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Technisches Gebiet
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Die
Erfindung betrifft Arzneistoffzufuhrsysteme, insbesondere Prodrugs,
die zur Aktivierung von Glutathion-S-Transferase (GST) abhängen. Insbesondere
betrifft die Erfindung Prodrugs, in denen die aktive Form des Arzneistoffs
aufgrund einer beibehaltenen Assoziierung mit einer analogen Form
von Glutathion der Clearance durch das Multidrug-Resistance associated
Protein (MRP)-System standhält.
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Stand der
Technik
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Die
PCT-Anmeldung WO 95/09866, veröffentlicht
am 13. April 1995 und hierin durch Bezugnahme aufgenommen, offenbart
eine Gruppe von GST-aktivierten Verbindungen, welche sich auf die
Wechselwirkung einer Prodrug-Form eines Arzneistoffs oder Toxins
mit Glutathion-S-Transferase und die resultierende Abstrahierung
eines Protons durch das Enzym stützen,
was ein Elektronenpaar freisetzt, welches wiederum die Freisetzung
des Arzneistoffs oder Toxin vermittelt. Diese Verbindungen weisen
allgemein die folgende Formel auf, in der der Weg der freigesetzten
Elektronen aus der Wasserstoffionen-Abstrahierung angezeigt ist.
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In
diesen Verbindungen
ist L eine Elektronen abziehende Abgangsgruppe;
ist
Sx eine oxidierte Form von S, Se oder C,
z.B. S=O, O=S=O, S=NH, HN=S=O, Se=O, O=SE=O, Se=NH, HN=Se=O, S+R',
worin R' (1-6C)-Alkyl
oder O-C=O oder HN-C=O ist;
ist jedes R unabhängig H oder
ein nicht störender
Substituent;
steht n für
0, 1 oder 2,
ist YCO ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus γ-Glu, β-Asp, Glu,
Asp, γ-GluGly, β-AspGly,
GluGly und AspGly; und
ist AAc eine
Aminosäure,
die durch eine Peptidbindung an den Rest der Verbindung gebunden
ist.
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Wie
in der oben genannten PCT-Anmeldung erklärt, kann die Spezifität bezüglich spezieller
Gewebe oder Ziele hauptsächlich
durch eine geeignete Wahl von AAc und zu
einem geringeren Ausmaß YCO
manipuliert werden. Der Grund dafür ist, dass die Natur des Glutathion-Analogon-Teils
des Prodrugs bestimmt, welches der vielen Isozyme von GST bei der
Freisetzung der biologisch aktiven Einheit wirksam ist. Die Natur
der Abgangsgruppe legt die biologische Wirkung der Verabreichung
des Prodrugs fest. Unter den beschriebenen Abgangsgruppen sind Stickstoffsenföle und andere
zytotoxische Substanzen sowie verschiedene Antibiotika, Indikator-Moleküle und andere
Gruppen eingeschlossen.
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Obwohl
die in der PCT-Anmeldung beschriebenen Prodrugs wirksam sind, können sie
aufgrund von erhöhten
Spiegeln des Multidrug-Resistance associated Protein (MRP), welches
GSH-konjugierte Substanzen aus der Zelle heraus transportiert, wie
von Jedlitschky, G. et al., Cancer Research (1994) 54:4833, beschrieben,
auch schneller als erwünscht
aus den Zielzellen oder dem Zielgewebe ausgeschieden werden. Zum
Beispiel hat im Fall der Phosphoramidsenföle die Verdrängung eines
Chloridions aus einer der 2-Chlorethylgruppen durch die Sulfhydrylgruppe
von Gutathion ein GSH-Konjugat zum Ergebnis, das dann durch das MRP-System
ausgeschieden werden kann.
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Es
wäre wünschenswert,
Prodrugs bereitzustellen, die nicht nur aktive Formen des Arzneistoffs
als solche freisetzen, sondern auch eine verringerte Clearance-Rate des aktivierten
Arzneistoffs zur Folge hätten. Die
vorliegende Erfindung liefert zwei Ansätze für dieses Problem. Ein Ansatz
beruht in der Auswahl eines Glutathion-Analogons, das selbst mit
dem MRP wechselwirkt, z.B. in Konkurrenz zu GSH, als dem Glutathion-Analogon
in dem Prodrug. So kann, nachdem das Prodrug durch GST gespalten
worden ist, das Glutathion-Analogon den Transport von anderen Einheiten,
wie des aktivierten Arzneistoffs oder Toxins, hemmen. Dieser Ansatz
funktioniert jedoch nur, wenn die für die Prodrug-Freisetzung gewünschte Spezifität es erlaubt,
dass diese Wahl getroffen wird.
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In
einem universelleren Ansatz ist das Prodrug so konstruiert, dass
es die biologisch aktive Einheit, die damit assoziiert ist, aktiviert,
aber nicht vollständig
freisetzt; die biologisch aktive Einheit bleibt an das Glutathion-Analogon
angebunden, was deren Empfänglichkeit
für die
GST-vermittelte Konjugation an freies GSH verringert. So weist sie
eine verringerte Fähigkeit
auf, eine Verbindung zu bilden, die wirksam durch das MRP-System
abtransprotiert wird.
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Lyttle
et al. (J. Med. Chem. (1994)37, 1501-1507) beschreiben die Konstruktion
und Synthese von Alkylierungsmitteln, die durch GSTs aktiviert werden.
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Offenbarung
der Erfindung
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Die
Erfindung stellt eine Verbesserung bei der Konstruktion gewisser
Prodrugs bereit, welche aufgrund der Hemmung der Clearance-Rate
des aktivierten Arzneistoffs niedrigere Dosierungen ermöglicht.
Die Prodrugs sind so konstruiert, dass sie die Clearance des aktivierten
Arzneistoffs durch das MRP-Ausströmungssystem
stören.
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Die
Erfindung ist auf Verbindungen der Formel:
und die Amide, Ester, gemischten
Ester/Amide und Salze derselben gerichtet, worin:
S
x für
S=O, O=S=O, S=NH, HN=S=O, Se=O, O=Se=O, Se=NH, HN=Se=O, S
+(1-6C-Alkyl), -O-C=O oder -HN-C=O steht;
YCO
ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus γ-Glu, β-Asp, Glu,
Asp, γ-GluGly, β-AspGly,
GluGly und AspGly;
AA
c eine Aminosäure ist,
die durch eine Peptidbindung an den Rest der Verbindung geknüpft ist;
jedes
R unabhängig
H oder ein nicht störender
Substituent ist;
(conj) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus -CR=CR-, -(CR=CR)
2-und -Phenylen-;
m für 0 oder
1 steht;
n eine ganze Zahl von 0-4 ist;
X
1 und
X
2 jeweils unabhängig S, O oder NR' sind, worin R' für H oder
einen nicht störenden
Substituenten steht;
Z eine Einheit ist, die, wenn sie mit
P(O)X
1X
2 assoziiert
ist, ein durch einen Linker angebundenes Phosphoramidatsenfgas oder
ein durch einen Linker angebundenes Phosphorodiamidatsenfgas zum
Ergebnis hat; und
jede der gepunkteten Linien eine kovalente
Bindung zwischen (CR
2)
n und
C
*, C
+ oder einem
Kohlenstoff in dem konjugierten System darstellt, falls vorhanden,
mit der Maßgabe,
dass eine und nur eine derartige Bindung vorliegt.
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Demgemäß liegt
bei der Gruppe bestehend aus der gepunkteten Linie, die (CR2) mit C* verbindet, der gepunkteten Linie,
die (CR2)n mit C+ verbindet, und der gepunkteten Linie, die
(CR2)n an einen
Kohlenstoff in dem konjugierten System, falls vorhanden, verbindet,
eine oder nur eine kovalente Bindung vor.
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So
wird in den Verbindungen der Formel (1), wenn das α zu SX stehende Wasserstoffion abstrahiert wird,
was Elektronen (durch das konjugierte System, falls vorhanden) freisetzt,
um letztendlich die kovalente Bindung (a) durchzutrennen, das Phosphoramidat/Phosphorodiamidatsenföl (ein "Biomolekül") biologisch aktiv,
obwohl es entweder durch eine kovalente Bindung an C* oder durch
eine kovalente Bindung an C+ oder durch
eine kovalente Bindung an einem Kohlenstoff in dem konjugierten
System, falls vorhanden, an den Rest des Moleküls gebunden bleibt.
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In
der vorstehenden Formel zeigt (R) an, dass R vorliegt, wenn die
durch eine gepunktete Linie dargestellte kovalente Bindung abwesend
ist, und abwesend ist, wenn die kovalente Bindung, die durch die
gepunktete Linie dargestellt wird, anwesend ist.
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In
anderen Aspekten ist die Erfindung auf pharmazeutische Zusammensetzungen
gerichtet, welche die Verbindungen der Formel (2) enthalten. Diese
Verbindungen können
verwendet werden, um den Metabolismus von Zielzellen durch Verabreichung
der Verbindung der Formel (2) oder pharmazeutischer Zusammensetzungen
derselben zu modulieren.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
ein Reaktionsschema für
die Synthese einiger der Ausführungsformen
der Formel (2), worin X2 für NH steht.
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Die 2 und 3 zeigen
Reaktionsschemata für
Synthesen der Verbindungen der Formel (2), in der X2 für O steht.
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4 zeigt
die Synthese von Verbindungen der Formel (2), in der SX für -O-C=O
oder -NH-C=CO steht.
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Weisen zur
Durchführung
der Erfindunq
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Die
Verbindungen der Formel (2) sind Prodrugs, die verwendet werden
können,
um selektiv Gewebe mit GST-Komplementen anzusteuern, die erhöht sind
oder die bezüglich
ihrer Spezifität
gegenüber
dem bereitgestellten Prodrug speziell sind. Die Spezifität des Prodrugs
bezüglich
erhöhter
Klassen von GST-Isoenzymen
kann durch geeignete Wahl von YCO und AAc festgelegt
werden. So können
diese Prodrugs zusätzlich dazu,
dass sie für
Zellen mit erhöhten
GST- Komplementen
als solchen selektiv sind, in einem fein abgestimmten Protokoll
zur Ansteuerung von Zellen verwendet werden, welche erhöhte Spiegel
eines speziellen Isoenzyms der GST-Gruppe aufweisen.
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Zusätzlich zu
ihrer Selektivität
sind die Prodrugs der Erfindung in der Lage, dem Ausströmen des
aktivierten Arzneistoffs aus den Zielzellen zu widerstehen, was
so niedrigere Dosierungen des Prodrugs ermöglicht. Die Beständigkeit
gegen das Ausströmen
kann durch Auswahl von YCO und AAc in den
Prodrugs erhalten werden, die in der WO 95/09866 offenbart sind,
so dass das freigesetzte Glutathion-Analogon (d.h. YCO-NHCH(CH2Sx-CH=CH2)CO-AAc) so mit
dem MRP-System wechselwirkt, dass dessen Fähigkeit gehemmt wird, zusätzliche
Substanzen zu sekretieren, wenn die Selektivitätsbedingungen eine derartige
Wahl der Konstruktion erlauben. Jedoch kann eine Beständigkeit
gegen ein Ausströmen
auch durch Zuführen
der Prodrugs der vorliegenden Erfindung der Formel (2) erhalten
werden, wobei der aktivierte Arzneistoff oder ein anderes biologisch
aktives Molekül über einen
Linker an das oxidierte Glutathion-Analogon, typisch ein Vinylsulfon,
angebunden bleibt.
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Verfahren
zur Auswahl von ausströmungsbeständigen Prodrugs
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Die
in der oben aufgenommenen WO 95/09866 beschriebenen Prodrugs können direkt
verwendet werden, um biologisch aktive Mittel bereitzustellen, um
Gewebe anzusteuern, wenn die für
das Ziel erforderliche Spezifität
die geeignete Wahl von YCO und AAc ermöglicht,
so dass das Glutathion-Analogon, das (typisch) durch das Vinylsulfon
dargestellt und freigesetzt wird, wenn das biologisch aktive Mittel
freigesetzt wird, mit dem MRP-Clearance-System so wechselwirkt,
dass die Fähigkeit
des Systems gehemmt wird, die Clearance der freigesetzten biologischen
Einheit zu bewirken. So sind zum Beispiel die Glutathion-Analoga
TER 106 (γGlu-C(Bz)-β-Ala); TER
222 (γGlu-C(Bz)-Gly)
und TER 117 (γGlu-C(Bz)-ΦGly) in Assays, die von Akerboom
et al., Biochim. Biophys. Acta (1992) 1103:115-119 beschrieben wurden
und wie sie im nachstehenden Beispiel 1 beschrieben werden, bezüglich ihrer
Fähigkeit
beurteilt worden, mit der MRP-Pumpe
wechselzuwirken. Die Ergebnisse zeigen, dass TER 222 und TER 106
mit MRP so wechselwirken, dass der Transport des radiomarkierten
GSH-Analogons durch die Proteinpumpe verringert wird. Jedoch ist
dies bei TER 117 nicht der Fall. Ein Prodrug, das aus TER 117 konstruiert
wurde, wie in der oben angegebenen PCT-Anmeldung beschrieben, TER
286, weist die gewünschte
Isoenzyme-Spezifität für Zellen
mit GST-Komplementen mit hohen Konzentrationen der P1-1-Isoform auf; jedoch
würde diese
Form des Prodrugs nicht vorteilhaft das Ausströmen hemmen. Andererseits könnten Prodrugs,
die aus TER 222 und TER 106 konstruiert sind, vernünftig verwendet
werden, vorausgesetzt, die GST-Spezifität ist für das Zielgewebe
geeignet.
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Die
Wirksamkeit der Prodrug-Verabreichung kann verbessert werden, indem
man zuerst die Fähigkeit von
Glutathion-Analoga, welche in oxidierter Form den klassischen Prodrug-Konstrukten
einverleibt werden können,
die in der oben angegebenen PCT-Anmeldung beschrieben sind, abschätzt, um
ein Analogon auszuwählen,
das mit MRP wechselwirkt. Zum Beispiel können Verfahren ähnlich den
in Beispiel 1 beschriebenen verwendet werden. Der erfolgreiche Kandidat,
der eine Wechselwirkung zeigt, wird dann verwendet, um das geeignete
Prodrug zu synthetisieren, vorausgesetzt, dass die Spezifität, die dem
Prodrug durch das Analogon verliehen wird, mit dem bestimmten GST-Komplement
der Zielzelle in Einklang steht. Das konstruierte Prodrug wird dann
einem Subjekt verabreicht, welches das biologisch aktive Mittel
benötigt,
das in dem Prodrug enthalten ist.
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Mit einem
Linker versehene Prodrugs
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Es
kann schwierig sein, ein Glutathion-Analogon zu finden, das sowohl
die Fähigkeit
aufweist, mit dem MRP-Clearance-System wechselzuwirken, als auch,
dem Prodrug die geeignete Spezifität zu verleihen. Ein universeller
anwendbares Verfahren zur Sicherstellung sowohl der erforderlichen
Spezifität
als auch der Ausströmungshemmung
ist die Verwendung der mit einem Linker versehenen Prodrugs der
Formel (2). In diesen Verbindungen kann der Glutathion-Analogon-Teil auf der Grundlage
seiner Spezifitäts-verleihenden
Eigenschaften gewählt
werden, und die biologisch aktive Einheit, da sie an das Prodrug
angebunden bleibt, obwohl sie durch teilweise Freisetzung aktiviert
wird, ist selbst gegen einen Transport durch die MRP-Pumpe beständig, da
die GSH-Einheit in dieser Konfiguration ein schlechtes Substrat
für die
MRP-Pumpe ist.
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Die
Verbindungen der Erfindung der Formel (2) umfassen ein Tripeptid,
das ein Glutathion-Analogon ist, welches durch ein molekulares System
an eine mit einem Linker versehene Abgangsgruppe gekuppelt ist, die
die Lösug
von einer der Bindungen der Abgangsgruppe ermöglicht, wenn die Verbindung
der Formel (2) mit dem geeigneten GST behandelt wird. Die Lösung findet
durch eine "β-Eliminierung" statt - - d.h.,
die Entfernung des Protons am Kohlenstoff, der α zu dem elektronenarmen Kohlenstoff,
Schwefel oder Selen steht, setzt Elektronen frei, die letztendlich
durch ein elektronegatives Atom in dem Biomolekül absorbiert werden. Dies kann
schematisch wie folgt gezeigt werden:
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Wie
gezeigt, werden die Elektronen, die in der kovalenten Bindung (a)
enthalten sind, an das Biomolekül
abgegeben. Jedoch bleibt das Biomolekül entweder durch C*, C
+ oder einen Kohlenstoff, der in dem konjugierten
System vorliegt, falls vorhanden, an den Rest des Moleküls gebunden.
So sind Verbindungen der Formel (1') das Ergebnis:
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Wegen
der Abgabe des Elektrons an das Biomolekül und der Durchtrennung der
kovalenten Bindung (a) wird das Biomolekül biologisch aktiv. Da jedoch
das Biomolekül über einen
Linker an den Rest des Glutathion-Analogons gebunden bleibt, wie
gezeigt, ist es gegen Clearance-Systeme beständig, die mit dem Multidrug
Resistance associated Protein assoziiert sind.
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Ein
spezieller Fall dieser Freisetzung ist für eine Ausführungsform der Verbindungen
der nachstehenden Formel (2a) gezeigt:
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Das
Elektronenpaar kann direkt durch β-Eliminierung,
wie oben gezeigt, oder durch ein Konjugationssystem, das durch (conj)m in Formel (1) dargestellt ist, an X1, das dem P-Atom benachbart ist, abgegeben
werden. So kann theoretisch jede Zahl von konjugierten π-Bindungen
in (Conj) eingeschlossen sein, aber man nimmt an, dass die Effizienz
des Elektronentransports abnimmt, wenn diese Zahl zunimmt.
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Nach
der Aktivierung durch die geeignete GST wird das resultierende Molekül eine aktivierte,
biologisch aktive Einheit, in der der biologisch aktive Teil über einen
Linker an das Glutathion-Analogon angebunden ist, wie in Formel
(2a') gezeigt
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Da
die teilweise Freisetzung die Einheit P(O)X1X2-Z freilegt, kann diese Einheit nun für eine biologische
Aktivität
sorgen.
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Geeignete
Ausführungsformen
von Z umfassen jene, die Arzneistoffe erzeugen, welche für unerwünschte Zellen
zytotoxisch sein können.
Derartige Arzneistoffe umfassen die Phosphoramidatsenföle. Bevorzugte
Formen der Phosphorodiamidatsenföle
sind -OP(O)(N(CH2CH2Cl)2, -OP(O)(N(CH2CH2Br)2)2, -OP(O)(NHCH2CH2Cl)2 und
-OP(O)(NHCH2CH2Br)2; so ist in diesen Fällen X1 identisch
mit Z in der Formel (2a').
Jedoch sind Verbindungen, in denen Z z.B. N(CH2CH2Cl)2 ist und X1 für
O steht, ebenfalls bevorzugt.
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Da
die Senföle
an das Glutathion-Analogon angebunden bleiben, wie oben gezeigt,
ist es unwahrscheinlich, dass sie mit Glutathion als solchem auf
herkömmliche
Weise reagieren, bei der ein Chloridion aus der 2-Chlorethyl-Einheit
freigesetzt wird, um Glutathion direkt an den Arzneistoff zu kuppeln.
Die sterische Hinderung durch das konjugierte GSH im Zentrum von
GST verringert die Möglichkeit,
dass ein freies GSH an das Phosphoramidat zum Ausströmen in der
Pumpe gekuppelt wird. So können
sie in Abwesenheit dieser Kupplung nicht unter Verwendung des MRP-Clearance-Wegs
aus der Zelle transportiert werden.
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Die
strukturellen Anforderungen an die Prodrugs der Erfindung sind oben
umrissen.
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Die
Substituenten R spielen keine direkte Rolle bei der Abgabe von Elektronen
an das Biomolekül
und müssen
einfach nicht störende
Substituenten sein. Die Geschwindigkeit der (β-Eliminierung kann jedoch durch die
Natur dieser Gruppen R gesteuert werden; durch Wählen von Elektronen abziehenden
oder Elektronen liefernden Substituenten kann die Eliminierungsgeschwindigkeit
beschleunigt oder verringert werden. Geeignete Substituenten für R umfassen
H, substituiertes oder unsubstituiertes (1-6C)-Alkyl, substituiertes
oder unsubstituiertes (6-12C)-Aryl, substituiertes oder unsubstituiertes
(7-12C)-Arylalkyl, Cyano, Halogen, substituiertes oder unsubstituiertes
(1-6C)-Alkoxy, substituiertes oder unsubstituiertes (6-12C)-Aryloxy
oder substituiertes oder unsubstituiertes (7-12C)-Arylalkyloxy.
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Alkyl,
Aryl und Arylalkyl weisen ihre herkömmlichen Bedeutungen auf; Alkylgruppen
sind gerade, verzweigte Ketten oder cyclische gesättigte Kohlenwasserstoff-Einheiten,
wie Methyl, tert-Butyl, Cyclohexyl und dergleichen. Arylgruppen
umfassen aromatische Systeme wie Phenyl, Naphthyl, Pyridyl und dergleichen.
Arylalkyl-Substituenten enthalten eine Aryl-Einheit, die durch eine
Alkylen-Einheit an den Rest des Moleküls gebunden ist. Derartige
Gruppen umfassen am häufigsten
Benzyl, Phenylethyl, 2-Pyridylethyl und dergleichen.
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Geeignete
Substituenten in den substituierten Formen umfassen Halogen, SR'', OR'' und NR''2, worin R'' für
H oder (1-4C)-Niederalkyl steht.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
für jedes
R sind unabhängig
H, (1-4C)-Niederalkyl und Phenyl, insbesondere H oder (1-4C)-Niederalkyl.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen
steht R für
H und m=0. Jedoch können
alle nicht störenden
Substituenten als R verwendet werden; diese Substituenten liegen
unabhängig
vor.
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Die
Ausführungsformen
von YCO und -AAc legen die Natur des Glutathion-artigen
Tripeptids fest. Eine bevorzugte Ausführungsform ist jene, in der
YCO für γ-Glutamyl steht und
AAc Glycin, Phenylglycin, β-Alanin, Alanin
oder Phenylalanin ist, was das Tripeptid Glutathion oder ein nahes
Analogon zum Ergebnis hat. Jedoch umfassen alternative Ausführungsformen
von YCO β-Asp,
Glu, Asp, γ-GluGly, β-AspGly,
GluGly und AspGly. Alternative Ausführungsformen von AAc umfassen zusammen mit dem bevorzugten Glycin
Phenylglycin, β-Alanin,
Alanin und unsubstituiertes Phenylalanin; Valin, 4-Aminobuttersäure, Asparaginsäure, Phenylglycin, Histidin,
Tryptophan, Tyrosin und substituiertes Phenylalanin. Geeignete Phenylalanin-Substituenten
sind vorstehend für
die substituierten Formen von R beschrieben.
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Die
Verbindungen der Erfindung können
auch in den Formen ihrer Ester oder Amide, gemischten Ester/Amide
oder als die Salze hergestellt werden. Die Ester, Amide oder Salze
werden mit jeder oder allen in dem Molekül vorliegenden Carboxylgruppen
gebildet; daher sind in dieser Gruppe Monoester, Diester und, falls
anwendbar, Triester eingeschlossen. Ähnlich sind Monoamide, Diamide
oder, falls anwendbar, Triamide eingeschlossen. Gemischte Ester/Amide
sind ebenfalls Teil der Erfindung.
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Bei
den Estern oder Amiden kann es sich um (1-6C)-Alkyl, (1-6C)-Alkenyl
oder (7-12C)-Arylalkyl
handeln. Alkylester der freien Carboxyle sind Ester der gerad- und
verzweigtkettigen (1-6C)-Alkylalkohole, wie Methanol, Ethanol, Isopropanol,
t-Butanol, n-Hexanol
und dergleichen. Geeignete (1-6C)-Alkylamide sind jene von primären gerad-
oder verzweigtkettigen Alkylaminen, wie Methylamin, Ethylamin, n-Propylamin,
Isopentylamin und Isohexylamin. Alkenylester sind ähnlich,
enthalten aber mindestens eine Doppelbindung. Arylalkyl ist wie
oben definiert. Die Alkohole oder Amine können auch nicht störende Substituenten,
wie Halogen, Alkoxy oder Alkylamine, tragen. Die Ester und Amide
werden unter Verwendung herkömmlicher
Techniken mit geeignetem Schutz aller Alkohol- oder Aminofunktionellen
Gruppen in der Verbindung der Formel (2) hergestellt.
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Die
Salze der Verbindungen der Erfindung können aus anorganischen oder
organischen Basen zur Bildung der basischen Salze der freien Carboxylgruppen
gebildet werden oder können
aus organischen oder anorganischen Säuren zum Erhalt der Säureadditionssalze
von freien Aminogruppen gebildet werden. So können die Salze die von anorganischen
Basen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid, Ammoniumhydroxid,
Magnesiumhydroxid und dergleichen, oder die von organischen Basen
sein, wie Triethylamin, Pyridin, Pyrimidin, Piperidin, Lysin, Koffein
und dergleichen. Die Säureadditionssalze
können
aus anorganischen Säuren,
wie Chlorwasserstoffsäure,
Bromwasserstoffsäure,
Schwefelsäure,
Phoshorsäure
und dergleichen, oder aus organischen Säuren gebildet werden, wie Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure und
dergleichen. Salze von Citronensäure
sind bevorzugt.
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Die
Salze der Verbindungen der Formel (2) werden gemäß Standardvorschriften durch
Behandlung mit der geeigneten Base oder Säure bei einer Temperatur von etwa
0°C bis
etwa 100°C,
bevorzugt bei Raumtemperatur entweder in Wasser allein oder in Kombination
mit einem inerten mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel,
wie Methanol, Ethanol oder Dioxan, gebildet.
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Bevorzugte
Formen der Verbindungen der Formel (2) sind jene, in denen S
x für
S=O, O=S=O, S=NH, NH=S=O, Se=O, O=Se=O, Se=NH, HN=Se=O, S
+R' steht,
worin R' (1-6C)-Alkyl
ist, bevorzugter worin S
x für O=S=O
oder S=O, insbesondere O=S=O steht. Ebenfalls bevorzugt sind jene
Verbindungen, in denen m=0 und alle Substituenten R für H stehen.
Besonders bevorzugt unter den Verbindungen der Formel (2) sind jene, in
denen Z für
N(CH
2CH
2Cl)
2 oder NHCH
2CH
2Cl oder die Analoga steht, die Br anstelle
von Cl enthalten. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform von n ist 2. In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
steht X
1 für O und steht X
2 für O oder
NH oder N(CH
2CH
ZCl)
2 oder NHCH
2CH
2Cl oder die Analoga, die Br anstelle von
Cl enthalten. Besonders bevorzugt sind Verbindungen der folgenden
Formeln:
worin YCO für γGlu steht
und AA
c Phenylglycin, Glycin oder β-Alanin ist
und Z für
N(CH
2CH
2Cl)
2 oder NHCH
2CH
2Cl steht.
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Jedoch
kann die Wahl von YCO und AAc innerhalb
der oben angegebenen Definition in großem Maß variieren, um dem Prodrug
die geeignete Spezifität
zu verleihen.
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Verwendung
der erfindungsgemäßen Verbindungen
für die
gezielte Arzneimittelzufuhr
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In
einem Aspekt stellt die Erfindung ein Vehikel zur Zufuhr von Arzneistoffen
an Gewebe speziell auf der Basis von deren GST-Gehalt bereit, wobei
das Ausströmen über MRP
verringert ist. Das biologisch aktive Mittel übt, wenn es partiell in dem
Zielgewebe freigesetzt wird, seine gewünschten Wirkungen selektiv
in diesem Zielgewebe aus. Die Zielzellen, in denen die partielle
Freisetzung stattfindet, können
durch Manipulieren der Natur des Glutathion-Analogon-Teils des Moleküls reguliert
werden.
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Wie
oben beschrieben, sind die verschiedenen mit einem Linker versehenen
Arzneistoffe der Erfindung für
die verschiedenen Isoenzyme von GST selektiv, deren Konzentrationen
in Tumorzellen erhöht
sein können.
Wie bei den in der WO 95/09866 beschriebenen Prodrugs erhält man,
indem man das Profil der GST-Isoenzym-Konzentrationen
in dem Tumorziel bestimmt und dies mit der Spezifität des Prodrugs
in Einklang bringt, eine maximale Wirksamkeit gegen die Tumorzelle,
und es kann eine maximale Selektivität gegenüber normalem Gewebe für die Tumorzelle
erzielt werden. Die Selektivität
des Prodrugs hängt
zu einem signifikanten Ausmaß von
der Wahl des als Komponente des Arzneistoffs verwendeten Glutathion-Analogons
ab.
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In
erläuternden
Verbindungen, die in der PCT-Anmeldung beschrieben sind, ist TER
231 besonders für
eine Spaltung durch GST M1a-1a empfänglich; ist TER 303 besonders
für eine
Spaltung durch A1-1 empfänglich;
ist TER 286 besonders für
eine Spaltung durch P1-1 und A1-1 empfänglich, während TER 296 selektiv durch
P1-1 gespaltet wird. Demgemäß wäre bei der
Behandlung eines Tumors mit erhöhten
Konzentrationen an P1-1 die Verwendung einer Verbindung der Formel
(1), in der das Tripeptid in TER 296 oder TER 286 enthalten ist,
bevorzugt. Das relevante Isoenzym, GST P1-1, ist in mehr als 75%
von Human-Tumorproben aus der Brust, Lunge, Leber und dem Kolon
erhöht.
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Die
geeignete Prodrug-Wahl wird auch durch Bestimmen des GST-Komplements
der zu behandelnden Zellen im Vergleich zu normalem Gewebe erleichtert.
Detaillierte Anweisungen zum Erhalt derartiger Komplemente werden
in der PCT-Anmeldung
US 92/03537, veröffentlicht
im Oktober 1992, gefunden. Die Beschreibung in dieser PCT-Anmeldung
gibt Verfahren zur Bestimmung an, welche GST-Isoenzyme in speziellen Geweben
erhöht
sind.
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Die
Verbindungen der Formel (2) werden als pharmazeutische Zusammensetzungen
in üblichen
Formulierungen verabreicht, wie jenen, die in Remington's Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, letzte Auflage, umrissen
sind. Typische Formulierungen umfassen jene zur Injektion, zur transdermalen
und transmukosalen Verabreichung und zur oralen Verabreichung. Die
Formulierungen können
abhängig
von der beabsichtigten Weise Flüssigkeiten,
Sirupe, Pulver, Kapseln, Suppositorien und dergleichen sein. Die
Verbindungen der Erfindung können
in Liposomen oder in anderen emulgierten Formen eingeschlossen sein.
Protokolle für
die Verabreichung und geeignete Formulierungen unterliegen einer
Optimierung unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Standardverfahren.
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Die
Antitumor-Aktivität
der erfindungsgemäßen Verbindungen
der Formel (2), die mit dem Phosphorodiamidatsenföl oder anderen
Toxinen gekoppelt sind, kann unter Verwendung einer Anzahl von Human-Tumor-Xenotransplantaten
zur Bestimmung der Tumorwachstums-Hemmung oder in einem B16-Maus-Melanom und
Messen der Verlängerung
des Überlebens
zur Bestimmung der Wirksamkeit der speziellen Verbindungen beurteilt
werden.
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Synthese der
erfindungsgemäßen Verbindungen
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Die
Verbindungen, die Glutathion oder dessen oben beschriebene Analoga
umfassen und an eine wünschenswerte
biologisch aktive Einheit gekuppelt sind, können unter Verwendung von allgemein
in der Technik bekannten Mitteln synthetisiert werden. Wenn Sx eine oxidierte Form von S oder Se ist,
können
die nachstehend erläuterten
Verfahren verwendet werden, die Modifikationen enthalten, welche
sie auf gewünschte
Verbindungen der Erfindung anwendbar machen.
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So
können
zum Beispiel Verbindungen der Formel (2), in der Sx für S=O, Se=O,
O=S=O oder O=Se=O steht, aus den entsprechenden Verbindungen, in
denen S oder Se in reduzierter Form vorliegt, durch Oxidation mit
milden Oxidationsmitteln, wie Peroxid oder Peracetat, hergestellt
werden. Verbindungen der Formel (2), in der Sx für S=NH,
Se=NH, O=S=NH oder O=Se=NH steht, können durch Behandlung der geeigneten
Vorstufe mit reduziertem S oder Se oder einer partiell oxidierten
Form mit Chloramin T unter in der Technik bekannten Bedingungen
erhalten werden. Alternativ kann das Verfahren von Whitehead, J.K.
et al., J. Chem. Soc. (1952) 1572-1574, verwendet werden. Dipeptid-Vorstufen
können
in die Verbindung der Formel (2) überführt werden, indem man die YCO-Einheit
oder die AAc-Aminosäure unter Verwendung von Standard-Peptid-Kupplungstechniken
an das geeignete Dipeptid kuppelt. Wenn S oder Se in reduzierter
Form in dem Dipeptid vorliegen, können diese Verbindungen ähnlich in
Tripeptide mit reduziertem S oder Se überführt werden. Verbindungen der
Formel (2), in der Sx ein Sulfoniumion ist,
d.h. S+, können synthetisiert werden,
indem man die Verbindungen mit reduziertem S mit Alkylhalogeniden
unter geeigneten Bedingungen zur Alkylierung des Sulfids behandelt,
oder Zwischenprodukte können
aus entsprechenden Dipeptid-Verbindungen synthetisiert werden. R' ist (1-6C)-Alkyl, wie oben
definiert. Bevorzugte Alkylhalogenide für die Reaktion, um letztendlich
Verbindungen der Formel (2) zu bilden, sind in dieser Ausführungsform
die Iodide.
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Verbindungen
der Formel (2), in der Sx für O-C=O
steht, werden erhalten, indem man als Dipeptid- oder Tripeptid-Ausgangsmaterial
Analoga von Glutathion verwendet, in denen Serin anstelle der Cystein-Einheit
vorliegt. Die Verbindungen werden dann durch Veresterung des Di-
oder Tripeptid-haltigen Serins erhalten.
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Wenn
Sx für
NH-C=O steht, wird die entsprechende Amidierungsreaktion mit Analoga
bewirkt, in denen 2,3-Diaminopropionsäure anstelle von Cystein vorliegt.
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In 1 ist
eine Reihenfolge von Reaktionen gezeigt, um die Vorstufe der Ausführungsform
zu erhalten, in der Sx für O=S=O bei Verbindungen der
Formel (2) steht, in der X2 für NH steht.
Das Sulfon wird durch Behandlung mit milden Oxidationsmitteln, wie
oben beschrieben, wie Peressigsäure,
aus dem Schwefel in reduzierter Form erhalten.
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Der
letzte Schritt in der Reaktionssequenz vor der Oxidation zum Sulfon
ist die Kupplung des Glutathion-Analogons an eine bromierte Form
der mit dem Linker versehenen Einheit. Die Konstruktion der mit
dem Linker versehenen Einheit ist wie folgt: das Ausgangsmaterial,
4-Aminobuttersäure,
wird zuerst in Acetanhydrid und Base, wie Pyridin oder Triethylamin,
acetyliert, was Verbindung A ergibt. Das α zum Carboxyl stehende Brom
wird unter Verwendung von Hell-Volhard-Zelinski-Bedingungen eingeführt, und die resultierende
Verbindung wird in Base hydrolysiert, wodurch die Verbindung C, γ-Amino-α-hydroxybuttersäure, erhalten
wird. Verbindung C wird mit Lithiumaluminiumhydrid reduziert, wodurch
das Diol D erhalten wird, das in Anwesenheit eines Säure-Katalysators
mit Dihydropyran behandelt wird, was das Tetrahydropyranylalkoholamin
E liefert. Die Verbindung E wird dann mit Phosphor(III)-oxychlorid
und Base behandelt, wodurch die Verbindung F erhalten wird, die
durch Kristallisation oder Chromatographie gereinigt wird. Die isolierte
Verbindung F wird dann mit Bis-2-chlorethylamin und Base behandelt,
gefolgt von der Umsetzung mit HBr, was die Verbindung G ergibt,
die isoliert und unter reduktiven Alkylierungsbedingungen (NaBH4, Ammoniak, Inertatmosphäre) mit einem geeigneten Glutathion-Analogon
umgesetzt wird, was das Sulfid H ergibt. Der Oxidation der Verbindung H
zu der gewünschten
Verbindung der Formel (2) mit Peressigsäure folgt die Reinigung des
Produkts mit HPLC.
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Die 2 und 3 zeigen
die Synthese von alternativen Formen der Verbindungen der Formel
(2), in der X2 für O steht. In 2 wird
Glycerol (A2) unter milden sauren Dehydratisierungsbedingungen,
die typisch durch Dean-Stark repräsentiert werden, mit Aceton
umgesetzt, um das entsprechende Ketal, den sechsgliedrigen Ring
B2, zu ergeben. Die Verdrängung
des Ring-Hydroxyls durch Chlorid unter Verwendung von SOCl2 in Pyridin liefert das resultierende C2,
das dann unter mild sauren Bedingungen hydrolysiert wird, wodurch
man 1,3-Dihydroxy-2-chlorpropan,
D2, erhält.
D2 wird mit Phosphoroxychlorid behandelt, wodurch man den cyclischen
Diester E2 erhält,
der dann mit Bis(2-chlorethyl)amin in Anwesenheit von Base, bevorzugt
Triethylamin, umgesetzt wird, was F2 ergibt. F2 wird dann unter
reduzierenden Bedingungen (NH4OH, NaBH4, Argon) mit dem gewünschten Glutathion-Analogon,
wie GSH selbst, umgesetzt, was das Sulfid-Zwischenprodukt liefert, das gereinigt
und oxidiert wird, was die Verbindung der Formel (G2) liefert. In
G2 steht, wie gezeigt, Sx für O=S=O,
sind X1 und X2 beide
O und steht Z für
N(CH2CH2Cl)2. In der Formel (G2) steht n für 1 und
m für 0.
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In 2 ist
auch das resultierende G2' gezeigt,
wenn der Wasserstoff, der α zum
Sulfon steht, abstrahiert wird und das Prodrug in die über den
Linker angebundene aktive Form überführt wird.
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3 zeigt
die Synthese der analogen Verbindung von Formel (2), J3, in der
m=1. Die Abgabe des Wasserstoffions, das α zum Sulfon in J3 steht, liefert
die über
den Linker angebundene aktive Form, die als J3' gezeigt ist.
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Um
J3 zu synthetisieren, wird das in 2 hergestellte
Ketal unter wasserfreien Bedingungen unter Verwendung von Pyridiniumchlorochromat
(PCC) oxidiert, wodurch man das entsprechende Keton B3 erhält. B3 wird
dann mit Wittig-Reagens
C3 behandelt, wodurch man die silylierte konjugierte Verbindung
D3 erhält. D3
wird mit Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) desilyliert, wodurch man
den Allylalkohol D2 erhält,
der dann mit SOCl2 in Pyridin chloriert
wird, wodurch man F3 erhält.
Die verbleibenden Schritte sind ähnlich
den in 2 gezeigten. Das Ketal wird hydrolysiert, was
das Thiol G3 ergibt, das dann mit Phosphoroxychlorid in Anwesenheit
von Base behandelt wird, was eine Phosphorylierung unter Erhalt
von H3 zur Folge hat. H3 wird dann mit Bis(2-chlorethyl)amin und
Base behandelt, was 13 ergibt, welches dann gereinigt und dann unter
basischen reduzierenden Bedingungen, wie sie in 2 angegeben
wurden, an das gewünschte
Glutathion-Analogon gekuppelt wird, was das Sulfid liefert, das
dann gereinigt und oxidiert wird, wodurch man J3, das Endprodukt, erhält.
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4 zeigt
die Synthese von Verbindungen der Formel (2), in der Sx für -O-C=O
oder -NH-C=O steht. Wie in 4 gezeigt,
wird das Triol A4 mit Aceton umgesetzt, was analog zur Bildung von
B2, wie in 2 gezeigt, das Ketal ergibt.
B4 wird dann in zwei Stufen oxidiert, zuerst unter milden Bedingungen
unter Verwendung von Pyridiniumchlorochromat (PCC) zu einem Aldehyd
und dann an Luft, was die entsprechende Carbonsäure C4 liefert, die dann zum
Diol hydrolyisiert wird. Analog zur Sequenz der Reaktionen in den 2 und 3 wird
das Diol mit Phosphoroxychlorid in Base behandelt, wodurch man das
phosphorylierte Produkt erhält,
das dann mit Bis(2-chlorethyl)amin in Anwesenheit von Base derivatisiert
wird, wodurch man F4 erhält. F4
wird mit dem gewünschten
Glutathion-Analogon umgesetzt, in dem die Position des Sulfhydryls
durch OH oder NH2 ersetzt ist, wodurch man
das resultierende Ester- oder Amid-verknüpfte Prodrug erhält, das
als H4 gezeigt ist. Diese Kupplung wird unter Verwendung von Standard-Reagenzien,
wie Dicyclohexylcarbodiamid oder N-Hydroxysuccinimid, bewirkt. Bei
diesem Schritt wird das Glutaminsäure-Amin unter Verwendung von Standard-Amino-Schutzgruppen
geschützt.
Die Abstrahierung des Wasserstoffs, der α zur Carbonylgruppe steht, hat
die über
den Linker angebundene aktive Form zum Ergebnis.
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Die
folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, aber nicht beschränken.
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Beispiel 1
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Bestimmung
der Wechselwirkung von Glutathion-Analoga mit MRP
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Zwei
indirekte Messungen der Wechselwirkung von Testverbindungen im MRP-System von menschlichen
Erythrozyten wurden verwendet. Die erste war die Stimulierung der
basalen Mg+2-stimulierten ATPase-Aktivität, die andere
war die Hemmung des Transports von tritiiertem Dinitrophenyl-S-glutathion.
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Im
ersten Verfahren wurde die Methode von Bartosz, M. et al., Biochem.
Mol. Biol. Int. (1994) 34:521-529, verwendet. Kurz gesagt, wurden
die Verbindungen zu Erythrozyten-Membranen in einem Medium gegeben,
das 100 mM Tris HCl, pH 4, 10 mM MgCl2,
1 mM ATP, 0,1 mM Ouabain und 1 mM EGTA enthielt, mit einer 30-minütigen Inkubation
bei 37°C.
Die Stimulierung der ATPase-Aktivität wurde gemessen, wie beschrieben.
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In
diesem Assay stimulierte TER 117 die ATPase-Aktivität nicht.
TER 222 stimulierte diese Aktivität, was ein Vmax von
125,9 mM/mg Protein pro h zum Ergebnis hatte; das Vmax,
das für
TER 106 beobachtet wurde, betrug 209,6 mM/mg Protein pro h; Km für
TER 222 betrug 0,385 mM; von TER 106 1,82 mM. Die vorstehenden Werte
waren Durchschnitte von drei getrennten Bestimmungen.
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In
dem Alternativverfahren wurde die Aufnahme von tritiiertem DNP-Glutathion-Konjugat durch umgedrehte
Vesikel von menschlichen Erythrozyten bestimmt, wie in Akerboom,
T.P.M. et al., Biochim. Biophys. Acta (1992) 1103:115-119, beschrieben.
Die markierte DNP-GSH-Konzentration betrug 5 μM, und die Verbindungen wurden
bei einer Endkonzentration von 1 μM
zugesetzt; die Aufnahme von markiertem DNP-GSH wurde nach 15-minütiger Inkubation
bei 37°C
gemessen. Als Mittel von drei getrennten Versuchen zeigte TER 222 eine
62,5%-ige Inhibierung der markierten Konjugat-Aufnahme; TER 106
zeigte eine 66,2%-ige Inhibierung und TER 117 eine 0,2%-ige Inhibierung.
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Demgemäß können Prodrugs,
die TER 222 und TER 106 als das Glutathion-Analogon enthalten, möglicherweise
ohne die Notwendigkeit zum Anbinden des biologisch aktiven Mittels über einen
Linker nützlich
zugeführt
werden, vorausgesetzt, dass die Spezifität für das GST-Komplement des Zielgewebes
geeignet ist.
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Beispiel 2
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Selektive
Aktivierung von Phosphoroamidaten durch GST-Isoenzyme
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Die
Selektivität
der Aktivierung der Verbindungen ist analog zu jener, die von Lyttle,
M.H. et al., J. Med. Chem. (1994) 37:1501-1507, beschrieben wurde.
Kurz gesagt, wird abhängig
vom Glutathion-Analogon, das in dem Konjugat verwendet wird, eine
Selektivität
für GSTs
der Isoformen A1-1, M1a-1a und P1-1 gezeigt. Die Bestimmung der
in-vitro-Zytotoxizität
der Verbindungen der Erfindung wird durchgeführt, wie in dieser Veröffentlichung
beschrieben.
