Erfindung verwendet ein Oberflächenfiltrationsmedium, welches auf der Aufstromseite voll exponiert ist, um eine hohe Wiedergewinnung (Wiederfindung) der Mikroorganismen zu ermöglichen. "Oberflächenfiltration" bedeutet, dass der Hauptteil der Mikroorganismen auf oder über der Oberfläche der Membran zurückgehalten wird, im Gegensatz zu einem Eindringen in die Membran, was die Entfernung verhindern würde. Der Ausdruck "voll exponiert" bedeutet eine Membran, welche nicht bedeckt oder eingeschlossen ist von einer poröseren Membran, einem Vorfilter oder dergleichen, was die Entfernung der Mikroorganismen ebenfalls stören würde. Eine grobe Sieb-, Netz- oder Maschenstruktur, welche als Träger oder Rückhaltung für das Filtermedium dient, dabei aber die Wiederfindung der Mikroorganismen im Wesentlichen nicht verhindert, ist keine Einschlussbedeckung und kann ein wünschenswertes Merkmal der erfindungsge mäßen Kapseln sein. Die Membran kann gefaltet sein, planar sein oder ein Hohlfaserbündel oder eine andere Form von Membran umfassen.
Die Gestalt und Anordnung der Filtrationsmembran kann variieren und ist nur insofern kritisch, als dass bei Verwendung einer gefalteten Membran, eines Bündels von Hohlfasern oder einer anderen Membran, wo die aufstromseitigen Membranflächen eng benachbart sind, die Oberflächen ausreichend getrennt werden müssen, um eine hohe Wiederfindung der Mikroorganismen/Partikel zu erlauben. Ein dichtgefaltetes Filter, bei dem zum Beispiel die Mehrheit der Falten aneinander anliegen, ist nicht wünschenswert. Eine flache, planare Membran oder ein flache Membran in zylinderförmiger Ausführung ist z. B. sehr geeignet, erlaubt aber nur begrenzte Strömungsraten. Kommerziell erhältliche Filter sind nicht geeignet, weil die Faltenanordnung zu eng ist und die Filterkapselwandungen zu nahe am Filterelement liegen, als dass das notwendige Elutionsvolumen möglich wäre.
Es wird nun auf 1 Bezug genommen, welche eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Wegwerfkapsel zeigt. Gemäß 1 ist die Kapsel 1 hermetisch versiegelt. Der Polymerkörper 3, welcher vorzugsweise transparent ist, enthält einen Proben-(Wasser/Sediment-)Einlass 5, welcher mit rippenbildenden röhren- oder rohrstutzenförmigen Strukturen 7 geformt ist, um das Dichten des Probenzuführungsschlauchs oder der Probenzuführungsleitung 9 zu unterstützen, welche mittels einer Standardluftfahrtklemme oder einer gleichwerten oder anderen Dichtungsanordnung dichtschließend mit der Kapsel verbunden werden kann. Alternativ kann der Probeneinlass 5 als Standardschlauchanschluss ausgeführt sein, d. h. als männlicher oder weiblicher Schraubverbinder.
Das Kapselgehäuse 3 ist mit der polymeren Endabdeckung 11 durch eine Klebverbindung, Lösungsschweißen, Thermofusion, Ultraschallschweißen oder andere Standard-Verbindungs-/-Siegeltechniken hermetisch versiegelt. Das Filterelement 12 in integraler, gefalteter Ausführung umfasst eine locker gefaltete mikroporöse Membran 13, welche auf der Aufstromseite voll exponiert ist, d. h. nicht von einem Einschlussvorfilter oder einer anderen Einschlussfläche bedeckt ist, um auf der aufstromseitigen Oberfläche des Filters festgehal tenes Sediment leicht eluieren zu können, und welche innerhalb einer optionalen Maschenstruktur 15 aus einem Kunststoff- oder anderen Material aufgenommen ist. Die mikroporöse Membran 13 wird von einem steifen Stützkern 17 gestützt, welcher hier als eine perforierte Kunststoffhülse gezeigt ist, und kann einen weiteren Gewebe-, Nonwoven- oder Membranträger auf der Abstromseite aufweisen. Das aufstromseitige, exponierte Ende des integralen gefalteten Filterelementes 12 ist hermetisch mit der Endabdeckung 19 versiegelt. Zu dem Ende des integralen Faltenfilterelementes hin, welches mit einem Fluidauslass 21 kommuniziert, ist das Element mit der Endabdeckung 11 hermetisch versiegelt, wobei es an die innere Oberfläche des radial konzentrischen Flansches 23 gesiegelt oder geklebt ist. Bei 25 ist ein optionales Luftauslassventil gezeigt, welches mit einer Gehäuseerweiterung 27 verschraubt ist. Das Innere des Luftauslassventils kann mit einem elastomeren Material gefüllt sein, um die Entfernung oder Probenahme des Inhalts mittels einer Spritze über ein Loch 29 zu ermöglichen. Angeordnet zwischen der Endabdeckung 19 und dem Ende 31 des Gehäuses 3, welche hermetisch miteinander verbunden sind, befindet sich ein Hohlraumvolumen zur Aufnahme eines Eluats.
Es wird weiterhin auf 1 Bezug genommen, gemäß welcher der Fluidfluss durch die Kapsel von 1 durch breite Pfeile gezeigt ist. Das Fluid, welches durch den Probeneinlass 5 eintritt, umströmt und durchströmt das integrale Faltenfilterelement 12 und tritt durch den Auslass 21 aus. Sediment, welches in der in die Vorrichtung eintretenden Probenflüssigkeit enthalten ist, wird zwischen dem integralen gefalteten Filterelement 12 und dem Polymergehäuse 3 festgehalten, während das die Vorrichtung verlassende Fluid im Wesentlichen sedimentfrei ist.
Es versteht sich, dass auch andere Ausführungsformen der Kapsel möglich sind. Erforderlich sind ein nicht-eingeschlossenes Filterelement, zum Beispiel ein locker gefaltetes Membranfilterelement ohne eine interferierende, bedeckende oder einschließende Schicht auf der Aufstromseite; Mittel zum Versiegeln der Enden des Elementes, so dass der Fluidfluss gänzlich durch die Membran stattfindet; ein Probeneintrittsdurchlass, welcher mit der Probenseite des Filterelementes in Verbindung steht, und ein Austrittsdurchlass, welcher mit der Filtratseite des Filterelementes in Verbindung steht; und ein Hohlraumvolumen von einer solchen Größe, dass ein ausreichendes Eluatvolumen aufgenommen werden kann und eine ausreichende Bewegung zum Resuspendieren des ganzen oder des wesentlichsten Teils des Sediments ermöglicht wird.
2a ist eine querschnittliche Darstellung einer Endabdeckung entlang der Linie 2-2 von 1. Der Fluidauslass 21 liegt innerhalb des Dichtflansches 23, mit dessen Innenumfang 23a das Filterelement versiegelt ist. Das Gehäuse (in 1 mit "3" bezeichnet) ist zwischen Oberflächen 23b und 24 gesiegelt.
2b ist eine querschnittliche Darstellung einer alternativen Endabdeckung zur Verwendung in einem polymeren Gehäuse wie in 1 mit "3" bezeichnet, wobei jedoch der Probeneinlass 5 zur Endabdeckung 11 verlagert wurde. In 2b ist das Filterelement (in 1 mit "12" bezeichnet) zwischen Dichtflächen 23a gesiegelt und das Polymer-Gehäuse (in 1 mit "3" bezeichnet) zwischen Dichtflächen 23b und 24 gesiegelt. Angeordnet zwischen den Dichtflächen 23a und 23b an einem Teil der Endabdeckung befindet sich der Fluidauslass 21. Die optionale Entlüftung kann ebenfalls zur Endabdeckung 11 verlagert sein, wie bei 25 gezeigt, wobei ein Verschluss 25a in ihm angeordnet eine optionale elastomere durchstoßbare Dichtung 25b enthält. Der Verschluss ist über ein Gewinde oder auf eine andere Art und Weise mit der Erweiterung 27 verbunden, welche durch die Öffnung 27a mit der Aufstromseite des Filterelementes 12 in Verbindung steht.
2c zeigt die Endabdeckung von 2b von oben gesehen. Das Filterelement (in 1 mit "12" bezeichnet) ist innerhalb der Oberfläche 23a des Flansches 23 gesiegelt. In diesem Fall ist der Flansch 23 nicht radial symmetrisch mit den Außenabmessungen der Endabdeckung, sondern versetzt, um ein sich in Längsrichtung erstreckendes Hohlraumvolumen 33 mit einem halbmondförmigen Querschnitt bereitzustellen, mit dem der Einlass 5 und die (hier ohne Verschluss 25 gezeigte) Erweiterung 27 für das optionale Luftauslassventil in Verbindung stehen. Das polymere Gehäuse (in 1 mit "3" bezeichnet), welches nun ein geschlossenes Ende aufweist, wo früher der Einlass 5 und die Entlüftung 27 angeordnet waren, ist zwischen Dichtflächen 23b und 24 gesiegelt, welche schattiert dargestellt sind. Es versteht sich, dass durch geeignete Positionierung des Probeneinlasses 5, des Auslasses 21 und der Erweiterung 27 für die optionale Entlüftung die verschiedenen Dichtflansche alle so ausgeführt sein können, dass sie radial konzentrisch angeordnet sind und das Hohlraumvolumen wieder jenseits des hermetisch geschlossenen Endes 19 des Filterelementes 12 angeordnet sein kann.
Der Querschnitt des Filterelementes kann eine beliebige Gestalt aufweisen, die mit der Forderung vereinbar ist, eine gute Abdichtung mit dem jeweiligen Dichtflansch an der Endabdeckung zu erhalten. Ferner: sind Einlass, Auslass und Entlüftungsventile sämtlich an der Endabdeckung, mit einem sich in Längsrichtung erstreckenden Hohlraumvolumen angeordnet, dann kann das aufstromseitige Ende des Filterelementes, welches bei 19 in 1 hermetisch geschlossen dargestellt ist, stattdessen hermetisch an das Ende 31 des polymeren Gehäuses 3 gesiegelt sein. Es sei betont, dass das Hohlraumvolumen einen doppelten Zweck erfüllt insofern, als es nicht nur eine ausreichende Menge der Elutionslösung aufnimmt, sondern auch ausreichend physikalischen Raum bereitstellt, so dass eine gründliche Bewegung realisiert werden kann. Der Ausdruck "wirksames" Hohlraumvolumen bezieht sich also nicht nur auf das Volumen dieses Hohlraums, sondern auch auf die Fähigkeit, eine ausreichende Menge an Sediment resuspendieren zu können, bevorzugt mindestens 30%, noch bevorzugter mindestens 50%, weiter bevorzugt 70% und meistbevorzugt 90% oder mehr, alles ohne auf eine besonders heftige Bewegung oder eine Dissektion der Membran zurückgreifen zu müssen.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Filters ist in den 5a und 5b gezeigt. Gemäß 5a besteht eine zylinderförmige Kapsel aus einem zylinderförmigen Filtergehäuse 501 und Endabdeckungen 503. Die Endabdeckungen 503 weisen Einlass-/Auslassstutzen auf, wobei der Einlassstutzen 505 mit einem Eintritts-/Elutionsreservoir 511 in Verbindung steht und der Auslassstutzen 507 mit einem Austrittsreservoir 509 in Verbindung steht. Ein Filterelement 513 umfasst eine Träger-Netzstruktur 517, ein Membranfilter 519 und eine Rückhalte-/Rückspül-Netzstruktur 515. Das Filterelement ist in 5b im Querschnitt gezeigt.
Gemäß 5b weist die Filternetzstruktur 517 eine Mehrzahl von "Spitzen und Tälern" 521 und 523 auf, um das Membranfilter 519 zu stützen. Löcher 525 erlauben den Zutritt von Filtrat in das Austrittsreservoir 509. Oben auf der Membran 519, bezogen auf die Aufstromseite, befindet sich eine steife Kunststoffmaschenstruktur 515, die es erlaubt, praktisch die gesamte Membranoberfläche nicht-eingeschlossen oder unverdeckt zu lassen, die aber dennoch ausreichend Membranstützung bereitstellt, um vorübergehend auftretendem Rückdruck zu widerstehen, und die insbesondere ein Rückspülen erlaubt, um eine vollständigere Wiederfindung der Mikroorganismen zu erzielen. Die in den 5a und 5b gezeigte Vorrichtung muss nicht zylinderförmig sein, sie kann auch flach sein oder eine andere Gestalt aufweisen, solange diese mit einer leichten Herstellung und der Fähigkeit, dem erwarteten Wasserfiltrationsdruck zu widerstehen, vereinbar ist.
Die erfindungsgemäßen Kapseln unterscheiden sich merklich von anderen Filtrationsvorrichtungen. Erstens ist die Vorrichtung in ihrer bevorzugten Ausführungsform eine hermetisch geschlossene, integrale Einheit. Allgemein sind bei dieser Art von Anwendungen die Vorrichtungen, welche für die Filtration großer Volumina ausgebildet sind, als austauschbare Filterelemente zur Montage in einem festen Patronengehäuse ausgebildet. Zweitens ist die Faltung der gefalteten mikroporösen Membranausführungen "locker", wie im Folgenden definiert. Bei konventionellen Filtrationselementen sind die Falten dicht zusammengepackt, um die Filteroberfläche zu maximieren und dadurch den Durchsatz zu erhöhen sowie die Zeit zwischen Filterelementwechseln zu verlängern. Eine konventionelle Konfiguration ist in 3a gezeigt, welche den Querschnitt eines konventionellen zylinderförmigen Filterelementes zeigt. Die Filterfalten 301 sind radial um eine makroporöse zylinderförmige Stütze 303 herum angeordnet, bei der es sich um eine Kunststoffnetzstruktur handeln kann, wie bei 17 in 1a gezeigt. Es ist ersichtlich, dass die Falten im Wesentlichen aneinander anliegen. Dieses Aneinanderanliegen ist notwendig, um in konventionellen mikroporösen Membranfiltern die Leistung (Performance) zu maximieren. Diese konventionellen Filter sind so ausgebildet, dass sie große Flüssigkeitsvolumina bei möglichst kleiner Größe und damit möglichst niedrigen Kosten durchsetzen können. Die von solchen Filtern festgehaltenen Feststoffe sollen verworfen werden und deshalb ist eine dichte Packung der Falten wünschenswert.
Bei den Wegwerfkapseln in Einklang mit der vorliegenden Erfindung ist die Flussrate jedoch nur insofern wichtig, als dass langsamere Durchflussgeschwindigkeiten längere Sedimentsammelzeiten erfordern; die Kapsel ist ausgebildet für den Zweck des reversiblen Einfangens von Sediment, nicht zur Erzeugung hoher Durchflussraten über lange Zeiträume hinweg. Am wichtigsten und von größter Bedeutung für das Verfahren zum Quantifizieren von Mikroorganismen wie hierin definiert ist jedoch, dass Sediment und Mikroorganismen resuspendierbar und aus der Kapsel eluierbar sein müssen. Bei Vorrichtungen wie z. B. Membran-Patronenfiltern für die Wasser- oder Getränkefiltration liegt das Ziel darin, das Sediment zu verwerfen, und ob das Sediment zwischen dichtgepackten Falten festgehalten wird, ist absolut unwichtig. Hier aber würden dichtgepackte Falten das Sediment festhalten und seine Resuspension und Elution verhindern. Aus diesem Grunde ist es bei Verwendung von Falten notwendig, dass die Falten locker gefaltet sind, wie in den 3b und 3c dargestellt.
In 3b sind Falten 301 radial um eine makroporöse Stütze 303 angeordnet, wie in 3a, jedoch ist der mit ∅ bezeichnete eingeschlossene Winkel zwischen den Falten wesentlich größer als der in 3a gezeigte; demnach liegen die Wandungen 305 und 307 von benachbarten Spitzen im Wesentlichen nicht aneinander an. Der Faltenwinkel liegt vorteilhaft in einem Bereich von 3 bis 10°, bevorzugt 4 bis 8° und meistbevorzugt bei ca. 5 bis 6°. In 3c ist eine lockere Faltung erzielt, und zwar nicht durch Vergrößern des eingeschlossenen Winkels zwischen den Falten, ∅, der klein bleibt, sondern durch Vergrößern des Abstandes zwischen den Falten durch Einbeziehung eines Beabstandungsabschnitts 309, welcher flach, gekrümmt oder andersartig gestaltet sein kann, solange die Basen der dreieckigen Querschnitte der Falten voneinander getrennt sind, so dass auch hier kein wesentlicher Kontakt zwischen benachbarten Faltenwandungen 305 und 307 vorhanden ist. Der Raum zwischen benachbarten Falten sollte am engsten Punkt eine solche Abmessung besitzen, dass das Sammeln der interessierenden Mikroorganismen/Partikel maximiert wird, dadurch, dass verhütet wird, dass das gesammelte "Sedi ment" zwischen benachbarten Faltenoberflächen eingekeilt und damit die Wiedergewinnung verhinderf wird.
Eine lockere Faltung gemäß der obigen Beschreibung kann definiert werden als eine Reihe von Falten, wobei im Mittel der Kontakt zwischen den Wandungen von aneinander angrenzenden Spitzen (z. B. 305 und 307 in den 3a bis 3c) nicht mehr als 25% des gesamten Oberflächenbereichs der Falte beträgt, deren Höhe in den 3b und 3c als "311" gemessen ist. Bevorzugt beträgt der Anlagekontakt weniger als 20% dieser Oberfläche, noch bevorzugter weniger als 10%, und im Besonderen besteht nur zufälliger, durch fertigungsbedingte Unregelmäßigkeiten in der Faltenbeabstandung verursachter Kontakt zwischen benachbarten Falten (d. h. im Wesentlichen kein Kontakt). Das Ausmaß des Falte-zu-Falte-Kontaktes kann durch visuelle Untersuchung des gekapselten Endes des zylinderförmigen Filterelementes festgestellt werden oder durch Vergießen des kompletten Elementes in eine Vergießmasse, z. B. Epoxid, und Schneiden quer zur Länge des Filterelementes.
Die obigen Limitationen gelten nicht für Faltungsabschnitte, wo ein Falte-zu-Falte-Kontakt notwendig ist, um das gefaltete Material an den faltenparallelen Nähten miteinander zu verbinden. Dies ist in 3d gezeigt, wo im Wesentlichen kein Kontakt zwischen "normalen" Spitzen 301 vorhanden ist, aber ein wesentlicher Kontakt zwischen miteinander verbundenen Falten 313 besteht, welche bei 315 mit einem Klebstoff oder mit anderen Mitteln, z. B. durch Schmelzverschweißen, Lösungsschweißen etc., miteinander verbunden sind. Ferner können die Falten, welche unmittelbar benachbart zu den miteinander verbundenen Falten liegen, verformt sein und sollten bei der Berechnung des Kontaktgrades zwischen den Falten unberücksichtigt gelassen werden. Bevorzugt sollte die Anordnung so getroffen sein, dass man – mit Ausnahme der miteinander verbundenen Falten und vielleicht noch der nächstbenachbarten Falten – den Grund des Tales zwischen benachbarten Falten visuell beobachten kann.
Ein alternativer Weg zum Definieren der Faltenlockerheit oder geeigneten Hohlfasertrennung kann auf der Wiederfindung von Challenge-Kryptosporidien und -Giardien basieren. Zur Beaufschlagung der Kapsel werden in Formalin konservierte Giardien in einer Konzentration von 1 × 10⁵ bis 5 × 10⁵ und/oder in Formalin konservierte Kryptosporidien in einer Konzentration von 5 × 10⁴ bis 1 × 10⁵ zu 16 l physiologischer Kochsalzlösung (Saline) hinzugegeben und mit einer Fließrate zwischen 1000 ml/min und 1500 ml/min durch die Kapsel gepumpt oder gesaugt, dann wird mit weiteren 2 l Salinelösung gespült. Das gesamte Volumen sollte die Kapsel innerhalb etwa 20 Minuten passieren. Die Kapsel wird dann getrennt, kräftig bewegt, d. h. durchwirbelt, um das Sediment (die Mikroorganismen) zu resuspendieren, und die Flüssigkeit wird in eine Zentrifugenflasche entleert. Sodann werden zwei 100 ml-Elutionen durchgeführt, jeweils mit einer Bewegungszeit von 5 Minuten. Die Eluate werden zu dem Anfangsresuspensionseluat hinzugegeben und ein gleichmäßiges Aliquot zur Mikroorganismenquantifizierung entnommen. Alternativ können die kombinierten Eluate in die Form eines Pellet zentrifugiert und das Pellet auf Mikroorganismen analysiert werden. Wenn die Kapsel ein locker gefaltetes Filter in Einklang mit der vorliegenden Erfindung enthält, im vorliegenden Text als "Faltung, welche das Resuspendieren von Mikroorganismen erlaubt" oder ähnlich bezeichnet, dann sollte die Wiederfindung der durch das Challenge dargebotenen Kryptosporidien im Mittel größer als 9%, bevorzugt größer als 30%, meistbevorzugt über 60% sein, während die Wiederfindung von Giardia größer als 9%, bevorzugt größer als 70%, noch bevorzugter größer als 85% und meistbevorzugt ca. 95% oder mehr betragen sollte.
Die hierin angegebenen Wiedergewinnungs- oder Wiederfindungsraten sind definiert als die prozentuale Wiederfindung von Mikroorganismen in der gefilterten Probe nach Dekantieren des Anfangseluats und zwei Wäschen mit Elutionslösungen und Zusammenführen des Anfangseluats und der Sedimenteluate. Die Messung erfolgt durch Zählung der Mikroorganismen nach Standardtechniken, wie in ASTM P229 offenbart, aus gleichmäßigen Teilen des Zentrifugenkuchens, der aus der Zentrifugation der kombinierten Eluate gemäß dem ASTM-Test gewonnen wird. Eine statistisch signifikante Zahl von Versuchen sollte herangezogen werden, um die Wiederfindung in Prozent zu beurteilen.
Die Faltung von Faltenmembranen oder der Abstand von Hohlfaserfiltern oder anderen Filtrationsvorrichtungen muss so gewählt sein, dass die Mikroorga nismen und/oder Partikel in wesentlichem Umfang wiedergewinnbar sind, wenn sie wie im Vorstehenden beschrieben verarbeitet werden. Der Ausdruck "in wesentlichem Umfang wiedergewinnbar sein", soweit der Ausdruck sich auf Mikroorganismen oder Partikel bezieht, bedeutet, dass die Konstruktion des Filterelementes im Mittel eine Wiederfindung von mindestens ca. 9% der Ziel-Mikroorganismen/-Partikel erlauben sollte. Bevorzugt sollte die Wiedergewinnung mehr als 30% betragen, meistbevorzugt höher.
Die Kapsel sollte eine mittlere Wiederfindungsrate für Giardia aufweisen, die mindestens zweimal so groß ist wie die eines spiralgewickelten Filters gemäß Spezifikation der ASTM P229, bevorzugt eine Wiedergewinnungsrate, die wenigstens viermal größer ist, und meistbevorzugt zehn- oder vierzigmal größer oder mehr, wobei letztere Werte bei Anfangsflussraten von ca. 1,25 gal./min (4,73 l/min) für spiralgewickelte Filter und ca. 0,28 gal./min (1,06 l/min) für die Kapsel bestimmt werden, für Wasser mit einer Trübe in NTU im Bereich von 20 bis 70. Die Probengröße in Liter für die Kapsel kann im Bereich von 5% bis 20% der Probengröße des spiralgewickelten Filters liegen. Zwecks weiterer Details wird auf die Tabelle 1 im vorliegenden Text verwiesen.
Bei der im Vorstehenden beschriebenen Kapsel handelt es sich um eine hermetisch geschlossene Kapsel, welche sich zur raschen, wirtschaftlichen und genaueren Detektion von Mikroorganismen, wie Giardia und Cryptosporidium, eignet und welche ferner für die Detektion anderer Mikroorganismen/Partikel Verwendung finden kann, vorausgesetzt, die Membranporengröße ist so gewählt, dass die interessierenden Mikroorganismen auf der aufstromseitigen Oberfläche im Wesentlichen zurückgehalten werden. Die Kapsel kann Verwendung finden zur Detektion von coliformen Bakterien, im Besonderen z. B. E. coli, und für Viren, wenn eine geladene oder eine andere zur Rückhaltung von Viren befähigte Membran verwendet wird. Die integrale, hermetisch geschlossene Beschaffenheit der Kapsel stellt eine bevorzugte Ausführungsform dar.
Jedoch können die Merkmale der Kapsel im Wesentlichen beibehalten und dabei gleichzeitig der Nutzen und die Flexibilität der Vorrichtung vergrößert werden, indem eine entfernbare Endabdeckung vorgesehen wird, bevorzugt so, dass das Filterelement komplett exponiert werden kann. Ein Beispiel für eine geeignete Endabdeckung zeigt die querschnittliche Darstellung von 2d, die ähnlich der in den 1 und 2a gezeigten Endabdeckung ist, ausgenommen, dass an Stelle der hermetischen Versiegelung des polymeren Gehäuses 3 in dem Bereich zwischen den Endabdeckungsoberflächen 23a und 24 eine der Oberflächen, in diesem Fall die Oberfläche 24, mit einem Gewinde versehen ist, um ein mit einem korrespondierenden Gewinde versehenes Ende des polymeren Gehäuses 3 aufzunehmen. Bei 26 ist eine elastomere O-Ringdichtung gezeigt. Andere Dichtungsanordnungen sind selbstverständlich möglich.
Der Vorteil eines entfernbaren Verschlusses liegt darin, dass dann die gesamte Membran zugänglich ist. Beispielsweise kann zur Testung auf Coliforme die Membran getrennt, flachgelegt, mit einem Wachstumsmedium bedeckt oder kontaktiert und inkubiert werden, um Kolonien von Mikroorganismen wachsen zu lassen, die zu klein sind, um mit traditionellen fluoroskopischen, mikroskopischen u. a. Techniken beobachtet werden zu können. Ein Beispiel hierfür sind coliforme Bakterien, wobei das Kolonienwachstum in einem Medium, welches geeignete chromogene Substrate und Enzyminduktoren enthält, wie in US- Patent Nr. 5 510 243 offenbart, verwendet werden kann, um sowohl die Gesamtzahl der Coliformen als auch E. coli auszuzählen. Andere Techniken sind ebenfalls geeignet, d. h. die Amplifikation und Hybridisierung von Nukleinsäuren durch PCR, IFA (Immunfluoreszenz-Assay) und dergleichen.
Die Porosität der Filtermembran und ihre Zusammensetzung können entsprechend der jeweiligen Anwendung gewählt werden. Bevorzugt ist die Membran eine spontan wasserbenetzbare Membran, z. B. eine mikroporöse Polyethersulfonmembran, hergestellt wie in US-Patent Nr. 4 900 499 offenbart, erhältlich von Gelman Sciences, Inc. als mikroporöse Membranen unter der Marke Supor^TM. Jedoch können auch andere hydrophile Membranen verwendet werden, z. B. aus Nylon, Celluloseacetat etc., ebenso wie hydrophobe Membranen, welche behandelt worden sind, um sie benetzbar zu machen. Die Membran kann ultraporös oder mikroporös sein, je nach Größe der interessierenden Mikroorganismen/Partikel. Die Porengröße sollte relativ gut kontrolliert sein, so dass keine großen Poren vorhanden sind, deren Größe weit über dem Mittel liegt. Die meisten konventionellen Filtrationsmembranmaterialien erfüllen dieses Kriterium.
Was die Porengröße der Membran anbelangt, so sollte die Porengröße so gewählt sein, dass eine wesentliche Menge der Mikroorganismen, welche die Zielgröße aufweisen, zurückgehalten werden. Diese Porengröße ist so gewählt, dass mindestens 9% der interessierenden Mikroorganismen/Partikel zurückgehalten werden, bevorzugt mehr als 30%, meistbevorzugt mehr als 90%.
Der Grad der Rückhaltung oder des Nichtdurchlassens der Membran sollte bevorzugt so gewählt sein, dass er statistisch zuverlässig ist für einen Positiv/Negativ-(Presence/Absence-)Test für einen ins Auge gefassten Mikroorganismus.
Die Filterelemente und die Kapsel werden nach konventionellen Fertigungsverfahren hergestellt. Das zylinderförmige Faltenfilter kann entlang seiner faltenparallelen Naht versiegelt sind, wobei ein beliebiges Mittel verwendet werden kann, welches eine Siegelung ohne Beschädigung der Membran sicherstellt. Als einige Beispiele für die eingesetzten Verfahren lassen sich nennen: Schmelzverschweißen, Lösungsschweißen, Ultraschallschweißen oder ein ge eigneter Klebstoff, z. B. ein Epoxidklebstoff. Die Enden des zylinderförmigen Faltenfilters sind hermetisch versiegelt oder "vergossen", wieder mit den gleichen oder ähnlichen Verschließ- oder Siegeltechniken. Planare Membranen können nach den gleichen Verfahren gegen eine Dichtfläche gesiegelt werden oder zwischen Schneidenverschlüssen, gerippten Oberflächen oder dergleichen festgehalten werden. Hohlfasermembranen können nach ähnlichen Techniken gegen eine Dichtfläche gesiegelt werden.
Die Kapsel – wieder anders als bei konventionellen Filtern, bei denen die Gehäusewandungen, Enden und Endabdeckungen, sofern vorhanden, physikalisch möglichst nahe dem Außendurchmesser der Faltenmembran liegen, um die Herstellkosten zu erniedrigen und die Vorrichtungen physikalisch möglichst klein zu halten – enthält ein beträchtliches Hohlvolumen, im vorliegenden Text als "elutionswirksames Hohlraumvolumen" bezeichnet.
Das elutionswirksame Hohlraumvolumen bedeutet ein Volumen, welches mindestens das 2,2fache des Filtervolumens, wie im Folgenden definiert, betragen kann, bevorzugt wenigstens das 2,5fache des Filtervolumens. Größere Hohlraumvolumina können Verwendung finden. Das Filtervolumen ist definiert als die Hälfte des Volumens, welches von dem Faltenfilter eingenommen wird, unter der Voraussetzung, dass das Filter in Form eines Hohlzylinders vorliegt mit einem Innendurchmesser korrespondierend zu der Distanz zwischen diametral gegenüberliegenden Falten über einen Durchmesser der makroporösen Stütze, und einem Außendurchmesser korrespondierend zu der Distanz zwischen Spitzenenden über eine Erweiterung dieses Durchmessers, z. B. Dimension A (Innendurchmesser) und Dimension B (Außendurchmesser) von
3b, und einer Länge, definiert durch die effektive Länge zwischen der Siegelung an den hermetisch geschlossenen Enden. Für eine Kapsel mit einem Filterelement von 2,54 cm Innendurchmesser, 4,45 cm Außendurchmesser und 12,2 cm Länge beträgt das Filtervolumen also ca. 66 cm³, und somit kann das zusätzliche, vom Gehäuse umschlossene Hohlraumvolumen in einem Bereich von ca. 100 ml bis ca. 600 ml angesiedelt sein, wobei Hohlraumvolumina im Bereich von 200 bis 300 ml für Filter dieser Größe bevorzugt werden. Für eine flache, planare Membran sollte das Hohlraumvolumen in cm³ mindestens das 0,5fache der Oberfläche, ausgedrückt in cm², und bevorzugt das 0,8- bis 3fache dieser Oberfläche betragen.
Das Hohlraumvolumen kann vielfältige Formen annehmen. Beispielsweise kann vorteilhaft ein wesentlicher Teil dieses Volumens, d. h. 30%, bevorzugt ca. 50% oder mehr, in einem definierten Raum liegen, der von einem rein konzentrisch mit dem Filterelement angeordneten Raum verschieden ist. Anders ausgedrückt: das Filterelement kann im Wesentlichen versetzt in dem Gehäuse angeordnet sein, wie durch die das Filterelement festlegende Endabdeckung von 2c dargestellt, wobei ein Volumen bereitgestellt wird, welches halbmondförmig im Querschnitt ist, oder es kann vorteilhaft in einer Erweiterung des polymeren Gehäuses liegen, wie in 1a gezeigt, wobei das Gehäuseende 31 nicht in der Nähe der Filterelementabdeckung 19 endet, sondern vielmehr etwas entfernt ist, z. B. um 0,75 bis 2 Inch (1,91 bis 5,08 cm), wodurch für die im Vorstehenden beschriebene Filtergröße ein definiertes Reservoir mit einer Größe von 100 ml bis 200 ml bereitgestellt wird. Der Ausdruck "definiert" in Bezug auf das Hohlraumvolumen bedeutet, dass mindestens 30% des Hohlraumvolumens und bevorzugt ca. 50% oder mehr in einem Volumen liegen, welches nicht radial konzentrisch mit dem Filterelement ist.
Im Vorstehenden wurde die Kapsel beschrieben, welche zur Verwendung für das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von in einem Fluid getragenen Mikroorganismen durch Einfließenlassen eines Stroms bekannten, bestimmbaren Volumens eines zu untersuchenden Fluids in den Probeneinlass einer Wegwerf-Filterkapsel mit einer mikroporösen Membran, welche eine geeignete Durchflussrate aufweist, die zum Beispiel, ohne jedoch hierauf begrenzt zu sein, 0,1 l/min oder mehr betragen kann, bei einem geeignetem Druck, z. B. 1 bar (100 kPa), wobei die aufstromseitige mikroporöse Membran eine locker gefaltete Membran ist, nicht eingeschlossen durch eine weitere Oberfläche, welche die Elution von Mikroorganismen aus derselben behindern würde, wobei die Kapsel ein elutionswirksames Hohlraumvolumen aufweist; Entfernen der Wegwerf-Kapsel von dem mit dem Probeneinlass verbundenen Fluidstrom; Bewegen zum Resuspendieren von auf der Aufstromseite des Filters festge haltenem Sediment und/oder Mikroorganismen; Dekantieren eines Anfangseluates von Fluid und Sediment (sofern nichts anderes angegeben ist, umfasst "Sediment" im Folgenden "Mikroorganismen") aus dem elutionswirksamen Hohlraumvolumen und einem anderen aufstromseitigen Innenraum; Zugabe einer Elutionslösung zu der Kapsel in einer Menge, die geringer ist als das gesamte aufstromseitige Innenvolumen; kräftiges Bewegen der Kapsel zum Lösen des membrangebundenen Sediments; Dekantieren der Elutionslösung als ein Sedimenteluat; Wiederholen des Zugebens von Elutionslösung, der Bewegung und des Dekantierens, falls erforderlich, um eine im Wesentlichen vollständige Entfernung des Sediments zu erzielen; und - vorzugsweise – Zusammenführen des Anfangseluats und des einen oder der mehreren Sedimenteluate, um ein kombiniertes Eluat zu bilden; gegebenenfalls Konzentrieren des Sedimenteluats und/oder des einen oder der mehreren Anfangs- oder kombinierten Eluate, um ein konzentriertes Sedimenteluat wiederzugewinnen; und gegebenenfalls Quantifizieren von mindestens einem Mikroorganismus, welcher in dem Sedimenteluat oder konzentrierten Sedimenteluat vorhanden ist.
Eine geeignete Kapsel, welche für das obige Verfahren Verwendung finden kann, weist ein Filtervolumen, wie im Vorstehenden definiert, von ca. 66 ml und ein Hohlraumvolumen von ca. 130–150 ml auf. Es können aber auch sowohl größere als auch kleinere Vorrichtungen verwendet werden. Eine Ausführungsform, welche geeignet ist zur Quantifizierung von Giardia und/oder Cryptosporidium, kann unter Bezugnahme auf eine Filterkapsel beschrieben werden, wie sie in 1 dargestellt ist, nämlich als eine Kapsel, welche umfasst: ein Filterelement, welches ein locker gefaltetes mikroporöses Membranfilterelement umfasst, mit einem Innendurchmesser von ca. 2,2 cm, einem Außendurchmesser von ca. 4,45 cm und einer Länge von 12,2 cm, einer Oberfläche von ca. 1400 cm² und einem definierten Hohlraumvolumen von ca. 140 ml, einem gesamten aufstromseitigen Volumen von ca. 264 ml (einschließlich des Volumens, welches von Fluid zwischen den Falten auf der Aufstromseite eingenommen wird). Die Membran ist eine inhärent benetzbare Polyethersulfon-Membran mit einer Porengröße von 1,0 μm, erhältlich von Gelman Sciences als mikroporöse Membran unter dem Namen SuporTM 1200. Die Membran sollte einen wesentlichen Teil des Sediments nicht durchlassen.
Die vorliegende Erfindung wurde im Vorstehenden allgemein beschrieben; zur weiteren Veranschaulichung werden im Folgenden bestimmte spezifische Beispiele vorgestellt, wobei diese rein beispielhaft sind und die Erfindung nicht begrenzen sollen, falls nicht anders angegeben.
Das Verfahren kann durch die nummerierten Schritte in 4 veranschaulicht werden, was der allgemeinen Beschreibung des Verfahrens dient. Einige der Schritte, wie hierin angegeben, sind optional, und, falls erforderlich, können weitere Schritte hinzugefügt werden. Die Verwendung der Wegwerf-Filtrationskapsel macht den Prozess flexibler als dies bei Verwendung von Patronenfiltern der Fall wäre. Zum Beispiel kann zu jedem beliebigen Zeitpunkt ein Aliquot aus dem Eluatreservoir entnommen werden; so etwa nach der anfänglichen Bewegung des zurückgehaltenen Sediments oder nach einer oder mehreren zusätzlichen Sedimentelutionen. Das Verfahren mit Wickelfilterpatrone bietet diesen Vorteil nicht.
In 4 wird bei 401 der Probeneinlass der Wegwerf-Filtrationskapsel mit der Probenquelle verbunden. Als nächstes wird bei 402 die gewünschte Flüssigkeitsprobengröße durch die Kapsel gefiltert. Bei 403 wird die Kapsel von der Probenquelle getrennt, allgemein versiegelt und zum Labor transportiert, welches im Allgemeinen entfernt von der Probenquelle liegt. Nach Ankunft im Labor wird die Kapsel bewegt, 404, um das während der Probenahme gesammelte Sediment zu resuspendieren und ein Anfangseluat hiervon zu erhalten, welches den größeren Teil des zurückgehaltenen Sediments enthält. Dieses Anfangseluat wird sodann bei 405 in ein geeignetes Gefäß, z. B. eine Zentrifugenflasche, dekantiert. In einigen Fällen kann das Dekantieren des Anfangseluats ausreichend sein, um eine Testung auf die gewünschten Mikroorganismen durchzuführen. Im Allgemeinen ist jedoch ein weiteres Eluieren der Kapsel mit Elutionslösung notwendig. In Schritt 406 wird Elutionslösung in die Kapsel eingeführt, deren Menge im Allgemeinen kleiner ist als das gesamte Innenvolumen, so dass während der Bewegung Turbulenz erzeugt werden kann. Bei 407 wird die Kapsel bewegt und bei 408 wird ein Sedimenteluat dekantiert, welches allgemein eine relativ geringe Menge an Sediment enthält, einschließlich eines darin enthaltenen Sediments, welches bislang der Filtermembranoberfläche fest anhaftete. Wieder kann an diesem Punkt das jewei lige Testprotokoll angeben, dass die Elution für analytische Zwecke ausreicht, und die Quantifizierung kann durchgeführt werden. Jedoch kann im Allgemeinen eine weitere Elution mit einer oder mehreren Elutionslösungen oder optional, wie durch den Entscheidungsblock 409 gezeigt, eine Rückspülung mit Elutionslösung bei 410 verwendet werden, um partikuläre Substanz und/oder Mikroorganismen, welche entweder der Filtermembranoberfläche fest anhaften oder in deren Poren festgehalten sind, mit mehr Vollständigkeit zu entfernen.
Wenn die Sedimentelution als abgeschlossen angesehen wird, kann die Quantifizierung eines beliebigen der gesammelten Eluate durchgeführt werden. Jedoch werden im Allgemeinen das Anfangseluat und Folgeeluate zusammengeführt, um ein kombiniertes Eluat zu bilden, 411, wobei diese Eluate anschließend in Schritt 412 aufkonzentriert werden können. Die Aufkonzentrierung kann z. B. in Form der Zentrifugation eines oder mehrerer Eluate geschehen, gefolgt von Resuspension der durch die Zentrifugation gewonnenen Pellets in einem kleineren Lösungsvolumen und Rezentrifugation. Dieses Verfahren wird beispielsweise in dem Test nach ASTM P229 verwendet.
Schließlich wird die Quantifizierung der Ziel-Mikroorganismen durchgeführt. Obgleich der Quantifizierungsschritt 413 ein Teil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, sind die Details unkritisch und können je nach dem von dem Protokoll vorgesehenen besonderen Test gewählt werden. Bei 404a und 408a sind optionale Schritte gezeigt zum Testen von Aliquoten, welche aus dem Elutionskammerhohlraumvolumen gewonnen werden, indem ein Aliquot mittels einer Subkutanspritze entnommen wird. Beispielsweise kann bei 408a ein Aliquot verwendet werden, um qualitativ zu bestimmen, ob die vorausgehende Elution nach der Bewegung ausreichend war, um im Wesentlichen alles Sediment zu entfernen. Das vorliegende Verfahren kann auch zum Quantifizieren von Sediment verwendet werden, z. B. nach Bruttogewicht oder anderen Methoden.
Beispiele 1 und 2 und Vergleichsbeispiele C1 und C2
Es wurden zwei Beprobungsserien mit Wegwerf-Filterkapseln in Einklang mit der vorliegenden Erfindung unter den Bedingungen hoher Trübung verwendet, um Cryptosporidium und Giardia in Wasserproben zu quantifizieren. Die zwei Serien unterschieden sich darin, dass die erste Untersuchungsreihe mit Wasser durchgeführt wurde, welches eine Trübe von 22 NTU aufwies, während in den Tests der zweiten Reihe die Trübe höher, bei 62,6 NTU lag. Die Filter wurden gegen ein standardmäßiges spiralgewickeltes Polypropylenfilter (Filterite, Modell U1A1OU) getestet, bei dem es sich um die Art von Patronenfilter handelt, wie sie in ASTM P229 spezifiziert ist. Die Wasserproben wurden aus dem Fluss Chattahoochee River entnommen.
Das vorgeschlagene Testverfahren nach ASTM P229 wurde modifiziert wie in der untenstehenden Tabelle 1 angegeben und verwendete einen Objektträgerausstrich an Stelle des Auffangens auf einem Celluloseacetat-Scheibenfilter zum Auszählen der Mikroorganismen. Die "Information Collection Rule" nach ASTM P229 erlaubt die Verarbeitung eines maximalen Sediments über den Percoll-/Saccharose-Gradienten von 1 ml.
Wasser mit einer hohen Trübung wurde durch die jeweiligen Filter geleitet. Die gewickelten Polypropylenfilter wurden entfernt, auseinandergeschnitten, gewaschen und in einem Stomacher behandelt, wie in dem von der EPA vorgeschlagenen Test auf Giardia und Cryptosporidium. Die erfindungsgemäßen Kapseln wurden 5 Minuten bewegt (aufgewirbelt), das Sediment eluiert, um ein Anfangseluat zu bilden, und der stromaufwärtige Teil (Sedimentseite) der Kapsel wurde zweimal mit 100 ml Phosphatpuffer-Elutionslösungen gewaschen, jeweils mit fünf Minuten Bewegung, um zwei Folgeeluate zu bilden. Das Anfangseluat und die Folgeeluate wurden zusammengeführt, nach ASTM P229-Protokoll zentrifugiert, der Überstand als Abfall verworfen und das Sedimentpellet resuspendiert und durch eine zweite Zentrifugation aufkonzentriert. Die Beprobungsparameter und die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 vorgestellt.
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass, obgleich die in den Beispielen 1 und 2 eingesetzten Wegwerfkapselfilter nur verwendet wurden, um ca. 20% bzw. 5% des Volumens zu sammeln, welches von dem gewickelten Filter in parallelen Vergleichstests C1 und C2 gesammelt wurde, das pro Liter gesammelte Sediment um einen Faktor von 1,86 bzw. 1,3 höher war und die Wiederfindung von Giardia um das 17,6- bzw. 5,9fache höher war. Das heißt also, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Empfindlichkeit für die Detektion von Giardia unerwarteterweise um einen Faktor von etwa 6 bis 18 höher ist, während das verarbeitete Probenvolumen erheblich kleiner war; dass das unkonzentrierte resuspendierte Sediment (Anfangseluat, Sedimenteluat) weit weniger war (ca. 300 ml versus ca. 3 l); und dass der für die Quantifizierung verwendete prozentuale Sedimentpelletanteil größer war (was zu einer größeren Zuverlässigkeit führen sollte). In keiner der Proben wurde Cryptosporidium nachgewiesen.
Beispiele 3 bis 6
Vier Wegwerfkapselfilter in Einklang mit der vorliegenden Erfindung wurden mit Spikes von Giardia und Cryptosporidium beaufschlagt und behandelt wie im Vorstehenden bereits beschrieben. Nachweisgrenze sind 5 Organismen; BDL = unter der Nachweisgrenze. Für die Berichte wurden alle Werte abgerundet. Die Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle 2 dargestellt.
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, war die Wiederfindung von sowohl Giardia als auch Cryptosporidium sehr hoch, im Mittel 90 bis 95% in gepuffertem, deionisiertem Wasser und 65–79% in rohem Oberflächenwasser.
Beispiel 7 und Vergleichsbeispiel C3
Ein erfindungsgemäße Wegwerfkapselfilter und ein Filter, welches die Anforderungen nach ASTM P229 erfüllt (Filterite, U1A1OU) wurden verwendet, um eine Prüfung auf Giardia- und Cryptosporidium-Oocysten in Wasser vom Lake Champlain-See durchzuführen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgezeigt.
Es ist erkennbar, dass, während nur 23% soviel Wasser beprobt wurden, das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Kapsel in 67% des Pelletvolumens des Standardtests resultierten. Mit der erfindungsgemäßen Kapsel wurden 2,7 ml Sediment/100 gal. (378,5 l) wiedergewonnen, verglichen mit 0,9 ml Sediment pro 100 gal. (378,5 l) für das gewickelte Filter.
Die Filtrationsparameter des Kapselfilters von Beispiel 7 und Vergleichsbeispiel 3 sind in der nachfolgenden Tabelle 4 wiedergegeben.
TABELLE 4
Beispiele 8 bis 15
Ziel dieser Experimente war es, die Extraktion von Giardia und Cryptosporidium aus dem Kapselfilter zu optimieren und zu automatisieren. Dieser Vorgang beinhaltete, sechs erfindungsgemäße Wegwerf-Kapselfilter mit frischen Giardia lamblia-Zysten und Cryptosporidium parvum-Oozysten gleichzeitig zu beaufschlagen, wobei eine Challenge-Rezirkulationsverteiler-/sammleranordnung verwendet wurde. Das von den Kapselfiltern aufgefangene Sediment wurde unter Anwendung von zwei Techniken dreifach eluiert unter Anwendung einer Lab-Line-Schüttelvorrichtung mit der Bewegungsart "Wrist-Action", die eine manuelle Schüttelbewegung aus dem Handgelenk nachahmt. Die Extrakte wurden zentrifugiert, gefärbt und mikroskopisch untersucht, wobei ein modifiziertes Protokoll nach ASTM P229 verwendet wurde. Kontrollen wurden gleichzeitig verarbeitet.
Es wurden mehrere Wrist-Action-Schüttler auf ihre Fähigkeit geprüft, eine aggressive manuelle Schüttelbewegung aus dem Handgelenk zu simulieren. Das Lab-Line Modell 3587-4 wurde als akzeptabel befunden.
Das Challenge-Setup enthielt ein Polypropylen-Reservoir von 55 gal. (208,2 l) Inhalt, welches die Organismen enthielt. Die Organismen wurden durch eine digitale Durchflussmesseinrichtung, einen statischen Mischer, eine Multiport-Verteiler/Sammleranordnung und zurück zum Reservoir gepumpt. Die Fließrate durch die Rezirkulationsverteiler-/sammleranordnung wurde konstant bei 11 gpm (41,6 l/min) gehalten. Sechs Kapselfilter und zwei Kontrollen wurden zu der Multiport-Verteiler/Sammleranordnung gepumpt, wobei jedes mit einem 1 gpm-(3,8 l/min-)Durchflussmengenregelventil ausgestattet war. Der Ausfluss von jedem Filter wurde in einem 20 l-Behälter aufgefangen.
Das Reservoir von 55 gal. (208,2 l) Inhalt wurde mit deionisiertem Wasser und 5 × 10⁶ Giardia lamblia-Zysten und Cryptosporidium parvum-Oozysten gefüllt. Die Organismen wurden als hochreine, in Formalin konservierte Präparationen drei Tage vor Durchführung des Challenge-Tests von der Fa. Waterborne, Inc. (New Orleans, LA) erhalten. Die Lösung der Organismen wurde gut gemischt und anschließend 15 Minuten bei 15 gpm (56,8 l/m) durch den statischen Mixer rezirkuliert.
Die Multiport-Verteiler/Sammleranordnung wurde sodann mit sechs Kapselfiltern und zwei Kontrollen bestückt. Bei den Kontrollen handelte es sich um 47 mm-Polytetrafluorethylen-(PTFE; Teflon^TM)-In-Line-Filterhalter, ausgestattet mit einer neutronenspurgeätzten 1 μm-Polycarbonat-Membran.
Der Fluss der Organismen durch das Rezirkulationssystem wurde initiiert und eingestellt, um einen Eintrittsdruck von 36 psi (248 kPa) zu den Filtern bereitzustellen. Nachdem alle Einstellungen durchgeführt worden waren, wurden die Ventile zu jedem Filter geöffnet und die Beaufschlagung (Challenge) gestartet.
Jedes Filter wurde mit ca. 20 l der Mischung beaufschlagt. Die Extraktvolumina wurden berechnet durch Wiegen des Gesamtvolumens an Wasser, welches von dem Ausfluss aufgefangen wurde, abzüglich des Gewichts des Behälters selbst.
Die Verwendung einer schnellen Rezirkulations-Verteiler/Sammleranordnung vom Entnahme-("Bleed-Off"-)Typ gewährleistete eine sehr homogene Beaufschlagung, ohne dass Bias der Strömungsdynamik auftrat, so dass eine gleichmäßige Beaufschlagung jedes Filters sichergestellt war. Zwei zusätzliche Kontrollen wurden am Anfang und am Ende der Beaufschlagung aufgefangen, indem innerhalb einer Zeitspanne von 2 Minuten ein Liter Challenge-Lösung aus der Multiport-Verteiler/Sammleranordnung in einen 1 l-PTFE-Behälter abgezweigt wurde. Jede Kapsel wurde mit 120 ml des folgenden Elutionspuffers gefüllt: Single Strength PBS (ASTM P229, pH 7,4), 0,01% Natriumdodecylsulfat (SDS) (w/v), 0,0003% Tween 80^TM (v/v) und 0,015% Antifoam B^TM (v/v).
Die SDS-Konzentration wurde berechnet mit Hinblick auf die durch PBS gelieferten Natriumionen und wurde formuliert bei 20% der kritischen Micellenkonzentration für die Proteindenaturierung (Bollag and Edelstein, Protein Methods, 1994). Höhere Konzentrationen als diese können eine unerwünschte Protein- und/oder Epitop-Denaturierung verursachen und die Effizienz der Immunofluoreszenz-Antikörper-Färbung mindern.
Drei der Kapselfilter wurden in den Lab-Line-Wrist-Action-Schüttler geklemmt. Die Arme des Schüttlers wurden so eingestellt, dass die Filter sich in einer horizontalen Position befanden. Der Schüttler wurde für 5 Minuten bei 90% der maximalen Schüttelgeschwindigkeit eingeschaltet. Nach fünf Minuten wurden die Filter aus dem Schüttler entnommen und die Eintrittsabdeckung wurde entfernt. Der Extrakt wurde aseptisch in ein steriles konisches 250 ml-Zentrifugenröhrchen gegossen.
Wieder wurden 120 ml Elutionspuffer zu jedem Filter hinzugegeben und diese dann in einer Ausrichtung von 180° gegenüber der vorherigen Position in den Schüttler geklemmt. Der Schüttler wurde wieder für 5 Minuten eingeschaltet und der Extrakt in die gleiche konische 250 ml-Zentrifugenflasche überführt.
Der gleiche Prozess wurde für die übrigen drei Filter wiederholt bis auf eine Ausnahme (die Schüttelzeit wurde bei beiden Bewegungsvorgängen auf 10 Minuten erhöht).
Die konischen 250 ml-Flaschen wurden bei 1100 × g für 20 Minuten zentrifugiert. Bis auf 40 ml wurde der gesamte Inhalt angesaugt und verworfen. Die übrigen 40 ml wurden aseptisch in ein steriles konisches 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Die 250 ml-Flaschen wurden zweimal mit 5 ml Elutionslösung gespült und in das entsprechende 50 ml-Röhrchen überführt.
Das PCTE-Membranfilter wurde aseptisch von dem PTFE-Filterhalter entfernt und in 50 ml Elutionspuffer überführt. Das Filter wurde extrahiert durch zehnminütiges Schütteln, dreiminütiges Aufwirbeln, mit einer kurzen Beschallung dazwischen.
Die 1 l-Abzweigproben, welche in den PTFE-Flaschen enthalten waren, erfuhren keine Verarbeitung mit Ausnahme der Pufferung mit PBS und Konservierung mit 50 ml 100% Formalin.
Quantitative Aliquote von allen Proben wurden dreifach gefärbt, wobei das Färbeverfahren nach ASTM P229 zur Anwendung kam. Die Organismen wurden gezählt durch eine komplette Durchmusterung (Scanning) des Objektträgers bei 300 mittels Fluoreszenzmikroskopie.
Nachfolgend sind die für das Giardia- und Cryptosporidium-Challenge- und Extraktionsverfahren mit Schüttelzeiten von fünf Minuten erhaltenen Resultate angegeben.
TABELLE 5
Das Kontrollmittel wurde mittels der Abzweigprobe und der PCTE-Membranzählungen bestimmt.
Nachfolgend sind die Resultate für das Giardia- und Cryptosporidium-Challenge- und Extraktionsverfahren mit Schüttelzeiten von zehn Minuten angegeben.
TABELLE 6
Die Bestimmung des Kontrollmittels erfolgt unter Verwendung von Daten von sowohl der Abzweigprobe als auch der PCTE-Membranpobe.
Unter Verwendung des gleichen Challenge wie im Vorstehenden beschrieben wurde das Challenge-Wasser mit Wassersediment vom Hudson River auf eine Konzentration von 1 l Challenge gleich 40 l Hudson River-Sediment beimpft.
Die Kapselfilter wurden mit ca. 18 l der Challenge-Mischung beaufschlagt und unter Verwendung des Lab Line-Wrist-Action-Schüttlers Modell 3587-4 extrahiert, wobei das 5-Minuten-Verfahren für ein Filter und das 10-Minuten-Verfahren für das andere Filter verwendet wurde.
Im Folgenden sind die Ergebnisse des Rohwasser-Challenge unter Anwendung des automatisierten Extraktionsverfahrens dargestellt.
TABELLE 7
Wie aus den Beispielen und Tabellen ersichtlich, ergibt die Verwendung der Wegwerf-Filterkapseln an Stelle eines gewickelten Filters eine außergewöhnlich und unerwartet hohe Steigerung der Genauigkeit der Mikroorganismentests, während sie gleichzeitig die Vorteile einer kleineren Rohprobengröße, eines kleineren Wasch-(Elutions-)Volumens und eines größeren, tatsächlich für den Test verwendeten Pelletanteils bietet. Ferner ist die Trübe des Fluids, welches die Kapsel verlässt, niedrig, was ein Hinweis dafür ist, dass eine erhebliche Menge an Sediment aufgefangen wird, im Gegensatz zu dem Patronenfilter, wo der Ausfluss ziemlich trübe bleibt. Die Fähigkeit, die Probe in einem kleinen Behälter sammeln zu können, der leicht versiegelbar ist und nicht anfällig für Transportschäden ist, macht den Feldeinsatz viel bequemer und zuverlässiger. Die Prüfung der erfindungsgemäßen Kapseln mit Challenge-Organismen von bekannter Konzentration führte zu einer konsistenten Wiederfindung von nicht weniger als 28% und im Mittel nicht weniger als 40%, während die vorgeschlagene ASTM-Methode eine Wiederfindung von nur etwa 3% erzielte.
Die eingesparte Laborzeit durch Wegfall der Arbeitsgänge Auftrennen, Segmentieren, Waschen, Bewegen und mehrfache Zentrifugation großer Volumina (3 l) ist ebenfalls beträchtlich, insbesondere, wenn man das geringere Infektionsrisiko für das Laborpersonal und Entsorgung von gefährlichem Abfall berücksichtigt.
Der Ausdruck "weitere (Auf)Konzentrierung" bedeutet ein Verfahren, wobei die zusammengeführten Waschflüssigkeiten oder Eluate weiter aufkonzentriert werden. Wie in den Beispielen angegeben, kann dieses weitere Aufkonzentrieren die Zentrifugation zu einem Sedimentpellet beinhalten, weiches optional in einem Zentrifugenröhrchen kleineren Volumens resuspendiert und rezentrifugiert werden kann, um das Sedimentpelletvolumen mit mehr Genauigkeit zu messen, falls dies erforderlich sein sollte.
Der Ausdruck "Quantifizierung" bedeutet ein Verfahren zum Quantifizieren vorhandener Mikroorganismen. Für Giardia und Cryptosporidium kann das Verfahren nach ASTM P229 oder die veröffentlichte EPA-Testmethode verwendet werden. Die molekularen Techniken, welche in den im Vorstehenden zitierten Veröffentlichungen beschrieben sind, können ebenfalls verwendet werden. Die eigentliche Methode und Details der Quantifizierung sind nicht Teil der vorliegenden Erfindung mit Ausnahme der Quantifizierung unter Verwendung eines Ausstrichs von flotiertem Sediment. Der Ausdruck "flotiertes Sediment" bezieht such auf die Flotation unter Verwendung einer Percoll/Saccharose-Lösung oder deren Äquivalent mit einer gewünschten relativen Dichte, die für Giardia und Cryptosporidium bei 1,09 bis 1,10 liegt, wie in der ASTM-Testmethode P229 beschrieben. Der Ausdruck Quantifizierung, wie er im vorliegenden Text verwendet wird, bezieht sich ferner auf einen Presence/Absence-Test, der andernfalls als ein qualitativer Test betrachtet werden könnte.

Claims

Verfahren zur Quantifizierung von Mikroorganismen in einer Fluidprobe, die verdächtig ist, Mikroorganismen zu enthalten, wobei das Verfahren umfasst: a) Verbinden einer Quelle, die die mikroorganismen-verdächtige Probe enthält, mit einem Probeneinlass einer Wegwerf-Filtrationskapsel; b) Durchfließenlassen eines bekannten Volumens der mikroorganismen-verdächtigen Fluidprobe durch die Wegwerf-Filtrationskapsel, wobei die Wegwerf-Filtrationskapsel ein Polymer-Gehäuse mit einem Probeneinlass und einem Auslass umfasst, wobei zwischen dem Probeneinlass und dem Auslass ein nicht-eingeschlossenes Filterelement angeordnet ist, welches eine Membran umfasst, so dass jegliches Fluid, welches von dem Probeneinlass zu dem Auslass fließt, durch die Membran hindurchtreten muss, und worin Mikroorganismen enthaltendes Sediment auf der Aufstromseite der Membran aufgefangen wird, wobei die Kapsel ein elutionswirksames Hohlraumvolumen aufweist; c) Dekantieren von Flüssigkeit und Sediment von der Aufstromseite der Wegwerf-Filtrationskapsel durch den Probeneinlass in Form eines Anfangseluates; d) Zugabe von mindestens einem Volumen an Elutionslösung zu der Aufstromseite der Wegwerf-Filtrationskapsel, Bewegen der Wegwerf-Filtrationskapsel, um mindestens einen Teil von jedem zurück bleibenden Sediment wieder zu suspendieren, und Dekantieren eines Sedimenteluates; e) gegebenenfalls Wiederholung von Schritt d) und Dekantieren von einem oder weiteren Eluaten; f) gegebenenfalls Zusammenführen von einem oder mehreren der Anfangseluate und des oder der Folge-Eluate, um ein kombiniertes Eluat zu bilden; g) gegebenenfalls Konzentrieren des einen oder der mehreren Anfangseluate, des oder der Folge-Eluate und/oder des kombinierten Eluates, um ein konzentriertes Eluat zu bilden; und h) Quantifizieren von einem oder mehreren Ziel-Mikroorganismen aus dem Anfangseluat, dem oder den Folge-Eluaten, dem oder den kombinierten Eluaten und/oder den konzentrierten Eluaten.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt (f) das Zusammenführen des Anfangseluates mit einem oder mehreren Folge-Eluaten zu einem kombinierten Eluat umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, worin Schritt (g) das Zentrifugieren des kombinierten Eluates zur Bildung eines oder mehrerer Pellets von Mikroorganismen enthaltendem Sediment umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das Pellet oder die Pellets in Flüssigkeit resuspendiert werden und wieder zentrifugiert werden, um ein rezentrifugiertes Pellet zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die Mikroorganismen ausgewählt sind aus der Gruppe, welche besteht aus Giardia, Cryptosporidium und sowohl Giardia als auch Cryptosporidium.
Verfahren nach Anspruch 5, worin mindestens ein Teil des rezentrifugierten Pellets verwendet wird, um ein aufschwimmendes Sediment zu bilden, wobei das aufschwimmende Sediment für Giardia und/oder Cryptosporidium durch Molekulartechniken quantifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Filterelement eine locker gefaltete Filtrationsmembran umfasst, worin die Falten der Membran durch eine Beabstandung getrennt sind, die bewirkt, dass Mikroorganismen, die von der Membran zurückgehalten werden, in wesentlichen Teilen zurückgewonnen werden können.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Filterelement eine locker gefaltete mikroporöse Filtrationsmembran umfasst, worin im Mittel nicht mehr als 25% der Oberflächenbereiche von aneinander grenzenden Falten aneinander anliegen.
Verfahren nach Anspruch 7, worin im Wesentlichen keine der Oberflächenbereiche von benachbarten Falten aneinander anliegen.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, worin das gefaltete mikroporöse Membranfilter eine gefaltete Membran umfasst, von der Mikroorganismen resuspendierbar sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Filterelement ein planares Filter umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Filterelement ein Bündel von Hohlfaserfiltern umfasst, wobei die Faserfilter durch eine Beabstandung voneinander getrennt sind, die bewirkt, dass Mikroorganismen, die von der Membran zurückgehalten werden, in erheblichem Umfang wiedergewinnbar sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Wegwerf-Filtrationskapsel ferner eine trennbare Versiegelung aufweist, dergestalt, dass aufgrund der Auftrennung der Siegelung die Membran exponiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das nicht-eingeschlossene Filterelement eine planare mikroporöse Membran umfasst, wobei eine Träger-Netz-Struktur benachbart zu der mikroporösen Memran, stromabseitig von der mikroporösen Membran wirksam ist, die mikroporöse Membran gegen Druck der Fluidprobe zu stützen.
Verfahren nach Anspruch 14, welches ferner eine Rückhalte-Netzstruktur umfasst, benachbart zu der mikroporösen Membran, stromaufseitig der mikroporösen Membran.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Rückhalte-Netzstruktur eine Stütze der Memran bildet, um Druck beim Rückspülen standzuhalten.
Verfahren nach Anspruch 14, worin ein Hohlraumvolumen in cm³ mindestens das 0,5-fache des Oberflächenbereiches der Membran in cm² beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner das Rückspülen der Membran vor dem Schritt der Quantifizierung umfasst.
Wegwerf-Filtrationskapsel, geeignet zur Verwendung bei der Quantifizierung von Mikroorganismen in einer Mikroorganismen enthaltenden Fluidprobe, wobei die Filtrationskapsel umfasst: a) ein Polymer-Gehäuse mit mindestens einem versiegelbaren Einlass und einem versiegelbaren Auslass; b) ein gefaltetes Filterelement, umfassend eine Membran mit einer Porengröße derart, dass ein ins Auge gefasster Mikroorganismus im Wesentlichen von der Membran zurückgehalten wird, wobei die Membran eine aufstromseitige Seite und eine abstromseitige Seite aufweist, wobei die Membran zwischen dem Einlass und dem Auslass angeordnet ist, so dass Fluid, welches durch den Einlass eintritt und durch den Auslass austritt, durch die Membran hindurch fließen muss, wobei die Aufstromseite der Membran im Wesentlichen frei von einer Einschluss-Struktur ist, welche eine Resuspendierung der Mikroorganismen, welche auf der Membran während des Filterns abgelagert wurden, stören würde; und worin die Filtrationskapsel ein für eine Elution wirksames Hohlraumvolumen aufweist, welches in der Lage ist, ein ausreichendes Volumen an Elutionslösung aufzunehmen und eine ausreichende Bewegung zum Resuspendieren der Mikroorganismen, welche auf der Membran während der Filtration abgelagert werden, zu ermöglichen.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 19, welche mindestens eine Endabdeckung umfasst, worin die Endabdeckung mindestens an ein Teil des Filterelementes gesiegelt ist.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 19, welche ferner ein Luftausstoßventil umfasst, welches durch das Polymer-Gehäuse mit einem Raum in Verbindung steht, der zwischen der Membran und dem Einlass vorhanden ist, worin das Luftausstoßventil ferner eine mit einer Subkutan-Nadel durchstoßbare Elastomersiegelung umfasst.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 19, worin die Kapsel ferner eine Endabdeckung aufweist, welche an das Polymer-Gehäuse gesiegelt ist.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 22, worin die Endabdeckung reversibel an das Polymer-Gehäuse gesiegelt ist.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 22, worin die Endabdeckung hermetisch mit dem Polymer-Gehäuse versiegelt ist.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 19, worin die Membran dadurch charakterisiert ist, dass sie einen Raum zwischen benachbarten Falten aufweist, welcher bei dem engsten Punkt eine solche Abmessung besitzt, dass die Wiedergewinnung der Ziel-Mikroorganismen dadurch maximiert wird, indem verhinderf wird, dass Mikroorganismen zwischen benachbarten Faltenoberflächen eingekeilt werden, was eine Wiedergewinnung ausschließen würde.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 19, worin die Membran dadurch gekennzeichnet ist, dass nicht mehr als 25% des Oberflächenbereiches benachbarter Falten aneinander anliegen.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 19, worin die Membran dadurch gekennzeichnet ist, dass nicht mehr als 10% des Oberflächenbereiches benachbarter Falten aneinander anliegen.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 19, worin das Filterelement eine gefaltete Membran umfasst, die das Resuspendieren von Mikroorganismen erlaubt.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 19, worin das für die Elution wirksame Hohlraumvolumen von dem Raum zwischen den inneren Wandungen des Polymer-Gehäuses und der aufstromseitigen Oberfläche des Filterelementes gebildet wird, gesehen aus einer Richtung entlang der Längsachse der Vorrichtung.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 19, worin das Hohlraumvolumen zwischen dem Ende bzw. den Enden des Filterelementes und den Enden des Polymer-Gehäuses angeordnet ist.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 19, worin das für eine Elution wirksame Hohlraumvolumen durch einen Raum zwischen der inneren Wandung des Polymer-Gehäuses und der aufstromseitigen Oberfläche des Filterelementes gebildet wird, gesehen aus der Richtung entlang der Längsachse der Kapsel, und durch einen Raum zwischen dem Ende oder den Enden des Filterelementes und dem Ende oder den Enden des Gehäuses.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 19, umfassend: a) ein hohlzylindrisches Polymer-Gehäuse mit einem offenen Ende und einem geschlossenen Ende, wobei das geschlossene Ende darin eingeformt einen Probeneinlass-Durchlass aufweist, welcher mit dem hohlen Inneren des hohlzylindrischen Polymer-Gehäuses in Verbindung steht; b) eine Endabdeckung, welche so angepasst ist, dass sie dichtend an dem offenen Ende des hohlzylindrischen Polymer-Gehäuses anliegt, wobei die Endabdeckung einen Auslass-Durchgang eingeformt aufweist, welcher mit dem hohlen Inneren in Verbindung steht, und wobei die Endabdeckung ferner so angepasst ist, dass sie dichtend an einem ersten hermetischen Siegel an einem Ende eines zylindrisch angeordneten, lose gefalteten Membranfilters anliegt, wobei das Filter außen einen makroporösen Polymerträger umfasst, wobei das erste hermetische Siegel einen Durchlass aufweist, welcher eine Fluidverbindung durch das erste hermetische Siegel von dem Auslass-Durchlass in die Endabdeckung hinein zu einem stromabwärts gelegenen Innenraum des zylindrisch angeordneten, locker gefalteten Membranfilters erlaubt, wobei das zylindrisch angeordnete, locker gefaltete Filter ferner ein zweites hermetisch gesiegeltes Ende aufweist, so dass kein Fluidverbindungsweg zwischen dem zweiten hermetisch gesiegelten Ende und dem Probeneinlassdurchgang existiert, so dass Fluid, welches durch den Probeneinlass- Durchgang eintritt, durch die Membran hindurchtreten muss, bevor es das Gehäuse durch den Auslass verlassen kann; und c) ein Hohlraumvolumen, welches ein geometrisches Volumen von mindestens dem 2,2-fachen der Größe des Filtervolumens des zylindrisch angeordneten, locker gefalteten Membranfilters aufweist, wobei das Hohlraumvolumen zwischen einem Ende des hohlzylindrischen Polymer-Gehäuses und dem zweiten hermetischen Siegel angeordnet ist.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 32, worin der innere Durchmesser des zylindrisch angeordneten, locker gefalteten mikroporösen Membranfilters ca. 2 cm bis ca. 3 cm beträgt, wobei die Falten eine Tiefe in Radialrichtung von ungefähr 0,75 cm bis ca. 2 cm aufweisen und worin der eingeschlossene Winkel zwischen zwei Seiten von Falten, deren Spitzen am weitesten von dem Träger entfernt sind, im Mittel nicht weniger als ca. 3° beträgt.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 32, worin der Innendurchmesser des zylindrisch angeordneten, locker gefalteten mikroporösen Membranfilters ca. 2 cm bis ca. 3 cm beträgt, wobei die Falten eine Tiefe in Radialrichtung von ca. 0,75 cm bis ca. 2 cm aufweisen und worin der eingeschlossene Winkel zwischen zwei Seiten von Falten, deren Spitzen am weitesten von dem Träger entfernt sind, im Mittel nicht weniger als ca. 4° beträgt.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 32, worin der innere Durchmesser des zylindrisch angeordneten, locker gefalteten mikroporösen Membranfilters ca. 2 bis ca. 3 cm beträgt, wobei die Falten eine Tiefe in Radialrichtung von ca. 0,75 cm bis ca. 2 cm aufweisen und worin der eingeschlossene Winkel zwischen den Seiten von Falten so ist, dass im Mittel nicht mehr als 25% der Oberflächenbereiche von benachbarten Falten aneinander anliegen.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 32, worin der innere Durchmesser des zylindrisch angeordneten, locker gefalteten mikroporösen Membranfilters ca. 2 bis ca. 3 cm beträgt, wobei die Falten eine Tiefe in Radialrichtung von ca. 0,75 cm bis ca. 2 cm aufweisen und worin der Winkel, der zwischen den Seiten der Falten eingeschlossen ist, so ist, dass im Mittel nicht mehr als 10% der Oberflächenbereiche von benachbarten Falten aneinander anliegen.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 32, worin der innere Durchmesser des zylindrisch angeordneten, locker gefalteten mikroporösen Membranfilters ca. 2 bis ca. 3 cm beträgt, worin die Falten eine Tiefe in Radialrichtung von ca. 0,75 cm bis ca. 2 cm aufweisen und worin der eingeschlossene Winkel zwischen den Seiten der Falten so ist, dass im Wesentlichen keine Oberflächenbereiche von benachbarten Falten aneinander anliegen.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 32, worin der innere Durchmesser des zylindrisch angeordneten, locker gefalteten mikroporösen Membranfilters ca. 2 bis ca. 3 cm beträgt, worin die Falten eine Tiefe in Radialrichtung von ca. 0,75 cm bis ca. 2 cm aufweisen und worin der eingeschlossene Winkel zwischen den Seiten der Falten so ist, dass eine Wiedergewinnung von Giardia-Beaufschlagung in einer Menge von 1 × 10⁵ bis 5 × 10⁵ größer als 70% ist.
Wegwerf-Filtrationskapsel nach Anspruch 32, worin der innere Durchmesser des zylindrisch angeordneten, locker gefalteten mikroporösen Membranfilters ca. 2 bis ca. 3 cm beträgt, worin die Falten eine Tiefe in Radialrichtung von ca. 0,75 cm bis ca. 2 cm aufweisen und worin der eingeschlossene Winkel zwischen den Seiten der Falten so ist, dass eine Wiedergewinnung von Giardia-Beaufschlagung in einer Menge von 1 × 10⁵ bis 5 × 10⁵ größer als 95% ist.