NO315406B1 - Blanding som omfatter lamell¶re polymeriske partikler samt fremstilling derav - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en blanding for tildeling av et aktivt middel, og nærmere bestemt en blanding som omfatter lamellære polymeriske partikler.

Systemer for tildeling av farmasøytisk eller terapeutisk aktive midler særlig antigener, er av spesiell interesse.

Selv om innvirkningen av faktorer slik som dosen, sammensetningen og frekvensen for administrering av antigen på immun-responsen gjenkjennes, har en imidlertid generelt ikke etablert noen optimal frigjøring/tildeling og presentasjon (Khan et al (1994)). I konvensjonelle væskedoserings-regimer er flere små doser antigen mere effektivt enn en enkelt inokulering eller noen få store doser ved stimulering av en beskyttende immunrespons. Det er også kjent at proteinkonsentrasjoner så lave som 0.001 ug er tilstrekkelig til å stimulere en sekundærrespons og at immunologisk ikke-respons (toleranse) kan induseres ved både høye og lave doser av antigen og ved hyppig administrering.

Mange rensete, syntetiske eller inaktiverte antigener slik som Tetanus toxoid er svake immunogene og krever vanligvis flere parenterale doser for å gi passende beskyttelse. Adsorpsjon av vaksine-antigener på hjelpestoffer slik som Alum er en vanlig metode for å fremme immunogenitet. Et stort utvalg substanser, både biologiske og syntetiske, har blitt brukt som hjelpestoffer inkludert mycobakterier, oljeemulsjoner, liposomer, polymer-mikropartikler og mineralgeler. Et utvalg på 24 ulike hjelpestoffer ble nylig undersøkt av Stieneker et al (1995) for inaktivert HIV-virus som omfattet mange av hjelpes toff-systemene som i dag er under utforskning. Bare aluminiumhydroksid ("Alum") har imidlertid blitt godkjent for administrering i mennesker men dets bruk er ofte forbundet med uheldige reaksjoner.

I likhet med beskyttende antigener, stimulerende fagocytose og aktiverende lymfoide celler, fungerer noen hjelpestoffer ved å opprettholde antigenet i posisjonen det er avsatt. Antigen-rentensjon ser ut til å være av vital betydning for gjentatt stimulering av minne B-celle-populasjon og for å opprettholde antistoff-titer over lengre perioder (Gray et al

(1988)). Hjelpe-effekten av W/O-emulsjoner slik som Freund's Complete Adjuvant (FCA)/ Freund's Incomplete Adjuvant (FIA), anses å oppstå fra dannelse av en kortlivet "deponerings-effekt" som involverer antigen-retensjon som et resultat av granuloma-dannelse. Marialt antigen har blitt detektert ved injeksjonsstedet 80 dager etter administrering når formulert med liposomer og innkapslet i alginat-poly(L-lysin)-mikropartikler (Cohen et al (1991)), som foreslår at dette systemet også gir en "depot-type" vaksine for vedvarende retensjon og presentasjon av antigener til immunsystemet.

Den betydelige forskningsinnsats som er ofret på vaksine-formulering har etablert en lang rekke strategier for å optimalisere antigen-frigjøringsrater og oppnå enkeltdose til-delings-systemer. Puls-frigj øring av antigen fra biodegraderbare, bioforenelige poly(laktid-ko-glycolid) [PLG] -mikropartikler er ansett som fordelaktig for å stimulere det konvensjonelle multidose-skjema. De fleste mikropartikkel-tildelingssystemer er imidlertid ansett for å fungere etter prinsippet med vedvarende antigenfrigjøring over lang tid, som presenterer en kontinuerlig vedlikeholdstilførsel til immunsystemet for å opprettholde for-økning av immunceller og antistoffproduksjon. Raghuvanshi et al (1993) utviklet en enkelt injeksjons-blanding for Tetanus toxoid (TT) basert på dette prinsippet ved bruk av PLG-mikropartikler. Den resulterende immunrespons i løpet av 5 måneder i rotter var sammen-liknbare med den konvensjonelle 2-dose-plan med TT adsorbert på alum.

Den lavere primærrespons observert med TT adsorbert på Alum ble ansett å være for-årsaket av rask antigen-uttømming som resulterer i redusert forøkning av immunceller.

De små antigen-ladete PLG-mikropartiklenes (< 5 um i størrelse) evne til å fungere som potente antigen-tilførselssystemer etter subkutan administrering er ansett å oppstå fra 2 mekanismer: 1) effektiv fagocytose som fører til transport til lymfenodene der det opptrer en effektiv antigen-prosessering og presentasjon overfor T-hjelpeceller og 2) kontrollert frigjøring av antigen fra mikropartiklene. (Eldridge et al (1991), 0'Hagan et al (1991)). Høye immunresponser har imidlertid også blitt indusert ved bruk av store (72 um) protein-ladete mikropartikler (0'Hagan et al (1993)) som viser at fagocytose og transport til lymfenodene ikke er absolutt nødvendig for å oppnå høy serumantistoff-titer. En har imidlertid sett at antigen-holdige fragmenter fra store mikropartikler kan undergå fagocytose.

Det er anerkjent at den forhøyete immunrespons oppnådd ved bruk av antigen-ladete PLG-mikropartikler kan tilskrives en hjelpeeffekt heller enn langsom frigjøring av innkapslet protein siden antigener adsorbert på mikropartikler har vist seg å generere potent immunrespons etter subkutan (0'Hagan et al (1993), Kreuter et al (1988)) og nasal administrering (Aplar og Almeida (1994)).

En har nå overraskende funnet at ved å bruke biodegraderbare polymerer som er i det minste delvis krystalliserbare, kan det framstilles lamellære substratpartikler som er i det minste delvis krystalline, og som har blitt funnet å gi forbedringer i adsorpsjon av antigen, retensjon av antigen in vitro og forbedring i immunrespons til adsorberte antigener.

Oppfinnelsen anviser derfor en blanding for tildeling av et aktivt middel omfattende et flertall lamellære partikler som omfatter en biodegraderbar polymer som er i det minste delvis krystallin, og et aktivt middel adsorbert på i det minste de fleste partiklene.

En bruker her betegnelsen "biodegraderbar polymer" på polymere systemer hvorav i det minste en del kan degraderes til lavmolekylære forbindelser som er kjent for å involveres normalt i metabolske prosesser. En bruker her også betegnelsen for å omfatte polymer-systemer som kan angripes i det biologiske miljø slik at systemets integritet, og i noen tilfeller for makromolekylene i seg selv, påvirkes og gir fragmenter eller andre degraderings-biprodukter som kan bevege seg vekk fra deres virkeområde, men ikke nødvendigvis fira kroppen.

Den biodegraderbare polymer som anvendes er fortrinnsvis minst 5 vekt% krystalliserbar.

Den biodegraderbare polymer i partikkelen er fortrinnsvis minst 5 vekt% krystallin, helst minst 30% og enda bedre minst 50%. Fortrinnsvis minst 70% og aller helst minst 90% krystallin.

Hvorvidt en polymer er krystallin eller ikke, og graden av krystallinitet, kan bestemmes med metoder som er velkjent i faget, for eksempel røntgenstråle-diffraksjonsmetoder som utføres på polymerer eller ved differensiert scanning-kalometri.

En foretrukket polymer er poly(L-laktid) (L.PLA) som har en halv-krystallin natur. Molvekten av L.PLA-polymeren er fortrinnsvis i området 2000 til 100000.

Polymeren kan være en blanding av L.PLA med en annen biodegraderbar polymer eller med en bioforenelig men ikke-degraderbar polymer, enten som en kopolymer eller som en blanding av polymerer. I alle tilfelle bør den resulterende blanding fremdeles være i det minste delvis krystallin og fortrinnsvis minst 5 vekt% krystallin. Innholdet av en ikke-krystalliserbar eller ikke-krystallin polymer-komponent bør derfor begrenses etter behov.

Egnete kopolymerer er kopolymerer av L.PLA og andre poly(a-hydroksysyrer) slik som DL-laktid eller glykolid (f.eks. PLG), krystalliserbare kopolymerer av melkesyre og lakton, kopolymerer av L-laktid og poly(etylenglykol) [PEG], kopolymerer av L-laktid og a-aminosyrer (polydepsipeptider), polyanhydrider og polyortoestere.

Egnete blandinger av L.PLA med andre polymerer omfatter andre poly(oc-hydroksysyrer) slik som poly(DL-laktid ko-glycolid), PEG, kopolymerer av polyetylenoksid og poly-propylenoksid (PEO-PPO), polydepsipeptider, polyortoestere, polyanhydrider, polyfosfazen og kopolymerer av akryl- og metakryl-syreestere (Eudragit).

Andre biodegraderbare syntetiske polymerer som er potensielt nyttige for framstilling av lamellære substrater omfatter kopolymerer av a-hydroksysyrer, a-aminosyrer (polydepsipeptider), polyhydroksysmørsyre, kopolymerer av melkesyre og lakton, kopolymerer av melkesyre og PEG, kopolymerer av hydroksybutyrat og hydroksyvalerat, polyetylen-tereftalat, polyfosfazener, polykaprolakton, polyortoestere, polyanhydrider og kopolymerer av samme eller blandinger av slike polymerer.

Med "lamellær" menes her at partiklene omfatter tynne plater eller lag; liposomer er ikke lamellære partikler ifølge oppfinnelsen.

Det er foretrukket at de lamellære partiklene har en irregulær form, som kan etableres ved bruk av noen av framgangsmåtene illustrert i eksemplene.

De lamellære partiklene er ofte "pastiH"-formete, og kan være tilstede i blandingen som separate lamellære partikler, eller som skive-liknende, polyhedriske partikler formet av lameller som er integrert langs et felles plan. Betegnelsen "lamellær partikkel" brukes til å omfatte begge mulighetene. Lamell-patrikkelens tykkelse er i området 50 nm til 80 um, men er fortrinnsvis i området 50 til 500 nm. Den nedre del av området tilsvarer enkle lamellære partikler som har hovedsakelig flat overflate mens den øvre del av området viser til avtrappete eller sammenhopede lamellære partikler. Overflaten av lamellen oppviser ofte en avtrappet topografi som er typisk for polymer krystallvekst.

Plandimensjonene av de lamellære partiklene, både bredde og lengde, er typisk i området 0.5 um til 80 fim, fortrinnsvis 1 um til 40 um, bedre 1-10 um og aller helst 3-5 um. Aspekt-forholdet, forholdet mellom lengde og bredde, er i området 160:1 til 1:1, helst 2.5:1 til 3:2.

Partikkelmorfologien kan måles ved bruk av scanning-elektron-mikroskopi og atom-mikroskopi.

Betegnelsen "aktivt middel" benyttes her til å betegne ethvert middel som det kan være ønskelig å administrere til menneskekroppen eller dyrekroppen for et vilkårlig formål, slik som terapeutiske, farmasøytiske, farmakologiske, diagnostiske, kosmetiske og profylaktiske midler samt immunomodulatorer.

Aktive midler omfatter veksthormon slik som ben-morfogent protein (BMP), insulin, interferoner (alfa, beta, gamma), erytropoietin, koloni-stimulerende faktor slik som granulocyt makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), intemuklein 2 og 12, para-thyroid-hormon, 'leutenizing' hormon-firgjørende hormon, kalcitonin, heparin, somatropin og ulike analoger til disse. Nukleinsyre, som omfatter oligonukleotider så små som 10 nukleotider i lengde, omfattes også av betegnelsen "aktivt middel".

Det aktive middel er fortrinnsvis en vaksine, antigen eller allergen eller DNA.

Tetanus toxoid og influensavirus er særlig foretrukket.

Antigener omfatter polypeptider, proteiner, glycoproteiner og polysakkarider som er oppnådd fra dyr, planter, bakterier, virale og parasittiske kilder eller framstilt syntetisk. En bruker her betegnelsen angiten for å benevne ethvert materiale som vil forårsake en anti-stoffreaksjon av enhver type ved administrering. Slike antigener kan administreres ved injeksjon eller til ulike slirnhinne-seter (nasal, oral, vaginal, rektal, kolon).

Vaksiner for behandling av allergener og for auto-immun-sykdommer er godt beskrevet i den kjente teknikk. For eksempel i autoimmun-sykdommer har det blitt foreslått at den langsomme administrering av essensielle faktorer kan være fordelaktig. Slike faktorer kan omfatte insulin for behandling av diabetes og kolalgen for behandling av reumatoid arthritis.

Det aktive midlet kan også være et polypeptid, peptid eller protein, et karbohydrat eller et oligonukleotid slik som DNA, inkludert veksthormon, insulin, interferoner (alfa, beta, gamma), internukleiner erytropoietin, kolonistimulerende faktorer, vekstfaktorer, paratyroid hormon, 'leutenizing' hormon-frigjørende hormon, kalcitonin, heparin, somatostatin og ulike analoger til disse.

Det aktive midlet adsorberes på eller i de lamellære partiklene etter framstilling av samme ved å blande midlet med partiklene.

Dersom det aktive midlet er et peptid eller et protein-medikament, blir fortrinnsvis den lamellære partikkelen, med det adsorberte aktive midlet, innkapslet eller enterisk belagt med polymer slik som poly (D,L-laktid-ko-gIykolid) (PLG) eller en Eudragit-polymer, før oral administrering.

Hjelpestoffer immobilisert på lamellen kan sam-administreres med immobiliserte antigener ved å blande to populasjoner av lameller. Hjelpestoffer omfatter dekstransulfat, syntetiske analoger av mycobakterielle fragmenter (muramyldipeptid, lauroyltetrapeptid), muramyltirpeptid-fosfatidyletanolamin (MTP-PE), monofosforyl-lipid avledet fra bakterielt endotoksin (MPL A), kitosan bg oligomerer av samme.

Den lamellære overflate kan modifiseres for å fremme samvirke mellom substrat og bioaktivt middel.

Den lamellære overflate kan modifiseres for å fremme samvirke mellom substrat og vertsceller og -vev.

Den lammelære overflate kan modifiseres for å fremme samvirke mellom substrat og bioaktive midler.

Modifisering av overflate-karakteristikkene ved lamellen kan være ønskelig for på denne måten å tiltrekke spesielle molekyler, ligander eller for å modulere samvirket mellom lamellen og vertscellen og -vevet.

I et tilfelle kan det være ønskelig med endringer i immuno-modularitets-karakteren ved lamellen for å stimulere en spesiell type respons. TH 1-lymfocytter er i det alt vesentlige

assosiert med cellemediert immunitet (essensielt for gjenkjenning og dreping av virus- eller bakterie-infiserte celler) som produserer cellecytokiner slik som IL-2 og IFN-v. TH2-celler er assosiert med antistoff-produksjon og humoral immunrespons som produserer cytokiner slik som IL-4 og IL-10. Sam-administrering av cytokin-modifiserte lameller og antigener

kan være nyttig for å etablere beskyttelse mot infiserende substanser av viral og bakteriell opprinnelse.

Lamellene kan være modifisert med et molekyl som kjenkjennes av, og som har affinitet for, en spesiell cellulær reseptor i menneskekroppen eller dyrekroppen for å gi et mål-rettende potensiale. Festing av lecitiner eller monoklonale antistoffer til overflata av lamellen kan være nyttig til å fremme samvirke med shmhinneoverflata av fordøyelses-kanalen.

Polymeriske overflate-modiflserende midler kan festes til lamellen ved adsorpsjon, ved fysisk kjedeinnifltrering og interpenetrering med overflata eller ved kjemisk innpoding.

Overflatemodifikatoren kan tilsettes til den ikke-oppløsende komponent som anvendes for utfelling av lamellene i prosesstrinn (b) (se nedenfor). Alternativt kan det faste substratet være behandlet etter framstilling.

Overflatemodifiserende polymerer omfatter blokk-kopolymerer basert på polyetylenoksid og polypropylen-oksid (Poloxamerer, Poloxaminer) og tetra-funksjonelle blokk-kopolymerer avledet fra den sekvensielle tilsats av propylenoksid og etylenoksid til etylen-diamin (Poloxaminer), polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, sorbitanestere slik som sorbitanmonostearat (Span 60), polysorbater (Tween), polyoksyetylen fettestere, fosfo-lipider slik som lecitin, lysofosfatidylcholin (LPC), fettsyrer, stearinsyre, stearater og deres derivater med for eksempel polyoksyetylen.

Andre polymerer som er potensielt nyttige for overflatemodifisering omfatter polyamido-aminer, polymalinsyre, polyaminosyrer, poly(L-lysin), poly(L-glutaminsyre), poly(L-aspartansyrc) og deres kopolymerer, polymerer av akrylsyre (Carbopol) og kopolymerer basert på maleinsyreanhydrid.

Andre kategorier av overflatemodifiserende midler omfatter de anioniske tensider, natriumsalter av deoksycholinsyre, glykocholinsyre eller natrium-laurylsulfat (SDS), kationiske tensider og ikke-ioniske tensider slik som Tridon (polyoksyetyleneter - Tridon er et handelsnavn for Union Carbide Ltd.).

Overflatemodifiserende polymerer kan også velges fra gruppen bestående av protein og polysakkarider, både naturlige og syntetiske, og derivater av slike, f.eks. som konjugater med polyetylenglykol PEG.

Betegnelsen protein har til hensikt å innlemme peptider, polypeptider, glykoproteiner, metalloproteiner, lipoproteiner og underenheter eller fragmenter av samme. Proteinholdige materialer omfatter albumin, gelatin, kollagen, glykoproteiner og deres derivater med for eksempel polyetylenglykol. Framgangsmåter for framstilling av konjugater av PEG og protein er beskrevet av Nucci et al i "Advances in Drig Delivery Reviews", é 113-151

(1991).

Betegnelsen polysakkarider omfatter polymerer av aminosukkere.

Eksempler på polysakkarider som er nyttige som overflatemodifiserende middel er dekstran, xanthan, kitosan, kitosanlaktat, kitosanglutamat, pektin, dekstrin, maltodekstrin, hyaluronsyre, cellulose, stivelse, hydroketylstivelse, pullulan, inulin, alginater, heparin og heparin-liknende syntetiske polymerer og deres respektive derivater. Konjugater av PEG og polysakkarider er beskrevet av for eksempel Duva] et al i "Carbohydrate Polymere", 15 233-242 (1991).

Overflatemodifikatoren kan være en blanding av to eller flere av polymertypene angitt foran.

Lamellene kan være tilpasset injeksjon enten intramuskulært, intravenøst, subkutant, intraarterielt eller intrapeirtonealt. De vil generelt være sterile og pyrogenfrie. Lamellene kan være tilpasset administrering til det dermale eller epidermale lag av huden ved injeksjon eller nålefritt injeksjonssystem. Lamellene kan også være tilpasset administrering til slimhinner slik som nesen, fordøyelseskanalen, kolon, vagina eller rektum.

Lamellpartiklene ifølge oppfinnelsen kan formuleres i henhold til i og for seg kjente metoder.

Formuleringene eller blandingene kan med fordel presenteres i enhetsdose-form og kan framstilles med enhver metode kjent innen farmasi. Slike metoder omfatter trinnet med å bringe de lamellære partiklene med adsorpsjonsavsatt aktivt middel i forbindelse med bæreren som utgjør en eller flere ledsagende bestanddeler. Generelt lages blandingene ved å bringe de lamellære partiklene i kontakt på en homogen og intim måte med væskebærere eller finfordelte faste bærere eller begge, og deretter om nødvendig forme produktet.

Blandinger som er egnet til parenteral administrering omfatter vandige og ikke-vandige sterile injeksjonsløsninger som kan inneholde antioksidanter, buffere, bakteriostater og substanser for oppløsning som gjør blandingen isoton med blodet hos den tiltenkte mottaker; og vandige og ikke-vandige sterile suspensjoner som kan inneholde suspenderende midler og fortykningsmidler. Blandingene kan presenteres i en enkeltdose-beholder eller multippeldose-beholder, for eksempel forseglete ampuller og flasker, og kan lagres i frysetørket (lyofilisert) tilstand som kun krever tilsats av den sterile væskebærer, for eksempel vann for injeksjon, umiddelbart før bruk.

Ekstemporerte injeksjonsløsninger og suspensjoner kan lages av sterilt pulver, granulat og tabletter av typen beskrevet foran.

Foretrukne enhetsdose-formuleringer er de som inneholder en daglig dose eller enhet, daglig del-dose eller en passende fraksjon av samme, av en aktiv bestanddel.

Det bør være klart at i tillegg til bestanddelene nevnt spesielt foran, kan formuleringene ifølge oppfinnelsen omfatte andre midler som er konvensjonelle i faget med hensyn til den aktuelle formulering.

Mengden av den lamellære partikkelblanding ifølge oppfinnelsen som skal administreres til en pasient kan bestemmes i forhold til mengden av aktiv bestanddel som skal administreres og til mengden av det aktive middel adsorbert på partikkelen og på hvilken måte det aktive middel blir tilgjengelig for pasienten etter administrering av blandingen.

Mengden av blandingen administrert vil med fordel være en som inneholder 1-1000% av den normale mengde aktivt middel administrert til pasienten når administrert på en konvensjonell måte. Mengden inneholder fortrinnsvis mellom 10% og 500% av den normale mengde av det aktive middel, helst i området 20-80%.

For nasal administrering kan det administreres vaksiner som en fin suspensjon ved bruk av en sprayanordning eller dersom i form av et pulver ved bruk av en pulveranordning eller neseinnblåsningsanordning. Slike innretninger er velkjente for fagmannen. Formuleringer/blandinger for fordøyelseskanalen kan administreres som suspensjoner eller formulert som tabletter og kapsler eller i pressete eller ekstruderte pellets.

For overflateadsorberte antigener som er følsomme overfor syrebetingelsene i magen, kan tilførselssystemet beskyttes med en enterisk polymer som kjent for fagmannen innenfor utforming av slike blandinger. Den enteriske polymer kan brukes til å belegge doserings-formen. Vaginale systemer egnet for tildeling omfatter geler og vaginale stikkpiller. Rektalt administrerte vaksiner kan tildeles som klyster eller innlemmes i stikkpiller.

Oppfinnelsen anviser også en framgangsmåte for framstilling av en blanding ifølge krav 1-12 omfattende:

a) løse polymeren i et løsningsmiddel,

b) røre polymerløsningen voldsomt og tilsette en substans som ikke er løsningsmiddel for

polymeren,

c) inndampe løsningsmidlet fra blandingen i trinn b) og

d) blande et aktivt middel med partiklene dannet på denne måten.

Det er funnet at ved å bruke krystalliserbare polymerer, vil utfellingsmetoden beskrevet

foran danne lamellære partikler, i motsetning til de tidligere kjente sfæriske partiklene dannet ved bruk av amorfe polymerer.

Løsningsmidlet som anvendes, som er et "dårlig løsningsmiddel" for den biodegraderbare polymer, er fortrinnsvis aceton, etylacetat, xyien eller dioksan, selv om andre egnete løsningsmidler kan anvendes. Varme kan være påkrevet for å løse opp polymeren i løsningsmidlet. Nevnte substans som ikke er løsningsmiddel er fortrinnsvis vann, metanol eller etanol.

Med "dårlig" løsningsmiddel menes her et løsningsmiddel der polymeren har en lav eller neglisjerbar løselighet slik at polymeren bli komme ut av løsning som et (delvis) krystallint materiale (fellingsprosess). Løsningsmidlene og ikke-løsningsmidlet for polymerer kan finnes i vanlig litteratur (f.eks. se Fuchs, i "Polymer Handbook", 3. utg.) og Deasy, "Micro-encapsulation and Related Drug Processes", Marcel Dekker Inc., NY (1984).

Polymerens evne til å løses opp i et løsningsmiddel kan estimeres ved bruk av det kohesive energidensitets-konseptet (CED) og relaterte løselighetsparameter-verdier som diskutert av Deasy og som finnes i detalj i artikkelen av Grulke i Polymer Handbook.

Følgelig vil en fagmann være i stand til å velge et "dårlig" løsningsmiddel for å gi den påkrevete utfelling av det lamellære materialet.

De lamellære partiklene kan også framstilles ved krystallisasjonsmetoden der polymeren løses opp i løsningsmidlet som tidligere, kjøles og hensettes for krystallisasjon. Partiklene kan deretter høstes ved filtrering. Partiklene dannet på denne måten blandes deretter sammen med det aktive middel for å danne en blanding ifølge krav 1-12.

Det er funnet at de lamellære partiklene ifølge oppfinnelsen gir en vesentlig økt adsorpsjon av aktive midler sammenliknet med kjente sfæriske partikler formet av amorfe polymerer. Adsorpsjonen av aktive midler på lamellære partikler unngår dessuten ulempene forbundet med kjente mikroinnkapslete vaksiner basert på PLG. Dette inkludert unngåelse av eksponering overfor høye skjærkrefter og løsningsmidler og syredegraderingsprodukter produsert av PLG som kan denaturere visse antigener. Dessuten har de lamellære partiklene vist seg å ha langt større retensjon av antigenet over lengre tidsrom ir vit ro. En antar at den irregulære form av partiklene kan tjene som en immunomodulator og stimulere immunsystemet.

Når brukt i dyrestudier for å måle immunresponsen på absorbert influensavirus, resulterte de lamellære partiklene ifølge oppfinnelsen i at 60% av eksponert mus ble beskyttet.

I det etterfølgende er det beskrevet foretrukne utførelser i detalj ved hjelp av eksempler og med henvisning til ledsagende figurer, der

figur 1 er et elektronmikroskop-fotografi av kjente sfæriske partikler av poly(DL-laktid-ko-glycolid) (PLG),

figur 2 er et elektronmikroskop-fotografi av L.PLA lamellære partikler i henhold til en foretrukket utførelse av oppfinnelsen, og

figur 3 og 4 er et elektronmikroskop-fotografi av de lamellære systemer uten (figur 3) og med (figur 4) adsorbert influensavirus.

Eksempel 1 Framstilling av lamellære substratpartiMer ved felling

Vann (10 ml) ble injisert i 5 ml 2% (w/w) PLA-løsning i aceton som ble omrørt voldsomt med magnetrører. Molvekten av PLA var 6600.

Blandingen ble deretter omrørt forsiktig over natta med en magnetrører for å inndampe acetonløsningsmidlet.

De resulterende lamellære PLA-partiklene kan høstes fra suspensjonen ved filtrering, eller suspensjonen kan lagres ved 5°C.

Eksempel 2 Framstilling av lamellært substrat vedpolymer- krystallisasjon fra løsning under statiske betingelser

Framgangsmåten har også blitt brukt til å framstille L.PLA-substrat fra 0.5% (w/v) acetonløsning av en 100000 Mw polymer som følger:

a) L.PLA-polymeren ble oppløst i aceton ved varming til ca. 50°C

b) løsningen fikk stå ved romtemperatur i 1 time hvorved krystallisasjon fant sted ved

kjøling.

De resulterende lamellære partiklene kan høstes ved filtrering.

Eksempel 3 Antigen- adsorpsjon

Nøyaktig inn veide partikler (25-3 Og) framstilt ifølge eksempel 1 ble inkubert i en vandig løsning av et antigen over natta ved romtemperatur med omveltende risting (Voss-blander). Mikropartiklene ble sentrifugert og vasket en gang med destillert vann. Supernatantene ble samlet og analysert for antigen-innhold ved bruk av BCA proteinanalyse. En kalibrerings-kurve ble laget fra en fortynningsserie av de respektive antigener og mengden av antigen adsorbert på de lamellære substratene ble oppnådd ved subtraksjon. De adsorberte mengder av antigenet, hhv. influensavirus, Tetanus toxoid og ovalbumin er presentert i tabell 1.

Eksempel 4 In vitro antigen- frigjøring fra PLA lamellære substratpartiMer

PLA lamellære partikler (25-30g) med adsorbert antigen laget ifølge eksempel 3 ble inkubert i 2 ml PBS som inneholdt 0.02% natriumazid ved 37°C. Frigjøringsmediet ble separert fra mikropartiklene etter 1 dag og friskt medium ble tilsatt til prøverørene. Denne prosessen ble gjentatt med 3 dagers mellomrom opp til 8 uker. Frigjøringsmediet ble analysert for antigeninnhold ved bruk av en BCA proteinanalyse og den kumulative fri-gjorte mengde av antigen (%) ble beregnet. De tilbakeholdte mengder av influensavirus, Tetanus toxoid og ovalbumin er presentert i tabell 1.

Eksempel 5 Immunogenitet av vaksiner laget ved adsorpsjon av in fluensavirus på PLA

lamellære substrater

A/Shanghai/24/90 influensavirus ble adsorbert på PLA lamellære substratpartikler laget i henhold til eksempel 1 og 3, og på kjente 75:25 PLG-mikrosfærer. Det adsorberte virus fikk stabiliseres i 14 uker før igangsetting av immunogenitets-studier. Hemagglutinin (HA)-innholdet i vaksinene ble beregnet ved å estimere mengden av antigener som forble festet til mikropartiklene. Vaksineformuleringene ble administrert subkutant til grupper av 20 Bale/ C mus og blodprøver ble tatt ved dag 28. Alt serum ble testet for antistoffer mot virus ved hemagglutinin-inhibering (HI).

Vaksinetest-sammensetningene var som følger:

1. Vandig inaktivert virus 15 jig HA/0.1 ml

2. Inaktivert virus, adsorbert på PLG-mikrosfærer, 15 ug HA/0.1 ml

3. Inaktivert virus, adsorbert på PLA lamellært additiv, 15 ug HA/0.1 ml

HI-titer-resultatene er vist i tabell 2. Disse resultatene viser at det ble funnet en 10 ganger så stor forbedring i antistoff-respons for vaksiner laget med PLA lamellære partikler ifølge oppfinnelsen sammenliknet med løselige virus. I tillegg var responsen mot virus adsorbert på PLA lamellære partikler nesten fem ganger det som ble oppnådd ved bruk av kjente PLG-mikrosfærer som et substrat for adsorpsjon av influensavirus.

Statistisk analyse:

Studenters t-test: 1. Sammenlikning av gruppe 1 med gruppe 21 = 5.55, signifikant ved P < 0.05 2. Sammenlikning av gruppe 1 med gruppe 3, t = 12.0, signifikant ved P < 0.05 3. Sammenlikning av gruppe 2 med gruppe 3, t = 7.60, signifikant ved P < 0.05

Eksempel 6 Termisk analyse av lamellære substrater

Termiske overganger ble registrert for PLA-lamellære substrater og 75:25 PLG mikrosfæriske substrater ved bruk av Differential Scanning Calorimetry. Ved varming ved 20C°/min fra 20°C til 200°C ble det observert en enkelt smeltetopp ved 130°C for lameller framstilt ved bruk av polymer med lav molvekt (molvekt 6600). Prøven ble deretter kjølt ned til 20°C ved en hastighet på 80°C/min og varmet på nytt umiddelbart ved 40°C/min. En rekrystalliserings eksoterm topp ble observert ved 87°C og en smeltetopp ved 120°C.

PLA-lamellære substrater laget ved bruk av en polymer med høyere molvekt (molvekt 90600) ga opphav til en smeltetopp ved 182°C ved vanning. Etter nedkjøling og ny oppvarming ble det observert en rekrystallisasjonstopp ved 117°C etterfulgt av en smeltetopp ved 175°C.

Den lave smeltetemperatur forbundet med bruken av lavmolekylært PLA-materiale gir indikasjon på små krystalittstørrelser og/eller en høyere grad av strukturell irregularitet i krystallittene som utgjør lamellene.

Mikrosfærene av 75:25 PLG oppviste en glassovergang ved 60°C ved oppvarming. Etter nedkjøling og ny oppvarming skiftet glassovergangstemperaturen til en noe lavere verdi på 57°C. Den amorfe natur ved 75:25 PLG-kopolymeren fører til et fravær av smelte- eller rekrystallisasjons-topper ved termisk analyse.

Eksempel 7 Immunrespons på oralt administrerte lameller med adsorbert influensavirus.

To doser influensavirus (A/Shanghai/24/90,15 ug HA/0.1 ml dose) adsorbert på lamellære partikler ble administrert oralt til mus (20/gruppe) i et intervall på 56 dager. Musene ble behandlet oralt med et oralt antacid (Aludrax), 2 timer før den første vaksine-dosen og med en H2-antagonist (Tagamet) parenteralt 2 timer før stigningen. Immun-responsen ble sammenliknet med den som oppsto i mus som mottok hhv. to doser influensavirus adsorbert på 75:25 PLG-mikrosfærer og vandig vaksine. Mikropartikler uten influensavirus ble også administrert som en kontroll.

Det ble tatt blodprøver og nesespyling på dag 28 og 76.

Alle gruppene ble eksponert på dag 80 med nasal/oral administrering av 50 mus smittende dose 50 (MID50) (A/Shanghai 24/90) virus.

Nesespyling ble utført på dag 1-7 etter eksponering og virus ble titrert i MDCK-celler.

Det ble målt svake serum Hl antistoff-responser for alle vaksinerte grupper ved dag 28 og 76 etter vaksineadministrering (tabell 3). Musene som mottok den adsorberte lamell-vaksinen ble vesentlig bedre beskyttet mot eksponert virus enn de som mottok vandig vaksine eller virus adsorbert på PLG-mikrosfærer.

Eksempel 8 Kumulativ rfigjøring av influensavirus fra PLA- lameller

Influensavirus ble adsorbert på PLA-lameller (Mw 6600) ved bruk av framgangsmåten beskrevet i eksempel 3. Mengden av virus i inkubasjonsmediet ble justert for slik å oppnå lameller med virusandeler på henholdsvis 19% w/w og 13.1% w/w. Influensavirus ble også adsorbert på lameller laget ved bruk av poly(L-laktid)-poIymer med Mw 90600. En in vitro-frigjøringsstudie ble utført som beskrevet i eksempel 4. Kumulative fhgjøringsforløp registrert for hver prøve er vist i tabell 4 for sammenlikning.

Mengden av tilbakeholdt influensavirus in vitro kan reguleres ved å justere mengden av virus adsorbert på lamellene ved å variere polymerens vektkarakteristikk.

Eksempel 9 Kumulativ rfigjøring av tetanus toxoidfra PLA- lameller

Tetanus toxoid ble absorbert på PLA-lameller (molvekt 90600) ved bruk av framgangsmåten beskrevet i eksempel 3 for å gi en adsorbert ladning på 7.1% (w/w). En in vtfrø-fiigjøringsstudie ble utført som beskrevet i eksempel 4. Kumulative fhgjøringsforløp er vist i tabell 5.

Litteraturhenvisninger:

Alpar H.O., Almeida AJ. Identification of some of the physico-chemical characteristics of microspheres which infiuence the induction of the immune response following mucosal delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm, 40,198-202 (1994).

Cohen S., Bernstein C, Hewes C, Chow M., Langer R. The pharmacokinetics of and humoral responses to antigen deliveredby microencapsulated liposomes. Proe. Nati. Acad. Sei. USa 88,10440-10444 (1991).

Eldridge J.H., Staas K., Meulbroek J.A., McGhee R., Tice T.R., Gilley R.M. Biodegradable microspheres as a vaccine delivery system. Mol. Immunol., 28,287-294 (1991).

Espartza I., Kissel T. Parameters affecting the immunogenicity of microencapsulated tetanus toxoid. Vaccine, 10,714-720 (1992).

Gray D., Skarvall H. B-cell memory is short lived in the absence of antigen. Nature, 336,70

(1988).

Khan M.Z.I., Optebeeck J.P., Tucker I.G. Immunopotentiation and delivery systems for antigens for single-step immunisation. Recent trends and progress. Pharm. Res., 11,2-11

(1994).

Kreuter J., Liehl E., Herg U., Soliva M., Speiser P.P. Infiuence of hydrophobicity on the adjuvant effect of particulate polymeric adj uvants. Vaccine, 6,253-256 (1988).

0'Hagan D.T., Dahman D., McGee P., Jeffery H., Davies M.C., Williams P., Davis S.S., Challacombe S.J. Biodegradable microparticles as controlled release antigen delivery systems. Immunology, 73,239-242 (1991).

0'Hagan D.T., Jeffery H., Davis S.S. Long term antibody repsonses in mice following subcutaneous immunisation with ovalbumin entrapped in biodegradable microparticles. Vaccine, 11,965-969(1993).

Park T.G., Lu W.L., Crotts G. Importance of in vitro experimental conditions on protein release kinetics, stability and polymer degradation in protein encapsulated polyfDL lactic acid co-glycolic acid) microspheres. J. Controlled Rel., 33,211-222 (1995).

Taghuvanshi R.S., Singh M., Talwas G.P. Biodegradable delivery system for single step immunisation with tetanus toxoid, Int. J. Pharm., 93, R1-R5 (1993).

Stieneker F., Kersten G., van Bloois L., Crommelin D.J.A., Hem S.L., Lower J., Kreuter J. Comparison of 24 different adjuvants for inactivated HTV-2 split whole virus as antigen in mice. Induction of titres of binding antibodies and toxicity of the formulations. Vaccine, 13, 45-53 (1995).

Claims (15)

1. Blanding for tildeling av et aktivt middel, karakterisert ved at den omfatter et flertall lamellære partikler omfattende en biodegraderbar polymer som er i det minste delvis krystallin, og et aktivt middel adsorbert på i det minste de fleste partiklene.

2. Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at den biodegraderbare polymer er i det minste 5%, fortrinnsvis minst 30% krystallin med hensyn til vekt

3. Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at den biodegraderbare polymer omfatter en blanding av to eller flere biodegraderbare polymerer som er i det minste delvis krystalline.

4. Blanding ifølge et av kravene 1 til 3, karakterisert ved at polymeren er poly(L-laktid).

5. Blanding ifølge et av kravene I til 4, karakterisert ved at polymeren er en kopolymer av poly(L-laktid).

6. Blanding ifølge et av kravene 1 til 5, karakterisert ved at det aktive middel er DNA, et antigen, et allergen eller en vaksine.

7. Blanding ifølge krav 6, karakterisert ved at antigenet er Tetanus toxoid eller influensavirus.

8. Blanding ifølge et av kravene 1 til 5, karakterisert ved at det aktive middel er et peptid, polypeptid eller et protein.

9. Blanding ifølge krav 8, karakterisert ved at det aktive middel er DNA, insulin, LHRH, en vekstfaktor, et veksthormon, et interferon, en interleukin koloni-sitmulerende faktor, somatostatin eller analoge av disse.

10. Blanding ifølge krav 8 eller 9, karakterisert ved at partiklene og det adsorberte aktive middel er belagt med en polymer.

11. Blanding ifølge et av kravene 1 til 10, karakterisert ved at de lamellære partiklene omfatter et flertall av sammenhopede lamellære partikler.

12. Blanding ifølge et av kravene 1 til 11, karakterisert ved at de lamellære partiklene har en tykkelse fra 50 nm til 80 um.

13. Framgangsmåte for framstilling av en blanding ifølge et av kravene 1-12, karakterisert ved å: a) løse polymeren i et løsningsmiddel, b) røre polymerløsningen voldsomt og tilsette en substans som ikke er løsningsmiddel for polymeren, c) inndampe løsningsmidlet fra blandingen i trinn b) og d) blande et aktivt middel med partiklene dannet på denne måten eller framstille lamellære partikler med en krystallisasjonsmetode der polymeren løses opp i løsningsmidlet som tidligere, kjøles ned og hensettes til krystallisasjon og blandes med et aktivt middel med partiklene dannet på denne måten.

14. Framgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at det som løsningsmiddel anvendes aceton, etylacetat, xylen eller dioksan.

15. Framgangsmåte ifølge krav 13 eller 14, karakterisert ved at det som substans som ikke er løsningsmiddel for polymeren anvendes vann, metanol eller etanol.