DE60005534T2

DE60005534T2 - Verfahren zur kupplung zwischen einem peptid und mindestens einer weiteren verbindung in lösung und verwendungen davon

Info

Publication number: DE60005534T2
Application number: DE60005534T
Authority: DE
Inventors: Dominique Bonnet; Oleg Melnyk; Helène GRAS-MASSE
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1999-08-19
Filing date: 2000-08-18
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2020-08-19
Also published as: AU777475B2; WO2001014408A3; WO2001014408A2; ATE250626T1; CA2382174A1; FR2797632B1; AU7013900A; EP1206482A2; EP1206482B1; JP2003516313A; DE60005534D1; FR2797632A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Kupplung, in Lösung, zwischen einem Peptid und mindestens einer Verbindung, die eine Carbonsäure- oder Alkoholfunktion aufweist, wie etwa ein Lipid, ein Zucker, ein Alkohol oder ein Fluoreszenzmarker, sowie auf modifizierte Peptide, welche im Wesentlichen aus einem Peptid bestehen, das durch eine Hydrazidbindung bzw. ein Hydrazidbindeglied an mindestens eine Verbindung, wie sie vorstehend definiert ist, gebunden ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung von N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure oder N,N'-Di(Boc)hydrazinoessigsäure zum Funktionalisieren eines Peptides mit einer α-hydrazinoessigsauren Gruppe.
Das Problem des Eintritts von verschiedenen Substanzen, die mit pharmakologischen Eigenschaften ausgestattet sind, in die lebenden Zellen besitzt eine große Bedeutung auf therapeutischem Gebiet. Für die synthetischen Peptide und die Oligonucleotide ist das Durchqueren der Zellmembran schwierig. Eine interessante Vorgehensweise zum Verbessern ihrer Fähigkeit, in die Zelle einzudringen, ist, sie durch einen lipophilen Teil zu modifizieren. So wurde gezeigt, dass ein durch eine einfache aliphatische Kette modifiziertes Peptid durch passiven Transfer über die Membran in das Innere der Zelle eindringen und mit seinem intrazytoplasmatischen Ziel wechselwirken kann. Die Lipopeptide stellen folglich interessante Moleküle zum Einschleusen einer funktionellen Gruppe in das Innere der Zelle dar.
Die Synthese von Lipopeptiden kann z.B. durch Kuppeln einer Fettsäure an ein Peptid in fester Phase erfolgen, wie es insbesondere von K. THIAM et al. in Biochemical and Biophysical Research Communications, 1998, 253, 639-647 beschrieben ist. Am Ende der Synthese müssen die Schritte der Spaltung der Peptid/Festträger-Bindung und der Entfernung der Schutzgruppen von den Seitenketten des Peptides durch eine starke Säure durchgeführt werden. Diese Behandlung beschränkt auf erhebliche Weise die Wahl des lipophilen Teils; sie verbietet insbesondere die Verwendung von ungesättigten Fettsäuren. Außerdem ist die Reinigung der Lipopeptide durch Umkehrphasen-Hochleistungs flüssigchromatografie schwierig und führt zu geringen Ausbeuten, in Anbetracht der zahlreichen Verunreinigungen, die am Ende der Synthese vorhanden sind.
Es wurde auch vorgeschlagen, in Lösung ein Protein an eine Palmitoyl-Coenzym A-Gruppe zu kuppeln, wobei letztere an der Thiolgruppe eines Cysteins eingeführt wird. Eine solche Kupplung führt zur Bildung einer Thioesterbindung, welche den Nachteil aufweist, dass sie wenig stabil ist. Andererseits ist diese Strategie auf die Modifikation von bestimmten Proteinen durch das Palmitoyl-Coenzym A beschränkt und kann nicht auf die Synthese von Lipopeptiden verallgemeinert werden.
Die aktuellen Strategien für die Synthese von Lipopeptiden bestehen auch darin, chemische Ligationsreaktionen einzusetzen. Die chemische Ligation ermöglicht es, in Lösung und unter äußerst müden Bedingungen zwei vorher gereinigte und von allen Schutzgruppen befreite Peptidstrukturen zu verbinden.
So wurde vorgeschlagen, in einem wässrigen Puffer eine Fettsäure mit einem Peptid durch eine Disulfidbindung zu verbinden. Die Disulfidbindung wirft jedoch zahlreiche Probleme auf; eine solche Bindung ist in der Tat wenig stabil und kann leicht in Gegenwart von Thiolen abgebaut werden, daher rührt die Notwendigkeit, die Verunreinigung der für die Solubilisierung der Produkte verwendeten Lösungsmittel durch Thiole zu vermeiden, sowie die Unmöglichkeit, ein Cystein in die einzuschleusende bzw. zu vektorisierende Peptidsequenz einzuführen. Die Verwendung der Thiolchemie erfordert außerdem, unter Inertatmosphäre zu arbeiten, um die Oxidation der Thiole zu vermeiden.
W. ZENG et al. (J. Pept. Sc., 1996, 2, 66-72) haben auch vorgeschlagen, in Lösung ein Peptid, von dem alle Schutzgruppen entfernt wurden, und das vorher gereinigt wurde, mit einer an ein Peptid gebundenen polyfunktionellen Lipidstruktur zu verbinden und zwar über den Umweg einer Oximbindung. Der lipophile Teil wird an einer Peptidsequenz in fester Phase eingeführt, wobei ein solches Verfahren die vorstehend erwähnten Nachteile aufweist, insbesondere die Beschränkung hinsichtlich der Wahl des lipophilen Teils und die Schwierigkeiten, die mit der Reinigung der Lipidstruktur verbunden sind.
Auf ähnliche Weise haben O. MELNYK et al. (J. Peptide Res., 1998, 52, 180–184) die Ligation, in Lösung und durch eine Hydrazonbindung, zwischen einem Peptid, das eine lipophile Kette und eine Aldehydfunktion aufweist, und einem anderen Peptid, das an der Seitenkette von Lysin durch eine Hydrazingruppe modifiziert ist, beschrieben. Die Hydrazonbindung erfolgt in Lösung, aber die lipophile Verbindung mit peptidartiger Beschaffenheit wird in fester Phase synthetisiert und die Beschränkungen sind die gleichen, die vorstehend erwähnt wurden.
Außerdem haben C. KLINGUER et al. (Tetrahedron Letters, 1996, 37, Nr. 40, 7259-7262) die Ligation, in einem Wasser/Acetonitril-Gemisch und durch eine Hydrazonbindung, zwischen einem Peptid, das eine Hydrazinfunktion aufweist, und dem Cyclohexancarboxaldehyd beschrieben. Das von diesen Autoren beschriebene Vertahren gestattet jedoch nicht, stabile und folglich für die Einschleusung bzw. Vektorisierung von Wirkstoffen brauchbare Verbindungen zu erhalten: in der Tat ist die zwischen dem Hydrazin und dem Aldehyd gebildete Hydrazonbindung in einem breiten pH-Bereich instabil.
Die chemische Ligation erscheint als Methode der Wahl zur Synthese von Lipopeptiden, welche die Verbesserung der Ausbeuten dieser Verbindungen ermöglicht. Wir haben jedoch gesehen, dass es bis jetzt keine Ligationsverfahren gibt, die nicht die Thiolchemie verwenden und eine direkte Kupplung einer lipophilen Verbindung, die nicht an eine Trägerstruktur gebunden ist, mit einem Peptid, das keinerlei Schutzgruppen aufweist, ermöglichen.
Die Erfinder haben sich folglich die Aufgabe gestellt, eine neue Strategie zur Synthese von Lipopeptiden und allgemeiner von modifizierten Peptiden durch verschiedene Verbindungen mit lipidartiger oder anderer Beschaffenheit durch chemische Ligation in Lösung bereitzustellen.
Diese neue Synthesestrategie muss insbesondere die folgenden Kriterien erfüllen:

– die Kupplung der vorstehend erwähnten Verbindung, z.B. eines Lipids, mit dem Peptid erfolgt in Lösung,
– die Kupplung erfolgt ausgehend von einem Peptid, das keine Schutzgruppen aufweist bzw. von dem alle Schutzgruppen entfernt sind, wobei die Reaktion chemoselektiv ist,
– die Reaktionsbedingungen der Kupplung gestatten die direkte Verwendung von Fettsäuren und handelsüblichen Cholesterinderivaten,
– die Reaktionsbedingungen der Kupplung gestatten insbesondere die Einführung von empfindlichen Carbonsäuren und Alkoholen, wie z.B. komplexen einfach und mehrfach ungesättigten Fettsäuren und Cholesterinderivaten an dem Peptid,
– die im Lauf der Kupplung gebildete Bindung ist in einem breiten pH-Bereich sehr stabil.

Die Erfinder haben sich auch die Aufgabe gestellt, modifizierte Peptide bereitzustellen, die durch chemische Ligation erhalten werden können, wobei die Peptide mit verschiedenen Verbindungen, insbesondere Lipiden, durch eine sehr stabile Bindung verbunden sind, und die nicht die Nachteile der Disulfidbindungen des Standes der Technik aufweisen.
Diese Aufgaben werden gelöst durch die Schaffung einer Hydrazidbindung zwischen dem Peptid und der Verbindung, die mit ihm gekuppelt wird, bei einer konvergenten Synthese in Lösung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Kupplung zwischen einem Peptid und mindestens einer Verbindung A, mit nicht-peptidartiger Beschaffenheit, die eine Funktion, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Carbonsäurefunktionen und den Alkoholfunktionen, aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Kupplung einen Schritt der Bildung einer Hydrazidbindung bzw. eines Hydrazidbindegliedes zwischen dem Peptid und der Verbindung A in Lösung umfasst.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter "Peptid" jede Verkettung von mehreren Aminosäuren ungeachtet ihrer Beschaffenheit und ihrer Anzahl; der Begriff "Peptid" bezeichnet folglich sowohl Oligopeptide (Dipeptide oder Tripeptide) als auch Polypeptide oder Proteine.
Auf besonders vorteilhafte Weise gestattet das erfindungsgemäße Verfahren, das in Lösung durchgeführt wird, einen Schritt der Spaltung des erhaltenen modifizierten Peptids von dem Träger zu vermeiden, wobei wir vorstehend gesehen haben, dass eine solche Spaltung auf erhebliche Weise die Wahl der mit dem Peptid gekuppelten Verbindung beschränkt. Außerdem ist die zwischen dem Peptid und der (oder den) Verbindungen) A gebildete Hydrazidbindung sehr stabil und zwar in einem sehr breiten pH-Bereich und in vivo.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Kupplung umfasst letzteres zum Bilden der Hydrazidbindung bzw. des Hydrazidbindegliedes die folgenden Schritte:

a) Aktivierung der Funktion, welche die Verbindung A aufweist, zu einer entsprechenden reaktiven Funktion, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Esterfunktionen und den Carbonatfunktionen, wenn die Verbindung A eine Carbonsäurefunktion bzw. eine Alkoholfunktion aufweist; und
b) Reaktion in Lösung und bei einem pH unter 6 zwischen der bei a} erhaltenen aktivierten Verbindung A und einem Peptid, von dem alle Schutzgruppen entfernt sind und das mindestens eine Hydrazingruppe oder ein Hydrazinderivat entweder an seinem N-terminalen Ende oder am Ende der Seitenkette eines Lysins oder eines Ornithins aufweist, das gegebenenfalls an einem beliebigen Ort der Peptidsequenz vorhanden ist.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter "Hydrazingruppe" eine Gruppe der Formel -NH-NH₂. Unter "Hydrazinderivatgruppe" versteht man jede Gruppe, die mindestens die Einheit -NR-NH₂ umfasst (darunter vorteilhafterweise die Einheit -CO-CHR₁-NR-NH₂), wobei R₁ und R unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine gesättigte oder ungesättigte, lineare, verzweigte oder cyclische Alkylgruppe umfassen, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome sowie gegebenenfalls 1 bis 3 Heteroatome, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, umfasst und mit 1 bis 6 Gruppen, ausgewählt aus den Hydroxy-, Alkoxy-, Aryloxy-, Amino-, Aminoalkyl-, Aminoaryl-, Thio-, Thioalkyl-, Carbonyl-, Carboxyl-, Guanidino- und Carboxamidogruppen, substituiert sein kann.
Die im Laufe des erfindungsgemäßen Kupplungsverfahrens gebildete Hydrazidbindung umfasst folglich mindestens die Einheit -CO-NH-NR-, wobei R wie vorstehend definiert ist.
Eine Hydrazingruppe kann entweder an dem N-terminalen Ende des Peptids oder am Ende der Seitenkette eines Lysins oder eines Ornithins, das gegebenenfalls an einem beliebigen Ort der Peptidsequenz vorhanden ist, durch jedes dem Fachmann bekannte Mittel eingeführt werden, z.B. gemäß der Vorschrift zur N-Aminierung, wie sie von C. KLINGUER et al. in Tetrahedron Letters, 1996, 37, 40, 7259-7262 beschrieben ist.
Auf besonders vorteilhafte Weise gestattet es die Kupplungsreaktion zwischen der aktivierten Verbindung A und dem Peptid, von dem alle Schutzgruppen entfernt sind und das wie vorstehend beschrieben funktionalisiert ist, jeglichen Schritt der Entfernung der Schutzgruppen von Seitenketten des Peptides mit einer starken Säure nach der Kupplungsreaktion zu vermeiden, was es gestattet, als Verbindung A empfindliche Fettsäuren zu verwenden. Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet es somit, direkt das modifizierte Peptid, d.h. das mit der Verbindung A gekuppelte Peptid zu erhalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet es, eine chemoselektive Reaktion zwischen der funktionellen Gruppe (Hydrazingruppe oder Hydrazinderivatgruppe), die an dem Peptid eingeführt ist, und der (oder den) aktivierten Verbindungen) A durchzuführen; in der Tat erfolgt die Reaktion bei einem pH unter 6, einem solchen pH, dass die Aminfunktionen der Seitenketten der Lysine (ε-NH₂-Funktion) oder der Ornithine (δ-NH₂-Funktion) oder die N-terminate α-NH₂-Funktion, die gegebenenfalls in der Peptidsequenz vorhanden sind, protoniert und folglich wenig reaktiv sind. Die Kontrolle des pH gestattet es somit, vorzugsweise die Hydrazingruppe oder Hydrazinderivatgruppe zu acylieren, die an dem Peptid eingeführt ist, ohne dass die anderen funktionellen Gruppen der Seitenketten der Aminosäuren, aus denen das Peptid gebildet ist, reagieren.
Die im Laufe des erfindungsgemäßen Verfahrens (Schritt b) durchgeführte Kupplungsreaktion erfolgt unter sehr milden Betriebsbedingungen und erfordert auf besonders vor teilhafte Weise nicht, unter inerten Bedingungen zu arbeiten, wie es bei bestimmten Verfahren des Standes der Technik der Fall ist, insbesondere bei solchen, die darin bestehen, ein Peptid mit einer Fettsäure durch eine Disulfidbindung zu kuppeln.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kupplungsverfahrens umfasst das Verfahren außerdem einen Schritt c) der Reinigung des in Schritt b) erhaltenen modifizierten Peptids.
Eine solche Reinigung wird auf klassische Weise durch Hochleistungsflüssigchromatografie durchgeführt. Im Vergleich zu der Reinigung eines modifizierten Peptids, das durch ein in fester Phase durchgeführtes Kupplungsverfahren, wie es vorstehend beschrieben wurde, erhalten wird, führt die Reinigung des durch das erfindungsgemäße Kupplungsverfahren erhaltenen modifizierten Peptids zu sehr viel besseren Ausbeuten, wobei das in Schritt b) erhaltene modifizierte Peptid reiner ist als ein in fester Phase erhaltenes modifiziertes Peptid.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kupplungsverfahrens wird nach dem Schritt a) der Aktivierung der Funktion, welche die Verbindung A aufweist, die entsprechende reaktive Funktion, welche die Verbindung A aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Estern und den Carbonaten von Succinimidyl, von Sulfosuccinimidyl und von Aryl.
Als Beispiel für Ester und für Carbonate von Aryl kann man die Ester und die Carbonate von para-Nitrophenyl nennen.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kupplungsverfahrens ist die Hydrazinderivatgruppe, die das Peptid aufweist, eine α-hydrazinoessigsaure Gruppe (Gruppe der Formel -CO-CH₂-NH-NH₂).
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung dieser Ausführungsform wird vor dem Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens das Peptid durch eine α-hydrazinoessigsaure Gruppe entweder an seinem N-terminalen Ende oder am Ende der Seitenkette eines Lysins oder eines Ornithins, das gegebenenfalls an einem beliebigen Ort der Peptidse quenz vorhanden ist, mit Hilfe von N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure oder N,N'-Di(Boc)hydrazinoessigsäure funktionalisiert.
Gemäß einer bevorzugten Modalität dieser Ausgestaltung folgt auf die Funktionalisierung des Peptides durch eine α-hydrazinoessigsaure Gruppe mittels N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure oder N,N'-Di(Boc)hydrazinoessigsäure ein Schritt der Reinigung des funktionalisierten Peptids durch Hochleistungsflüssigchromatografie mit Hilfe eines Elutionsmittels, das aus einem Wasser/Alkohol-Gemisch, vorzugsweise einem Wasser/isopropanol-Gemisch, das Trifluoressigsäure umfasst, besteht. Ein solches Elutionsmittel gestattet vorteilhafterweise, jeglichen Abbau der von dem Peptid getragenen a-hydrazinoessigsauren Gruppe zu vermeiden.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kupplungsverfahrens wird die Verbindung A ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Lipiden, den Zuckern, den Alkoholen und den Fluoreszenzmarkern.
Als Beispiel für einen brauchbaren Fluoreszenzmarker kann man auf nichtbeschränkende Weise Fluorescein oder Rhodamin nennen.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung dieser Ausführungsform werden die Lipide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den gesättigten Fettsäuren, den ungesättigten Fettsäuren und den Sterolen. In der Tat gestattet es das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafterweise, komplexe (einfach und mehrfach ungesättigte) Fettsäuren und allgemein jede empfindliche Carbonsäure mit einem Peptid zu kuppeln. Vorzugsweise werden die vorstehend erwähnten Lipide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Palmitinsäure, Stearinsäure, cis-9,10-Epoxystearinsäure, Ölsäure, Linolsäure und Cholesterin.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein modifiziertes Peptid, das im Wesentlichen aus einem Peptid besteht, das durch eine Hydrazidbindung bzw. ein Hydrazidbindeglied an wenigstens eine Verbindung A gebunden ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Lipiden, den Zuckern, den Alkoholen und den Fluoreszenzmarkern.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung dieser Ausführungsform ist das erfindungsgemäße modifizierte Peptid ein Oligopeptid, das im Wesentlichen besteht aus einem Peptid, das durch eine Hydrazidbindung bzw. ein Hydrazidbindeglied an mindestens ein Lipid gebunden ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den gesättigten Fettsäuren, den ungesättigten Fettsäuren und den Sterolen.
Vorzugsweise besteht das erfindungsgemäße Oligopeptid im Wesentlichen aus einem Peptid, das durch eine Hydrazidbindung bzw. ein Hydrazidbindeglied an mindestens ein Lipid gebunden ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Palmitinsäure, Stearinsäure, cis-9,10-Epoxystearinsäure, Ölsäure, Linolsäure und Cholesterin.
Die Stabilität der Hydrazidbindung macht die erfindungsgemäßen modifizierten Peptide besonders interessant, da die Hydrazidbindung sowohl in vivo als auch in einem sehr breiten pH-Bereich stabil ist. Außerdem ist die Hydrazidbindung unter den Bedingungen einer katalytischen Hydrierung stabil, was z.B. im Fall von Peptiden, die durch ungesättigten Fettsäuren modifiziert sind, die Synthese von Lipopeptiden gestattet, die in der Fettsäurekette mit Tritium markiert sind, welche für einen intrazellulären radioaktiven Nachweis der besagten Lipopeptide und ein besseres Verständnis ihres Wirkungsmechanismus brauchbar sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein synthetischer Impfstoff und ein Diagnosereagenz, welche mindestens ein erfindungsgemäßes modifiziertes Peptid, wie es vorstehend beschrieben ist, umfassen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Kupplungsverfahrens, wie es vorstehend beschrieben ist, zum Herstellen eines Arzneimittels, das einen Wirkstoff mit vektorisierter peptidartiger Beschaffenheit umfasst, das für die gezielte Ansteuerung von Zellen brauchbar ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem die Verwendung von N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure oder von N,N'-Di(Boc)hydrazinoessigsäure zum Funktionalisieren eines Peptids, das dazu bestimmt ist, gemäß dem vorstehenden Kupplungsverfahren gekuppelt zu werden, im Fall, dass die Hydrazingruppe, die das Peptid aufweist, eine α-hydrazinoessigsaure Gruppe ist, und zwar vor dem Schritt b), durch eine a-hydrazinoessigsaure Gruppe, entweder am N-terminalen Ende des Peptids oder am Ende der Seitenkette eines Lysins oder eines Ornithins, das gegebenenfalls an einem beliebigen Ort der Peptidsequenz vorhanden ist.
Es versteht sich jedoch, dass eine α-hydrazinoessigsaure Gruppe entweder am N-terminalen Ende des Peptids oder am Ende der Seitenkette eines Lysins oder eines Omithins, das gegebenenfalls an einem beliebigen Ort der Peptidsequenz vorhanden ist, durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren in das Peptid eingeführt werden kann; z.B, kann die Funktionalisierung eines Peptides durch eine α-hydrazinoessigsaure Gruppe durch eine N-Aminierungsreaktion in fester Phase, wie sie von C. KLINGUER et al. in Tetrahedron Letters, 1996, 37, 40, 7259-7262 beschrieben ist, mittels des handelsüblichen Reagenzes N-Boc-3-(4-cyanophenyl)oxazirdin (BCPO) erfolgen. Dies ist z.B. der Fall bei einer N-Aminierungsreaktion, die an einem Glycinrest durchgeführt wird, der sich in der N-terminalen Position eines Peptides befindet, oder an der Seitenkette eines Lysins oder eines Ornithins durchgeführt wird, das an einem beliebigen Ort der Peptidsequenz vorhanden ist.
In Anbetracht der hohen Kosten von BCPO und der erheblichen Zeit, die für eine solche Reaktion erforderlich ist, ist dieser Syntheseweg jedoch nur für die Funktionalisierung von Produkten mit sehr hohem Mehrwert geeignet, die in geringer Menge synthetisiert werden. Auf besonders vorteilhafte Weise ist die Verwendung von N,N'-Tri(Boc)-hydrazinoessigsäure oder von N,N'-Di(Boc)hydrazinoessigsäure gemäß der vorliegenden Erfindung einfacher und viel billiger, um ein Peptid mit einer α-hydrazinoessigsauren Gruppe zu funktionalisieren. Diese Funktionalisierung erfolgt in fester Phase, wobei das funktionalisierte Peptid anschließend von dem festen Träger abgetrennt und gemäß Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, von Schutzgruppen befreit wird; anschließend kann ein Reinigungsschritt durch Hochleistungsflüssigchromatografie durchgeführt werden, wobei Wasser/Alkohol als Elutionsmittel wie vorstehend beschrieben verwendet wird, was vorteilhafterweise gestattet, jeglichen Abbau der a-hydrazinoessigsauren Gruppe zu vermeiden, welche das Peptid aufweist.
Neben den vorangegangenen Ausgestaltungen umfasst die Erfindung noch weitere Ausgestaltungen, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen, welche sich auf Ausführungsbeispiele des Verfahrens, welches Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, und auf Synthesen von erfindungsgemäß modifizierten Peptiden sowie auf die beigefügten Abbildungen bezieht, in welchen:
die 1 die Synthese von N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure 4 und N,N'-Di(Boc)hydrazinoessigsäure 4' veranschaulicht;
die 2 die Synthese eines Hydrazinopeptids 6 ausgehend von Peptid 5 und N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure veranschaulicht;
die 3 die Synthese der Lipopeptide 11, 12, 13, 14, 16 und 18 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgehend von Hydrazinopeptid 6 und den Lipiden 7, 8, 9, 10, 15 und 17 veranschaulicht, wobei Su eine Succinimidylgruppe bedeutet;
die 4 die Synthese des Lipopeptids 13 durch katalytische Hydrierung des Lipopeptids 12 veranschaulicht;
die 5 die Synthese des Lipopeptids 21 nach dem erfindungsgemäßen Verfahrens veranschaulicht;
die 6 die Synthese des Lipopeptids 23 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren veranschaulicht.
Es versteht sich jedoch, dass diese Beispiele einzig und allein zur Veranschaulichung des Gegenstands der Erfindung angegeben werden und auf keine Weise eine Beschränkung desselben darstellen.
In den folgenden Beispielen werden die folgenden Abkürzungen verwendet: eq.: Äquivalente; Boc: tert-Butyloxycarbonyl; Boc₂O: Ether von Di(tert-butyloxycarbonyl); CH₂Cl₂: Dichlormethan; AcOH: Essigsäure; AcOEt: Ethylacetat; Na₂SO₄: Natriumsulfat; KH₂PO₄: Kaliumdihydrogenphosphat; Na₂HPO₄: Dinatriumphosphat; DMF: Dimethylformamid; DMAP: 4-Dimethyl-aminopyridin; PEG: Polyethylenglycol; PS: Polystyrol; CDCl₃: deuteriertes Chloroform; CD₃CO₂H: d₃-Essigsäure; TFA: Trifluoressigsäure; Et₂O: Diethylether; EDT: Ethandithiol; NMP: N-Methylpyrrolidon; THF: Tetrahydrofuran; HBTU: N-Oxid von N-[(1-N-Benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylen]-N-methylmethanamini um-Hexafluorphosphat; HOBt: N-Hydroxybenzotriazol; ^tBu; tert-Butyl; DIEA: Diisopropylethylamin; Pmc:.2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl; Trt: Trityl; Fmoc: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl; Pbf: 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydro-benzofuran-5-sulfonyl; BOP: Benzotriazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorphosphat; HPLC: Hochleistungsflüssigchromatografie; RP-HPLC: Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatografie; ES-MS: Elektrospray-Massenspektrometrie; TOF: Flugzeit (time-of-flight); MALDI: matrixassistierte Laserdesorption/Ionisation; NMR: magnetische Kernresonanz; TOCSY: Korrelation aller Protonen eines Spinsystems (total correlation spectroscopy); PDMS: Plasmadesorptions-Massenspektrometrie; PAL: Peptid-Amid-Linker.
Beispiel 1
Synthese von N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure 4 und N,N'-Di(Boc)hydrazinoessigsäure 4' (1)
1) Synthese von N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure 4
Synthese von N-Boc-hydrazinoessigsäureethylester 2
14,9 g (96,4 mmol) handelsübliches Hydrazinoessigsäureethylester-hydrochlorid 1 und 26,1 g (119,5 mmol) Boc₂O werden in 70 ml eines Wasser/Ethanol (1/1)-Gemisches gelöst. Nach dem Auflösen der Reagenzien wird das Reaktionsmedium auf 0°C abgekühlt. 13,2 ml N-Methylmorpholin (119,5 mmol) werden anschließend dem Reaktionsmedium zugegeben. Nach 15 Minuten Rühren bei 0°C, anschließend 2 h bei Umgebungstemperatur wird das Gemisch in 100 ml Wasser verdünnt. Die wässrige Phase wird mit KHP₂O₄ gesättigt, dann mit Diethylether (3 × 70 ml) und Petrolether (2 × 70 ml) extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt und anschließend über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und schließlich unter vermindertem Druck konzentriert. Das erhaltene gelbe Öl (19,8 g, 91,1 mmol, Ausbeute: 94,5%) wird über Phosphorpentoxid (P₂O₅) über Nacht getrocknet. Das so erhaltene Produkt 2, das nachstehend wiedergegeben ist, wird ohne weitere Reinigung im Lauf der Synthese verwendet.
Die Analyse des Produkts 2 ist wie folgt: ¹H-NMR (CDCl₃, TMS-Standard, 300 MHz, 323 K) δ: 4,19 (q, 2H, H₁₀, J_10-11 = 7,18 Hz), 4,11 (s, 2H, H₈), 1,45 (m, 9H, H₁ _,2,3), 1,26 (t, 3H, H₁₁, J_11-10 = 7,16 Hz). ¹³C-NMR (CDCl₃, TMS, 75 MHz, 323 K) δ: 175,51 und 174,38 (C₅), 161,76 und 160,83 (Cg), 85,89 und 85,23 (C₄), 65,57 und 65,46 (C₁₀), 57,41 (C₈), 32,87, 32,78 und 32,63 (C₁, C₂, C₃), 18,70 (C₁₁). Elementaranalyse berechnet für C₉H₁ ₈N₂O₄: C 49,53; H 8,31; N 12,84; O 29,32; gefunden: C 49,78; N 8,36; N 12,33; O 29,27.
Synthese von N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäureethylester 3
Die Verbindung 2 (19,86 g, 91,1 mmol) wird in 16 ml CH₂Cl₂ unter Inertatmosphäre und in Gegenwart von 38,5 ml Et₃N (276 mmol) bei 0°C gelöst. Außerdem werden 60,2 g (276 mmol) Boc₂O in 20 ml CH₂Cl₂ in Gegenwart von 3,4 g (27,6 mmol) DMAP bei 0°C gelöst. Nach der vollständigen Auflösung der Reagenzien wird das Gemisch aus Verbindung 2/Et₃N zu dem Boc₂O/DMAP-Gemisch unter Inertatmosphäre und bei 0°C tropfenweise zugegeben. Nach der Beendigung der Zugabe wird die Temperatur des Reaktionsmediums nach und nach auf Umgebungstemperatur gebracht. Nach 2 h Rühren wird das Medium mit 50 ml CH₂Cl₂ verdünnt. Die organische Phase wird mit einer gesättigten KHP₂O₄-Lösung (3 × 75 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und anschließend unter vermindertem Druck konzentriert. Das zurückbleibende gelborange Öl wird durch Filtration über Siliciumdioxid (40–60 μm, 160 g) mit einem CH₂Cl₂/AcOEt (97:3)-Gemisch gereinigt. Das zurückbleibende gelbe Öl wird eine Nacht in Gegenwart von P₂O₅ getrocknet. So werden 36,9 g (88,3 mmol; Ausbeute: 96,9%) von Produkt 3 erhalten.
Die Analyse des Produkts 3 mittels NMR ist wie folgt: ¹H-NMR (CDCl₃, TMS-Standard, 300 K) δ: 4,16 (s, 2H), 3,71 (q, 2H, J = 7 Hz), 1,46 (m, 27H), 1,23 (t, 3N, J = 7 Hz). ¹³C-NMR (CDCl₃, TMS-Standard, 300 K) δ: 167,74 (C=O), 150,48 und 150,23 (C=O), 83,68 82,46 und 82,00 (quaternäres C), 60,98 und 58,40 (OCH₂CH₃), 53,51 und 51,57 (CH₂CO), 28,09 ((CH₃)₃C), 18,42 und 14,20 (CH₂CH₃).
Elementaranalyse von Produkt 3 (Summenformel: C₁ ₉H₃₄N₂O₈): C 54,53, N 8,19, N 6,69 (berechnet), C 54,81, N 8,25, N 6,71 (gefunden).
Analyse von Produkt 3 durch Massenspektrometrie: MALDI-TOF [M+H]⁺ berechnet: 419,5, gefunden: 441,4 [M+Na]⁺, 457,4 [M+K]⁺.
Synthese von N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure 4
Die Verbindung 3 (15,05 g, 36,01 mmol) wird in 40 ml absolutem Ethanol gelöst. Das Medium wird auf 0°C abgekühlt und 39,6 ml (39,6 mmol) einer molaren Natriumhydroxidlösung mit 0°C werden tropfenweise zugegeben. Nach 25 Minuten Rühren bei 0°C wird das Reaktionsmedium durch tropfenweise Zugabe von 20 ml einer Citronensäurelösung (634 mg/ml) bis zu einem pH 4,0 neutralisiert. Das Gemisch wird anschließend mit 50 ml Wasser verdünnt und mit Diethylether (2 × 80 ml) und anschließend Dichlormethan (2 × 80 ml) extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit einer gesättigten NaCl-Lösung (2 × 40 ml) gewaschen, anschließend über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und schließlich unter vermindertem Druck konzentriert. Das zurückbleibende Öl wird in einem Gemisch aus Diethylether (55 ml)/Heptan (74 ml) in der Kälte ausgefällt. Das erhaltene Produkt 4, das nachstehend wiedergegeben wird, ist ein weißer Feststoff (9,63 g, Ausbeute: 68,5%).
Die Analyse des Produkts 4 ist wie folgt: ¹H-NMR (DMSO-d₆, TMS-Standard, 300 MHz, 300 K) δ: 4,04 (s, 2H, H₆), 1,42 (m, 27N, H_{1-3,10-12,15-17}). ¹³C-NMR (DMSO-d₆, TMS-Standard, 75 MHz, 300 K) δ: 169,3 (C₇), 153,5 und 149,8 (C_5,13,8), 82,9 und 81,7 und 81,1 (C_4,9,13), 53,1 und 51,2 (C₆), 27,8 (C_{1-3,10-12,15-17}). Elementaranalyse berechnet für C₁₇H₃ ₀N₂O₈: C 52,30; H 7,74; N 7,17; O 32,78; gefunden: C 52,26; H 7,77; N 7,22; O 32,63.
2) Synthese von N,N,'-Di(Boc)hydrazinoessigsäure 4'
Die Verbindung 3 (36,9 g, 88,3 mmol), die in 135 ml Ethanol gelöst ist, wird mit 135 ml molarem Natriumhydroxid bei 0°C behandelt. Nach 30 Minuten Rühren bei 0°C wird die Temperatur des Reaktionsmediums nach und nach auf Umgebungstemperatur gebracht. Das Gemisch wird anschließend 3h30 bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Reaktionsmedium wird anschließend mit 110 ml Wasser verdünnt und mit Diethylether (2 × 80 ml) extrahiert. Die wässrige Phase wird durch Zugabe von 1 N Chlorwasserstoffsäure bis zu einem pH 2 angesäuert. Die Reaktion ist exotherm. Die wässrige Phase wird anschließend mit Dichlormethan (2 × 80 ml) und danach Diethylether (2 × 80 ml) extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit einer gesättigten KH₂PO₄Lösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und schließlich unter vermindertem Druck konzentriert. Das zurückbleibende Gemisch wird eine Nacht lang bei 4°C aufbewahrt und anschließend in einem Gemisch aus Diethylether/Heptan (90 ml/120 ml) in der Kälte umkristallisiert. Das erhaltene Produkt 4', das nachstehend wiedergegeben wird, ist ein weißer Feststoff (17,9 g, 61,6 mmol, Ausbeute: 69,8%).
Die Analyse des Produkts 4' ist wie folgt: ¹H-NMR (DMSO-d₆, TMS-Standard, 300 MHz, 300 K) δ: 9,23 (s, 0,53N, H₆), 9,16 (s, 0,26H, H₆), 8,84 (s, 0,14H, H₆), 8,74 (s, 0,07H, H₆), 3,97 (s, 2H, H₇), 1,39 (m, 18H, H_1-3,11-13). ¹³C-NMR (DMSO-d₆, TMS-Standard, 75 MHz, 300 K) δ: 170,10 (C₈), 155,04 und 154,19 (C₅,₉), 80,15 und 79,54 (C_4,10), 54,6 und 53,1 (C₇), 27,93 (C₁ _-3, C₁₁ _-13). Elementaranalyse berechnet für C₁₂H₂₂N₂O₆: C 49,65; H 7,64; N 9,65; O 33,07; gefunden: C 50,09; H 7,84; N 9,57; O 32,64.
Beispiel 2
Synthese und Reinigung des Hydrazinopeptids 6 (2)
Synthese des Hydrazinopeptids 6
Das Peptid 5 wird an einem Wang-Harz (0,73 mmol/g, Applied Biosystems, Foster City, USA) nach der Fmoc/tert-Butyl-Methode, wie sie z.B. von Fields et al. in Int. J. Pept. Protein, 1990, 35, 161 beschrieben ist, und einer HBTU/HOBt-Aktivierung (siehe SCHNÖLZER et al in Int. J. Pept. Protein Res., 1992, 40, 180) mit Hilfe eines Peptidsynthesegerätes Applied Biosystem 431A (Foster City, USA) hergestellt. Die Schutzgruppen der Seitenketten sind: His(Trt), Glu(O^tBu), Arg(Pmc), Lys(Boc). Am Ende der Synthese wird die Fmoc-Gruppe der α-NH₂-Funktion von Arginin in Gegenwart von 20% Piperidin in DMF entfernt. Anschließend wird N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure 4 (1,2 äq) manuell eingeführt, wobei eine BOP-Aktivierung in situ eingesetzt wird (BOP 1,2 äq, DIEA 3,6 äq in DMF während 20 min), wie es z.B. von GAIRI et al. in Tetrahedron Letters, 1990, 50, 7363 beschrieben ist. Man könnte auch als Variante N,N'-Di-(Boc)-hydrazinoessigsäure verwenden. Das Peptidyl-Harz wird nacheinander mit DMF, Dichlormethan und dann mit Ether gewaschen. Es wird anschließend unter vermindertem Druck 30 min getrocknet.
Die Spaltung der Peptid-Harz-Bindung sowie die Entfernung der Schutzgruppen von den Seitenketten erfolgt in Gegenwart eines Gemisches aus TFA/H₂O/Anisol (1 g getrocknetes Harz/9,5 ml TFA/0,25 ml Anisol/0,25 ml H₂O) unter Rühren während 2 h bei Umgebungstemperatur. Das Peptid 6 wird in einem Gemisch aus Et₂O/Heptan (1/1), das zuvor auf 0°C abgekühlt wurde, (200 ml) gefällt. Der Niederschlag wird zentrifugiert und danach in einem Gemisch aus H₂O/AcOH (5/1) gelöst, eingefroren und lyophilisiert.
Reinigung des Hydrazinopeptids 6
Das Hydrazinopeptid 6 wurde durch HPLC an einer C18-Hyperprep-Säule gereinigt, wobei ein linearer Gradient von 0% bis 50% eines Gemisches aus TFA/Wasser/Isopropanol (Verhältnis Wasser/Isopropanol: 2/3, wobei das Gemisch 0,05% TFA umfasst) in einem Gemisch aus 0,05% TFA/Wasser verwendet wurde. Ein solches Elutionsmittel gestattet es vorteilhafterweise, jeglichen Abbau des Peptids zu vermeiden. Die gereinigte Verbindung wird lyophilisiert und bei –20°C aufbewahrt.
Die Reinheit der gereinigten Verbindung wird durch analytische HPLC an einer C18-Vydac-Säule kontrolliert, wobei das gleiche Elutionsmittelsystem wie vorstehend verwendet wurde. Die Identität des Peptids 6 wurde durch ES-MS-Analyse an einem Micromass Quatro-Spektrometer bestätigt ([M+H]⁺ berechnet 1432,5, gefunden 1432,7).
Beispiel 3
Synthese der Lipopeptide 11, 12, 13, 14, 16 und 18 (3)
1) Synthese der Verbindungen 8, 9, 10, 15 und 17
Synthese der Verbindungen 8, 9, 15 und 17
Falls R (3) die Fettsäurekette einer Ölsäure bedeutet, werden 10 mg (35,4 μmol) Ölsäure, 4,08 mg (35,4 μmol) N-Hydroxysuccinimid und 4,3 μl (27,2 μmol) Diisopropylcarbodiimid in einem Gemisch aus THF/ Dichlormethan (175 μl/175 μl) gelöst. Nach einer Nacht bei 0°C wird das Medium unter vermindertem Druck konzentriert. Das zurückbleibende Öl (Verbindung 8) wird in 6,8 ml 2-Methyl-propan-2-ol aufgenommen.
Man geht auf die gleiche Weise vor, um Stearinsäure, Linolsäure und cis-9,10-Epoxystearinsäure zu aktivieren, d.h., um diese Säuren in Form von Succinimidylestern zu erhalten (Erhalt der Verbindungen 9, 17 und 15).
Synthese der Verbindung 10
500 mg (1,13 mmol) Cholesteryl-chlorameisensäureester und 140,9 mg (1,22 mmol) N-Hydroxysuccinimid werden bei Umgebungstemperatur in 2 ml Dichlormethan gelöst. 170 μl (1,22 mmol) Triethylamin werden dem Reaktionsmedium zugegeben. Die Reaktion ist exotherm und es bildet sich ein weißlicher Niederschlag. Nach 45 min Rühren bei Umgebungstemperatur wird das Medium mit 50 ml Dichlormethan verdünnt und mit einer gesättigten KH₂PO₄-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und anschließend unter vermindertem Druck konzentriert. Die erhaltene Verbindung 10 ist ein weißer Feststoff (451,6 mg, 0,85 mmol, Ausbeute: 76%). Es handelt sich um ein mit N-Hydroxysuccinimid aktiviertes Cholesterylcarbonat.
2) Synthese des Lipopeptids 11
6 mg (3 μmol) des Hydrazinopeptids 6, dessen Synthese in Beispiel 2 beschrieben wurde, werden in 900 μl eines 0,25 mM Phosphat/Citrat-Puffers, pH = 5,2 (160,2 μl einer Lösung von 0,2 M Na₂HPO₄ und 139,8 μl 0,1 M Citronensäure, mit Wasser auf 1,2 ml aufgefüllt) gelöst. Der pH des Hydrazinopeptids 6 in Lösung wird mit der Lösung von 0,2 M NaHP₂O₄ wieder eingestellt, falls dies erforderlich ist. 1,48 mg (3,6 μmol) Succinimidylpalmitat 7 (Sigma) werden in 900 μl 2-Methyl-propan-2-ol gelöst. Die zwei Lösungen werden anschließend vermischt und 72 h bei Raumtemperatur gerührt.
Die Verwendung eines gemischten Mediums aus Puffer/2-Methyl-propan-2-ol gestattet gleichzeitig, den pH des Reaktionsmediums zu regeln und die gute Löslichkeit des Hydrazinopeptids 6, der Fettsäure 7 und des am Ende erhaltenen Lipopeptids 11 zu gewährleisten. Außerdem erfolgt die Einführung des lipophilen Teils an dem Peptid unter milden Bedingungen, welche somit die Einführung von Fettsäuren ermöglichen, die gegen starke Säuren empfindlich sind.
Das Fortschreiten der Reaktion wird durch HPLC an einer C3-Zorbax-Säule verfolgt (0 bis 100% von Lösungsmittel B mit 0,05% TFA/80% Acetonitril/20% Wasser in 30 min, danach 5 min mit 100% Lösungsmittel B, 1 ml/min, Detektion bei 215 nm). Nach 72 h zeigt die Verfolgung mittels HPLC, dass die Reaktion beendet ist. Das Reaktionsmedium wird daraufhin mit 5 ml eines Gemisches aus Wasser/Essigsäure (80/20) verdünnt und an einer C3-Zorbax-Säule gereinigt, wobei das vorstehende Elutionsmittelsystem verwendet wird. Nach dem Einfrieren und der Lyophilisierung wird das Lipopeptid 11 mit einer Ausbeute von 61% (3,89 mg, 1,83 μmol) erhalten. Man erhält nur 6% des diacylierten Lipopeptids (Kupplung der Palmitylgruppe nicht nur an der Hydrazingruppe von Peptid 6, sondern auch an der Aminfunktion, die sich in der Seitenkette des Lysinrests des Peptids befindet).
Das gereinigte Lipopetid 11 wird mittels ES-MS (Micromass Quatro II Electrospray Mass Spectrometer) analysiert. [M+H]⁺ berechnet: 1672,1, gefunden: 1671,6.
3) Synthese der Lipopeptide 12, 13, 14, 16 und 18
Man geht auf ähnliche Weise vor, wie sie unter 2) für die Synthese von Lipopeptid 11 beschrieben wurde, wobei man das Hydrazinopeptid 6 mit den Verbindungen 8, 9, 10, 15 bzw. 17 reagieren lässt.
Nur die Reinigung des Lipopeptids 16 weicht ab. Seine Reinigung durch HPLC erfolgt bei pH 7,0 an einer C3-Zorbax-Säule, wobei das folgende Elutionsmittel verwendet wird: von 100% Lösungsmittel A (50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0) bis 100% Lösungsmittel B (50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, der 50% Isopropanol umfasst) in 100 Minuten, mit einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/Minute und bei 50°C, wobei die Detektion bei 215 nm erfolgt. Die so erhaltene Verbindung 16 wird anschließend entsalzt, wobei die folgenden Bedingungen eingesetzt werden: Polystyrol-Divinylbenzol-Säule, Gradient von 100 Lösungsmittel A (Wasser umfassend 0,05% Triethylamin) bis 100% Lösungsmittel B (Gemisch aus Wasser/Acetonitril 20/80, umfassend 0,05% Triethylamin) in 10 Minuten, mit einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/Minute und bei 50°C, wobei die Detektion bei 215 nm erfolgt.
Die Charakterisierung der Lipopeptide 12, 13, 14, 16 und 18 durch ES-MS und die für die verschiedenen Lipopeptide erhaltenen Ausbeuten sind wie folgt (Tabelle I): Tabelle I
Man erhält nur 6, 7 bzw. 8% diacylierte Lipopeptide bei den Synthesen der Lipopeptide 12, 13 und 14.
Beispiel 4: Synthese des Lipopeptids 13 durch katalytische Hydrierung des Lipopeptids 12 (4).
500 μg von 10% Palladium auf Kohlenstoff in Suspension in 600 μl einer Lösung von 20% konzentrierter Essigsäure in Wasser werden zu 5 mg (2,3 μmol) der Verbindung 12 zugegeben, die auf die im vorangehenden Beispiel beschriebene Weise erhalten wurde und in 300 μl der gleichen Lösung gelöst ist. Nach 4 h Rühren bei Umgebungstemperatur unter Wasserstoffatmosphäre werden 1,64 mg Palladium auf Kohlenstoff in Suspension in 100 μl Eisessig dem Reaktionsmedium zugegeben. Nach 20 h ist die Umwandlung vollständig und das Medium wird auf Celite filtriert und mit einer Lösung von 20 % Essigsäure in Wasser (3 × 3 ml), anschließend mit Methanol (3 × 3 ml) gewaschen. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck konzentriert, eingefroren und anschlie- . ßend lyophilisiert. Die so erhaltene Verbindung wird durch HPLC an einer C3-Zorbax-Säule gereinigt, wobei ein linearer Gradient von 0% bis 55% eines Gemisches aus Wasser/Acetonitril/TFA (1/4 an Wasser/Acetonitril, mit 0,05% TFA) in einem Gemisch aus 0,05% TFA/Wasser (Wasser, das 0,05% TFA umfasst) verwendet wird. Die gereinigte Verbindung (2,55 mg, 1,2 mmol, Ausbeute: 52%) wird lyophilisiert und bei –20°C aufbewahrt.
Die Reinheit der gereinigten Verbindung wird durch analytische HPLC an einer C3-Zorbax-Säule kontrolliert, wobei das gleiche Elutionsmittelsystem wie vorstehend verwendet wird. Die Verbindung wird durch ES-MS identifiziert: [M+H]⁺ berechnet: 1699,2, gefunden: 1699,6.
Beispiel 5
Synthese des Lipopeptids 21 (5)
1) Synthese des Hydrazinopeptids 19
Das Hydrazinopeptid 19 ist mit Hilfe eines Peptidsynthesegerätes Applied Biosystem 431A (Foster City, USA) an 0,25 mmol (357,1 mg) des Harzes Rink-Amid-Aminomethylpolystyrol, das 1% Divinylbenzol umfasst (0,70 mmol/g, 100–200 Mesh, Senn Chemicals AG) synthetisiert worden, wobei die Fmoc/tert-Butyl-Methode, wie sie z.B. von FIELDS et al. Int. J. Pept. Protein, 1990, 35, 161 beschrieben wurde, und eine HBTU/HOBt-Aktivierung (SCHNÖLZER et al., Int. J. Pept. Protein Res., 1992, 40, 180) verwendet wurde. Die Fmoc-Schutzgruppen werden mit Hilfe einer Lösung von 20% Piperidin in DMF entfernt.
Die α-NH₂-Funktion wird unter Verwendung des Verfahrens der elektrophilen N-Aminierung in fester Phase modifiziert, das von C. KLINGUER et al. (Tetrahedron Letters, 1996, 37, 40, 7259–7262) ausgearbeitet wurde. Das erhaltene Hydrazinopeptid wird entschützt und von dem Harz abgespalten, wobei 10 ml einer Lösung von TFA (94% TFA, 2,5% H₂O, 2,5% Thioanisol, 1% Triisopropylsilan) während 1 h 30 unter Rühren eingesetzt werden. Die Verbindung wird anschließend in 100 ml einer Lösung von Et₂O/Pentan 1/1 gefällt. Nach der Fällung und der Entfernung des Überstandes wird der Bodensatz in 10%-iger Essigsäure gelöst, eingefroren und lyophilisiert.
Die Identität des Hydrazinopeptids 19 wird durch PDMS-TOF an einem Plasmadesorptions-Massenspektrometer Bio-ion 20 überprüft. [M+H]+ berechnet: 895,5, beobachtet: 895,9.
Die Reinigung des Hydrazinopeptids 19 erfolgt an einer präparativen C3-Zorbax-Säule (30°C, Detektion bei 235 nm, Puffer A = H₂O 100%/TFA 0,05%, Puffer B = Isopropylalkohol 40%/H₂O 60%/TFA 0,05%, Durchflussmenge 2 ml/Minute, von 0 bis 70% B in 70 Minuten). Nach dem Einfrieren und der Lyophilisierung wird das Hydrazinopeptid 19 mit einer Ausbeute von 56 %o erhalten. Die Reinheit des Produktes nach der Lyophilisierung wird durch RP-HPLC unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend angegeben überprüft.
2) Synthese des Lipopeptids 21
5,06 mg Hydrazinopeptid 19 werden in 791 μl Citrat-Phosphat-Puffer pH 5,11 gelöst.
1,1 äq (4,12 μmol) Succinimidylpalmitat 7 (wobei Su eine Succinimidylgruppe bedeutet), gelöst in 791 μl ^tBuOH, werden anschließend zugegeben. Die Reaktion wird durch RP-HPLC an einer C3-Zorbax-Säule verfolgt. Nach 48 h wird das Reaktionsmedium an einer präparativen C3-Zorbax-Säule gereinigt (30°C, Detektion bei 215 nm, Puffer A = H₂O 100%/TFA 0,05%, Puffer B = Acetonitril 80%/H₂O 20%/TFA 0,05%, Durchfluss 3 ml/Minute, von 0 bis 70% B in 70 Minuten). Die Ausbeute an Lipopeptid 21 beträgt 60%.
Beispiel 6
Synthese des Lipopeptids 23 (6)
1) Synthese des Hydrazinopeptids 22
Das Peptid 22 wird an einem Fmoc-PAL-PEG-PS-Harz (0,16 mmol/g, Perseptive) nach der FmoGtert-Butyl-Methode und einer HBTU/HOBt-Aktivierung (siehe Beispiel 2) an einem Peptidsynthesegerät Pioneer-Perseptive hergestellt. Die Schutzgruppen der Seitenketten der Aminosäuren sind wie folgt: His(Trt), Asn(Trt), Glu(O^tBu), Arg(Pbf), Lys(Boc), Ser(^tBu). Am Ende der Synthese wird die Fmoc-Gruppe der a-NH₂-Funktion des Alanins in Gegenwart von 20% Piperidin in DMF entfernt. N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure (1,2 äq) wird anschließend manuell eingeführt, wobei die BOP-Aktivierung in situ (BOP: 1,2 äq, DIEA: 3,6 äq in DMF während 20 Minuten) eingesetzt wird. Das Peptidyl-Harz wird nacheinander mit DMF, Dichlormethan und dann mit Ether gewaschen. Es wird anschließend unter vermindertem Druck 30 Minuten lang getrocknet. Die Spaltung der Peptid-Harz-Bindung sowie die Entfernung der Schutzgruppen von den Seitenketten erfolgen in Gegenwart eines Gemisches aus TFA/Phenol/Ethandithiol/Thioanisol/H₂O (1 g trockenes Harz/10 ml TFA/0,25 ml Ethandithiol/0,25 ml H₂O/0,25 ml Thioanisol/ 0,75 g Phenol) unter Rühren während 3 h 30 bei Umgebungstemperatur. Das Peptid wird in 200 ml eines Et₂O/Heptan-Gemisches (1/1), das vorher auf 0°C abgekühlt wurde, gefällt. Der Niederschlag wird zentrifugiert und anschließend in einem H₂O/AcOH-Gemisch (5/1) gelöst, eingefroren und lyophilisiert. Man erhält 263 mg rohes Peptid ausgehend von 0,072 mmol Harz.
Das Hydrazinopeptid 22 wurde durch HPLC an einer C3-Zorbax-Säule gereinigt, wobei ein linearer Gradient von 0% bis 50% eines Gemisches aus 0,05 % TFA/Wasser/Isopropanol (2/3) in einem Gemisch aus 0,05 % TFA/Wasser in 70 Minuten eingesetzt wurde. Die gereinigte Verbindung (43 mg) wird lyophilisiert und bei -20°C aufbewahrt. Die Analyse des Hydrazinopeptids 22 durch ES-MS ist wie folgt: [M+H]⁺ berechnet: 4645,5, gefunden: 4645,7. Seine Aminosäureanalyse ist wie folgt: Lys(3): 2,8; Arg(6): 6,0; Glu(7): 7,3; Ala(2): 1,9.
2) Synthese des Lipopeptids 23
Das Lipopeptid 23 wird ausgehend von Verbindung 7 und dem Hydrazinopeptid 22 gemäß der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise für die Synthese von Lipopeptid 11 erhalten. Es wird mit einer Ausbeute von 40% nach der Reinigung erhalten. Die Analyse durch ES-MS (Micromass Quatro II Electrospray Mass Spectrometer) des Lipopeptids 23 ergibt die folgenden Ergebnisse: [M+H]⁺ berechnet: 4883,5, gefunden: 4883,7.
Beispiel 7: Analyse und Quantifizierung der Expression von Molekülen der Klasse II des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC), auf der Oberfläche von Zellen, ausgelöst durch Inkubation dieser Zellen mit den erfindungsgemäßen modifizierten Peptiden.
1) Verwendete Peptide und Lipopeptide
Man verwendet die Peptide mit der Bezeichnung Mu-Gly, MuSc-Gly, 22 und 22Sc sowie die Lipopeptide Mu-Gly-Palm, MuSc-Gly-Palm, 23 et 23Sc . Der Begriff "Sc" bezeichnet eine "Scramble"-Version des Peptids, d.h. eine Peptidsequenz, in welcher die Aminosäuren (ihre Reihenfolge in der Sequenz) durchmischt wurden. Der Begriff "Palm" bezeichnet eine Palmitoylgruppe.
Das Peptid 22 und das Lipopeptid 23 wurden wie in Beispiel 6 angegeben hergestellt. Das Peptid 22Sc ("Scramble"-Version von Peptid 22) weist die folgende Sequenz auf: H2N-NH-CH2CO-PSRENQNAVKIQKLSWLRREQKHRVERLAFRNQSLPF-NH2
Das Peptid 22Sc wurde an einem Rink-Amid-MBHA-PS-Harz (0,25 mmol, 0,74 mmol/g, Applied Biosystems, Foster City, USA) nach der Fmoc/tert-Butyl-Methode an einem Peptidsynthesegerät Applied Biosystem 430A hergestellt. Am Ende der Synthese und nach der Entfernung der Schutzgruppen von der N-terminalen Aminogruppe wird die Hälfte des Peptidyl-Harzes (125 μmol) in Gegenwart von 63,4 mg (162 μmol) N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure, 84,6 mg (162 μmol) PyBOP und 85,2 μl (486 μmol) DIEA in DMF 30 Minuten lang behandelt. Die Abspaltung und Entfernung der Schutzgruppen von Peptid 22Sc erfolgte in Gegenwart eines Gemisches aus TFA/H₂O/Phenol/EDT/ Thioanisol (1 g getrocknetes Harz/10,0 ml TFA/0,5 ml H₂O/0,75 g Phenol/0,25 ml EDT/0,5 ml Thioanisol). Nach der Fällung in einem Ether/Heptan-Gemisch (1/1), einer Zentrifugation, dem Einfrieren und der Lyophilisierung wurde 22Sc durch RP-HPLC wie das Peptid 22 gereinigt. Nachdem es lyophilisiert war, wurde das Peptid 22Sc (117,5 mg, 15,9 %) bei –20°C aufbewahrt. Seine Aminosäureanalyse ist wie folgt: Lys(3): 2,6; Arg(6): 6,0; Glu(7): 7,4; Ala(2): 1,9. Seine Analyse durch ES-MS ist wie folgt: [M+H]⁺ berechnet 4645,4; gefunden 4645,6.
Das Peptid 23Sc ("Scramble"-Version von Peptid 23) weist die folgende Sequenz auf: Palm-NH-NN-CH₂CO-PSRENQNAVKIQKLSWLRREQKHRVERLAFRNQSLPF-NH₂. Das Peptid 23Sc wurde auf die gleiche Weise wie das Peptid 23, aber ausgehend von Peptid 22Sc anstelle von Peptid 22 hergestellt. Die Kupplung erfolgte mit Hilfe von 15,27 mg von Peptid 22Sc. Das Peptid 23Sc wurde an einer präparativen C3-Zorbax-Säule gereinigt, wobei ein linearer Gradient von 20 bis 60% eines Lösungsmittels B (Acetonitril 80%/Wasser 20%/TFA 0,05%) in einem Lösungsmittel A (Wasser/ TFA 0,05%) in 100 Minuten eingesetzt wurde. Die Temperatur beträgt 50°C, der Elutionsdurchfluss beträgt 3 ml/Minute und die Detektion erfolgt bei 215 nm. Nach dem Einfrieren und der Lyophilisierung wurden so 2,46 mg (Ausbeute 16%) des Peptids 23Sc erhalten. Die Reinheit des gereinigten Produkts wird durch RP-HPLC an einer C3-Zorbax-Säule kontrolliert, wobei ein Gradient von 0 bis 100% des Lösungsmittels B in dem Lösungsmittel A (1 ml/Minute, 215 nm, 50°C) in 60 Minuten eingesetzt wurde. Eine Kreuzkontrolle erfolgt durch Kapillarelektrophorese unter Verwendung eines 20 mM Citratpuffers, pH 3,0 bei 40°C, 30 kV über 10 Minuten. Die Analyse des Produkts 23Sc mittels ES-MS ist wie folgt: [M+H]⁺ berechnet 4883,8; gefunden 4882,5.
Die Peptide und Lipopeptide Mu-Gly, MuSc-Gly, Mu-Gly-Palm und MuSc-Gly-Palm weisen jeweils die folgenden Sequenzen auf: Mu-Gly: H2NCH2CO-AKFEVNNPQVQRQAFNELIRWHQLLPESSLRKRKRSR-NH2 MuSc-Gly: H2N-CH2CO-PSRENQNAVKIQKLSWLRREQKHRVERLAFRNQSLPF-NH2 Mu-Gly-Palm: Palm-NHCH2CO-AKFEVNNPQVQRQAFNELIRWHQLLPESSLRKRKR-SR-NH2 MuSc-Gly-Palm: Palm-NHCH2CO-PSRENQNAVKIQKLSWLRREQKHRVERLAFRNQSLPF-NH2
Diese Peptide wurden durch Peptidsynthese in fester Phase gemäß Standardvorschriften erhalten, wobei die Fmoc/tert-Butyl-Methode eingesetzt wurde. Für die Lipopeptide Mu-Gly-Palm und MuSc-Gly-Palm wurde nach der Verlängerung der Peptidsequenz und der Entfernung der Schutzgruppen von dem Glycin in N-terminaler Position mit 20% Piperidin in DMF Palmitinsäure (4 äq) gekuppelt, wobei eine Aktivierung mit HBTU/ HOBt/DIEA: 4 äq/4 äq/12 äq (Äquivalente bezogen auf Aminfunktionen) in DMF während 40 Minuten eingesetzt wurde. Die Abspaltung und Entfernung der Schutzgruppen von den Peptiden erfolgte in Gegenwart eines Gemisches aus TFA/H₂O/Phenol/EDT/ Thioanisol (1 g getrocknetes Harz/10,0 ml TFA/0,5 ml N₂O/0,75 g Phenol/0,25 ml EDT/ 0,5 ml Thioanisol). Die Peptide und Lipopeptide wurden vor der Verwendung gereinigt.
So umfassen die Peptide 22, 23, Mu-Gly und Mu-Gly-Palm die gleiche Peptidsequenz von 38 Aminosäuren. Sie unterscheiden sich darin, dass sie eine Fettsäurekette von Palmitinsäure umfassen oder nicht umfassen, sowie durch die Beschaffenheit der chemischen Bindung der Fettsäurekette an die Peptidsequenz.
2) Vorschrift der Quantifizierung der Expression der Moleküle der Klasse II des Haupthistokompatilitätskomplexes (MHC) auf der Oberfläche von Zellen.
Die Zellen COLO 205 (menschliche Zeltlinie, die von einem Colonkarzinom herrührt) stammen von der Zeltbank ATCC (American Type Culture Collection). Sie werden in RPMI 1640-Medium (Gibco BRL, Courbevoie, Frankreich) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und 5 mM Natriumpyruvat kultiviert und bei 37°C in Gegenwart von 5% CO₂ inkubiert. Die Zellen werden 24 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen (35, 50 oder 65 μM) von Peptiden oder Lipopeptiden stimuliert. Die Zellen werden anschließend 1 Stunde lang bei 4°C mit 10 μl Anti-NLA-DR-Klasse 11-Maus-Antikörpern, die an FITC gekoppelt sind, (Klon TAL, 1 B5, Cymbus Biotechnology Ltd. Hants, Großbritannien) in 10% FCS/PBS markiert und anschließend 3 mal mit FCS/PBS gewaschen.
Die Oberflächenexpression von Molekülen der Klasse II des MHC wird durch Durchflusszytometrie in einem Coulter EPICS 11-Zytometer mit 10000 Zählerereignissen pro Probe analysiert. Die beobachtete Fluoreszenzintensität ist direkt proportional zur Menge der Moleküle der Klasse II des MHC, die auf der Oberfläche der Zellen vorhanden ist. Der Mittelwert der beobachteten Fluoreszenz für die nicht-behandelten Zellen und für die behandelten Zellen (Spalte "Mittelwert" in der Tabelle II) gestattet es, ein Verhältnis zwischen dem Mittelwert der Fluoreszenz der behandelten Zellen und dem Mittelwert der Fluoreszenz der nicht-behandelten Zellen zu berechnen (Spalte "Verhältnis" in der Tabelle II).
3) Ergebnisse
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle II zusammengefasst. Tabelle II
Man bemerkt, dass die nicht durch eine Palmitinkette derivatisierten Produkte (Peptide Mu-Gly und 22) nicht zu einer Erhöhung der Expression von MHC II im Vergleich zu "Scramble"-Versionen, nämlich MuSc-Gly bzw. 22Sc führen. Dagegen induziert das Lipopeptid 23 eine dosisabhängige Expression von MHC II im Vergleich zur Scramble- Version 23Sc. Diese Expression ist folglich spezifisch für die Sequenz und das Vorhandensein der über eine Hydrazidbindung an das Peptid gebundenen lipophilen Kette. So führt die Kupplung eines Hydrazinopeptids mit einer aktivierten Fettsäure in Lösung zum Erhalt des entsprechenden Lipopeptids zu einem Produkt, welches in der Lage ist, die Zellmembran zu durchqueren und ein intrazytoplasmatisches Ziel zu erreichen.
Das Lipopeptid 23 liefert bessere Ergebnisse als das standardgemäß synthetisierte Lipopeptid (Mu-Gly-Palm). Weitere Versuche haben gezeigt, dass die Ergebnisse zwischen den Lipopeptiden 23 und Mu-Gly-Palm vergleichbar waren. Das Lipopeptid 23 weist jedoch eine deutlich bessere Reinheit auf als das Lipopeptid Mu-Gly-Palm. Außerdem zeigt die Untersuchung der mit den Lipopeptiden behandelten Zellen, dass das erfindungsgemäße Lipopeptid 23 viel weniger zytotoxisch für die Zellen ist als das Standardpeptid Mu-Gly-Palm.
Beispiel 8
Verwendung von N,N'-Di(Boc)hydrazinoessigsäure zum Funktionalisieren eines Peptides mit einer α-hydrazinoessigsauren Gruppe
Das Peptidyl-Harz der Formel Fmoc-G-R(Pmc)-K(Boc)-R(Pmc)-S(tBu)-H(Trt)-A-G-Y(tBu)-Q(Trt)-T(tBu)-1-0-Harz wurde an einem festen Träger nach der Fmoc/tert-Butyl-Methode unter Verwendung eines Wang-Harzes wie im Beispiel 2 beschrieben hergestellt. 143,9 mg (33,7 μmol) dieses Peptidyl-Harzes werden 2 Minuten lang und anschließend 20 Minuten lang mit dem Gemisch Piperidin/NMP (20/80) behandelt, um die Schutzgruppen von der terminalen Aminofunktion zu entfernen.
11,7 mg N,N'-Di(Boc)hydrazinoessigsäure (40,4 μmol, 1,2 äq) werden in 500 μl NMP in Gegenwart von 5,5 mg HOBt (40,4 μmol, 1,2 äq) und 15,3 mg HBTU (40,4 μmol, 1,2 äq) solubilisiert. Die Zugabe von 21 μl DIEA führt zum aktivierten Hydroxybenzotriazolester, der nicht isoliert und sofort dem Peptidyl-Harz zugegeben wurde. Nach 45 Minuten Kupplung ist der Kaiser-Test (Anal. Biochem. 1970, 34, 595) immer noch positiv. Man führt folglich eine zweite Kupplung unter den gleichen Bedingungen durch und erhält dieses Mal einen negativen Kaiser-Test.
Das Peptidyl-Harz wird mit 1,5 ml eines Gemisches aus TFA/Phenol/EDT/Thioanisol/ Wasser (10 ml/0,75 g/0,25 ml/0,25 ml/0,5 ml) 1 h 30 behandelt. Das Peptid wird in ei nem Ethylether/Heptan-Gemisch, das auf –20°C abgekühlt ist (2 × 20 ml) gefällt. Der Überstand wird verworfen. Das ausgefällte Peptid wird in 1 ml Essigsäure resolubilisiert. Anschließend werden 5 ml Wasser zugegeben, die Lösung wird mit Stickstoff entgast, eingefroren und lyophilisiert. Das erhaltene rohe Peptid wird durch RP-HPLC an einer C18-Nucleosil-Säule gereinigt. Elutionsmittel A: 0,05% TFA in Wasser. Elutionsmittel B: Wasser/Propan-2-ol (60/40), umfassend 0,05% TFA. Der Gradient ist wie folgt: von 0 bis 60% B in 60 Minuten, wobei das interessierende Produkt nach 23 Minuten eluiert wird. Nach der Reinigung erhält man 19,9 mg reines Peptid (Ausbeute: 29,7%), das an seinem N-terminalen Ende durch eine a-hydrazinoessigsaure Funktion funktionalisiert ist. Seine Analyse durch ES-MS ist wie folgt: [M+H]⁺ berechnet: 1545,6; gefunden: 1545,4.

Claims

Verfahren zur Kupplung zwischen einem Peptid und mindestens einer Verbindung A, mit nichtpeptidartiger Beschaffenheit, die eine Funktion, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Carbonsäurefunktionen und den Alkoholfunktionen, aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Kupplung einen Schritt der Bildung einer Hydrazidbindung baw eines Hydrazidbindegliedes zwischen dem Peptid und der Verbindung A in Lösung umfasst.
Verfahren zur Kupplung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es zum Bilden der Hydrazidbindung bzw des Hydrazidbindegliedes die folgenden Schritte umfasst: a) Aktivierung der Funktion, weiche die Verbindung A aufweist, zu einer entsprechenden reaktiven Funktion, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Esterfunktionen und den Carbonatfunktionen, wenn die Verbindung A eine Carbonsäurefunktion bzw eine Alkoholfunktion aufweist, und b) Reaktion in Lösung und bei einem pH unter 6 zwischen der bei a) erhaltenen aktivierten Verbindung A und einem Peptid, von dem alle Schutzgruppen entfernt sind und das mindestens eine Hydrazingruppe oder ein Hydrazinderivat entweder an seinem N-terminalen Ende oder am Ende der Seitenkette eines Lysins oder eines Ornithins aufweist, das gegebenenfalls an einem beliebigen Ort der Peptidsequenz vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem einen Schritt c) der Reinigung des in Schritt b) erhaltenen modifizierten Peptids umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Schritt a) der Aktivierung der Funktion, welche die Verbindung A auf weist, die entsprechende reaktive Funktion, weiche die Verbindung A aufweist, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Estern und den Carbonaten von Succinimidyl, von Sulfosuccinimidyl und von Aryl.
Verfahren naeh einem der Ansprüche 2bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die von Hydrazin abgeleitete Gruppe, welche das Peptid aufweist, eine α-hydrazinoessigsaure Gruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Schritt b) das Peptid durch eine α-hydrazinoessigsaure Gruppe entweder an seinem Nterminalen Ende oder am Ende der Seitenkette eines Lysins oder eines Ornithins, das gegebenenfalls an einem beliebigen Ort der Peptidsequenz vorhanden ist, mit Hilfe von N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure oder von N,N'-Di(Boc)hydrazinoessigsäure funktionalisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass auf die Funktionalisierung des Peptids durch eine α-hydrazinoessigsaure Gruppe ein Schritt der Reinigung des funktionalisierten peptids durch Hochleistungsflüssigchromatografie mittels eines Elutionsmittels, das aus einem Wasser/Alkohol-Gemisch, vorzugsweise einem Wasser/Isopropanol-Gemisch, das Trifluoressigsäure umfasst, besteht, folgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Lipiden, den Zuckern, den Alkoholen und den Fluoreszenzmarkern.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipide ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den gesättigten Fettsäuren, den ungesättigten Fettsäuren und den Sterolen.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipide ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Palmitinsäure, Stearinsäure, cis-9,10-Epoxystearinsäure, Ölsäure, Linolsäure und Cholesterin. K
Modifiziertes Peptid, dadurch gekennzeichnet, dass es im Wesentlichen besteht aus einem Peptid, das durch eine Hydrazidbindung bzw. ein Hydrazidbindeglied an wenigstens eine Verbindung A gebunden ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Lipiden, den Zuckern, den Alkoholen und den Fluoreszenzmarkern.
Modifiertes Peptid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Oligopeptid handelt, das im Wesentlichen besteht aus einem Peptid, das durch eine Hydrazidbindung bzw. ein Hydrazidbindeglied an mindestens ein Lipid gebunden ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den gesättigten Fettsäuren, den ungesättigten Fettsäuren und den Sterolen.
Modifiziertes Peptid nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Oligopeptid handelt, das im Wesentlichen besteht aus einem Peptid, das durch eine Hydrazidbindung bzw. ein Hydrazidbindeglied an mindestens ein Lipid gebunden ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Palmitinsäure, Stearinsäure, cis-9,10-Epoxystearinsäure, Ölsäure, Linolsäure und Cholesterin.
Synthetischer Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens ein modifiziertes Peptid nach einem der Ansprüche 11 bis 13 umfasst.
Diagnosereagenz, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein modifiziertes Peptid nach einem der Ansprüche 11 bis 13 umfasst.
Verwendung des Produkts des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zum Herstellen eines Arzneimittels, das einen Wirkstoff mit vektorisierter peptidartiger Beschaffenheit umfasst, das für eine gezielte Ansteuerung von Zellen brauchbar ist.