DE69620182T2

DE69620182T2 - Polymere lamellare substratpartikel zur arzneistoffverabreichung

Info

Publication number: DE69620182T2
Application number: DE69620182T
Authority: DE
Inventors: Gerald Coombes; Stewart Davis; Lisa Major; Michael Wood
Original assignee: West Pharmaceutical Services Drug Delivery and Clinical Research Center Ltd
Current assignee: NOTTINGHAM NOTTINGHAM GB, University of
Priority date: 1995-07-13
Filing date: 1996-07-15
Publication date: 2003-01-16
Anticipated expiration: 2016-07-16
Also published as: EP0837673B1; PT837673E; WO1997002810A2; NO976018L; AU6466596A; ATE214918T1; NO315406B1; JPH11508912A; GB9514285D0; ES2175109T3; US6001395A; CA2223884A1; DE69620182D1; DK0837673T3; NO976018D0; EP0837673A2; WO1997002810A3; AU709031B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Abgabe eines aktiven Wirkstoffs und insbesondere eine Zusammensetzung, die lamellare Polymerteilchen umfasst.
Systeme zur Abgabe von pharmazeutisch oder therapeutisch aktiven Wirkstoffen, insbesondere von Antigenen sind von beträchtlichem Interesse.
Obwohl der Einfluss von Faktoren wie z. B. der Dosis, der Zubereitung und der Häufigkeit der Verabreichung eines Antigens auf die Immunantwort bekannt ist, wurde eine optimale Verabreichung und Darreichung noch nicht allgemein eingeführt (Kahn et al. 1994). Bei herkömmlichen flüssigen Dosierungsformen sind mehrere kleine Dosen des Antigens hinsichtlich der Stimulation einer schützenden Immunantwort wirksamer als eine einzelne Verabreichung oder einige wenige große Dosen. Es ist auch bekannt, dass Proteinkonzentrationen von nur 0,001 ug ausreichend sind, um eine Sekundärreaktion zu stimulieren und dass eine immunologische Nichtreaktion (Toleranz) sowohl durch hohe als auch niedrige Dosen des Antigens und durch häufige Verabreichung verursacht werden kann.
Viele gereinigte synthetische oder inaktivierte Antigene wie z. B. Tetanus-Toxoid haben nur eine geringe Immunogenizität und erfordern üblicherweise mehrere parentarale Dosen, um einen angemessenen Schutz zu bewirken. Die Adsorption von Impf-Antigenen an Adjuvantien wie z. B. Alum ist ein übliches Verfahren, um die Immunogenizität zu erhöhen. Es wurde eine große Zahl sowohl biologischer als auch synthetischer Substanzen als Adjuvantien verwendet, einschließlich Mycobakterien, Ölemulsionen, Liposomen, polymeren Mikropartikeln und Mineralgelen. Ein Bereich von 24 verschiedenen Adjuvantien wurde kürzlich durch Stieneker et al. (1995) für deaktivierte HIV-Viren untersucht, wobei zu dieser Gruppe auch viele der zur Zeit in Erforschung befindlichen Adjuvans-Systeme gehörten. Es hat sich jedoch nur Aluminiumhydroxid "Alum" für eine Verabreichung an Menschen als geeignet herausgestellt, doch ist seine Verwendung häufig mit nachteiligen Reaktionen verbunden.
Manche Adjuvantien halten das Antigen an der Abgabestelle ebenso zurück wie sie die Antigene schützen, die Phagozytosis stimulieren und die lymphoiden Zellen aktivieren. Das Festhalten des Antigens scheint vital für eine wiederholte Stimulation der Gedächtnis-B- Zellen-Population und für eine Aufrechterhaltung der Antikörper-Titer über lange Zeiträume zu sein (Gray et al. 1988). Man nimmt an, dass der Adjuvans-Effekt von Wasser-in-Öl- Emulsionen, Freunds Complete Adjuvant (FCA)/Freunds Incomplete Adjuvant (FIA) beispielsweise aus der Erzeugung eines kurzzeitigen "Depoteffekts" entsteht, wozu eine Antispielsweise aus der Erzeugung eines kurzzeitigen "Depoteffekts" entsteht, wozu eine Antigen-Zurückhaltung als Ergebnis einer Granuloma-Ausbildung gehört. Es wurde entdeckt, dass sich Malaria-Antigen 80 Tage nach der Verabreichung an der Injektionsstelle befand, wenn es mit Liposomen zubereitet und in Alginat-Poly(L-Lysin)-Mikropartikel eingekapselt war (Cohen et al. 1991), was darauf hinweist, dass dieses System auch als "Depot"-Impfstoff für ein fortgesetztes Festhalten und Präsentieren von Antigenen an das Immunsystem wirkt.
Der beträchtliche Forschungsaufwand, der auf Impfstoff-Zubereitungen gerichtet war, hat zu einer Vielzahl von Strategien zur Optimierung der Antigen-Freisetzungsraten und zur Schaffung von Einzeldosis-Verabreichungssystemen geführt. Die impulsförmige Freisetzung eines Antigens aus biologisch abbaubaren, biokompatiblen Poly(Lactid-Co-Glycolid)[PLG]-Mikropartikel wird für vorteilhaft gehalten, um den herkömmlichen Multidosis- Zeitablauf zu stimulieren. Man nimmt jedoch an, dass die meisten auf Mikropartikeln beruhenden Abgabesysteme nach dem Prinzip einer aufrechterhaltenen Langzeit-Antigen-Freisetzung beruhen, die das Antigen dem Immunsystem kontinuierlich in kleinen Dosen zuführt, um die Prolieferation von Immunzellen und die Antikörper-Produktion aufrechtzuerhalten. Raghuvanshi et al. (1993) entwickelten eine Einmal-Injektions-Zubereitung für Tetanus-Toxoid (TT) auf der Basis dieses Prinzips unter Verwendung von PLG- Mikropartikeln. Die sich bei Ratten über 5 Monate hinweg ergebende Immunantwort war vergleichbar mit dem herkömmlichen 2-Dosen-Zeitablauf von an Alum adsorbiertem TT.
Man war der Auffassung, dass die niedrigere Primärreaktion, die bei an Alum adsorbiertem TT beobachtet wurde, auf einer schnellen Antigen-Verarmung beruhte, die zu einer verminderten Prolieferation von Immunzellen führte.
Man ist der Auffassung, dass die Fähigkeit von kleinen, mit Antigenen beladenen PLG-Mikroteilchen (> 5 um Größe), als leistungsfähiges Antigen-Abgabesystem nach einer subkutanen Verabreichung zu funktionieren, auf zwei Mechanismen beruht: 1) Einer effizienten Phagozytose, die zu einem Transport zu den Lymphknoten führt, wo eine wirksame Antigen-Verarbeitung und Präsentation an die T-Helferzellen auftritt, und 2) einer gesteuerten Freisetzung des Antigens aus den Mikroteilchen. (Eldridge et al. 1991, O'Hagan et al. 1991). Es wurden jedoch auch heftige Immunantworten unter Verwendung von großen (72 um) protein-beladenen Mikropartikeln induziert (O'Hagan et al. 1993), was zeigt, dass eine Phagozytose und ein Transport zu den Lymphknoten nicht unbedingt erforderlich ist, um hohe Serum-Antikörper-Titer zu erzielen. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass Antigen enthaltende Bruchstücke von großen Mikroteilchen phagozytosiert werden könnten.
Es ist bekannt, dass die stärkere Immunantwort, die erzielt wird, wenn antigen-beladene PLG-Mikropartikel verwendet werden, eher einem Adjuvans-Effekt als einer langsamen Freisetzung von verkapseltem Protein zugeordnet werden kann, da gezeigt wurde, dass an Mikropartikeln adsorbierte Antigene kräftige Immunantworten erzeugen, nachdem sie subkutan (O'Hagan et al. 1993, Kreuter et al. 1998) und nasal (Alpar und Almeida, 1994) verabreicht wurden.
Es hat sich nun in überraschender Weise gezeigt, dass unter Verwendung von biologisch abbaubaren Polymeren, die zumindest teilweise kristallisierbar sind, lamellare Substratteilchen erzeugt werden können, die zumindest teilweise kristallin sind und von deren sich gezeigt hat, dass sie zu Verbesserungen bei der Adsorption von Antigenen, dem Festhalten von Antigenen in vitro und zu einer Verbesserung bei der Immunantwort auf adsorbierte Antigene führen.
Die vorliegende Erfindung schafft daher eine Zusammensetzung für die Abgabe eines aktiven Wirkstoffs, die eine Vielzahl von lamellaren Teilchen umfasst, welche ein biologisch abbaubares Polymer umfassen, das zumindest teilweise kristallin ist, sowie einer aktiven Wirkstoff, der zumindest an die meisten der Teilchen adsorbiert ist.
Es wird hier der Ausdruck "biologisch abbaubares Polymer" verwendet, um Polymersysteme zu bezeichnen, von denen zumindest ein Teil in Bestandteile mit geringem Molekulargewicht abgebaut werden kann, von denen bekannt ist, dass sie normalerweise bei metabolischen Abläufen eine Rolle spielen. Der Ausdruck wird auch verwendet, um Polymersysteme zu bezeichnen, die im biologischen Milieu angegriffen werden können, so dass die Integrität des Systems und in manchen Fällen der Makromoleküle selbst beeinflußt wird und Fragmente oder andere Abbau-Nebenprodukte entstehen, die sich von ihrem Wirkungsort aber nicht notwendiger Weise aus dem Körper weg bewegen können.
Das verwendete biologisch abbaubare Polymer ist vorzugsweise zu wenigstens 5 Gew.-% kristallisierbar.
Das biologisch abbaubare Polymer in den Teilchen ist vorzugsweise zumindest zu 5 Gew.- % kristallin, in stärker bevorzugter Weise zumindest zu 30%, noch stärker bevorzugt zumindest zu 50% oder zumindest zu 70% und in besonders bevorzugter Weise zumindest zu 90% kristallin.
Ob ein Polymer kristallin ist oder nicht und das Ausmaß der Kristallisation können durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren, beispielsweise Röntgenstrahlen-Beugungsverfahren ermittelt werden, wie sie auf Polymere angewandt werden, oder durch eine Differential-Scanning-Kalorimetrie.
Ein bevorzugtes Polymer ist Poly(L-Lactid)(L.PLA), das in der Natur halbkristallin ist. Das Molekulargewicht des L.PLA-Polymers liegt vorzugsweise im Bereich von 2.000 bis 100.000.
Das Polymer kann eine Mischung aus L.PLA mit einem anderen biologisch abbaubaren Polymer oder mit einem biokompatiblen aber nicht abbaubaren Polymer sein und entweder als Copolymer oder als Mischung von Polymeren vorliegen. In jedem Fall sollte die sich ergebende Mischung zumindest teilweise kristallin und zumindest zu 5 Gew.-% kristallin sein. Der Gehalt an nicht kristallisierbaren oder nicht kristallinen Polymerbestandteilen sollte daher in der erforderlichen Weise begrenzt sein.
Geeignete Copolymere sind Copolymere von L.PLA und andere Poly(α-Hydroxisäuren) wie z. B. DL-Lactid oder Glycolid (z. B. PLG), kristallisierbare Copolymere von Milchsäure und Lacton, Copolymere von L-Lactid und Poly(Ethylenglycol) [PEG], Copolymere von L-Lactid und α-Aminosäuren (Polydepsipeptide), Polyanhydride und Polyorthoester.
Geeignete Mischungen von L.PLA mit anderen Polymeren umfassen andere Poly(α-Hydroxisäuren) wie z. B. Poly(DL-Lactid-Co-Glycolid), PEG, Copolymere von Polyethylenoxid und Polypropylenoxid (PEO-PPO), Polydepsipeptide, Polyorthoester, Polyanhydride, Polyphosphazen und Copolymere von Acryl- und Methacrylsäureestern (Eudragit).
Andere biologisch abbaubare synthetische Polymere, die möglicherweise für die Zubereitung von lamellaren Substraten geeignet sind, umfassen Copolymere von α-Hydroxisäuren, α-Aminosäuren (Polydepsipeptide), Polyhydroxibuttersäure, Copolymere von Milchsäure und Lacton, Copolymere von Milchsäure und PEG, Copolymere von Hydroxybutyrat und Hydroxivalerat, Polyethylenterephtalat, Polyphosphazene, Polycaprolacton, Polyorthoester, Polyanhydride und Copolymere hiervon oder Mischungen solcher Polymere.
Unter "lamellar" wird hier verstanden, dass die Teilchen dünne Platten oder Schichten umfassen; Liposome sind keine lamellaren Teilchen im Sinne der Erfindung.
Vorzugsweise sind die lamellaren Teilchen unregelmäßig geformt, wie sie sich unter Verwendung einiger der in den Beispielen wiedergegebenen Verfahren ausbilden.
Die lamellaren Teilchen sind häufig "rautenförmig" und können in der Zusammensetzung als diskrete lamellare Teilchen oder als scheibenförmige, polyedrische Teilchen vorhanden sein, die von Lamellen gebildet werden, die längs einer gemeinsamen Ebene miteinander verbunden sind. Der Ausdruck "lamellare Teilchen" wird verwendet, um beide Möglichkeiten zu umschließen. Die Lamellarteilchendicken liegen im Bereich von 50 nm bis 80 um, doch vorzugsweise im Bereich von 50 bis 500 nm. Das untere Ende des Bereichs entspricht einzelnen lamellaren Teilchen, die im wesentlichen flache Oberflächen besitzen, und das obere Ende entspricht abgestuften oder zusammenhängenden lamellaren Teilchen. Die Oberfläche einer Lamelle zeigt oft eine gestufte Topographie, die typisch für das polymere Kristallwachstum ist.
Die ebenen Abmessungen der lamellaren Teilchen, sowohl Länge als auch Breite, liegen typischerweise im Bereich von 0,5 um bis 80 um, vorzugsweise zwischen 1 um bist 40 um, noch bevorzugter zwischen 1 um und 10 um und in besonders bevorzugter Weise im Bereich von 3 um bis 5 um. Das Längen-/Breiten-Verhältnis liegt im Bereich von 160 : 1 bis 1 1, vorzugsweise im Bereich 2,5 : 1 bis 3 : 2.
Die Teilchenmorphologie kann unter Verwendung eines Abtastelektronenmikroskops oder der Atomkraftmikroskopie gemessen werden.
Der Ausdruck "aktiver Wirkstoff" wird hier verwendet, um jeglichen Wirkstoff zu beschreiben, von dem es wünschenswert sein kann, ihn dem menschlichen oder tierischen Körper für irgend einen Zweck zuzuführen, wozu therapeutische, pharmazeutische, pharmakologische, diagnostische, kosmetische und prophylaktische Wirkstoffe und Immunomodulatoren gehören.
Aktive Wirkstoffe umfassen Wachstumshormon wie z. B. knochen-morphogenes Protein (BMP), Insulin, Interferone (α, β, γ) Erytropoietin, kolonie-stimulierende Faktoren wie z. B. den granulocytmakrophagen-kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), Interleukin 2 und 12, Paratyroidhormon, leutenisirendes Hormon freisetzendes Hormon, Calcitonin, Heparin, Somatropin und verschiedene Analoge hiervon. Nukleinsäure, die Oligonukleotide mit einer Länge bis zu 10 Nukleotiden umfasst, wird ebenfalls unter dem Ausdruck "aktiver Wirkstoff' verstanden.
Der aktive Wirkstoff ist vorzugsweise ein Impfstoff, ein Antigen, ein Allergen oder DNA.
Tetanus-Toxoid und Influenza-Viren sind besonders bevorzugt.
Antigene umfassen Polypeptide, Proteine, Glycoproteine und Polysaccharide, die aus tierischen, pflanzlichen, bakteriellen, viralen und Parasiten-Quellen gewonnen oder durch synthetische Verfahren erzeugt werden. Wir verwenden den Ausdruck Antigen um jegliches Material zu bezeichnen, das eine Antikörper-Reaktion jeglicher Art verursacht, wenn es verabreicht wird. Solche Antigene können durch Injektion oder über verschiedene Schleimhautbereiche (nasal, oral, vaginal, rektal oder die Darmschleimhaut) verabreicht werden.
Impfstoffe für die Behandlung von Allergenen und Autoimmun-Erkrankungen sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Beispielsweise wurde vorgeschlagen, dass bei einer Autuoimmun-Erkrankung die langsame Zuführung von essentiellen Faktoren hilfreich sein kann. Solche Faktoren können Insulin für die Behandlung von Diabetes und Collagen für die Behandlung von rheumatoider Arthritis umfassen.
Der aktive Wirkstoff kann auch ein Polypeptid, Peptid oder Protein, ein Kohlehydrat oder ein Oligonukleotid wie z. B. DNA, einschließlich Wachstumshormon, Insulin, Interferonen (α, β, γ), Interleukinen, Erythropoietin, kolonie-stimulierenden Faktoren, Wachstumsfaktoren, Parathyroidhormon, leutenisierendes Hormon freisetzendes Hormon, Calcitonin, Heparin, Somatostatin und verschiedene Analoge hiervon sein.
Der aktive Wirkstoff wird an oder in den lamellaren Teilchen nach deren Zubereitung dadurch adsorbiert, dass der Wirkstoff mit den Teilchen gemischt wird.
Wenn der aktive Wirkstoff ein Peptid- oder Protein-Medikament ist, wird das lamellare Teilchen mit dem adsorbierten aktiven Wirkstoff vorzugsweise mit einem Polymer wie z. B. Poly-(D.L-lactid-Coglycolid) (PLG) oder einem Eudragid-Polymer verkapselt oder vollständig beschichtet, bevor es oral verabreicht wird.
An Lamellen gebundene, imobilisierte Adjuvantien können gleichzeitig mit imobilisierten Antigenen dadurch verabreicht werden, dass zwei Lamellenarten gemischt werden. Adjuvantien umfassen Dextransulfat, synthetische Analoge von mykobakteriellen Fragmenten (Muramyldipeptid, Lauroyltetrapeptid), Muramyltripeptid, Phosphatidylethanolamin (MTP- PE), Monophosphoryllipid, das aus bakteriellem Endotoxin gewonnen wurde (MPL A), Chitosan und seine Oligomere.
Die lamellare Oberfläche kann modifiziert werden, um die Wechselwirkung des Substrats mit den bioaktiven Wirkstoffen zu verbessern.
Die lamellare Oberfläche kann modifiziert werden, um die Wechselwirkung des Substrats mit Wirtzellen und -geweben zu verbessern.
Die lamellare Oberfläche kann modifiziert werden, um die Wechselwirkung des Substrats mit bioaktiven Wirkstoffen zu verbessern.
Die Modifikation der Oberflächeneigenschaften der Lamellen kann wünschenswerter Weise so sein, dass spezielle Moleküle oder Liganden angezogen werden oder dass die Wechselwirkung der Lamellen mit Wirtszellen und -geweben moduliert wird.
Beispielsweise können Änderungen des immunomodulatorischen Charakters der Lamellen wünschenswert sein, um eine spezielle Art von Antwort zu stimulieren. TH1-Lymphozyten sind in vorherrschender Weise der durch die Zellen vermittelten Immunität (die wesentlich für die Erkennung und Abtötung von mit Viren oder Bakterien infizierten Zellen ist) zugeordnet und erzeugen Zytokine wie z. B. IL-2 und IFN-γ. TH2-Zellen sind der Antikörperproduktion und humoralen Immunantworten zugeordnet und erzeugen Zytokine wie z. b. IL-4 und IL-10. Die gemeinsame Verabreichung von zytokin-modifizierten Lamellen und Antigenen kann nützlich sein, um einen Schutz gegen infektiöse Wirkstoffe viralen oder bakteriellen Ursprungs zu erzielen.
Die Lamellen können durch ein Molekül modifiziert sein, das von einem speziellen zellulären Rezeptor im menschlichen oder tierischen Körper erkannt wird und zu diesem eine Affinität besitzt, um ein Zielrichtungs-Potential zu schaffen. Die Anheftung von Lecitinen oder monoklonalen Antikörpern an die Oberfläche der Lamellen könnte nützlich sein, um eine Wechselwirkung mit der Schleimhautoberfläche des Magen-Darm-Trakts zu verbessern.
Polymere Oberflächenmodifikatoren können an den Lamellen durch Adsorption, durch physikalische Ketten-Verknüpfung und Interpenetration mit der Oberfläche oder durch chemisches Pfropfen (grafting) angeheftet werden.
Die Oberflächenmodifikatoren können dem Nicht-Lösemittel zugesetzt werden, das für die Ausfällung der Lamellen in der Prozessstufe (b) (siehe unten) verwendet wird. Alternativ kann das feste Substrat nach der Herstellung behandelt werden.
Zu den die Oberflächen modifizierenden Polymeren gehören die Block-Copolymere basierend auf Polyethylenoxid und Polypropylenoxid (Poloxamere, Poloxamine) und tetra-funktionelle Block-Copolymere, die durch sequentielle Hinzufügung von Propylenoxid und Ethylenoxid zu Ethylendiamin abgeleitet werden (Poloxamine), Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Sorbitanester wie z. B. Sorbitanmonostearat (Span 60), Polysorbate (Tween), Polyoxiethylenfettester, Phospholipide wie z. B. Lecithin, Lysophosphatidylcolin (LPC), Fettsäuren, Stearinsäuren, Stearate und deren Derivate wie z. B. Polyoxiethylen.
Andere Polymere die möglicherweise für die Oberflächenmodifikation nützlich sind, umfassen die Polyamidoamine, Polymäpfelsäure, Polyaminosäuren, Poly(L-Lysin), Poly-(L- Glutaminsäure), Poly(L-Asparaginsäure) und deren Copolymere, Polymere von Acrylsäure (Cabopol) und Copolymere basierend auf Maleinsäure-Anhydrid.
Andere Kategorien von die Oberfläche modifizierenden Wirkstoffen umfassen die anionischen Detergenzien, Natriumsalze der Deoxicholsäure, Glycocholsäure oder Natriumlaurylsulfat (SDS), kathionische Detergenzien und nicht-ionische Detergenzien wie z. B. Triton (Polyoxyethylenether - Triton ist eine Handelsmarke von Union Carbide Ltd.).
Die Oberfläche modifizierende Polymere können auch aus der Gruppe ausgewählt werden, die sowohl natürliche als auch synthetisch hergestellte Proteine und Polysaccharide und deren Derivate sowie Konjugate mit Polyethylenglykol PEG umfasst.
Der Ausdruck "Protein" soll auch Peptide, Polypeptide, Glycoproteine, Metalloproteine, Lipoproteine und Untereinheiten oder Bruchstücke hiervon umfassen. Proteinmaterialien umfassen Albumin, Gelatin, Kollagen, Glycoproteine und deren Derivate mit beispielsweise Polyethylenglykol. Verfahren zur Zubereitung von Konjugaten von PEG und Protein wurden von Nucci et al. in Advances in Drug Delivery Reviews, Band 6, Seiten 113 bis 151 (1991) beschrieben.
Der Ausdruck Polysaccharide umfasst Polymere von Amino-Zuckern.
Beispiele von Polysacchariden, die als Oberflächenmodifikatoren nützlich sind, umfassen Dextran, Xanthan, Chitosan, Chitosanlactat, Chitosanglutamat, Pectin, Dextrin, Maltodextrin, Hylaluronsäure, Cellulose, Stärke, Hydroxiethylstärke, Pullulan, Inulin, Algianate, Heparin und eeparin-ähnliche, synthetische Polymere und ihre jeweiligen Derivate. Konjugate von PEG und Polysacchariden wurden beispielsweise von Duval et al. in Carbohydrate Polymess, Band 15, Seiten 233 bis 242 (1991) beschrieben.
Der Oberflächenmodifikator kann eine Mischung von zwei oder mehr der oben aufgeführten Polymere sein.
Die Lamellen können entweder für eine intramuskuläre, intravenöse, subkutane, intraarterielle oder intraperitoneale Injektion geeignet sein. Sie werden im allgemeinen steril und pyrogenfrei sein. Die Lamellen können für eine Verabreichung an die dermale oder epidermale Schicht der Haut durch Injektion oder ein nadelloses Injektionssystem geeignet sein. Die Lamellen können auch für eine Verabreichung an die Schleimhaut beispielsweise der Nase, des Magendarmtrakts, des Dickdarms, der Vagina und des Rektums geeignet sein.
Die lamellaren Teilchen der Erfindung können auf die aus dem Stand der Technik allgemein bekannten Arten zubereitet werden.
Die Zubereitungen können bequemer Weise in Einheits-Dosis-Form dargeboten werden und können durch jedes der in der Pharmazie aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren zubereitet werden. Diese Verfahren umfassen den Schritt, die lamellaren Teilchen, an denen der aktive Wirkstoff adsorbiert worden ist, mit dem Träger in Verbindung zu bringen, der einen oder mehrere zusätzliche Ingredienzien bildet. Im allgemeinen werden die Zubereitungen dadurch hergestellt, dass die lamellaren Teilchen mit flüssigen Trägern oder fein zerteilten festen Trägern oder beiden in gleichförmigen und engen Kontakt gebracht werden, worauf das Produkt erforderlichenfalls geformt wird.
Zubereitungen, die für die parentarale Verabreichung geeignet sind, umfassen wässrige und nicht-wässrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und Beimengungen umfassen können, die die Zubereitung mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers isotonisch machen; es können auch wässrige oder nicht-wässrige sterile Suspensionen umfasst werden, die Suspensionsmittel und Verdickungsmittel umfassen können. Die Zubereitungen können in Einzeldosis- oder Mehrdosen-Behältern, beispielsweise versiegelten Ampullen und Gefäßen dargeboten werden und können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, der lediglich die Hinzufügung des sterilen flüssigen Trägers, beispielsweise Wassers für die Injektionen unmittelbar vor der Verwendung erfordert.
Für improvisierte Injektionen geeignete Lösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der zuvor beschriebenen Art zubereitet werden.
Bevorzugte Eindosis-Zubereitungen sind solche, die eine tägliche Dosis oder Einheit, eine tägliche Unterdosis oder einen geeigneten Bruchteil hiervon eines aktiven Bestandteils enthalten.
Es sei darauf hingewiesen, dass zusätzlich zu den speziell oben erwähnten Ingredienzien die Zubereitungen gemäß der Erfindung andere im Stand der Technik übliche Wirkstoffe enthalten können, die für den jeweiligen Zubereitungstyp von Bedeutung sind.
Die Menge der lamellare Teilchen umfassenden Zubereitung gemäß der Erfindung, die einem Patienten verabreicht wird, kann in Relation zu der zu verabreichenden Menge des aktiven Wirkstoffs und der Menge des aktiven Wirkstoffs bestimmt werden, der an den Teilchen adsorbiert ist, sowie in Bezug auf die Art und Weise, auf welche der aktive Wirkstoff im Patienten nach der Verabreichung der Zusammensetzung verfügbar wird.
Geeigneter Weise wird die Menge der verabreichten Zusammensetzung diejenige sein, die zwischen 1% und 1000% der normalen Menge des aktiven Wirkstoffs enthält, die dem Patienten auf herkömmliche Weise verabreicht wird.
Vorzugsweise enthält die Menge zwischen 10% und 500% der normalen Menge des aktiven Wirkstoffs und in besonders bevorzugter Weise zwischen 20% und 80%.
Für eine nasale Verabreichung können die Impfstoffe als feine Suspension unter Verwendung einer Sprühvorrichtung oder in der Form eines Pulvers unter Verwendung einer Pulvervorrichtung oder eines nasalen Insufflators verabreicht werden. Diese Vorrichtungen sind dem Fachmann allgemein bekannt. Zubereitungen für den Magendarmtrakt können als Suspensionen oder als Tabletten und Kapseln oder in komprimierten oder extrudierten Pelletts verabreicht werden.
Bei an der Oberfläche adsorbierten Antigenen, die gegen die Säurebedingungen im Magen empfindlich sind, kann das Verabreichungssystem durch ein enterisches Polymer geschützt werden; diese sind dem Fachmann für die Herstellung von solchen Zubereitungen ohne weiteres bekannt. Das entherische Polymer kann verwendet werden, um die Dosierungsform zu überziehen. Vaginale Systeme, die für eine Abgabe geeignet sind, umfassen Gele und Vaginal-Zäpfchen. Rektal verabreichbare Impfstoffe können als Klistiere oder als Bestandteil von Zäpfchen gegeben werden.
Die Erfindung schafft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, das folgende Schritte umfasst:
a) Lösen des Polymers in einem Lösemittel,
b) Heftiges Rühren der Polymerlösung und Hinzufügen eines Nicht-Lösemittels für das Polymer,
c) Verdampfen des Lösemittels aus der Mischung von Schritt b), und
d) Beimischen eines aktiven Wirkstoffs zu den derart gebildeten Teilchen.
Es hat sich gezeigt, dass bei der Verwendung von kristallisierbaren Polymeren das obige Ausfällverfahren lamellare Teilchen bildet, die im Gegensatz zu den dem Stand der Technik entsprechenden kugeligen Teilchen stehen, die bei der Verwendung von amorphen Polymeren gebildet werden.
Das verwendete Lösemittel, das ein "schlechtes Lösemittel" für das biologisch abbaubare Polymer ist, ist vorzugsweise Aceton, Ethylacetat, Xylen oder Dioxan, obwohl auch jedes andere geeignete Lösemittel verwendet werden kann. Es kann erforderlich sein, Wärme zuzuführen, um das Polymer in dem Lösemittel aufzulösen. Das Nicht-Lösemittel ist vorzugsweise Wasser, Methanol oder Ethanol.
Unter einem "schlechten Lösemittel" wird ein Lösemittel verstanden, in welchem das Polymer eine niedrige oder vernachlässigbare Löslichkeit besitzt, so dass das Polymer aus der Lösung als (teilweise) kristallines Material austritt (Ausfällverfahren). Die Lösemittel und Nicht-Lösemittel für Polymere finden sich in Standardtexten (siehe z. B. Fuchs in Polymer Handbook, 3. Ausgabe und Deasy, Microencapsulation and Related Drug Processes, 1984, Marcel Dekker, Inc., New York).
Die Fähigkeit eines Polymers, sich in einem Lösemittel zu lösen, kann unter Verwendung des Cohessive Energie Densitiy Concepts (CED) und darauf bezogener Löslichkeitsparameterwerte abgeschätzt werden, wie dies von Deasy beschrieben wird und sich im einzelnen in dem Artikel von Grulke im Polymer Handbook findet.
Somit ist der Fachmann in der Lage, ein "schlechtes" Lösemittel auszuwählen, um die erforderliche Ausfällung des lamellaren Materials zu erzielen.
Die lamellaren Teilchen können auch durch ein Kristallisationsverfahren hergestellt werden, bei dem man das Polymer wie zuvor in dem Lösemittel löst, abkühlt und auskristallisieren läßt. Die Teilchen können dann durch Filtration gewonnen werden. Die derart ausgebildeten Teilchen werden dann mit dem aktiven Wirkstoff vermischt, um eine Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 12 zu ergeben.
Es hat sich gezeigt, dass die lamellaren Teilchen gemäß der Erfindung eine stark erhöhte Adsorption des aktiven Wirkstoffs im Vergleich zu den dem Stand der Technik entsprechenden kugeligen Teilchen ergeben, die aus amorphen Polymeren gebildet werden. Die Adsorption der aktiven Wirkstoffe an lamellare Teilchen vermeidet auch die Nachteile, die sich bei den gemäß dem Stand der Technik mikroverkapselten Impfstoffen auf PLG-Basis ergeben. Dies umfasst auch das Vermeiden der Aussetzung an hohe Scherkräfte und Lösemittel und Säureabbauprodukte, die durch PLG erzeugt werden und gewisse Antigene denaturieren können. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die lamellaren Partikel das Antigen in vitro über lange Zeiträume hinweg besser zurückhalten. Es wird angenommen, dass die irreguläre lamellare Form der Teilchen als Immunomodulator wirken und das Immunsystem stimulieren kann.
Bei der Verwendung in Tierstudien zur Messung der Immunantwort auf adsorbierte Influenza-Viren führten die lamellaren Teilchen gemäß der Erfindung dazu, dass 60% der behandelten Mäuse geschützt waren.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden nun im Einzelnen in den folgenden Beispielen und unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung beschrieben; in dieser zeigen:
Fig. 1 eine Elektronenmikroskop-Aufnahme von dem Stand der Technik entsprechenden kugeligen Teilchen von Poly(DL-Lactid-Coglycolid) (PLG);
Fig. 2 eine elektronenmikroskopische Aufnahme von lamellaren L.PLA-Teilchen gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, und
Fig. 3 und 4 elektronenmikroskopische Aufnahmen des lamellaren Systems ohne (Fig. 3) und mit (Fig. 4) adsorbierten Influenza-Viren.

BEISPIEL 1

Herstellung von lamellaren Substratpartikeln durch Ausfällen

10 ml Wasser wurden in 5 ml einer 2%-igen (Gewicht/Gewicht) PLA-Lösung in Aceton injiziert, die mit einem Magnetrührer heftig gerührt wurde. Das Molekulargewicht des PLA betrug 6.600.
Die Mischung wurde dann über Nacht mit einem Magnetrührer vorsichtig gerührt, um das Aceton-Lösemittel zu verdampfen.
Die sich ergebenden lamellaren PLA-Teilchen können aus der Suspension durch Filtration gesammelt oder die Suspension kann bei 5ºC gelagert werden.

BEISPIEL 2

Herstellung von lamellarem Substrat durch Polymer-Kristallisation aus einer Lösung unter Ruhebedingungen

Das Verfahren kann auch verwendet werden, um L.PLA-Substrate aus einer 0,5%-igen (Gewicht/Volumen) Aceton-Lösung eines Polymers mit einem Molekulargewicht von 100.000 in folgender Weise zuzubereiten:
a) Das L.PLA-Polymer wurde in Aceton unter Erwärmen auf ungefähr 50ºC gelöst.
b) Die Lösung wurde 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen, worauf beim Abkühlen Kristallisation auftrat.
Die sich ergebenden lamellaren Teilchen können durch Filtration gesammelt werden.

BEISPIEL 3

Antigen-Adsorption

25 bis 30 mg von Teilchen (genau gewogen), die durch das Verfahren nach Beispiel 1 hergestellt worden waren, wurden in einer wässrigen Lösung eines Antigens über Nacht bei Zimmertemperatur unter End-Over-End-Schütteln (Foss-Mixer) inkubiert. Die Mikroteilchen wurden zentrifugiert und einmal mit destilliertem Wasser gewaschen. Der Überstand wurde gesammelt und auf seinen Antigen-Gehalt unter Verwendung eines BCA-Protein-Analyseverfahrens untersucht. Es wurde eine Eichkurve aus einer Reihendillution des betreffenden Antigens konstruiert und die Menge des an den lamellaren Substraten adsorbierten Antigens wurde durch Subtraktion ermittelt. Die adsorbierten Mengen des Antigens, nämlich eines Influenza-Virus, Tetanus-Toxoids bzw. Ovalbumin sind in Tabelle 1 dargestellt.

BEISPIEL 4

In vitro erfolgende Antigen-Freisetzung von lamellaren PLA-Substratpartikeln

25-30 mg lamellare PLA-Partikel mit adsorbiertem Antigen, die nach Beispiel 3 zubereitet worden waren, wurden in 2 ml PBS, das 0,02% Natriumazid enthielt, bei 37ºC inkubiert. Das Freisetzungsmedium wurde nach einem Tag von den Mikropartikeln getrennt und es wurde frisches Medium zu den Probenröhrchen hinzugefügt. Dieses Verfahren wurde mit dreitägigen Intervallen bis zu acht Wochen fortgesetzt. Das Freisetzungsmedium wurde unter Verwendung eines BCA-Protein-Untersuchungsverfahrens auf seinen Antigen-Gehalt analysiert und die kumulative Freisetzungsmenge des Antigens (%) berechnet. Die zurückgehaltenen Mengen des Influenza-Virus, Tetanus-Toxoids bzw. Ovalbumins sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Adsorption von Antigenen an lamellaren Poly(Lactid)-Adjuvanzien

BEISPIEL 5

Immunogenizität von Impfstoffen, die durch Adsorption von Influenza-Viren an lamellaren PLA-Substraten zubereitet wurden

A/Shanghai/24/90-Influenza-Viren wurden an lamellaren PLA-Substratteilchen adsorbiert, die durch die Verfahren der Beispiele 1 und 3 zubereitet worden waren und ebenso an dem Stand der Technik entsprechenden 75 : 25 PLG-Mikrokügelchen. Man ließ die adsorbierten Viren sich 14 Wochen stabilisieren, bevor die Immunogenizitätsstudie begonnen wurde. Der Hämagglutinin(HA)-Gehalt der Impfstoffe wurde dadurch berechnet, dass die Menge des Antigens abgeschätzt wurde, die an den Mikropartikeln haften blieb. Die Impfstoffzubereitungen wurden subkutan Gruppen von 20 Balb/C-Mäusen verabreicht und Blutproben wurden am 28. Tag entnommen. Alle Seren wurden auf Virus-Antikörper durch Hämagglutinin-Hemmung (H1) getestet.
Die Impfstoff-Testzubereitungen waren die folgenden:
1. Wässrige inaktivierte Viren, 15 ug HA/0,1 ml
2. Inaktivierte Viren an PLG-Mikrokügelchen adsorbiert, 15 ug HA/0,1 ml
3. Inaktivierte Viren an lamellaren PLA-Adjuvanzien adsorbiert, 15 ug HA/0,1 ml
Die HI-Titter-Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich gegenüber löslichen Viren eine mehr als zehnfache Verbesserung bei der Antikörper-Antwort auf Impfstoffe ergab, die mit lamellaren PLA-Teilchen gemäß der Erfindung zubereitet worden waren. Darüber hinaus war die Antwort auf Viren, die an lamellaren PLA-Teilchen adsorbiert waren, ungefähr das 5-fache derjenigen, die bei der Verwendung von dem Stand der Technik entsprechenden PLG-Mikrokügelchen als Substrat für die Adsorption von Influenza-Viren erzielt wurde. Tabelle 2

Statistische Analyse

Students-t-Test

1. Vergleich von Gruppe 1 mit Gruppe 2: t = 5,55, signifikant bei t < 0,05
2. Vergleich von Gruppe 1 mit Gruppe 3: t = 12,0, signifikant bei p < 0,05
3. Vergleich von Gruppe 2 mit Gruppe 3: t = 7,60, signifikant bei p < 0,05

BEISPIEL 6

Thermale Analyse von lamellaren Substraten

Thermische Übergänge wurden für lamellare PLA-Substrate und 75 : 25-PLG-Mikrokügelchen-Substrate unter Verwendung der Differenzial Scanning Calorimetry aufgezeichnet. Bei einer Erwärmung von 20ºC/min von 20ºC auf 200ºC wurde bei 130ºC ein einzelner Schmelzscheitel für Lamellen beobachtet, die unter Verwendung eines Polymers mit niederem Molekulargewicht (Molekulargewicht 6.600) zubereitet worden waren. Die Probe wurde dann mit einer Geschwindigkeit von 80ºC/min auf 20ºC abgekühlt und dann sofort mit 40º C/min erneut erhitzt. Ein exothermer Rekristallisationsscheitel wurde bei 87ºC und ein Schmelzscheitel bei 120ºC beobachtet.
Lamellare PLA-Substrate, die unter Verwendung eines Polymers mit höherem Molekulargewicht (Molekulargewicht 90.600) zubereitet worden waren, führten beim Erwärmen zu einem Schmelzpunkt bei 182ºC. Nach dem Abkühlen und erneuten Erhitzen wurde ein Rekristallisationsscheitel bei 117ºC beobachtet, auf den ein Schmelzscheitel bei 175ºC folgte.
Die niedrige Schmelztemperatur, die in Verbindung mit der Verwendung von PLA-Material mit niederem Molekulargewicht auftrat, ist kennzeichnend für kleine Kristallit-Größen und/oder einen höheren Grad von Strukturunregelmäßigkeiten innerhalb der Kirstallite, welche die Lamellen bilden.
Die 75 : 25-PLG-Mikrokügelchen zeigten einen Glasübergang bei 60ºC während des Erwärmens. Nach dem Abkühlen und erneuten Erhitzen wurde beobachtet, dass sich die Glasübergangstemperatur auf die etwas niedrigere Temperatur von 57ºC verschoben hatte. Die amorphe Natur des 75 : 25-PLG-Copolymers führt zum Fehlen von Schmelz- oder Rekristallisations-Scheiteln bei der thermalen Analyse.

BEISPIEL 7

Immunantwort auf oral verabreichte Lamellen mit adsorbierten Influenza-Viren

Zwei Dosen von Influenza-Viren (A/Shanghai/24/90, 15 ug HA/0,1 ml-Dosis) die an lamellaren Teilchen adsorbiert waren, wurden Mäusen (20/Gruppe) in einem Intervall von 56 Tagen oral verabreicht. Die Mäuse wurden oral mit einem oralen Antazidum (Aludrax) 2 Stunden vor der ersten Impfdosis und mit einem H&sub2;-Antagonisten (Tagamet) parentaral 2 Stunden vor dem Boost behandelt. Die Immun-Antwort wurde mit der verglichen, die bei Mäusen auftrat, welche zwei Dosen von an 75 : 25-PLG-Mikrokügelchen adsorbierten Influenza- Viren bzw. einen wässrigen Impfstoff erhalten hatten. Zur Kontrolle wurden auch Mikroteilchen ohne Influenza-Viren verabreicht.
Probeblutentnahmen und Nasenspülungen wurden am 28. und 76. Tag entnommen.
Alle Gruppen wurden am 80. Tag durch eine nasale/orale Verabreichung einer 50-Maus- Infektionsdosis 50 (MID50) des A/Shanghai/24/90-Virus stimuliert.
Nasenspülungen wurden an den Tagen 1 bis 7 nach der Stimulierung vorgenommen und der Virus wurde in MDCK-Zellen zitriert.
Schwache Serum-H1-Antikörper-Antworten wurde für alle geimpften Gruppen am 28. und 76. Tag nach der Impfstoff-Verabreichung gemessen (Tabelle 3). Die Mäuse, welche den an Lamellen adsorbierten Impfstoff erhalten hatten, waren gegen die Virus-Stimulation signifikant besser geschützt als diejenigen, die einen wässrigen Impfstoff oder an PLG-Mikrokügelchen adsorbierte Viren erhalten hatten. Tabelle 3 Immunogenizität und Schutzeffekte für oral verabreichte lamellare Systeme Immunogenizität
¹ Nachimmunisierungs-H1-Titer ≥ 1 : 40 Schutz
¹ auf Basis der Viren-Ausschüttung

BEISPIEL 8

Kumulative Freisetzung von Influenza-Viren aus PLA-Lamellen

Influenza-Viren wurden an PLA-Lamellen (Molekulargewicht 6.600) unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens adsorbiert. Die Menge der Viren im Inkubationsmedium wurde so eingestellt, dass Lamellen mit einer Virusbeladung von 19% (Gewicht/Gewicht) bzw. 13,1% (Gewicht/Gewicht) erhalten wurden. Influenza-Viren wurden auch an Lamellen adsorbiert, die unter Verwendung eines Poly(L-Lactid)-Polymers mit einem Molekulargewicht von 90.600 zubereitet worden waren. Eine in vitro Freisetzungsstudie wurde durchgeführt, wie in Beispiel 4 beschrieben. Kumulative Freisetzungs-Zahlen, die für jede Probe ermittelt wurden, sind in Tabelle 4 für Vergleichszwecke dargestellt.
Die Menge der zurückgehaltenen Influenza-Viren in vitro kann dadurch überprüft werden, dass die Menge der an die Lamellen adsorbierten Viren jeweils durch Variation der Polymer-Molekulargewichts-Eigenschaften eingestellt wird.

Tabelle 4

Kumulative Freisetzung von Influenza-Viren aus PLA-Lamellen

BEISPIEL 9

Kumulative Freisetzung von Tetanus-Toxoid aus PLA-Lamellen

Tetanus-Toxoid wurde an PLA-Lamellen (Molekulargewicht 90.600) unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens adsorbiert, um eine Adsorptionsbeladung von 7,1 % (Gew./Gew.) zu erhalten. Eine in vitro durchgeführte Freisetzungsstudie erfolgtr wie in Beispiel 4 beschrieben. Die kumulativen Freisetzungs-Zahlen sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5 Freisetzung von adsorbierten Tetanus-Toxoid aus lamellaren Strukturen
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Claims

1. Zusammensetzung für die Abgabe eines aktiven Wirkstoffs, die eine Vielzahl von lamellaren Teilchen umfaßt, wobei diese Teilchen ein biologisch abbaubares Polymer umfassen, das zumindest teilweise kristallin ist, sowie einen aktiven Wirkstoff, der zumindest an die meisten der Teilchen adsorbiert ist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das biologisch abbaubare Polymer zumindest zu 5 Gew.-% und vorzugsweise zumindest zu 30 Gew.-% kristallin ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das biologisch abbaubare Polymer eine Mischung von zwei oder mehr biologisch abbaubaren Polymeren umfaßt, die zumindest teilweise kristallin sind.

4. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Polymer Poly(L-lactid) ist.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der das Polymer ein Copolymer von Poly(L-lactid) ist.

6. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der der wirksame Wirkstoff DNA, ein Antigen, ein Allergen oder ein Impfstoff ist.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, bei der das Antigen Tetanus- Toxoid oder ein Influenza-Virus ist.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei der der aktive Wirkstoff ein Peptid, Polypeptid oder ein Protein ist.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, bei der der aktive Wirkstoff DNA, Insulin, LHRH, ein Wachstumsfaktor, ein Wachstumshormon, ein Interferon, ein Interleukin-Kolonie-Stimulierungsfaktor, Somatostatin oder ein hierzu analoges Mittel ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, bei der die Teilchen und der adsorbierte aktive Wirkstoff mit einem Polymer überzogen sind.

11. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die lamellaren Teilchen eine Vielzahl von miteinander verbundenen lamellaren Teilchen umfassen kann.

12. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die lamellaren Teilchen eine Dicke von 50 nm bis 80 um besitzen.

13. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, das folgende Schritte umfaßt:

a) Auflösen des Polymers in einem Lösemittel,

b) heftiges Rühren der Polymerlösung und Hinzufügen eines Nichtlösungsmittels für das Polymer,

c) Verdampfen des Lösemittels aus der Mischung von Schritt b), und

d) Hinzumischen eines aktiven Wirkstoffs zu den so gebildeten Teilchen oder Herstellen von lamellaren Teilchen durch ein Kristallisationsverfahren, bei dem das Polymer im Lösemittel wie oben aufgelöst und gekühlt wird, um es dann kristallisieren zu lassen, worauf zu den so geformten Teilchen ein aktiver Wirkstoff hinzu gemischt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das Lösemittel Azeton, Ethylacetat, Xylen oder Dioxan ist.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, bei dem das Nichtlösemittel Wasser, Methanol oder Ethanol ist.