DE69722294T2

DE69722294T2 - Vehikel zur Hinzufügung von Teilchen zu einer Probe

Info

Publication number: DE69722294T2
Application number: DE69722294T
Authority: DE
Inventors: Matthew P. Seven Valleys Collis; Allen S. Owing Mills Reichler
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1996-03-12
Filing date: 1997-03-05
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2017-03-06
Also published as: JPH104949A; AU1510897A; AU719543B2; EP0796917A2; US5707860A; EP0796917B1; EP0796917A3; JP3055771B2; DE69722294D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der Zugang zu Zellenkomponenten, wie beispielsweise Nukleinsäure, ist für eine Vielzahl von Methodologien der Molekularbiologie dringend notwendig. Derartige Methodologien umfassen eine Nukleinsäuresequenz, den direkten Nachweis von speziellen Nukleinsäuresequenzen durch Verfahren der Nukleinsäurehybridisation und der Nukleinsäuresequenzerweiterung.
Obgleich ein Zugang zu Nukleinsäuren aus Zellen der gleichen Organismen nicht speziell komplizierte Methodologien oder harte Behandlungen einschließt, weisen andere Organismen Zellen auf, aus denen es besonders schwierig ist, einen Zugang zu Nukleinsäuren oder anderen Zellenkomponenten zu haben. Organismen in der letzteren Gruppe umfassen Spezies des Genus Mycobacteria, der Hefe und Pilze. Im allgemeinen ist die Schwierigkeit des Zuganges zu Zellenkomponenten die Folge der Zellenwände der Organismen, die sehr widerstandsfähig gegen Lysis oder eine Spaltung sind, und/oder des Adhäsionsvermögens bestimmter Zellenkomponenten, wie beispielsweise Nukleinsäuren, an Zellenproteinen und anderen Zellensubstanzen, wie beispielsweise Stücken von Zellenwänden.
Kürzlich wurde ein neues Verfahren für einen Zugang zu Nukleinsäuren entdeckt, das vollständiger in der mit angemeldeten Patentanmeldung offenbart wird, die als EP-A 795602 veröffentlicht wurde. Kurz gesagt, dieses neue Verfahren für einen Zugang zu Nukleinsäuren schließt ein, daß eine Probe aus gespalteten Zellen in Gegenwart von Teilchen umgerührt wird, um die Nukleinsäuren von anderen Zellenkomponenten zu trennen. Es wurde ermittelt, daß dieses Verfahren besonders nützlich ist, um einen Zugang zu Nukleinsäuren aus Zellen von mykobakteriellen Organismen zu haben, nachdem jene Zellen durch die Anwendung von Wärme gespaltet wurden.
Es wurde jedoch ermittelt, daß das Hinzufügen von Teilchen zur Probe aus Zellen bestimmte Schwierigkeiten mit sich bringt. Im allgemeinen werden die Teilchen aus einer großen Menge in die Probe geschöpft, und das tendiert daher dazu, daß unbeständige Mengen von Teilchen an die Probe abgegeben werden. Das Schöpfen und der Versuch, eine so genaue und beständige Menge an Teilchen an die Probe abzugeben, fügen ebenfalls eine zusätzliche Zeit zum Gesamtverfahren hinzu. Außerdem wird beim Versuch, eine genaue Menge an Teilchen an die Probe abzugeben, das Schöpfgefäß, das die Teilchen abgibt, in unmittelbare Nähe der Öffnung des Probenbehälters gebracht, und das riskiert daher eine Kontamination des Schöpfgefäßes und eine folgliche Kontamination der großen Menge an Teilchen und aller weiteren Proben, zu denen Teilchen hinzugefügt werden. Außerdem wird gelegentlich ein Teilchen in der Öffnung des Probenbehälters in einer derartigen Weise angelagert, daß eine richtige Abdichtung nicht bewirkt werden kann. Das würde oftmals zu einem Probenverlust führen, insbesondere, wenn ein Erwämungsschritt im Verfahren eingeschlossen ist.
Das WO 95/28409 liefert ein Reagens, ein Verfahren und einen Behälter für die Isolierung von Zellenkomponenten, wie beispielsweise Ribonukleinsäure (RNS), aus Zellen in einer flüssigen Lösung. Der Behälter umfaßt eine Deckelbaugruppe und einen Aufnahmebehälter, der normalerweise durch die Deckelbaugruppe verschlossen wird, und enthält ein RNS-Extraktionsmittel-Lösungsmittel, Teilchen im Mikrometerbereich und mindestens ein größeres Teilchen, in geeigneter Weise in Millimetergröße. Der Behälter enthält das Reagens, das ein Extraktionsmittel-Lösungsmittel ist, das Phenol und Guanidiniumthiocyanat oder Guanidiniumchlorid enthält und einen pH-Wert von etwa 4 aufweist. Der Behälter umfaßt ebenfalls eine bröcklige Abdichtungsschicht, die das Extraktionsmittel-Lösungsmittel vom flüssigen Medium trennt, das die Zellen enthält, bis der Behälter hin und her geschüttelt wird. Das Verfahren umfaßt das Hin- und Herschütteln des Behälters, worin das größere Teilchen die bröcklige Schicht aufbricht, um das Mischen des flüssigen Mediums mit dem Extraktionsmittel-Lösungsmittel zu gestatten, was zum Aufbrechen der Zellenwände durch die Kügelchen im Mikrometerbereich und zur Freigabe von RNS führt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt alternative Lösungen für die Schwierigkeiten zur Verfügung, denen man begegnet, wenn Teilchen zu Proben von Zellen hinzugefügt werden, indem ein Vehikel mit einer Sperre bereitgestellt wird, um die Teilchen festzuhalten, bis die Teilchen in die Probe freigegeben werden. Die Sperre löst sich auf, wenn sie mit der Probe in Berührung kommt, oder schmilzt bei über etwa 80°C, was bewirken wird, daß die Teilchen für einen Einsatz beim Umrühren der Probe freigegeben werden, um die Zellen zu spalten und/oder die Zellenkomponenten voneinander zu trennen. Eine Ausführung des Vehikels ist eine Kapsel, worin eine auflösbare oder schmelzbare Oberfläche oder Wand der Kapsel die Sperre ist, die die Teilchen festhält.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die verschiedenen Ziele, Vorteile und neuartigen charakteristischen Merkmale der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung leichter erkannt, wenn sie in Verbindung mit den als Anhang beigefügten Fig. gelesen wird, worin das Vehikel aus 7 verschiedene Formen annehmen kann, die die Erfindung verkörpern und nicht verkörpern. 1 bis 6 betreffen Ausführungen außerhalb der Erfindung, unterstützen aber das Verständnis für 7 und die Erfindung.
Es zeigen:
1 eine auseinandergezogene perspektivische Darstellung einer Ausführung des Vehikels und ein typisches Probenröhrchen mit Schraubkappe, in dem das Vehikel angeordnet würde;
2 eine auseinandergezogene Schnittdarstellung des Vehikels und des Probenröhrchens aus 1;
3 eine Schnittdarstellung des Vehikels in einer Probe im Probenröhrchen;
4 eine Schnittdarstellung, die die anfängliche Freigabe der Teilchen aus dem Vehikel im abgedichteten Probenröhrchen während des Umrührens zeigt;
5 eine Schnittdarstellung der freigegebenen Teilchen im abgedichteten Probenröhrchen während des Umrührens;
6 eine Schnittdarstellung der freigegebenen Teilchen im abgedichteten Probenröhrchen, nachdem das Umrühren abgeschlossen ist; und
7 eine vergrößerte Schnittdarstellung des Vehikels.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In einem allgemeinen Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Vehikel für das Abgeben von Teilchen an eine Probe von Zellen. Das Vehikel umfaßt eine Sperre, die die Teilchen festhält, bis sie in die Probe freigegeben werden.
Basierend auf den gewünschten Zielen der Erfindung, d. h., das Abgeben einer genauen beständigen Menge an nicht kontaminierten Teilchen an eine Probe von Zellen, kann das Vehikel eine Vielzahl von Formen aufweisen. Geeignete Vehikel umfassen eine bestimmte Art von Sperre, um die Teilchen bis zur Freigabe in die Probe festzuhalten.
Beispielsweise können die Vehikel physikalische Sperren aufweisen, um die Teilchen festzuhalten, und sie können daher die Form von Aufnahmebehältern, wie beispielsweise Gefäßen, Kapseln, Beuteln, Hülsen, Taschen, und anderen Behältern und Trägern annehmen. Alternativ können die Vehikel andere physikalische Sperren aufweisen, die eher, als daß sie die Teilchen umgeben, um sie festzuhalten, auf den Teilchen vorhanden sind, wie beispielsweise auflösbarer Leim, wie beispielsweise Trehalose, Kleister, Mörtel oder andere Klebstoffe.
Ein Beispiel für ein geeignetes Vehikel wird in 7 veranschaulicht, die eine Kapsel 12 zeigt. Bei dieser Ausführung ist die Sperre die Oberfläche oder Wand 14 der Kapsel.
Bei einer derartigen Ausführung besteht die Sperre aus einem Material, das so ausgelegt sein kann, daß es die Teilchen 16 bis zu ihrer gewünschten Freigabe in eine Probe festhält. Die Sperre ist ein auflösbares oder schmelzbares Material. Ein Teil der Sperre kann ebenfalls auflösbar oder schmelzbar sein, wohingegen der Rest der Sperre nicht so ist, so daß die Teilchenfreigabe von nur einem Teil des Vehikels erfolgt.
Im Fall eines auflösbaren Sperrmaterials wird das Material basierend auf der Beschaffenheit der Probe und der gewünschten Freigabezeit der Teilchen ausgewählt. Gelatine, Polyethylenglycol (PEG) und bestimmte Zuckermaterialien können beispielsweise im allgemeinen durch Einschluß von speziellen Bestandteilen, um sie mit höheren oder langsameren Geschwindigkeiten aufzulösen, kundenspezifisch hergestellt werden.
Ein Teil der Sperre kann ebenfalls zerbrechlich, auflösbar oder schmelzbar sein, wohingegen der Rest der Sperre nicht so ist, so daß die Teilchenfreigabe von nur einem Teil des Vehikels erfolgt.
Bei einem schmelzbaren Sperrmaterial muß das Material nur auf der Basis seines Schmelzprofils (Temperatur und Zeit oder Geschwindigkeit) ausgewählt werden. Wenn es beispielsweise in einem Probenbehandlungsverfahren eingesetzt wird, das einen Erwärmungsschritt umfaßt, um infektiöse Organismen nichtinfektiös zu machen und/oder Zellen zu spalten, ist ein Sperrmaterial, das bei Temperaturen von mehr als etwa 80°C schmilzt, geeignet, da die meisten derartigen Erwärmungsschritte Temperaturen von mindestens 80°C auf die Probe anwenden.
Bei einer Abwandlung des Vehikels 12, das in 7 gezeigt wird, die nicht Teil dieser Erfindung ist, ist die Sperre 14 ein zerbrechliches Material, und mindestens ein Teilchen mit einer größeren Abmessung als die anderen Teilchen 16, ein sogenanntes „Brecherteilchen" 18, ist im Vehikel eingeschlossen. Das Brecherteilchen ist von einer ausreichenden Größe, um das Aufbrechen der Sperre 14 beim Aufschlag hervorzurufen, der durch Umrühren der Probe bewirkt wird. Daher trägt das Brecherteilchen 18 zum anfänglichen Aufbrechen einer zerbrechlichen Sperre 14 bei und trägt ebenfalls zum anschließenden Aufbrechen von Stücken der Sperre bei, während die Teilchen 16 in die Probe freigegeben werden und sich dort hindurch bewegen.
Die Teilchen, die das Brecherteilchen umfassen, können von unterschiedlichen Zusammensetzungen sein, die beispielsweise Glas, Kunststoff, Sandsilikate, Latex, Kristalle, Metalle, wie beispielsweise Zirkonium, Metalloxide, usw., umfassen. Infolge des Einsatzes der Teilchen bei einem Umrührvorgang, um Zellen zu spalten, oder um Zellenkomponenten voneinander in einer Probe von gespalteten Zellen zu trennen, bleiben die Teilchen vorzugsweise in der Probe über eine Zeit unaufgelöst, die ausreichend ist, um den Umrührvorgang abzuschließen. Obgleich nicht auflösbare Teilchen bevorzugt werden, wäre ein Teilchen mit einer langsamen Auflösungsgeschwindigkeit ebenfalls geeignet.
Die Teilchen können ebenfalls verschiedene Formen aufweisen, die beispielsweise Kugeln, Würfel, ovale, kapselartige, tablettenartige, schwer zu beschreibende wahllose Formen, usw. umfassen, und die eine gleichmäßige Form oder ungleichmäßige Form aufweisen können. Wie auch immer die Form eines Teilchens ist, sein Durchmesser an seiner breitesten Stelle liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 0,1 min bis etwa 0,15 mm. Es wurde ermittelt, daß Teilchen mit Durchmessern von mehr als etwa 0,5 min nicht so wirksam beim Spalten der Zellenkomponenten voneinander sind.
Im Gegensatz dazu weist das Brecherteilchen im allgemeinen einen Durchmesser an seiner breitesten Stelle von mindestens etwa 1 mm auf und es kann einen Durchmesser an der breitesten Stelle von bis zu etwa 4 mm aufweisen. Wenn Zirkoniumteilchen mit einem Durchmesser an der breitesten Stelle von etwa 0,1 min verwendet werden, ist ein nützliches Brecherteilchen ein Glasteilchen mit Durchmessern an der breitesten Stelle von etwa 3 min. Daher ist dieses Brecherteilchen von größerer Abmessung als die Zirkoniumteilchen, die nach Freigabe vom Vehikel die Zellenkomponenten voneinander während des Umrührens der Probe von gespalteten Zellen scheren.
Die Menge an Teilchen, die im Vehikel festgehalten wird, hängt von der Menge und der Viskosität der Probe ab, der das Vehikel hinzugefügt wird. Im allgemeinen weist eine typische klinische Probe, aus der ein Kliniker einen Zugang zu Nukleinsäuren für diagnostische Zwecke wünschen würde, ein Volumen von etwa 1 ml oder weniger auf. Andere Proben, wie beispielsweise Umweltproben oder Nahrungsmittelproben, können größere Volumen aufweisen, und andere Proben können kleinere Volumen aufweisen.
Es wurde ermittelt, daß die Größe des Leerraumes zwischen dem Volumen der Teilchen 16 in einem Vehikel 12 und der Sperre 14 einen sehr geringen Unterschied in der Fähigkeit des Vehikels 12 zur Abgabe von Teilchen 16 an die Probe ausmacht. Dieses Fehlen einer spezifischen Forderung betreffs Leerraum wird bei auflösbaren und schmelzbaren Sperren vorgefunden.
Die Viskosität der verschiedenen Proben kann variieren. Beispielsweise ist innerhalb der Kategorie der klinischen Proben eine Speichelprobe im allgemeinen viskoser als eine Blut- oder Urinprobe. Gleichermaßen werden die Viskositäten der verschiedenen Umweltproben ebenfalls variieren.
Als eine allgemeine Regel in viskosen Proben, wie beispielsweise Speichel, wird das Volumen der Teilchen, die einem bestimmten Volumen der Probe zugegeben werden, in einem Verhältnis von etwa 0,25 : 1 bis zu etwa 1 : 1 sein. Bei weniger viskosen Proben glaubt man, daß ein kleineres Volumen-zu-Volumen-Verhältnis der Teilchen zur Probe ausreichend sein wird, um einen Zugang zu Nukleinsäuren aus der Probe zu haben.
Das Vehikel der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um Teilchen an eine Probe für eine Vielzahl von Zwecken abzugeben. Im allgemeinen wird das Vehikel jedoch Teilchen an eine Probe von Zellen für eine Zellenspaltungs- oder einen Lysis-Vorgang abgeben, der ein Umrühren oder eine Ultraschallbehandlung der Probe umfaßt. Derartige Zellenlysis- oder Spaltungsvorgänge sind den Fachleuten gut aus Hinweisen wie beispielsweise Hurley, S. S. und Mitarbeiter, J. Clin. Microbiol. 25 (11) 2227–2229 (1987), der das Umrühren von Proben aus mycobakteriellen Zellen mit Kügelchen und dem lysogenen Mittel, Phenol, in einem Biospec Mini-Beadbeater Instrument beschreibt, und Shah, J. S. und Mitarbeiter, J. Clin. Microbiol. 33 (2) 322–328 (1995) bekannt, der das Umrühren von Proben von M. tuberculosis Zellen mit Kügelchen und dem lysogenen Mittel, Guanidiumthiocyanat (GuSCN), in einem GENE-TRAK-Probenbehandlungsinstrument beschreibt.
Eine weitere Verwendung des Vehikels der vorliegenden Erfindung ist die Abgabe von Teilchen an eine Probe von Zellen, die bereits der Lysis ausgesetzt oder gespaltet wurden. Es wurde ermittelt, daß das Umrühren einer derartigen Probe aus gespalteten Zellen mit Teilchen optimale Ausbeuten an zugänglichen Nukleinsäuren infolge der Trennung oder des Scherens der Nukleinsäuren von anderen Zellenkomponenten, wie beispielsweise Proteinen und Zellenwandbruchstücken, liefert. Über ein derartiges Verfahren für das Zugänglichmachen von Nukleinsäuren aus gespalteten Zellen wird detaillierter im mit angemeldeten EP-A 795602 informiert.
Proben von Zellen, ob gespaltet oder nicht, sind typischerweise in einem Probenröhrchen 20 enthalten, wie beispielsweise dein in 1 gezeigten. Um einen Probenverlust während des Umrührens oder anderer Handhabungen zu vermeiden, weisen derartige Röhrchen im allgemeinen eine Schraubkappe 22 und eine Dichtung (Runddichtring) 24 auf, um das Bereitstellen einer dichten Abdichtung zwischen dem Oberteil des Probenröhrchens und der Schraubkappe zu unterstützen.
Wie in 2 und 3 gezeigt wird, wird das Vehikel 12 im Probenröhrchen 20 angeordnet, entweder vor oder nach dein Hinzufügen einer Probe 26. Wie es vorangehend dargelegt wird, kann die Probe 26 aus intakten, nicht gespalteten Zellen oder aus gespalteten Zellen oder einer Kombination von beiden bestehen. Wie in 3 gezeigt wird, wird sich das Vehikel im allgemeinen auf dem Boden der Probe im Röhrchen absetzen.
Sobald das Probenröhrchen 20 mit der Kappe versehen wurde, wie in 4 gezeigt wird, kann das Röhrchen umgerührt werden, was bewirkt, daß sich die Probe 26 und das Vehikel 12 durchgehend im Röhrchen bewegen. Während sich das Vehikel durch die Probe bewegt, und insbesondere, wenn das Vehikel die Innenwand des Röhrchens berührt, verursacht der Aufprall des Brecherteilchens 18 an der Vehikelsperre 14, daß die Sperre aufbricht.
Das Aufbrechen der Sperre 14 gestattet die Freigabe von Teilchen 16 aus dem Vehikel 12 in die Probe 26, wie in 5 gezeigt wird. Während des Umrührens und nach der Freigabe der Teilchen aus dein Vehikel werden die Teilchen 16, das Brecherteilchen 18 und Bruchstücke 28 der Vehikelsperre durchgängig in der Probe 26 verteilt. Im Anschluß an den Abschluß des Umrührens der Probe setzen sich die Teilchen 16, das Brecherteilchen 18 und die Vehikelsperrenbruchstücke 28 auf dem Boden der Probe 26 ab, wodurch das Entfernen der Probe aus dem Röhrchen durch Pipettieren oder andere ähnliche Mittel ohne Störung durch die Teilchen, das Brecherteilchen oder die Vehikelsperrenbruchstücke gestattet wird.
Das folgende Beispiel 5 veranschaulicht spezifische Ausführungen der Erfindung, die in diesem Dokument beschrieben werden. Die Beispiele 1 bis 4 betreffen eine zerbrechliche Sperre und sind nicht Ausführungen dieser Erfindung, werden aber festgehalten, um das Verständnis für Beispiel 5 zu unterstützen.
BEISPIEL 1
HERSTELLUNG VON VEHIKELN MIT EINER ZERBRECHLICHEN SPERRE
Herstellung von Zirkoniumkapseln
Dieser Versuch wurde durchgeführt, um ein Vehikel für die Abgabe von Teilchen an eine Probe herzustellen, das eine Sperre aufweist, die ausreichend zerbrechlich ist, um die Labcraft^®-Röhrchen zu spalten, wenn in einem BioSpec Bead Beater umgerührt wird.
Materialien Die bei diesem Versuch eingesetzten Materialien waren:

– Borosilikatglas mit einem Durchmesser von 6,9 min
– Zirkonium/Silikat-Kügelchen (Durchmesser 0,1 min bis 0,15 mm), Cole Palmer Cat. # 36270-62
– 3,0 min Glasbrecherkügelchen, Curtin Matheson Cat. # 125-021
– Labcraft^® Microfuge-Röhrchen mit kegelförmigem Boden mit einem Fassungsvermögen von 2,0 ml, Catalog # 273-695

Verfahrensweise
Borosilikatglas mit einem Durchmesser von 6,9 mm wurde an einem Ende an einem Fletcher-Terry Glasabdichtinstrument abgedichtet. Zirkonium/Silikatteilchen (0,1 mm bis 0,15 mm) wurden in jedes abgedichtete Glasteil mit 2,2 g bis 2,3 g/Teil abgegeben. Das Teil, das die Zirkonium/Silikatteilchen enthält, wurde mit einer Gesamtlänge von 3,0 cm abgedichtet, um das Vehikel zu bilden. Ein Glasbrecherteilchen (Durchmesser 3,0 min) wurde in jedes der fünf kegelförmigen Labcraft^®-Röhrchen von 2,0 ml eingesetzt. Ein Vehikel wurde in jedes Röhrchen eingesetzt, und es wurden 1,0 ml Wasser in das Röhrchen abgegeben. Die Röhrchen, die die Kapseln, Kügelchen und Wasser enthalten, wurden in einen BioSpec^® Bead Beater eingesetzt. Die Röhrchen wurden mit 2600 U/min. über 1,0 Minute umgerührt.
Ergebnisse Alle Kapseln in den Labcraft^®-Röhrchen wurden durch Umrühren im BioSpec Bead Beater gespaltet.
Schlußfolgerung
Es konnten Vehikel hergestellt werden, die ein ausreichendes Volumen an Teilchen für eine Abgabe an ein typisches Probenvolumen enthalten. Außerdem spalteten sich die Vehikel innerhalb der Labcraft^®-Röhrchen, wie es gewünscht wurde, und gaben die Teilchen frei.
BEISPIEL 2
ERMITTELUNG DES VOLUMENS DER TEILCHEN FÜR EINEN EINSCHLUSS 1N VEHIKELN
Dieser Versuch wurde durchgeführt, um zu ermitteln, ob das Verändern des Volumens der Teilchen in einem Vehikel die Rückgewinnung und den Nachweis der Zielnukleinsäure aus der Probe beeinflußt.
Materialien
Die folgenden Materialien wurden bei diesem Versuch verwendet.

– KPDG, Posten # 95-01B
– Negative NALC Pellet-Pool
– 0,1 mm Zirkonium/Silikatkügelchen, Cole Palmer Catalog # 36270-62
– Glas 3,0 min Brecherkügelchen, Curtin Matheson Catalog # 125-021
– Zirkoniumkapseln 3,0 cm, Posten # 01061–33
– Mycobacterium tuberculosis H37Rv Teilchen, Posten # 081095DS
– Voramplifikationspuffer, Posten # 95-02A
– Vordekontaminationspuffer, Posten # 95-01A
– Amplifikationspuffer, Posten # 95-471
– Dekontaminationspuffer, Posten # 95-472
– LumiPhos 530, Posten # 052695
– Mtb Hybridisationsmischung, Posten # 95-01B
– Genus-Hybridisationsmischung, Posten # 95-02
– Signatur-Hybridisationsmischung, Posten # 95-01
– Systemfluid, Posten # 95-03A
– Stringency Wash, Posten # 95-03A
– AD-Platten, Posten # 95-03
– Labcraft^®-Röhrchen, Catalog # 273–695

Verfahrensweise
M. tuberculosis H37R-Zellen wurden mit M/15 Phosphatpuffer gewaschen, um jegliche extrazelluläre DNA zu entfernen. Die Zellen wurden erneut im Phosphatpuffer aufgeschlämmt, gezählt und (in Phosphatpuffer) auf Arbeitskonzentrationen verdünnt.
Bei Anwendung einer der Arbeitskonzentrationen wurden Mtb-Teilchen in das Negative NALC Sediment für eine endgültige Konzentration der Mtb-Teilchen im Negative NALC Sediment von 500 Teilchen/0,25 ml gemischt. Das gemischte Negative NALC Sediment wurde in 2,0 ml kegelförmige Labcraft^®-Röhrchen mit 0,25 ml/Röhrchen übertragen.
Ein Milliliter von KPDG wurde jedem Röhrchen zugesetzt, und die Röhrchen wurden mit 12000 g über 3,0 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde aus jedem Röhrchen dekandiert, und 1,0 ml von KPDG wurde jedem Röhrchen zugesetzt. Die Röhrchen wurden mit 12000 g über 3,0 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekandiert.
Ein ml von 0,1 mm Zirkonium/Silikatkügelchen und danach 1,0 ml von KPDG wurden 24 der vorangehend beschriebenen Röhrchen zugesetzt, die gewaschene H37R-Zellen enthielten. Zwei Reihen (acht Röhrchen/Reihe) dieser Röhrchen, die 1,0 ml der 0,1 mm Zirkoniumkügelchen und KPDG enthielten, wurden in einem Umlauflieißluftofen erwärmt und danach bei Benutzung eines BioSpec^®-Bead Beater mit 2600 U/min. über 2,0 Minuten umgerührt, und die andere Reihe von Röhrchen wurde nicht umgerührt.
Ein 3,0 mm Glasbrecherteilchen, ein Vehikel, das 1,0 ml Zirkoniumteilchen enthielt, wie es im Beispiel 1 beschrieben wird, und danach 1,0 ml von KPDG wurden acht Röhrchen zugesetzt, die gewaschene H37R-Zellen enthielten. Diese Reihe von Röhrchen, die ein Brecherkügelchen, ein teilchenenthaltendes Vehikel und KPDG enthielten, wurden mit 2600 U/min. über 2,0 Minuten bei Verwendung des BioSpec^®-Bead Beater umgerührt.
Siebenhundertundfünfzig Mikroliter von 0,1 min Zirkoniumteilchen und danach 1,0 ml von KPDG wurden den acht Röhrchen zugesetzt, die gewaschene H37R-Zellen enthielten. Diese Reihe von Röhrchen, die 750 μl an Zirkoniumteilchen enthielten, wurde in einem Umlaufheißluftofen über 30 Minuten bei 105 °C erwärmt und danach über 2,0 Minuten mit 2600 U/min. umgerühr.
Zwei weitere Reihen von H37R-Zellen enthaltenden Röhrchen, die 500 Mikroliter und bzw. 250 Mikroliter an 0,1 min Zirkoniumteilchen enthielten, wurden in der gleichen Weise behandelt.
Ein Milliliter von KPDG wurde den verbleibenden sechzehn Röhrchen hinzugefügt, die gewaschene H37R-Zellen enthielten. Eine Reihe von Röhrchen wurde in einem Umlauflieißluftofen über 30 Minuten bei 105°C erwärmt und danach mit 2600 U/min. über 2,0 Minuten bei Benutzung des BioSpec^® Bead Beater ummgerührt, und die verbleibende Reihe von Röhrchen wurde in einem Umlaufheißluftofen erwärmt, aber nicht umgerührt.
Strand Displacement Amplification(SDA)- und Nachweisverfahren, die im Beispiel 1 der mit angemeldeten EP-A 795602 beschrieben werden, wurden bei allen Röhrchen dieses Beispiels durchgeführt. Genauer gesagt, eine 30 μl Aliquote einer jeden Probe („unverdünnte Probe") wurde direkt in einem SDA-Versuch mit den folgenden Reagensen unter den folgenden Bedingungen laufen gelassen: Die 30 μl Probe wurde mit 5 μl des Voramplifikationspuffers in einem 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert. Diese Probe wurde über 3 Minuten in einem siedenden Wasserbad erwärmt. Dazu wurden 10 μl der Decontamination Drydown Mix zugesetzt, und eine Amplicon-Dekontaminationsreaktion wurde über 50 Minuten bei 41 °C durchgeführt. Die Amp1icon-Dekontamination wurde bei Anwendung eines Verfahrens durchgeführt, das den Fachleuten aus Hinweisen, wie beispielsweise dem U.S. Patent Nr. 5035996, gut bekannt ist, auf dessen Offenbarung man sich hierin ausdrücklich bezieht. Kurz gesagt, während des Nukleinsäureamplifikationsvorganges wird Nukleotid dUTP für das dTTP substituiert, und daher enthalten alle Produkte, die aus der Target-DNA-Sequenz (Amplicone) repliziert wurden, dUTP anstelle von dTTP. Dann wird vor dein Nukleinsäureamplifikationsvorgang die Probe mit dem Enzym Urazil-DNA-Glycosylase (UDG) in Kontakt gebracht. Die UDG spaltet die glykosidischen Bindungen zwischen Urazil und der Zucker-Deoxyribose, wenn dUTP in einem DNA-Molekül einverleibt wird. Daher werden die Amplicone von den vorhergehenden Nukleinsäureamplifikationsvorgängen nicht amplifizierbar gemacht (d. h., sie sind nicht als Templates für eine Replikation geeignet). Daher wird die einzige richtige Targetsequenz in der Probe als ein Template für die Nukleinsäureamplifikation dienen.
Im Anschluß an die Amplicon-Dekontamination wurden 10 μl der Amplification Drydown Mix hinzugefügt, und die Probe wurde über weitere 2 Stunden bei 41°C inkubiert, um die Abwicklung des Strand Displacement Amplification(SDA)-Vorganges zu gestatten. Der SDA ist ein Nukleinsäure-Amplifikationsvorgang, der den Fachleuten gut bekannt ist. Kurz gesagt, die Strand Displacement Amplification (SDA) ist ein isothermes Verfahren der Nukleinsäure-Amplifikation, bei dein die Extension der Primer, das Einschneiden einer hemimodifizierten Restriktions-Endonuklease-Erkennungs/Spaltstelle, die Verschiebung der Einstrang-Extensionsprodukte, das Annealing der Primen betreffs der Extensionsprodukte (oder Originaltargetsequenz) und die folgende Extension der Primer gleichzeitig in der Reaktionsmischung auftreten. Das steht im Gegensatz zum PCR, bei dein die Schritte der Reaktion in einzelnen Phasen oder Zyklen im Ergebnis der Temperaturzykluscharakteristik der Reaktion auftreten. SDA basiert auf 1) der Fähigkeit einer Restriktions-Endonuklease, den nicht modifizierten Strang einer Hemiphosphorothioat-Form seiner Doppelstrang-Erkennungs/Spaltstelle einzuschneiden und 2) der Fähigkeit bestimmter Polymerasen, die Replikation an der Einschneidstelle einzuleiten und den stromabwärts befindlichen Nicht-Template-Strang zu verschieben. Nach einer anfänglichen Inkubation bei einer erhöhten Temperatur (etwa 95°C), um die Doppelstrang-Targetsequenzen für ein Annealing der Primer zu denaturieren, findet die folgende Polymerisation und Verschiebung der neu synthetisierten Stränge bei einer konstanten Temperatur statt. Die Herstellung einer jeden neuen Kopie der Targetsequenz besteht aus fünf Schritten: 1) Binden der Amplifikations-Primer an eine Originaltargetsequenz oder ein vorher polymerisiertes verschobenes Einstrang-Extensionsprodukt; 2) Extension der Primen um eine 5'-3' Exonuklease-defiziente Polymerase, die ein α-Thiodeoxynukleosittriphosphat (α-Thio dNTP) enthält; 3) Einschneiden einer hemimodifizierten Doppelstrang-Restriktionsstelle; 4) Dissoziation des Restriktionsenzyms von der Einschneidstelle; und 5) Extension vom 3'-Ende der Einschneidstelle um die 5'-3' Exonuklease-defiziente Polymerase mit Displacement des stromabwärts befindlichen neu synthetisierten Stranges. Das Einschneiden, die Polymerisation und Displacement treten gleichzeitig und kontinuierlich bei einer konstanten Temperatur auf, weil die Extension von der Einschneidstelle eine weitere einschneidbare Restriktionsstelle regeneriert. Wenn ein Paar Amplifikations-Primen verwendet wird, wobei ein jeder davon zu einem der zwei Stränge einer Doppelstrang-Targetsequenz hybridisiert, ist die Amplifikation exponentiell. Das ist so, weil die kodierten und antikodierten Stränge als Templates für den entgegengesetzten Primen in den anschließenden Amplifikationsrunden dienen. Wenn ein einzelner Amplifikations-Primer verwendet wird, ist die Amplifikation linear, weil nur ein Strang als ein Template für die Primerextension dient. Beispiele für Restriktions-Endonukleasen, die ihre Doppelstrang-Erkennungs/Spaltstellen einschneiden, wenn ein α-Thio dNTP eingebaut ist, sind HincII, HindII, Aval, Ncil und Fnu4HI. Alle diese Restriktions-Endonukleasen und andere, die die erforderliche Einschneidaktivität zeigen, sind für eine Verwendung bei der konventionellen SDA geeignet. Sie sind jedoch relativ thermolabil und verlieren über etwa 40°C an Aktivität.
Targets für die Amplifikation mittels SDA können durch Zertrümmern größerer Nukleinsäuren durch Restriktion mit einer Endonuklease hergestellt werden, die die Targetsequenz nicht trennt. Es wird jedoch im allgemeinen bevorzugt, daß Targetnukleinsäuren, die die ausgewählten Restriktions-Endonuklease-Erkennungs/Spaltstellen für das Einschneiden aufweisen, bei der SDA-Reaktion erzeugt werden, wie von Walker und Mitarbeitern in 1992 Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 392–396, Walken und Mitarbeitern in 1992 Nucl. Acids Res. 20, 1691–1696 und im U.S. Patent Nr. 5270184 beschrieben wird. Kurz gesagt, wenn die Targetsequenz ein Doppelstrang ist, werden vier Primen diesbezüglich hybridisiert. Zwei der Primer (S₁ und S₂) sind SDA-Amplifikations-Primer, und zwei (B₁ und B₂) sind externe oder Bumper-Primer. S₁ und S₂ binden an entgegengesetzten Stränge der Doppelstrang-Nukleinsäuren, die die Targetsequenz flankieren. B₁ und B₂ binden an die Targetsequenz 5' (d. h., stromaufwärts) von S₁ und bzw. S₂. Die Exonuklease-defiziente Polymerase wird danach verwendet, um gleichzeitig alle vier Primer in Gegenwart von drei Deoxynukleosidtriphosphaten und mindestens einem modifizierten Deoxynukleosidtriphosphat (z. B. 2'-Deoxyadenosin 5'-O-(1-thiotriphosphat), „dATP αS") auszudehnen. Die Extensionsprodukte von S₁ und S₂ werden dadurch vom Originaltargetsequenz-Teinplate um die Extension von B₁ und B₂ verschoben. Die verschobenen Einstrang-Extensionsprodukte der Amplifikations-Primer dienen als Targets für das Binden der entgegengesetzten Amplifikations- und Bumper-Primer (beispielsweise bindet das Extensionsprodukt von S₁ die S₂ und B₂). Der nächste Zyklus der Extrension und Displaceinent führt zu zwei Doppelstrang-Nukleinsäurebruchstücken mit hemimodifizierten Restriktions-Endonuklease-Erkennungs/Spaltstellen an jedem Ende. Sie sind geeignete Substrate für die Amplifikation mittels SDA. Wie bei der SDA treten die einzelnen Schritte der Targeterzeugungsreaktion gleichzeitig und kontinuierlich auf, wobei Targetsequenzen mit den Erkennungs/Spaltsequenzen an den Enden erzeugt werden, die für das Einschneiden durch das Restriktionsenzym bei der SDA erforderlich sind. Da alle der Komponenten der SDA-Reaktion bereits in der Targeterzeugungsreaktion vorhanden sind, gelangen die erzeugten Targetsequenzen automatisch und kontinuierlich in den SDA-Zyklus und werden amplifiziert.
Die SDA-Reaktion, über die ursprünglich in den vorangehend angeführten Veröffentlichungen berichtet wird („konventionelle SDA"), wird typischerweise bei einer Temperatur zwischen etwa 35 °C und 45 °C durchgeführt und ist zu einer 10⁸-fachen Amplifikation einer Targetsequenz in etwa 2 Stunden in der Lage. Kürzlich wurde die SDA für höhere Reaktionstemperaturen angepaßt (etwa 45–65°C – „thermophile SDA" oder „tSDA"). Die tSDA ist in der Lage, eine 10⁹- bis 10¹⁰-fache Amplifikation in etwa 15 bis 30 mm. bei etwa 50 bis 60°C zu bewirken. Zusätzlich zu einer erhöhten Reaktionsgeschwindigkeit ist eine bedeutende Reduzierung der nicht spezifischen Untergrundamplifikation bei der tSDA verglichen mit der konventionellen SDA zu verzeichnen.
Der Nachweis der amplifizierten Target Mycobacterium genus-Sequenz und der M. tuberculosis-Komplexspezies-Sequenz (IS6110) wurde in einem Nur-Versuchformat im BDProbeTec^TM-Instrument durchgeführt. Dieses Nachweissystem wird vollständig von C. A. Spargo und Mitarbeitern in Molec. Cellular Probes 7: 395–404 (1993) beschrieben.
Das BDProbeTec^TM-Instrument ist ein automatisiertes System für das Durchführen von SDA-Versuchen. Die speziellen Details der Ausführungen des BDProbeTec^TM-Instrumentes, das eingesetzt wurde, um automatisch den Nachweis der amplifizierten Targetsequenzen nach den SDA-Versuchen bei diesem Beispiel durchzuführen, werden im U.S. Patent 5578270 offenbart.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse dieses Beispiels werden in der Tabelle 1 nachfolgend dargelegt.
TABELLE 1
Behandelte Proben zeigten statistisch äquivalente Ergebnisse für alle vier Teilchenvolumen (1,0 ml, 750 μl, 500 μl und 250 μl). Die Verwendung von Vehikeln zeigte statistisch äquivalente Ergebnisse zu den Ergebnissen der losen Teilchenvolumen. Die Ergebnisse für lose Teilchen und das teilchenhaltige Vehikel waren statistisch für den Mtb- und Genus-Nachweis besser als für Proben, die keine Teilchen enthielten, oder für jene Proben, die nicht umgerührt wurden.
Vier Proben gingen bei einer Reihe verloren, die ein ml der losen Zirkoniumteilchen enthielt. Man glaubt, daß diese Proben infolge dessen verlorengingen, daß die Teilchen einen Rand auf der Oberseite der Gummidichtung auf den Labcraft®-Röhrchen bildeten, was zu einem Luftspalt führte, der den Verlust der Probe während des Erwärmens gestattete.
BEISPIEL 3
UMRÜHREN DER TEILCHENHALTIGEN VEHIKEL IN PROBEN
Dieser Versuch wurde vorgesehen, um Vehikel von variierenden Längen herzustellen, die variierende Volumen an Teilchen mit und ohne einem 3,0 mm Glasbrecherteilchen enthalten. Die Vehikel wurden basierend auf der Spaltung in einem Savant FastPrep^TM-Instrument bewertet.
Materialien

– Borosilikatglas mit einem Durchmesser von 6,9 min, Ausgangsmaterial
– 0,1 min Zirkonium/Silikatkügelchen, Posten # 072795
– 3,0 mm Natriumsilikatglaskügelchen, Curtin Matheson Catalog # 125–021
– Labcraft^®-Röhrchen Catalog # 273–695

Verfahrensweise
Glasausgangsmaterial mit flachem Boden und einem Durchmesser von 6,9 mm wurde mit einer Länge von 4,5 ein hergestellt. Ein Mark-10 EG50 Kraftmeßgerät wurde verwendet, um zu ermitteln, daß eine Kraft von < 10 lbs. erforderlich war, um die Kuppe bei 10 dieser Teile aufzubrechen.
Danach wurde eine 0,56 g (250 μl) Aliquote von Zirkonium/Silikaltteilchen in die am Boden abgedichteten Glasteile abgegeben. Ein Cozzoli-Kappenverschließinstrument wurde reguliert, um Vehikel mit einer Länge von 1,0 ein, 1,5 cm, 2,0 ein und 2,5 cm herzustellen. Kraftmessungen wurden bei diesen Vehikeln durchgeführt, und es wurde ermittelt, daß eine Kraft von < 10 lbs. erforderlich war, um die Kuppe bei diesen Vehikeln ebenso zu spalten.
Alle Vehikel wurden danach hinsichtlich Spaltung mit einem Savant FastPrep^TM-Instrument bewertet. Die Vehikel wurden in Labcraft®-Röhrchen eingesetzt, und 1,0 ml Wasser wurde in jedes Röhrchen abgegeben. Die Röhrchen wurden in das FastPrep^TM-Istrument in Reihen eingesetzt, die auf der Vehikellänge basierten und darauf, ob des Vehikel ein 3,0 mm Brecherteilchen enthielt.
Die Geschwindigkeitseinstellung des FastPrep^TM-Instrumentes wurde auf 5,5 Meter/Sekunde reguliert, und die Zeiteinstellung wurde auf 45 Sekunden reguliert. Das FastPrep^TM-Instrument wurde danach in Betrieb genommen, und die Anzahl der Kapseln, die pro Art gespaltet wurden, wurde festgehalten.
Ergebnisse
Die Ergebnisse der vorangehenden Verfahrensweisen werden nachfolgend in Tabelle 2 dargelegt.
TABELLE 2
Basierend auf den Ergebnissen von diesem Versuch wurden alle Vehikel, die das 3,0 mm Brecherteilchen enthielten, als akzeptabel betrachtet. Die Vehikel, die nicht das Brecherteilchen enthielten, zeigten einen Spaltungsfehler bei einer größeren Länge von 2,0 ein. Um das Spritzen des KPDG während des Hinzufügens des Vehikels zu minimieren, und um die Menge des verwendeten Sperrenmaterials zu minimieren, wurden daher die kürzeren Vehikel (die 1,0 cm Vehikel mit und ohne 3,0 min Brecherteilchen) weiter hinsichtlich sowohl der Spaltung als auch der Funktionalität bewertet.
BEISPIEL 4
OPTIMIERUNG DER VEHIKELLÄNGE
Dieser Versuch wurde durchgeführt, um die Verwendung der Vehikel mit einer Länge von 1,0 ein (mit und ohne ein 3,0 mm Brecherteilchen), die Verwendung von zwei 1,0 ein Vehikeln mit 3,0 min Brecherteilchen (zwei Vehikel/Probenröhrchen) und von 1,0 ml freien Zirkoniumteilchen hinsichtlich der Spaltung (im Fall der Vehikel) und des Nachweises der Targetnukleinsäure aus einer Probe von gespalteten Zellen zu bewerten.
Materialien
Die in diesem Beispiel verwendeten Materialien waren:
– 0,1 mm freie Zirkoniumkügelchen, Cole Palmen Catalog #36270-62
– Glasvehikel mit einer Länge von 1,0 cm mit 3,0 min Glaskügelchen, Posten # 092295
– Glasvehikel mit einer Länge von 1,0 ein ohne 3,0 mm Glaskügelchen, Posten # 092295
– KPDG, Posten # 95-A
– Negative NALC Sediment, Posten # 081695
– Mtb H37Rv, Posten # 092895DS, Ausgangsmaterialkonzentration
– Labcraft®-Röhrchen, Catalog # 273–695
– Voramplifikationspuffer, Posten # 95-02A
– Vordekontaminationspuffer, Posten # 95-01A
– Dekontaminationsmischung, Posten # 95-605
– Amplifikationsmischung, Posten # 95-604
– Mtb Hybridisationsmischung, Posten # 95-02
– Genus-Hybridisationsmischung, Posten # 95-451A und 95-451B
– Signature-Hybridisationsmischung, Posten # 95-02
– LumiPhos 530, Posten # 052695
– AD Posten # 95-05
– Stringency Wash, Posten # 063095
– Systemfluid, Posten # 95-03A
Verfahrensweise
Das Negative NALC Sediment wurde für endgültige Konzentrationen von 2000 Teilchen H37Rv/ml und 800 Teilchen H37Rv bei Verwendung der gewaschenen Zellenausgangsmaterialkonzentrationen von H37Rv aus Beispiel 2 gemischt. Jede Konzentration der gemischten NALC-Lösung wurde in fünfzig Röhrchen/Lösung mit 250 μl/Röhrchen übertragen.
Ein Milliliter von KPDG wurde jedem Röhrchen zugesetzt, und die Röhrchen wurden mit 12000 g über 3,0 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde aus jedem Röhrchen dekandiert, und 1,0 ml von KPDG wurde jedem Röhrchen zugesetzt. Die Röhrchen wurden wiederum mit 12000 g über 3,0 Minuten zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde dekandiert.
Zwei Vehikel mit einer Länge von 1,0 cm (mit 3,0 mm Brecherteilchen) wurden zehn Röhrchen mit jeder Konzentration zugesetzt, und danach wurde ein ml von KPDG einem jeden Röhrchen zugesetzt. Ein Vehikel mit einer Länge von 1,0 cm (mit 3,0 min Brecherteilchen) wurde zehn Röhrchen mit jeder Konzentration zugesetzt, und danach wurde ein ml von KPDG einem jeden Röhrchen zugesetzt. Ein Vehikel mit einer Länge von 1,0 cm (ohne 3,0 mm Brecherteilchen) wurde zwanzig Röhrchen mit jeder Konzentration zugesetzt, und danach wurde ein ml von KPDG einem jeden Röhrchen zugesetzt. Ein ml der Zirkonium/Silikatteilchen wurde zehn Röhrchen mit jeder Konzentration zugesetzt, und danach wurde ein ml von KPDG einem jedem Röhrchen zugesetzt.
Die Röhrchen wurden in einem Umlauflieißluftofen bei 105°C über 30 Minuten erwärmt. Die Röhrchen wurden danach in einem Savant FastPreb^TM-Instrument mit einer Einstellung von 5,0 m/s über 45 Sekunden umgerührt.
Die Strand Displaceinent Amplification (SDA)- und Nachweisverfahren wurden, wie im Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt, um die Ergebnisse aus diesem Versuch in Relativen Lichteinheiten (RLUs) zu erhalten.
Ergebnisse
Die Ergebnisse dieses Beispiels werden nachfolgend in Tabelle 3 dargelegt.
TABELLE 3
Schlußfolgerung
Es wurden keine statistischen Unterschiede bei irgendwelchen der Bedingungen gesehen, was die Äquivalenz des Vehikels, das das Brecherteilchen enthält, zu 1,0 ml der freien Zirkoniumteilchen (Kontrolle) für eine effektive Mycobacterium DNA-Darstellung für Nukleinsäureamplifikationsvorgänge veranschaulicht. Das Vehikel, das kein Brecherteilchen enthielt, zeigte 9/40 Spaltungsfehler, was es für eine fortgesetzte Bewertung unattraktiv macht.
BEISPIEL 5
BEWERTUNG DER AUFLÖSBAREN VEHIKEL
Dieser Versuch wurde durchgeführt, um die Verwendung von auflösbaren Gelatinekapseln als Abgabevehikel für Zirkoniumteilchen zu bewerten.
Materialien
Die bei diesem Versuch verwendeten Materialien waren:
– Probenverdünnungsmittel (KPDG), Teil # 360691
– Gelatinekapseln NOW^TM Kode # 5215 Typ # 3
– Zirkoniumkügelchen (0,1 mm-0,15 mm) Biospec Catalog # 11079101Z
Verfahrensweise
Zirkoniumkügelchen wurden in vier Gelatinekapseln mit 0,56 g/Kapsel abgegeben. Die Kapseln wurden in Labcraft®-Röhrchen mit einer Kapsel/Röhrchen eingesetzt, und 1,0 ml des Probenverdünnungsmittels wurden in jedes Röhrchen abgegeben. Die Röhrchen wurden mit einer Kappe versehen, und die Röhrchen wurden in einen Umlaufheißluftofen eingesetzt. Die Röhrchen wurden im Umlaulheißluftofen bei 105°C über 30 Minuten gehalten. Die Röhrchen wurden aus dem Ofen herausgenommen, nachdem die Röhrchen auf 40°C abgekühlt wurden. Die Röhrchen wurden in ein Savant FastPrep^TM-Instrument übertragen. Die Geschwindigkeitseinstellung wurde auf 5,0 m/s reguliert, und die Zeit wurde auf 45 Sekunden reguliert. Das FastPrep^TM-Instrument wurde in Betrieb genommen, und die Ergebnisse wurden festgehalten.
Ergebnisse
Die Kapseln wurden im wäßrigen Probenverdünnungsmittel in weniger als 20 Minuten bei 105°C löslich gemacht oder aufgelöst, wodurch Zirkoniumkügelchen in das Probenröhrchen freigegeben werden. Es wurde kein Verlust an Probenfluid festgehalten. Die Zirkoniumkügelchen strömten ungehindert in das Probenröhrchen zum Zeitpunkt des Umrührens und unmittelbar im Anschluß an das Umrühren.
Schlußfolgerung
Dieser Versuch zeigt, daß auflösbare Kapseln als ein Abgabevehikel für die nicht auflösbaren Teilchen an eine Probe verwendet werden können. Die Gelkapsel verhinderte, wie die Glaskapsel, daß die freien Zirkoniumkügelchen die Dichtung am Probenröhrchen zerreißen und den damit verbundenen Verlust an Probenfluid bewirken. Die Zirkoniumkügelchen strömten vor und unmittelbar nach dein Kügelchenaufschlagen ungehindert, was gestattet, daß die Kügelchen die bakteriellen Zellen spalten und DNA für Amplifikations- und Nachweisreaktionen freigeben.
Während die Erfindung mit einer gewissen Spezifik beschrieben wurde, können Abwandlungen, die für die Fachleute offensichtlich sind, vorgenommen werden, ohne daß man vom Bereich der Erfindung abweicht. Verschiedene charakteristische Merkmale der Erfindung werden in den nachfolgenden Patentansprüchen dargelegt.

Claims

Vehikel für die Abgabe von Teilchen an eine Probe, das Zellen enthält, wobei das Vehikel eine Sperre aufweist, die die Teilchen festhält, bis die Teilchen in die Probe abgegeben werden, wobei die Teilchen ausreichend nicht auflösbar sind, um unaufgelöst in der Probe über eine Zeit zu verbleiben, die ausreichend ist, um die Zellen zu spalten und für Nukleinsäuren daraus zugänglich zu machen, wenn die Probe umgerührt oder mit Ultraschall behandelt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Sperre ein Material aufweist, das sich auflöst, wenn es mit der Probe in Berührung gebracht wird, oder das bei einer Temperatur höher als etwa 80°C schmilzt.
Vehikel nach Anspruch 1, bei dein die Teilchen Glaskügelchen sind.
Vehikel nach Anspruch 1, bei dem die Teilchen Zirkonium/Silicat-Kügelchen sind.
Verfahren zum Bewirken einer Zugänglichkeit von Zellenkomponenten, das die folgenden Schritte aufweist: (a) Hinzufügen des Vehikels aus Anspruch 1 zu einer Probe, die Zellen enthält; (b) Veranlassen einer Abgabe der Teilchen aus dein Vehikel; (c) Spalten der Zellen, um eine Freigabe der Zellenkomponenten zu veranlassen; und (d) Umrühren der Probe in ausreichender Weise, so daß Nukleinsäuren zugänglich gemacht werden.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Zellen durch Erwärmen der Probe auf eine Temperatur und über eine Zeit gespaltet werden, die ausreichend ist, um infektiöse Organismen in der Probe nichtinfektiös zu machen.