CN1193344A - 防止植物组织培养基微生物污染的组合物和方法 - Google Patents

防止植物组织培养基微生物污染的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1193344A
CN1193344A CN96196050A CN96196050A CN1193344A CN 1193344 A CN1193344 A CN 1193344A CN 96196050 A CN96196050 A CN 96196050A CN 96196050 A CN96196050 A CN 96196050A CN 1193344 A CN1193344 A CN 1193344A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
plant tissue
chemical reagent
tissue culture
culture media
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN96196050A
Other languages
English (en)
Inventor
A·Z·古里
K·N·帕特尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
PANT CELL TECHNOLOGY Inc
Original Assignee
PANT CELL TECHNOLOGY Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by PANT CELL TECHNOLOGY Inc filed Critical PANT CELL TECHNOLOGY Inc
Publication of CN1193344A publication Critical patent/CN1193344A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明包括减少或防止植物组织培养基中微生物生长的组合物和方法,包括在植物组织培养基中加入一种化学试剂,该化学试剂含有甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、氯化镁和硝酸镁,其浓度可以有效减少或防止该植物组织培养基的微生物污染,使种子基本正常发芽或使植物、植物器官、植物组织或植物细胞基本正常生长或发育。该化学试剂可以另外含有山梨酸钾或苯甲酸钠、或含二者俱有。本发明还提供一种在一种含该化学试剂的植物组织培养基上萌发植物种子或培养植物、植物器官、植物组织或植物细胞的药盒。

Description

防止植物组织培养基微生物污染的组合物和方法
                  1.发明领域
本发明涉及在通常需要保持无菌条件的植物组织培养的培养基中防止或抑制微生物生长的组合物和方法。在培养基中使用了特殊的化学试剂，其浓度减少或防止微生物污染，但基本保证种子正常发芽或植物、植物器官、植物组织或植物细胞的正常生长或发育。公开的组合物和方法不仅有益于植物组织培养和植物分子生物学研究者，而且有益于植物育种和植物营养工作者，并可用于多种商业用途。
                  2.背景技术
               2.1体外植物培养系统
植物生长和发育是有巨大科学、教育和商业意义的基础生物学过程。通过种子发芽和在各种类型培养基上体外无菌培养进行全植株、植物器官、植物组织和植物细胞的繁殖，可以观察和操作这些生物学过程。
体外培养植物的技术已经成熟。参见例如Thorpe，T.A.(ed.)植物组织培养：农业中的方法和应用，Academic Press，Inc.，NewYork(1981)；Evans等(ed.)植物细胞培养手册，Vol.1，MacMillanPublishing Co.，New York，London，(1983)；和Dixon，R.A.(ed.)植物细胞培养：实用入门，IRL Press，Oxford，Washington DC(1985)。
为了植物的正常生长和发育，体外生长的植物至少需要一含基本无机盐的培养基。参见例如Salisbury，F.B.和Ross，C.W.植物生理学，3d.Ed.，Wadsworth Publishing Co.(1985)。另外，培养的植物组织和细胞通常需要植物激素、维生素和一种或多种单糖的各种组合物。参见Thorpe，supra。
不幸的是，这种培养基也是可以支持细菌和真菌快速生长的丰富营养混合物。一旦这些污染物在培养中确立，它们通常就快速生长，消耗培养基的营养并产生能影响培养的植物组织生长并最终杀死这些组织的毒素。
因此，采用无菌操作技术是所有体外植物组织培养操作的一项严格要求。例如，准备和保持标准组织培养系统要求用加热或过滤灭菌培养基、灭菌培养容器、对要培养的种子和植物组织表面灭菌、灭菌任何用于操作或处理植物组织的仪器。另外，任何对该植物组织的后续操作通常都必须在过滤空气环境例如层流罩内进行。
尽管熟练的技术员最严格地使用无菌技术，但是植物组织培养污染依然不断发生，能造成少量培养的损失直至整批培养基和组织培养的灾难性的损失。细菌和真菌污染是在整个培养期间持续威胁植物组织培养的伺机为害的过程。尽管植物组织培养开始时可以是无菌的，但微生物常常在后续组织培养操作的任何时刻都可以污染培养物。因此，提供一种减少或防止植物组织培养基微生物污染并在培养期间保持培养基无菌的化学试剂是有益处的。
                 2.2.植物组织培养中的抗菌剂
在植物组织培养中已试验了各种类型抗菌化学试剂。已广泛地测试抗菌素在植物培养中抑制或防止细菌生长的能力。然而，使用抗菌素有一定限制。例如，抗菌素比较贵，仅对细菌有效而对真菌无效，抗菌谱一般较窄，通常不耐热，一般能毒害植物或能改变培养植物的行为。
例如，Phillips，R.等，Plant Sci.Lett.，21：235-240(1981)描述了六种抗菌素(即青霉素G、phosphomycin，氯霉素，链霉素，利福平，萘啶酮酸)在洋姜(Helianthus tuberosus)培养中防止细菌感染的试验。只有利福平能在不影响培养的分离块的细胞分裂、细胞分化或DNA合成速率的情况下控制细菌污染。但是，利福平触发了蛋白合成的增加。
Pullock，K.等Plant Cell Reports，2：36-39(1983)描述了超过20种不同抗菌素对原生质体来源的Nicotiana plumbaginifolia细胞平板效率的毒性。β-内酰胺类即青霉素和先锋霉素对细胞平板效率几乎没有可观察到的毒性效果，这些抗菌素刺激了植物细胞菌落的生长。正好相反，氨基糖苷类，例如链霉素和卡那霉素，对植物细胞有明确的毒性。红霉素对植物细胞相对无毒，而四环素在长期毒性试验中有强抑制性。
Gilbert，J.E.等，Ann.Appl.Biol.，119：113-120(1991)描述了在马铃薯细胞培养中用抗菌素控制潜伏细菌污染。测试了两种不同的抗菌素组合物，或者是青霉素、链霉素和两性霉素或者是红霉素、链霉素和羧苄青霉素。当把每种组合加入用于培养微小植物(microplantlet)的培养基中时，都减缓植物生长并在高浓度时诱导萎黄病。这些混合物不仅具植物毒性，而且不能消除污染。不过，当把前一种抗菌素混合物加入用来制备原生质体的酶介质时，明显地消除了污染。
除抗菌素之外，测试了化学杀生物剂在植物培养中抑制或防止微生物污染的能力。
例如，Macek，T.等，Biotechnology Techniques，8(12)：885-888(1994)描述了用二碳酸二乙酯(DPC)对植物细胞培养的营养培养基进行化学灭菌。DPC杀死了所有的污染微生物而不改变培养植物细胞的生长特性。然而，由于DPC在与水接触几小时内分解成乙醇和二氧化碳，DPC不能在整个培养期间保持植物细胞培养无菌。
日本专利No.4-311326公开了一种在仙客来属植物组织培养中消除真菌污染的方法，包括把仙客来属植物组织切片在含有咪唑或三唑杀真菌剂中浸渍或在含有该杀真菌剂的培养基上培养组织切片。但是，这种处理不能用于抑制细菌污染。
日本专利No.4-63589公开了在植物组织培养中用异硫氢酸丙烯酯(CH2＝CHCH2N＝C＝S)做灭菌剂，其中该化学试剂免除了高压灭菌的需要，并且在香石竹植物的组织培养中没有观察到异常。
已经测试了抗菌素和化学杀生物剂的组合物在植物培养中抑制微生物污染的能力。
例如，Francko，D.A.，Aquatic Botany，26：113-117(1986)描述了在试图从水生植物Nelumbo lutea(Willd.)种子获得无菌植物中使用抗菌素(青霉素G和硫酸链霉素)与杀真菌剂(克菌丹)的组合。试验表明，当孵化培养基含有这些药剂时，约一半的种子培养物在生长2周后检测不到污染物。但是，转移到不含抗菌素和杀真菌剂的新鲜培养基4周后，只有11％的原始培养物保持无菌。
Haldeman，J.H.等，Hortscience，22(2)：306-307(1987)描述了在田间生长的山茶植物根尖分离块培养中使用杀真菌剂(苯菌灵)和抗菌素(利福平)的组合物，作为控制持续的真菌和细菌污染的处理。在漂白剂溶液中进行标准去感染处理之后用此混合物处理根尖24小时显著地减少了污染，但不能消除污染。
Kneifel，W.和Leonhardt，W.，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，29：139-144(1992)描述了抗菌素和化学杀生物剂的不同组合物抵抗从植物组织培养物中分离的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的测试。发现ImipenemTM(单水合N-亚胺甲基-thienanycin；Merck，USA)和氨苄青霉素的混合物、ImipenenTM和青霉素G的混合物最有效地抑制细菌污染，对生长速率或根生长无明显影响且对叶绿素无明显损伤。但是，IMIPENEMTM和KATHONTM(5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮；Rohm&Haas，奥地利)的混合物导致测试的2个植物种的根生长减慢。
在本领域里已认识到多种其它各种化学药品具一般的防腐或杀生物活性。其中在本发明中有用的四种化学药品是山梨酸钾、苯甲酸钠、甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮。
The Merck Index(10th Ed.，1983，Entry No.7555)把山梨酸钾列为霉菌和酵母菌的抑制剂，把苯甲酸钠(Entry No.8413)列为防腐剂，特别是食品防腐剂。Ryu，D.和Holt，D.L.，J.Food Protection，56(10)：862-867(1993)证实山梨酸钾抑制扩展青霉在真菌培养和苹果上的生长。Hall，D.J.，Proc.Fla.State Hort.Soc.，101：184-187(1988)证实山梨酸钾和苯甲酸钠做为柑桔类收获后的杀真菌剂都有效。Idise，O.E.和Izuagbe，Microbios Lett.，28：117-121(1985)证实苯甲酸钠有效地抑制细菌和酵母菌在瓶装棕榈酒内的生长。Sodeko，O.O.等，Microbios，51：133-143(1987)证实苯甲酸钠有效地在橙汁中抑制细菌和真菌。授予Biggs的美国专利No.3,122,432公开了一种保存切花的组合物，其中包括几种组分，包括被描述为发酵和霉菌抑制剂的苯甲酸钠。
甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮与做为稳定剂的镁盐一起，组成了杀生物剂KATHONTM CG(Rohm&Haas，USA)，该杀生物剂广泛用于许多化妆品、油漆、空调器等。Gruvberger，B.等，Contact Dermatitis，15：24-27(1986)描述了检测化妆品中KATHONTMCG的色谱法。Haack，T.K.和Warwick，E.F.，在杀虫剂配方和应用系统，Devisetty，D.G.等(eds)，Am.Soc.Testing and Materials，Philadelphia(1993)，第105-115页中提供了关于农业防腐剂LegendMKTM的数据，它是甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮的一种不同的商业实施方案，在该文章中被描述为一种用于流动型水溶液杀虫剂配方的有效抗菌剂。Green，P.N.，Lett.Appl.Microbiol.，17：158-161(1993)证明在所测试的五种杀生物剂中，甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮的混合物对实验室产生的Legionella bozemanii微生物生物膜非常有效。Chapman，J.S.，Am.Clin.Lab.，第13-14页，(1994年8月)描述了以ProClinTM(Rohm&Haas，由Supelco.Inc.分销)出售的甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮的混合物的第三种商业实施方案，该混合物对至少14个不同种的革兰氏阴性细菌、9个不同种的革兰氏阳性细菌和18个不同种的真菌高效广谱抗菌。
另外，授予Lewis的美国专利No.3,523,121、3,761,488、4,105,431、4,243,403、4,252,694、4,265,899和4,279,762公开了新的异噻唑酮，它们在广泛的应用范围内(包括肥皂、去污剂、涂料、化妆品、切消油和做为种植在土壤里的种子的杀真菌剂)对广谱的微生物(包括细菌、藻类和真菌)有杀生物剂活性。
另外，授予Borovian的美国专利No.4,454,146、4,499,071、4,540,570和4,555,400公开了抑制微生物生长的协同防腐组合物，该组合物包括至少2种组分，其中第一种组分选自一种或多种传统防腐剂(包括苯甲酸、山梨酸和甲基氯异噻唑啉酮与甲基异噻唑啉酮的混合物)，定义为多环化合物的第二种组分与第一种组分组合时，协同杀死或抑制微生物。
最后，授予Hsu的美国专利No.5,028,620和5,100,905公开了一种具较低致敏潜力的协同杀生物剂组合物，其第一种组分是浓度范围为1.2-25.4％的甲基氯异噻唑啉酮，其第二种组分是浓度范围为74.6-98.8％的甲基异噻唑啉酮。
尽管已知这四种组分(即山梨酸钾，苯甲酸钠，甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮)有防腐或杀生物剂活性，但本领域没有建议这些化学药品或其任意组合物能在植物组织培养中用于减少或防止微生物污染而对植物组织无负面影响。事实上，Kneifel，W.和Leonhardt，W.，supra的关于在IMIPENEMTM和KATHONTM的混合物上根生长减缓的报告指出不要在植物组织培养中使用含KATHONTM的试剂。
提供可加入植物组织培养基的其它化学药品是有益的，这些化学试剂应当在整个培养期间减少防止细菌和真菌污染，并基本保证种子正常发芽或培养的种子、植物、植物器官、植物组织或植物细胞的正常生长或发育。
                    3.发明概述
本发明的一个目的是提供在整个培养期间减少或防止体外植物组织培养的微生物污染的组合物和方法。通过在植物组织培养基中加入一种化学试剂可以实现该目的，该化学试剂的浓度可以有效减少或防止细菌和真菌生长，并基本保证种子正常发芽或植物、植物器官、植物组织或植物细胞的正常生长或发育。
本发明的另一个目的是提供一种含一种化学试剂的植物组织培养基，该化学试剂的浓度可以在整个培养期间减少或防止微生物污染，并基本保证种子正常发芽或植物、植物器官、植物组织或植物细胞的正常生长或发育。
本发明的另一个目的是提供一种在一种含一种化学试剂的植物组织培养基上培养种子、植物、植物器官、植物组织或植物细胞的药盒，该化学试剂的浓度在整个培养期间减少或防止微生物污染并基本保证种子正常发芽或植物、植物器官、植物组织或植物细胞的正常生长或发育，该药盒包括装有含该化学试剂的植物组织培养基的容器，其中该培养基或者已制备完毕即立即可用，或者易于制备例如加水即可。另外，该药盒包括一个或多个最好已表面灭菌的植物种子、或一个或多个植物、植物器官、植物组织或植物细胞。
                  4.本发明详细说明
本发明提供在整个培养期间减少或防止体外植物组织培养的微生物污染的组合物和方法。在植物组织培养基中加入一种化学试剂，其浓度可以有效减少或防止细菌和真菌生长，并基本保证种子正常发芽或植物、植物器官、植物组织或植物细胞的正常生长或发育。
用于实施本发明的化学试剂优选包括甲基氯异噻唑啉酮(5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)、甲基异噻唑啉酮(2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)，氯化镁和硝酸镁的混合物。该化学试剂更优选包括甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮，氯化镁、硝酸镁、和山梨酸钾或苯甲酸钠的混合物。该化学试剂最优选包括甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮，氯化镁、硝酸镁、山梨酸钾和苯甲酸钠的混合物。
本发明人意外地发现这些化学药品的组合物在一特定浓度范围内有效地在组织培养期间减少或防止植物组织培养的微生物污染，而且基本保证种子正常发芽或植物、植物器官、植物组织或植物细胞的正常生长或发育。
组成该化学试剂的各组分的相对浓度可以变化，以制备对任何植物培养基、植物种、植物种子、植物、植物器官、植物组织或植物细胞最有效的实施本发明的混合物。然而，该化学试剂优选的组分混合物包含：浓度范围约2.0-2.6g/l的甲基氯异噻唑啉酮；浓度范围约0.6-0.8g/l的甲基异噻唑啉酮；浓度范围约15.0-30g/l的氯化镁；浓度范围约15.0-30g/l的硝酸镁。
该化学试剂中更优选的组分混合物另外还包含：浓度范围约15-25g/l的山梨酸钾或浓度范围约13-27g/l的苯甲酸钠。
该化学试剂中最优选的组分混合物另外还包含：浓度范围约15-25g/l的山梨酸钾和浓度范围约13-27g/l的苯甲酸钠。
在所有情况下，用能溶解这些组分的液体、优选为水、最优选为蒸馏水或去离子水将该化学试剂的组分混合制成该化学试剂贮液。
在本申请中所用的“植物组织培养”或“培养植物组织”是指在体外进行的任何过程，其中在限定或非限定培养基上进行种子发芽或植物、植物器官、植物组织或植物细胞繁殖、分化、继代培养或其它保持，该过程通常在无菌的(同义词：防腐的、无污染的)条件下保持(即无微生物污染)，一般在控制环境条件下培养。
在本申请中所用的“微生物污染”是指在植物组织培养中的任何不需要的微生物(例如细菌或真菌)的生长。
在本申请中所用的“植物组织培养基”、“植物培养基”、“培养基”和“培养基”是指固体基质或液体溶液，它保持在无菌条件下即基本上没有微生物污染，在其中可以进行种子发芽、植物保持或生长、分离植物器官或植物组织的保持、繁殖或分化、一个或多个分离植物细胞、植物细胞团聚体或植物细胞原生质体的保持、繁殖或分化。
另外，“植物组织培养基”、“植物培养基”、“培养基”和“培养基”是指含有适当的无机盐混合物的水。另外，培养基可以含有适当浓度的植物激素(包括例如植物生长素、细胞分裂素或赤霉素)、维生素(例如一种或多种B族维生素)、一种或多种碳源(包括例如蔗糖或葡萄糖)和一种或多种非限定生长促进剂(例如椰乳)。无机盐混合物的组分可以根据繁殖的特定植物种的需要进行选择和制备。无机盐混合物的适当组合物可以或者根据经验确定，或者从植物组织培养领域的已知无机盐组合物进行选择并据此制备。另一方法是，从任何市售混合物中选择(例如Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.的产品)。可以用于实施本发明的无机盐混合物包括，例如，Hoagland基础盐混合物(basal salt mixture)、Gamborg B-5基础盐混合物、Heller基础盐混合物、Murashige and Skoog基础盐混合物、Nitsch and Nitsch基础盐混合物、White基础盐混合物及其变化品种。另外，本领域已知的各种常量养料、微量养料和维生素组分可变化组合制备适合繁殖的植物种的培养基。
根据本发明的方法，将该化学试剂加入植物组织培养基中，其浓度可以有效减少或防止细菌或真菌或细菌和真菌生长，并基本保证种子正常发芽或在培养基上培养的植物、植物器官、植物组织或植物细胞的正常生长或发育。
正如在本发明中使用的，如果将化学试剂加入植物组织培养基，其浓度基本保证种子正常发芽或植物、植物器官、植物组织或植物细胞的正常生长或发育，同时与没有该化学试剂的对照培养基相比减少至少80％的细菌或真菌污染，则该化学试剂能有效地减少或防止植物组织培养中的微生物生长。
根据本发明，种子基本正常发芽定义为发芽率是在不含该化学试剂的对照培养基上发芽率的至少50％。
根据本发明，植物、植物器官、植物组织或植物细胞的基本正常生长定义为该植物、植物器官、植物组织或植物细胞的生长速率或细胞分裂速率是在不含该化学试剂的对照培养基上相应植物、植物器官、植物组织或植物细胞的生长速率或细胞分裂速率的至少50％。
根据本发明，植物、植物器官、植物组织或植物细胞的基本正常发育定义为该植物、植物器官、植物组织或植物细胞的一个或多个发育现象的发生与在不含该化学试剂的对照培养基上相应植物、植物器官、植物组织或植物细胞的发育现象的发生基本相同。
一般来说，对本发明的方法有用的化学试剂在培养基中的一个浓度范围是有效的，该浓度范围保证在其上培养的种子基本正常发芽或植物、植物器官、植物组织或植物细胞的基本正常生长或发育时。培养基中该化学试剂优选的浓度范围是约0.01％-0.20％(v/v)。培养基中该化学试剂更优选的浓度范围是约0.02％-0.10％(v/v)。培养基中该化学试剂最优选的浓度范围是约0.03％-0.05％(v/v)。
对于那些上述浓度范围不适用的任何物种的植物种子、植物、植物器官、植物组织或植物细胞，可以根据经验确定要求保护方法使用的培养基内该化学试剂的最有效浓度，即将所述种子、植物、植物器官、植物组织或植物细胞在含有一浓度范围之该化学试剂的植物组织培养基中生长，选择一个或多个浓度，在该浓度时可以减少或防止微生物污染、而保证种子基本正常发芽或植物、植物器官、植物组织或植物细胞的基本正常生长或发育。可以将种子发芽、植物、植物器官、植物组织或植物细胞繁殖的标准技术与该领域技术人员已知的常规筛选技术结合使用、不用过度试验即可进行这种经验确定。
例如，按照本领域已知的植物组织培养基的任何标准配方，可以制备植物组织培养基，其中加入欲筛选浓度范围的该化学试剂、及不加入该化学试剂(对照)。将植物种子“植入”这些培养基中，适当地培养，于充足时间后检查以测定发芽率。另外，借助于任何形态学、解剖学或生物化学特征鉴定，通过比较含该化学试剂的培养基上发芽的种子和不含该化学试剂的对照培养基上发芽的种子可以评价发芽种子的根和苗的生长和发育。
熟练的技术员知道并能够用各种有用的形态学、解剖学、生理学和生物化学分析测定化学试剂对植物生长的影响。形态学分析可以包括例如比较根、苗、叶或生殖器官、或其部位的形状、大小或数量。解剖学分析例如可以包括比较分析细胞的大小、形状、模式或分化，例如维管组织、毛状体或气孔的数量、位置或成熟度、或是否存在活跃分裂的分生组织。生理学分析可以包括例如呼吸、光合作用、气孔阻力或乙烯产生速率的比较分析。生物化学分析可以包括例如比较分析蛋白质或DNA合成、叶绿素降解或其它色素的存在与否或数量。所有这些熟练技术员已知的试验的一种或多种可以用于经验确定对一特定植物种实施本发明方法的植物组织培养基中该化学试剂的最佳浓度。
一旦确定了实施本发明方法的该化学试剂的最佳浓度，将其加入一培养基中，此后该培养基可以液态使用于液体培养(包括例如细胞悬浮培养或原生质体培养)、或加入胶凝剂将其固化。然而，该培养基通常用适当的酸性或碱性溶液例如盐酸(HCl)或氢氧化钾(KOH)调节至适当的pH，例如pH5.8。
在那些培养基要固化的情况下，可在培养基中加入适当浓度范围[gellan胶为0.2％-0.3％(w/v)]的胶凝剂，例如PHYTAGELTM gellan胶(Sigma Chemical Co.)。然后必须对该培养基充分加热例如高压灭菌以溶解胶凝剂。然而，该化学试剂的存在使得高压灭菌的灭菌目的不必要。
含该化学试剂的培养基的抗微生物活性不因高压灭菌(121℃，15分钟)而减弱。另外，本发明人发现与未高压灭菌的含该化学试剂的同样培养基相比，已高压灭菌的含该化学试剂的植物培养基对植物种子发芽或对植物、植物器官、植物组织或植物细胞的生长或发育的抑制较小。但这并不意味着实施本发明必需高压灭菌，仅意味着在某些未对培养基高压灭菌的情况下用于实施本发明的培养基中化学试剂的浓度范围可以减少。
高压灭菌后，将含化学试剂和溶解的胶凝剂的培养基转移至本领域使用的任何类型的各个培养容器中，使培养基冷却和固化。
该化学试剂的另一个优点是，当不需要用高压灭菌溶解胶凝剂时，就不再需要对培养基的不耐热组分(如维生素和糖)进行过滤灭菌。由此制备的培养基可以储存较长时间或立即使用。
各批培养基可以细分转移至本领域使用的一个或多个培养容器，包括烧瓶、烧杯、方边容器、螺口瓶、培养管或其它可用于培养种子、植物、植物器官、植物组织或植物细胞的任何容器。培养容器可由玻璃(包括例如硼硅玻璃或钠玻璃)制成，也可用塑料(包括例如透明的聚苯乙烯或聚丙烯)制成。一般来说，培养容器应干净，即无纤维屑、无尘或无化学残留物；不过，在培养基中加入该化学试剂使得不需要用热、辐射或其它化学措施对这些培养容器灭菌。
任何植物种子、全植株、分离的植物器官、植物组织或植物细胞都可以在含该化学试剂的植物组织培养基中培养。例如，任何植物种的种子都可以在本发明的培养基中发芽。这些种子可以来自双子叶植物、单子叶植物或裸子植物的任何物种，包括生长为乔木或灌木的任何木本植物种、任何草本植物种、或产生可食果实、种子或蔬菜的任何植物种、或产生多彩或芳香花朵的任何植物种。例如，种子、全植株、分离植物器官、植物组织或植物细胞可以选自黄瓜、牵牛花、凤仙花、胡椒、茄子、万寿菊、莲、甘蓝、雏菊、香石竹的一个植物种。另外，为了本发明的目的，  “植物种子”一词包括蕨类植物和其它低等维管植物的孢子以及非维管植物(如藓类、苔类植物和金鱼藻)的孢子。
虽然该化学试剂有抗微生物的性质，但在将种子、植物或植物器官放入培养基中开始新的培养之前，最好对该种子、植物或植物器官表面灭菌以去除其表面原来相对密集存在的真菌或细菌孢子。种子、植物和植物器官的表面灭菌技术在本领域广为人知，并可用常用的消毒剂进行，但最好用以水稀释的家用漂白剂(次氯酸钠溶液)。例如，将一个或多个种子浸入有或无表面活性剂的家用漂白剂的稀释溶液中，在水中的漂白剂浓度例如为约5％-20％(v/v)的漂白剂，浸泡足以表面灭菌种子的时间、例如约10-120分钟，就可以有效地进行表面灭菌。然后，最好用水冲洗种子三次。
根据本发明方法可以培养的植物器官包括(但不限于)叶、茎、根、叶芽、花芽、分生组织、胚、子叶、胚乳、萼片、花瓣、雌蕊、心皮、雄蕊、花药、花粉、花粉管、胚珠、子房和果实，或取自它们的部分、切片、片等。
根据本发明方法可以培养的植物组织包括(但不限于)愈伤组织、基本组织、维管组织、贮藏组织、分生组织、叶组织、茎组织、根组织、瘿瘤组织、植物肿瘤组织和生殖组织。
可以在本发明的培养基上培养的植物细胞包括(但不限于)有细胞壁的分离细胞及其各种大小的团聚体、和原生质体。
在本发明的培养基上体外培养的任何植物、植物器官、植物组织或植物细胞都可以在适当的时间转移(即继代培养)至含该化学试剂的新鲜培养基以进行体外的连续生长、发育或分化。本发明提供的另一个优点是，植物组织或植物细胞的继代培养可以不必严格遵守无菌技术或不必使用无菌工作环境，例如层流罩。
本发明预计培养的植物、植物器官、植物组织和植物细胞可以从本发明培养基转移至不含该化学试剂的培养基，合适的话，反之亦然。
另外，本发明预计，在本发明培养基上培养、再生或其它方式保持的整植株或植物器官随后可以从该体外组织培养环境中移出并转移至一基质(例如土壤或蛭石)上，以在该体外环境之外进行连续生长和发育。
另外，本发明提供了一种在一种含一种化学试剂的植物组织培养基上培养种子、植物、植物器官、植物组织或植物细胞的药盒，该化学试剂的浓度在整个培养期间减少或防止微生物污染并基本保证种子正常发芽或植物、植物器官、植物组织或植物细胞的正常生长或发育，该药盒包括装有含该化学试剂的植物组织培养基的一个培养容器，其中该培养基或者已制备完毕即立即可用，或者易于制备，例如加水即可。另外，该药盒包括一个或多个最好已表面灭菌的植物种子、或一个或多个植物、植物器官、植物组织或植物细胞。
一般描述本发明之后，通过参考以下实施例将更易理解本发明，提供这些实施例作为说明，不是限制本发明。
        5.实施例：该化学试剂对微生物污染的抑制效果
进行以下试验以测试增加植物组织培养基中该化学试剂浓度的抗微生物效果。
制备标准植物组织培养基，该组合物有Murashige和Skoog无机盐、2％(w/v)蔗糖、0.4％(w/v)GelriteTM，用KOH调至pH5.8，如下述含或不含该化学试剂。
在第一组试验里，制备含有下列组分的化学试剂，以在高压灭菌前将其加入培养基：
甲基氯异噻唑啉酮                     2.3g
甲基异噻唑啉酮                       0.7g
氯化镁                               23.0g
硝酸镁                               23.0g
山梨酸钾                             20.0g
苯甲酸钠                             20.0g
蒸馏水定容至1升
测试了上述化学试剂在培养基里的不同浓度以确定抗微生物活性的最佳浓度。例如，以0.1％的增量检测了培养基中该化学试剂0.2-1.0％(v/v)的浓度范围。以0.025％的增量检测了培养基中该化学试剂0.1-0.2％(v/v)的浓度范围。最后，以0.01％的增量检测了培养基中该化学试剂0.01-0.1％(v/v)的浓度范围。
加入该化学试剂后，将该培养基高压灭菌(15分钟，121℃)以溶解胶凝剂。所有后续操作都在非无菌条件下进行。将含该化学试剂的培养基倒入非无菌聚苯乙烯容器，用非无菌盖覆盖，让其固化。将不含该化学试剂的培养基或者倒入非无菌容器(对照A)或者倒入无菌容器(对照B)，分别用非无菌盖和无菌盖覆盖，让其固化。装有含各个浓度该化学试剂的培养基容器各10个与10个对照A培养基容器在28℃黑暗培养7天。一周后，装有含该化学试剂的培养基的容器内都无明显微生物污染。与之相反，在所有对照A容器中都有明显微生物污染，平均每个容器有总数为6.5个菌落的真菌和细菌。
在第二个试验中，装有含各个浓度该化学试剂的培养基的容器各10个与10个对照B培养基容器都未封盖，在外界空气中暴露8小时。然后再将其封盖并在28℃黑暗培养7天。装有含该化学试剂的培养基容器内一般无明显微生物污染，只有2个含最低浓度该化学试剂[即0.01％(v/v)]的容器例外，每个的培养基表面有一个真菌菌落。与之相反，所有对照B容器中都被污染，平均每个容器有总数为2.5个菌落的真菌和细菌。
进行了另外的试验以检测不同配方的化学试剂的效力。制备的第一种化学试剂含有用于上述配制的化学试剂的所有6个组分，即甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、氯化镁、硝酸镁、山梨酸钾和苯甲酸钠，各组分的浓度与上述相同。制备的第二种化学试剂除缺少苯甲酸钠外，含有与上述相同的组分与浓度。制备的第三种化学试剂除缺少山梨酸钾外，含有与上述相同的组分与浓度。制备的第四种化学试剂除缺少山梨酸钾和苯甲酸钠外，含有与上述相同的组分与浓度。制备的第五种化学试剂仅含有山梨酸钾和苯甲酸钠，其浓度与上述浓度相同。制备的第六种化学试剂仅含有山梨酸钾，其浓度与上述浓度相同。制备的第七种化学试剂仅含有苯甲酸钠，其浓度与上述浓度相同。
按上述方法制备植物组织培养基。将上述制备的7种不同的化学试剂按上述方法加入不同批的植物培养基，除对照以外，它们在培养基中的最终浓度均为0.035％(v/v)。然后将所有的植物培养基高压灭菌(121℃，15分钟)。将含不同化学试剂的植物培养基各倒入10个非无菌的聚苯乙烯容器并封非无菌盖。不含化学试剂的对照培养基也按上述方法制备。将这些容器在27℃黑暗培养14天。
培养后，装有对照培养基的10个容器总共有82个微生物菌落(效力0％)。含有第一种化学试剂(含所有6个组分)的培养基没有微生物菌落(效力100％)。含有第二种化学试剂(仅缺苯甲酸钠)的培养基有7个微生物菌落(效力91％)。含有第三种化学试剂(仅缺山梨酸钾)的培养基有10个微生物菌落(效力88％)。含有第四种化学试剂(缺山梨酸钾和苯甲酸钠)的培养基有13个微生物菌落(效力84％)。含有第五种化学试剂(仅含山梨酸钾和苯甲酸钠)的培养基有31个微生物菌落(效力62％)。含有第六种化学试剂(仅含山梨酸钾)的培养基有55个微生物菌落(效力33％)。最后，含有第七种化学试剂(仅含苯甲酸钠)的培养基有65个微生物菌落(效力21％)。
这些结果表明，几个化学试剂配方在减少或防止非无菌条件下植物培养基内细菌和真菌的生长方面是有效的。但是，如欲符合本发明要求的效力，该化学试剂必须包括甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、氯化镁和硝酸镁等组分。
           6.实施例：该化学试剂对种子发芽的影响
进行以下试验以测试增加植物组织培养基中该化学试剂浓度对种子发芽和随后苗和根生长的影响。用于这些试验的化学试剂含有甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、氯化镁、硝酸镁、山梨酸钾和苯甲酸钠，并按照第5节第一组试验描述的方法配制，并按上述方法加入培养基中。然后将培养基高压灭菌(121℃，15分钟)。
来自10个植物种的种子或表面灭菌或不表面灭菌。将欲表面灭菌的种子浸入20-40％(v/v)家用漂白剂溶液30分钟，并用一般的非无菌自来水冲洗3次。然后将种子插入含各种浓度化学试剂的固化培养基内约1/10英寸。每个植物种在每个化学试剂浓度测试100枚种子。将容器在28℃黑暗培养7天，同时检查微生物污染和种子发芽率。
关于微生物污染，在该化学试剂浓度为0.4％(v/v)或更低时，约86％的没有表面灭菌的种子上有细菌和真菌菌落，而表面灭菌的种子在所有浓度下都没有微生物污染。
化学试剂浓度对种子发芽率的影响随植物种而变化。例如，当化学试剂浓度为1.0％(v/v)时，表面灭菌的黄瓜种子发芽率高(72％)，而表面灭菌的莲种子发芽率很低(5％)(表1)。在化学试剂浓度小于等于0.2％(v/v)时，所有物种的表面灭菌种子的发芽率都高(大于50％)。
这些结果表明，培养基中加入的化学试剂浓度高至0.2％(v/v)时，所测试的所有物种种子都基本正常发芽，但是某些物种例如黄瓜、牵牛花、凤仙花等在培养基中化学试剂浓度高至1.0％(v/v)时能基本正常发芽。另外，这些结果表明，由于在大多数植物种种子的表面上存在的细菌和真菌孢子密度一般很高，最好对种子进行表面灭菌，以使培养基中的该化学试剂能够发挥减少或防止植物组织培养物微生物污染的最佳效果。
值得注意的是，没有表面灭菌的种子发芽率一般比同物种的表面灭菌的种子发芽率高(表1)。这种差别在培养基中化学试剂浓度为0.2％(v/v)或更高时更加明显，可能是由于漂白剂使种皮更易透过，由此使得种子对该化学试剂更敏感。
关于发芽种子的后续苗和根的生长，当化学试剂浓度为0.3％(v/v)或更高时，所有物种或者不由发芽种子生根或者根的生长和发育有障碍(表2)。当培养基中含有的化学试剂浓度为0.05％或更低时，在所有物种都观察到苗和根的正常生长和发育。
这些结果表明，培养基中加入的化学试剂浓度为0.05％(v/v)或更低时，所测试的所有物种的苗和根都基本正常生长和发育，而某些物种例如黄瓜和甘蓝，在培养基中化学试剂浓度高至0.2％(v/v)时能产生基本正常苗和根。如上述第4节所述，化学试剂对其它植物种的最佳浓度，不用过度试验就可以根据经验确定。
    7.实施例：该化学试剂对愈伤组织器官发生的影响
进行以下试验以测试增加组织培养基中化学试剂浓度对愈伤组织器官发生的影响。用于这些试验的化学试剂含有甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、氯化镁、硝酸镁、山梨酸钾和苯甲酸钠，并按照上述方法配制。
采用无菌技术，将体外生长的茄子(cv.Black Beauty)植株的叶切成小方块(约1×1cm)。将10个叶块培养在培养基上，该培养基含有Murashige and Skoog无机盐、维生素(包括维生素B1、维生素B6、烟酸)、3％蔗糖(w/v)、2mg/l萘乙酸(NAA)和0.8％琼脂(对照培养基)、pH5.8，该培养基在使用前高压灭菌(121℃，15分钟)。将10个叶块各培养在与上述相同但另外含有0.03％或0.04％(v/v)化学试剂的培养基上。将培养物于27℃黑暗培养。30-40天后，所有培养基上的所有叶块上都增殖出约50mg的白色愈伤组织。
从每个叶块分离愈伤组织，在按上述方法制备的但用反式玉米素(2mg/l)取代NAA的新鲜培养基上继代培养。愈伤组织在27℃、每天10,000英尺烛光光照处理10小时继代培养。37天后，所有培养基上的愈伤组织都再生出平均每个愈伤组织28根苗。从愈伤组织分离苗，将其插入按上述方法制备的但缺乏任何植物激素的新鲜培养基中。所有培养基上的苗都再生出根。
这些结果表明，在培养基中加入有效抗微生物浓度的化学试剂对愈伤组织诱导、愈伤组织增殖或植株再生没有负面影响。
尽管已结合具体实施例说明本发明，不言而喻，本发明可以有其它修改。本申请将包括大体上遵循本发明原则的本发明的任何变化、应用或改编和包括那些在本发明从属的领域内已知或习惯做法和可以应用到所附权利要求书提出的基本特征的违背本说明书的本发明的任何变化、应用或改编。
上述引用的出版物在此都通过引用结合到本文中。
                       表1
                                                     递增化学试剂浓度时的种子发芽率+
  植物类型*                                    化学试剂百分比浓度(v/v)
  0     0.01     0.02     0.03     0.04     0.05   0.06     0.07     0.08     0.09     0.1     0.125     0.15     0.175     0.2     0.3   0.4   0.5   0.6   0.7   0.8   0.9   1.0
  黄瓜   S   96     96     97     98     96     96   95     96     93     92     93     93     90     90     84     78   75   75   72   72   73   73   72
  N   98     98     99     99     97     96   96     96     98     98     97     96     97     94     90     90   91   90   90   88   89   88   89
牵牛花   S   88     88     87     88     89     86   85     87     86     85     84     85     82     83     79     78   74   72   71   72   70   70   70
  N   92     93     91     92     90     91   93     92     91     93     92     90     91     90     89     89   89   87   86   85   85   86   86
  凤仙花   S   97     97     97     96     95     94   96     95     94     94     94     92     91     92     91     89   88   88   86   84   83   81   80
  N   99     99     99     100     98     98   97     96     95     96     96     97     93     94     92     91   90   91   89   89   87   88   87
  胡椒   S   90     90     91     90     91     89   86     88     88     86     87     86     85     84     85     73   68   60   51   32   21   12   8
  N   92     93     92     92     91     91   91     92     90     91     92     90     91     90     88     82   80   80   79   77   76   75   72
  茄子   S   91     90     92     90     91     92   91     90     89     91     90     90     91     90     82     72   67   61   52   34   22   11   6
  N   92     93     92     94     92     91   91     90     90     92     91     90     89     88     87     80   80   78   77   72   74   72   70
  万寿菊   S   90     89     89     89     90     88   82     80     81     79     78     75     74     76     72     70   69   62   48   32   28   9   5
  N   98     97     93     94     95     92   93     91     90     90     90     87     82     83     80     77   76   75   72   68   66   52   46
  莲   S   82     81     81     80     81     80   79     78     76     77     77     75     73     72     72     70   51   43   28   20   12   7   5
  N   85     85     84     85     83     84   82     84     82     81     83     80     81     82     80     77   71   70   65   60   52   48   32
  甘蓝   S   81     82     81     81     78     78   79     78     78     77     76     75     74     73     71     71   72   70   70   69   65   63   61
  N   83     84     82     83     82     81   82     81     82     83     83     82     79     80     81     79   78   72   72   70   70   69   63
                                                                 递增化学试剂浓度时的种子发芽率+
植物类型*                                                    化学试剂百分比浓度(v/v)
  0   0.01   0.02   0.03     0.04   0.05   0.06   0.07   0.08   0.09   0.1   0.125   0.15   0.175   0.2   0.3   0.4   0.5   0.6   0.7   0.8   0.9   1.0
雏菊   S   76   74   74   74     72   73   70   71   68   69   61   60   59   57   58   46   40   31   27   21   17   12   6
  N   81   81   80   80     81   81   80   78   79   80   77   76   74   75   75   76   70   68   68   66   62   60   57
香石竹   S   92   90   93   93     92   90   87   88   85   83   80   79   78   71   70   70   68   51   38   27   19   11   8
  N   95   96   93   93     94   94   92   91   92   90   89   88   84   82   81   80   80   76   74   73   60   49   38
*100枚种子/植物/处理    S＝表面灭菌    N＝未表面灭菌+用于这些试验的化学试剂含有甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、氯化镁、硝酸镁、山梨
酸钾和苯甲酸钠，将含该化学试剂的培养基高压灭菌。
                                                   表2
                                                                                        含有递增化学试剂浓度的植物组织培养基上苗和根的形成
  植物类型*                                                                            化学试剂百分比浓度(v/v)+
  0   0.01   0.02   0.03   0.04   0.05   0.06   0.07   0.08   0.09   0.1   0.125   0.15   0.175   0.2   0.3   0.4   0.5   0.6   0.7   0.8   0.9   1.0
  黄瓜   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-
牵牛花   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-
  凤仙花   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-
  胡椒   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   -/-   -/-   -/-   -/-
  茄子   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   -/-   -/-   -/-   -/-
万寿菊 S/R S/R S/R S/R S/R S/R S/- S/- S/- S/- S/- S/- S/- S/- S/- S/- S/- S/- -/- -/- -/- -/- -/-
  莲   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   -/-   -/-   -/-   -/-   -/-
  甘蓝   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-
  雏菊   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   -/-   -/-   -/-   -/-   -/-
  香石竹   S/ R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/R   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   S/-   -/-   -/-   -/-   -/-
*＝100枚种子/处理+＝用于这些试验的化学试剂含有甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、氯化镁、硝酸镁、山梨酸钾和苯甲酸钠。将含该化学试剂的培养基高压灭菌。s＝正常生苗R＝正常生根，-＝不生长和异常生长

Claims (10)

1.一种含一种化学试剂的植物组织培养基，该化学试剂包括：浓度范围约2.0-2.6g/l的甲基氯异噻唑啉酮，浓度范围约0.6-0.8g/l的甲基异噻唑啉酮，浓度范围约15.0-30g/l的氯化镁，浓度范围约15.0-30g/l的硝酸镁；其中该化学试剂存在于该植物组织培养基中，其浓度可以减少或防止该植物组织培养基被微生物污染，并使种子基本正常发芽或使植物、植物器官、植物组织或植物细胞的基本正常生长或发育。
2.权利要求1的植物组织培养基，其中该化学试剂还含有浓度范围约15.0-25g/l的山梨酸钾。
3.权利要求1的植物组织培养基，其中该化学试剂还含有浓度范围约13-27g/l的苯甲酸钠。
4.权利要求1的植物组织培养基，其中该化学试剂还含有浓度范围约15-25g/l的山梨酸钾和浓度范围约13-27g/l的苯甲酸钠。
5.权利要求4的植物组织培养基，其中该化学试剂在该植物组织培养基中的浓度范围是约0.01％-0.20％(v/v)。
6.权利要求4的植物组织培养基，其中该化学试剂在该植物组织培养基中的浓度范围是约0.02％-0.10％(v/v)。
7.权利要求4的植物组织培养基，其中该化学试剂在该植物组织培养基中的浓度范围是约0.03％-0.05％(v/v)。
8.一种体外萌发植物种子或培养植物、植物器官、植物组织或植物细胞的药盒，该药盒包括：
(a)一个培养容器；
(b)一种植物种子、植物、植物组织、植物器官织或植物细胞；
   和
(c)权利要求1、2、3、4、5、6、或7的植物组织培养基。
9.权利要求8的药盒，其中种子、植株、植物器官、植物组织或植物细胞来自选自黄瓜、牵牛花、凤仙花、胡椒、茄子、万寿菊、莲、甘蓝、雏菊、香石竹的一个植物种。
10.一种减少或防止植物组织培养基中微生物污染的方法，包括将权利要求1、2、3、4、5、6、或7的化学试剂加入该植物组织培养基。
CN96196050A 1995-06-02 1996-06-03 防止植物组织培养基微生物污染的组合物和方法 Pending CN1193344A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/460,703 1995-06-02
US08/460,703 US5750402A (en) 1995-06-02 1995-06-02 Compositions and methods to prevent microbial contamination of plant tissue culture media

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1193344A true CN1193344A (zh) 1998-09-16

Family

ID=23829745

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN96196050A Pending CN1193344A (zh) 1995-06-02 1996-06-03 防止植物组织培养基微生物污染的组合物和方法

Country Status (16)

Country Link
US (1) US5750402A (zh)
EP (1) EP0828820B1 (zh)
JP (1) JPH11506331A (zh)
CN (1) CN1193344A (zh)
AT (1) ATE314459T1 (zh)
AU (1) AU698103B2 (zh)
BR (1) BR9608621A (zh)
CA (1) CA2222935C (zh)
DE (2) DE96916997T1 (zh)
ES (1) ES2256860T3 (zh)
HU (1) HUP9900888A2 (zh)
IL (1) IL122373A (zh)
NO (1) NO975556L (zh)
NZ (1) NZ309512A (zh)
PL (1) PL323749A1 (zh)
WO (1) WO1996038542A1 (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101255385B (zh) * 2008-04-10 2011-03-16 杨壮 一种清洁剂及含有这种清洁剂的清洁用品
CN103734010A (zh) * 2013-12-30 2014-04-23 古田县恒春农业开发有限公司 一种组培瓶口防霉胶及其使用方法
CN103881774A (zh) * 2012-12-23 2014-06-25 北京合创同盛科技有限公司 一种稳定液态烃油的添加剂
CN102283212B (zh) * 2005-10-04 2014-07-09 罗门哈斯公司 杀微生物组合物
CN105409780A (zh) * 2015-12-30 2016-03-23 云南飞熊农业科技有限公司 一种无需灭菌的植物组培培养基及其制备方法
CN106745773A (zh) * 2016-12-31 2017-05-31 许伟琦 含高盐高有机物的城市生活污水、工业污水的生态处理系统和方法及处理剂、调节剂
CN111565571A (zh) * 2017-09-29 2020-08-21 0903608 B.C.有限公司 用于递送活性成分的协同农药组合物和方法
CN112753581A (zh) * 2021-02-04 2021-05-07 公孙国林 一种阿福花科十二卷属多肉植物多倍体植株培育配方
CN114600757A (zh) * 2022-03-25 2022-06-10 广东环境保护工程职业学院 一种枳椇的育苗方法
US11839212B2 (en) 2018-09-27 2023-12-12 0903608 B.C. Ltd. Synergistic pesticidal compositions and methods for delivery of insecticidal active ingredients

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5803014A (en) * 1997-02-14 1998-09-08 Plant Cell Technology, Inc. Habitat media for ants and other invertebrates
AR039365A1 (es) * 2002-11-08 2005-02-16 Magri Federico German Un metodo para la preparacion de un inoculante concentrado y composicion inoculante concentrada obtenida con dicho metodo
US6841572B2 (en) * 2003-02-20 2005-01-11 H&I Agritech Environmentally safe fungicide and bactericide formulations
US20090035340A1 (en) * 2007-07-30 2009-02-05 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Preservative compositions for moist wipes
WO2011017565A2 (en) * 2009-08-07 2011-02-10 Joule Unlimited, Inc. Methods and compositions for controlling contamination growth in cell cultures
CN103155861A (zh) * 2011-12-10 2013-06-19 何寒 一种植物开放式组织培养育苗的方法
CN103329800A (zh) * 2013-06-17 2013-10-02 何寒 一种植物开放式组培时不用琼脂的组培培养基及其制备方法
IL275418B1 (en) * 2017-12-21 2024-03-01 Genzyme Corp Methods for improved removal of impurities during protein A chromatography
CN109874669B (zh) * 2019-01-16 2022-04-19 南京农业大学 一种荷花无菌苗走茎快速增殖方法
CN115428797B (zh) * 2022-09-28 2024-05-07 山东省农业科学院 一种洋葱种子消毒及无菌苗培养方法
KR102629108B1 (ko) * 2023-09-01 2024-01-25 김연준 식물 배지 항미생물용 조성물

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3122432A (en) * 1964-02-25 Composition and method for preserving
US3523121A (en) * 1967-03-09 1970-08-04 Rohm & Haas Certain 2-carbamoyl-3-isothiazolenes
US4252694A (en) * 1967-03-09 1981-02-24 Rohm And Haas Company Cleaning composition containing 3-isothiazolones
US4265899A (en) * 1978-05-30 1981-05-05 Rohm And Haas Company Cosmetic formulation comprising 3-isothiazolones
US4540570A (en) * 1982-05-14 1985-09-10 Lever Brothers Company Synergistic preservative compositions
US4454146A (en) * 1982-05-14 1984-06-12 Lever Brothers Company Synergistic preservative compositions
US4499071A (en) * 1982-05-14 1985-02-12 Lever Brothers Company Synergistic preservative compositions
US4555400A (en) * 1982-05-14 1985-11-26 Lever Brothers Company Synergistic preservative compositions
US5100905A (en) * 1988-09-15 1992-03-31 Rohm And Haas Company Method for inhibiting growth of bacteria, fungi or algae by treatment with biocide composition
US5028620A (en) * 1988-09-15 1991-07-02 Rohm And Haas Company Biocide composition
JP2803336B2 (ja) * 1990-07-02 1998-09-24 松下電器産業株式会社 植物の組織培養方法
JPH04311326A (ja) * 1990-12-26 1992-11-04 Hokko Chem Ind Co Ltd シクラメンの組織培養方法

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102283212B (zh) * 2005-10-04 2014-07-09 罗门哈斯公司 杀微生物组合物
CN101255385B (zh) * 2008-04-10 2011-03-16 杨壮 一种清洁剂及含有这种清洁剂的清洁用品
CN103881774A (zh) * 2012-12-23 2014-06-25 北京合创同盛科技有限公司 一种稳定液态烃油的添加剂
CN103881774B (zh) * 2012-12-23 2016-06-15 北京合创同盛科技有限公司 一种稳定液态烃油的添加剂
CN103734010A (zh) * 2013-12-30 2014-04-23 古田县恒春农业开发有限公司 一种组培瓶口防霉胶及其使用方法
CN105409780A (zh) * 2015-12-30 2016-03-23 云南飞熊农业科技有限公司 一种无需灭菌的植物组培培养基及其制备方法
CN105409780B (zh) * 2015-12-30 2019-03-29 玉溪市飞熊农业开发有限公司 一种无需灭菌的植物组培培养基及其制备方法
CN106745773A (zh) * 2016-12-31 2017-05-31 许伟琦 含高盐高有机物的城市生活污水、工业污水的生态处理系统和方法及处理剂、调节剂
CN111565571A (zh) * 2017-09-29 2020-08-21 0903608 B.C.有限公司 用于递送活性成分的协同农药组合物和方法
US11839212B2 (en) 2018-09-27 2023-12-12 0903608 B.C. Ltd. Synergistic pesticidal compositions and methods for delivery of insecticidal active ingredients
CN112753581A (zh) * 2021-02-04 2021-05-07 公孙国林 一种阿福花科十二卷属多肉植物多倍体植株培育配方
CN114600757A (zh) * 2022-03-25 2022-06-10 广东环境保护工程职业学院 一种枳椇的育苗方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO1996038542A1 (en) 1996-12-05
AU698103B2 (en) 1998-10-22
ATE314459T1 (de) 2006-01-15
PL323749A1 (en) 1998-04-14
BR9608621A (pt) 1999-08-17
JPH11506331A (ja) 1999-06-08
CA2222935A1 (en) 1996-12-05
EP0828820A1 (en) 1998-03-18
NZ309512A (en) 1999-06-29
DE96916997T1 (de) 2005-07-14
HUP9900888A2 (hu) 1999-07-28
US5750402A (en) 1998-05-12
IL122373A (en) 2000-12-06
CA2222935C (en) 2012-02-07
EP0828820A4 (en) 2002-12-04
ES2256860T3 (es) 2006-07-16
EP0828820B1 (en) 2005-12-28
NO975556D0 (no) 1997-12-02
DE69635658T2 (de) 2006-09-07
IL122373A0 (en) 1998-06-15
AU5970196A (en) 1996-12-18
NO975556L (no) 1998-01-26
DE69635658D1 (de) 2006-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1193344A (zh) 防止植物组织培养基微生物污染的组合物和方法
Teixeira et al. Influence of NaClO on nutrient medium sterilization and on pineapple (Ananas comosus cv Smooth cayenne) behavior
CN102757915B (zh) 一种氯代乙酰胺类除草剂降解菌及其生产的菌剂和应用
Taji et al. Plant tissue culture practice
Halim et al. Sterilization process for in vitro regeneration of Stevia (Stevia rebundiana Bertoni)
Silva et al. In vitro germination of Melanoxylon brauna Schott. and evaluation of the toxicity of disinfecting agents in the Lactuca sativa L. model plant
CN106591168B (zh) 一种烟嘧磺隆降解赤红球菌ymhl-1及其应用
Moutia et al. Evaluation of surface sterilization and hot water treatments on bacterial contaminants in bud culture of sugarcane
Roychowdhury et al. Germination behaviors in M2 generation of Dianthus after chemical mutagenesis
Kolozsvári Nagy et al. Apple tissue culture contamination by Rhodotorula spp.: identification and prevention
Kumar et al. Standardization of in vitro culture establishment and proliferation of micro-shoots in African and French marigold genotypes
KR101499759B1 (ko) 벼 키다리병 저항성 품종의 대량 검정방법
Kumar et al. Standardization of rapid multiplication protocol in petaloid male sterile lines of African marigold (Tagetes erecta) through in vitro culture
Sharaf-Eldin et al. Movement and containment of microbial contamination in the nutrient mist bioreactor
EP3476930B1 (en) Pseudozyma
Gabbrielli et al. Ni toxicity on carnation (Dyanthus cariophyllus L. cv. Corrida) cell cultures: selection of Ni tolerant lines and effects of Ca and Mg
MXPA97009379A (en) Compositions and methods to prevent microbial control of plantable detention media
McAlister In vitro propagation of eucalytpus clones using a temporary immersion bioreactor system (RITA)
US5803014A (en) Habitat media for ants and other invertebrates
Brundrett et al. Orchid conservation techniques manual
Singh et al. Effect of antibiotics on in vitro seed germination responses in Adansonia digitata L.: A valuable medicinal tree
EP0384661A1 (en) Antialgal compositions comprising diphenylethers
Westbrook et al. Multi-Seed Zea Pellets (MSZP) for increasing agroecosystem biodiversity
Patil et al. Standardization of sterilization protocol for explants and its suitability for direct organogenesis in tuberose cv. Arka Vaibhav
Lozoya Saldaña et al. Coffee.

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1016215

Country of ref document: HK