DE69627349T2

DE69627349T2 - Einrichtung zur synthese von oligonukleotiden

Info

Publication number: DE69627349T2
Application number: DE69627349T
Authority: DE
Inventors: Lars Holmberg
Original assignee: Amersham Bioscience AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1995-08-17
Filing date: 1996-08-16
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2016-08-17
Also published as: CA2229653A1; US5641459A; DE69627349D1; JPH11512085A; EP0844910A1; WO1997006884A1; CA2229653C; EP0844910B1; JP4074339B2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Synthetisieren von Oligonukleotiden.
Hintergrund der Erfindung
Ein Oligonukleotid ist ein Makromolekül, umfassend eine Sequenz von Nukleosiden, von denen jedes einen Zucker und eine Base beinhaltet. Jedes Nukleosid ist von benachbarten Nukleosiden durch eine Internukleosid-Bindung getrennt, die gewissermaßen dazu dient, die Nukleoside zusammen zu binden. Der Zucker ist im Allgemeinen eine Pentose, am häufigsten eine Deoxyribose, eine Ribose oder eine 2'-O-substituierte Ribose. Es können eine Anzahl von verschiedenen Basen verwendet werden, von denen die vier häufigsten Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin sind (abgekürzt als A, C, G beziehungsweise T). Die Internukleosid-Bindung ist am häufigsten ein Phosphat, das mit einer Vielzahl von Substituenten, am häufigsten durch Schwefel oder eine Alkyl-, Ester- oder Amidgruppe an einem nicht brückenbildenden Sauerstoffatom substituiert sein kann.
Es werden verschiedene Verfahren zur Synthetisierung von Oligonukleotiden verwendet, einschließlich Phosphoramidit-, Phosphortriester- und H-Phosphonatverfahren, von denen jedes auf dem Gebiet der molekularen Biologie allgemein bekannt ist. Das Phosphoramiditverfahren wird hier als beispielhaftes Verfahren beschrieben. Um mit diesem Verfahren eine große Anzahl von Oligonukleotidmolekülen herzustellen, wird in einem Reaktionsgefäß eine feste Auflage vorgesehen, und eine große Anzahl von DMT-geschützten Nukleosiden wird an dieser Auflage befestigt. Ein durch einen Detritylationsmechanismus wirkendes Deprotektionierungsmittel wird zugegeben, um das DMT von dem Nukleosid zu entfernen, und so diese eine Hydroxylgruppe zu „deprotektionieren". Als Ergebnis besitzt das letzte Nukleosid in der Sequenz eine Hydroxcylgruppe, die bereit ist, ein nächstes Amidit aufzunehmen. Nukleosid-Phosphoramidite (im Folgenden „Amidite"), gelöst in einem Lösungsmittel wie zum Beispiel Acetonitril (ACN) werden in das Gefäß eingebracht. Ein Aktivator wie zum Beispiel Tetrazol, wird ebenfalls in das Gefäß mit den Amiditen eingebracht. Der Phosphor in den Amiditen bindet mit dem Sauerstoff in der Hydroxylgruppe, und stellt so an die Auflage gebundene Nukleotide bereit. Nachdem die an die Auflage gebundenen Nukleotide gebildet sind, werden überschüssige Amidite mit ACN aus dem Gefäß ausgespült.
Ein Oxidationsmittel wird zugegeben, um den dreiwertigen Phosphor in fünfwertigen umzuwandeln. Nachdem das Oxidationsmittel ausgespült ist wird ein Abdeckreagenz zugegeben, um alle ungeschützten Hydroxylgruppen für eine Reaktion mit zu einem späteren Zeitpunkt zugegebenen Amiditen zu blockieren. Wieder wird ACN zugegeben, um das Abdeckreagenz auszuspülen.
Diese Schritte werden einige Male wiederholt, um wachsende Oligonukleotidketten aus an die Auflage gebundenen Nukleosiden zu erzeugen. Jede der Ketten sollte eine identische, sich wiederholende Sequenz von Nukleosiden aufweisen.
Dieses Verfahren (und andere) zur Herstellung von Oligonukleotiden sind zeitraubend, und die verwendeten Materialien, insbesondere die Amidite, sind teuer und erfordern eine spezielle Handhabung und Entsorgung nach ihrer Verwendung. In Laboratorien werden Oligonukleotide im Maßstab von ungefähr einem Mikromol hergestellt. Eine Gruppe von Vorrichtungen, hergestellt unter dem Namen OligoPilot (eine Marke des Rechtsnachfolgers der vorliegenden Erfindung) hat das Verfahren verbessert, um so viel wie 3–4 Millimol an Oligonukleotiden zu erzeugen. Es wäre wünschenswert, die Anzahl an Oligonukleotiden, die gleichzeitig hergestellt werden kann, zu erhöhen, und dies effizient zu tun.
Die Herstellung von größeren Mengen an Oligonukleotiden wirft jedoch einige Bedenken auf. Aufgrund der Bedeutung der Verwendung von synthetisierten Oligonukleotiden für Anwendungen beim Menschen müssen die Oligonukleotide einen hohen Grad an Homogenität aufweisen. Inzwischen beinträchtigen konkurrierende Bedenken die wirksame Verwendung von Materialien, insbesondere der Amidite und des ACN. Während eine überschüssige Menge an Amiditen benötigt wird, um sicherzustellen, dass so viel wie möglich der naszierenden Oligonukleotide mit neu eingebrachten Amiditen reagieren, sollte die Menge an in das Gefäß eingebrachten Amiditen nicht zu übermäßig und verschwenderisch sein. Es ist auch wünschenswert, die Menge an verwendetem ACN zu reduzieren, während weiterhin übrig gebliebene Amidite so weit wie möglich ausgespült oder zumindest verdünnt werden. Wenn das Ausspülen ungenügend ist, können im Gefäß oder in verschiedenen zu der Säule führenden Leitungen übrig gebliebene Amidite inhomogene Sequenzen produzieren.
Die als OligoPilot II bekannte Vorrichtung (ebenfalls eine Marke des Rechtsnachfolgers der vorliegenden Erfindung) verwendet eine Durchströmanordnung, in der verschiedene Leitungen, Pumpen und Ventile ständig mit Flüssigkeit gefüllt sind. In ein Gefäß eingebrachte Flüssigkeit (in einer Durchströmvorrichtung „Säule" genannt) ersetzt vorher eingebrachte Flüssigkeit. Dieses Durchströmsystem unterscheidet sich von einem „Batch"-System, in dem Flüssigkeiten in ein Reaktionsgefäß eingebracht werden, die eingebrachten Flüssigkeiten ausgespült werden, und die Schritte des Einbringens und Ausspülen von Flüssigkeiten wiederholt werden. In einem solchen Batchsystem werden die Flüssigkeiten dem Gefäß durch Gasdruck und nicht mit Pumpen zugeführt. Dieser Ansatz kann verwendet werden, weil ein Batchverfahren Lücken im Flüssigkeitsdurchfluss aufweist.
In der OligoPilot II-Vorrichtung weisen erste und zweite Achtwegeventile, die jeweils acht individuelle auswählbare Einlassöffnungen besitzen, an Einlassöffnungen eines ersten Dreiöffnungsventils der Art, in der eine und nur eine der Einlassöffnungen offen gehalten werden muss, gekoppelte Auslassöffnungen auf. Jedes der zwei Achtwegeventile weist vier Einlassöffnungen auf, die so gekoppelt sind, dass sie eine von vier verschiedenen Arten von Amiditen aufnehmen, und vier Einlassöffnungen zur Aufnahme des ACN (des Spülmittels) auf.
Die Auslassöffnung des ersten Dreiöffnungsventils ist mit einer ersten Einlassöffnung eines zweiten Dreiöffnungsventils der gleichen Art wie das erste verbunden. Eine zweite Einlassöffnung zu diesem zweiten Dreiöffnungsventil ist mit einem dritten Achtwegeventil verbunden, das verschiedene Einlässe einschließlich ACN, Oxidationsmittel, Abdeckreagenzien und Aktivator aufweist. Die Auslassöffnung des zweiten Dreiwegeventils ist für ein Ventil vorgesehen, das mit einer Einlassseite einer Reagenzienpumpe zum Pumpen von Flüssigkeit zu der Säule durch das Ventil an der Auslassseite der Reagenzienpumpe verbunden ist. Dieses letzte Ventil ist auch mit zwei Pumpen verbunden, die dafür vorgesehen sind, Deprotektionierungsmittel und ACN mit einer höheren Fließrate als die Reagenzienpumpe zu pumpen.
Die aus der Säule ausgegebenen Flüssigkeiten werden durch das Ventil an der Einlassseite der Pumpe einem Monitor zur Detektierung der Absorption von Licht zugeleitet, um verdrängte Tritylgruppen aufzuspüren, und dann einem Ablaufventil, das einen Einlass aufnimmt und eine Anzahl von separaten Auslassöffnungen für Abfallstoffe aufweist. Durch die Auswahl gewisser Öffnungen an den Ventilen auf den Einlass- und Auslassseiten der Reagenzienpumpe kann die Flüssigkeit für eine gewünschte Zeit durch die Säule zirkuliert werden.
In der OligoPilot II-Vorrichtung wird, um ein nächstes Amidit in die Säule einzuführen, eines der Achtwegeventile so eingestellt, dass es ein nächstes Amidit aufnehmen kann, während ein anderes der Achtwegeventile so eingestellt wird, dass es den Aktivator aufnehen kann. Die Achtwegeventile, die den Aktivator und das Amidit aufnehmen, sind vorwärts und rückwärts gepulst, um abwechselnd Mengen von jedem einzuspeisen.
Um die Mengen der Flüssgkeiten, die der Säule zugeführt werden, zu regulieren, wird jede der Pumpen zunächst kalibriert. Während des Betriebs werden die Pumpen für einen gewissen Zeitraum aktiviert, um die gewünschten Mengen an Flüssigkeit bereit zu stellen. Die Pumpen müssen periodisch nochmals überprüft und rekalibriert werden, um Schwierigkeiten zu vermeiden, die von einem Driften in der Pumpe resultieren können. Für den verwendeten Synthesemaßstab ist eine solche Durchflusskalibrierung ausreichend genau zur Kontrolle der Mengen an der Säule zugeführtem Reagenzien. Für Synthesen in größerem Maßstab besteht jedoch eine Notwendigkeit für exaktere Mittel zur Kontrolle des Zuführens der Flüssigkeiten.
Vorrichtungen für die Synthese von Oligonukleotiden sind auch in GB 2,118,139 und US 4,588,049 offenbart worden.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung stellt eine verbesserte Vorrichtung zum Synthetisieren von Oligonukleotiden eine bessere Kontrolle und Wirksamkeit gegenüber früheren Durchström-Vorrichtungen zur Verfügung. Die Vorrichtung nimmt eine Anzahl von verschiedenen Flüssigkeiten einschließlich verschiedener Amidite und typischerweise anderer Mittel wie zum Beispiel Abdeckreagenzien, Oxidationsmittel und eines Aktivators auf. Jede der Flüssigkeiten ist mit einem entsprechenden Pumpmodul verbunden, das ein Ventil und eine Pumpe beinhaltet. In bevorzugten Ausführungsformen sind an mehren Stellen Durchfließratensensoren vorgesehen, um Volumina an Aktivator, Amiditen, ACN, Abdeckreagenzien und Oxidationsmitteln zu messen. Die der Steuereinheit von diesen Sensoren zur Verfügung gestellten Signale werden dazu verwendet, die Pumpen während des Betriebs individuell zu regeln. Die Ventile in den Modulen sind ebenfalls verbunden, um eine Spülflüssigkeit aufzunehmen.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung erlaubt jedes der Amidite und anderer mit der Vorrichtung verbundenen Flüssigkeiten individuell zu steuern. Diese Steuerung wird wirkungsvoll mit Durchflusssensoren gemessen, die dazu verwendet werden, den Pumpenfluss so zu regulieren, dass die Menge des verwendeten Amidits ungefähr 1,5 molare Äquivalente beträgt, d. h., ein Flüssigkeitsvolumen, das 1,5 mal so viele Amidite wie die Anzahl der in einer Säule erzeugten Sequenzen aufweist.
Um eine verbesserte Sicherheit zur Verfügung zu stellen, werden alle Flüssigkeiten in einem Außenraum eines Gehäuses gehandhabt, während das Gehäuse elektronische Komponenten beherbergt. In dem Reaktionsraum wird beständig Luft zirkuliert und gereinigt, um Lösungsmitteldämpfe davon abzuhalten, in das Innere einzudringen, wo sich Funken bilden können.
Die vorliegende Erfindung erlaubt eine genaue Steuerung der eingeführten Flüssigkeitsvolumina. Das Steuerungssystem vermeidet die Notwendigkeit der Rekalibrierung aufgrund von Drifting, weil die Ventile während des Betriebs geregelt werden. Durch die Verwendung von Dreiwegeventilen, in denen einer, beide oder keiner der Einlassöffnungen gleichzeitig geöffnet werden können, können verschiedene Abdeckreagenzien in dem Ventil miteinander vermischt werden; der Aktivator und die Amidite können ebenfalls gleichzeitig zugegeben und vermischt werden. Andere Merkmale und Vorteile werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung, den Zeichnungen und Patentansprüchen deutlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Die 1 und 2 stellen Blockdiagramme einer Synthetisierungsvorichtung gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
3 ist eine repräsentative bildhafte Ansicht der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung.
4 ist eine Querschnittsansicht entlang der Querschnittslinien 4-4 in 3.
5 ist ein Blockdiagramm eines Steuerungssystems gemäß der vorliegenden Erfindung.
6 ist ein Flussdiagramm eines Verfahrens zur Synthetisierung von Olegonukleotiden.
Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine Durchströmvorrichtung für eine genaue, wirkungsvolle Synthetisierung von Oligonukleotiden in großem Malistab in Mengen im Bereich von 100 Millimol, eine Mege, die viel höher ist als vorher möglich. Die Vorrichtung weist eine Anzahl von Pumpen und Ventilen auf, von denen jedes zu einem einer Anzahl von verschiedenen Arten von einzuführenden Flüssigkeiten korrespondiert, einschließlich einer Anzahl von verschiedenen Amiditen als auch anderer Mittel zum Spülen, Aktivieren, Abdecken, Oxidieren und Deprotektionieren. Es werden Sensoren bereit gestellt, um den Durchfluss der Flüssigkeiten zu messen, und der gemessene Durchfluss wird dazu verwendet, die Pumpen zu regeln.
Bezugnehmend auf 1 weist eine Vorrichtung 8 zur Synthetisierung von Oligonukleotiden Einlassöffnungen zum flüssigkeitsmäßigen Aufnehmen von Flüssigkeiten aus einer Anzahl von Behältern auf, die verschiedene Arten von Flüssigkeiten enthalten, und eine Auslassöffnung zum Bereitstellen von ausgewählten Flüssigkeiten zu einer Säule. Während sie hier im Zusammnhang mit einem Phosphoramiditverfahren zur Synthetisierung von Oligonukleotiden beschrieben ist, kann die Vorrichtung 8 auch mit anderen Vefahren zur Synthetisierung von Oligonukleotiden verwendet werden.
Die vier am häufigsten verwendeten Amidite, die die Monomeren dartsellen, die im Phosphoramiditverfahren verwendet werden, werden separat in Behältern 10, 12, 14 beziehungsweise 16 aufbewahrt. Diese Amidite besitzen einen Deoxyibose-Zucker und die Amidite sind daher Deoxyadenosin, Deoxycytin, Deoyguanosin und Deoxythymidin, bekannt als dA, dC, dG beziehungsweise dT. Andere Amidite, die verwendet werden können, hierin bezeichnet als dX und dY, werden in Behältern 18 und 20 aufbewahrt. Alle Amidite sind in ACN gelöst.
Andere Agenzien werden ebenfalls in separaten Behältern aufbewahrt. Abdeckreagenzien, bezeichnet als Cap A und Cap B, werden in Behältern 22 und 24 aufbewahrt; ein Aktivator, vorzugsweise Tetrazol, wird in Behälter 28 aufbewahrt; ein Oxidationsmittel wird in Behälter 28 aufbewahrt; und ein Deprotektionierungsmittel, vorzugsweise ein Detritylationsittel, befindet sich in Behälter 124. Im Fall des Oxidationsmittels können zweizusätzliche Ventile und Pumpen verwendet werden, um zwischen zwei verschiedenen Arten von Oxidationsmitteln auszuwählen, eines für die Bildung von Phosphordiesterbindungen, und das andere für die Bildung von Phosphorthioatbindungen.
Jeder Behälter 10–28 ist flüssigkeitsmäßig mit einer ersten optionalen Einlassöffnung eines der optionalen Ventile 30–39 (nicht in entsprechender Reihenfolge) durch entsprechende Leitungen 40–49 verbunden. Die Ventile 30–39 sind vorzugsweise Dreiöffnungs-/Dreiwegeventile, d. h., jedes besitzt drei Öffnungen, typischerweise eine Auslassöffnung und zwei Einlassöffnungen, so, dass eine, beide oder keine der Einlassöffnungen offen gehalten werden kann. Eine zweite Einlassöffnung für jedes optionale Ventil 30–39 ist flüssigkeitsmäßig durch eine entsprechende Leitung 70–79 mit einer Leitung 80 verbunden, die ACN aus einem Behälter 82 mit Spülflüssigkeit führt. Jedes der Ventile 30–39 ist flüssigkeitsmäßig an seiner Auslassöffnung über eine Leitung 60–69 mit einer entsprechenden Pumpe 50–59 verbunden. Jede der Flüssigkeiten ist auf diese Weise mit einem individuellen Pumpmodul verbunden, das eine Pumpe und ein Ventil beinhaltet.
Die Module sind stromabwärts durch eine Ventilanordnung verbunden, die gesteuert wird, um Flüssigkeiten zur Einführung in die Säule auszuwählen. Die Auslassöffnungen der Pumpen 50 und 51, die Cap A und Cap B aufnehmen, sind flüssigkeitsmäßig mit den Einlassöffnungen des Ventils 90 verbunden, dessen Auslassöffnung flüssigkeitsmäßig mit der ersten Einlassöffnung eines Ventils 92 verbunden ist. Wenn das Abdeckreagenz eingeführt werden soll, werden typischerweise beide Einlassöffnungen des Ventils 90 gleichzeitig offen gehalten, um die Abdeckreagenzien in gleichen Mengen zu kombinieren. Die zweite Einlassöffnung des Ventils 92 nimmt ein Oxiationsmittel von der Auslassöffnung der Pumpe 52 auf. Folglich kann das Ventil 92 selektiv eine der Kombinationen von Cap A und Cap B, ein Oxidationsmittel und ACN zur Verfügung stellen.
Die Pumpen 53–58, die flüssigkeitsmäßig verbunden sind, um dA, dC, dG, dT, dX beziehungsweise dY aufzunehmen, werden paarweise zusammengeschaltet, und die Auslässe dieser Pumpen sind flüssigkeitsmäßg mit einem Teil der Ventilanordnung verbunden, um eines der Amidite (oder ACN) zur Einführung in die Säule auszuwählen. Die Auslassöffnungen der Pumpen 53 und 54 sind flüssigkeitsmäßig mit den Einlassöffnungen eines Ventils 96 verbunden. Die Auslassöffnungen der Ventile 94 und 96 sind flüssigkeitsmäßig mit den Einlassöffnungen eine Ventils 98 verbunden, das wiederum ACN oder eines der Amidite dA, dC, dG und dT einer ersten Einlassöffnung des Ventils 102 zur Verfügung stellt. Die Pumpen 57 und 58, die selektiv dX und dY pumpen, sind flüssigkeitsmäßig mit einem Ventil 100 verbunden, das an seiner Auslassöffnung einer zweiten Einlassöffnung des Ventils 102 eine Flüssigkeit zur Verfügung stellt. Die Auslassöffnung des Ventils 102 stellt so eines der sechs Amidite oder ACN zur Verfügung. Weil jeweils nur ein Amidit zur Verfügung gestellt wird, ist von den Ventilen 94–102 jeweils nur eine der Einlassöffnungen offen.
Die Pumpe 59 zum Pumpen von Aktivator, vorzugsweise Tetrazol, aus dem behälter 26 ist nicht mit einer anderen Pumpe gepaart.
Die von dem Ventil 92, dem Ventil 102 und der Pumpe 59 ausgegebenen Flüssigkeiten werden einem entsprechenden Durchflusssensor 110, 112 und 114 zugeleitet. Diese Sensoren stellen vorzugsweise jeweils Turbinen-Durchflussmesser, wie zum Beispiel ein Modell FTO-3, hergestellt von EG&G/ Amtele AG, dar, die eine rotierende Turbine zum vorsichtigen Messen eines Volumens an Flüssigkeitsdurchfluss aufweisen. Die Durchflussmesser stellen einem Steuergerät Signale zur Verfügung, das diese Signale dazu verwendet, die Pumpen 50–59 zu regeln.
Das Amidit oder ACN, das durch den Sensor 112 fließt und der Aktivator oder das ACN, das durch den Sensor 114 fließt, werden den Einlassöffnungen des Ventils 116 zugeführt. Da das Ventil 116 ein Dreiwegeventil ist und Flüssigkeiten an zwei Einlassöffnungen gleichzeitig aufnehmen kann, wenn ein Amidit von dem Ventil 102 und ein Aktivator vom Sensor 114 zur Verfügung gestellt werden, können diese Flüssigkeiten innerhalb des Ventils 116 miteinander vermischt werden. Die durch den Sensor 110 fließende Flüssigkeit wird mit einer ersten Einlassöffnung des Ventils 118 verbunden, das an einer zweiten Einlassöffnung die Flüssigkeit von der Auslassöffnung des Ventils 116 aufnimmt. Nur eine der Einlassöffnungen zu dem Ventil 118 ist typischerweise jeweils geöffnet, wenn überhaupt eine geöffnet ist.
Die Auslassöffnung des Ventils 118 ist flüssigkeitsmäßig mit einer ersten Einlassöffnung eines Ventils 120 verbunden. Die zweite Einlassöffnung des Ventils 120 nimmt entweder ACN aus dem Behälter 82 oder Deprotektionierungsmittel aus dem Behälter 124 auf. Das ACN und das Deprotektionierungsmittel werden jeweils einem Pumpmodul zur Verfügung gestellt, das ein Ventil 126 und eine Pumpe 128 beinhaltet. Die Auslassöffnung der Pumpe 128 ist flüssigkeitsmäßig mit der zweiten Einlassöffnung des Ventils 120 verbunden. Die Pumpe 128 ist im Allgemeinen vom Design her den Pumpen 50–59 ähnlich, hat aber eine Durchflussrate, die zehnmal größer ist als die jeder der Pumpen 50–59.
Die Flüssigkeit von der Auslassöffnung des Ventils 120 wird einem piezoelektrischen Druckgeber 140 zugeführt, der den Druck in der Flüssigkeit abtastet und dem Steuergerät ein elektrisches Signal zur Verfügung stellt, das den Druck der fließenden Flüssigkeit angibt.
Die Flüssigkeit wird dann einem Ultraschall-Luftsensor 142 zugeführt, der eine in der die Flüssigkeit transportierende Leitung angeordnete Sensoreinheit und eine mit der Sensoreinheit verbundene Steuereinheit aufweist. Der Luftsensor überwacht kontinuierlich die Flüssigkeit, um Blasen oder Lücken in der Flüssigkeit in der Leitung wahrzunehmen. Solche Blasen oder Lücken sollten in einem Durchströmsystem nicht auftauchen; vielmehr sollten die verschiedenen Leitungen immer Flüssigkeit führen. Wenn Blasen wahrgenommen werden, kann der Flüssigkeitsstrom abgeschaltet werden, um zu verhindern, dass Luft flussabwärts in die Säule eindringt, und ein Alarm wird ausgelöst.
Die Flüssigkeit wird als nächstes einem UV-Monitor und einem Geber 144 zur Verfügung gestellt. Der Monitor ist vorzugsweise ein Modell UV-M/1, und der UV-Geber ist vorzugsweise ein Modell UV-P. Jedes dieser Modelle wird durch den Rechtsnachfolger der vorliegenden Erfindung vertrieben. Der Monitor besitzt eine Lichtquelle für das Zuverfügungstellen von Licht, ein Filter zum Zuverfügungstellen von Licht bei einer ersten ausgewählten Wellenlänge, und einen Lichtdetektor, der eine Menge an UV-Absorption abtastet. Die Wellenlänge wird so gewählt, dass die UV-Absorption die Menge an Nukleosiden in der Flüssigkeit angibt. Der Monitor stellt dem Geber, der Analog/Digital-Konverter mit hoher Auflösung aufweist, analoge Signale zur Verfügung, um die analogen Signale in digitale Information zur Verwendung durch eine Steuereinheit umzuwandeln.
Die Flüssigkeit von dem UV-Monitor und dem Geber 144 wird dann einem Ventil 146 zugeführt, das eine erste Auslassöffnung 147 zur Verbindung mit einer Durchflusssäule 151 aufweist, wo die Oligonukleotide hergestellt werden, und eine zweite Auslassöffnung 148, die dazu verwendet werden kann, die Säule 151 während Tests oder während des Inbetriebsetzens zu umgehen, wenn alle Flüssigkeitsleitungen betriebsfertig gemacht werden.
Wie oben angegeben gibt es eine Anzahl von Schritten, in denen Flüssigkeiten aus der Säule 151 ausgespült (oder zumindest ausreichend verdünnt) werden müssen. Konsequenterweise wird dafür Sorge getragen, dass die von diesen Spülprozessen zur Verfügung gestellten Flüssigkeiten aufgenommen und überwacht werden. Die Säule 151 ist mit einer Einlassöffnung eines Ventils 150 verbunden, das die von der Säule 151 abgegebene Flüssigkeit aufnimmt, wenn neue Flüssigkeit in die Säule eingeführt wird. Eine zweite Einlassöffnung des Ventils 150 ist mit der Auslassöffnung 148 des Ventils 146 verbunden, um die Säule 151, wenn gewünscht, zu umgehen.
Die verdrängte Flüssigkeit wird an der Auslassöffnung 150 ersten und zweiten UV-Monitoren und Gebern 152, 154 zugeführt. Diese beiden sind von der gleichen allgemeinen Art wie UV-Monitor und Geber 144. Monitor und Geber 152 verwenden die gleiche Wellenlänge wie Monitor und Geber 144, um Nukleoside, die aus der Säule 151 verdrängt wurden, zu detektieren. Durch Erhalt von Signalen von den UV-Monotoren und Gebern 144 und 152 kann das Steuergerät die Menge an in die Säule eingeführten und aus der Säule 151 verdrängten Nukleosiden bestimmen, und kann daher die Differenz bestimmen, die in der Säule aufgrund der Reaktion mit naszierendem Oligonukleotid verbleibt.
UV-Monitor und Geber 154 verwenden eine zweite, von der ersten unterschiedliche, ausgewählte Wellenlänge (die im sichtbaren Bereich und nicht im Ultravioletten liegen könnte), um die Menge an DMT abzutasten, die durch das Deprotektionierungsmittel entfernt wird. Wenn das Deprotektionierungsmittel eingeführt wird, und die Menge an durch den Monitor und den Geber 154 abgetastetem DMT einen ersten Schwellenwert überschreitet, gibt das den Beginn eines Deprotektionierungszyklus an. Wenn die abgetastete Menge an DMT dann unter eine zweiten Schwellenwert fällt, legt die Steuereinheit fest, dass der Deprotektionierungszyklus beendet ist. Obwohl dieser Prozess eine Menge an Deprotektionierungsmittel in den Leitungen zwischen der Säule und dem Ventil 120 (1) zurücklässt, ist diese Menge klein im Verhältnis zum Volumen der Säule. Das vom Monitor und dem Geber 154 durchgeführte Abtasten könnte mit einem Leitfähigkeitssensor durchgeführt werden.
Nach den UV-Monitoren und Gebern durchläuft die Flüssigkeit den Durchflusssensor 156. Zusätzlich zum allgemeinen Abtasten von verdrängtem Flüssigkeitsdurchfluss wird der Sensor 156 auch dazu verwendet, den Durchfluss der Pumpe 128 zu regeln. Der Sensor 156 ist im Allgemeinen den Sensoren 110, 112 und 114 ähnlich, ist aber vorzugsweise ein Modell FT4-B, das eine größere Menge an Flüssigkeitsfluss aufnimmt.
Von dem Durchflusssensor 156 wird die Flüssigkeit einem Hinterdruckventil und dann einem ersten Ablaufventil 160 zugeführt. Das Ventil 160 besitzt eine einzelne Einlassöffnung und zwei Auslassöffnungen, von denen die erste als Abfall-Auslauf ausgelegt ist, und von denen die zweite einem zweiten Ablaufventil 162 zur Verfügung gestellt wird. Das Ventil 162 weist ebenfalls zwei Auslassöffnungen auf. Folglich stellt die Kombination der Ventile 160 und 162 drei separate Ausläufe für Abfallstoffe zur Verfügung, die vom Spülen der Säule herrühren. Diese Abtrennung ist nützlich, weil die verschiedenen Abfallflüssigkeiten unterschiedliche Erfordernisse in Bezug auf Handhabung und Entsorgung aufweisen.
Jedes der oben beschriebenen Ventile ist vorzugsweise ein pneumatisch betätigtes Dreiöffnungs-/Dreiwege-Diaphragmaventil, vorzugsweise ein Modell hergetsellt durch Robolux AB aus Lidingo/Schweden. Die Luftventile für die Zuverfügungstellung des pneumatischen Antriebs, der die Ventile steuert, werden durch Solenoidventile gesteuert, die mit dem Steuergerät verbunden sind. Jede der Pumpen ist vorzugsweise eine Flügelzellenpumpe mit einem magnetischen Kupplungsantrieb, hergestellt von Castor in Italien. Die meisten Pumpen sind ein Modell MPA114AP mit einer Kapazität von 3–48 Litern pro Stunde, die Pumpe 128 ist ein Modell MPA116AP mit einer Kapazität von 30–480 Litern pro Stunde.
Bezugnehmend auf die bildhafte Perspektivansicht in 3 sind die oben beschriebenen Pumpen, Ventile und Sensoren in einem Außenraum eines Edelstahlgehäuses 170 angebracht. Das Gehäuse 170 beinhaltet eine durch Räder 172 gestützte untere Plattform 171, die, wenn gewünscht, für Mobilität sorgt.
Die Ventile 33–38 sind in einer Reihe in einer ersten vertikalen Höhe entlang eines unteren Abschnitts 175 des Gehäuses 170 befestigt, und die Pumpen 53–58 sind in einer Reihe in einer zweiten vertikalen Höhe, die unterhalb der ersten vertikalen Höhe liegt, befesetigt. Die Pumpen liegen direkt unterhalb der entsprechenden Ventile 33–38, die die Amidite aufnehmen. Eine Ventilanordnung, die die Ventile 94–102 zur Auswahl aus den sechs Amiditen beinhaltet, ist kurz unterhalb der Pumpen 53–58 befestigt. Die Ventilanordnung zur Auswahl einer Flüssigkeit aus allen Ausstößen der Sensoren und des Deprotektionierungsmittels, nämlich die Ventile 116, 118 und 120, sind so befestigt, dass die Ventile 116 und 118 auf der Vorderseite des Gehäuses oberhalb der Sensoren, und das Ventil 120 an einer Seitenwand 176 des Gehäuses befestigt sind.
Bezugnehmend auf 4 ist ein Teil der Pumpe und der Ventilanordnung im Querschnitt gezeigt. Wie hier gezeigt weisen die Pumpen 53–58 Außenabschnitte auf, durch die Flüssigkeit auf einer Seite der Wand 178 bereit gestellt wird, und Motorabschnitte 182 auf der Innenseite des Frontplatte 175. Die Motoren sind mit dem Steuergerät (das von dem Gehäuse entfernt angeordnet ist) durch Signaldrähte 180 verbunden. Durch diese Anordnung sind die Flüssigkeiten und die elektrischen Signale durch die Platte 175 voneinander isoliert. Obwohl nur für die Pumpen 53–58 gezeigt, findet diese Art der Isolation durch Anbringen auf dem Gehäuse 170 auch auf die Pumpen 50–52, 59 und 128 Anwendung.
Noch einmal bezugnehmend auf 3 sind elektrische, Verbindungs- und pneumatische Einlassöffnungen 184 in einer oberen Platte 186 des Gehäuses 170 befestigt. Eine Öffnung ist vorgesehen zur Aufnahme eines Netzanschlusskabels, eine für einen Relaiskontakt für einen entfernt liegenden Alarm, eine ist für die Zuverfügungstellung eines unterbrechungsfreien Netzanschlussalarmeingangs, und eine ist für die Aufnahme der Instrumentenluftversorgung durch einen Schlauch.
Bezugnehmend auf 5 nimmt, wie oben angegeben, ein Steuergerät Signale von den verschiedenen Sensoren auf und stellt Kontrollsignale an die Ventile und Pumpen bereit. Diese Steuergerätfunktionen sind mittels eines Personal Computer-Systems 200, wie zum Beispiel einem Compaq DeskPro XE, programmiert mit entsprechender Steuersoftware implementiert. Das Computersystem 200 ist mit dem Flüssigkeitshandhabungs- und verarbeitungssystem 204, das das Gehäuse 170 und die angebrachten Komponenten der 3 beinhaltet, durch das Glasfaserkabel 206 mit Glasfasermodems an beiden Enden verbunden. Diese Glasfaser-Datenübertragung erlaubt ein Multiplexen, während die Komponenten elektrisch von dem Computersystem isoliert werden. Das Computersystem 200 empfängt daher Signale von den Sensoren im System 204, einschließlich Durchflusssensoren 110, 112, 114 und 158; UV-Monitore und Geber 144, 152, 154; Druckgeber 140; und Luftsensor 142; und stellt die Antriebssignale zur Verfügung, die die Ventile und Pumpen aktivieren.
Gas, zum Beispiel Luft, zur pneumatischen Aktivierung der verschiedenen Dreiwegeventile in dem System 204 wird durch eine Gaseinspeisung 210 und durch ein Ventil 212 und ein Solenoid 214 zur Verfügung gestellt. Diese Luftzuführung ist auch mit einem automatischen, unter Druck stehenden, Kapselungssystem 220, wie zum Beispiel ein Modell 4R2100, hergestellt durch H. Ruf GmbH, verbunden, um Luft innerhalb des Gehäuses 170 zu zirkulieren. Während der Inbetriebnahme wird ein Äquivalent von sechs inneren Gehäusevolumina an Luft bei einer hohen Durchflussrate aus dem Gehäuse 170 gereinigt. Während des Betriebs wird kontinuierlich Luft bei einer niedrigen Durchflussrate gereinigt, um einen geringfügig höheren Druck innerhalb des Gehäuses als außen zu erzeugen.
Die verschiedenen Komponenten des Systems sind mit einer unterbrechungsfreien Stromversorgung verbunden und werden auf diese Weise angetrieben.
Die Vorrichtung 8 stellt auf diese Weise Oligonukleotide unter Verwendung eines Phophoramiditverfahrens, wie in dem Ablaufplan von 6 gezeigt, her. Dieses Verfahren beginnt, nachdem die Säule 151 mit der Vorrichtung verbunden, eine Auflage in der Säule bereit gestellt, ein erstes DMT-geschütztes Nukleosid an der Auflage befestigt, und die Behälter mit verschiedenen Flüssigkeiten flüssigkeitsmäßig mit der Vorrichtung verbunden wurden. Eine Abfolge von Schritten zur Zugabe eines Amidits wird unten beschrieben. In diesem Beispiel ist das nächste zur Verfügung zu stellende Amidit Deoxycytosin.
Bezugnehmend auf die 1 und 2 wird zunächst das an die Auflage gebundene DMT-geschützte Nukleotid deprotektioniert (Schritt 300). Das Deprotektionierungsmittel wird aus dem Behälter 124 durch das Ventil 126, die Pumpe 128 mit höherer Rate, dem Ventil 120 zugeführt. Das Ventil 120 wird so geschaltet, dass es Flüssigkeit nur von der Pumpe 128 und nicht von dem Ventil 118 aufnimmt, und um die Flüssigkeit durch die verschiedenen Sensoren dem Ventil 146 und dann der Säule 151 zuzuführen. Monitor und Geber 154 tasten ab, wann eine erste Schwellenmenge an aus der Säule verdrängtem DMT überschritten wird, und wann das verdrängte DMT unter eine zweite Schwellenmenge fällt. Das Volumen der Flüssigkeit wird mit dem Sensor 156 abgetastet. Der Sensor 156 misst nicht tatsächlich nur das Deprotektionierungsmittel, wenn er die Pumpe 128 regelt, weil andere Flüssigkeiten sich in der Säule und den verschiedenen Leitungen befinden, wenn das Deprotektionierungsmittel zum ersten Mal eingeführt wird. Vielmehr misst der Sensor 156 eine gewisse Menge an welcher Flüssigkeit auch immer, die ihn durchströmt. Da die verdrängte Flüssigkeit in Bezug auf das Volumen der eingeführten Flüssigkeit entspricht, bestimmt die Messung tatsächlich die Menge an eingeführtem Deprotektionierungsmittel.
Das Deprotektionierungsmittel wird dann mit ACN durch das Ventil 128, die Pumpe 128, das Ventil 120, etc., entlang desselben Weges wie das Deprotektionierungsmittel 124 (Schritt 302) ausgespült.
Der nächste Schritt ist ein Schritt der Zusammenstellung eines nächsten Nukleosids (Schritt 304). Das dC aus dem Behälter 12 wird zusammen mit dem Aktivator aus dem Behälter 26 (Schritt 308) zugeführt. Der Computer schaltet das Ventil 34, um Amidit aus dem Behälter 12 aufzunehmen, während die mit der Leitung 74 verbundene Einlassöffnung geschlossen wird. Der Computer veranlasst, dass dC durch die Pumpe 54 zu einer ersten Einlassöffnung des Ventil 94 gepumpt wird, während die Einlassöffnung zu dem Ventil von der Pumpe 53 her geschlossen wird. Jedes der Ventile 98 und 102 ist ebenfalls nur an einer Öffnung geöffnet, um Flüssigkeit von dem Ventil 94 beziehungsweise dem Ventil 98 aufzunehmen. Der Durchflusssensor 112 tastet den Durchfluss der Flüssigkeit ab und stellt dem Steuergerät ein Signal zur Verfügung, was dann das Ventil 34 veranlasst, auf ACN umzuschalten, wenn die Menge Amidit, die den Sensor 112 durchfließt, ausreichend ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Menge ausreichend, wenn 50% mehr Nukleoside (auf molarer Basis) als die Anzahl an in der Säule hergestellter Olegonukleotide, d. h., 1,5 molare Äquivalente an Nukleotiden, existieren. Bei der Bestimmung dieser Menge berücksichtigt das Steuergerät, dass die Pumpe 54 eine gewisse Menge an Startzeit benötigt, bevor sie ihre gewünschte Rate erreicht, und integriert daher die Pumprate, um die Menge an Flüssigkeit zu akkumulieren. Das Ventil 116 wird dann eingestellt, um Flüssigkeit durch den Sensor 112 aufzunehmen, und um diese Flüssigkeit einer Einlassöffnung des Ventils 118 zuzuführen.
Unterdessen empfängt das Ventil 116 den Aktivator aus dem Behälter 26 durch das Ventil 39, die Pumpe 59 und den Sensor 114. Beide Öffnungen des Ventils 116 werden offen gehalten, so dass das dC und der Aktivator im Ventil 116 zusammengemischt und zusammen einem Einlass des Ventils 118 zugeführt werden. Die Pumpen 54 und 59 zum Pumpen des dC beziehungsweise des Aktivators können bei der gleichen Rate für eine 50-50-Mischung arbeiten, oder die Pumpe 59 kann schneller betrieben werden, um eine 60-40-Mischung bereit zu stellen. Die Kombination wird einer ersten Einlassöffnung des Ventils 120 zur Verfügung gestellt, während eine zweite Einlassöffnung, die mit dem Durchflusssensor 110 verbunden ist, um das Abdeckreagenz, das Oxidationsmittel oder ACN aufzunehmen, geschlossen wird.
Das dC und der Aktivator werden dann durch den Druckgeber 140, den Luftsensor 142 und den UV-Monitor und Geber 144 und zu einer Einlassöffnung des Ventils 146 geleitet. Das Ventil 146 leitet dann das dC und den Aktivator zu der Säule. Das dC und der Aktivator werden zusammen bei einer Rate gepumpt, die eine gewünschte Kontaktzeit sicherstellt, z. B., eine Minute vom Beginn der Zeit an, wenn das aktiveirte dC die naszierende Oligonukleotidsequenz kontaktiert, bis zu der Zeit wenn der dC-Fluss die Säule passiert hat.
Das dC und der Aktivator werden dann zu den Monitoren und Gebern geleitet. Die Menge an an den Einlass- und Auslassseiten der Säule 151 mit den Monitoren und Gebern 144 und 152 abgetastetem Nukleosid wird geprüft, um sicherzustellen, dass eine aureichende Menge an Amidit verbraucht wird. Wenn nicht genug Amidit verbraucht wird, veranlasst das Steuergerät, dass mehr Amidit zugegeben wird, z. B., ungefähr 0,5 molare Äquivalente.
Wenn eine ausreichende Menge an dC und Aktivator gepumpt und abgetastet wurde, werden die Ventile 34 und 39 geschaltet, um ACN aus den Leitungen 74 beziehungsweise 79 aufzunehmen (Schritt 308). Die Menge an ausgewähltem ACN ist ausreichend, um die Leitungen bis zu der Säule 151 von verbleibendem dC und Aktivator zu reinigen. Da die Flüssigkeit kontinuierlich fließt, werden die Ventile 34 und 39 sogar geschaltet, während dC und Aktivator noch durch die Säule und durch die Abfallstoffauslässe fließen.
Es folgt ein Oxidationsschritt (Schritt 310), in dem ein Oxidationsmittel durch das Ventil 32, die Pumpe 52, das Ventil 92, den Sensor 110, etc. zugeführt wird. Durch Schalten des Ventils 32, um ACN aufzunehmen, wird dann das Oxidationsmittel ausgewaschen (Schritt 314).
Wenn eine ausreichende Menge an ACN verwendet wurde, um die Leitungen des Oxidationsmittels zu spülen, wird der Abdeckschritt (Schritt 316) durch Zugabe der Abdeckreagenzien, Cap A und Cap B, mit gleichen Raten mit den Pumpen 50, 51 gepumpt und im Ventil 90 zusammengemischt, durchgeführt. Die Mischung wird der Säule durch das Ventil 92, den Sensor 110, das Ventil 118, das Ventil 120, den Druckgeber 140, den Luftsensor 142, den UV-Monitor und Geber 144, und das Ventil 146 zugeführt (Schritt 318). Wie oben diskutiert blockiert das Abdeckreagenz die vorher unreagierten Hydroxylgruppen auf der Auflage, ausgenommen die mit DMT-geschützten Hydroxylgruppen.
Nachdem eine ausreichende Menge an Abdeckreagenz zur Verfügung gestellt wurde, wird es mit ACN aus dem Behälter 82 ausgespült (Schritt 320). Das ACN wird durch Leitungen 70, 71 zu den Ventilen 30, 31 geleitet, von denen es es durch das Ventil 90, etc., dem gleichen Weg wie das Cap A und das Cap B folgend, geleitet wird.
Wenn zu dieser Zeit das Oligonukleotid noch nicht fertiggestellt ist (Schritt 322), werden die Schritte wiederholt. Wenn das Oligonukleotid fertiggestellt ist, wird das an die Auflage gebundene, völlig geschützte Oligonukleotid von der Säule 151 entfernt, getrocknet, und mit einem Spaltungs- und Deprotektionierungsmittel, wie zum Beispiel Ammoniumhydroxid, behandelt, um das Oligonukleotid von der Auflage abzuspalten und die verschiedenen Schutzgruppen zu entfernen.
Es wurde gefunden, dass bis zu 100 Millimol der Oligonukleotide mit einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können. Die Vorrichtung gestattet es, dass diese Oligonukleotide effizienter durch vorsichtiges Messen und Überwachen der Flüssigkeiten mit individuell zugeordneten Pumpen hergestellt werden können. Die effizientere Verwendung von Materialien ist bei größeren verwendeten Mengen, um diese größere Anzahl an Oligonukleotiden herzustellen, insbesondere wichtig.
Nachdem eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben wurde, sollte klar sein, dass andere Modifikationen gemacht werden können, ohne vom Umfang der Erfindung, so wie er durch die anhängenden Patentansprüche definiert wird, abzuweichen. Zum Beispiel ist selbstverständlich dass, obwohl spezielle Verbindungen beispielhaft erwähnt wurden, diese nur Beispiele sind und dass andere Modelle oder Arten solcher Verbindungen verwendet werden können. Obwohl die Vorrichtung zur Verwendung mit einem Phosphoramiditverfahren beschrieben wurde, können die Amidite durch andere Monomere ausgetauscht werden, wenn die Vorrichtung verwendet wird, um Oligonukleotide mit einem anderen Verfahren herzustellen.

Claims

Vorrichtung zum Synthetisieren eines Oligonukleotids aus Oligonukleotid-Monomeren durch einen Durchströmprozess, wobei die Vorrichtung Flüssigkeitsverbindungen aufweist a) zu Behältern (10, 12, 14, 16), um verschiedene Arten von Monomeren aufzunehmen, b) zur Bereitstellung jeweils eines Typs der Monomeren von den Behältern zu einem Reaktionsgefäß (151), in dem das Oligonukleotid synthetisiert wird, und c) zur Aufnahme von aus dem Reaktionsgefäß (151) verdrängter Flüssigkeit, wobei die Vorrichtung umfasst: – eine Mehrzahl von Pumpen (53–56), wobei jede der Pumpen mit einem der unterschiedlichen Typen von Monomeren verbunden ist; – eine steuerbare Ventileinrichtung, die Ventile (94, 96, 98) umfasst, die eine Flüssigkeitsverbindung zu Auslassöffnungen der Mehrzahl von Pumpen (53-56) aufweisen, um die Monomeren unter der Mehrzahl von Pumpen auszuwählen, und um das ausgewählte Monomer zur Einleitung in das Reaktionsgefäß (151) bereit zu stellen; – einen Durchflusssensor (112) zum Abtasten der Menge des Monomerenflusses; und – ein Steuergerät zum Empfangen von Signalen des Sensors (112) und zum Steuern der Mehrzahl von Pumpen (53–56) und der steuerbaren Ventileinrichtung, die Ventile (94, 96, 98) umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 1, worin ein Ventil (jeweils 33–36) vor jeder Pumpe der Mehrzahl von Pumpen (53–56) existiert, wobei das Ventil einen Einlass (73–76) zur Aufnahme eines Spülmediums aufweist, und wobei die Ventile (33–36) durch das Steuergerät steuerbar sind, um zwischen dem zugeordneten Monomer und dem Spülmedium auszuwählen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1–2, weiterhin umfassend ein Gehäuse (170), das einen Innen- und einen Aussenraum der Vorrichtung definiert, wobei jede Pumpe der Mehrzahl von Pumpen (53–56) an dem Gehäuse (170) der Vorrichtung befestigt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, worin jede Pumpe der Mehrzahl von Pumpen (53–56) ein erstes Ende zur Aufnahme von Flüssigkeit und ein zweites Ende zum Empfang eines Signals zur Steuerung der Pumpe (53–56) aufweist, wobei jede Pumpe so befestigt ist, dass sie sich so durch das Gehäuse hindurch erstreckt, dass sich das erste Ende auf der Aussenseite des Gehäuses (170) und das zweite Ende sich auf der Innenseite des Gehäuses (170) befindet.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3–4, weiterhin umfassend ein Gasspülungssystem (210, 212, 214) zum Spülen eines Gases durch den Innenraum des Gehäuses (170).
Vorrichtung nach Anspruch 5, worin die Ventile (33–36), wenn vorhanden, und die Ventile (94, 96, 98) in der Ventileinrichtung pneumatisch aktiviert werden, wobei das Gasspülungssystem Gas zur Aktivierung der Ventile liefert.
Vorrichtung nach Anspruch 6, worin das Gasspülungssystem durch das Steuergerät steuerbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1–7, worin die Vorrichtung eine Pumpe (128) zum Pumpen eines Deprotektionierungsmittels zur Entfernung einer Schutzgruppe von dem in dem Reaktionsgefäß (151) synthetisierten Oligonukleotid aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 8, weiterhin umfassend einen Schutzgruppensensor (154) zum Abtasten der aus dem Reaktionsgefäß (151) entfernten Schutzgruppe, wobei das Steuergerät die Pumpe (128) zum Pumpen eines Deprotektionierungsmittels als Antwort auf den Schutzgruppensensor (154) steuert.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1–9, weiterhin umfassend ein Ventil für Abdeckreagenzien (90), das einen ersten Einlass zur Aufnahme eines ersten Abdeckreagenzes und einen zweiten Einlass zur Aufnahme eines zweiten Abdeckreagenzes, sowie einen Auslass zur Zuführung von Abdeckreagenz zu dem Reaktonsgefäß (151) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 10. worin die ersten und zweiten Einlassöffnungen des Ventils für Abdeckreagenzien (90) gleichzeitig offen gehalten werden können, um die ersten und zweiten Abdeckreagenzien zu mischen, wobei das Ventil (90) durch das Steuergerät steuerbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1–11, weiterhin umfassend (a) eine Flüssigkeitsverbindung, die einen Aktivator zur Verfügung stellt und die eine Pumpe (59) und ein Ventil (39) und einen Durchflusssensor (114) umfasst; und (b) ein Mischventil (116), das eine erste Öffnung zur Aufnahme des ausgewählten Monomeren und eine zweite Öffnung zur Aufnahme eines Aktivators aufweist, wobei die ersten und zweiten Öffnungen gleichzeitig offen gehalten werden können, um das ausgewählte Monomere und den Aktivator in dem Mischventil (116) zu mischen.
Vorrichtung nach Anspruch 12, worin die Pumpe (59) durch das Steuergerät als Antwort auf Signale des Durchflusssensors (114) steuerbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1–13, worin die Ventile (90, 116) pneumatisch durch Gas aus dem Gasspülungssystem (210, 212, 214) aktiviert werden.