DE69635658T2

DE69635658T2 - Zusammensetzungen und verfahren zur verhinderung mikrobieller kontaminierung von pflanzengewebekulturmedien

Info

Publication number: DE69635658T2
Application number: DE69635658T
Authority: DE
Inventors: Assaf Z. Guri; Kishor N. Patel
Original assignee: Plant Cell Technology Inc
Current assignee: Plant Cell Technology Inc
Priority date: 1995-06-02
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2016-06-04
Also published as: HUP9900888A2; NO975556D0; WO1996038542A1; BR9608621A; PL323749A1; EP0828820A1; AU5970196A; CA2222935C; ATE314459T1; CA2222935A1; AU698103B2; ES2256860T3; NZ309512A; DE96916997T1; NO975556L; CN1193344A; IL122373A; DE69635658D1; JPH11506331A; US5750402A

Description

1. GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Verhinderung oder Inhibierung eines mikrobiellen Wachstums in Kulturmedien für Pflanzengewebekulturen, die normalerweise die Einhaltung von sterilen Bedingungen erfordern. In dem Kulturmedium werden spezifische chemische Mittel in Konzentrationen verwendet, die die mikrobielle Kontamination vermindern oder verhindern, die jedoch eine im wesentlichen normale Keimung von Samen oder ein im wesentlichen normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen ermöglichen. Die offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren sind nützlich für Forscher bei der Pflanzen-Gewebekultur und Pflanzen-Molekularmikrobiologie sowie für Pflanzenzüchter und Beschäftigte von Pflanzenzuchtgärten, sowie für eine Vielzahl von kommerziellen Anwendungen.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
2.1. IN VITRO PFLANZENKULURSYSTEME
Das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung sind grundlegende biologische Prozesse von hohem wissenschaftlichem, erzieherischem und kommerziellem Interesse. Diese biologischen Prozesse können durch die Keimung von Samen und die Aufzucht von ganzen Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben und Pflanzenzellen in vitro in steriler Kultur auf verschiedenen Typen von Kulturmedien beobachtet und manipuliert werden.
Die Praxis einer Züchtung von Pflanzen in vitro ist gut entwickelt. Vergleiche zum Beispiel, Thorpe, T.A. (ed.) Plant Tissue Culture: Methods and Applications in Agriculture, Academic Press, Inc., New York (1981); Evans et al. (ed.), Handbook of Plant Cell Culture, Vol. 1, MacMillan Publishing Co., New York, London, (1983); und Dixon, R.A. (ed), Plant Cell Culture: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, Washington DC (1985).
Für ein normales Wachstum und eine normale Entwicklung benötigen in vitro gezüchtete Pflanzen mindestens ein Medium, das essentielle Mineralsalze enthält. Vergleiche beispielsweise Salisbury, F.B. und Ross, C.W. Plant Physiology, 3d Ed., Wadsworth Publishing Co. (1985). Zusätzlich benötigen kultivierte Pflanzengewebe und -zellen typischerweise verschiedene Kombinationen von Pflanzenhormonen (Phytohormonen), Vitaminen und einem oder mehreren einfachen Zuckern. Vergleiche Thorpe, supra.
Leider stellen derartige Kulturmischungen auch eine reichhaltige Mischung von Nährstoffen dar, die das rasche Wachstum von Bakterien und Pilzen unterstützen können. Wenn einmal derartige Kontaminantien in der Kultur heimisch geworden sind, wachsen sie üblicherweise rasch, entziehen dem Medium Nährstoffe und erzeugen Toxine, die das Wachstum des kultivierten Pflanzengewebes beeinträchtigen und dieses schließlich töten können.
Demgemäß war die Anwendung von Steriltechniken eine strikte Anforderung an alle in vitro-Pflanzenkulturmanipulationen. Beispielsweise erfordert die Herstellung und Wartung eines Standard-Gewebekultursystems die Sterilisierung des Kulturmediums, entweder durch Hitze oder Filtration, die Sterilisierung des Kulturbehälters, die Oberflächensterilisierung des zu kultivierenden Samens oder Pflanzengewebes, und die Sterilisierung aller Instrumente, die dazu verwendet werden, das Pflanzengewebe zu handhaben oder zu manipulieren. Zusätzlich muss jede nachfolgende Manipulation des Pflanzengewebes typischerweise in einer Umgebung mit filtrierter Luft durchgeführt werden, beispielsweise unter einem Laminarströmungsabzug.
Trotz der striktesten Anwendung der Steriltechniken durch den erfahreren Fachmann bleibt die Kontamination von Pflanzenkulturen ein andauerndes Problem, das zu Verlusten führen kann, die von geringen Zahlen von Kulturen bis zu einem katastrophalen Verlust von ganzen Ansätzen von Kulturmedium und Gewebekulturen reichen. Die Kontamination durch Bakterien und Pilze ist ein heimtückischer Prozess, der Pflanzengewebekulturen während der gesamten Dauer der Kulturperiode kontinuierlich bedroht. Trotz der Tatsache, dass Pflanzengewebekulturen steril sein können, wenn sie gestartet werden, können Mikroorganismen häufig Kulturen zu einem beliebigen Zeitpunkt während anschließender Gewebekulturmanipulationen kontaminieren. Es wäre daher nützlich, ein chemisches Mittel zur Verfügung zu stellen, das die mikrobielle Kontamination von Pflanzengewebe-Kulturmedien vermindert oder verhindert und die Sterilität der Medien für die Dauer der Kulturperiode aufrechterhält.
2.2 ANTIMIKROBIELLE MITTEL IN DER PFLANZENGEWEBEKULTUR
In Pflanzengewebekulturen wurden verschiedene Typen von antimikrobiellen chemischen Mitteln getestet. Auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung oder Verhinderung des Wachstums von Bakterien in Pflanzenkulturen wurden im großen Umfange Antibiotika getestet. Die Verwendung von Antibiotika unterliegt jedoch bestimmten Einschränkungen. Beispielsweise sind Antibiotika teuer, sind häufig nur gegen Bakterien, jedoch nicht gegen Pilze wirksam, der Bereich ihrer Wirksamkeit gegen Typen von Bakterien ist häufig eng, sie sind üblicherweise wärmelabil, und sie sind häufig phytotoxisch oder auf andere Weise in der Lage, das Verhalten von kultivierten Pflanzengeweben zu verändern.
Beispielsweise beschreiben Phillips, R., et al., Plant Sci. Lett., 21: 235–240 (1981) Tests von sechs Antibiotika, d.h. Benzylpenicillin, Phosphomycin, Chloramphenicol, Streptomycin, Rifampicin und Nalidixinsäure, zur Verhinderung von bakteriellen Infektionen in Topinamur-Kulturen (Helianthus tuberosus). Nur Rifampicin war in der Lage, die bakterielle Kontamination zu bekämpfen, ohne das Ausmaß der Pflanzenzellteilung, Zelldifferenzierung oder DNA-Synthese in kulti vierten Explantaten zu beeinträchtigen. Rifampicin löste jedoch eine Zunahme der Proteinsynthese aus.
Pollock, K., et al., Plant Cell Reports, 2: 36–39 (1983), beschreiben die Toxizität von mehr als zwanzig unterschiedlichen Antibiotika auf den Plattierungswirkungsgrad von Protoplasten abgeleiteten Zellen von Nicotiana plumbaginifolia. Während die Betalactane, d.h. die Penicilline und die Cephalosporine, nur einen geringen beobachtbaren toxischen Effekt auf den Plattierungswirkungsgrad der Zellen aufwiesen, stimulierten diese Antibiotika das Wachstum von Pflanzenzellkolonien. Die Aminoglycoside, z.B. Streptomycin und Kanamycin, waren im Gegensatz dazu für Pflanzenzellen klar toxisch. Erythromycin war für Pflanzenzellen relativ nicht-toxisch, während die Tetracycline in Langzeit-Toxizitätstests stark inhibitorisch wirkten.
Gilbert, J.E., et al., Ann. Appl. Biol., 119: 113–120 (1991) beschreiben die Verwendung von Antibiotika zur Bekämpfung einer latenten bakteriellen Kontamination in Kartoffelzellkulturen. Zwei unterschiedliche Kombinationen von Antibiotika, entweder Penicilllin, Streptomycin und Amphotericin oder Erythromycin, Streptomycin und Carbenicillin wurden getestet. Jede Kombination verminderte bei ihrer Zugabe zu Medien, die zur Kultivierung von Mikropflänzchen verwendet wurden, das Pflanzenwachstum und lösten in höheren Konzentrationen eine Chlorose aus. Die Mischungen waren nicht nur phytotoxisch, sondern versagten auch in Hinblick auf die Eliminierung einer Kontamination. Wenn die obige Mischung von Antibiotika jedoch zu Enzymmedien zugesetzt wurde, die dazu verwendet wurden, Protoplasten herzustellen, wurde eine Kontamination anscheinend eliminiert.
Zusätzlich zu Antibiotika wurden chemische Biozide auf ihre Fähigkeit untersucht, die Kontamination in Pflanzenkulturen zu inhibieren oder zu verhindern.
Beispielsweise beschreiben Macek, T., et al., Biotechnology Techniques, 8(12): 885–888 (1994) die Verwendung von Diethylpyrocarbonat (DPC) zur chemischen Sterilisation von Nährstoffmedien für Pflanzenzellkulturen. DPC tötete alle kontaminierenden Mikroorganismen ab, ohne die Wachstumseigenschaften von kultivierten Pflanzenzellen zu verändern. Da sich DPC jedoch innerhalb eines Zeitraums von mehreren Stunden zu Ethanol und Kohlendioxid zersetzt, wenn es mit Wasser in Kontakt gebracht wird, kann DPC nicht dazu dienen, die Sterilität von Pflanzenzellkulturen über die Dauer der Kulturperiode aufrechtzuhalten.
Das japanische Patent Nr. 4-311326 offenbart ein Verfahren zur Eliminierung einer Pilzkontamination in Gewebekulturen von Alpenveilchen-Pflanzen, das das Eintauchen eines Gewebeschnitts aus einer Alpenveilchen-Pflanze in eine Lösung, die ein Imidazol- oder Triazol-Fungizid enthält, oder die Kultivierung eines Gewebeschnitts auf einem Kulturmedium, das das Fungizid enthält, umfasst. Diese Behandlung dient jedoch nicht dazu, eine bakterielle Kontamination zu inhibieren.
Das japanische Patent Nr. 4-63589 beschreibt die Verwendung von Allylisothiocyanat (CH₂=CHCH₂N=C=S) als Sterilisierungsmittel in Pflanzenkulturmedien, in denen das chemische Mittel die Notwendigkeit beseitigte, eine Autoklavenbehandlung durchzuführen, und es wurde keine Anormalität bei Gewebekulturen von Nelken-Pflanzen beobachtet.
Kombinationen von Antibiotika und chemischen Bioziden wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, eine mikrobielle Kontamination in Pflanzenkulturen zu inhibieren.
Beispielsweise beschreibt Francko, D.A., Aquatic Botany, 26: 113–117 (1986) die Verwendung von Antibiotika (Penicillin G und Streptomycinsulfat) in Kombination mit einem Fungizid (Captan) bei einem Versuch, axenische Pflanzen aus Samen der Wasserpflanze Nelumbo lutea (Willd.) zu erhalten. Tests zeigten, dass wenn diese Mittel zu den Inkubationsmedien zugegeben wurden, etwa die Hälfte der Samenkulturen nach zwei Wochen des Wachstums keine nachweisbaren Kontaminantien enthielten. Vier Wochen nach der Übertragung auf frische Medien, denen die Antibiotika und Fungizide fehlten, blieben jedoch nur 11% der Anfangskulturen frei von Kontaminantien.
Haldeman, J.H., et al., Hortscience, 22(2: 306–307 (1987) beschreiben die Verwendung einer Kombination aus einem Fungizid (Benomyl) und einem Antibiotikum (Rifampicin) als Behandlung zur Bekämpfung einer andauernden Kontamination durch Pilze und Bakterien in Kulturen von Kamelien-Sprossspitzenexplantaten aus feldgezüchteten Pflanzen. Eine 24 h-Behandlung von Sprossspitzen mit dieser Mischung nach Standard-Entkeimungsbehandlungen in Bleichlösung verminderte die Kontamination erheblich, beseitigte sie jedoch nicht.
Kneifel, W. und Leonhardt, W., Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 29: 139–144 (1992) beschreiben Tests unterschiedlicher Kombinationen von Antibiotika und chemischen Bioziden gegen grampositive und gramnegative Bakterien, die aus Pflanzengewebekulturen isoliert wurden. Eine Mischung aus Imipenem^TM (N-Formimidoylthienanycinmonohydrat; Merck, USA) und Ampicillin, und eine Mischung aus Imipenem^TM und Penicillin G erwiesen sich als am wirksamsten bei der Inhibierung einer bakteriellen Kontamination und wiesen keine erkennbare Wirkung auf die Wachstumsgeschwindigkeit oder das Wurzelwachstum auf, noch war irgendeine Schädigung des Chlorophylls erkennbar. Eine Mischung aus IMIPENEM^TM und KATHON^TM (5-Chlor-2-methyl-4-isothiazolin-3-on und 2-Methyl-4-isothiazolin-3-on; Rohm & Haas, Österreich), führte jedoch zu einem verminderten Wurzelwachstum von zwei getesteten Pflanzenspezies.
Auf dem Fachgebiet sind eine Vielzahl von anderen Chemikalien dafür bekannt, dass sie eine allgemeine konservierende oder biozide Aktivität aufweisen. Vier dieser Chemikalien, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, sind Kaliumsorbat, Natriumbenzoat, Methylchlorisothiazolinon und Methylisothiazolinon.
Im Merck Index (10th Ed., 1983, Entry No. 7555) wird Kaliumsorbat als Schimmel- und Hefeinhibitor aufgelistet, und Natriumbenzoat (Entry No. 8413) als ein Konservierungsmittel, insbesondere für Lebensmittelprodukte. Ryu, D. und Holt, D.L., J. Food Protection, 56(10): 862–867 (1993) zeigen, dass Kaliumsorbat das Wachstum von Penicillium expansum in Pilzkultur und auf Äpfeln inhibiert. Hall, D.J., Proc. Fla. State Hort, Soc., 101; 184–187 (1988) zeigt, dass Kaliumsorbat und Natriumbenzoat jeweils als Nachernte-Fungizide bei Citrusfrüchten wirksam sind. Idise, O.E. und Izuagbe, Microbios Lett., 28: 117–121 (1985) zeigen, dass Natriumbenzoat wirksam das Wachstum von Bakterien und Hefe in einem auf Flaschen abgefüllten Palmwein inhibiert.
Sodeko, O.O., et al., Microbios, 51: 133–143 (1987) zeigen, dass Natriumbenzoat wirksam Bakterien und Pilze in Orangensaft inhibiert. Das US-Patent Nr. 3 122 432 von Biggs beschreibt eine Zusammensetzung zur Konservierung von Schnittblumen, die verschiedene Zutaten enthält, einschließlich Natriumbenzoat, das als Fermentations- und Schimmelinhibitor beschrieben wird.
Methylchlorisothiazolinon und Methylisothiazolinon, zusammen mit Magnesiumsalzen als Stabilisatoren, sind in dem Biozid KATHON^TM CG (Rohm & Haas, USA) enthalten, das in einem großen Bereich von Kosmetika, Anstrichfarben, Air Condition-Einheiten, usw. verwendet wird. Gruvberger, B., et al., Contact Dermatitis, 15: 24–27 (1986) beschreiben chromatographische Verfahren, um KATHON^TM CG in Kosmetika nachzuweisen. Haack, T.K. und Warwick, E.F., in: Pesticide Formulations and Application Systems, Devisetty, D.G., et al. (eds), Am. Soc. Testing and Materials, Philadelphia (1993), Seiten 105–115 stellen Daten zur Verfügung, die das Landwirtschafts-Konservierungsmittel Legend MK^TM betreffen, das eine andere kommerzielle Ausführungsform von Methylchlorisothiazolinon und Methylisothiazolinon darstellt, und das darin als wirksames antimikrobielles Mittel für wässrige fließfähige Pestizidzusammensetzungen beschrieben wird. Green, P.N. Lett. Appl. Microbiol., 17: 158–161 (1993) zeigt, dass von fünf getesteten kommerziellen Bioziden die Mischung aus Methylchlorisothiazolinon und Methylisothiazolinon gegen im Labor erzeugte mikrobielle Biofilme von Legionella bozemanii hochwirksam war.
Chapman, J.S. Am. Clin. Lab., Seiten 13–14, (Aug. 1994) beschreibt, wie eine dritte kommerzielle Ausführungsform einer Mischung von Methylchlorisothiazolinon und Methylisothiazolinon, vermarktet als ProClin^TM (Rohm & Haas, vertrieben von Supelco, Inc.) hochwirksam ist gegen ein breites Spektrum von wenigstens 14 unterschiedlichen Spezies von gramnegativen Bakterien, 9 unterschiedlichen Spezies von grampositiven Bakterien und 18 unterschiedlichen Spezies von Pilzen.
Zusätzlich beschreiben die US-Patente 3 523 121; 3 761 488; 4 105 431; 4 243 403; 4 252 694; 4 265 899; und 4 279 762 von Lewis neue Isothiazolone, die gegen ein breites Spektrum von Mikroorganismen biodzid wirksam sind, die einschließen Bakterien, Algen und Pilze, und zwar in einem breiten Bereich von Anwendungen, einschließlich Seifen, Waschmitteln, Anstrichen, Kosmetika, Schneidölen und als Fungizide auf Samen, die in die Erde gepflanzt werden sollen.
Außerdem beschreiben die US-Patente Nr. 4 454 146, 4 499 071; 4 540 570; und 4 555 400 von Borovian synergistische Konservierungszusammensetzungen zur Inhibierung des Wachstums von Mikroorganismen, wobei die Zusammensetzungen wenigstens zwei Bestandteile aufweisen, von denen der erste aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus einem oder mehreren herkömmlichen Konservierungsstoffen, einschließlich Benzoesäure, Sorbinsäure und einer Mischung von Methylchlorisothiazolinon und Methylisothiazolinon, besteht, und einem zweiten Bestandteil, der eine polycyclische Verbindung ist, die darin definiert wird, die, in Kombination mit dem ersten Bestandteil, Mikroorganismen synergistisch tötet oder inhibiert.
Schließlich beschreiben die US-Patente 5 028 620 und 5 100 905 von Hsu eine synergistische Biozidzusammensetzung mit einem verminderten Sensibilisierungspotential, deren erster Bestandteil Methylchlorisothiazolinon im Bereich von 1,2 bis 25,4% ist, und deren zweiter Bestandteil Methylisothiazolinon im Bereich von etwa 74,6 bis etwa 98,8% ist.
Obwohl die vier Bestandteile, d.h. Kaliumsorbat, Natriumbenzoat, Methylchlorisothiazolinon und Methylisothiazolinon dafür bekannt sind, dass sie konservierende oder biozide Wirkungen aufweisen, gibt es auf dem Fachgebiet keine Lehre und keinen Vorschlag, dass diese Chemikalien, oder irgendeine Kombination davon, dafür nützlich sein könnten, eine mikrobielle Kontamination in Pflanzengewebekulturen zu vermindern oder zu verhindern, und zwar ohne eine negative Beeinflussung der Pflanzengewebe. Tatsächlich führt der Bericht von Kneifel, W. und Leonhardt, W., supra, betreffend ein vermindertes Wurzelwachstum auf einer Mischung aus IMIPENEM^TM und KATHON^TM von einer Verwendung von KATHON^TM enthaltenden Mitteln in Pflanzengewebekulturen weg.
Es wäre vorteilhaft, weitere chemische Mittel bereitzustellen, die Pflanzengewebe-Kulturmedien zugesetzt werden können, wobei die Mittel eine Kontamination mit Bakterien und Pilzen für die Dauer der Kulturperiode vermindern oder verhindern könnten, und eine im wesentlichen normale Keimung von Samen oder ein im wesentliches normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale Entwicklung von kultivierten Samen, Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen gestatten würden.
3. KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen und Verfahren zur Verminderung oder Verhinderung einer mikrobiellen Kontamination von in vitro-Pflanzengewebekulturen während der Kulturperiode bereitzustellen. Ein derartiges Ziel kann dadurch erreicht werden, dass man ein chemisches Mittel in ein Pflanzenkulturmedium in einer Konzentration einarbeitet, die das Wachstum von Bakterien und Pilzen wirksam vermindert oder verhindert, und die eine im wesentlichen normale Keimung von Samen oder ein im wesentlichen normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen ermöglicht.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Pflanzengewebe-Kulturmedium bereitzustellen, das ein chemisches Mittel in einer Konzentration aufweist, die im Hinblick auf eine Verminderung oder Verhinderung einer mikrobiellen Kontamination während der gesamten Kulturperiode wirksam ist und eine im wesentlichen normale Keimung von Samen oder ein im wesentlichen normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen gestattet.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Kit zum Kultivieren von Samen, Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen auf einem Pflanzengewebe-Kulturmedium bereitzustellen, der ein chemisches Mittel in einer Konzentration aufweist, die zur Verminderung oder Verhinderung einer mikrobiellen Kontamination während der Kulturperiode wirksam ist und die eine im wesentlichen normale Keimung von Samen oder ein im wesentliches normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen ermöglicht, wobei der Kit einen Kulturbehälter aufweist, der ein Pflanzengewebe-Kulturmedium aufweist, das das chemische Mittel aufweist, d.h. für eine sofortige Verwendung bereit ist, oder das, beispielsweise durch Zugabe von Wasser, feritg für eine Zubereitung ist. Der Kit umfasst außerdem einen oder mehrere Pflanzensamen, die vorzugsweise oberflächensterilisiert wurden, oder eine oder mehrere Pflanzen, Pflanzenorgane, Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen.
4. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zur Verminderung oder Verhinderung einer mikrobiellen Kontamination von in vitro-Pflanzenkulturen während der gesamten Kulturperiode bereit. Dem Pflanzenkulturmedium wird ein chemisches Mittel in einer Konzentration zugesetzt, die wirksam ist, das Wachstum von Bakterien und Pilzen zu vermindern oder zu verhindern, und die eine im wesentlichen normale Keimung von Samen oder ein im wesentliches normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen gestattet. Die Erfindung stellt ein Pflanzengewebe-Kulturmedium bereit, das ein chemisches Mittel aufweist, wobei dieses chemische Mittel umfaßt: Methylchlorisothiazolinon in einem Konzentrationsbereich von etwa 2,0 bis etwa 2,6 g/l; Methylisothiazolinon in einem Konzentrationsbereich von etwa 0,6 bis etwa 0,8 g/l; Magnesiumchlorid in einem Konzentrationsbereich von etwa 15,0 bis etwa 30,0 g/l; und Magnesiumnitrat in einem Konzentrationsbereich von etwa 15,0 bis etwa 30,0 g/l; wobei das chemische Mittel in einem Konzentrationsbereich von etwa 0,01% (v/v) bis etwa 0,20% (v/v) vorhanden ist, um eine mikrobielle Kontamination des Pflanzengewebe-Kulturmediums zu vermindern oder zu verhindern und eine im wesentlichen normale Keimung der Samen oder ein im wesentlichen normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zu ermöglichen.
Stärker bevorzugt umfasst das chemische Mittel eine Mischung aus Methylchlorisothiazolinon, Methylisothiazolinon, Magnesiumchlorid, Magnesiumnitrat und Kaliumsorbat oder Natriumbenzoat. Am stärksten bevorzugt umfasst das chemische Mittel eine Mischung von Methylchlorisothiazolinon, Methylisothiazolinon, Magnesiumchlorid, Magnesiumnitrat, Kaliumsorbat und Natriumbenzoat.
Die Anmelder haben überraschenderweise entdeckt, dass diese Kombination von Chemikalien, in einem bestimmten Bereich von Konzentrationen, wirksam im Hinblick auf eine Verminderung oder Verhinderung einer mikrobiellen Kontamination in Pflanzengewebekulturen für die Dauer der Gewebekulturperiode ist, jedoch eine im wesentlichen normale Keimung von Samen oder ein im wesentliches normales Wachstum oder eine im wesentliches normale Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen ermöglicht.
Die relativen Konzentrationen der individuellen Bestand teile, die das chemische Mittel umfasst, können variiert werden, um eine Mischung zu erzeugen, die zur praktischen Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens für irgendein spezielles Pflanzenkulturmedium, eine Pflanzenspezies, einen Pflanzensamen, eine Pflanze, ein Pflanzenorgan, ein Pflanzengewebe oder eine Pflanzenzelle optimal wirksam ist. Eine stärker bevorzugte Mischung der Bestandteile in dem chemischen Mittel umfasst außerdem: Kaliumsorbat in einem Konzentrationsbereich von etwa 15 bis etwa 25 g/l oder Natriumbenzoat in einem Konzentrationsbereich von etwa 13 bis etwa 27 g/l.
Eine besonders bevorzugte Mischung der Bestandteile im chemischen Mittel umfasst außerdem: Kaliumsorbat in einem Konzentrationsbereich von etwa 15 bis etwa 25 g/l; und Natriumbenzoat in einem Konzentrationsbereich von etwa 13 bis etwa 27 g/l.
In allen Fällen werden Bestandteile des chemischen Mittels unter Bildung einer Vorratslösung des chemischen Mittels vermischt, wobei man irgendeine Flüssigkeit verwendet, in der sich die Bestandteile auflösen, vorzugsweise jedoch Wasser und am stärksten bevorzugt destilliertes oder entionisiertes Wasser.
Bei der Verwendung in der vorliegenden Anmeldung bezieht sich "Pflanzengewebekultur" oder "kultivierte Pflanzengewebe" auf irgendein Verfahren, das in vitro durchgeführt wird, bei dem Samen zur Keimung gebracht werden, oder Pflanzen, Pflanzenorgane, Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen aufgezogen, differenziert, subkultiviert oder in anderer Weise auf einem Kulturmedium gehalten werden, und zwar einem definierten oder undefinierten, das typischerweise in einem sterilen (synonym: aseptischen, axenischen) Zustand gehalten wird, d.h. frei von mikrobieller Kontamination, und das im allgemeinen unter kontrollierten Umgebungsbedingungen inkubiert wird.
Bei der Verwendung in der vorliegenden Anmeldung betrifft die "mikrobielle Kontamination" das Wachstum von irgendwelchen unerwünschten Mikroorganismen, z.B. Bakterien oder Pilzen in einer Pflanzengewebekultur.
Bei der Verwendung in der vorliegenden Anmeldung beziehen sich die Begriffe "Pflanzengewebekulturmedium", "Pflanzenkulturmedium", "Kulturmedium" und "Medium" auf ein festes Subtrat oder eine flüssige Lösung, in denen ein Pflanzensamen keimt, eine Pflanze gehalten oder gezüchtet werden kann und ein isoliertes Pflanzenorgan oder Pflanzengewebe gehalten, aufgezogen oder differenziert werden kann, oder auch eine oder mehrere isolierte Pflanzenzellen, Pflanzenzellaggregate oder Pflanzenzellprotoplasten gehalten, aufgezogen oder differenziert werden können, und das in einem sterilen Zustand gehalten werden muss, d.h. im wesentlichen frei von mikrobieller Kontamination.
Die Begriffe "Pflanzengewebekulturmedium", "Pflanzenkulturmedium", "Kulturmedium" und "Medium" sollen ferner auch Wasser bezeichnen, das eine geeignete Mischung von Mineralsalzen enthält. Das Kulturmedium kann außerdem, in geeigneten Konzentrationen, Phytohormone, einschließlich beispielsweise Auxine, Cytokinine oder Gibberelline, Vitamine wie beispielsweise eines oder mehrere der B-Vitamine, eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, einschließlich beispielsweise Saccharose oder Glukose, und einen oder mehrere undefinierte(n) Wachstumsverstärker wie beispielsweise Kokosnussmilch, beinhalten. Die Bestandteile der Mineralssalzmischung können gemäß den Anforderungen der speziellen Pflanzenspezies, die aufgezogen wird, ausgewählt und hergestellt werden. Die geeignete Zusammensetzung der Mineralsalze kann entweder empirisch bestimmt sein, oder aus Mineralsalzzusammensetzungen ausgewählt sein, die vorher auf dem Fachgebiet der Pflanzengewebekultur bekannt waren und entsprechend hergestellt werden. Alternativ können die Mineralsalze aus irgendeiner Anzahl von kommerziell erhältlichen Mischungen ausgewählt werden (z.B. von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.). Mineralsalzmischungen, die für die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen beispielsweise Hoaglands Basalsalzmischung, Gamborgs B-5 Basalsalzmischung, Hellers Basalsalzmischung, Murashige und Skoog Basalsalzmischung, Nitsch und Nitsch-Basalsalzmischung, Whites Basalsalzmischung und Variationen davon ein. Zusätzlich können verschiedene Makronährstoffe, Mikronährstoffe und Vitaminbestandteile, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, auf verschiedene Weise kombiniert werden, um ein Kulturmedium herzustellen, das für die Pflanzenspezies, die aufgezogen wird, geeignet ist.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird das chemische Mittel dem Pflanzengewebekulturmedium in einer Konzentration zugesetzt, die das Wachstum von Bakterien oder Pilzen oder beiden vermindert oder verhindert, und die eine im wesentlichen normale Samenkeimung oder ein im wesentliches normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale Entwicklung einer Pflanze, eines Pflanzenorgans, Pflanzengewebes oder einer Pflanzenzelle, die darauf kultiviert werden, ermöglicht.
Gemäß der Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist ein chemisches Mittel dann zur Verminderung oder Verhinderung eines mikrobiellen Wachstums in einem Pflanzenkulturmedium wirksam, wenn die Zugabe des chemischen Mittels zu dem Pflanzenkulturmedium in einer Konzentration, die eine im wesentlichen normale Samenkeimung oder ein im wesentlichen normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenteilen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen ermöglicht, die Menge einer Kontaminierung mit Bakterien oder Pilzen um wenigstens 80%, verglichen mit Kontrollmedien, denen das chemische Mittel fehlt, vermindert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine im wesentlichen normale Keimung von Samen definiert als ein Prozentsatz an Keimung, der wenigstens 50% des Prozentsatzes an Keimung auf Kontrollkulturmedien, die das chemische Mittel nicht enthalten, beträgt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein im wesentlichen normales Wachstum einer Pflanze, eines Pflanzenorgans, Pflanzengewebes oder einer Pflanzenzelle definiert als eine Wachstumsrate oder Zellteilungsrate der Pflanze, des Pflan zenorgans, des Pflanzengewebes oder der Pflanzenzelle, die wenigstens 50% der Wachstumsrate oder Rate der Zellteilung bei einer entsprechenden Pflanze, einem Pflanzenorgan, Pflanzengewebe oder einer Pflanzenzelle auf einem Kontroll-Kulturmedium, das das chemische Mittel nicht enthält, beträgt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine im wesentlichen normale Entwicklung einer Pflanze, eines Pflanzenorgans, Pflanzengewebes oder einer Pflanzenzelle definiert als das Erscheinen von einem oder mehreren Entwicklungsereignissen bei der Pflanze, dem Pflanzenorgan, dem Pflanzengewebe oder der Pflanzenzelle, das im wesentlichen das gleiche ist wie dasjenige, das bei einer entsprechenden Pflanze, einem Pflanzenorgan, Pflanzengewebe oder einer Pflanzenzelle auf einem Kontrollkulturmedium, das das chemische Mittel nicht enthält, auftritt.
Im allgemeinen ist das chemische Mittel, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, in einem Bereich von Konzentrationen in dem Kulturmedium wirksam, die eine im wesentlichen normale Samenkeimung oder ein im wesentlichen normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale Entwicklung einer Pflanze, eines Pflanzenorgans, Pflanzengewebes oder einer Pflanzenzelle, die darauf kultiviert werden, ermöglichen.
Ein stärker bevorzugter Konzentrationsbereich des chemischen Mittels in dem Kulturmedium beträgt von etwa 0,02% bis etwa 0,10% (v/v). Der am stärksten bevorzugte Konzentrationsbereich des chemischen Mittels in dem Kulturmedium beträgt von etwa 0,03% bis etwa 0,05% (v/v).
Für diejenigen Pflanzensamen, Pflanzen, Pflanzenorgane, Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen von irgendeiner Spezies, für die die obigen Bereiche nicht zufriedenstellend sind, kann die optimale wirksame Konzentration des chemischen Mittels in dem Kulturmedium zur Verwendung bei dem beanspruchten Verfahren empirisch dadurch bestimmt werden, dass man den genannten Samen, die Pflanze, das Pflanzenorgan, das Pflanzengewebe oder die Pflanzenzelle in einem Pflanzen gewebe-Kulturmedium bei einem Bereich von Konzentrationen des chemischen Mittels züchtet, und eine oder mehrere Konzentrationen auswählt, bei denen die mikrobielle Kontamination vermindert oder verhindert ist, die jedoch eine im wesentlichen normale Samenkeimung ermöglichen oder die ein im wesentlichen normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale Entwicklung der Pflanze, des Pflanzenorgans, des Pflanzengewebes oder der Pflanzenzelle ermöglichen. Eine derartige empirische Bestimmung kann ohne unzumutbare Versuche und unter Anwendung von Standardtechniken für die Samenkeimung oder die Aufzucht von Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen durchgeführt werden, und zwar in Kombination mit Routine-Screeningtechniken, die dem einschlägigen Fachmann bekannt sind.
Beispielsweise können Pflanzengewebekulturmedien gemäß irgendeinem Standardrezept für Pflanzengewebekulturmedien, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden, wobei das chemische Mittel in einem Bereich von Konzentrationen zugesetzt wird, und zwar für ein Screenen, sowie ohne chemisches Mittel (Kontrolle). Pflanzensamen können in diese Medien "eingepflanzt" werden, geeignet inkubiert werden und nach einem ausreichenden Zeitraum untersucht werden, um den Prozentsatz der Keimung zu bestimmen. Zusätzlich kann eine Bewertung des Wachstums oder der Entwicklung von Wurzeln und Sprossen von gekeimten Samen, wie sie beispielsweise unter Verwendung irgendwelcher morphologischer, anatomischer oder biochemischer Kennwerte bestimmt wurden, dadurch erfolgen, dass man Samen, die auf Kulturmedien keimten, das das chemische Mittel enthielt, mit Samen, die auf Kulturmedien ohne chemisches Mittel keimten, vergleicht.
Der erfahrene Fachmann kennt verschiedene morphologische, anatomische, physiologische und biochemische Assays, und kann diese anwenden, die für die Bestimmung der Wirkungen von chemischen Mitteln auf das Wachstum von Pflanzen nützlich sind. Beispielsweise kann eine morphologische Analyse einen Vergleich der Form, Größe oder Anzahl von Wurzeln, Sprossen, Blättern oder Fortpflanzungsorganen oder Teilen davon umfassen. Eine anatomische Analyse kann beispielsweise eine vergleichende Analyse der Größe, Form, des Musters der Differenzierung von Zellen umfassen, wie beispielsweise die Menge, Anordnung oder Reifung von Gefäßgeweben, Pflanzenhaaren oder Spaltöffnungen oder die Anwesenheit oder das Fehlen von sich aktiv teilenden Meristemen. Eine physiologische Analyse kann beispielsweise eine vergleichende Analyse des Grads der Atmung, Photosynthese, des Spaltöffnungswiderstands oder der Ethylenproduktion umfassen. Eine biochemische Analyse kann beispielsweise eine vergleichende Analyse der Protein- oder DNA-Synthese, des Chlorophyllabbaus oder der Anwesenheit, des Fehlens oder der Menge an anderen Pigmenten umfassen. Einer oder mehrere dieser Assays, die alle dem erfahrenen Fachmann bekannt sind, kann zu einer empirischen Bestimmung der optimalen Konzentration des chemischen Mittels in einem Pflanzengewebekulturmedium beitragen, um das Verfahren der vorliegenden Erfindung bei einer speziellen Pflanzenspezies in die Praxis umzusetzen.
Wenn einmal die optimale Konzentration des chemischen Mittels für die praktische Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt ist, kann es dem Kulturmedium zugesetzt werden, das danach in flüssiger Form für Flüssigkulturen verwendet wird, einschließlich beispielsweise Zellsuspensionskulturen oder Photoplastenkulturen, oder das anschließend durch Zugabe eines Geliermittels verfestigt wird. Das Kulturmedium wird typischerweise auf einen geeigneten pH eingestellt, beispielsweise pH 5,8, indem man geeignete saure oder basische Lösungen verwendet, z.B. Chlorwasserstoffsäure (HCl) oder Kaliumhydroxid (KOH).
In denjenigen Fällen, wenn das Kulturmedium verfestigt werden soll, kann ein Geliermittel, beispielsweise PHYTAGEL^TM-Gellangummi (Sigma Chemical Co.) in einem geeigneten Konzentrationsbereich, beispielsweise von 0,2% bis 0,3% (w/v) für Gellangummi, zu dem Kulturmedium zugesetzt werden. Das Kulturmedium muss dann ausreichend erwärmt werden, z.B. durch Autoklavenbehandlung, um das Geliermittel aufzulösen. Die Anwesenheit des chemischen Mittels macht jedoch eine Autoklavenbehandlung zu Sterilisationszwecken unnötig.
Die antimikrobielle Aktivität eines Kulturmediums, das das chemische Mittel aufweist, wird durch Autoklavenbehandlung (121 °C, 15 min) nicht vermindert. Zusätzlich haben die Anmelder entdeckt, dass ein Pflanzenkulturmedium mit dem chemischen Mittel, das einer Autoklavenbehandlung unterzogen wurde, im Hinblick auf eine Pflanzensamenkeimung oder das Wachstum oder die Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen weniger hemmend, verglichen mit dem gleichen Kulturmedium mit dem chemischen Mittel, das keiner Autoklavenbehandlung unterzogen wurde. Das bedeutet jedoch nicht, dass eine Autoklavenbehandlung zur Durchführung der Erfindung im strengen Sinne erforderlich ist, sondern nur, dass der Bereich von Konzentrationen des chemischen Mittels in dem Kulturmedium, die zur praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, in einigen Fällen niedriger sein kann, wenn das Kulturmedium keiner Autoklavenbehandlung unterzogen wurde.
Nach der Autoklavenbehandlung kann das Kulturmedium mit dem chemischen Mittel und dem aufgelösten Geliermittel dann auf einzelne Kulturbehälter irgendeines Typs übertragen werden, die auf dem Fachgebiet verwendbar sind, und man kann das Medium abkühlen und verfestigen lassen.
Ein weiterer Vorteil des chemischen Mittels ist der, dass dann, wenn eine Autoklavenbehandlung zum Auflösen eines Geliermittels nicht erforderlich ist, wärmelabile Bestandteile des Kulturmediums wie Vitamine und Zucker nicht mehr länger eine Filter-Sterilisierung benötigen. Das so hergestellte Kulturmedium kann für einen ausgedehnten Zeitraum gelagert werden, oder sofort verwendet werden.
Ansätze von Kulturmedien können durch Übertragung auf einen oder mehrere auf dem Fachgebiet verwendbare Kulturbehälter aufgeteilt werden, einschließlich Kolben, Becher, quadratische Behälter, Schraubdeckelgläser, Kulturröhrchen oder irgendwelche anderen Behälter, die für Kultursamen, Pflanzen, Pflanzenorgane, Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen nützlich sind. Kulturbehälter können aus Glas hergestellt sein, einschließlich beispielsweise Borsilikatglas oder Natronglas, sowie aus Kunststoffen, einschließlich beispielsweise durchsichtiges Polystyrol oder Polypropylen. Die Kulturbehälter sollten im allgemeinen sauber sein, d.h. frei von Textilstaub, Staub oder chemischen Rückständen; die Zugabe des chemischen Mittels zu dem Kulturmedium macht jedoch die Sterilisierung der Kulturbehälter durch Hitze, Strahlung oder auf anderem chemischem Wege unnötig.
Irgendein Pflanzensamen, eine ganze Pflanze, ein isoliertes Pflanzenorgan, Pflanzengewebe oder eine Pflanzenzelle kann in dem Pflanzengewebe-Kulturmedium, das das chemische Mittel enthält, kultiviert werden. Beispielsweise können Samen irgendeiner Pflanzenspezies in dem Kulturmedium der vorliegenden Erfindung zum Keimen gebracht werden. Derartige Samen können von irgendeiner Spezies von zweikeimblättrigen, einkeimblättrigen oder nacktsamigen Pflanze stammen, einschließlich irgendeiner holzigen Pflanzenspezies, die als Baum oder Strauch wächst, irgendeiner krautartigen Spezies oder irgendeiner Spezies, die essbare Früchte, Samen oder Gemüse produziert, oder irgendeiner Spezies, die farbige oder duftende Blumen erzeugt. Beispielsweise kann der Samen, die ganze Pflanze, das isolierte Pflanzenorgan, das Pflanzengewebe oder die Pflanzenzelle aus einer Pflanzenspezies ausgewählt werden, aus der Gruppe, die besteht aus Gurke, Trichterwinde, Springkraut, Paprika, Aubergine, Ringelblume, Lotosblume, Kohl, Gänseblümchen und Nelke. Außerdem umfasst für Zwecke der vorliegenden Erfindung der Begriff "Pflanzensamen" auch die Sporen von Farnen und anderen niedrigeren Gefäßpflanzen, sowie die Sporen von Nichtgefäß-Pflanzen wie beispielsweise Moosen, Lebermoosen und Hornmoosen.
Trotz der antimikrobiellen Natur des chemischen Mittels ist es bevorzugt, dass bevor man einen Samen, eine Pflanze oder ein Pflanzenorgan zur Initiierung einer neuen Kultur in das Kulturmedium gibt, der Samen, die Pflanze oder das Pflanzenorgan oberflächensterilisiert werden sollten, um Pilz- oder Bakteriensporen zu entfernen, die häufig zu Beginn darauf in einer relativ hohen Dichte vorhanden sind. Techniken zur Oberflächensterilisation von Samen, Pflanzen und Pflanzenorganen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und können unter Verwendung irgendeines allgemein verfügbaren Sterilisierungsmittel durchgeführt werden, wobei jedoch eine Haushaltsbleiche (Natriumhypochloritlösung) mit Wasser verdünnt bevorzugt ist. Beispielsweise können einer oder mehrere Samen wirksam durch Eintauchen in eine verdünnte Lösung von Haushaltsbleiche in Wasser in einer Konzentration von beispielsweise etwa 5 bis 20% (v/v) Bleiche mit oder ohne Tensid wirksam sterilisiert werden, und zwar für eine Zeit, die ausreicht, die Samen oberflächlich zu sterilisieren, beispielsweise etwa 10 min bis etwa 120 min. Die Samen werden dann vorzugsweise 3 mal mit Wasser gewaschen.
Pflanzenorgane, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert werden können, können, ohne darauf beschränkt zu sein, Blätter, Stengel, Wurzeln, Vegetationsknospen, Blütenknospen, Meristeme, Embryonen, Keimblätter, Endosperm, Kelchblätter, Blütenblätter, Stempel, Carpellen, Stamina, Antheren, Pollen, Pollenschläuche, Keimknospen, Fruchtknoten und Früchte sein sowie Abschnitte, Schnitte oder Scheiben, die daraus gewonnen wurden.
Pflanzengewebe, die gemäß der vorliegenden Erfindung kultiviert werden können, schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Kallusgewebe, zerkleinerte Gewebe, Gefäßgewebe, Speichergewebe, Meristemgewebe, Blattgewebe, Sprossgewebe, Wurzelgewebe, Gallengewebe, Pflanzentumorgewebe und reproduktive Gewebe.
Pflanzenzellen, die auf dem Kulturmedium der vorliegenden Erfindung kultiviert werden können, schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein isolierte Zellen mit Zellwänden, Aggregate davon mit unterschiedlichen Größen sowie Protoplasten.
Irgendwelche Pflanzen, Pflanzenorgane, Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen, die in vitro auf dem erfindungsgemäßen Kulturmedium kultiviert wurden, können auf frisches Kulturmedium mit dem chemischen Mittel zu geeigneten Zeitpunkten für ein kontinuierliches Wachstum, eine kontinuierliche Entwicklung oder Differenzierung in vitro übertragen, d.h. subkultiviert, werden.
Die vorliegende Erfindung weist einen zusätzlichen Vorteil dahingehend auf, dass die Subkultivierung von Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen durchgeführt werden kann, ohne dass man Steriltechniken in einem strengen Sinne anwenden muss oder eine sterile Arbeitsumgebung, wie beispielsweise einen Laminarströmungsabzug, verwenden muss.
Die vorliegende Erfindung sieht vor, dass kultivierte Pflanzen, Pflanzenorgane, Pflanzengewebe und Pflanzenzellen von dem Kulturmedium der vorliegenden Erfindung auf Kulturmedium übertragen werden können, das das chemische Mittel nicht umfasst, oder umgekehrt, je nach Anwendungsfall.
Die vorliegende Erfindung sieht ferner vor, dass eine intakte Pflanze oder ein intaktes Pflanzenorgan, die kultiviert, regeneriert oder auf andere Weise auf dem erfindungsgemäßen Kulturmedium gehalten wurden, anschließend aus der in vitro-Gewebekulturumgebung entfernt werden können und auf ein Substrat übertragen werden können, beispielsweise Erde oder Vermikulit, für ein fortgesetztes Wachstum und eine Entwicklung außerhalb der in vitro-Umgebung.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen Kit zur Kultivierung von Samen, Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen auf einem Pflanzengewebe-Kulturmedium bereit, der ein chemisches Mittel in einer Konzentration aufweist, die wirksam ist, eine mikrobielle Kontamination während der gesamten Kulturperiode zu vermindern oder zu verhindern und die eine im wesentlichen normale Keimung von Samen oder ein im wesentlichen normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen ermöglichen, wobei der Kit einen Kulturbehälter umfasst, der ein Pflanzengewebe-Kulturmedium mit dem chemischen Mittel aufweist, in dem das Kulturmedium entweder bereits hergestellt ist, d.h. fertig für eine unmittelbare Verwendung ist, oder dafür bereit ist, durch Zugabe von beispielsweise Wasser hergestellt zu werden. Der Kit umfasst ferner einen oder mehrere Pflanzensamen, die vorzugsweise oberflächensterilisiert wurden, oder eine oder mehrere Pflanzen, Pflanzenorgane, Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen.
Nachdem die Erfindung nunmehr in allgemeiner Form beschrieben wurde, läßt sich diese einfacher unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele verstehen, die zu Illustrationszwecken angeführt werden und nicht einer Beschränkung der vorliegenden Erfindung dienen sollen.
5. BEISPIEL: HEMMEFFEKT DES CHEMISCHEN MITTELS AUF EINE MIKROBIELLE KONTAMINATION
Die folgenden Versuche wurden durchgeführt, um die antimikrobielle Wirkung von zunehmenden Konzentrationen des chemischen Mittels in einem Pflanzengewebe-Kulturmedium zu untersuchen.
Ein Standard-Pflanzenkulturmedium wurde hergestellt, das aus Murashige und Skoog-Mineralsalzen, 2% (w/v) Saccharose, 0,4% (w/v) Gelrite^TM, mit KOH auf einen pH 5,8 eingestellt, bestand und das nachfolgend beschriebene chemische Mittel entweder enthielt oder nicht.
In einem ersten Satz von Versuchen wurde ein chemisches Mittel, das die folgenden Bestandteile umfasste, für die Zugabe zu dem Kulturmedium vor der Autoklaven-Behandlung hergestellt.

Methylchlorisothiazolinon 2,3 g

Methylisothiazolinon 0,7 g

Magnesiumchlorid 23,0 g

Magnesiumnitrat 23,0 g

Kaliumsorbat 20,0 g

Natriumbenzoat 20,0 g

Destilliertes Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 1 l.
Es wurden unterschiedliche Konzentrationen des obigen chemischen Mittels in dem Kulturmedium untersucht, um die optimalen Konzentrationen für eine antimikrobielle Aktivität zu bestimmen. Beispielsweise wurde ein Bereich von Konzentrationen des chemischen Mittels von 0,2 bis 1,0% (v/v) in dem Kulturmedium in 0,1%-Schritten untersucht. Ein Konzentrationsbereich des chemischen Mittels von 0,1 bis 0,2 (v/v) wurde in 0,025%-Schritten untersucht. Schließlich wurde ein Konzentrationsbereich des chemischen Mittels von 0,01 bis 0,1% in dem Kulturmedium in 0,01%-Schritten untersucht.
Nach der Zugabe des chemischen Mittels wurde das Kulturmedium einer Autoklavenbehandlung (15 min, 121 °C) unterzogen, um das Geliermittel aufzulösen. Alle anschließenden Manipulationen erfolgten unter nicht-sterilen Bedingungen. Kulturmedien, die das chemische Mittel enthielten, wurden in nicht-sterile Polystyrolbehälter gegossen, mit nicht-sterilen Deckeln abgedeckt, und man ließ sie verfestigen. Kulturmedium, das das chemische Mittel nicht enthielt, wurde entweder in nicht-sterile Behälter (Kontrolle A) oder in sterile Behälter (Kontrolle B) gegossen, wobei die Behälter mit nicht-sterilen bzw. sterilen Abdeckungen abgedeckt wurden, und man ließ sie verfestigen. Zehn Behälter, die Kulturmedium mit dem chemischen Mittel bei jeder Konzentration enthielten, und zehn Behälter des Kontrollmediums A wurden 7 Tage bei 28 °C in der Dunkelheit inkubiert. Nach einer Woche wurde in keinem Behälter, der Kulturmedium mit dem chemischen Mittel enthielt, irgendeine mikrobielle Kontamination festgestellt. Im Gegensatz dazu war eine mikrobielle Kontamination in allen Kontrollbehältern A zu erkennen, die ein Mittel von 6,5 Kolonien von Pilzen und Bakterien, insgesamt, pro Behälter enthielten.
In einem zweiten Experiment wurden 10 Behälter, die Kulturmedium mit dem chemischen Mittel bei der jeweiligen Konzentration enthielten, sowie 10 Kontrollbehälter B aufgedeckt und der Außenluft für 8 Stunden ausgesetzt. Die Behälter wurden wieder abgedeckt und 7 Tage bei 28 °C in der Dunkelheit inkubiert. In keinem Behälter, der Medium mit dem chemischen Mittel enthielt, war eine mikrobielle Kontamina tion zu erkennen, mit Ausnahme von zwei Behältern, die die niedrigste Konzentration des chemischen Mittels enthielten, d.h. 0,01% (v/v), von denen jeder eine einzelne Pilzkolonie auf der Oberfläche des Mediums enthielt. Im Gegensatz dazu waren alle Kontrollbehälter B kontaminiert, indem sie ein Mittel von 2,5 Kolonien von Pflanzen und Bakterien, insgesamt, pro Behälter enthielten.
Es wurden zusätzliche Versuche durchgeführt, um die Wirksamkeit von verschiedenen Formulierungen des chemischen Mittels zu testen. Es wurde ein erstes chemisches Mittel hergestellt, das alle sechs Bestandteile, die in dem oben formulierten chemischen Mittel verwendet wurden, aufwies, d.h. Methylchlorisothiazolinon, Methylisothiazolinon, Magnesiumchlorid, Magnesiumnitrat, Kaliumsorbat und Natriumbenzoat, jeweils in der gleichen Konzentration wie oben. Es wurde ein zweites chemisches Mittel mit den gleichen Bestandteilen in den gleichen Konzentrationen wie oben hergestellt, dem jedoch Natriumbenzoat fehlte. Es wurde ein drittes chemisches Mittel mit den gleichen Bestandteilen in den gleichen Konzentrationen wie oben hergestellt, dem jedoch Kaliumsorbat fehlte. Es wurde ein viertes chemisches Mittel mit den gleichen Bestandteilen in den gleichen Konzentrationen wie oben hergestellt, dem jedoch sowohl Kaliumsorbat als auch Natriumbenzoat fehlten. Es wurde ein fünftes chemisches Mittel mit nur Kaliumsorbat und Natriumbenzoat in den gleichen Konzentrationen wie oben hergestellt. Es wurde ein sechstes chemisches Mittel mit nur Kaliumsorbat in der gleichen Konzentrat wie oben hergestellt. Es wurde ein siebtes chemisches Mittel mit nur Natriumbenzoat in der gleichen Konzentration wie oben hergestellt.
Pflanzenkulturmedien wurden wie oben hergestellt. Die sieben wie oben hergestellten unterschiedlichen chemischen Mittel wurden in verschiedene Ansätze eines obigen Pflanzenkulturmediums bis zu einer Endkonzentration von 0,035% (v/v) in allen Medien außer den Kontrollmedien eingearbeitet. Alle Pflanzenkulturmedien wurden dann autoklavenbehandelt (121 °C, 15 min). Die Pflanzenkulturmedien mit den unterschiedlichen chemischen Mitteln wurden in jeweils 10 nicht-sterile Polystyrolbehälter gegossen und mit nichtsterilen Deckeln abgedeckt. Ein Kontrollkulturmedium ohne chemisches Mittel wurde ebenfalls wie oben hergestellt. Die Behälter wurden 14 Tage bei 27 °C in der Dunkelheit inkubiert.
Nach der Inkubation zeigten die 10 Behälter mit Kontrollkulturmedium eine Gesamtzahl von 82 mikrobiellen Kolonien (0% wirksam). Kulturmedium mit dem ersten chemischen Mittel (mit allen sechs Bestandteilen) zeigten keine mikrobiellen Kolonien (100% wirksam). Kulturmedium mit dem zweiten chemischen Mittel, dem nur Natriumbenzoat fehlte, zeigte 7 mikrobielle Kolonien (91% wirksam). Kulturmedium mit dem dritten chemischen Mittel, dem nur Kaliumsorbat fehlte, wies 10 mikrobielle Kolonien auf (88% wirksam). Kulturmedium mit dem vierten chemischen Mittel, dem sowohl Kaliumsorbat als auch Natriumbenzoat fehlten, wies 13 mikrobielle Kolonien auf (84% wirksam). Kulturmedium mit dem fünften chemischen Mittel, das nur Kaliumsorbat und Natriumbenzoat aufwies, wiesen 31 mikrobielle Kolonien auf (22% wirksam). Kulturmedium mit dem sechsten chemischen Mittel, das nur Kaliumsorbat aufwies, wies 55 mikrobielle Kolonien auf (33 wirksam). Schließlich wies Kulturmedium mit dem siebten chemischen Mittel, das nur Natriumbenzoat umfasste, 65 mikrobielle Kolonien auf (21% wirksam).
Diese Ergebnisse zeigen, dass verschiedene Formulierungen des chemischen Mittels im Hinblick auf eine Verminderung oder Verhinderung des Wachstums von Bakterien und Pilzen in Pflanzenkulturmedien unter nicht-sterilen Bedingungen wirksam sind. Um jedoch gemäß der vorliegenden Erfindung wirksam zu sein, müssen die Bestandteile Methylchlorisothiazolinon, Methylisothiazolinon, Magnesiumchlorid und Magnesiumnitrat in dem chemischen Mittel enthalten sein.
6. BEISPIEL: WIRKUNG DES CHEMISCHEN MITTELS AUF DIE SAMENKEIMUNG
Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um die Wirkungen von zunehmenden Konzentrationen an chemischem Mittel in einem Pflanzenkulturmedium auf die Samenkeimung und das anschließende Wachstum von Sprossen und Wurzeln zu untersuchen. Das für diese Experimente verwendete chemische Mittel umfasste Methylchlorisothiazolinon, Methylisothiazolinon, Magnesiumchlorid, Magnesiumnitrat, Kaliumsorbat und Natriumbenzoat und war wie oben für den ersten Satz Versuche im Abschnitt 5 beschrieben formuliert und wurde dem Kulturmedium wie oben zugesetzt. Das Kulturmedium wurde dann autoklavenbehandelt (121 °C, 15 min).
Samen von 10 Pflanzenspezies wurden entweder oberflächensterilisiert oder nicht oberflächensterilisiert. Samen, die oberflächensterilisiert werden sollten, wurden in 20–40% (v/v) Haushalts-Bleichlösung für 30 min eingetaucht und dreimal mit normalem, nicht-sterilem Leitungswasser gewaschen. Die Samen wurden dann etwa 1/10 Zoll in verfestigtes Kulturmedium mit dem chemischen Mittel bei der jeweiligen Konzentration eingeschoben. Bei jeder Konzentration des chemischen Mittels wurden 100 Samen für jede Pflanzenspezies getestet. Die Behälter wurden 7 Tage bei 28 °C in der Dunkelheit inkubiert, und dann auf sowohl mikrobielle Kontamination als auch den Prozentsatz der Samenkeimung gescreent.
Was die mikrobielle Kontamination angeht, erschienen bei Konzentrationen des chemischen Mittels von 0,4% (v/v) und weniger Kolonien von Bakterien und Pilzen auf etwa 86% der Samen, die nicht oberflächensterilisiert waren, während oberflächensterilisierte Samen bei allen Konzentrationen frei von irgendeiner mikrobiellen Kontamination blieben.
Die Wirkung der Konzentration des chemischen Mittels auf den Prozentsatz der Samenkeimung variierte mit der Pflanzenspezies. Beispielsweise keimten oberflächensterilisierte Gurkensamen bei einer 1,0% (v/v)-Konzentration des chemischen Mittels zu einem hohen Prozentsatz (72%), während die Keimung von oberflächensterilisierten Lotussamen dramatisch vermindert war (5%) (Tabelle 1). Der Prozentsatz der Keimung von oberflächensterilisierten Samen blieb für alle Spezies (>50%) bei Konzentrationen des chemischen Mittels bis zu und einschließlich 0,2% (v/v) hoch.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe des chemischen Mittels zu dem Kulturmedium bis zu einer Konzentration von 0,2% (v/v) eine im wesentlichen normale Samenkeimung für alle untersuchten Spezies gestattete, dass jedoch einige Spezies, z.B. Gurke, Trichterwinde, Springkraut usw. eine im wesentlichen normale Keimung bis zu einer Konzentration des chemischen Mittels im Medium von 1,0% (v/v) zeigten. Zusätzlich zeigen diese Ergebnisse, dass eine Oberflächensterilisation von Samen bevorzugt ist, damit das chemische Mittel in dem Kulturmedium seine optimale Wirkung auf die Verminderung oder Verhinderung einer mikrobiellen Kontamination von Pflanzengewebekulturen entwickelt, und zwar aufgrund der hohen Dichte von Bakterien- und Pilzsporen, die normalerweise auf den Samen der meisten Pflanzenspezies vorhanden sind.
Es ist bemerkenswert, dass Samen, die nicht oberflächensterilisiert waren, im allgemeinen einen höheren Prozentsatz von Keimung zeigten, als Samen der gleichen Spezies, die oberflächensterilisiert waren (Tabelle 1). Dieser Unterschied war deutlicher in Medien mit Konzentrationen des chemischen Mittels von 0,2% (v/v) und höher, und kann das Ergebnis der Bleichung sein, die die Samenhülle durchlässiger macht, wodurch der Samen gegenüber dem chemischen Mittel empfindlicher wird.
Im Hinblick auf das anschließende Wachstum von Sprossen und Wurzeln aus den keimenden Samen wuchsen für alle Spezies bei Konzentrationen des chemischen Mittels von 0,3% (v/v) und höher entweder keine Wurzeln aus den keimenden Samen, oder die Wurzeln, die wuchsen, waren in ihrem Wachstum und ihrer Entwicklung eingeschränkt (Tabelle 2). Ein normales Wachstum und eine normale Entwicklung von sowohl Sprossen als auch Wurzeln wurden für alle Pflanzenspezies in Kulturmedien beobachtet, die eine Konzentration des chemischen Mittels von 0,05% oder weniger enthielten.
Diese Ergebnisse zeigen, dass während eine Konzentration von 0,05% (v/v) des chemischen Mittels oder weniger in dem Kulturmedium ein im wesentlichen normales Wachstum und ein im wesentlichen normale Entwicklung von Sprossen und Wurzeln bei allen untersuchten Spezies ermöglichte, einige Spezies, z.B. Gurke und Kohl, im wesentlichen normale Sprossen und Wurzeln in Kulturmedium liefern, das das chemische Mittel in einer Konzentration bis zu 0,2% (v/v) enthielt. Wie oben im Abschnitt 4 beschrieben wurde, kann die optimale Konzentration des chemischen Mittels für andere Pflanzenspezies empirisch und ohne unzumutbaren Versuchsaufwand bestimmt werden.
7. BEISPIEL: WIRKUNG DES CHEMISCHEN MITTELS AUF DIE ORGANBILDUNG AUS KALLUSGEWEBE
Die folgenden Versuche wurde durchgeführt, um die Wirkungen von steigenden Konzentrationen des chemischen Mittels in Kulturmedien auf die Organbildung aus Kallusgewebe zu untersuchen. Das für diese Experimente verwendete chemische Mittel umfasste Methylchlorisothiazolinon, Methylisothiazolinon, Magnesiumchlorid, Magnesiumnitrat, Kaliumsorbat und Natriumbenzoat, formuliert wie oben.
Auberginenblätter (cv. Black Beauty) von Pflanzen, die in vitro gezüchtet worden waren, wurden in kleine Quadrate (etwa 1 × 1 cm) geschnitten und zwar unter Anwendung von Steriltechniken. Zehn Blattquadrate wurden auf Kulturmedium mit Murashige und Skoog Mineralsalzen, Vitaminen, einschließlich Thiamin, Pyridoxin und Nikotinsäure, 3 Saccharose (w/v), 2 mg/l Naphthalinessigsäure (NAA) und 0,8% Agar (w/v) (Kontrollmedium) bei pH 5,8 inkubiert, wobei das Medium vor der Verwendung einer Autoklaven-Behandlung unterzogen worden war (121 °C, 15 min). Zehn Blattquadrate wurden jeweils auf dem gleichen Typ von Kulturmedium wie oben inkubiert, das jedoch außerdem entweder 0,03% oder 0,04% (v/v) des chemischen Mittels aufwies. Die Kulturen wurden in der Dunkelheit bei 27 °C inkubiert. Nach 30–40 Tagen hatten sich etwa 50 mg weißes Kallusgewebe auf allen Blattquadraten auf allen Medien vermehrt.
Das Kallusgewebe wurde von jeden der Blattquadrate getrennt und auf frischen Kulturmedien, die wie oben hergestellt worden waren, subkultiviert, außer dass NAA durch trans-Zeatin (2 mg/l) ersetzt wurde. Die Kallusgewebe wurden bei 27 °C mit einer Lichtbehandlung von 10.000 ft-candles für 10 Stunden pro Tag unterzogen. Nach 37 Tagen regenerierten die Kallusgewebe auf allen Medien im Mittel 28 Sprossen pro Kallusgewebe. Die Sprossen wurden von dem Kallusgewebe getrennt und in frisches Kulturmedium eingesetzt, das wie oben hergestellt worden war, dem jedoch alle Phytohormone fehlten. Alle Sprossen führten zu einer Regeneration von Wurzeln auf allen Kulturmedien.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe einer antimikrobiell wirksamen Konzentration an chemischem Mittel zu dem Kulturmedium die Kallusbildung, Kallusvermehrung oder Pflanzenregeneration nicht negativ beeinträchtigte.
Während die vorliegende Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen beschrieben wurde, versteht es sich, dass sie weiteren Modifikationen unterzogen werden kann. Diese Anmeldung soll irgendwelche Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung abdecken, die im allgemeinen den Prinzipien der Erfindung folgen und soll solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung beinhalten, zu denen es bei einer bekannten oder üblichen Praxis auf dem Fachgebiet, auf das sich die Erfindung bezieht, kommt, und wie sie auf die wesentlichen oben beschriebenen Merkmale angewandt werden können, wie es sich aus dem Bereich der beigefügten Ansprüche ergibt.

Claims

Pflanzengewebe-Kulturmedium, das ein chemisches Mittel aufweist, wobei dieses chemische Mittel umfaßt: Methylchlorisothiazolinon in einem Konzentrationsbereich von etwa 2,0 bis etwa 2,6 g/l; Methylisothiazolinon in einem Konzentrationsbereich von etwa 0,6 bis etwa 0,8 g/l; Magnesiumchlorid in einem Konzentrationsbereich von etwa 15,0 bis etwa 30,0 g/l; und Magnesiumnitrat in einem Konzentrationsbereich von etwa 15,0 bis etwa 30,0 g/l; wobei das chemische Mittel in einem Konzentrationsbereich von etwa 0,01% (v/v) bis etwa 0,20% (v/v) vorhanden ist, um eine mikrobielle Kontamination des Pflanzengewebe-Kulturmediums zu vermindern oder zu verhindern und eine im wesentlichen normale Keimung der Samen oder ein im wesentlichen normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zu ermöglichen.
Pflanzengewebe-Kulturmedium gemäß Anspruch 1, wobei das chemische Mittel außerdem Kaliumsorbat in einem Konzentrationsbereich von etwa 15 bis etwa 25 g/l umfaßt.
Pflanzengewebe-Kulturmedium gemäß Anspruch 1, wobei das chemische Mittel außerdem Natriumbenzoat in einem Konzentrationsbereich von etwa 13 bis etwa 27 g/l umfaßt.
Pflanzengewebe-Kulturmedium gemäß Anspruch 1, wobei das chemische Mittel außerdem Kaliumsorbat in einem Konzentrationsbereich von etwa 15 bis etwa 25 g/l und Natriumbenzoat in einem Konzentrationsbereich von etwa 13 bis etwa 27 g/l umfaßt.
Pflanzengewebe-Kulturmedium gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, wobei das chemische Mittel im Pflanzengewebe-Kulturmedium in einem Konzentrationsbereich von etwa 0,02% (v/v) bis etwa 0,10% (v/v) vorhanden ist.
Pflanzengewebe-Kulturmedium gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, wobei das chemische Mittel im Pflanzengewebe-Kulturmedium in einem Konzentrationsbereich von etwa 0,03% (v/v) bis etwa 0,05% (v/v) vorhanden ist.
Kit für die Keimung eines Pflanzensamens oder die Kultivierung einer Pflanze, eines Pflanzenorgans, Pflanzengewebes oder einer Pflanzenzelle in vitro, wobei der Kit umfaßt: (a) einen Kulturbehälter; (b) einen Pflanzensamen, eine Pflanze, ein Pflanzengewebe, ein Pflanzenorgan oder eine Pflanzenzelle; und (c) das Pflanzengewebe-Kulturmedium gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 oder 6.
Kit gemäß Anspruch 7, wobei der Samen, die Pflanze, das Pflanzenorgan, das Pflanzengewebe oder die Pflanzenzelle von einer Pflanzenart stammen, die aus einer Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Gurke, Trichterwinde, Springkraut, Paprika, Aubergine, Ringelblume, Lotosblume, Kohl, Gänseblümchen und Nelke.
Verfahren zur Verminderung oder Verhinderung einer mikrobiellen Kontamination in einem Pflanzengewebe-Kulturmedium, das die Zugabe des chemischen Mittels von Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 zu dem Pflanzengewebe-Kulturmedium umfaßt.
Pflanzengewebe-Kulturmedium gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, wobei das Medium eine Flüssigkeit ist.
Pflanzengewebe-Kulturmedium gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, wobei das Medium ein Feststoff ist.
Pflanzengewebe-Kulturmedium gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, wobei das Medium ein Gel ist.
Verfahren zur Kultivierung eines Pflanzensamens, einer ganzen Pflanze, eines isolierten Pflanzenorgans, Pflanzengewebes oder einer Pflanzenzelle, das das Kultivieren des Pflanzensamens, der ganzen Pflanze, des isolierten Pflanzenorgans, Pflanzengewebes oder der Pflanzenzelle in dem Pflanzengewebe-Kulturmedium nach irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, das außerdem vor der Kultivierungsstufe eine Stufe der Oberflächensterilisierung des Pflanzensamens, der ganzen Pflanze, des isolierten Pflanzenorgans, Pflanzengewebes oder der Pflanzenzelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Oberflächensterilisierung das Eintauchen der Pflanze, des isolierten Pflanzenorgans, des Pflanzengewebes oder der Pflanzenzelle in eine Lösung umfasst, die etwa 5% bis 20% (v/v) Bleichmittel umfasst.
Verfahren zur Kultivierung eines Pflanzensamens, einer ganzen Pflanze, eines isolierten Pflanzenorgans, Pflanzengewebes oder einer Pflanzenzelle, das das Aufbewahren des Pflanzensamens, der ganzen Pflanze, des isolierten Pflanzenorgans, Pflanzengewebes oder der Pflanzenzelle in dem Pflanzengewebe-Kulturmedium nach irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 13–16, wobei das Pflanzenorgan ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Blättern, Stengeln, Wurzeln, Vegetationsknospen, Blütenknospen, Meristemen, Embryonen, Keimblättern, Endosperm, Kelchblättern, Blütenblättern, Stempeln, Carpellen, Stamina, Antheren, Pollen, Pollenschläuchen, Keimknospen, Fruchtknoten und Früchten sowie Abschnitten, Schnitten oder Scheiben, die daraus gewonnen wurden.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 13–16, wobei das Pflanzengewebe aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Kallusgeweben, zerkleinerten Geweben, Gefäßgeweben, Speichergeweben, Meristemgeweben, Blattgeweben, Sprossgeweben, Wurzelgeweben, Gallengeweben, Pflanzentumorgeweben und reproduktiven Geweben.