CN115038709A - 用于合成寡核苷酸的设备及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于合成寡核苷酸和相关化合物的装置和方法。

Description

用于合成寡核苷酸的设备及其制备方法
本发明一般性地涉及工业或实验室规模的低聚物合成领域。公开了用于合成寡聚体的改进的方法和装置，特别是对于寡核苷酸和相关聚合物的合成。特别地，本发明的方法可以高效地制备试剂，以便将其输入用于合成所述低聚物的装置中。
寡核苷酸和相关寡聚体可以通过各种合成策略产生，包括常用的亚磷酰胺法(phosphoramidite method)。该合成策略通常包括向不断增长中的低聚物链，逐步添加单体或低聚结构单元(building blocks)，例如核苷亚磷酰胺。通常，生长中的寡聚体链由核苷酸或其类似物组成，并固定在固体支持物上，例如通过核糖部分的羟基。低聚物链上的反应性基团被合适的保护基团覆盖而防止副反应。例如，生长中的寡核苷酸链可以通过3'羟基固定到固体支持物上，并可以带有保护基团，如表1中列出的保护基团，以阻断核糖部分的羟基部分和碱基部分的环外氨基(exocyclic amino groups)发生副反应.
表1：寡核苷酸合成中常用保护基的非限制性选择
Figure BDA0003775368660000011
一般而言，寡核苷酸的化学合成的迭代方法通常依赖于两类保护基团，第一类保护基团用于保护位于碱基/碱基类似物和核糖/核糖类似物部分(moieties)中的那些不参与链延长的官能团，第二种类型的是临时保护基用于控制链的骨架延伸：临时保护基位于待添加的结构单元上，用于避免该结构单元的双重插入或结构单元的多聚化。第一类和第二类保护基相互正交(orthogonal)，也就是说可以在不影响一类保护基的条件下除去另一种保护基。通常，第一类保护基团可在碱性条件下除去，并且是“永久性的”，因为它们只有在链组装完成后才会被去除；第二种类型的临时保护基团可在酸性条件下除去，并且在每个合成循环中被去除一次。因此，偶联循环包括将受保护的结构单元偶联到寡核苷酸骨架的未保护末端的步骤，然后对由此延伸的寡核苷酸进行脱保护，以便为随后的偶联循环做准备。
对于亚磷酰胺寡核苷酸合成，合成循环通常从5'羟基的选择性脱保护开始，这是通过将固体支持物与脱保护试剂DR(通常是脱三苯甲基化试剂其可去除DMT基团)温育来实现的。接下来，将生长的寡核苷酸链与带有适当保护基团的核苷亚磷酰胺和活化试剂组成的偶联试剂CR一起温育。然后使用氧化剂OR将由偶联反应产生的三配位亚磷酸三酯氧化以产生磷酸三酯。在硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯合成的情况下，使用硫化试剂SR进行硫化而不是氧化，而产生硫代磷酸三酯。加帽步骤包括将固体支持物与加帽试剂(cappingreagent，也称为封闭试剂BR)一起孵育，以封闭树脂上的任何未反应基团，从而避免在随后的偶联轮次中出现缺失序列。在其他情况下，可以在三配位亚磷酸三酯的氧化之前或之后进行封端。在每个步骤之间，树脂可以用溶剂洗涤，通常是乙腈或甲苯。生长中的寡核苷酸链可以任何可能的方式固定在固体支持物上，例如，通过环外胺或通过核糖/核糖类似物部分的羟基。此外，还公开了亚磷酰胺合成的变体模式，例如采用5'-亚磷酰胺的反向5'-3'寡核苷酸合成。
对于膦酸寡核苷酸合成，使用带有酸敏感性临时保护基团(如DMT)的核苷H-膦酸单酯。核苷间的H-膦酸二酯键在链组装后被氧化。取决于所使用的反应条件，在该步骤中可能会产生磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、硒酸磷酸酯或氨基磷酸酯类似物。
上述试剂的组成可能会有所不同，具体取决于所使用的确切方案。表2给出了常用组合物的非限制性总结。
表2：用于寡核苷酸合成的试剂混合物的非限制性例子
Figure BDA0003775368660000021
Figure BDA0003775368660000031
*腐蚀性试剂
US 2008/0058512和US 5,681,534公开了用于制备寡核苷酸的装置。采用市售的自动化寡核苷酸合成仪，这样在罐中预先制备的去保护溶液DS、氧化溶液OS和硫化溶液SS，可以通过一个或多个泵送回路将其应用于合成反应器。通过临时混合两种预制溶液制备封闭溶液BS。将亚磷酰胺的乙腈溶液与活化剂溶液在合成器中混合成偶联溶液CS
然而，这种布局是不利的，因为它不允许“细调”特定偶联循环的试剂组成，例如通过变化去保护剂的浓度。此外，它需要使用大量的罐集合，而罐的体积限制了合成规模的放大。为了克服这些问题，本发明提供了一种改进的寡核苷酸合成装置，其中所有试剂都可以通过临时混合按需制备。纯液体试剂可以直接从它们各自的储存容器送入系统。而非液体的试剂可以作为浓缩储备溶液加入系统。作为进一步的改进，本发明提供了一种用于寡核苷酸合成的装置，其包括批量反应器(batch reactor)而不是柱床反应器(column bedreactor)，从而提供进一步的选择以执行和控制合成过程。
在一个特定的方面，本发明提供了一种通过为每个偶联循环定义保护试剂的组成来“细调”去保护试剂组成的方法。之前有报道，去保护步骤需要在寻求一种困难的平衡，即避免酸催化的寡核苷酸中间体的降解，且同时实现保护基团的有效去除。为了解决这个问题，现有技术比较了各种去保护组合物，例如，Septak教导使用15％DCA而不是3％DCA或3％TCA(Nucleic Acids Research,1996,Vol.24,No.153053–3058)。然而，据本发明人所知，用于寡核苷酸合成的所有自动化方法都依赖于在给定合成的所有循环中使用相同的脱保护剂。相比之下，本发明提供了一种用于在每个偶联循环中均可单独调节去保护试剂的组成的装置和方法。
因此，本发明的一个实施方案涉及一种用于自动合成寡核苷酸的装置，包括：
a)反应容器，其通过液体导管连接到废物容器；
b)液体供应单元，用于将液体试剂输送到反应容器；
c)旁通管道，其允许将液体从液体供应单元直接引导到废物容器中而不经过反应容器；和
d)一个控制单元
其特征在于，所述液体供应单元包括：
b-1)至少一个混合装置，其连接到
b-2)至少两条液体供应管线，每条包括至少一个具有n个液体入口的液体导管，其中n是1到25之间的整数，以及至少一个液体泵。
因此，本发明的另一方面涉及一种用于合成低聚物的装置，包括：
a)反应容器，其通过液体导管连接到废物容器；
b)液体供应单元，用于将液体试剂输送到反应容器；
c)旁通管道，其允许将液体从液体供应单元直接引导到废物容器中而不经过反应容器；和
d)一个控制单元
其中液体供应单元包括：
b-1)至少一个混合装置，其连接到
b-2)至少4条上游液体供应管线，每条包括1条具有n个液体入口的液体导管，其中n为1至25之间的整数，以及1个液体泵；和
b-3)n个传感器，其中n是等于或大于1的整数，这些传感器位于混合装置的下游并确定从混合装置流出的液体的至少一种特性，其中由传感器提供的至少一个读数用作反馈信号以调节一个或多个所述液体泵的运作。
优选地，该装置用于寡核苷酸的固相合成，特别是核糖核酸、2'-脱氧核糖核酸、寡核苷酸硫代磷酸酯、异种核酸和相关分子。在一些实施例中，该装置用于通过亚磷酰胺法进行固相合成的方法。
如本文所用，表述“寡核苷酸”广义地指包含通过磷酸二酯部分或通过类似结构连接的至少两个核苷单元的任何寡聚体。所述类似结构例如那些存在于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、非对映体纯的硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、砷酸二酯和硒代磷酸酯中的结构。天然存在的核苷单元通常包含核糖或2'-脱氧核糖部分，以及选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的核基。如本文所用，术语核苷单元包括天然存在的核苷以及人工化合物。后者可以在核糖/核糖类似物部分带有取代基，例如-F、-OMe(-O-CH3)或-甲氧基乙基(-O-CH2-CH2-O-CH3，又名MOE，-O-甲氧基乙基)等取代基，或者核糖可以含有另外的亚甲基桥，连接2'羟基与4'碳，或核糖部分可以被另一种环状单糖取代，例如戊糖(例如阿拉伯糖)或己糖、非环状单糖(例如苏糖)，或其它替代物结构，例如环己烯、苏氨醇、丝氨醇或乙二醇。所有这些结构在本文中可称为“核糖类似物”。同样，人工核苷可能含有非标准的核基、核基的人工类似物或无核基位点(abasic sites)。脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)之外的寡核苷酸的非限制性例子是锁核酸(LNA)、氨基LNA、受限乙基核酸类似物(cET)、桥接核酸(BNA)、三环DNA、解锁核酸(UNA)、亚磷酰胺吗啉代寡核苷酸(PMO)iRNA、dsRNA和寡核苷酸硫代磷酸酯，以及它们的衍生物和类似物。
如本文所用，术语“液体供应单元”(liquid supply unit)用于指代根据本发明的设备的那些部件，其用于提供待装入反应器(反应容器)中的液体试剂。特别地，液体供应单元可以包括一个或多个液体入口、储存容器或液体罐、液体导管、泵、阀、液体混合装置、热交换器、歧管和传感器。
如本文所用，术语“液体供应管线”(liquid supply line)用于指代包括液体泵和一个或多个液体入口的液体导管，可连接到一个或多个液体容器。每个液体入口和导管之间的流体连接可以通过阀来调节。液体供应管线因此可以提供一个或多个从所述液体入口/容器到下游装置的受控液体流。泵和阀可以由就地控制单元和/或中央控制单元控制。在一些实施例中，每条液体供应管线具有1至25个、优选3至10个入口。一个或多个这样的入口可以连接到分支的液体导管，该液体导管又可连接到多个储存容器。每个液体供应管线的最外面的入口可以连接到溶剂和液氮的供应源，以便在各步骤之间清洗管线。
在一些实施例中，该设备的液体供应单元还包括连接到混合装置的第三液体供应管线，所述第三液体供应管线包括具有n个液体入口的至少一个液体导管和至少一个液体泵，其中n是1和25之间的整数。
如贯穿本文档所使用的，如果本装置的两个部分从彼此接收输入，则可以说它们是“连接的”(connected)。例如，这些部件可以通过液体导管连接以便液体从一个部件流向另一个部件。
液体入口(liquid inlet)可连接至储存容器，该储存容器可适于将其内容物保持在惰性气体下。例如，容器可以包括可连接至真空源的可控阀，以及可连接至诸如氮气的惰性气体源的第二可控阀。对于自动惰性化，储存容器可以另外包括电子或机械压力控制器并且阀门可以自动操作。对于手动惰性化，储存容器可以包括压力指示器和手动控制的阀门。
储存容器可以由任何合适的材料制成，例如塑料。金属、搪瓷或聚合物，如聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚醚醚酮。优选地，选择的材料对将会暴露于的试剂基本上惰性。取决于它们所含的内容物，不同的储存容器可以由不同的材料制成。优选地，该材料符合药品、化妆品和/或食品和饮料生产的适用法规，即符合良好生产规范(GMP)。此外，为了减小静电引燃的风险，可以使用导电材料。在一些实施例中，储存容器由不锈钢或
Figure BDA0003775368660000061
合金或涂有导电聚合物的金属制成。储存容器的大小可根据合成规模选择，可根据内容物的体积同时使用不同大小的储存容器。在一些实施例中，储存容器可具有约1升(L)至40立方米的内容积，例如约1,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,100,150,200,550,770,990,1120,1300,1500升。在一些实施例中，一些储存容器可具有约10至40升的内部容积。在一些实施例中，用于溶剂的储存容器，例如对于乙腈和甲苯，可采用容积为20至40立方米的罐。其他试剂，例如特定的受保护核苷亚磷酰胺溶液，可以用小得多的储存容器提供，如体积约为1至5升的容器。
本领域技术人员将理解任何反应容器都可以与上述液体供应单元一起使用。反应容器可以由任何合适的材料制成，例如金属、玻璃、搪瓷或聚合物，例如聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚醚醚酮。优选地，选择的材料对将会暴露于的试剂基本上惰性，并且符合良好生产规范(GMP)的材料。此外，为了减小静电引燃的风险，可以使用导电材料。反应容器的尺寸大小可以根据预期的合成规模来选择。例如，可以使用最大内部容积为5、10、30、40、50、60、70、75、80、90、100、150或200升的柱反应器。作为进一步的例子，最大内部容积为5、10、30、40、50、60、70、75、80、90、100、150、200、250、300、450、600或650升的批量式反应器(batch reactor)也是可以使用的。作为进一步的例子，可以使用内部容积为100或200ml的反应器。在本发明的一些实施方案中，反应容器的内部容积为约30-250升，优选约40-200升，最优选约40-150升。如本文所用，表述“约”表示可能存在给定值的正负10％的偏差。
例如，固相寡核苷酸合成通常使用填充有固体支持物的柱反应器进行，生长中的寡核苷酸链系在该固体支持物上。柱反应器通常可以包括底部玻璃滤料和顶部玻璃滤料，固体载体填充在其间。固体支持物可从各种供应商处获得，其可以带有或没有带有附着在支持物上的可选择的第一个受保护核苷酸。
特别是如果使用柱式反应器，通过泵使试剂混合物在柱上循环可能是有利的。因此，在一些实施例中，本装置还包括循环回路，其通过泵将来自连接反应容器和废物容器的液体导管的流引导回反应容器。循环回路可以集成到设备的液体供应管线之一中。在这种情况下，循环回路包括在液体供应管线之一中，该液体供应管线通过其入口之一和多路阀连接到液体导管，其泵可以驱动来自液体导管的流体再循环，将反应容器和废物容器连接起来，通过混合装置回到反应容器中。循环回路可以布置成使得通过柱的液体流动的方向可以颠倒。例如，柱式反应器可以通过阀组件连接到液体供应单元，允许液体以正向和反向流过反应器，也可以完全绕过反应器。
作为替代，发明人发现也可以使用批量反应器。该反应器可包括底部玻璃滤料或滤布以将支撑件保持在反应器内、混合装置和一个或多个用于冲洗反应器内表面的喷射球或喷嘴。可以使用旋转或固定的喷射球或喷嘴，其位于反应容器的顶部并连接到液体源。本领域技术人员通常会根据待混合的材料选择混合装置，如根据所用支撑的物理坚固性。例如，可以使用包括旋转叶轮的搅拌器。这种叶轮可以是湍流混合器，导致反应容器内的液体轴向、混合或径向流动。已知的叶轮包括船用型螺旋桨、变桨叶轮机、平叶轮机和平叶桨。挡板叶片的使用可能有助于改善混合。替代地或另外地，可以通过将气体鼓泡通过液体来实现混合。可替代地或另外地，混合可以通过液体循环来实现，例如，通过泵送回路(pumpingcircuit)。本领域技术人员通常会选择混合方式以实现物质在反应介质内的有效分布，且同时避免起泡。当在反应容器内使用固体支持物时，容器和搅拌器叶片优选设计成使剪切力最小化。优选地，混合装置的操作可以由控制单元控制。批量反应器可以优选地适于在保护气氛下工作。例如，批量式反应器的反应容器可以包括可以连接到真空源的第一可控阀、可以连接到诸如氮气的惰性气体源的第二可控阀，以及电子或机械压力控制器。优选地，阀门可以自动操作并且在控制单元的控制下。为了便于温度控制，批量反应器可以是夹套反应器。与填料柱反应器相比，批量反应器的使用具有几个优点，因为它允许对固体材料进行取样，且反应条件可以在整个反应器中更为均匀。
因此，本发明的另一实施方式涉及寡核苷酸的固相合成装置，其特征在于，在批量反应器内进行合成。在一些实施方案中，所述反应器包括混合装置、一个或多个用于冲洗反应器内表面的喷射球或喷嘴，并且适用于在保护性气体下工作。
本领域技术人员很容易理解，可以使用各种阀，优选自动阀，来控制整个设备的液体流动。例如，流入反应容器和流出反应容器的液体可以通过集成到流入和流出液体导管中的阀来控制。
本领域技术人员将理解，任何混合装置都可以与本发明一起使用，其可以使最少2个液体流入，例如3或4个液体流入，形成一个均质溶液。因此，本领域技术人员会根据混合效果、尺寸和压降等方面选择适合的混合装置。混合装置可以包括一系列混合三通或混合四通(mixing tees或mixing crosses)，连续地混合至少两个进入流(incoming flow)。混合装置可以包括一个或多个混合三通或T形阀和热交换器。混合装置可以包括静态混合器。混合装置可以包括至少2个入口和一个出口的静态混合器。在一些实施例中，混合装置可以包括一个多路阀,或一个T型阀和一个静态混合器。多路阀和静态混合器可以布置成使得多个进入流被阀合并，然后被引导通过静态混合器。混合装置可以包括一个歧管，该歧管将至少两个液体供应管线的液体流合并，并将合并的流引导到静态混合器或热交换器中。混合装置可以配置夹套以允许加热或冷却混合液体。
在一个实施例中，至少混合装置的内表面和液体供应管线之一的内表面由耐酸材料制成。这意味着至少一个液体供应管线的内表面，从至少一个液体入口、经由泵直到并包括混合装置，均由耐酸材料制成或涂覆有耐酸材料。如本文所用，“耐酸”意味着材料对酸性溶液具有抗性或基本惰性。酸性溶液，例如50％DCA(二氯乙酸)的甲苯溶液和200ppm水。还可以使用包含200ppm水的100％DCA溶液来评估耐酸性。可以使用完善的程序测试材料的这种特性，例如2018年3月版的DIN 50905-4中规定的程序。如果金属材料没有显示局部腐蚀迹象并且暴露于含酸液体后材料的损失低于0.01毫米/年，则它可以被归类为耐酸材料。如果金属材料不会将显着量的可浸出物或可萃取物释放到它所接触的酸溶液中，它可以被归类为耐酸材料。所述显着量是指，如果这个量对要合成的低聚物产生可检测的污染，且根据监管机构制定的指导方针，这些污染对于药物成分来说是不可接受的，那么这个量可能被认为是显着的。例如，如果在合成的寡核苷酸中检测不到可浸出物或可提取物，这个材料可被认为是耐酸的，即可耐受50％DCA(二氯乙酸)的甲苯溶液含200ppm水或100％DCA。在一个实施例中，至少混合装置的内表面和液体供应管线之一的内表面由耐酸合金制成。此外，至少混合装置和液体供应管线之一的内表面可以包括耐酸聚合物涂层或玻璃涂层。例如，耐酸材料可选自镍基合金、聚合物涂层和玻璃衬里。合适的聚合物涂层包括聚四氟乙烯(PTFE)、全氟烷氧基烷烃(PFA)、乙烯四C22、C-2000和C276合金，它们可分别通过材料编号/金属和合金统一编号系统(UNS)编号识别：2.4610/N06455、2.4602/NO06022、2.4675/NO6200和2.4819/N10276。
根据本发明的设备还可以包括n个传感器，其中n是等于或大于1的整数，这些传感器位于混合装置的下游并且确定从混合装置中流出液体的至少一种性质。
n个传感器可用于分析从混合装置流出的液体的成分，从而向控制单元提供信号。例如，由至少一个传感器提供的至少一个读数可用作反馈信号以调节液体供应单元中包括的一个或多个泵的活动。这可以用来调节从液体泵进入混合装置的流量，从而实现并保持给定的设定值。因此，传感器可以是控制各个液体供应管线的泵的反馈回路的一部分。附加地或替代地，该设备可以包括至少一个流量传感器，该流量传感器集成到混合装置上游的每条液体供应管线中，例如，混合装置。位于泵和混合装置之间，其中由所述传感器提供的至少一个读数用作反馈信号以调节一个或多个泵的活动。此外，由至少一个传感器提供的至少一个读数可用于控制液体流是被引导到反应容器中，还是被引导到废物容器中而不通过反应容器。在一些实施例中，传感器的数量n为1、2、3或4个。本领域技术人员将理解多种传感器可能适用于此装置，并会根据所设想的合成化学选择适当的传感器。在一些实施例中，n个传感器独立地选自红外光谱仪、密度传感器、折射仪、电导率传感器、温度传感器、阻抗传感器、UV/Vis吸收传感器。在一些实施例中，n个传感器独立地选自红外光谱仪、折射仪、密度传感器、电导率传感器、温度传感器、阻抗传感器、UV/Vis吸收传感器，其中在n个传感器中的至少一个是红外光谱仪。在一些实施例中，n个传感器独立地选自红外光谱仪、折射仪、密度传感器、电导率传感器、温度传感器、阻抗传感器、UV/Vis吸收传感器，其中在n个传感器中的至少一个是密度传感器。另外，一个传感器可以集成到连接反应容器和废物容器的液体导管。该传感器可以选自红外光谱仪、密度传感器、折射仪、电导率传感器、温度传感器、阻抗传感器、UV/Vis吸收传感器。在一个实施例中，该设备可以包括电导率传感器、温度传感器和UV吸收传感器，这些传感器位于混合装置的下游并且确定从混合装置流出的液体的至少一种性质。
液体供应单元还可包括至少一个热交换器。热交换器可以定位在混合装置和第一个所述n个传感器之间，或者它可以是混合装置的一部分。
将要集成到液体供应管线中的液体泵优选地设计成其表面对将要暴露于的试剂是惰性的。优选地，至少一个泵具有耐腐蚀表面(特别是如上定义的“耐酸”表面)，例如，由哈氏合金或聚四氟乙烯制成。特别适合在液体供应管线内使用的液体泵应提供具有最小脉动的恒定流量，并允许液体流速的无缝变化。例如，可以使用隔膜泵(diaphragm pump)。在本发明的一些实施例中，每个泵可以提供高达50L/min、80L/min、100L/min、200L/min或300L/min的最大流速。在一些实施例中，一个泵中可提供100L/min的最大流速，而其他泵可提供60L/min的最大流速。在一个实施例中，第一和第二液体供应管线的泵p1和p2可以提供10ml/min，并且第三液体供应管线的泵p3具有大约50ml/min的泵送功率。
控制单元可以控制所述设备的泵和自动阀等部件的活动，并从操作员以及系统的传感器(n个传感器和/或另外的传感器)接收信号。控制单元可以包括多个设备，这些设备形成不同的控制层级，如监督控制和数据采集(SCADA)控制系统的架构。例如，控制单元可以包括一个或多个远程监控计算机，其从外围设备收集数据并向其发送控制命令，以及一个或多个外围设备，例如远程终端单元(RTU)、可编程逻辑控制器(PLC)和用户GUI面板等界面。PLC和监控SCADA软件可以接收来自现场传感器的输入，例如温度、压力、液位、重量、位置或浓度等传感器。一个或多个SCADA监督计算平台可以另外与制造执行系统(MES)交互，MES进而与企业资源规划(ERP)系统交互。此外，一个或多个SCADA监控计算平台可以通过发送特定的过程参数来执行日志记录任务，例如将有关脱保护试剂成分的传感器数据存储到专用数据库中。在一些实施例中，控制单元包括至少一个SCADA系统和至少一个PLC，其具有控制泵和阀的活动的传感器和执行器。或者，本地控制单元可以根据从混合单元下游的传感器接收到的信号来调节泵的功能。因此，本地控制单元可以在中央控制单元的监督下，也可以是独立的。
控制单元可以优选地被配置为控制包括耦合循环的至少两次迭代的合成程序(synthesis protocol)的执行，其中该程序单独定义每个耦合循环的酸性脱保护试剂的组成，且其中控制单元相应地引导试剂流动经过至少一个液体供应管线，其内表面由耐酸材料制成。控制单元可以允许用户定义工艺步骤的顺序，特别是每个偶联循环的偶联试剂的组成。当执行该合成方案时，控制单元可以指导阀门和泵的动作，以便在每个耦合循环中实现去保护试剂的特定组成，并且可以通过来自现场传感器的信号来控制所述组成.，例如信号来自混合装置上游的流量传感器，或来自位于混合装置和反应容器之间的传感器。
在一些实施例中，根据本发明的设备——或至少其暴露的表面——由一种材料制成，该材料对将会暴露于其中的试剂基本上是惰性的。在一些实施例中，该装置——或至少其暴露的表面——由不锈钢、合金或聚合物涂层金属制成。优选地，该材料符合药品、化妆品和/或食品和饮料生产的适用法规，即符合良好生产规范(GMP)。在一些实施例中，至少混合装置的暴露表面和设备的一条线由耐酸材料制成，所述一条线即一个液体导管，其包括一个或多个液体入口、阀门和泵，其终止于混合装置的入口。耐酸材料制成例如耐酸合金或耐酸聚合物涂层，而设备的其他部分由不锈钢制成。
根据本发明的装置的操作可以根据以下详述的步骤。尽管将参照图4解释这些步骤以进行说明，但这不应解释为这些说明仅限制于图4的特定设备。此外，应理解，可以使用其他的试剂，这取决于合成策略。因此，以下步骤序列仅是一个特定耦合循环内的一个可能例程的示例。
1)液体供应管线的设置
Figure BDA0003775368660000111
值得注意的是，所有容器都包含纯液体，除非那些在环境温度下为固体的试剂，需要作为储备溶液提供。
2)准备三苯甲基化溶液
液体从容器v1-3和v2-2流入混合装置5。首先将液流引入废液容器7，并在获得所需混合物后立即引入反应容器6。
3)用来自容器v1-1和v2-1的乙腈冲洗管线1和2、混合室和反应容器。
4)用受保护的核苷亚磷酰胺1制备偶联溶液
液体从容器v3-2和v4-3流入混合装置5。流体可以首先被引导到废物容器7中，一旦获得预期的混合物就被引导到反应容器6。将来自液体导管9的偶联溶液经由管线4和混合装置5再循环到反应容器6中。
5)用来自容器v2-1、v3-1和v4-1的乙腈冲洗管线2、3和4、混合室和反应容器。
6)准备氧化溶液
液体从容器v1-4、v4-5和v3-n流入混合装置5。流体首先被引导到废物容器7中，一旦获得预期的混合物就被引导到反应容器6。
或者：准备硫化溶液
液体从容器v4-4和v3-n流入混合装置5。流体首先被引导到废物容器7中，一旦获得预期的混合物就被引导到反应容器6。
反应过程中通过管线2进行循环。
7)用来自容器v2-1、v1-1、4-1和v3-1(氧化)或v2-1、v4-1和v3-1(硫化)的乙腈，冲洗管线2和1、4、3(氧化)或4、3(硫化)1或3、2和4、混合室和反应容器。
8)准备阻断(即封端)溶液
液体从容器v1-2、v4-2、v3-n和v2-1流入混合装置5。首先将液流引入废液容器7，一旦获得预期的混合物就被引导到反应容器6。反应中通过管线2进行循环。
9)用来自容器v1-1、v2-1、v3-1和v4-1的乙腈冲洗管线1、2、3和4、混合室和反应容器。
从上述步骤可以看出，所有试剂都可以由纯液体混合而成，除非起始材料不是液体并且需要以溶液形式提供。除了程序优势之外，这还提高了所用试剂的稳定性，从而提高了工艺稳定性。
本文进一步公开了使用如上详述的装置合成低聚物的有利方法，其中至少一种选自脱保护溶液、氧化溶液和硫化溶液的溶液是通过在线(on line)临时混合制备的。在使用如上详述的装置合成低聚物的进一步有利的方法中，至少两种独立地选自脱保护溶液、封闭溶液、氧化溶液和硫化溶液的溶液是通过在线混合制备的。在其他实施方案中，通过在线混合制备至少三种独立地选自脱保护溶液、封闭溶液、氧化溶液和硫化溶液的溶液。
本发明的装置可用于执行用于合成寡核苷酸的方案，该方案包括至少两次偶联循环的迭代，其中该方案单独定义每个偶联循环的酸性脱保护试剂的组成。
以上关于本发明的装置的解释和定义同样适用于本发明的方法，反之亦然。优选地，这些方法以自动化方式进行。
如本文所用，术语“以自动化方式”描述了一种过程，该过程在没有干预、没有人为完全控制的情况下被例行执行。这可能意味着合成过程的步骤由如上详述的控制单元控制。然而，该装置和/或控制单元可以被配置为允许或什至请求人在特定情况下的干预。这可能会，例如，在不可预见的事件出现时发生，例如过程参数超出特定的预定义的范围。此外，有利的是，能以自动化方式执行例如一定数量的耦合循环，同时在人工控制和/或人工干预下执行特定的关键步骤。
这里详述的方法的步骤可以按照它们被列举的确切顺序执行。然而，本领域技术人员理解所述步骤顺序在某些情况下可以不同。如本文所用，术语“执行以下步骤1至x”是指其中执行步骤1至x中的每一个的过程，尽管不一定以所示的顺序执行。
如本文所用，术语“偶联循环”、“结构单元添加循环”、“迭代聚合物合成过程的循环”、“延伸循环”和“合成循环”是同义词，涉及延伸一个结构单元的聚合物链，例如寡核苷酸链，所需的步骤。通常，一个合成循环包括至少一个提供未受保护的聚合物链用于偶联的步骤，以及将结构单元偶联至聚合物链的步骤。提供未受保护的聚合物链的步骤可以包括去除临时保护基团、分离和洗涤聚合物链。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种通过重复循环的结构单元偶联以自动化方式组装寡核苷酸链的方法，其中在结构单元偶联的每个循环中重新进行以下步骤1至6：
1.提供一种n-聚体寡核苷酸，其中n是等于或大于1的整数，其与固体支持物结合并含有游离的第一反应性基团，所述第一反应性基团可与包含在待掺入的结构单元中的第二反应性基团反应而延伸寡核苷酸骨架；
2.提供待掺入的结构单元，其包含游离的可与n-聚体寡核苷酸的第一反应基团反应的第二反应基团，且进一步包含被酸敏感性临时保护基团封闭的第一反应基团；
3.在允许n聚体寡核苷酸的第一反应基团与待掺入的结构单元的第二反应基团结合的条件下使n聚体寡核苷酸与待掺入的结构单元接触，并产生受保护的、延伸的n-聚体寡核苷酸，其中被酸敏感性临时保护基团阻止进一步延伸；
4.通过混合至少两种液体组合物来制备酸性脱保护试剂；
5.将步骤3被保护的延伸的n-聚体寡核苷酸与步骤4的酸性脱保护试剂接触，从而从延伸的n-聚体寡核苷酸上切割掉酸敏感临时脱保护基团；和
6.从延伸的n-聚体寡核苷酸中去除脱保护试剂和可溶性切割产物，然后可将其用作n-聚体寡核苷酸用于后续的偶联循环的步骤1中。
上述表述“提供n-聚体寡核苷酸”可以在最广泛的可能意义上理解。在反应开始时，步骤1可能涉及提供核苷，该核苷被固定在固体支持物上并带有酸敏感临时保护基团阻断主链延伸。一些这样的固定核苷是可商购的。然后可以通过与酸性脱保护试剂一起温育除去临时保护基团，随后进行去溶剂/洗涤步骤以提供n-聚体寡核苷酸。在其他情况下，寡核苷酸链的组装可能开始于与固体支持物结合的较长寡核苷酸。在偶联循环之间，步骤1可以与先前偶联循环的步骤5和6部分重叠，即从延伸的n-聚体寡核苷酸上切割临时保护基团，并且可以包括进一步的漂洗步骤以调理前一偶联循环中的扩展的、脱保护的n-聚体寡核苷酸，以用于随后的偶联循环。
本领域技术人员熟知许多固体支持物可用于寡核苷酸的合成，包括由可控孔径玻璃(CPG)和交联聚苯乙烯珠制成的支持物。用于将第一寡核苷酸连接至固体支持物的接头(linker)同样为本领域所熟知。
当从通过磷酸二酯键连接的单糖部分合成具有主链的寡核苷酸时，第一反应基团可以是羟基，优选伯羟基，例如核糖部分的5'羟基。然而，第一反应基团可以是参与形成具体寡核苷酸结构骨架的任何反应基团。
如本文所用，表述“寡核苷酸主链”可用于指磷酸二酯键/磷酸二酯键类似物和核糖/核糖类似物部分的重复链，其提供支架，以供核基/核基类似物连接。第一反应基团通常可以位于寡核苷酸骨架的一端，第二反应基团可以位于寡核苷酸的另一端
“提供结构元件”的表述可以在尽可能广泛的意义上理解。待掺入的结构单元可包含待掺入寡核苷酸链中的任何核苷或核苷类似物。它可以包含脱核基位点(abasic site)、核基或通过糖苷键(或这种键的类似物)结合的核基类似物。结构元件可以是单体的或可以是寡聚的，即结构元件可以是寡核苷酸本身。结构单元还可包含非核苷修饰，例如胆固醇。结构单元包含游离的、可与n聚体寡核苷酸的第一反应基团反应的第二反应基团。第二反应基团可以是亚磷酰胺基团，例如3'-O-(N,N-二异丙基亚磷酰胺)基团，或H-膦酸酯单酯。此外，结构单元包含第一反应基团，其被临时保护基团阻止反应。结构单元中包含的第一反应基团是与n聚体寡核苷酸相同位置上存在的化学部分是相同的化学部分。封闭结构单元的第一个反应性基团的酸敏保护基团可以是三苯甲基类型的保护基团，例如三苯甲基(trityl)、4-单甲氧基三苯甲基(MMT)、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黄原-9-基(pixyl)或9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-y1(MOX)。
在一些实施方案中，第一反应性基团是羟基，优选伯羟基，例如核糖/核糖类似物部分的5'羟基，第二个反应基团是亚磷酰胺基团，例如3'-O-(N,N-二异丙基亚磷酰胺)基团。在进一步的实施方案中，第一反应性基团是羟基，优选伯羟基，例如核糖/核糖类似物部分的5'羟基，第二个反应基团是膦酸酯单酯基团。
本领域技术人员熟知使n聚体寡核苷酸的第一反应基团与结构单元的第二反应基团反应所需的条件。例如，在酸性唑催化剂的存在下，例如1H-四唑、5-乙硫基-1H-四唑，在无水溶剂(通常为乙腈)中使n-聚体寡核苷酸与结构单元接触，可以诱导亚磷酸三酯基团的形。.然后将亚磷酸三酯基团暴露于硫化剂或氧化剂以产生受保护的延伸的n聚体，这是本领域的标准。作为另一个例子，当第二反应基团是膦酸酯单酯基团时，新戊酰氯、2,4,6-三异丙基苯磺酰氯(TPS-Cl)和其他化合物可以用作活化剂。
本方法预期通过混合至少两种液体组合物在每个偶联循环中重新制备酸性脱保护试剂。因此，可以针对每个偶联循环单独定义去保护试剂的组成。这允许调整例如酸的含量以适应在各自的偶联循环中遇到的具体情况。例如，嘌呤碱基可能比嘧啶碱基更容易从寡核苷酸上切割下来，留下脱核基位点。脱嘌呤在寡核苷酸链的末端比在其中间更容易发生。因此，能够优化在每个步骤中除去临时保护基团的条件是有利的。因此，该合成程序允许最大限度地减少不需要的副反应，并最大限度地提高合成过程中组装的原始寡核苷酸链的纯度。
在根据本发明的一些方法中，去保护试剂的组成在至少两个偶联循环之间是不同的。去保护试剂的组成尤其可以在所含酸量方面有所不同。例如，酸的浓度可能会随着循环次数的增加而增加。在一个实施方案中，对于每个偶联循环，去保护试剂中酸的含量分别独立地选自0.1％(w/w)至50％(w/w)的范围。例如，去保护试剂中酸的浓度可以是0.1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,或50％(重量比)。在许多情况下，去保护试剂中酸的浓度可以选自0.5至20％DCA的范围。脱保护剂中所含的酸可以选自DCA和TCA，优选DCA。对于每个偶联循环，去保护试剂中酸的含量可以分别选自0.1％(重量比)至50％(重量比)DCA(在溶剂中)的范围。对于每个偶联循环，去保护试剂中酸的含量可以分别选自0.1％(重量比)至20％(重量比)TCA(在溶剂中)的范围。优选的溶剂是甲苯。
脱保护试剂可以通过在本装置的混合装置内混合纯DCA和溶剂流来制备。作为纯酸的替代方案，可以使用各自酸在溶剂中的浓缩溶液，并且可以通过与后续液体混合来进一步稀释，例如用溶剂稀释。例如，50％DCA在甲苯中的溶液可以作为储备溶液提供，并且可以进一步与甲苯混合以达到预期的浓度。或者，可以使用TCA溶液。虽然去封闭溶液通常通过在溶剂如甲苯中稀释酸如DCA来制备，去保护试剂还可包含其它组分如阳离子清除剂。
脱保护试剂可以在完成脱保护反应后通过从固体支持物排出和/或通过洗涤步骤除去。也可以通过用溶剂冲洗来进行，例如乙腈。
本发明的另一方面如下：
1.一种用于合成低聚物的装置，包括：
a)反应容器，其通过液体导管连接到废物容器；
b)液体供应单元，用于将液体试剂输送到反应容器；
c)旁通管道，其允许将液体从液体供应单元直接引导到废物容器而不经过反应容器；和
d)一个主控制单元
其特征在于，所述供液单元包括：
b-1)至少一个混合装置，其连接到
b-2)至少4条上游液体管线，每条管线包括一个带有n个液体入口的液体导管以及一个液体泵，其中n是1到25之间的整数；和
b-3)n个传感器，其中n是等于或大于1的整数，所述传感器位于混合装置的下游并确定从混合装置流出的液体的至少一种性质，其中由传感器提供的至少一个读数用作反馈信号以调节一个或多个液体泵的活动。
2.根据上述方面1所述的设备，其中，所述主控制单元接收来自所述n个传感器的输入并调节所述一个或多个泵的液体流量。
3.根据方面1或2中任一项所述的设备，其中，所述泵由接收局部控制单元的控制，局部控制单元接受来自所述传感器的输入。
4.根据方面1至3中任一项所述的设备，其中所述混合装置通过液体导管连接至所述反应容器。
5.根据方面1至3中任一项所述的设备，其中所述混合装置通过液体导管连接到一个歧管(manifold)，所述歧管通过液体导管连接到所述反应容器。
6.根据方面5所述的设备，其中，所述歧管进一步连接到至少一个液体导管，以通过泵从液体导管的液体入口提供液体的流入。
7.根据方面1至6中任一项所述的设备，其中，所述液体供应单元还包括至少一个热交换器，优选地，其中所述热交换器中的至少一个位于所述混合单元和第一个n个传感器之间。
8.根据方面1至7中任一项所述的设备，其中所述反应容器是填充柱反应器或批量反应器。
9.根据方面1至8中任一项所述的设备，其中混合装置和至少一个液体管线的的内表面由耐腐蚀材料制成，优选由哈氏(Hastelloy)合金或聚四氟乙烯制成。
10.根据方面1至9中任一项所述的设备，其中，所述n个传感器独立地选自红外光谱仪、密度传感器、折射仪、电导率传感器、温度传感器、阻抗传感器，UV/Vis吸收传感器。
11.根据方面1至10中任一项所述的设备，还包括循环回路，该循环回路通过泵将来自所述液体导管的流经由所述混合单元和所述n个传感器引导到所述反应容器中。
12.根据方面1至10中任一项所述的设备，还包括循环回路，该循环回路通过泵将来自所述液体导管的液体流经由所述混合单元和所述n个传感器引导到所述反应容器中，其中所述具有泵的所述液体管线之一，通过其一个入口和三通阀连接到液体导管并用作循环管线。
13.一种用于寡核苷酸的固相合成的设备，其特征在于该设备包括用于在其中进行合成的批量反应器。
14.一种使用根据方面1至13中任一项的装置合成寡核苷酸的方法。
15.根据方面14的方法，其中至少两种溶液是通过在液体管线中临时在线混合来制备的，所述两种溶液独立地选自脱保护溶液、封闭溶液、氧化溶液和硫化溶液。
以下提供的附图和它们的描述仅用于说明目的并且不应被解释为限制权利要求的范围。
附图简要说明
图1显示一个用于自动合成低聚物具有四个液体供应管线的设备的基本实施方案，
图2显示所述设备的另一个实施方案，其包括再循环导管，
图3是所述设备的另一个实施方案，其中一个液体供应管线用作循环回路，
图4图4显示所述设备具有储存容器的另一个实施方案，
图5显示所述设备包括歧管的另一个实施例，
图6图6显示所述设备的另一个实施例，其包括两个混合装置和一个歧管，
图7显示所述设备具有两个液体供应管线的另一个实施例，
图8显示所述设备具有两个液体供应管线和一个循环回路的另一个实施例，
图9显示所述设备如同图7装置的一个实施例，具其有布置在混合装置下游的另外的传感器，
图10显示所述设备如同图3装置的一个实施例，仅具有两个液体供应管线，
图11显示所述设备如同图2装置的一个实施例，仅具有三个液体供应管线，
图12显示所述设备的另一个实施例，具有三个液体供应管线，其中一个液体供应管线用作循环回路，以及
图13显示所述设备如同图3装置的一个实施例，仅具有三个液体供应管线。
参考符号列表
1 液体供应管线1
i1-1 管线1，进液口1
i1-2 管线1，进液口2
i1-3 管线1，进液口3
i1-4 管线1，进液口4
i1-n 管线1，进液口n
p1 液泵,管线1
l1 液体导管，管线1
2 液体供应管线2
i2-1 管线2，进液口1
i2-2 管线2，进液口2
i2-3 管线2，进液口3
i2-4 管线2，进液口4
i2-n 管线2，进液口n
p2 液泵，管线2
l2 液体导管，管线2
3 液体供应管线3
i3-1 管线3，进液口1
i3-2 管线3，进液口2
i3-3 管线3，进液口3
i3-4 管线3，进液口4
i3-n 管线3，进液口n
p3 液泵，管线3
l3 液体导管，管线3
4 液体供应管线4
i4-1 管线4，进液口1
i4-2 管线4，进液口2
i4-3 管线4，进液口3
i4-4 管线4，进液口4
i4-n 管线4，进液口n
i4-n p液泵，管线4
l4 液体导管，管线4
v1-n n号储存容器，管线1
v2-n n号储存容器，管线2
v3-n n号储存容器，管线3
v4-n n号储存容器，管线4
5 混合装置
6 反应容器
7 废物容器
8 控制单元
9 可控液体导管
10 阀
11 旁通导管
s1 传感器1
s2 传感器2
sn 传感器n
12 三通阀
13 热交换器
14 歧管
15 本地控制单元
16 液体回收导管
17 液泵
18 进液口
19 液体供应单元
20 混合装置和反应容器之间的液体导管
21 混合装置和歧管之间的液体导管
22 歧管和反应容器之间的液体导管
23 传感器
24 流量传感器
附图说明
图1显示了根据本发明的设备的基本实施例。该设备的液体供应单元19可以包括混合装置5，其连接到四个液体供应管线、第一液体供应管线1、第二液体供应管线2、第三液体供应管线3和第四液体供应管线4。每条所述液体供应管线包括泵[分别为(p1)、(p2)、(p3)或(p4)]、液体导管[分别为(l1)、(l2)、(l3)或(l4)]，和n个入口[分别为(i1-1到i1-n)，(i2-1到i2-n)，(i3-1到i3-n)，(i4-1到i4-n)]，其中n是等于或大于1的整数。每个液体入口和导管之间的流体连接可以通过阀10来调节。为了清楚起见，用虚线框突出显示液体供应管线1、2、3、4。应当理解，直到混合装置5的入口的液体导管[分别为(l1)、(l2)、(l3)或(l4)]的整个长度被认为属于相应的液体供应管线。混合装置5合并来自所述液体供应管线1、2、3、4的任何液体流并且将它们混合以获得一种均质溶液，该均质溶液可以通过包括n个传感器(s1至sn)的液体导管20，被引导进入反应容器6，其中n是等于或大于1的整数。传感器可以向控制单元8提供与溶液成分相关的反馈信号，控制单元8使用该信号，分别调节管线泵的流量[(p1)、(p2)、(p3)、或(p4)]。只要通过传感器的溶液成分在给定的设定间隔内不稳定，溶液就不会被引导到反应容器中，而是会通过自动三通阀12和旁通管道11被引导到废物中容器7。除了泵p1、p2、p3、p4之外，控制单元8控制通过导管11、20的液体流动，以及控制通过连接反应容器与废物容器7的液体导管9的液体流动。控制单元8从而可以确定哪种溶液与反应容器的内容物一起温育多长时间。
图2显示了本发明装置的另一个实施例，所有关于图1的评论都适用该实施例。除了上述元件之外，其中，带有泵17的液体循环管道16通过三通阀12连接到液体管道9。该设置允许将从反应容器6出来的给定溶液通过混合装置5和具有n个传感器(s1到sn)的液体导管20循环回到反应容器6中。三通阀12和泵17的动作由控制单元8控制。附加的液体入口18位于回收管道16以提供灵活性。
图3显示了本发明装置的另一个实施例，所有关于图1的评论都适用该实施例。除了上述元件之外，其中，热交换器13被集成到混合装置5和第一传感器s1之间的液体导管20中。这可以用来调节溶液的温度以便从传感器获得更可靠的读数并调节反应容器6内的试剂的温度。此外，另一个传感器23集成到反应容器下游的液体导管9中。该传感器同样向控制单元提供信号，该信号可能与反应容器内的事件相关。本实施例中的第二液体供应管线2具有双重功能，其中一个入口通过位于传感器23和废物容器7之间的三通阀12连接到液体导管9。这种设置允许循环给定的液体。从反应容器6出来的溶液通过液体导管12、混合装置5和带有n个传感器(s1到sn)的液体导管20回到反应容器6，这样不需要如图2所示的专用的再循环导管和泵。三通阀12和泵p2的动作由控制单元8控制。
图4显示了本发明装置的另一个实施例，所有关于图3的评论都适用该实施例。三个液体供应管线1、3、4分别显示有四个储存容器[(v1-1至v1-4)、(v3-1至v3-4)、(v4-1至v4-4)]和n-4个入口[分别为(i1-5到i1-n)、(i3-5到i3-n)、(i4-5到i4-n)]，其中n是等于或大于7的整数。第二液体供应管线2起到液体供应管线和再循环导管的双重功能，如上面参照图3所解释的。它显示有两个存储容器(v2-1)、(v2-2)和n-2个入口(i2-3至i2-n)，其中n是等于或大于5的整数。液体供应单元19包括热交换器13和两个传感器(s1)、(s2)。
图5显示了本发明装置的另一个实施例。该设备的液体供应单元19可以包括混合装置5，其连接到四个液体供应管线1、2、3、4。每个所述液体供应管线包括泵[(p1)、(p2)、(p3)或(p4)]，液体导管[(l1)、(l2)、(l3)或(l4)]，和n个入口[(i1-1至i1-n)，(i2-1至i2-n)、(i3-1至i3-n)、(i4-1至i4-n)]，其中n为等于或大于1的整数。每个液体入口和导管之间的流体连接可以通过阀10来调节。从混合装置5流出的组合溶液通过液体导管21被引导到歧管14中。集成到所述液体导管21中的是热交换器13和传感器(s1)。传感器(s1)向本地控制单元15提供信号，本地控制单元15调节液体供应管线的泵(p1)、(p2)、(p3)或(p4)的动作。本地控制单元15可以在控制单元8的控制之下，或者可以是独立的。歧管14还连接到四个另外的液体导管，每个液体导管包括一个泵17和两个液体入口18。从歧管流出的液体流被引导通过液体导管22进入反应容器6。一个另外的热交换器13和一个传感器23集成到所述液体导管22中。所有其他元件如关于图3所述。
图6显示了本发明装置的另一个实施例，其类似于图5的实施例。歧管14接收来自两个混合装置5的输入，每个混合装置5连接到四个液体供应管线1、2、3、4。
图7显示了该设备的另一个实施例，其中该设备具有两条液体供应管线。图7的设备基本上对应于图1描述的设备，但仅包括两个液体供应管线1、2，并且不包括布置在混合装置5下游的传感器。
图8显示了具有两个液体供应管线和一个循环回路的设备的另一个实施例。图8的设备基本上对应于图7所描述的设备，但其另外包括再循环回路，该回路包括液体循环导管16和液体泵17。如图8所示的循环回路还包括额外的液体入口18.
此外，图1的实施例包括布置在两个液体供应管线1、2中的每一个中的液体流量传感器24，其布置在相应的液体泵p1、p2的下游和混合装置5的上游。
图9显示如同图1设备的一个实施例，其仅具有两个液体供应管线1、2。关于图1的评论也适用于图9所示的实施例，除了省略另外两个液体管线3,4.
图10显示如同图3设备的一个实施例，但只有两条液体供应管线。
图11显示如同图2设备的一个实施例，它只有三个液体供应管线。除了减少了液体供应管线1、2外，图2的实施例的描述也适用于图11的实施例。
图12显示了具有三个液体供应管线的设备的另一个实施例，其中一个液体供应管线用作循环回路。图12的实施例类似于图3描述的实施例，除了省略传感器和第四液体供应管线。
图13显示如同图3设备的一个实施例，它只有三个液体供应管线。与图12的实施例相比，其具有传感器s1…sn以及传感器23。

Claims (23)

1.一种用于自动合成寡核苷酸的设备，包括：
e)反应容器(6)，其通过液体导管(9)连接到废物容器(7)；
f)液体供应单元(19)，用于将液体试剂输送到反应容器(6)；
g)旁路导管(11)，其允许将液体从液体供应单元(19)引导到废物容器(7)而不经过反应容器(6)；和
h)控制单元(8)
其特征在于，供液单元(19)包括：
b-1)至少一个混合装置(5)，其连接到
b-2)至少两条液体供应管线(1、2)，每条所述包括至少一个具有n个液体入口(i1-n、i2-n)的液体导管(l1、l2)，和至少一个液体泵(p1，p2)，其中n是1到25之间的整数。
2.根据权利要求1所述的设备，其中至少所述混合装置(5)的内表面和所述两条液体供应管线(1、2)之一的内表面由耐酸材料制成和/或包括耐酸涂层。
3.根据权利要求2所述的设备，其中至少所述混合装置(5)的内表面和所述两条液体供应管线(1、2)之一的内表面由耐酸合金制成和/或包含耐酸聚合物涂层。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的设备，其中，所述液体供应单元(19)还包括第三液体供应管线(3)，其连接到所述至少一个混合装置(5)且包括至少一个具有n个液体入口(i3-n)的液体导管(l3)，和至少一个液体泵(p3)，其中n是1到25之间的整数。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的设备，其中，所述至少一个混合装置(5)包括静态混合器。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的设备，还包括n个传感器(s1至sn)，其中n是等于或大于1的整数，所述传感器(s1至sn)位于所述至少一个混合装置(5)的下游，可以确定从混合装置(5)流出的液体的至少一种性质。
7.根据权利要求6所述的设备，其中由所述传感器(s1至sn)中的至少一个提供的至少一个读数用作反馈信号以调节包括在所述液体供应单元(19)中的一个或多个液体泵的活动。
8.根据权利要求6或7所述的设备，其中由所述传感器(s1至sn)中的至少一个提供的至少一个读数用于控制是否将液体流引导到反应容器(6)中或不经过反应容器(6)而进入废液容器(7)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的设备，还包括至少一个流量传感器(24)，其集成到所述混合装置(5)上游的所述至少两条液体供应管线(1、2)的每一个条，其中由所述流量传感器提供的至少一个读数用作反馈信号以调节所述液体泵(p1，p2)中的一个或多个的活动。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的设备，其中，所述液体供应单元(19)还包括至少一个热交换器(13)。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的设备，还包括电导率传感器、温度传感器和UV吸收传感器。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的设备，其中，所述反应容器(6)是填充柱反应器或批量反应器。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的设备，还包括循环回路，该循环回路利用液体泵(17)将来自液体导管(9)的流体引回到反应容器(6)中，所述液体导管(9)是反应容器到废物容器之间的连接。
14.根据权利要求13所述的设备，其中，所述循环回路包括在所述至少两条液体供应管线(1、2)之一中，通过其入口(i1-n、i2-n)之一和一个多路阀(12)连接到液体导管(9)，其泵(p1,p2)可以驱动来自液体导管(9)的流体通过所述混合装置(5)再循环回到反应容器。
15.根据权利要求2至14中任一项所述设备的用途，用于执行一种合成寡核苷酸的程序，所述程序包括偶联循环的至少两次迭代，其中所述程序分别单独地定义用于每一个偶联循环的酸性脱保护试剂的组成。
16.一种以自动化方式通过重复的结构单元偶联循环组装寡核苷酸链的方法，其中在每个结构单元偶联循环中重复进行以下步骤1至6：
1.提供一种n-聚体寡核苷酸，其中n是等于或大于1的整数，其与固体支持物结合并包含游离的第一反应性基团，其通过与包含在待掺合的结构单元中的第二反应性基团反应而延伸寡核苷酸骨架；
2.提供所述待掺入的结构单元，其包含一个游离的、可与n-聚体寡核苷酸的第一反应基团反应的第二反应基团，并且进一步包含被酸敏感性临时保护基团封闭的一个第一反应基团；
3.在允许n-聚体寡核苷酸的第一反应基团与待掺入的结构单元的第二反应基团结合的条件下，使n-聚体寡核苷酸与待掺入的结构单元接触，产生受保护的、延伸的n-聚体寡核苷酸，其被酸敏感性临时保护基团阻止进一步延伸；
4.通过混合至少两种液体组合物来制备酸性脱保护试剂；
5.将步骤3的所述受保护的、延伸的n-聚体寡核苷酸与步骤4的酸性脱保护试剂接触，从而从延伸的n-聚体寡核苷酸上切割掉酸敏感性临时保护基团；和
6.从延伸的n-聚体寡核苷酸中去除去保护试剂和可溶性切割产物，然后将其作为n-聚体寡核苷酸用于下一轮偶联循环的步骤1中。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述脱保护试剂的组成在至少两个偶联循环之间是不同的。
18.根据权利要求16至17中任一项所述的方法，其中，所述脱保护试剂的组成针对每个偶联循环单独定义。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中，对于每个偶联循环所述脱保护试剂中的酸含量各自独立地选自0.1％(重量比)至50％(重量比)范围的酸含量。
20.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中所述酸敏感性临时保护基团是三苯甲基型保护基团
21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中所述第一反应性基团是羟基。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二反应性基团是亚磷酰胺基团或H-膦酸酯单酯基团。
23.根据权利要求22所述的方法，其中步骤3包括在允许形成亚磷酸三酯基团的条件下使所述结构单元和所述n-聚体寡核苷酸接触，并将所得化合物产物与一种氧化剂或一种硫化剂混合以将所述亚磷酸三酯基团分别转化为磷酸三酯基团或硫代磷酸三酯基团。
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