DE69529980T2

DE69529980T2 - Carotenoidwirkstoffe zur hemmung der umwandlung von epithelzellen in melanome

Info

Publication number: DE69529980T2
Application number: DE69529980T
Authority: DE
Inventors: Lance Elliott Schlipalius; Julie A. Buckmeier; jr. Frank L. Meyskens
Original assignee: Cognis Australia Pty Ltd
Current assignee: Cognis Australia Pty Ltd
Priority date: 1994-04-08
Filing date: 1995-04-10
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2015-04-11
Also published as: EP0754035A4; DE69529980D1; EP0754035B1; WO1995027483A1; EP0754035A1; CA2187367A1; ATE234612T1; JPH09511508A; ES2194904T3; JP3795075B2; AUPM493194A0

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Carotinoid-Mittels zur Hemmung der Umwandlung von Epithelzellen in Melanome. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung eines Carotinoid-Mittels zur Hemmung der Umwandlung von Melanocyten in Melanome.
Hintergrund der Erfindung
Obwohl sich die folgende Beschreibung insbesondere auf Melanocyten und Melanome bezieht, ist sich der Fachmann darüber im klaren, dass ähnliche Kommentare auch für andere Typen von Epithelzellen gelten.
Melanome gehen auf eine Veränderung bei normalen Hautzellen, den Melanocyten, zurück, die das braune Pigment Melanin erzeugen, das wir als Bräune erkennen. Muttermale und Sommersprossen ergeben sich aus Bereichen der Haut mit vielen Melanocyten.
Melanome werden im Allgemeinen durch Einwirkung von Sonnenlicht auf die Haut verursacht. Personen mit heller Hautfarbe haben das größte Risiko, insbesondere solche, die Muttermale entwickeln.
Der Einfluss von Licht auf Melanocyten ist ein Weg, durch den sie so verändert werden können, dass sie anders wachsen und sich teilen und möglicherweise ein Melanom verursachen. Die Melanome können bösartig sein und sich auf andere Teile des Körpers ausbreiten. Melanome, die sich nicht ausbreiten, werden gutartige Melanome genannt.
Obwohl sich Melanome normalerweise auf der exponierten Haut bilden, können sie auch an Stellen wie dem Mund beginnen. Melanome wachsen und müssen chirurgisch entfernt werden, bevor sie sich ausbreiten und andere Teile des Körpers befallen. Wenn sich die Melanome auf die inneren Organe ausbreiten, ist die Entfernung und Behandlung schwieriger, und es müssen Chemotherapie und Radiotherapie eingesetzt werden. Aus diesem Grund gilt: Wenn die Umwandlung von Melanocyten in Melanome gehemmt werden kann, können die mit der Behandlung von Melanomen verbundenen Probleme ebenfalls reduziert werden.
Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass Carotinoide und insbesondere β-Carotin die Gefahr von Brust-, Lungen-, Dickdarm-, Prostata- und Gebärmutterhalskrebs, Herzkrankheiten und Schlaganfall reduzieren und die Makuladegeneration verzögern können. In dieser Hinsicht besagt eine Hypothese, dass β-Carotin bei Säugern in Vitamin A und Vitamin-A-Analoga oder Retinoide umgewandelt wird (siehe R. C. Moon, Comparative aspects of carotenoids and retinoids as chemopreventive agents for cancer, J. Nutr. 119: 127–134, 1989). Es sind diese Provitamin-A-Aktivität und die Fähigkeit, oxidative Schäden zu verhindern, weswegen Carotinoide und insbesondere β-Carotin als Verbindung für chemopräventive Studien interessant sind. Zum Beispiel werden Antioxidantien unter anderem dazu verwendet, Radikale abzulöschen, die Nebenprodukte des normalen Stoffwechsels in Zellen sind.
β-Carotin wird auch bei der Behandlung von erythropoetischer Protoporphyrie (EPP) verwendet. EPP ist eine genetische Krankheit, die einen Defekt im Stoffwechsel von Porphyrinverbindungen verursacht. Er führt zu einer schnellen Blasenbildung der Haut bei Einwirkung von Sonnenlicht.
Das US-Patent Nr. 4,680,314 betrifft die Herstellung von carotinhaltigen Zusammensetzungen durch Extraktion von Algen. Die Verwendung solcher Zusammensetzungen in der Ernährung und als Präventivum für bestimmte Arten von Krebs wird postuliert.
Obwohl es die Hypothese der Wirksamkeit von Carotinoiden hinsichtlich einer Reduktion des Risikos bestimmter Fälle von Krebs gibt, habe keine Untersuchungen die mögliche hemmende Wirkung von Carotinoiden bei der Umwandlung von Melanocyten in Melanome nachgewiesen.
Aus diesem Grund wurden Untersuchungen vorgenommen, um die Wirksamkeit von Carotinoiden im Sinne einer Hemmung oder Reduktion der Umwandlung von Melanocyten in Melanome zu bestimmen. Als Teil dieser Untersuchung war es notwendig, die Schwierigkeiten bei der Verwendung von Carotinoiden in Anwendungen auf den Menschen wegen der Natur und der chemischen Eigenschaften von Carotinoiden in Betracht zu ziehen.
Carotinoide sind lipophil und daher in Wasser nicht in geeigneten Mengen löslich. Vermutlich werden sie im Blutstrom in Verbindung mit Lipoproteinen geringer Dichte transportiert.
Bisher haben mehrere in-vitro-Studien stattgefunden, um die Wirkung von β-Carotin auf normale und transformierte Zelltypen zu bestimmen, wobei Lösungsmittel verwendet wurden, um das β-Carotin in Lösung zu bringen, wie Tetrahydrofuran, Butanol, Chloroform, Hexan, Dimethylsulfoxid, Ethanol, oder in einer Liposomenmicelle. Frühere Liposomenpräparate haben Toxizität in Zelllinienkulturen gezeigt und waren in der Anwendung beschränkt (siehe J. S. Bertram, A. Pung, M. L. Churley et al.: Diverse carotenoids protect against chemically induced neoplastic transformation, Carcinogenesis 12: 671–678, 1991; M. B. Hazuka, J. Prasad-Edwards, F. Newman et al.; Beta-carotene induces morphological differentiation and decreases adenylate cyclase activity in melanocyte cells in culture, J. Am. Coll. Nutr. 9: 143–149, 1990; T. D. Schultz, B. P. Chew, W. R. Seaman et al.: Inhibitory effect of conjugated dienoic derivatives of linoleic acid and beta-carotene on the in vitro growth of human cancer cells, Canc. Letters 63: 125–133, 1992; J. L. Schwartz, G. Chklar: The selective cytotoxic effect of carotenoids and α-tocopherol on human cancer cells in vitro, J. Oral Maxillofac. Surg. 50: 367–373, 1992; J. L. Schwartz, J. Tanaka, V. Khandekar et al.: Beta-Carotene and/or Vitamin E as modulators of alkylating agents in SCC-25 human squamous carcinoma cells, Canc. Chemother. Pharmacol. 29: 207–213, 1992; L. -X. Zhang, R. V. Cooney, J. S. Bertram: Carotenoids enhance gap junctional communication and inhibit lipid peroxidation in C3H/10T1/2 cells: relationship to their cancer chemopreventive action, Carcinogenesis 12: 2109–2114, 1991; and L. -X. Zhang, R. V. Cooney, J. S. Bertam: Carotenoids up-regulate connexin 43 gene expression independent of their provitamin A or antioxidant properties, Canc. Res 52: 5707–5712, 1992). Es hat sich gezeigt, dass diese Lösungsmittel eine toxische Wirkung haben, die dosisabhängig ist. Diese Lösungsmittel sind außerdem für die Zwecke von intravenösen oder injizierbaren Präparaten mit menschlichem Blut oder Lymphe unverträglich.
Bei der Verabreichung von Carotinoiden muss also darauf geachtet werden, geeignete Träger zu verwenden. Dementsprechend führten wir in-vitro-Studien durch, um die Wirksamkeit von Carotinoiden hinsichtlich einer Hemmung der Umwandlung von Epithelzellen in Tumoren und insbesondere der Umwandlung von Melanocyten in Melanome zu bestimmen.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Endung wird die Verwendung einer Zusammensetzung, die eine wasserunlösliche Carotinoidkomponente und einen nichttoxischen-Träger dafür umfasst, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von normalen Hautzellen, so dass ihre Umwandlung zu Melanomen gehemmt wird, angegeben, wobei die Zusammensetzung eine effektive Menge von 0,1 bis 10 Gew.-% des wasserlöslichen Carotinoids umfasst.
Besonders bevorzugt ist die Hautzelle ein Melanocyt. In einer ganz besonders bevorzugten Form der Erfindung ist die Hautzelle eine humane Zelle, und in einer besonders bevorzugten Form der Erfindung ist sie ein humaner Melanocyt.
Vorzugsweise umfasst die wasserunlösliche Carotinoidkomponente β-Carotin. In einer ganz besonders bevorzugten Form der Erfindung umfasst die wasserunlös liche Carotinoidkomponente 2 bis 50 Gew.-% β-Carotin. Es ist weiterhin bevorzugt, dass die wasserunlösliche Carotinoidkomponente 20 bis 40 Gew.-% β-Carotin umfasst. Ganz besonders bevorzugt umfasst die wasserunlösliche Carotinoidkomponente 30 Gew.-% β-Carotin.
Vorzugsweise umfasst das Trägermedium ein Suspendiermittel, das aus der Gruppe ausgewählt ist,.die Fettsäuren, Triglyceridlipide, nichtverseifbare Lipidpräparate, lösliche Kohlenwasserstoffe und Kombinationen davon umfasst.
Vorzugsweise sind die Triglyceridlipide aus der Gruppe ausgewählt, die aus pflanzlichen Quellen stammende Fette und/oder Öle umfasst. Die Fette und/oder Öle können aus pflanzlichen Quellen (in diesem Fall werden besonders bevorzugt Samenöle, wie Baumwollsaatöl, Sonnenblumenöl oder Kombinationen davon verwendet) oder aus tierischen Quellen (wie Fleisch und Fisch) stammen. Samenöle sind besonders bevorzugt, und Sojaöl ist ein für die Verwendung im Trägermedium besonders bevorzugtes Öl.
Die wasserunlösliche Carotinoidkomponente bildet 0,1 bis 10 Gew.-% der Zusammensetzung. Besonders bevorzugt bildet die wasserunlösliche Carotinoidkomponente 1 bis 5 Gew.-% der Zusammensetzung.
Das nichttoxische Trägermedium umfasst vorzugsweise auch einen Emulgator. Vorzugsweise ist der Emulgator aus der Gruppe ausgewählt, die Tween^®, Glycerinfettsäureester und acetylierte Ester von Fettsäuren umfasst. Glycerinmonooleat ist ein besonders bevorzugter Emulgator.
Vorzugsweise umfasst das nichttoxische Trägermedium auch ein wasserlösliches., Dispergiermittel. Besonders bevorzugt ist das wasserlösliche Dispergiermittel ein Zucker oder ein Polyol. Besonders bevorzugt ist das wasserlösliche Dispergier- mittel aus der Gruppe ausgewählt, die Sorbit und Glycerin umfasst.
In allen Formen der Erfindung beträgt die effektive Menge der Carotinoide, die mit den Melanocyten in Kontakt kommen, vorzugsweise 0,1 bis 10,0 Mikro gramm/ml und besonders bevorzugt 0,3 bis 3,0 Mikrogramm/ml. Diese Konzentrationen werden durch Verdünnung mit geeigneten Verdünnungsmitteln erreicht. Besonders bevorzugt wird die Verdünnungslösung aus Medien, die für das Wachstum der Zellen geeignet sind, wässrigen Puffern, normalen intravenösen Präparaten (einschließlich isotonischer Kochsalzlösung oder 5%iger Dextroselösung) und Blutserum sowie Kombinationen der obigen ausgewählt.
Der hier verwendete Ausdruck "Gemisch" soll verschiedene physikalische Formen einschließlich Emulsionen, Lösungen und Kristallsuspensionen umfassen.
Beispiele
Die folgenden Beispiele demonstrieren die Wirksamkeit von Carotinoidzusammensetzungen bei der Behandlung von Melanocyten und die relative Ungiftigkeit dieser Zusammensetzungen.
Die folgenden Beispiele werden nun unter Bezugnahme auf die Begleitzeichnungen beschrieben:
1 ist eine Graphik, die die Wirkung von β-Carotin auf die DNA-Synthese bei normalen humanen Melanocyten zeigt. Um es zusammenzufassen: Während die DNA-Synthese bei der höchsten β-Carotin-Dosis weitgehend gehemmt war, hatten die niedrigeren Dosen wenig oder keine Wirkung. Die 1,0-μg/ml-Dosis wurde als Vorbehandlungsdosis für die UV-Experimente gewählt, da sie die höchste β-Carotin-Konzentration bot, die mit einer minimalen Wirkung auf die DNA-Synthese erreichbar ist. β-Carotin wurde 24 Stunden lang mit den Melanocyten inkubiert. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von 6 Näpfen ± prozentualer Standardfehler im Vergleich zur Kontrolle.
2 ist eine Graphik, die die Lebensfähigkeit normaler humaner Melanocyten nach UV-B-Bestrahlung mit und ohne β-Carotin zeigt. Um es zusammenzufassen: Unmittelbar nach 500 mJ/cm² UV-B (0,05 h) nahm die Lebensfähigkeit der Zellen in Anwesenheit vonβ-Carotin im Vergleich zu UV-B allein um fast 20% zu.
Diese Wirkung blieb während der Dauer des Zeitverlaufs bestehen. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von 3 Näpfen ± prozentualer Standardfehler im Vergleich zu den Kontrollen.
3 sind Graphiken, die die Northern-Analyse von Melanocyten zeigen, die UV-B-Bestrahlung mit und ohne β-Carotin ausgesetzt wurden. Um es zusammenzufassen: Die größte Induktion von c-jun durch UV-B erfolgte 24 Stunden nach einer Bestrahlung mit 500 mJ/cm² (36,2fach über Grundniveau). Die maximale Induktion von c-fos erfolgte 2 Stunden nach der Bestrahlung mit einem Expressionsniveau von 57fach über dem Grundwert. Die Induktion von c- fos durch UV-B wurde durch β-Carotin im Wesentlichen blockiert. Die Expression von c-jun wurde durch β-Carotin vier Stunden nach der Bestrahlung auf das ll,1fache erhöht, während die Induktion durch UV-B nach 24 Stunden vollständig blockiert war. Das Grundexpressionsniveau dieser Gene ohne β-Carotin oder UV-B wurde von allen gezeigten RNA-Niveaus subtrahiert. Die Blots wurden einer Korrektur aufgrund der Beladung durch 185 unterzogen.
4 ist eine Graphik, die die DNA-Synthese in normalen menschlichen Melanocyten mit und ohne β-Carotin zeigt. Um es zusammenzufassen: Die Vorbehandlung mit β-Carotin steigerte die DNA-Synthese 24 Stunden nach 400 mJ/cm² UV-B. Diese Wirkung war 4 Stunden nach der Bestrahlung nicht zu sehen. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von 6 Näpfen ± prozentualer Standardfehler im Vergleich zu den Kontrollen.
5 ist eine Graphik, die die spektrale Verteilung für die UVP-Birnen zeigt, die in der bei den Experimenten verwendeten Stratalinker-Crosslinker-Apparatur verwendet wurden.
6 zeigt vier Histogramme, die die Ergebnisse von Experimenten zeigen, die die Wirkungen einer Behandlung mit β-Carotin auf Melanocyten zeigt, die UV-B-Bestrahlung ausgesetzt wurden. Um es zusammenzufassen: Melanocyten wurden 24 Stunden lang mit oder ohne β-Carotin (1 μg/ml) mit den passenden Kontrollen behandelt. Dann wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden mit 100 oder 500 mJ/cm² UV-B bestrahlt. Dann wurde frisches Medium hinzugefügt, und die Zellen wurden weitere 1, 4 bzw. 24 Stunden inkubiert, und die Gesamt-RNA wurde isoliert. Dieses Histogramm ist repräsentativ für vier unabhängige Northern-Blots (Beladung korrigiert) von vier normalen Kaukasischen Melanocytenlinien.
7 zeigt die Ergebnisse einer Behandlung mit β-Carotin auf die DNA-Bindungsaktivität von Zellen, die 100 mJ/cm² UV-B-Bestrahlung ausgesetzt waren.
8 zeigt die Ergebnisse einer Behandlung mit β-Carotin auf die DNA-Bindungsaktivität von Zellen, die 500 mJ/cm² UV-B-Bestrahlung ausgesetzt waren. Um es zusammenzufassen: Ein Gel-Mobility-Shift-Assay unter Verwendung einer NF-Kappa-B-Konsensussequenz wurde durchgeführt, um die DNA-Bindungsaktivität von Kernextrakten aus vier normalen Kaukasischen Melanocytenlinien (NCM) zu bestimmen. NCM wurden 24 Stunden lang mit 1,0 μg/ml β-Carotin vorbehandelt und anschließend mit 500 mJ/cm² UV-B bestrahlt und 1, 4 bzw. 24 Stunden nach der Bestrahlung einem Assay unterzogen.
9 zeigt die Wirkungen einer Behandlung von menschlichen Melanocyten, die O-Tetradecanoylphorbol-l3-acetat (TPA), 3-Isobutyl-l-methylxanthin (IBMX) und einer Kombination von TPA und IBMX ausgesetzt waren, auf die Gesamt-RNA-Synthese solcher Melanocyten, die anschließend mit UVB bestrahlt wurden. Um es zusammenzufassen: Melanocyten wurden 24 Stunden lang mit oder ohne TPA (10 ng/ml) oder IBMX (0,1 mM) mit den passenden Kontrollen behandelt. Dann wurde das Medium entfernt, und die Zellen, die mit UV-B bestrahlt wurden, erhielten eine Dosis von 100 mJ/cm². Dann wurde frisches Medium mit oder ohne TPA oder IBMX hinzugefügt, und die Zellen wurden nach. der Bestrahlung 1 Stunde lang inkubiert, und die Gesamt-RNA wurde isoliert. Dieses Histogramm ist repräsentativ für zwei unabhängige Northern-Blots (Beladung korrigiert) von zwei normalen neonatalen Kaukasischen Melanocytenlinien.
10 zeigt einen Überblick über die intrazellulären Mechanismen, die vermutlich für die Reaktion von humanen Melanocyten auf die Einwirkung von ultravioletter Strahlung verantwortlich sind.
Die 1 und 5 beziehen sich auf den "prozentualen Einbau von tritiiertem Thymidin", der ein Maß für die Aktivität der DNA-Synthese ist.
Einzelheiten der in Verbindung mit der Erfindung durchgeführten Experimente sind wie folgt.
Materialien
(a) Zellkulturen
Humane neonatale Vorhäute wurden über Nacht bei 4 °C in 0,25% Trypsin gelegt. Nach dieser Inkubation wurde das Gewebe abgekratzt, um die Melanocyten zu gewinnen. Die Melanocyten wurden im Medium MCDB 151 (Sigma), das 2% fetales Kälberserum, 0,3% Rinderhypophysenextrakt (Clonetics Corp.), 10 Nanogramm/ml TPA, 2 mM CaCl₂, 5 Mikrogramm/ml Insulin und 0,1 mM IBMX (Sigma) enthielt, kultiviert.
(b) Chemikalien
Das β-Carotin wurde aus der Alge Dunaliella salina isoliert und stellte 85–90% der gesamten Carotinoide dar, wobei die Hälfte des Restes aus Oxycarotinoiden (Lutein und Zeaxanthin) und die andere Hälfte aus α-Carotin bestand. γ-Carotin ist normalerweise durch HPLC nicht nachweisbar. Das Sojaöl wurde aus Sojabohnen isoliert. Eine kristalline Suspension von β-Carotin und Sojaöl wurde hergestellt. Die resultierende Phase wurde dann in der beschriebenen Zusammensetzung emulgiert. Dann wurde sie durch Hitze oder Filtration sterilisiert. Vor dem Test an den Zelllinien wurde jede Ampulle der Zusammensetzung in kryogene Ampullen (Costar) aufgeteilt, wobei für jedes Experiment eine frische Ampulle verwendet wurde. Während der gesamten Verfahren wurde β-Carotin ; vor direktem Licht geschützt: Die Einzelheiten der emulgierten ß-Carotin-Zusammensetzung sind wie folgt:

Gew.-%

(I) β-Carotin 2,4%

und

(II) SOY, d. h.:

Sojaöl 6,8%

Glycerylmonooleat 7,2%

Glycerin 66,7%

Wasser 16,9%
Die obige Zusammensetzung kann nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden. Eine kristalline Suspension von β-Carotin in Sojaöl wird erhitzt, und Glycerylmonooleat wird hinzugefügt. Diese Ölphase wird in der Glycerin-Wasser-Phase durch Mischen mit hoher Scherung dispergiert, und anschließend wird bei 60–70 °C homogenisiert. Typischerweise wird ein Homogenisierungsdruck von 55 150 bis 68 940 kPa (8000 bis 10 000 psi) verwendet, doch variiert dieser Druck je nach der verwendeten Maschine. Das resultierende Produkt wird dann durch Verarbeitung in der Hitze sterilisiert. Typischerweise erfolgt die Verarbeitung in der Hitze durch 15 Minuten Autoklavieren bei 121 °C in einer Verpackung zur Entnahme (3-ml-Glasampulle). Gegebenenfalls werden 0,3% Tocopherole als Antioxidantien hinzugefügt, um Toxizität zu überwinden, die sich im Laufe der Zeit entwickeln kann.
(e) Experimentelle Bedingungen
Ultraviolette ("UV") Strahlung kann schwere Schäden an Zellen verursachen, einschließlich genetischer Mutationen, der Förderung von Krebs und anderer nachteiliger Bedingungen. Die potentiell schädlichen Wirkungen von UV-Strahlung für Menschen sind hauptsächlich auf das UVB-Spektrum zurückzuführen (d. h. Strahlung mit einer Wellenlänge zwischen 290 und 320 Nanometer) (siehe: B. A. Gilchrest, N. A. Soler, J. S. Staff und M. C. Mihm Jr.: "The human sunburn reaction: histologic and biochemical studies", J. Am. Acad. Dermatol. 5: 411–422 (1981)). Eine andere Form der UV-Strahlung wird "UVC" genannt. UVC-Strahlung im Sonnenlicht hat typischerweise eine Wellenlänge in der Größenordnung von 254 Nanometer. Sie ist jedoch biologisch nicht so relevant wie UVB-Strahlung, da die UVC-Strahlung im Sonnenlicht durch die Ozonschicht der Erde stark absorbiert wird. Dementsprechend untersuchten wir in der vorliegenden Studie die Wirkungen von UVB-Bestrahlung auf Melanocyten und die Änderungen dieser Wirkungen durch Behandlung dieser Zellen mit Carotinoiden. UVC-Wellenlängen wurden bei den Experimenten blockiert, da die Zellen in Kunststoffgefäßen inkubiert wurden.
UVB-Bestrahlung der Melanocyten wurde mit einem Stratalinker Crosslinker (Stratagene) durchgeführt, der mit fünf UVP-Birnen ausgestattet war, die ein Emissionsmaximum aufweisen, das um 302 nm zentriert ist, gemessen mit einem UVX-31-Radiometer (UVP Inc.). Wellenlängen, die kürzer als 280 nm waren, wurden abgeschnitten, indem man Deckel auf den Gewebekulturschalen ließ. 5 zeigt die spektrale Verteilung für die UVP-Birnen des Stratalinker.
(d) RNA-Analyse
Gesamt-RNA wurde durch Lyse mit einem Detergens und anschließende Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung isoliert. 15 Mikrogramm RNA wurden auf denaturierenden Formaldehyd/Agarose-Gelen der Größe nach fraktioniert und durch Kapillarblotting auf Nylonfilter übertragen. Die Blots wurden 32Pmarkierten cDNA-Sonden ausgesetzt und 24 Stunden lang bei 42 °C in 50% Formamid, 2X SSC, 5X Denhardts, 0,1% SDS, 10% Dextransulfat und 100 Mikrogramm/ml Lachssperma-DNA hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter bei 60 °C bis zu einer Stringenz von 0,5–0,1 × SSC gewaschen und drei bis zehn Tage lang bei -80 °C unter Verwendung von Fuji-Film autoradiographiert. Die Autoradiographien werden durch Densitometrie unter Verwendung der Software GS-365 (Hoefer Scientific) quantifiziert.
(e) Gensonden
Die c-jun-Sonde war ein 1,2-kb-SalI/HpaI-Fragment aus dem Plasmid pH) (Bohmann, 1987). Die c-fos-Sonde war, ein 1,8-kb-XhoI/EcoRI-Fragment aus dem Plasmid BK 28 (Verma, 1988). Die 185-Sonde wurde aus einem EcoRI-Abbauprodukt isoliert, und die Isolation des 5,6-kb-Fragments erfolgte aus dem Plasmid pB (Gonzalez, 1988).
(f) Zellzählung und DNA-Synthese-Messungen
Zellen wurden mit 0,25% Trypsin geerntet und mit einem Counter Counter (Counter Instruments) gezählt. Die Lebensfähigkeit wurde durch Trypanblau-Ausschluss bestimmt. Die DNA-Synthese wurde durch Markierung mit (Methyl--Thymidin (9,25 × 10⁷ Bq/ml, 7,4 × 1011 Bq/mmol (2,5 mCi/ml, 20 Ci/mmol), Dupont New England Nuclear) geniessen, das während der letzten 4 Stunden der Inkubation zu dem Medium gegeben wurde. Melanocyten wurden unter Verwendung eines Ph. D.-Zellsammlers (Cambridge Research Inc.) geerntet. Die Menge der eingebauten Radioaktivität wurde durch Flüssigszintillationszählung (LS5000TD, Beckman Instruments) bestimmt.
(g) Kernproteinextrakte
Zellen wurden bis zu einer Konfluenz von ungefähr 50–60% gezüchtet und so behandelt, wie es in der experimentellen Vorschrift beschrieben ist, die unten in Abschnitt (i) angegeben ist. Man ließ die Zellen in hypotonischem Puffer (10 mM HEPES, pH 7,8, 0,1 mM EDTA, 10 mM KCC, 1 mM DTT, PMSF, 15 Minuten lang auf Eis) aufquellen. Die cytosolische Proteinfraktion wurde nach der Zugabe von Nonidet P-40 bis zu einer Endkonzentration von 0,5% und Abtrennung von den Zellkernen durch Zentrifugation (500 g während 5 Minuten) erhalten. Die Kernproteine wurden aus dem verbleibenden Sediment durch Dialyse mit hypertonischem Puffer (20 μM HEPES, pH 7,9, 350 mM NaCI, 1 mM DTT, 1 mM PMSF während 2 Stunden bei 10 °C extrahiert. Das isolierte Kernprotein wurde bei -80 °C eingefroren und gelagert. Die Quantifizierung wurde aus den Ablesungen der optischen Dichte bei den Wellenlängen 230, 260 und 320 nm berechnet.
(h) Gel-Mobility-Shift-Assays
Fünf-Mikrogramm-Proben jedes Extrakts wurden mit 10 000 cpm eines ³²Pmarkierten Consensus-Oligonucleotids von NF Kappa B inkubiert. Nach 1 Stunde Inkubation wurden Proben einer Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel mit geringer Ionenstärke unterzogen. Die Quantifizierung von Protein:DNA-Komplexen erfolgte durch Densitometrie.
(i) Experimentelle Vorschrift Die folgende experimentelle Zeittafel wurde verwendet:
Normale humane Melanocyten wurden in einem geeigneten Gefäß (6-Napf-Platte, 96-Napf-Platte, 75-cm- oder 175-cm-Kolben) angesetzt und bis zu einer Konfluenz von 50–60% wachsen gelassen. In einer "behandelten" Gruppe wurde dann frisches Medium und 1,0 Mikrogramm/ml β-Carotin hinzugefügt, und die Zellen wurden 24 Stunden lang mit dem β-Carotin inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal mit PB5 gewaschen und mit 500 mJ/cm² UV-B bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurde frisches Medium (ohne β-Carotin) hinzugefügt, und die Zellen wurden weitere 1, 2, 4 bzw. 24 Stunden inkubiert. Der Zeitpunkt 0,05 Stunden eist darauf hin, dass die Zellen innerhalb von 3 Minuten nach der UV-B-Bestrahlung geerntet wurden. Eine "Kontrollgruppe" erhielt genau dieselbe Behandlung wie die "behandelte" Gruppe, mit der Ausnahme, dass sie mit β-Carotin behandelt wurde.
Diskussion der Ergebnisse
1 zeigt, dass die DNA-Synthese bei der höchsten β-Carotin-Dosis zwar weitgehend gehemmt wurde, die niedrigeren Dosen aber wenig oder keine Wirkung hatten. In dieser Hinsicht wurde die Dosis von 1,0 Mikrogramm/ml als Vorbehandlungsdosis für die UV-Experimente gewählt, da sie die höchste β-Carotin-Konzentration bot, die mit einer minimalen Wirkung auf die DNA-Synthese erreichbar war. β-Carotin wurde 24 Stunden lang mit den Melanocyten inkubiert. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von 6 Näpfen ± prozentualer Standardfehler im Vergleich zur Kontrolle.
2 zeigt, dass die Lebensfähigkeit der Zellen unmittelbar nach 500 mJ/cm² UV-B (0,05 h) im Vergleich zu UV-B allein um fast 20% zunahm. Diese Wirkung blieb während der Dauer des Zeitverlaufs bestehen. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von 3 Näpfen ± prozentualer Standardfehler im Vergleich zu den Kontrollen.
3 zeigt, dass die größte Induktion von c-jun durch UV-B 24 Stunden nach einer Bestrahlung mit 500 mJ/cm² erfolgte (36,2fach über Grundniveau). Die maximale Induktion von c-fos erfolgte 2 Stunden nach der Bestrahlung mit einem Expressionsniveau von 57fach über dem Grundwert. Die Induktion von cfos durch UV-B wurde durch β-Carotin im Wesentlichen blockiert. Die Expression von c-jun wurde durch β-Carotin vier Stunden nach der Bestrahlung auf das 11,1fache erhöht, während die Induktion durch UV-B nach 24 Stunden vollständig blockiert war. Das Grundexpressionsniveau dieser Gene ohne β-Carotin oder UV-B wurde von allen gezeigten RNA-Niveaus subtrahiert. Die Blots wurden einer Korrektur aufgrund der Beladung durch 18S unterzogen.
4 zeigt, dass der Einbau von tritiiertem Thymidin 24 Stunden nach der Bestrahlung bei Melanocyten, die mitβ-Carotin behandelt wurden, gestiegen war.
Ohne uns auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, ist das gezeigte Gemisch anscheinend eine superfeine Emulsion.
Wir beziehen uns jetzt auf 6. Die in dieser Figur gezeigten Histogramme sind repräsentativ für vier unabhängige Northern-Blots. Auf der linken Seite sind die Ergebnisse nach 100 mJ/cm² UVB gezeigt, und rechts sind die Ergebnisse nach 500 mJ gezeigt. Wie in den Histogrammen in 6 gezeigt ist, nahmen die c-fos- und c-jun-RNA-Niveaus rasch zu, wobei das höchste Expressionsniveau eine Stunde nach der Bestrahlung erreicht wurde. Diese Induktion war jedoch nur vorübergehend, da die Expression 4 Stunden nach der Bestrahlung auf die Grundniveaus zurückkehrte. Eine Stunde nach der Bestrahlung mit 500 mJ/cm² befand sich c-jun fast auf dem doppelten Expressionsniveau im Vergleich zu einer Bestrahlung mit 100 mJ/cm². Die Expression von c-fos war nach einer Bestrahlung mit 500 mJ/cm² ebenfalls höher. Das β-Carotin veränderte die UVB-induzierte c-fos-Expression nicht und hatte nur eine geringe Wirkung auf c-jun.
Wir beziehen uns jetzt auf 7. Wir isolierten dann Kernprotein aus den Melanocyten und betrachteten die DNA-Bindungsaktivitäten nach der Bestrahlung. Die Aktivität für den Transcriptionsfaktor NF Kappa B blieb über diese Zeitspanne im Wesentlichen unbeeinflusst. Die Aktivierung von Kernfaktor Kappa B (NF Kappa B) im Cytoplasma ist bekanntermaßen auf die Dissoziation eines inaktiven NF-Kappa-B-Inhibitors des Kernfaktor-Kappa-B-Komplexes zurückzuführen. (Siehe M .M. Simon et al.: "UVB light induces Nuclear Factor Kappa B (NF Kappa B) activity independently from chromosomal DNA damage in cell-free cytosolic extracts": The Journal of Investigative Dermatology: 102 (Nr. 4), 422 (April 1994)). β-Carotin senkte jedoch leicht die NF-Kappa-B-Bindungsaktivität. Obwohl die Dosis von 100 mJ/cm² die Bindungsaktivität nicht über das Grundni- veau hinaus induzierte, modifizierteβ-Carotin die NF-Kappa-B-Aktivität.
8 zeigt die Ergebnisse für die DNA-Bindungsaktivität normaler Kaukasischer Melanocyten nach Bestrahlung mit 500 mJ/cm² UVB. Eine repräsentative Autoradiographie der NF-Kappa-B-Aktivität ist links gezeigt, und ein Histogramm davon ist rechts gezeigt. Das niedrigste Aktivitätsniveau wird 24 Stunden nach der Bestrahlung beobachtet.
In 7 wurde gezeigt, dass β-Carotin bei 100 mJ/cm² nur, eine mäßige Wirkung auf NF Kappa B hatte, währendβ-Carotin bei der höheren Dosis von 500 mJ/cm² die NF-Kappa-B-Aktivität in der ersten Stunde nach der Bestrahlung um mehr als 50% hemmte. Diese Daten zeigen, dass die NF-Kappa-B-Bindungsaktivität bei der höheren UVB-Dosis herunterreguliert wird.
9 zeigt die Ergebnisse von Northern-Analysen von normalen neonatalen Kaukasischen Melanocyten, die in TPA sowie IBMX kultiviert wurden. Dann betrachteten wir die Wirkung dieser Mediumbedingungen auf die c-jun-Induktion im Anschluss an eine Bestrahlung mit 100 mJ/cm² UVB. Die Melanocyten wurden 24 Stunden lang mit und ohne TPA und IBMX behandelt, dann bestrahlt und eine weitere Stunde mit und ohne den relevanten Faktor inkubiert. Im Vergleich zu bestrahlten Melanocyten in vollständigem Medium (d. h. Medium, das sowohl TPA als auch IBMX enthielt) nahm die c-jun-Induktion um ungefähr 50% ab. Außerdem reduzierten die bestrahlten Melanocyten, denen TPA und IBMX gleichzeitig fehlten, die c-jun-Expression auf die Niveaus, die man unter allen unbestrahlten Bedingungen beobachtet. Die RNA-Niveaus waren in Melanocyten, die nicht mit UVB bestrahlt wurden, durch die Abwesenheit von TPA, IBMX oder ihrer Kombination nicht beeinflusst. Bei dieser geringen Dosis von 100 mJ/cm² scheinen Melanocyten für eine vollständige Induktion von c-jun sowohl TPA als auch IBMX zu benötigen.
Schlussfolgerungen
Die wissenschaftliche Literatur zeigt, dass wahrscheinlich mehrere Transcriptionsfaktoren an der Reaktion auf DNA-Schäden durch ultraviolette Strahlung beteiligt sind. Dazu gehören die Gene c-fos und c-jun sowie der NF-Kappa-B- Komplex und der AP-1-Komplex. Ein schematischer Überblick über die etwas komplexen vermuteten Mechanismen, die bei der Vermittlung der Reaktion auf Schäden durch ultraviolette Strahlung an der DNA normaler Melanocyten beteiligt sind, ist in 10 gezeigt. Wir führten eine Reihe von Experimenten mit kultivierten normalen Melanocyten durch (untersucht durch Northern-Analyse auf ihre Expression von c-fos und c-jun nach Einwirkung von Ultraviolett-B-(UVB)-Strahlung). Die Daten, die aus Experimenten erhalten wurden, die die Wirkung auf die Gene c-fos und c-jun untersuchten, haben etwas widersprüchliche Ergebnisse gezeigt. Die Diskrepanzen können auf mehrere Einflussfaktoren zurückzuführen sein, wie die Möglichkeit, dass die verwendeten Dosen der ultravioletten Strahlung nicht geeignet sind, um die Wirkungen einer solchen Bestrahlung bei den Genen c-fos und c-jun in Epithelzellen oder die Wirkungen von Carotinoiden auf die hervorgerufene Reaktion zu untersuchen. Dementsprechend kann es notwendig sein., die Wirkungen von Bestrahlung und Carotinoid-Behandlungen auf diese Gene unter anderen experimentellen Bedingungen zu untersuchen. Außerdem bleibt noch die Möglichkeit, dass andere Vertreter der jun- und fos-Genfamilie (z. B. jun-B, jun-D, fos-B, fra I, fra II) eine wichtigere Rolle bei der Reaktion auf ultraviolette Bestrahlung von normalen Epithelzellen und der Wirkung von β-Carotin auf diese Reaktion spielen könnten. Diese ungelösten Fragen werden eine weitere Untersuchung erfordern.
Andererseits waren wir vor kurzem in der Lage, Experimente durchzuführen, die die erst in neuerer Zeit entdeckten Eigenschaften des NF-Kappa-B-Komplexes untersuchten, und die Ergebnisse dieser Studien zeigen ein statistisch signifikantes Ergebnis für den Schutz durch β-Carotin vor der von diesem Komplex vermittelten Reaktion auf UV-Schäden. Wir bringen hier zwar keine definitive und bindende Theorie zum Ausdruck, um diese Beobachtungen zu erklären, doch scheint es, dass der NF-Kappa-B-Komplex ein stärker attenuierter und daher empfindlicherer Indikator von Nucleinsäureschäden ist, die durch ultraviolette Bestrahlung normaler humaner Melanocyten verursacht werden. Die Vorbehandlung solcher Melanocyten mit β-Carotin zeigte einen statistisch signifikanten schützenden Effekt, insbesondere eine Stunde nach der UVB-Bestrahlung mit 500 mJ/cm². Der schützende Effekt war bei einem p-Wert von weniger als 0,05 (unter Verwendung des Studentschen t-Tests) statistisch signifikant. Dementsprechend scheint es, dass der NF-Kappa-B-Komplex das am besten geeignete Modell ist, das zur Zeit für die Untersuchung der Umwandlung von Melanocyten in Melanome und die Unterdrückung dieses Vorgangs durch β-Carotin bekannt ist.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, die eine wasserunlösliche Carotinoidkomponente und einen nichttoxischen Träger dafür umfasst, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von normalen Hautzellen, so dass ihre Umwandlung zu Melanomen gehemmt wird, wobei die Zusammensetzung eine effektive Menge von 0,1 bis 10 Gew.-% des wasserlöslichen Carotinoids umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die normalen Hautzellen von einem Säuger stammen.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei die normalen Hautzellen vom Menschen stammen.
Verwendung gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die normalen Hautzellen Melanocyten sind.
Verwendung gemäß einem der Anspruche 1 bis 4, wobei die wasserunlösliche Carotinoidkomponente β-Carotin umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei die wasserunlösliche Carotinoidkomponente 2 bis 50 Gew.-% β-Carotin umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei die wasserunlösliche Carotinoidkomponente 20 bis 40 Gew.-% β-Carotin umfasst.
Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der nichttoxische Träger ein Suspendiermittel umfasst, das aus Fettsäuren, Triglyceridlipiden, nichtverseifbaren Lipidpräparaten und Kombinationen davon ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei der nichttoxische Träger weiterhin einen Emulgator, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Tween^®-Glycerinfettsäureestern und acetylierten Estern von Fettsäuren besteht, sowie ein wasserlösliches Dispergiermittel, bei dem es sich um einen Zucker oder ein Polyol handelt, umfasst.
Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung mit einem geeigneten Verdünnungsmittel verdünnt wird, so dass der Anteil der Gesamtcarotinoide 0,1 bis 10 μg pro ml der verdünnten Zusammensetzung beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei der Anteil 0,3 bis 3,0 μg pro ml beträgt.