DE69524093T2

DE69524093T2 - Kombination von prokoagulans und cytokin oder induktor seiner produktion für die behandlung von tumoren

Info

Publication number: DE69524093T2
Application number: DE69524093T
Authority: DE
Inventors: A. Vehar
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-08
Publication date: 2002-07-11
Anticipated expiration: 2015-06-09
Also published as: EP0765168B1; FI965008A; IL114119A0; KR970703783A; CA2191065A1; FI965008A0; WO1995034319A1; EP0765168A1; FI119677B; JPH10501813A; IL114119A; US5830448A; AU2821295A; US5762921A; ZA954984B; AU696003B2; DE69524093D1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und deren Verwendung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren. Die Erfindung offenbart auch ein Verfahren zur Inhibierung des Wachstums und/oder zur Rückbildung von mikrovaskulären Tumoren durch Verabreichung einer Kombination aus einem Prokoagulans, wie z.B. einem Thrombomodulin-Inhibitor, und einem Cytokin oder einem Induktor der Cytokinproduktion.

Hintergrund der Erfindung

Thromboglobulin ist ein Bestandteil des Systems der Protein C-Antikoagulantien (Walker, F.J. und Fay, P.J., Faseb J. 6, 2561-2567 [1992]; Esmon, C.T., Trends in Cardiovasc. Med. 2, 214-219 [1992]), welches das wichtigste natürliche Antikoagulans-System des Kapillarbetts darstellt (Nydahl, S. et al., Thrombosis Res. 65, 365-376 [1992]; Nydahl, S. et al., Thromb. Haemost. 69, 41-44 [1993]). Bekannte Bestandteile dieses Systems sind das Vitamin K-abhängige Protein, Protein C, welches, wenn es aktiviert wird, das zentrale Enzym dieses Antikoagulans-Stoffwechselwegs ist, Protein S (ein weiteres, Vitamin Kabhängiges Enzym), C&sub4;-bindendes Protein, Thrombomodulin, und Thrombin. Wie in Fig. 1 dargestellt ist, reagieren diese Proteine in komplexer Art und Weise mit anderen Bestandteilen des Systems, was zur Aktivierung des Protein C führt. Thrombomodulin ist ein integrales Membranprotein der Endothelzellen. Es wird angenommen, dass es Thrombin unter Bildung eines Komplexes bindet, der die Aktivierung von Protein C katalysiert. Aus physiologischer Sicht zeigt freies Thrombin eine Reihe von prokoagulierenden Aktivitäten, einschließlich Fibrinbildung, Blutplättchenaktivierung und die Aktivierung der Faktoren V, VIII und XIII, ist jedoch nicht imstande, Protein C zu aktivieren. Sobald Thrombin durch Thrombomodulin gebunden ist, verliert es alle seine prokoagulierenden Funktionen, und der Thrombin-Thrombomodulin-Komplex kann nun die Aktivierung von Protein C an einer spezifischen Arg/Leu-Bindung auf effiziente Weise katalysieren. Die Spaltung resultiert in Konformationsänderungen die eine funktionsfähige Serin-Protease ergeben. In Kombination mit Protein S und einer Phospholipid-Oberfläche, katalysiert dann das aktivierte Protein C die proteolytische Inaktivierung der Koagulationsfaktoren V und VIII. Ohne die Faktoren V und VIII kann die Koagulationskaskade nicht ablaufen, und es wird daher kein Fibrin gebildet. Zusätzlich zu dessen Funktion als Antikoagulans, fördert aktiviertes Protein C möglicherweise die Fibrinolyse (de Fouw N.J. et al., Fibrinogen, Thrombosis, Coagulation and Fibrinolysis, CY Liu und S. Chien, (Hrsg.), 235-243 [1990]). Diese Wirkung umfasst die Komplexbildung zwischen aktiviertem Protein C und dem Plasminogen-Aktivator-Inhibitor (PAI-1) (Sakata, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1121-1125 [1985]; Sakata Y. et al., Blood 68, 1218-1223 [1986]; de Fouw, N. J. et al., Thromb. Haemost. 57(2), 176-182 [1987]).
Die wichtige Rolle des Protein C-Systems, und von Protein C und Thrombomodulin im Besonderen, in der aufhebenden Regulation der Blutgerinnung (Koagulation) ist gut dokumentiert, und es ist bekannt, dass jegliche Verschiebung des Gleichgewichts in Richtung Koagulation zu ernsthaften pathologischen Zuständen mit möglichen katastrophalen Konsequenzen führen könnte. Protein C-Mangel wurde mit erhöhtem Risiko für Venenthrombose und Gewebenekrose in Zusammenhang gebracht. Es wurde auch darauf hingewiesen, dass das Fehlen hinreichender Protein C-Aktivierung zum pathologischen Schaden des septischen Schocks beiträgt. Aktiviertes Protein C wurde daher als zweckmäßig für die Behandlung der frühen Phasen des septischen Schocks vorgeschlagen (Taylor et al., J. Clin. Invest. 79, 918-925 [1987]; Esmon, J. Biol. Chem. 264, 4743-4746 [1989]; Esmon, C.T., Trends in Cardiovasc. Med. 2, 214-219 [1992]).
Die Beziehung zwischen Blutgerinnung und Krebs ist höchst umstritten. Abnormalitäten der Hämostase bei Krebspatienten sind seit langem bekannt. Thrombose und Hyperkoagulabilität wurden bei bis zu 60% der Patienten mit Malignität beobachtet (Glassman et al., Ann. Clin. Lab. Si. 24, 1-5 [1994]), während andere Autoren anmerkten, dass etwa 15% der Krebspatienten im Verlauf ihrer Krankheit ein thrombotisches Ereignis erleiden werden (Scates, Sem. Thromb. Hemost. 18, 373-379 [1992]). Fibrinablagerungen wurden in einer Vielzahl von soliden Karzinomen beobachtet, wie z.B. das kleinzellige Lungenkarzinom (SCCL, "small cell carcinoma of the Iung"), Grawitz-Tumor (RCC, "renal cell carcinoma"), und das bösartige Melanom (Constantini und Zacharski, Thromb. Haemost. 69, 406-414 [1993]). Basierend auf der Fähigkeit antithrombotischer (antikoagulierender und antithrombozytischer) Wirkstoffe zur Verhinderung von Tumoren in Tumor-tragenden Versuchstieren, wurde vorgeschlagen, dass die Blutgerinnungsreaktionen zum Wachstum und zur Ausbreitung bestimmter Tumortypen beitragen (Zacharski, Haemostasis 16, 300-320 [1986]). Es konnte gezeigt werden, dass bestimmte Antikoagulantien, wie z.B. Warfarin und Heparin, günstige Auswirkungen auf den Verlauf von SCCL in klinischen Studien am Menschen haben (Zacharski et al., Fibrinolysis 6, 39-42 [1992], sowie die darin zitierten Verweise).
Im Gegensatz zu den berichteten Vorteilen bestimmter Antikoagulantien in der Tumortherapie beschrieben C.T. Esmon und P.C. Comp (U.S. Patent 5.147.638, erteilt am 15. September 1992, und PCT-Anmeldung Nr. WO 9110153, veröffentlicht am 21. Februar 1991), dass bestimmte Inhibitoren des Protein C-Antikoagulans-Systems, entweder alleine oder in Kombination mit der Verabreichung von Cytokinen und/oder anderen Anti- Tumor-Wirkstoffen, einen ausgeprägten inhibitorischen Effekt auf das Tumorwachstum besitzen und in vielen Fällen zu einer dramatischen Tumor-Rückbildung führen (U.S. Patent Nr. 5.147.638, erteilt am 15. September 1992). Die Autoren haben empirisch gefunden, dass ein Protein C-neutralisierender Antikörper (HPC4) eine extensive Gerinnung und anschließende Nekrose innerhalb einer breiten Vielfalt von Tumoren verursacht, und dass diese Wirkung höchstspezifisch ist und das Gefäßsystem des normalen Gewebes unberührt lässt. Die Autoren haben insbesondere gezeigt, dass die Behandlung von tumortragenden Tieren mit einem Protein C-neutralisierenden Antiköper (HPC 4) zu einer dramatischen Reduktion der Tumorgröße führt, und dass diese Wirkung bei einigen Tumorarten durch die Verabreichung eines Cytokins, Tumor-Nekrosefaktor (TNF), verstärkt wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung basiert auf Experimenten, die zeigen, dass die Verabreichung einer Kombination von Lymphotoxin (LT, TNF-β) und inaktiviertem Thrombin, jedoch nicht von inaktiviertem Thrombin oder Lymphotoxin alleine, zu einem vollständigen, selektiven Verlust der Blutzufuhr zu den Tumoren in tumortragenden Tieren führt. Dieser verursacht seinerseits eine im Wesentlichen vollständige Inhibierung des Tumorwachstums ohne jeden signifikanten Schaden an normalen Gewebezellen. Da das inaktivierte (an der aktiven Stelle blockierte) exogene Thrombin ein Inhibitor der Komplexbildung zwischen aktivem endogenen Thrombin und Thrombomodulin ist, verbleibt das Protein C in seiner inaktiven zymogenen Form, d.h. man nimmt an, dass die Behandlung zu einer totalen Blockierung des Protein C-Systems führt. Zusätzlich erzeugt das inaktivierte Thrombin einen leistungsfähigeren Prokoagulans-Reiz als ein Antikörper gegen Protein C. Mit einem Antikörper gegen Protein C wird jegliches gebildetes Thrombin in seiner Aktivität zur Bindung an Thromboglobulin im Gefäßbett neutralisiert. Wenn Thrombomodulin mit inaktiviertem Thrombin austitriert wird, hat das Gefäßsystem seine Fähigkeiten sowohl zur Inaktivierung von Protein C, als auch zur Neutralisation der Prokoagulans-Aktivitäten des Thrombins durch Komplexbildung mit Thrombomodulin verloren.
Die vorliegende Erfindung basiert zusätzlich auf den experimentellen Ergebnis, dass ein ähnlicher selektiver Zusammenbruch des Tumor-Gefäßsystems und die daraus resultierende Inhibierung des Tumorwachstums durch die Verabreichung einer Kombination anderer Wirkstoffe, die einen prokoagulierenden Zustand und Cytokine induzieren, erzielt werden kann. Insbesondere haben wir festgestellt, dass Kombinationen von Faktor IXa und TNF-β, sowie Gewebefaktor und TNF-β, zu einem vollständigen selektiven Verlust der Blutzufuhr zu den Tumoren in tumortragenden Tieren führt.
Im Hinblick auf die umfassende biomedizinische Literatur, die die Vorteile von anti-koagulierenden Wirkstoffen zur Behandlung von bösartigen Tumoren bestätigt, war es vollkommen unvorhersehbar, dass Verbindungen, die einen prokoagulierenden Zustand hervorrufen, wie z.B. Thrombomodulininhibitoren, Faktor IXa und Gewebefaktor, für die Tumorbehandlung brauchbar wären. Weiters ist es im Hinblick auf die von C.T. Esmon und P.C. Comp (s.o.) berichteten Ergebnisse überraschend, dass inaktiviertes Thrombin alleine keinen signifikanten Effekt auf die Blutversorgung zu den Tumoren zeigt, währenddessen die Verabreichung inaktivierten Thrombins in Kombination mit einem Cytokin (LT) innerhalb weniger Stunden nach Verabreichung zu einem im Wesentlichen vollständigen Verschluss der in die Tumoren hineinwachsenden Kapillaren und folglich zu einer dramatischen Tumor-Rückbildung führt.
In einem Aspekt offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Tumors in einem Patienten, umfassend einen dem Patienten verabreichte, therapeutisch wirksame Dosis einer Kombination aus einem Prokoagulans und einem Cytokin oder einem Induktor der Cytokin-Produktion. Die Verabreichung kann gleichzeitig oder nacheinander erfolgen, wobei entweder Prokoagulans oder Cytokin oder Cytokin- Induktor zuerst verabreicht wird. Der Patient ist vorzugsweise ein Mensch. In einer bevorzugten Anwendungsform ist das Prokoagulans Gewebefaktor oder Faktor IXa oder eine Kombination davon, während das Cytokin TNF-β, TNF-α, IL-1 und/oder IN-γ, insbesondere TNF-β, ist. Die Behandlung kann mit der Inhibierung einer oder mehrerer Komponenten des Protein C-Systems und/oder anderen bekannten Tumor-Behandlungsmethoden kombiniert werden.
In einem weiteren Aspekt offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Tumors in einem Patienten, umfassend die dem Patienten verabreichte, therapeutisch wirksame Dosis einer Kombination aus einem Thrombomodulin-Inhibitor und einem Cytokin oder einem Induktor der Cytokin-Produktion. Die Verabreichung kann gleichzeitig oder nacheinander erfolgen, wobei entweder Thrombomoduliri-Inhibitor oder Cytokin oder Cytokin-Induktor zuerst verabreicht wird. Der Patient ist vorzugsweise ein Mensch. In einer bevorzugten Anwendungsform ist das Thrombomodulin ein an der aktiven Stelle blockiertes, verändertes (d.h. durch Aminosäure-Substitution oder Insertion) oder deletiertes Thrombin-Molekül (welche kollektiv als "inaktiviertes Thrombin" bezeichnet werden), insbesondere ein durch ortsspezifische Mutagenese an einem oder in der Nähe eines oder mehrerer Reste der aktiven Stelle modifiziertes Thrombin, verabreicht in Kombination mit TNF-β (LT), TNF-α, IL-1 und/oder INF-γ. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform ist das Cytokin TNF-β. Die Behandlung kann mit der Inhibierung einer oder mehrerer weiteren Komponenten des Protein C-Systems und/oder anderen bekannten Tumor-Behandlungsmethoden kombiniert werden.
In einem wiederum anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren in Patienten, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer Kombination aus einem Prokoagulans und einem Cytokin oder einem Induktor der Cytokin-Produktion.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren in Patienten, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer Kombination aus einem Thrombomodulin-Inhibitor und einem Cytokin oder einem Induktor der Cytokin-Produktion.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Antikörper, der imstande ist, sich spezifisch an die Thrombin-Bindungsstelle(n) des Thrombomodulins zu binden.
In wiederum einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung einen Antikörper, der imstande ist, sich spezifisch an den Thrombin/Thrombomodulin-Komplex zu binden, und im Wesentlichen außerstande ist, sich an Thrombin zu binden.
Die Erfindung betrifft weiters Hybridom-Zellinien, die die vorangegangenen Antikörper sekretieren.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 (Esmon, C.T., Science 235, 1348-1352 [1987]) veranschaulicht die bekannten Wechselwirkungen zwischen den Bestandteilen des Protein C-Antikoagulans-Stoffwechselwegs. Die folgenden Abkürzungen wurden verwendet: PC: Protein C; S. Protein S. TM: Thrombomodulin; Th: Thrombin; APC: aktiviertes Protein C; Villa: aktivierter Faktor VIII; VIIIainactive: inaktivierter Faktor VIII; Va: aktivierter Faktor V; Vainactive: inaktivierter Faktor V; C4BP: C&sub4;-bindendes Protein; PSBP: Protein S-bindendes Protein.
Die Fig. 2A-D zeigen die Reaktion fester Mäuse-Tumoren auf die Behandlung mit aktivstellenblockiertem Thrombin und TNF-β. Sowohl die Gefäße des normalen subkutanen Hautgewebes als auch die der transplantierten Tumore wurden kontinuierlich im Umkehrmikroskop beobachtet. Die Fig. 2A-D sind zu den angegebenen Zeiten vor der Behandlung (Fig. 2A) und nach der Behandlung (Fig. 2B) aufgenommene Bilder.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

A. Definitionen

Die Begriffe "Tumor" und "Krebs" werden austauschbar verwendet und bezeichnen, zusammen mit ihren grammatikalischen Variationen, Tumoren jeglicher Art von Zellen, einschließlich Karzinom, Sarkom, Lymphom und Leukämien jeglicher humaner und nichthumaner Tierspezies, einschließlich Schweine, Katzen, Hunde und höhere Primaten. Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind besonders geeignet für die Behandlung fester Tumoren, die durch ausgeprägte Gefäßsysteme charakterisiert sind (mikrovasculäre Tumoren), einschließlich Karzinom, Sarkom und Lymphom verschiedenster Zelltypen. Solche Tumoren sind von einer Fibrinkapsel umgeben, und enthalten ein ausgeprägtes Gefäßsystem, welches durch eine rasche Wucherung seiner Endothelzellen, schwache Zellwandstruktur, erhöhte Permeabilität für Plasmaproteine und eine beschränkte Fähigkeit zur Steigerung des Blutflusses bei erhöhtem Bedarf charakterisiert ist. Feste Tumoren, auf die durch die Behandlung der vorliegenden Erfindung besonders abgezielt wird, umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) Lungenkrebs; Krebs von Kopf und Hals, einschließlich Plattenepithel- und Epidermiszellenkarzinom; Adenokarzinom, einschließlich Prostata-, szirrhöse und Brust-Adenokarzinome; Lymphosarkom; Fibrosarkom; Leiomyosarkom; Chondrom, usw. Das vorliegende Verfahren ist besonders wertvoll in der Therapie diffuser fester Tumoren, für die es bisher keine effizienten Behandlungsverfahren gab.
Der Begriff "Prokoagulans" wird hier verwendet, um jegliche Verbindung mit prokoagulierender Wirkung oder jegliche Verbindung die in der Lage ist, einen prokoagulierenden Zustand zu induzieren, zu bezeichnen. Insbesondere umfasst der Begriff Polypeptide, Peptide und organische Moleküle, ob sie nun aus natürlichen Quellen gereinigt, chemisch synthetisiert, oder durch DNA-Rekombinationstechnologie oder durch jede andere Kombination dieser und/oder anderer Verfahren produziert wurden, vorausgesetzt, dass sie die erforderlichen prokoagulierenden Aktivitäten oder die Fähigkeit, einen prokoagulierenden Zustand zu erzeugen, besitzen. Solche "Prokoagulantien" umfassen (sind jedoch keineswegs beschränkt auf) Faktor IXa, Gewebefaktor, Faktor VIIa, und Faktor XIa.
Der Begriff "Thrombomodulin" wird verwendet, um ein natives Thrombomodulin zu beschreiben, das in jeglicher Zelle (einschließlich Endothelzellen des Mikro- und Makrokreislaufs) jeglichen Tiers, z.B. Säuger-Spezies, einschließlich Menschen. Die vollständige cDNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz des nativen humanen Thrombomodulins sind bekannt, wie auch die Lokalisation des Thrombomodulin-Gens (Dittman et al., Biochemistry 26, 4350-4357 [1987]; Jackman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6425-6429 [1987]; Suzuki et al., EMBO J. 6, 1891-1897 [1987]). Die humane cDNA des Thrombomodulins kodiert für ein Protein aus etwa 575 Aminosäuren, die zusammengesetzt sind aus stark hydrophoben, Cystein-armen und Tryptophan-reichen Domänen am N-Terminus, gefolgt von einer Domäne mit sechs EGF-artigen Wiederholungen, einem Serin- und Threonin-reichen Segment, das wahrscheinlich über O-Bindungen glykosyliert ist, einer Transmembran-Domäne aus etwa 23 hydrophoben Aminosäuren und einem zytoplasmatischen Schwanz aus etwa 38 Aminosäuren (Esmon, N.L., Proc. Haemost. Thromb. 9, 29-58 [1988]).
Die Begriffe "Thrombin" und "α-Thrombin" werden verwendet, um ein enzymatisch aktives Thrombin-Molekül zu beschreiben, welches z.B. bei der Spaltung eines nativen Prothrombins entsteht, das in beliebigen Zellen jeglicher Tiere, z.B. Säugerspezies, einschließlich Menschen, exprimiert wird, oder mittels Verfahren der DNA-Rekombinationstechnologie, chemischer Synthese oder einer beliebigen anderen Kombination dieser und/oder anderer Verfahren hergestellt wird. Die Sequenz, Kristallstruktur, Funktionen und Wechselwirkungsstellen des Nativsequenz-Thrombins sind dem Fach weithin bekannt und sind beispielsweise bei Bode, W. und Stubbs, M.T., Thromb. Haemost. 19, 321-333 (1993), und in den darin zitierten Verweisen offenbart.
Der Ausdruck "Thrombomodulin-Inhibitor", wie sie hier verwendet wird, bezeichnet jegliche Verbindung oder jeglichen Eingriff, die/der die Bildung eines funktionsfähigen Thrombin/Thrombomodulin-Komplexes verhindert oder diesen spezifisch erkennt und blockiert und so die Aktivierung von Protein C verhindert. Im Zusammenhang mit dieser Definition ist ein "funktionsfähiger Thrombin/Thrombomodulin-Komplex" ein in vivo gebildeter Komplex zwischen nativem Thrombin und nativem Thrombomodulin, der durch die Fähigkeit zur Aktivierung von Protein C gekennzeichnet ist.
Die Bildung eines funktionsfähigen Thrombin/Thrombomodulin-Komplexes kann durch einen oder mehrere der folgenden Ansätze verhindert werden: (i) Inhibierung der in vivo-Expression von Thrombomodulin; (ii) selektive Blockierung von Thrombomodulin, so dass es kein Thrombin bindet; (iii) selektive Blockierung von Thrombin, so dass es kein · Thrombomodulin bindet, und (iv) selektive Blockierung des Thrombin/Thrombomodulin-Komplexes, vorausgesetzt dass, falls Ansatz (i) angepasst wird, dieser immer mit mindestens einem der Verfahren (ii)-(iv) kombiniert werden sollte.
Die in vivo-Expression von Thrombomodulin kann zum Beispiel durch IL-1, TNF-α, TNF-β und Thrombin inhibiert werden, die dafür bekannt sind, die Thrombomodulin- Produktion und -Expression hinunterzuregeln. Die Thrombomodulin-Expression an Endothelzellen in einem Tumor kann auch als Konsequenz der Strahlenbehandlung hinuntergeregelt sein. Die Röntenbestrahlung mit ungefähren Dosen von 100-300 rad auf den Tumorherd reicht für eine leichte lokale Entzündung im Tumor aus, was erwartungsgemäß zu einem Verlust der Thrombomodulin-Expression führt.
Thrombomodulin kann durch einen neutralisierenden Antikörper selektiv blockiert werden, oder durch jegliche andere Verbindung (einschließlich organische Moleküle, Peptide und Polypeptide), die in der Lage ist, sich selektiv an die Thrombin-Bindungsstelle(n) des Thrombomodulins zu binden. Die bedeutendste Thrombin-Bindungsstelle des Thrombomodulins wurde an der fünften und/oder sechsten EGF-artigen Wiederholung des Moleküls lokalisiert (Kurosawa et al., J. Biol. Chem. 263, 5993-5996 [1988]; Zushi et al., J. Biol. Chem. 264, 10351-10353 [1989]), die erste N-terminale Domäne des Moleküls könnte jedoch ebenfalls zur Thrombin-Bindung beitragen, entweder durch. Stabilisierung der EGF-artigen Region oder, alternativ dazu, durch einen Beitrag zur passenden Konformation der Thrombin-Bindungsstelle (Esmon, N.L., s.o.; Jackman et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 83, 8834-8838 [1986]; Wen et al., Biochemistry 26, 4350-4357 [1987]). Eine einfache Art der Blockierung von Thrombomodulin ist die Reaktion mit aktivstellenmodifiziertem, deletiertem oder blockiertem Thrombin (inaktiviertes Thrombin) unter Beibehaltung seiner Fähigkeit, natives Thrombomodulin zu binden. Diese inaktive Form des Thrombins bindet sich an Thrombomodulin, allerdings ist der gebildete Komplex nicht in der Lage, Protein C zu aktivieren. Auf diese Weise wird nach vorheriger Dosierung von inaktiviertem Thrombin, sobald funktionsfähiges Thrombin im Gefäßsystem gebildet wird, das gesamte Thrombomodulin mit der inaktiven Form austitriert.
Thrombin kann mit einem neutralisierenden Antikörper oder einer anderen Verbindung (z.B. einem organischen Molekül, Peptide oder Polypeptid), die in der Lage ist, die Thrombin/Thrombomodulin-Wechselwirkung zu inhibieren, spezifisch blockiert wer- den, z.B. durch selektive Bindung an die Thrombin/Thrombomodulin-Bindungsstelle(n) des Thrombins, ohne das Thrombin zu inaktivieren. Die an der Bindung von Thrombomodulin (sowie Fibrinogen, Thrombin-Rezeptor, Fibrin und Hirudin) beteiligte Region wurde innerhalb der "Fibrinogen-Exo-Erkennungsstelle" gefunden und ist in Fig. 2 von Bode und Stubbs, s.o., mit "F" markiert. Die einzigartige Eigenschaft von Thrombin, dieselben oder überlappende Bindungsregionen für verschiedene Bestandteile der Koagulationskaskade zu verwenden, erklärt, wie sich die Thrombin-Spezifität sich vom Prokoagulans zum Antikoagulans verändert. Thrombomodulin bindet sich über die Stelle, die von Thrombin eingenommen wird, um seine Substrate zu erkennen, und hilft bei der Bildung einer Bindungsstelle für Protein C. Dementsprechend kann Thrombin selektiv durch Neutralisation der für die Thrombomodulin-Bindung benötigten Stelle blockiert werden, ohne die für die Substraterkennung benötigte Stelle zu neutralisieren. Peptide, die die Wechselwirkung von Thrombin mit Thrombomodulin spezifisch inhibieren, wurden offenbart von Suzuki et al., J. Biol. Chem. 265, 13263-13267 [1990]; Suzuki & Nishioka, J. Biol. Chem. 266, 18498-18501 [1991]; und Nishioka et al., J. Biochem. 114, 148-155 [1993].
Eine alternatives Verfahren der Thrombomodulin-Inhibierung basiert auf den unterschiedlichen Bindungsspezifitäten des Thrombin/Thrombomodulin-Komplexes bzw. des freien Thrombins. Ein Antikörper oder eine andere Verbindung (z.B. ein organisches, Peptid- oder Polypeptid-Molekül) kann konstruiert oder identifiziert werden, welches den Thrombin/Thrombomodulin-Komplex, nicht jedoch freies Thrombin spezifisch erkennt und neutralisiert. Basierend auf bekannten Inhibitoren für das Thrombin selbst, welche unterschiedliche Affinitäten für den Thrombin/Thrombomodulin-Komplex besitzen, kann ein solches Molekül ein kleines organisches Molekül, ähnlich dem Argatroban, einem Thrombin-Inhibitor; ein kleines Protein, wie z.B. Hirudin, ein weiterer Thrombin-Inhibitor; oder ein größeres Protein, wie z.B. Anti-Thrombin sein.
"Antikörper (Abs)" sind Glykoproteine, die Bindungsspezifität für ein spezifisches Antigen (das heißt Thrombomodulin und Thrombin) aufweisen.
Native Antikörper und Immunglobuline sind gewöhnlich heterotetramere Glykoproteine von etwa 150.000 Dalton, und bestehen aus zwei identischen leichten (L) Ketten und zwei identischen schweren (H) Ketten. Jede leichte Kette ist über eine einzige kovalente Disulfidbrücke mit einer schweren Kette verbunden, während die Anzahl von Disulfidbrücken zwischen den schweren Ketten unter den unterschiedlichen Immunglobulin- Isotypen variiert. Jede schwere und leichte Kette besitzt zudem auch in regelmäßigen Abständen angeordnete Intraketten-Disulfidbrücken. Jede schwere Kette hat an einem Ende eine variable Domäne (VH), gefolgt von einer Anzahl konstanter Domänen (CH). Jede leichte Kette hat an einem Ende eine variable Domäne (VH) sowie eine konstante Domäne am anderen Ende; die konstante Domäne der leichten Kette ist in einer Linie ausgerichtet mit der ersten konstanten Domäne der schweren Kette, und die variable Domäne der leichten Kette ist mit der variablen Domäne der schweren Kette ausgerichtet. Man nimmt an, dass bestimmte Aminosäure-Reste eine Schnittstelle zwischen den variablen Domänen der leichten und schweren Kette bilden (Clothia et al.,). Mol. Biol. 186, 651-663 [1985]; Novotny und Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4592-4596 [1985]).
Der Begriff "variabel" betrifft die Tatsache, dass bestimmte Anteile in den variablen Domänen von Antikörpern sich untereinander in ihrer Sequenz stark unterscheiden und für die Bindung und Spezifität jedes Antikörpers für sein spezielles Antigen genutzt werden. Die Variabilität ist jedoch innerhalb der variablen Domänen der Antikörper nicht gleichmäßig verteilt. Sie ist den variablen Regionen sowohl der leichten als auch der schweren Ketten in drei Segmenten konzentriert, den komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs, "complementarity determining regions") oder hypervariablen Regionen. Die stärker konservierten Anteile der variablen Regionen werden als Rahmen (FR, "framework") bezeichnet. Jede der variablen Domänen der leichten und schweren Ketten umfasst vier FR-Regionen, die größtenteils eine β-Faltblattstruktur einnehmen, die über drei CDRs verbunden sind, welche Schleifen bilden, die die β-Faltblattstruktur verbinden und in manchen Fällen Teil der β-Faltblattstruktur sind. Die CDRs in jeder Kette werden durch die FR-Regionen in unmittelbarer Nachbarschaft gehalten und tragen gemeinsam mit den CDRs der anderen Kette zur Bildung der Antigen-Bindungsstelle der Antikörper bei (siehe Kabat, E.A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institute of Health, Bethesda, MD [1991]). Die konstanten Regionen sind nicht direkt an der Bindung eines Antikörpers an ein Antigen beteiligt, besitzen aber verschiedene Effektor-Funktionen, wie z.B. die Beteiligung des Antikörpers an der Antikörper-abhängigen Zelltoxizität.
Papain-Verdau von Antikörpern produziert zwei identische Antigen-bindende Fragmente, die als Fab-Fragmente bezeichnet werden, beide mit einer einzelnen Antigen-Bindungsstelle, sowie ein "Fc"-Restfragment, eine Bezeichnung die dessen leichte Kristallisierbarkeit andeutet. Pepsin-Behandlung ergibt ein F(ab')2-Fragment, welches zwei Antigen-bindende Stellen besitzt und immer noch in der Lage ist, Antigene zu vernetzen.
"Fv" ist das kleinste Antikörperfragment, das eine vollständige Antigen-Erkennungs- und -Bindungsstelle enthält. Diese Region besteht aus einem Dimer der variablen Domäne jeweils einer schweren und einer leichten Kette in enger, nicht-kovalenter Verknüpfung. Es ist dies die Konfiguration, in der die drei CDRs jeder variablen Domäne wechselwirken um eine Antigen-Bindungsstelle an der Oberfläche des VH-VL-Dimers zu definieren. Gemeinsam verleihen die sechs CDRs dem Antikörper seine Antigen-bindende Spezifität. Allerdings besitzt sogar eine einzelne variable Domäne (oder ein halbes Fv mit nur drei Antigen-spezifischen CDRs) die Fähigkeit zur Erkennung und Bindung von Antigen, obgleich mit niedrigerer Affinität als die gesamte Bindungsstelle.
Das Fab-Fragment enthält auch die konstante Domäne der leichten Kette und die erste konstante Domäne (CH1) der schweren Kette. Fab'-Fragmente unterscheiden sich von Fab-Fragmenten durch einige zusätzliche Reste am Carboxy-Terminus der CH1-Domäne der schweren Kette, einschließlich eines oder mehrerer Cystein-Reste der Hinge-Region des Antikörpers. Fab'-SH wird hierin für ein Fab gebraucht, in welchem der/die Cystein- Rest(e) der konstanten Regionen eine freie Thiol-Gruppe trägt/tragen. F(ab')&sub2;-Antikörper- Fragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten produziert, zwischen denen sich Hinge-Cysteine befinden. Andere chemische Kopplungen von Antikörperfragmenten sind ebenfalls bekannt.
Die leichten Ketten der Antikörper (Immunglobuline) aller Wirbeltier-Spezies können einem von zwei offensichtlich unterschiedlichen Typen zugeordnet werden, die aufgrund der Aminosäure-Sequenz ihrer konstanten Domänen als Kappa (K) und Lambda (λ) bezeichnet werden.
In Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer schweren Ketten können Immunglobulin zwei unterschiedlichen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf bedeutende Klassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere davon können in weitere Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden, z.B. IgG-1, IgG-2, IgG-3, und IgG-4; IgA-1 und IgA-2. Die konstanten Domänen der schweren Kette, welche den unterschiedlichen Klassen der Immunglobulin entsprechen, werden als α, δ, s, γ, und u bezeichnet. Die Strukturen und dreidimensionalen Konfigurationen der Untereinheiten der verschiedenen Immunglobulin-Klassen sind weithin bekannt.
Der Begriff "Antikörper" wird hierin im weitesten Sinne seiner Bedeutung verwendet und umfasst insbesondere sowohl einzelne monoklonale Antikörper, Antikörper-Gemische mit Polyepitop-Spezifität, als auch Antikörper-Fragmente (z.B., Fab, F(ab')&sub2;, und Fv), solange sie die gewünschten biologischen Eigenschaften aufweisen.
Der Begriff "monoklonaler Antikörper", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet einen Antikörper, der aus einer Population im Wesentlichen homogener Antikörper erhalten wird, d.h., die einzelnen Antikörper, aus denen sich die Population zusammensetzt, sind identisch - mit Ausnahme möglicher natürlich auftretender Mutationen, die in geringem Ausmaß vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind höchst spezifisch und gegen einzelne antigene Stellen gerichtet. Weiteres ist jeder monoklonale Antikörper - im Gegensatz zu konventionellen (polyklonalen) Antikörper-Präparaten, die typischerweise verschiedene Antikörper enthalten, die gegen verschiedene Determinänten (Epitope) gerichtet sind - spezifisch gegen eine einzelne Determinante am Antigen gerichtet. Zusätzlich zu ihrer Spezifität besitzen monoklonale Antikörper der Vorteil, dass sie in Hybridom-Kultur synthetisiert werden und daher nicht mit anderen lmmunglobulinen kontaminiert sind. Die Einschränkung "monoklonal" gibt zu verstehen, dass der Antikörper aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten wurde, und darf nicht dahingehend ausgelegt werden, dass die Produktion des Antikörpers die Anwendung eines bestimmten Verfahrens erfordert. Beispielsweise können die monoklonalen Antikörper, wie sie gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, mittels der erstmals von Köhler & Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschriebenen Hybridom-Methode, oder mittels DNA-Rekombinationsmethoden [siehe z.B. U.S. Patent Nr. 4.816.567 (Cabilly et al.)] hergestellt werden.
Die monoklonalen Antikörper umfassen hierin speziell auch "chimäre" Antikörper (Immunglobuline), in denen ein Teil der schweren und/oder leichten Kette identisch mit oder homolog zu den entsprechenden Sequenzen der von einer bestimmten Spezies abgeleiteten Antikörper ist oder einer bestimmten Antikörper-Klasse oder -Unterklasse angehört, während der Rest der Kette(n) identisch mit oder homolog zu den entsprechenden Sequenzen der von anderen Spezies abgeleiteten Antikörper ist oder einer anderen Antikörper-Klasse oder -Unterklasse angehören, sowie Fragmente solcher Antikörper, solange diese die gewünschten Eigenschaften aufweisen (U.S. Patent Nr. 4.816.567 (Cabilly et al.); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855 [1984]).
"Humanisierte" Formen nicht-humaner (z.B. Murin-) Antikörper sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulin-Ketten oder deren Fragmente (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')&sub2; oder andere Antigen-bindende Untersequenzen der Antikörper), die eine von nicht-humanen Antikörpern abgeleitete Minimalsequenz enthalten. Humanisierte Antikörper sind größtenteils humane Antikörper (Rezipienten-Antikörper), in welchen die Reste einer für die Erkennung der Antikörper verantwortlichen Region (CDR) des Rezipienten durch Reste einer CDR einer nicht-humanen Spezies (Donor-Antikörper), wie z.B. von Maus, Ratte, Katze oder Kaninchen, ersetzt sind, die die gewünschte Spezifität, Affinität und Kapäzität aufweisen. In manchen Fällen sind die Fv-Rahmen-Reste des humanen Immunglobulins durch die entsprechenden nicht-humanen Reste ersetzt. Weiters können die humanisierten Antikörper Reste umfassen, die weder im Rezipienten-Antikörper noch in der eingeführten CDR- oder Rahmen-Sequenz zu finden sind. Diese Modifikationen werden durchgeführt, um die Leistung der Antikörper weiter zu verfeinern und zu optimieren. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von mindestens einer oder typischerweise zweivariablen Domänen, in welchen alle oder fast alle der FR-Regionen jene einer humanen Immunglobulin-Konsens-Sequenz sind. Im Optimalfall umfasst der humanisierte Antikörper auch mindestens einen Teil einer konstanten Region (Fc) eines Immunglobulins, typischerweise die eines humanen Immunglobulins. (Zu weiteren Details siehe: Jones et al., Nature 321, 522-525 [1986]; Reichmann et al., Nature 332, 323-329 [1988]; und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 [1992]).
"Cytokin" ist ein allgemeiner Begriff für von einer einzelnen Zellpopulation freigesetzte Proteine, die auf andere Zellen als intrazelluläre Mediatoren wirken. Erfasst unter den Cytokinen sind die nativen Tumor-Nekrose-Faktoren-α und -β (TNF-α und -β), Interferone (INFs), wie z.B. INF-a, INF-β und INF-γ, Interleukine (lLs), wie z.B. IL-1, IL-2, IL-3, IL- 4; IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 usw., Wachstumshormone (GHs), einschließlich humanes Wachstumshormon (hGH), N-Methionyl-hGH; und Rinder-GH; Insulin-artige Wachstumsfaktoren, Nebenschilddrüsenhormon, Thyroxin, Insulin, Proinsulin, Relaxin, Prorelaxin, Glykoproteinhormone, wie z.B. follikelstimulierendes Hormon (FSH), thyroidstimulierendes Hormon (TSH), Lutenisierungshormon (LH), hämopoetischer Wachstumsfaktor (HGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Prolactin, Plazentalaktogen, Müllersche inhibierende Substanz, Mäuse-Gonadotropin-assoziiertes Peptid, Inhibin, Activin, Endothelgefäß- Wachstumsfaktor, Integrin, Thrombopoietin, Nerven-Wachstumsfaktor, wie z.B. NGF-β, PDGF, transformierende Wachstumsfaktoren (TGFs), wie z.B. TGF-α und TGF-β, Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-1 und -2 (IGF-1 und IGF-2), Erythropoietin, osteoinduktive Faktoren, koloniestimulierende Faktoren (CSFs), wie z.B. M-CSF, GM-CSF und G-CSF, und andere Polypeptid-Faktoren aller humanen und nicht-humanen Tierspezies sowie funktionelle Derivate solcher nativen Proteine. Die in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Cytokine sind durch die Entfaltung einer oder mehrerer der folgenden Eigenschaften charakterisiert: Stimulation der prokoagulierenden Aktivität; Stimulation der von natürlichen Killerzellen (NK) und Lymphokinaktivierten Killerzellen vermittelten Zytotoxizität, Makrophagen-Aktivierung, Stimulation der Fc-Rezeptor-Expression auf mononuclearen Zellen und Antikörper-abhängigen Zellzytotoxizität (ADCC) sowie Verstärkung der HLA-Klasse II Antigen-Expression. Bevorzugt sollten die erfindungsgemäß zu verwendenden Cytokine die Fähigkeit zur Stimulation prokoagulierender Aktivität besitzen. Besonders angesprochene Cytokine sind natives TNF-α und -β, lnterleukin-1 und -2, Interferon-γ, alleine oder in Kombination, und funktionelle Derivate dieser nativen Proteine.
Die Aminosäure- und Nucleotidsequenzen humaner und verschiedenster tierischer TNF- α sind dem Fach weithin bekannt. TNF-α wurde beschrieben von Perinica et al., Nature 312, 721 (1984); TNF-β (LT) wurde beschrieben von Gray et al., Nature 312, 724 (1984). Der Begriff "TNF-α" wie er in der Patentschrift und den Ansprüchen durchgehend verwendet wird, betrifft nativen Tumor-Nekrose-Faktor-α (nativen TNF-ct) und seine funktionellen Derivate. Die Ausdrücke "nativer Tumor-Nekrose-Faktor-α" und "nativer TNF-α", welche austauschbar verwendet werden, betreffen ein TNF-α-Polypeptid jeglicher humaner oder nicht-humaner Spezies, wie sie in der Natur vorkommt. Der Ausdruck "nativer humaner TNF-α", wie sie hierin verwendet wird, betrifft ein humanes Polypeptid mit der in den U.S Patenten Nr. 4.879.226, erteilt am 7. November 1989, und 5.288.852, erteilt am 22 Februar 1994, offenbarten Aminosäure-Sequenz, mit oder ohne das initiierende Methionin sowie mit oder ohne einer an den N-Terminus gebundenen Signalsequenz, ob es aus einer natürlichen Quelle gereinigt, synthetisiert, durch DNA-Rekombinationstechnologie oder mittels jeglicher Kombination dieser oder anderer Verfahren hergestellt wird.
Die Begriffe "Tumor-Nekrose-Faktor-β", "TNF-β", "Lymphotoxin" und "LT" werden austauschbar verwendet und betreffen einen nativen Tumor-Nekrose-Faktor-β (TNF-β) und seine funktionellen Derivate. Der Begriff "nativer TNF-β" bezeichnet ein Polypeptid jeglicher humaner oder nicht-humaner Spezies, wie es in der Natur vorkommt. "Nativer humaner TNF-β", "natives humanes Lymphotoxin", oder "natives humanes LT" ist ein humanes Polypeptid wie im U.S Patent Nr. 4.920.196, erteilt am 24. April 1990, offenbart, mit oder ohne das initiierende Methionin sowie mit oder ohne einer an den N-Terminus gebundenen Signalsequenz, mit oder ohne assoziierte Glykosylierung, ob es aus einer natürlichen Quelle gereinigt, synthetisiert, durch DNA-Rekombinationstechnologie oder mittels jeglicher Kombination dieser oder anderer Verfahren hergestellt wird.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe "Gamma-Interferon", "Interferon-Gamma", und "INF-γ" austauschbar verwendet und betreffen ein natives INF-y und seine funktionellen Derivate. Die Phrase "natives INF-γ" wird verwendet zur Bezeichnung von INF-γ jeglicher humaner oder nicht-humaner Tierspezies, wie es in der· Natur vorkommt. Die Begriffe "natives humanes Gamma-Interferon", "natives humanes Interferon-Gamma" und "natives humanes INF-γ" betreffen ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, wie sie von Gray et al., Nature 295, 503-508 (1982), und in den U.S Patenten Nr. 4.762.791, 4.929.544, 4.727.138 und 4.925.793 offenbart sind, ohne Rücksicht darauf, auf welche Weise es hergestellt wird. Das rekombinante humane INF-γ von Gray und Geoddel, wie es in E. coli produziert wird, besteht aus 146 Aminosäuren, wobei die N-terminale Position des Moleküls mit der Sequenz CysTyrCys beginnt. Später wurde gefunden, dass das native humane INF-y (d.h. jenes, das aus der Mitogen-Induktion humaner peripherer Blut-Lymphozyten und anschließender Reinigung hervorgeht) ein Polypeptid ist, bei welchem der von Gray et al., s.o., zugeordnete CysTyrCys-N-Terminus fehlt. In letzter Zeit wurde die Kristallstruktur des von E. coli abgeleiteten rekombinanten humanen INF-γ (rhINF-γ) aufgeklärt [Ealick et al., Science 252, 698-702 (1991)], wobei sich zeigte, dass das Protein als ein eng verdrehtes, nicht-kovalentes Homodimer vorliegt, in dem die beiden identischen Polypeptidketten antiparallel orientiert sind.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung werden die Ausdrücke "Interleukin-1" und "IL-1" austauschbar verwendet, und betreffen gemeinsam native IL-1-Polypeptid-Hormone, einschließlich natives lnterleukin-1α (IL-1α) und natives lnterleukin-1β (IL-1β) und ihre funktionellen Derivate. Die Verwendung der Begriffs "natives IL-1" bezieht sich auf IL-1 jeglicher humaner und nicht-humaner Tierspezies, wie es in der Natur vorkommt. Der Audruck "natives humanes IL-1" betrifft natives IL-1α und natives IL-1β humaner Herkunft wie in den U.S. Patenten Nr. 4.894.333 und 4.879.374 beschrieben, ohne Rücksicht auf die Art und Weise ihrer Herstellung. Die IL-1α- und IL-1β-Proteine wurden ursprünglich beide als IL-1 klassifiziert, basierend auf einer gemeinsamen Lymphozyten- Aktivierungsfaktor-Aktivität und ihrem häufigen Vorkommen in aktivierten Makrophagen. Obwohl nun bekannt ist, dass ihre Strukturen nur entfernt verwandt sind, werden beide in Anbetracht ihrer gemeinsamen biologischen Aktivitäten im Begriff "IL-1" zusammengefasst.
Der Begriff "Induktor der Cytokin-Produktion", wie er hierin verwendet wird, betrifft jegliche Verbindungen oder Eingriffe, die zu einer Induktion der in vivo-Cytokin-Produktion im behandelten Patienten führen. Bevorzugt wird die Induktion eines Cytokins mit einer oder mehrerer der folgenden Eigenschaften: Stimulation der prokoagulierenden Aktivität, Stimulation der von natürlichen Killerzellen (N K) und Lymphokin-aktivierten Killerzellen vermittelten Zytotoxizität, Makrophagen-Aktivierung, Stimulation der Fc-Rezeptor-Expression auf einkernige Zellen und Antikörper-abhängigen Zellzytotoxizität- (ADCC), sowie Verstärkung der HLA-Klasse II-Antigen-Expression. Bevorzugt hat das induzierte Cytokin die Fähigkeit zur Stimulation prokoagulierender Aktivität. Besonders bevorzugte Cytokine sind TNF-α und -β, lnterleukin-1 und -2, Interferon-γ, insbesondere TNF-β.
Ein "funktionelles Derivat" eines nativen Polypeptids ist eine Verbindung, die eine qualitative biologische Aktivität mit dem nativen Polypeptid gemein hat. Beispielsweise ist ein funktionelles Derivat eines nativen TNF-α und TNF-β eine Verbindung, die eine qualitative biologische Aktivität mit einem nativen TNF-α- bzw. TNF-β-Polypeptid gemein hat. "Funktionelle Derivate" umfassen - sind aber nicht beschränkt auf - Fragmente nativer Polypeptide jeglicher Tierspezies (einschließlich des Menschen) und Derivate nativer (humaner und nicht-humaner) Polypeptide und ihrer Fragmente, vorausgesetzt, dass sie eine biologische Aktivität mit einem entsprechenden nativen Polypeptid gemein haben. "Fragmente" umfassen Regionen innerhalb einer Sequenz des reifen nativen Polypeptids. Der Begriff "Derivat" wird verwendet, um Aminosäuresequenzen und Gykosylierungs-Varianten zu definieren, sowie kovalente Modifikationen des nativen Polypeptids, während der Begriff "Varianten" Aminosäure-Sequenzen und Glykosylierungs- Varianten innerhalb dieser Definition betreffen. Bevorzugt handelt es sich bei den funktionellen Derivaten um Polypeptide, deren Aminosäuresequenz mindestens zu etwa 65%, mehr bevorzugt zu etwa 75%, noch mehr bevorzugt zu mindestens etwa 85%, und insbesondere zu mindestens etwa 95% identisch zu der Sequenz eines entsprechenden nativen Polypeptids ist. Aminosäure-Sequenzvarianten von TNF-α, welche sich nur an eine der beiden bekannten nativen TNF-Rezeptoren binden und bei denen deshalb eine geringere Toxizität zu erwarten ist als bei den entsprechenden nativen TNF-α, liegen ausdrücklich innerhalb der Definition für TNF-α-funktionelle Derivate. Solche Varianten besitzen eine AminosäUre-Abweichung an der Stelle 86 und sind in der EP-A- 563.714 beschrieben.
Identität oder Homologie in Bezug auf das native Polypeptid und seine funktionellen Derivate wird hierin als der Prozent-Anteil der Aminosäure-Reste in der Anwärter-Sequenz definiert, der mit den Resten des entsprechenden nativen Polypeptids identisch ist, und zwar, falls notwendig, anschließend an die Ausrichtung der Sequenz und Einführung von Lücken, um den maximalen Prozent-Anteil an Homologie zu erzielen, und ohne jedwede konservative Substitutionen als Teil der Sequenzidentität zu berücksichtigen. Weder N- oder C-terminale Extensionen noch Insertionen, die die Identität oder Homologie verringern, sind zu konstruieren.
"Biologische Aktivität" im Zusammenhang mit der Definition von "funktionellen Derivaten" der erfindungsgemäß zu verabreichenden nativen Cytokine ist definiert als der Besitz zumindest einer der folgender Eigenschaften: Stimulation der prokoagulierenden Aktivität, Stimulation der von natürlichen Killerzellen (NK) und Lymphokin-aktivierten Killerzellen vermittelten Zytotoxizität, Makrophagen-Aktivierung, Stimulation der Fc-Rezeptor-Expression auf mononuklearen Zellen und Antikörper-abhängigeü Zellzytotoxizität (ADCC), und Verstärkung der HLA-Klasse II Antigen-Expression. Die biologische Aktivität der Cytokine wird gewöhnlich mit gut etablierten Zell-Tests auf Zytotoxizität getestet, wie z.B. mittels Tests, die auf der Abtötung von L929-Zelleil oder davon abgeleiteter Ziellinien basieren.
Der Begriff "Aminosäure" und "Aminosäuren" betrifft alle natürlich auftretenden L-α- Aminosäuren. Mit dieser Definition sind auch Norleucine, Orthinine, und Homocysteine gemeint. Die Aminosäuren werden entweder durch Einbuchstaben- oder durch Dreibuchstaben-Bezeichnungen identifiziert:
Diese Aminosäuren können entsprechend der chemischen Zusammensetzung und der Eigenschaften ihrer Seitenketten klassifiziert werden. Sie werden grob in zwei Gruppen eingeteilt: geladene und ungeladene. Jede dieser Gruppen wird in Untergruppen unterteilt um die Aminosäuren genauer zu klassifizieren:
I. Geladene Aminosäuren
Saure Reste: Asparaginsäure, Glutaminsäure
Basische Reste: Lysin, Arginin, Histidin
II. Ungeladene Aminosäuren
Hydrophile Reste: Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin
Aliphatische Reste: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin
Apolare Reste: Cystein, Methionin, Prolin
Aromatische Reste: Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan
Der Begriff "Aminosäure-Sequenzvariante" betrifft Moleküle mit einigen Unterschieden in ihren Aminosäure-Sequenzen im Vergleich mit dem eines entsprechenden nativen Polypeptids oder eines seiner Fragmente. Gewöhnlich werden die Aminosäure-Sequenzvarianten mindestens etwa 65%, bevorzugt mindestens etwa 75%, mehr bevorzugt mindestens etwa 85%, insbesondere mindestens etwa 95% Homologie zu der Aminosäure-Sequenz eines nativen Polypeptids aufweisen, oder werden alternativ durch DNA kodiert, die in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement des entsprechenden nativen Polypeptids zu hybridisieren.
Substitutions-Varianten sind jene, bei denen mindestens ein Aminosäure-Rest in der nativen Sequenz entfernt und stattdessen durch eine andere Aminosäure an derselben Stelle ersetzt ist. Die Substitutionen können einzeln sein, wobei im Molekül nur eine Aminosäure substituiert worden ist, oder sie können mehrfach sein, wobei zwei oder mehrere Aminosäuren im selben Molekül substituiert worden sind.
Insertions-Varianten sind jene, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren unmittelbar neben einer Aminosäure an einer bestimmten Stelle der nativen Aminosäure-Sequenz insertiert sind. Unmittelbar neben einer Aminosäure heißt gebunden entweder an der funktionellen α-Carboxy oder α-Amino-Gruppe der Aminosäure.
Deletions-Varianten sind jene, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren aus der nativen Aminosäure-Sequenz entfernt sind. Gewöhnlich sind bei Deletions-Varianten eine oder zwei Aminosäuren in einer bestimmten Region des Moleküls deletiert.
Der Begriff "Glykosylierungs-Variante" wird verwendet in Bezug auf ein Molekül mit einem Glykosylierungs-Profil, welches sich von dem eines entsprechenden nativen Polypeptids unterscheidet. Die Glykosylierung von Polypeptiden ist typischerweise entweder N-verknüpft oder O-verknüpft. N-verknüpft betrifft die Anbindung des Kohlenhydrat- Teils an die Seitenkette eines Asparagin-Restes. Die Tripeptid-Sequenzen, Asparagin-X- Serin und Asparagin-X-Threonin, wobei X eine beliebige Aminosäure außer Prolin bezeichnet, sind Erkennungssequenzen für die enzymatische Anbindung des Kohlenhydrat-Teils an die Asparagin-Seitenkette. O-verknüpfte Glykosylierung betrifft die Anbindung einer der Zucker N-Acetylgalactosamin, Galactose, oder Xylose an eine Hydroxy- Aminosäure, meistens Serin oder Threonin, obwohl 5-Hydroxyprolin und 5-Hydroxylysin ebenfalls an der O-verknüpften Glykosylierung beteiligt sein können. Jeder in einer Variante oder in einem Fragment vorhandene Unterschied in der Lokalisation und/oder Natur der Kohlenhydrat-Teile im Vergleich zum nativen Gegenstück liegt innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung.
Das Glykosylierungsmuster von nativen Polypeptiden kann mittels gut bekannter Analysenverfahren bestimmt werden, einschließlich HPAE-Chromatographie [Hardy, M.R. et al., Anal. Biochem. 170, 54-62 (1988)], Methylierungsanalyse zur Bestimmung der Zusammensetzung der Glykosyl-Biridung [Lindberg, B., Meth. Enzymol. 28, 178-195 (1972); Waeghe, T.J. et al., Carbohydr. Res. 123, 281-304 (1983)], NMR-Spektroskopie, Massenspektrometrie, usw.
"Kovalente Derivate" umfassen Modifikationen des nativen Polypeptids oder dessen Fragmente mit einem proteinhaltigen oder nicht-proteinhaltigen Derivatisierungsreagens, sowie post-translationelle Modifikationen. Kovalente Modifikationen werden traditionellerweise eingeführt, indem die Ziel-Aminosäure mit einem organischen Derivailsierungsreagens umgesetzt wird, welches in der Lage ist, mit ausgesuchten Seitenketten oder terminalen Resten zu reagieren, oder durch Modifikations-Mechanismen der posttranslationellen Modifikationen, die in ausgesuchten rekombinanten Zellen wirken. Bestimmte post-translationelle Modifikationen sind das Resultat der Wirkung rekombinanter Wirtszellen auf das exprimierte Polypeptid. Glutaminyl- und Asparagyl-Reste werden häufig post-translationell zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten desamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen desamidiert. Beide Formen dieser Reste können in den funktionellen Derivaten nativer Cytokin-Polypeptide, wie sie in der vorliegenden Erfindung definiert sind, vorhanden sein. Andere post-translationelle Modifikationen umfassen die Hydroxyfierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung der Hydroxygruppen von Seryl- und Threonyl-Resten, die Methylierung der a-Aminogruppen der Lysin-, Arginin-, und Histidin-Seitenketten [T.E. Creighton, "Proteins: Structure and Molecular Properties", W.H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79-86 (1933)].
Der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge einer Kombination aus einem Thrombomodulin-Inhibitor und einem Cytokin oder einem Induktor der Cytokin-Produktion (Cytokin-Induktor)" wird hierin in Bezug auf eine Dosierung verwendet, bei der der Thrombomodulin-Inhibitor und das Cytokin oder der Cytokin-Induktor in Kombination die hämorrhagische Nekrose des Tumors verursacht. "Wirksame" Behandlung resultiert bevorzugt in einer sichtbaren Tumor-Rückbildung und in einer Verbesserung der Lebensqualität des Patienten. Am meisten bevorzugt resultiert die Behandlung in einer Erhöhung der Lebenserwartung des behandelten Patienten.
Der Begriff "Kombination" im vorangegangenen Ausdruck bedeutet die kombinierte Anwendung eines Thrombomodulin-Inhibitors und eines Cytokins oder eines Induktors der Cytokin-Produktion, entweder gleichzeitig oder nacheinander, in jeder beliebigen Reihenfolge. Wenn Thrombomodulin-lnhibitor und Cytokin oder Cytokin-Induktor nacheinander verabreicht werden, sollte die Verabreichung zu ausreichend nahe aufeinander folgenden Zeitpunkten erfolgen, sodass die Ausübung der biologischen Aktivitäten der betreffenden Komponenten in einem überlappenden Zeitrahmen gewährleistet ist. Folglich umfasst der Begriff "Kombination", wie er oben verwendet wird, insbesondere die aufeinander folgende Verabreichung eines Thrombomodulin-Inhibitors und eines Cytokins oder eines Induktors der Cytokin-Produktion in Abständen von mehreren Stunden (z.B. 3-4 Stunden), in beliebiger Reihenfolge.

B. Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Patient, dem ein solider mikrovaskulärer Tumor diagnostiziert wird, mit einem aktivstellenblockierten Thrombin und einem Cytokin, z.B. Lymphotoxin (LT) behandelt.
Thrombin kann aus Prothrombin mittels einer Reihe von Verfahren hergestellt werden, wie z.B. jenen, die von Miletich, J. et al., J. Biol. Chem. 253, 6908 (1978); Morita, T. et al.,J. Biochem. 79, 1091 (1986); Franza, R.B. et al., J. Biol. Chem. 250, 7057-7068 (1975); Fenton, J.W. et al., Biochim. Biophys. Acta 229, 26 (1971), beschrieben wurden.
Thrombin ist ein Teil der gut charakterisierten Familie der Serin-Proteasen. Diese Proteine katalysieren die Spaltung von Peptid-Bindungen anderer Proteine und haben eine gemeinsame dreidimensionale Struktur. Die Lokalisätion und Funktion der essentiellen Aminosäuren für die Aktivität und Katalyse sind identifiziert worden (Stroud, R.M. et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 6, 177 [1977]; Bode, W. et al,), Mol. Biol. 118, 99 [1978]; Kraut, J., Annu. Rev. Biophys. Eng. 6, 177 [1982]). Alle Mitglieder der Familie besitzen einen konservativen Katalysemechanismus, wobei die entscheidenden Reste der aktiven Stelle aus His&sup5;&sup7;, Asp¹&sup0;², und Ser¹&sup9;&sup5; bestehen, und die Nummerierung, gemäß der anerkannten Konvention, auf der Aminosäure-Nummerierung des Chymotrypsins beruht.
Die Spezifität für die abzuspaltenden Reste wird vom Rest an Position 189 bereitgestellt. Im Falle der blutkoagulierenden Proteasen ist der Rest an Position 189 eine Asparaginsäure, was die Spezifität dieser Proteasen für die Spaltung an Arginin- oder Lysin-Resten bewirkt.
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende, in der experimentellen Arbeit verwendete Thrombin, wurde mit einem für die aktive Stellen spezifischen Reagens, D- PheProArg-Chlormethylketon (PPACK), wie im Beispiel 1 beschrieben, inaktiviert. Allerdings sind auch andere Reagenzien, wie z.B. andere Tripeptid-Chlormethylketone, z.B. D-TyrProArg-Ch lormethylketon (YPACK), Bachem Bioscience, Inc., Philadelphia), und die Inhibitoren der aktiven Stelle von Thrombin, wie in der EP-A-589.741 offenbart, geeignet. Im Allgemeinen kann die Inaktivierung mit jedem Reagens erzielt werden, das mit einem Rest der aktiven Stelle des Thrombins kovalent reagiert, wie z.B. PPACK, YPACK, Diisopropylfluorophosphat, p-Toluylsulfonylsinechloromethylketon usw., oder das zu einer nicht-kovalenten, hochaffinen Assoziation mit der aktiven Stelle des Thrombins in der Lage ist, vorausgesetzt, dass das resultierende Thrombin seine Fähigkeit zur Bindung an Thrombömodulin nach wie vor beibehält.
Alternativ dazu kann eine katalytisch inaktive Thrombin-Variante durch Verfahren der DNA-Rekombinationstechnologie erzeugt werden, z.B. durch ortsgerichtete Mutagenese der DNA, die für natives Thrombin oder eine bereits hergestellte Thrombin-Variante kodiert. Dies kann z.B. erreicht werden, indem beliebige der Reste der aktiven Stelle (His&sup5;&sup7;, Asp¹&sup8;&sup9; und/oder Ser¹&sup9;&sup5;) zu Aminosäure(n) verändert werden, die unfähig ist/sind, die Katalyse zu erleichtern. Alternativ kann die Bindungstasche modifiziert werden: Die Umwandlung von Asp¹&sup8;&sup9; zu Glu oder ähnlichen Resten kann zu einem Molekül führen, das zur Spaltung an den Arg- oder Lys-Resten nicht in der Lage ist (und daher nicht in der Lage ist, Protein C zu aktivieren), während es die Fähigkeit zur Bindung von Thrombomodulin beibehält. Zusätzliche Reste, welche die Substratspaltung stören sollten, während sie die Bindung von Thrombomodulin nicht beeinflussen, finden sich im Übersichtsartikel von Bode und Stubbs, s.o., Fig. 2. Solche Mutationen (Aminosäure-Substitutionen), alleine oder in Kombination, liegen ebenfalls innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung.
Orte oder Regionen, die für Substitutionen identifiziert worden sind, welche die katalytische Funktion von Thrombin stören, ohne dessen Fähigkeit zur Bindung von Thrombomodulin zu beeinflussen, werden dann in der Regel seriell modifiziert, z.B. (1) indem zunächst mit einer konservativen Auswahl substituiert wird und anschließend, in Abhängigkeit von den erzielten Ergebnissen, mit einer radikaleren Auswahl, (2) Deletion des/- der Ziel-Restes oder Reste, oder (3) Insertion von Resten derselben oder einer unterschiedlichen Klasse an einer zum lokalisierten Ort benachbarten Stelle, oder durch Kombinationen der Optionen 1-3.
Eine hilfreiche Technik wird als "Alanin-Scanning" bezeichnet (Cunningham und Wells, Science 244, 1081-1085 [1989]). Hier wird ein Restoder eine Gruppe von Ziel-Resten identifiziert und durch Alanin oder Polyalanin substituiert. Jene Domänen, die gegenüber Alanin-Substitutionen eine funktionelle Sensitivität zeigen, werden dann durch Einführung weiterer oder anderer Substituenten an den oder statt der Orte(n) der Alanin- Substitution verfeinert.
Nach der Identifizierung der gewünschten Mutation(en), kann das Gen, welches für die gewünschte Variante kodiert, unter Verwendung einer der von Engels und Uhlmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 28, 716 (1989), beschriebenen Verfahren durch chemische Synthese erhalten werden. Diese Verfahren umfassen Triester-, Phosphit-, Phosphoramidit- und H-Phosphonat-Methoden, PCR und andere Autoprimer-Methoden, und Oligonucleotid-Synthesen auf festen Trägern.
Mehr bevorzugt wird DNA, welche für eine gewünschte aktivstellenblockierte Aminosäure-Sequenzvariante kodiert, durch ortsgerichtete Mutagenese einer DNA hergestellt, die für eine früher hergestellte Variante oder eine nonvariante Version des Thrombinmoleküls kodiert. Ortsgerichtete (ortsspezifische) Mutagenese erlaubt die Herstellung von Thrombin-Varianten über die Verwendung spezifischer Oligonucleotidsequenzen, welche für die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation kodiert, sowie eine ausreichende Anzahl benachbarter Sequenzen zur Bereitstellung einer Primersequenz ausreichender Größe und Sequenz-Komplexität, um einen stabilen Doppelstrang an beiden Seiten der zu überspannenden Deletionsverbindung zu bilden. Typischerweise wird ein Primer von 20 bis 25 Nucleotiden mit etwa 5 bis 10 Resten an beiden Seiten der Verknüpfung der zu ändernden Sequenz bevorzugt. Im Allgemeinen sind die Techniken der ortsspezifischen Mutagenese fachbekannt, beispielsweise in Publikationen wie Edelman et al., DNA 2, 183 (1983). Bekanntlich verwendet die Technik der ortspezifischen Mutagenese typischerweise einen Phagen-Vektor, der sowohl in einzelsträngiger als auch in doppelsträngiger Form existiert. Typische Vektoren, die für die ortsgerichtete Mutagenese geeignet sind, umfassen Vektoren, wie z.B. den M13-Phagen, wie z.B. offenbart von Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, A. Walton (Hrsg.), Elsevier, Amsterdam (1981). Dieser oder andere Phagen-Vektoren sind im Handel erhältlich, und deren Gebrauch ist fachlich qualifizierten Leuten weithin bekannt. Eine vielseitiges und effizientes Verfahren zur Konstruktion von Oligodesoxyribonucleotid-gerichteten ortsspezifischen Mutationen in DNA-Fragmenten unter Verwendung von M13-abgeleiteter Vektoren wurde von Zoller, M.J. und Smith, M., Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500 (1982), publiziert. Ebenso können Vektoren, die einen einzelsträngigen Phagen-Replikationsstartpunkt enthalten (Veira et al., Meth. Enzymol. 153, 3 (1987)), verwendet werden, um einzelsträngige DNA zu erhalten. Alternativ können Nucleotid-Substitutionen durch in vivo Synthese des geeigneten DNA-Fragments und Amplifikation mit fachbekannten PCR-Verfahren eingeführt werden.
Im Allgemeinen wird hierin die ortsspezifische Mutagenese durchgeführt, indem zunächst ein einzelsträngiger Vektor erhalten wird, der in seiner Sequenz eine DNA-Sequenz enthält, welche für das relevante Protein kodiert. Ein Oligonucleotidprimer, der die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird gewöhnlich synthetisch hergestellt, z.B. nach dem Verfahren von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978). Der Primer wird dann mit dem Einzelstrang-Proteinsequenz-enthaltenden Vektor anneliert, und DNA-polymerisierenden Enzymen, wie z.B. Polymerase I Klenow-Fragment aus E. coli, unterworfen, um die Synthese des mutationstragenden Strangs zu vervollständigen. Auf diese Weise wird ein Heteroduplex gebildet, in dem ein Strang für die ursprüngliche, nichtmutierte Sequenz kodiert, und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplex-Vektor wird dann verwendet, um geeignete Wirtszellen, wie z.B. JP101-Zellen, zu transformieren, und es werden Klone selektiert, die die rekombinanten Vektoren mit der mutierten Sequenz-Anordnung enthalten. Danach kann die mutierte Region entfernt und in einen geeigneten Expressionsvektor für die Proteinproduktion eingesetzt werden.
Die PCR-Technik kann auch zur Erzeugung von Aminosäure-Sequenzvarianten eines Thrombinmoleküls eingesetzt werden. Wenn kleine Mengen von Templat-DNA als Ausgangsmaterial in der PCR verwendet werden, können Primer, die sich in ihrer Sequenz von der entsprechenden Region der Templat-DNA nur leicht unterscheiden, verwendet werden, um relative große Mengen eines spezifischen DNA-Fragments zu erzeugen, welches sich von der Templat-Sequenz nur an denjenigen Positionen unterscheidet, an denen sich die Primer vom Templat unterscheiden. Zur Einführung einer Mutation in eine Plasmid-DNA wird einer der Primer so entworfen, dass er die Position der Mutation überlappt und die Mutation enthält; die Sequenz des anderen Primers muss mit einer Sequenzstrecke des entgegengesetzten Strangs des Plasmids identisch sein, jedoch kann diese Sequenz irgendwo entlang der Plasmid-DNA positioniert sein. Es wird jedoch bevorzugt, dass die Sequenz des zweiten Primers innerhalb von 200 Nucleotiden von der des ersten Primers lokalisiert ist, sodass am Ende die gesamte amplifizierte Region der von den Primern gebundenen DNA leicht sequenziert werden kann. PCR-Amplifizierung unter Verwendung von Primer-Paaren, wie sie gerade oben beschrieben wurde, liefert eine Population von DNA-Fragmenten, die sich an der vom Primer spezifizierten Mutationsstelle und möglicherweise an anderen Stellen unterscheiden, da das Templat- Kopieren etwas fehleranfällig ist.
Wenn das Verhältnis von Templat zu Produktmaterial extrem niedrig ist, enthält der allergrößte Teil der DNA-Fragment-Produkte die gewünschte(n) Mutation(en). Dieses Produktmaterial wird zum Ersatz derjenigen entsprechenden Region im Plasmid verwendet, die unter Verwendung von Standard-DNA-Technologie als PCR-Templat diente. Mutationen an gesonderten Positionen können gleichzeitig eingeführt werden, indem entweder ein zweiter mutierter Primer verwendet wird, oder indem eine zweite PCR mit unterschiedlichen mutierten Primern durchgeführt wird ind die beiden resultierenden PCR-Fragmente simultan in einer Drei- oder Mehrkomponenten-Ligation ligiert werden.
In einem spezifischen Beispiel für PCR-Mutagenese wird Templat-Plasmid-DNA (1 ug) durch Verdau mit Restriktions-Endonuclease linearisiert, die eine einzigartige Erkennungsstelle in der Plasmid-DNA außerhalb der zu amplifizierenden Region besitzt. 100 ng dieses Materials werden einer PCR-Mischung zugegeben, welche PCR-Puffer, der die vier Desoxynucleotid-Triphosphate enthält und in den GenAmpR-Kits (erworben von Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT und Emeryville, CA) inkludiert ist, sowie 25 umol jedes Olinucleotidprimers in einem Endvolumen von 35 ul enthält. Das Reaktionsgemisch wird mit 35 pl Mineralöl überschichtet. Die Reaktion wird für 5 Minuten bei 100ºC denaturiert, kurz auf Eis gelegt, worauf 1 ul (Tag) DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (5 Units/I, erworben von Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT und Emeryville, CA) unter die Mineralölschicht zugegeben wird. Das Reaktionsgemisch wird dann in einen folgendermaßen programmierten DNA-Thermocycler (erworben von Perkin-Elmer Cetus) eingesetzt:
2 min bei 55ºC,
30 s bei 72ºC, dann 19 der folgenden Zyklen:
30 s bei 94ºC,
30 s bei 55ºC und
30 s bei 72ºC.
Nach dem Ende des Programms wird das Reaktionsgefäß aus dem Thermocycler entfernt und die wässrige Phase in ein neues Gefäß transferiert, mit Phenol/Chloroform (50 : 50 Vol-%) extrahiert und in Ethanol gefällt, und die DNA wird mittels Standardmethoden gewonnen. Das Material wird anschließend geeigneten Behandlungen für die Insertion in einen Vektor unterworfen.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung aktivstellenblockierter Substitutionsvarianten des Thrombins, die Kassetten-Mutagenese, basiert auf der Technik von Wells et al. [Gene 34, 315 (1985)]. Das Ausgangsmaterial ist jenes Plasmid (oder Vektor), das (der) die zu mutierende Thrombin-DNA enthält. Das/die innerhalb des Thrombinmoleküls zu mutierende(n) Codon(s) werden identifiziert. An jeder Seite der identifizierten Mutationsstelle(n) muss eine einzigartige Restriktionsstelle für Endonuclease vorhanden sein. Falls solche Restriktionsstellen nicht existieren, können sie mittels der oben beschriebenen Oligonucleotid-vermittelten Mutagenesemethode erzeugt werden, um diese an geeigneten Stellen der Thrombin-DNA einzuführen. Nachdem die Restriktionsstellen in das Plasmid eingeführt worden sind, wird das Plasmid an diesen Stellen geschnitten, um es zu linearisieren. Ein doppelsträngiges Oligonucleotid, welches für die Sequenz der DNA zwischen der Restriktionsstelle kodiert, jedoch die gewünschte(n) Mutation(en) enthält, wird nach Standard-Verfahren synthetisiert. Die beiden Stränge werden getrennt synthetisiert und dann unter Verwendung von Standard-Techniken hybridisiert. Dieses doppelsträngige Oligonucleotid wird als Kassette bezeichnet. Diese Kassette ist so entworfen, dass sie 3' und 5'-Enden besitzt, die mit den Enden des linearisierten Plasmids kompatibel sind, sodass es direkt mit dem Plasmid ligiert werden kann. Dieses Plasmid enthält nun die mutierte Thrombin-DNA-Sequenz.
Zusätzlich kann die sogenannte Phlagmeid-Display-Methode dazu geeignet sein, um Aminosäure-Sequenzvarianten von nativen oder Varianten-Thrombin-Molekülen herzustellen. Diese Methode beinhaltet (a) die Konstruktion eines replizierbaren Expressionsvektors umfassend ein erstes Gen, welches das zu mutierende Thrombin enthält, ein zweites Gen, welches zumindest einen Teil eines natürlichen oder Wildtyp-Phagen- Hüllproteins kodiert, wobei das erste und zweite Gen heterolog sind, und ein Transkriptions-Regulationselement, welches mit dem ersten und zweiten Gen operabel verbunden ist, sodass eine Genfusion gebildet wird, die für ein Fusionsprotein kodiert; (b) die Mutation des Vektors an einer oder mehrerer ausgewählten Position innerhalb des ersten Gens, sodass eine Familie verwandter Plasmide gebildet wird; (c) die Transformation von geeigneten Wirtszellen mit dem Plasmid; (d) die Infektion der transformierten Wirtszellen mit einem Helferphagen, welches ein Gen des Phagen-Hüllproteins kodiert; (e) die Kultivierung der transformierten, infizierten Wirtszellen unter Bedingungen, die für die Bildung rekombinanter Phagemid-Partikel geeignet sind, die mindestens einen Teil des Plasmids enthalten und in der Lage sind, den Wirt zu transformieren, wobei die Bedingungen so eingestellt sind, dass nicht mehr als eine minimale Menge der Phagemid- Partikel mehr als eine Kopie des Fusionsproteins an der Oberfläche der Partikel aufweisen; (f) das Kombinieren der Phagemid-Partikel mit einem geeigneten Antigen, sodass sich zumindest ein Teil des Phagemid-Partikels an das Antigen bindet; und (g) die Trennung der bindenden Phagemid-Partikel von denen, die sich nicht binden. Die Schritte (d) bis (g) können mehrmals wiederholt werden. Bevorzugt steht das Plasmid bei dieser Methode unter strenger Kontrolle des Transkriptions-Regulationselements, und die Kultivierungsbedingungen werden so eingestellt, dass die Menge oder Anzahl der Phagemid- Partikel, die mehr als eine Kopie des Fusionsproteins an der Oberfläche des Partikels tragen, kleiner als 1% ist. Ebenso wird bevorzugt, dass die Menge an Phagemid-Partikeln, die mehr als eine Kopie des Fusionsprotein tragen, weniger als 10% der Menge an Phagemid-Partikeln beträgt, die eine einzelne Kopie des Fusionsproteins tragen. Am meisten bevorzugt beträgt die Menge weniger als 20%. Typischerweise umfasst in dieser Methode der Expressionsvektor weiters eine an die DNA fusionierte Sekretions-Signalsequenz und kodiert für alle Untereinheiten des Polypeptids, und das Transkriptions-Regulationselement ist ein Promotor-System. Die bevorzugten Promotor-Systeme werden aus den lac Z-, λPL-, tac-, T7-Polymerase-, Tryptophan- und alkalische Phosphatase-Promotoren und Kombinationen davon ausgewählt. Weiters nutzt das Verfahren gewöhnlich einen Helferphagen, ausgewählt aus M13K07; M13R408, M13-VCS, und Phi · 174. Der bevorzugte Helferphage ist M13K07, und das bevorzugte Hüllprotein ist das M13-Phagen-Gen III-Hüllprotein. Der bevorzugte Wirt ist E. coli sowie proteasedefiziente Stämme von E. coli.
Weitere Details der vorangegangenen und ähnlichen Mutagenese-Techniken finden sich in allgemeinen Lehrbüchern, wie z.B. Sambrook et al., "Molecular Cloning; A Laboratory Manual", 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989, und "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al. (Hrsg.), Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 1991.
Alternativ können die katalytisch inaktiven Thrombin-Varianten, bei denen die Fähigkeit zur Bindung von Thrombomodulin erhalten bleibt, durch Deletion einer oder mehrerer der Aktivstellen-Reste oder anderer Reste oder Regionen, die für Veränderungen mit einer oder mehrerer der vorangegangenen Techniken identifiziert worden sind, hergestellt werden. Deletions-Varianten des nativen Thrombins können im Wesentlichen nach den zuvor beschriebenen ortsspezifischen Mutagenese-Techniken hergestellt werden, um Aminosäure-Substitutionen in das Thrombin-Molekül einzuführen. Zusätzlich kann, wie in Abschnitt 15.3 von Sambook et al., s.o., beschrieben, Restriktioris-Endonuclease-Verdau von DNA, gefolgt von Ligation verwendet werden, um aktivstellendeletierte Thrombin-Varianten zu generieren. Um diese Methode zu verwenden, ist zu bevorzugen, dass die Fremd-DNA in einen Plasmid-Vektor insertiert wird. Eine Restriktionskarte sowohl der insertierten DNA, als auch des Vektors muss bekannt sein. Die insertierte DNA muss einzigartige Restriktionsstellen besitzen, die im Vektor nicht vorhanden sind. Deletionen können dann an der insertierten DNA durchgeführt werden, indem man sie zwischen diesen einzigartigen Restriktionsstellen verdaut, unter Verwendung der geeigneten Restriktions-Endonucleasen bei den vom Hersteller der Enzyme empfohlenen Bedingungen. Falls die Restriktionsenzyme glatte oder kompatible Enden erzeugen, können die Enden direkt miteinender ligiert werden, unter Verwendung einer Ligase, wie z.B. T4 DNA-Ligase, und Inkubation der Mischung für 1-4 Stunden bei 16ºC in Gegenwart von ATP und Ligase-Puffer, wie von Sambrook et al., s.o., im Abschnitt 1.68 beschrieben wurde. Falls die Enden nicht kompatibel sind, müssen sie zuerst unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase f oder der Bakteriophagen-T4 DNA-Polymerase geglättet werden. Beide Polymerasen erfordern die vier Desoxyribonucleotid-Triphosphate um die überstehenden einzelsträngigen Enden der verdauten DNA auszufüllen. Alternativ können die Enden mit einer Nuclease geglättet, werden, wie z.B. Nuclease 51 oder Mungobohnen-Nuclease, wobei beide in der Weise arbeiten, dass sie die überstehenden Einzelstränge der DNA zurückschneiden. Die DNA wird dann mittels Ligase zurückligiert. Das resultierende Molekül ist eine aktivstellendeletierte Variante des Thrombins.
Aminsäure-Insertionen können ebenfalls Thrombin-Varianten hervorbringen, die katalytisch nicht mehr aktiv sind, jedoch Thrombomodulin binden können. Um Insertions-Varianten zu konstruieren, kann eine der Konstruktion von Deletions-Varianten ähnliche Strategie angewandt werden, wie sie von Sambrook et al., s.o., in Abschnitt 15.3 beschrieben wurde. Nach dem Verdau der in den Plasmid-Vektor insertierten DNA (Fremd-DNA) an den/der einzigartigen Restriktionsstelle(n), wird ein Oligonucleotid an jene Stelle ligiert, wo die Fremd-DNA geschnitten wurde. Das Oligonucleotid ist so entworfen, dass es für die gewünschten zu insertierenden Aminosäuren kodiert und zusätzlich 5'- und 3'-Enden besitzt, die mit den Enden der verdauten Fremd-DNA kompatibel sind, sodass eine direkte Ligation möglich ist. Mehr bevorzugt werden Insertions-Varianten des Thrombins durch ortsspezifische Mutagenese von DNA hergestellt, die für ein natives Thrombin oder eine Thrombin-Variante kodiert, im Wesentlichen wie zuvor für die Herstellung von Substitutions-Varianten beschrieben wurde.
Sobald die für eine aktivstellenblockierte oder deletierte Thrombin-Variante kodierende Nucleinsäure zur Verfügung steht, wird sie im Allgemeinen für das weitere Klonieren (Amplifizierung der DNA) oder für die Expression in einen replizierbaren Expressionsvektor ligiert.
Expressions- und Klonierungsvektoren sind dem Fach weithin bekannt und enthalten Nucleinsäuresequenzen, die dem Vektor die Replikation in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen ermöglicht. Die Selektion des geeigneten Vektors hängt ab 1) davon, ob er für DNA-Amplifikation oder DNA-Expression verwendet werden soll, 2) von der Größe der in den Vektor zu insertierenden DNA, und 3) von der mit dem Vektor zu transformierenden Wirtszelle. Jeder Vektor enthält verschiedene Komponenten in Abhängigkeit von seiner Funktion (DNA-Amplifizierung und DNA-Expression) und der Wirtszelle, zu der er kompatibel ist. Die Vektoren umfassen im Allgemeinen, sind aber nicht beschränkt auf folgende Komponenten: eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergen(e), ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptions-Terminationssequenz. Klonierungs- und Expressionsvektoren und deren Komponenten sind im Handel erhältlich und sind in einer Vielzahl von Publikationen offenbart, wie z.B. in den U.S. Patenten Nr. 5.190.756 (erteilt am 2. März 1993); 5.156.969 (erteilt am 20. Oktober 1992); 5.270.198 (erteilt am 14. Dezember 1993). Ebenfalls bekannt sind prokaryotische eukaryotische Wirtszellen (einschließlich Mikroorganismen und vielzellige Organismen) und Klonierungsmethoden, die für die rekombinante Produktion von aktivstellenblockierten Thrombin-Varianten geeignet sind (siehe z.B. die voranstehenden U.S. Patente; Sambrook et al., s.o.; und Ausubel et al. (Hrsg.), s.o.).
Falls der Thrombomodulin-Inhibitor ein Antikörper mit der Fähigkeit zur spezifischen Bindung an die Thrombin-Bindungsstelle(n) des Thrombomodulins, oder ein Anti- Thrombin-Antikörper mit der Fähigkeit zur selektiven Bindung an die Thrombomodulin- Bindungsstelle(n) des Thrombins ist, ohne jedoch das Thrombin zu inaktivieren, oder ein Antikörper ist, der den Thrombin-Thrombomodulin-Komplex spezifisch erkennt und neutralisiert, nicht jedoch das freie Thrombin, kann er mittels dem Fach weithin bekannten Methoden hergestellt werden.
Polyklonale Antikörper werden in Tieren generell durch mehrfache subkutane (sc) oder intraperitoneale Injektionen des Antigens (Thrombin oder Thrombin/Thrombomodulin- Komplex) und eines Adjuvans hergestellt. Es kann zweckdienlich sein, das Antigen oder ein die Ziel-Aminosäuresequenz enthaltendes Fragment mit einem Protein, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, zu konjugieren, z.B. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH; "keyhole limpet hemocyanin"), Serumalbumin, Rinder- Thyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor unter Verwendung eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels, zum Beispiel Maleimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cystein-Reste), N-Hydroxysuccinimid (über Lysin-Reste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCI&sub2; oder R¹N = C = NR, wobei R und R¹ unterschiedliche Alkylgruppen sind.
Die Tiere werden gegen die immunogenen Konjugate oder Derivate immunisiert, indem 1 mg oder 1 pg (für Kaninchen bzw. Mäuse) des Konjugats mit 3 Volumseinheiten komplettem Freundschem Adjuvans vermischt und die Lösung an mehreren Stellen intrakutan injiziert wird. Einen Monat später erhalten die Tiere durch subkutane Injektion an mehreren Stellen mit 1/5 bis 1/10 des ursprünglich eingesetzten Volumens an Konjugat in komplettem Freundschem Adjuvans Auffrischungen. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen, und der Antikörper-Titer des Serums getestet. Die Tiere erhalten Auffrischungen, bis der Titer ein Plateau erreicht. Vorzugsweise erhält das Tier Auffrischungen mit dem Konjugat desselben Antigens, welches jedoch mit einem anderen Protein und/oder durch ein anderes Quervernetzungs-Reagens konjugiert ist. Konjugate können auch in rekombinanten Zellkulturen als Proteinfusionen hergestellt werden. Weiters werden Aggregationsagenzien, wie z.B. Alaun, verwendet, um die Immunantwort zu verstärken.
Monoklonale Antikörper werden aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten, d.h., die einzelnen Antikörper innerhalb der Population sind identisch, mit Ausnahme von möglichen natürlich auftretenden Mutationen, die in geringfügigen Mengen vorhanden sein können. Folglich bezeichnet die nähere Bestimmung "Monoklonal" den Charakter des Antikörpers dahingehend, dass es sich nicht um ein Gemisch ungleicher Antikörper handelt.
Beispielsweise kann für die Herstellung der monoklonalen Anti-Thrombomodulin-Antikörper dieser Erfindung die Hybridom-Methode verwendet werden, die erstmals von Kohler & Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde, oder sie können mittels DNA-Rekombinationsmethoden hergestellt werden [Cabilly et al., U.S. Patent Nr. 4.816.567].
Mit der Hybridom-Methode wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier, wie z.B. ein Hamster, wie zuvor beschrieben immunisiert, um Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper produzieren oder zu produzieren in der Lage sind, welche sich spezifisch an das zur Immunisierung verwendete Protein binden. Alternativ können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Die Lymphozyten werden dann unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie z.B. Polyethlyenglykol, mit Myelomzellen fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden [Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", S. 59-103 (Academic Press, 1986)].
Die so hergestellten Hybridomzellen werden in ein geeignetes Kulturmedium eingeimpft und kultiviert, welches vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der nicht-fusionierten Eltern-Myelomzellen inhibieren. Wenn beispielsweise in den Eltern-Myelomzellen das Enzym Hypöxanthin-Guanin- Phosphoribosyl-Transferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, wird das Kulturmedium typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium) enthalten, d.h. Substanzen, die das Wachstum HGPRT-defizienter Zellen verhindern.
Bevorzugte Myelomzellen sind jene, die effizient fusionieren, die die stabile High-Level-Expression des Antikörpers in den ausgesuchten antikörperproduzierenden Zellen unterstützen und die sensitiv gegen ein Medium sind, wie z.B. dem HAT-Medium.
Unter diesen bevorzugten Myelomzellen sind Murin-Zellinien, wie z.B. jene von MOPC 21- und MPC 11-Maustumoren abgeleiteten, die vom Salk Lnstitute Cell Distribution Center, San Diego, Californien, USA, erhältlich sind, sowie SP 2-Zellen, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, bezogen werden können. Hümanmyelom- und Maus-Human-Heteromyelom-Zellinien wurden auch für die Produktion von humanen monoklonalen Antikörpern beschrieben [Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur, et al., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", S. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].
Das Kulturmedium in dem die Hybridomzellen wachsen, wird auf die Produktion von gegen das gewünschte Antigen (z.B. Thrombin) gerichteten monoklonalen Antikörpern getestet. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität der von Hybridomzellen gebildeten monoklonalen Antikörper mittels Immunfällung oder eines in vitro-Bindungstests, wie z.B. Radioimmuntest (RIA) oder Enzym-gebundener lmmunabsorptionstest (ELISA), bestimmt.
Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann z.B. durch Scatchard-Analyse von Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nachdem die Hybridomzellen, welche die Antikörper der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität produzieren, identifiziert wurden, können die Klone mittels Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und nach Standard-Verfahren gezüchtet werden. Goding, "Monoclorial Antibodies: Principles and Practice", S. 59-104 (Academic Press, 1986). Geeignete Kulturmedien zu diesem Zweck umfassen, z.B., Dulbecco's Modified Eagle's Medium oder RPMI-1640-Medium. Zusätzlich können Hybridom-Zellen in Ascites-Tumoren eines Tieres in vivo gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sekretierten Antikörper werden in geeigneter Weise aus dem Kulturmedium, der Ascites-Lösung, oder dem Serum mittels konventioneller Immunglobulin-Reinigungsverfahren, wie z.B. Protein A-Sepharose, Hyroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, abgetrennt.
Die für monoklonale Antikörper kodierende DNA der Erfindung kann ohne Weiteres nach konventionellen Verfahren isoliert und sequenziert werden (z.B. durch Verwendung von Oligonucleotid-Sonden, die in der Lage sind, sich spezifisch an Gene zu binden, die für die leichten und schweren Ketten von Murin-Antikörpern kodieren). Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als bevorzugte Quellen einer solchen DNA.
Wenn die DNA isoliert ist, kann sie in Expressionsvektoren eingebracht werden, welche dann in Wirtszellen transfiziert werden, wie z.B. Simian-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstockzellen (CH0) oder Myelomzellen, die andernfalls keine anderen Immunglobulin- Proteine produzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erzielen. Die DNA kann auch modifiziert werden, z.B. indem die kodierenden Sequenzen der homologen Murin-Sequenzen durch die konstanten Domänen der humanen leichten und schweren Kette substituiert werden, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851 (1984), oder indem die gesamte oder eine Teil der für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kodierende(n) Sequenz mit der lmmunglobulin-kodierenderi Sequenz kovalent verbunden wird. Auf diese Weise können "chimäre" oder "Hybrid-" Antikörper erhalten werden, welche die Bindungsspezifität des monoklonalen Antikörpers besitzen.
Typischerweise werden solche Nicht-Immunglobulin-Polypeptide durch die konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung substituiert, oder sie werden durch die Variablen Domänen einer einzelnen antigenbindenden Stelle eines Antikörpers der Erfindung substituiert, um einen chimären bivalenten Antikörper hervorzubringen, umfassend eine antigenbindende Stelle mit einer Spezifität für ein Antigen, dessen Neutralisierung zu Thrombomodulin-Inhibierung führt, und einer anderen, für ein unterschiedliches Antigen spezifischen, antigenbindende Stelle.
Chimäre oder Hybrid-Antikörper können auch in vitro hergestellt werden, indem bekannte Verfahren der synthetischen Proteinchemie angewandt werden, einschließlich jene unter Verwendung von Vernetzern. Beispielsweise können Immunotoxine konstruiert werden, indem eine Disulfid-Austauschreaktion oder die Bildung einer Thioether- Bindung eingesetzt wird. Beispiele von für diesen Zweck geeigneten Reagenzien schließen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrylimidat ein.
Jedes fachbekannte Verfahren zur einzelnen Konjugation des Antikörpers mit dem detektierbaren Teil kann angewendet werden, einschließlich des von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982).
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können für jedes bekannte Testverfahren verwendet werden, wie z.B. kompetitiver Bindungstest, direkte und indirekte Sandwich- Tests, und Immunpräzipitationstests. Zola, "Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, S. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).
Die Verfahren der Humanisierung nicht-humaner Antikörper sich weithin fachbekannt. Im Allgemeinen sind bei einem humanisierten Antikörper eine oder mehrere Aminosäurereste einer nicht-humanen Quelle eingeführt. Diese nicht-humanen Aminosäure-Reste werden häufig als "Import"-Reste bezeichnet, welche typischerweise von einer variablen "Import"-Domäne angeeignet werden. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach einem Verfahren von Winter und seinen Mitarbeitern Dones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (19889], durchgeführt werden, indem Nagetier-CDRs oder -CDR-Sequenzen durch die entsprechenden Sequenzen eines humanen Antikörpers substituiert werden. Dementsprechend sind solche "humanisierten" Antikörper chimäre Antikörper (Cabilly, s.o.), in welchen beträchtlich weniger als eine intakte humane variable Domäne durch die entsprechende Sequenz einer nicht-humanen Spezies substituiert worden ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise humane Antikörper, in welchen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste analoger Stellen von Nagetier-Antikörpern substituiert sind.
Es ist wichtig, dass Antikörper unter Beibehaltung hoher Affinität für das Antigen und anderer bevorzugter biologischer Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden humanisierte Antikörper, entsprechend einer bevorzugten Methode, durch einen Prozess von Analyse der Parental-Sequenzen und verschiedensten konzeptionellen humanisierten Produkten hergestellt, wobei dreidimensionale Modelle der parentalen und humanisierten Sequenzen verwendet werden. Dreidimensionale Immunglobulin-Modelle sind allgemein verfügbar, und fachlich Erfahrenen wohl vertraut. Es sind Computerprogramme verfügbar, die wahrscheinliche dreidimensionale Konformations-Strukturen von ausgesuchten Immunglobulin-Kandidatensequenzen veranschaulichen und darstellen. Die Untersuchung dieser Darstellungen erlaubt die Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste in der Wirkungsweise der Kandidaten-Immunglobulinsequenz, d.h. der Analyse von Resten, die die Fähigkeit des Kandidaten-Immunglobulins zur Bindung an dessen Antigen beeinflussen. Auf diese Weise könne FR-Reste aus der Konsens- und Importsequenz selektiert und kombiniert werden, sodass eine erhöhte Affinität für das/die Zielantigen(e) erhalten wird. Im Allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und in höchstem Maße daran beteiligt, die Bindung des Antigens zu beeinflussen. Zu weiteren Details siehe die PCT WO 94/0479 vom 03 März 1994.
Alternativ dazu ist es nun möglich, transgene Tiere zu erzeugen (z.B. Mäuse), die bei Immunisierung ein volles Repertoire humaner Antikörper in Abwesenheit endogener Immunglobulinbildung produzieren. Beispielsweise ist beschrieben worden, dass die homozygote Deletion des Gens der schwerkettenverbindenden Antikörperregion (JH) in chimären und keimbahnmutierten Mäusen zu einer vollständigen Inhibierung der endogenen Antikörperproduktion führt. Der Transfer der humanen Keimbahn-Immunglobulin-Genreihe in solche keimbahnmutierte Mäusen führt bei Antigenexposition zur Produktion humaner Antikörper. Siehe, z.B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 90, 2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993).
Bispezifische Antikörper können bei den Methoden der vorliegenden Erfindung ebenfalls als Thrombomodulin-Inhibitoren verwendet werden. Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise humane oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für mindestens zwei unterschiedliche Antigene besitzen. Im vorliegenden Fall kann beispielsweise eine der Spezifitäten für die Bindungsstelle(n) von Thrombomodulin sein, während die zweite für den Thrombin-Thromboglobulin-Komplex sein kann. Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind fachbekannt. Traditionell basiert die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf der Koexpression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren, wobei die beiden schweren Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Millstein und Cuello, Nature 305, 537- 539 (1983)). Wegen der zufälligen Verteilung der schweren und leichten Immunglobulinketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) potentiell ein Gemisch aus 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die richtige bispezifische Struktur besitzt. Die Reinigung des richtigen Moleküls, die gewöhnlich mittels affinitätschromatographischer Schritte durchgeführt wird, ist ziemlich aufwendig und die Produktausbeuten sind niedrig. Ähnliche Verfahren sind in der PCT-Anmeldung Nr. WO 93/08829 (erteilt am 13. Mai 1993) offenbart, sowie von Traunecker et al., EMBO 10, 3655-3659 (1991). Gemäß einem anderen und stärker bevorzugten Ansatz, werden die gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Bindungsstellen) aufweisenden variablen Antikörperdomänen mit den Sequenzen der konstanten Immunglobulindomänen fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Domäne der schweren Immunglobulinkette, die zumindest einen Teil der Hinge-, CH&sub2;- und CH&sub3;-Regionen beinhalten. Vorzugsweise soll die erste konstante Region der schweren Kette (CH1), welche die für die Bindung der leichten Kette notwendige Stelle enthält, in zumindest einer der Fusionen vorhanden sein. DNAs, die für die Fusionen der Immunglobulin-Schwerkette kodieren und, falls gewünscht, für die Immunglobulin-Leichtkette, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert, und werden in einen geeigneten Wirtsorganismus kotransfiziert. Dies schafft ein hohes Maß an Flexibilität bei der Einstellung der wechselseitigenAnteile der drei Polypeptidfragmente in Ausführungsvarianten, wo die Verwendung ungleicher Verhältnisse der drei Polypeptidketten für die Konstruktion die optimalen Ausbeuten liefert. Es ist jedoch möglich die Kodierungssequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor zu insertieren, wenn die Expression zumindest zweier Polypeptidketten im gleichen Verhältnis zu hohen Ausbeuten führt, oder wenn die Verhältnisse keine besondere Signifikanz haben. In einer bevorzugten Ausführungsvariante dieses Ansatzes sind die bispezifischen Antikörper zusammengesetzt aus einer Immunglobulinhybrid-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität an einem Arm, und einem Immunglobulinhybrid-Schwerketten/Leichtketten-Paar (die eine zweite Bindungspezifität bereitstellt) am anderen Arm. Es wurde gefunden, dass diese asymmetrische Struktur die Abtrennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulinkettenkombinationen erleichtert, da die Anwesenheit einer Immunglobulin-Leichtkette in nur der Hälfte der bispezifischen Moleküle einen einfachen Weg zur Trennung schafft. Dieser Ansatz ist in der PCT-Anmeldung WO 95/04690 (erteilt am 3. März 1994) offenbart.
Zu näheren Details über die Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe z.B. Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
Heterökonjugierte Antikörper liegen ebenfalls im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugierte Antikörper sind aus zwei kovalent verbundenen Antikörpern zusammengesetzt. Solche Antikörper sind beispielsweise vorgeschlagen worden, um Zellen des Immunsystems gegen unerwünschte Zellen zu richten (U.S. Patent Nr. 4.676.980), sowie zur Behandlung von HIV-Infektion (PCT-Anmeldungen, Publikationen Nr. WO 91/00360 und WO 92/200373; EP-A-03.089). Heterokonjugierte Antikörper können nach beliebigen bequemen Vernetzungsverfahren hergestellt werden. Geeignete Vernetzungsmittel sind weithin fachbekannt und im U.S Patent Nr. 4.676.980 zusammen mit einer Anzahl von Vernetzungsmethoden offenbart.
Die bevorzugt zu verabreichenden Cytokine sind erfindungsgemäß TNF-ct und -β, IL-1, INF-γ alleine oder in jeder gewünschten Kombination. Diese Cytokine sind im Handel erhältlich oder können durch Reinigung aus natürlichen Quellen, durch Verfahren der DNA-Rekombinationsteehnologie, durch chemische Synthese oder durch Kombination dieser und/oder anderer bekannter Verfahren hergestellt werden. Dieselben Verfahren sind geeignet, Aminosäure-Sequenzvarianten nativer Cytokine herzustellen, wie z.B. TNF-β, TNF-α, IL-1 und INF-γ usw., wie z.B. jene, die im Zusammenhang mit der Herstellung inaktiver Aminosäure-Sequenzvarianten von Thrombin beschrieben wurden. Aminosäure-Sequenzvarianten natürlich vorkommender oder bekannter Varianten prokoagulierender Peptide und Polypeptide können in analoger Weise hergestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Prokoagulans oder der Thrombomodulin-Inhibitor und das Cytokin oder der Induktor der Cytokin-Produktion als Einzeldosis entweder systemisch oder an der Tumorstelle verabreicht. Der Thrombomodulin-lnhibitor wird vorzugsweise in einer Menge verabreicht, die gleich der oder größer als die molare(n) Konzentration des zu inhibierenden Materials im Körper des Patienten ist. Beispielsweise wird der Thrombomodulin-Inhibitor, falls es sich dabei um ein aktivstelleninhibiertes Thrombin handelt, vorzugsweise in einer Menge verabreicht, die gleich der oder größer als die molare(n) Konzentration des Thrombomodulins im Plasma des Patienten ist. Die Thrombomodulinkonzentration im Plasma eines normalen Menschen beträgt typischerweise 20 ng/ml, während sie in verschiedenen Krankheitsstadien im Mittel bis zu 80 ng/ml betragen kann. Desgleichen kann der Thrombomodulininhibitor in einer Menge gleich oder größer der molaren Konzentration von Thrombin im Plasma des Patienten verabreicht werden, wenn dieser als Blocker der Thrombomodulinbindungsstelle von Thrombin fungiert. Gewöhnlich werden zwei- bis fünffache Überschüsse der für das zu neutralisierende Protein berechneten Menge bevorzugt.
TNF-α kann systemisch verabreicht werden, und zwar in einer Human-Dosis von etwa fünf bis zehn Prozent der CD50 von 100 ug TNF-α/kg Körpergewicht, oder etwa 5 bis 10 pg TNF-α/kg Körpergewicht, obwohl niedrigere oder höhere Dosierungen ebenfalls wirksam sein können, vorausgesetzt, dass die Cytotoxizität von TNF-α bei höheren Dosierungen den Nutzen der Behandlung nicht übertrifft. TNF-α kann mit einer Dosierung von etwa ein Mikrogramm bis 200 Mikrogramm/m²,vorzugsweise weniger als etwa 25 Mikrogramm/m², in einen Tumor verabreicht werden. Typische Dosierungen von TNF-β sind ähnlich, obwohl wegen der niedrigeren Toxizität die Dosierung von TNF-β in der Human-Therapie auf bis zu 100 ug/kg gesteigert werden, und typischerweise zwischen 50 und 80 ug, z.B. 60 ug/kg, liegen kann.
Tierversuche liefern verlässliche Richtlinien für die Bestimmung der effektiven Dosen in der Humantherapie. Interspezies-Skalierung der effektiven Dosen können nach den von Mordenti, J. und Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics", "Toxicokinetics and new Drug Development", Yacobi et al. (Hrsg.), Pergamon Press, New York 1989, S. 42-96, niedergelegten Prinzipien durchgeführt werden.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung tatsächlich verabreichte Dosis der Koagulantien, Thrombomodulin-Inhibitoren und Cytokine ist eine Funktion einer Vielzahl von Parametern, wie z.B. des zu behandelnden Tumortyps und des Alters und Zustands des Patienten. Die Bestimmung der tatsächlichen Dosis für jede Situation ist weithin innerhalb der Fachkenntnis eines praktizierenden Arztes.
Wie vorher erwähnt, kann die Verabreichung des Prokoagulans oder/und Cytokins oder Induktors der Cytokinproduktion gleichzeitig oder nacheinander erfolgen, wobei jedes der Mittels als erstes verabreicht werden kann. Auf ähnliche Weise können der Thrombomodulin-Inhibitor und Cytokin oder Cytokininduktor gleichzeitig oder, in beliebiger Reihenfolge, nacheinander verabreicht werden. Jedes Mittel kann als Rezeptur in derselben oder zwei getrennten pharmazeutischen Mischungen vorliegen. Lagerfähige therapeutische Rezepturen werden hergestellt, indem die aktiven Bestandteile gewünschten Reinheitsgrads mit optionalen physiologisch vertretbaren Trägern, Füllstoffen oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausgabe, Osol, A. (Hrsg.) (1980), in Form von lyophilisierten Rezepturen oder wässrigen Lösungen vermengt werden. Annehmbare Träger, Füllstoffe oder Stabilisatoren sind für die Empfänger bei den angewendeten Dosen und Konzentrationen nichttoxisch und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat oder andere organische Säuren; Antioxidantien einschließlich Ascorbinsäure: niedermolekulare (weniger als etwa 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z.B. Rinderserumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide oder andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose, oder Dexirine; Chelatbildner, wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Detergenzien, wie z.B. Tween, Pluronics oder PEG.
Die für die in vivo-Verabreichung zu verwendenden Rezepturen müssen steril sein. Dies kann - vor oder nach der Lyophilisierung und Rekonstitution - leicht durch Filtration durch sterile Filtermembranen erreicht werden.
Therapeutische Zusammensetzungen werden hierin im Allgemeinen in einen Behälter mit steriler Zugangsöffnung gefüllt, beispielsweise eine Beutel für intravenöse Lösungen, oder ein Fläschchen mit einem Stopfen, der mit einer Injektionsnadel durchstechbar ist.
Der Weg der Verabreichung ist der gemäß bekannter Methoden z.B. Injektion oder Infusion durch intravenöse, intraperitoneale, intracerebrale, intramuskuläre, intraokulare, intraarteriale oder intraläsionale Wege, äußerliche Verabreichung oder durch Retard- Systeme.
Die Wirksamkeit der Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung kann mit einer Vielzahl von in vivo-Testmethoden überwacht werden.

Tiermodelle

Es werden Tiermodelle gewählt, bei denen die Ergebnisse reproduzierbar sind und einfach auf die humane klinische Situation extrapoliert werden können.

1. Behandlung experimenteller Tumoren

Die in vivo-Wirksamkeit der Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung gegen chemisch induzierte Tumoren kann in verschiedensten Nager-Modellen untersucht werden. Beispielsweise sind Meth A, CMS4, CMS5, CMS21, und WEH1164 chemisch induzierte Fibrosarkome von weiblichen BALB/c-Mäusen (DeLeo et al.,). Exp. Med. 146, 720 [1977]), welche ein gut kontrollierbares Modellsystem für das Studium von Antitumoraktivitäten verschiedenster Mittel bereitstellen (Palladino et al., J. Immunol. 138, 4023- 4032 [1987]). Kurz gesagt werden Tumorzelllinien in Zellkultur in vitro vermehrt. Vor der Injektion in Tiere werden die Zelllinien gewaschen und in einer Zelldichte von etwa 10 · 10&sup6; bis 10 · 10&sup7; Zellen/ml in Puffer suspendiert. Den Tieren werden dann subkutan 100 bis 200 ul der Zellsuspension injiziert, und es wird eine bis drei Wochen lang bis zum Auftreten des Tumors abgewartet.
Zusätzlich kann das Lewis-Lungenkarzinom (3LL) von Mäusen, einem der am gründlichsten untersuchten experimentellen Tumoren, als experimentelles Tumormodell verwendet werden. Die Leistungsfähigkeit dieses Tumormodells ist mit den vorteilhaften Effekten bei der Behandlung von menschlichen Patienten, die bei kleinzelligem Karzinom der Lunge (SCCL) diagnostiziert worden sind, korreliert worden. Dieser Tumor kann in normale Mäuse eingeführt werden, indem Tumorfragmente betroffener Mäuse oder in Kultur gehaltene Zellen injiziert werden (Zupi et al., Br. J. Cancer 41; Suppl. 4, 309 [1980], und Beweismaterial weist darauf hin, dass Tumore sogar durch Injektion einer einzelnen Zelle in Gang gesetzt werden können, und dass ein sehr großer Anteil der injizierten Tumorzellen überleben. Zu weiteren Details über diesen Tumor siehe Zacharski, Haemostasis 16, 300-320 (1986), und Beispiel 1 hierin unten.

2. Behandlung spontaner Tiertumoren

Ein geeignetes Ziel für klinische in vivo-Studien ist das orale Plattenepithelkarzinom der Katze (SCC). Das orale SCC der Katze ist ein höchst invasiver, maligner Tumor, und die häufigste gewöhnliche orale Malignität von Katzen, verantwortlich für mehr als 60% aller oralen Tumoren dieser Spezies. Er metastasiert selten an fernen Stellen, obwohl diese niedrige Häufigkeitsrate der Metastasierung möglicherweise nur die kurze Überlebenszeit der Katzen mit diesem Tumor widerspiegelt. Diese Tumoren sind gewöhnlich operativ nicht zugänglich, in erster Linie wegen der Anatomie der Katzenmundhöhle. Zur Zeit gibt es keine effektive Behandlungsmethode für diesen Tumor.
Gemäß einer optimalen Ausführungsform einer Studie um die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Behandlung zu testen, werden die Katzen in vier Gruppen randomisiert. Gruppe 1 wird mit einer Kombination aus Thrombomodulin-Inhibitor und einem Cytokin (oder Induktor der Cytokinproduktion), Gruppe 2 mit dem Cytokin alleine, Gruppe 3 mit dem Thrombomodulin alleine und Gruppe 4 nicht behandelt (obwohl die Hinzufügung der Gruppe 4 aufgrund der beschränkten Anzahl zur Verfügung stehender Tiere möglicherweise nicht praktikabel ist). Vor der Teilnahme an der Studie erfährt jede Katze eine vollständige klinische Untersuchung, Biopsie, und wird mittels Computertomographie (CT) gescannt. Katzen, für die ein sublingualer oraler Plattenepitheltumor diagnostiziert wurde, werden von der Studie ausgeschlossen. Die Zunge kann aufgrund eines solchen Tumors gelähmt werden, und obwohl die Behandlung den Tumor abtötet, wären die Katzen möglicherweise nicht in der Lage, sich zu ernähren. Jede Katze wird über einen Zeitraum von 5 Tagen behandelt. Fotografien werden während des Behandlungszeitraums täglich, sowie bei jeder folgenden Nachkontrolle aufgenommen. Nach der Behandlung wird jede Katze einem weiteren CT-Scan unterzogen. CT-Scans sowie Thorax-Radiogramme werden danach alle 8 Wochen evaluiert. Die Daten werden auf Unterschiede bezüglich Überleben, Reaktion und Toxizität innerhalb der beiden Gruppen evaluiert. Positive Reaktion erfordert den Nachweis von Tumorrückbildung, vorzugsweise mit einer Verbesserung der Lebensqualität und/oder erhöhten Lebenserwartung.
Zusätzlich kann die Wirksamkeit der hierin offenbarten Behandlung in anderen spontanen Tiertumoren, wie z.B. Fibrosarkom, Adenosarkom, Lymphom, Chondrom, Leiomyosarkom von Hunden, Katzen, und Pavianen getestet werden. Von diesen sind Säuger- Adenokarzinome in Hunden und Katzen ein bevorzugtes Modell, da ihr Auftreten und Verhalten dem des Menschen sehr ähnlich ist. Die Verwendung dieses Modells ist jedoch wegen dem seltenen Auftreten dieses Tumortyps bei Tieren eingeschränkt. Die Wirksamkeit von Kombinationen anderer Prokoagulantien und Cytokine wird in denselben Tiermodellen unter Verwendung analoger Versuchsanordnungen getestet.

Klinische Studien am Menschen

Klinischen Studien am Menschen werden vorzugsweise an mit Krebs des Kopfes und Halses diagnostizierten Patienten durchgeführt. Diese Krebsformen stehen gewöhnlich mit exzessiven Tabakkonsum oder Alkoholmissbrauch im Zusammenhang, und machen in den Vereinigten Staaten etwa 4-5% aller Krebsfälle aus. In 95% der Fälle sind es Plattenepithel- oder Epidermiskarzinome, welche aus dem Plattenepithel entstehen. Aufgrund lokaler Symptome, wie Schmerz, Heiserkeit, Schluckbeschwerden usw., werden solche Tumore gewöhnlich in einem frühen Stadium diagnostiziert, und sind typischerweise nicht von entfernten Metastasen begleitet. Die Krebsformen des Kopfes und Halses werden zur Zeit durch Operation und Strahlentherapie und/oder Chemotherapie behandelt. Die Prognose ist eher schlecht; typischerweise überleben etwa 10% der Patienten, in Abhängigkeit von der Lokalisation des Tumors, 5 oder mehr Jahre nach der operativen Therapie. Die Wirksamkeit in humanen klinische Studien erfordert den Nachweis von Tumorrückbildung, vorzugsweise zusammen mit einer Verbesserung der Lebensqualität und/oder erhöhter Lebenserwartung.
Die erfindungsgemäße Behandlung kann mit bekannten Tumortherapien kombiniert werden, wie z.B. Strahlentherapie, Chemotherapie und Immunotoxintherapie, einschließlich der der Verabreichung von Immunotoxin gegen das Tumorgefäßsystem, wie von Burrows und Thorpe, s.o., beschrieben wurde. Am meisten bevorzugt wird die Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung mit der Verabreichung eines (weiteren) Inhibitors des Protein C-Systems kombiniert, welches z.B. Antikörper gegen Protein C oder aktiviertes Protein C, Antikörper gegen Protein S. inaktiviertes Protein C und C4bbindendes Protein, wie im U.S. Patent Nr. 5.147.638 beschrieben wurde, sein kann. Zusätzlich können auch Steroide oder andere Mittel, die bekanntermaßen Blutplättchenverlust reduzieren oder verhindern können, vor oder nach der Behandlung verabreicht werden.
Weitere Details der Erfindung werden aus den folgenden, nicht einschränkenden, Beispielen offensichtlich.

Beispiel 1

Behandlung von großen, festen Tumoren in Mäusen mit einer Kombination aus inaktiviertem Thrombin und TNF-β

Inaktivierung von Thrombin

PPACK (Syn Organon Chemica Alta, Ltd.) wurde in 10 mM HCl in einer Endkonzentration von 5 mg PPACK/ml gelöst. Die Thrombinkonzentration hat in unterschiedlichen Präparaten zwischen 1 und 5 mg/ml variiert. Sowohl humane als auch Rinderthrombine wurden als Reagens verwendet. Die für die Inaktivierung verwendeten Puffer bestanden entweder aus 50 mM HEPES, pH 6,5, mit 0,5 M NaCl oder aus 25 mM Tris, pH 7,5, mit 0,15 M NaCl. PPACK wurde in Bezug auf das Thrombin in einem 10fachen molaren Überschuss zugesetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für drei bis vier Stunden sanft geschüttelt. Restliches PPACK wurde durch wiederholte Diafiltration unter Verwendung eines Amicon Rührzellelkonzentrators entfernt; für kleine Volumina in einem Centricon 10 Mikrokonzentrator. Das Reagens wurde auf eine Endkonzentration von etwa 10 mg/ml PPACK-Thrombin gebracht. Es wurde darauf geachtet, dass alle Puffer und Materialien endotoxinfrei waren.

Behandlung und Evaluierung der Tumorreaktion

Die Tumorreaktion in der Maus wurde in Dorsalhaut-Kammern (Leunig, M. et al., Cancer Res. 52, 6553-6560 [1992]; Lehr, H. et al., Am.J. Pathol. 143, 1055-1062 [1993]) evaluiert. Dieses Verfahren erlaubt einem die kontinuierliche Beobachtung der Gefäße, sowohl im normalen subkutanen Hautgewebe, als auch in transplantierten Tumoren.
Kurz gesagt wurde die Dorsalhaut-Kammer an CD6/F1-Mäusen implantiert. Lewis-Lungenkarzinom-Sphäroide mit etwa 700 um Durchmesser wurden, zwei bis drei Tage nachdem die Kammern implantiert worden waren, in diese Kammern transplantiert. Etwa eine Woche nach der Transplantation der Tumoren, nachdem sich ein extensives Gefäßsystem gebildet hatte, wurden die Mäuse auf den Objekttisch eines invertierten Mikroskops platziert.
Die Komponenten wurden in 200 ul nicht überschreitenden Volumina durch Schwanzveneninjektion entweder alleine oder in Kombination verabreicht, TNF-β (LT) (rekombinantes Produkt aus E. coli, Genentech, Inc. South San Francisco, CA) wurde in einer Dosierung von 7 ug/Maus und aktivstellenblockiertes Thrombin (ABT) in einer Dosierung von 1 mg/Maus verwendet.
Die Reaktion wurde in der ersten Stunde nach der Injektion kontinuierlich und anschließend einmal pro Stunde für die folgenden 24 Stunden beobachtet. Kontrastverstärkung des Transports weißer Blutzellen wurde durch intravenöse Acridinorange-Injektion vor der Zufuhr des Testmaterials erhalten. Die Beobachtungen wurden mit einem VHS- Videorekorder für spätere off-line-Analyse aufgenommen.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse der Verabreichung von 7 ug Human-TNF-β und 1 mg aktivstellenblockiertes Rinderthrombin zu unterschiedlichen Zeiten nach der Behandlung. (Ähnliche Ergebnisse wurden mit aktivstellenblockiertem Humanthrombin erzielt.) Die tatsächlichen Zeiten sind in den linken unteren Ecken der Fig. 2A-D gezeigt. Fig. 2A zeigt die Tumorgefäßneuverteilung vor der Behandlung in 10facher Vergrößerung. Wie in Fig. 2B gezeigt (10fache Vergrößerung) sind 6,5 Stunden nach der Behandlung verstärkt Ödeme im Tumor zu erkennen. Zusätzlich erschien der Blutfluss im eigentlichen Video zu dieser Zeit träge. Das Bild der Fig. 2C wurde etwa 23 Stunden nach der Behandlung aufgenommen und wird in 4facher Vergrößerung gezeigt. Das Bild zeigt den Bereich, in dem sich der Tumor befand (dunkler Bereich), und dass das Gefäßsystem des Tumors vollständig eliminiert ist, sowie auch die benachbarten, vorher vorhandenen Gefäße, die sich im Bereich des Tumors befinden. Das Bild der Fig. 2D wurde etwa 25 Minuten vor dem Bild der Fig. 2C, an einer zweiten Tumorstelle im selben Tier, aufgenommen, und wird in 1,6facher Vergrößerung gezeigt. An dieser Stelle trat dasselbe Phänomen (Gefäßkollaps, einschließlich Nachbargefäße) wie an der in Fig. 2C gezeigten Stelle auf. Die Bilder zeigen auch, dass normales Gewebe (Teile der Fig. 2C und 2D links unten) durch die Therapie nicht beeinflusst wird. Tatsächlich behielt das normale Gewebe gemäß den Beobachtungen mit der Videokamera normalen Blutfluss während der gesamten Beobachtungsdauer bei. Die Behandlung mit entweder TNF-β (getestet in zwei Tieren) oder ASBT (getestet in drei Tieren) alleine hatten zu keiner Zeit einen Einfluss auf den Tumorblutstrom oder Ödem.
Eine zweite Studie, durchgeführt mit einer Dosis von 2 mg/Maus Human-ASBT, kombiniert mit TNF-β, verabreicht in einer Dosis von 7 ug/Maus unter ansonsten identischen Bedingungen resultierte ebenfalls in einem Kollaps des Tumorgefäßsystems.

Beispiel 2

Behandlung von Katzen mit oralem Plattenepithelkarzinom mit aktivstellenblockiertem Thrombin und TNF-β

Katzen mit histologisch bestätigtem Plattenepithelkarzinom (SCC) der Mundhöhle wurden nach einer Vorschrift, beinhaltend aktivstellenblockiertes Thrombin und TNF-β, behandelt. Alle Tiere werden vor der Behandlung gemäß den Weltgesundheitsorganisations-Richtlinien eingestuft. Die Behandlungsvorschrift umfasst drei Behandlungen über einen Zeitraum von 5-7 Tagen.
Jede Katze wird zur Anbringung eines Zentralkatheters, vorzugsweise in die Drosselvene, in einem Spital aufgenommen. Diese Dauerkatheter werden so angebracht, dass sie während des gesamten Behandlungszeitraums durchlässig bleiben. Jede Katze erhält eine individuelle unterstützende Behandlung, sofern indiziert. Die unterstützende Behandlung beinhaltet, ist aber nicht beschränkt auf intravenöse Flüssigkeit, intravenöse Antibiotika und Magen-Darm-Behandlungen.
Aktivstellenblockiertes Thrombin wird wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und in einer Dosis von etwa 30 mg/kg eingesetzt. Die TNF-β-Dosis wird basierend auf einem vorbestimmten Steigerungsschema von 3, 5, und 10 mg/kg gesteigert. TNF-β wird mit steriler Kochsalzlösung verdünnt und in BuretroF (Add-On Set, Baxter Healthcare Corporation, Deerfield Illinois, USA) IV-Verabreichungssystem gegeben. Die Menge der zur Verdünnung von TNF-β verwendeten Kochsalzlösung beträgt 25-30 ml, abhängig von der Menge des zu verabreichenden TNF-β. Normales Katzenplasma (0,5-1 ml) wird zu Kochsalzlösung zugegeben um die Adhäsion von TNF-β an Plastikteilen des intravenösen Verabreichungs-Sets und -Schläuchen zu verhindern. Das aktivstellenblockierte Thrombin und TNF-β können gleichzeitig intravenös oder nacheinander in beliebiger Reihenfolge verabreicht werden, obwohl angenommen wird, dass die Vordosierung mit TNF-β für einen maximalen Effekt zu bevorzugen ist.

Beispiel 3

Behandlung von großen, festen Tumoren in Mäusen mit Kombinationen von Koagulantien und TNF-β

Unter Verwendung des Tiermodells und Befolgung der in Beispiel 1 beschriebenen Vorschrift werden jeder von sechs mit Lewis-Lungenzellenkarzinom implantierten CD6/F1- Mäusen eine Dosis von 5 ug/Maus an Faktor IXa in Kombination mit einer Dosis von 7 ug/Maus an rekombinantem TNF-β (produziert in E. Coli von Genentech, Inc.) verabreicht. Fünf der sechs behandelten Tiere zeigten einen vollständigen, selektiven Kollaps der Tumorgefäße.
In einem ähnlichen Experiment wurden fünf tumortragende CD6/F1-Mäuse mit einer Dosis von 5 ug/Maus an Gewebefaktor in Kombination von 7 ug/Maus an TNF-β behandelt. Fünf Tiere zeigten einen raschen, selektiven Kollaps des Tumorgefäßsystems. Der Blutfluss begann schon etwa zwei Stünden nach Verabreichung zu stoppen.
Obwohl die obige Beschreibung bestimmte bevorzugte Ausführungsformen betrifft, versteht sich, dass die vorliegende Erfindung nicht dermaßen eingeschränkt ist. Es ist dem fachlich gewöhnlich Erfahrenen klar, dass die offenbarten Ausführungsformen in verschiedenster Weise modifiziert werden können, ohne deshalb vom Gesamtkonzept der Erfindung abzuweichen. Alle solchen Modifikationen liegen innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung.

Claims

1. Verwendung einer Kombination aus einem Prokoagulanten und einem Cytokin oder einem lnducer von Cytokin-Produktion zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors bei einem Patienten.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Prokoagulant aus der aus Gewebefaktor, Faktor IXa, Faktor VIIa und Faktor XIa bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

3. Verwendung nach Anspruch 2, worin der Prokoagulant Gewebefaktor oder Faktor IXa ist.

4. Verwendung einer Kombination aus einem Thrombomodulin-Inhibitor und einem Cytokin oder einem Inducer von Cytokin-Produktion zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors bei einem Patienten.

5. Verwendung nach Anspruch 4, worin die Verabreichung der Komponenten einer solchen Kombination gleichzeitig erfolgt.

6. Verwendung nach Anspruch 5, worin der Thrombomodulin-Inhibitor und das Cytokin oder der lnducer von Cytokin-Produktion in einer einzigen pharmazeutischen Formulierung verabreicht werden.

7. Verwendung nach Anspruch 4, worin die Verabreichung der Komponenten der Kombination nacheinander erfolgt.

8. Verwendung nach Anspruch 7, worin zuerst der Thrombomodulin-Inhibitor verabreicht wird, gefolgt von der Verabreichung des Cytokins oder des lnducers von Cytokin-Produktion.

9. Verwendung nach Anspruch 7, worin zuerst das Cytokin oder der lnducer von Cytokin-Produktion verabreicht wird, gefolgt von der Verabreichung des Thrombomodulin-Inhibitors.

10. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, worin die Zeit zwischen den beiden aufeinanderfolgenden Verabreichungen etwa 3 bis 8 h beträgt.

11 Verwendung nach Anspruch 10, worin die Zeit etwa 3 bis 6 h beträgt.

12. Verwendung nach Anspruch 4, worin der Patient ein Mensch ist.

13. Verwendung nach Anspruch 12, worin der Thrombomodulin-Inhibitor ein aktivstellenblockiertes, verändertes oder deletiertes Thrombin ist.

14. Verwendung nach Anspruch 13, worin der Thrombomodulin-Inhibitor ein Human-Thrombin ist, dessen aktive Stelle durch ein kovalentes Reagens blockiert ist.

15. Verwendung nach Anspruch 14, worin das kovalente Reagens ein Tripeptidchlormethylketon ist.

16. Verwendung nach Anspruch 15, worin das Keton D-PheProArg-Chlormethylketon ist.

17. Verwendung nach Anspruch 15, worin das Keton D-TyrProArg-Chlormethylketon ist.

18. Verwendung nach Anspruch 13, worin das Cytokin aus der, die aus TNF-β (LT), TNF-α, IL-1 und IFN-γ bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

19. Verwendung nach Anspruch 4, die weiters die Verabreichung eines weiteren Inhibitors des Protein C-Systems umfasst.

20. Verwendung nach Anspruch 19, worin der Inhibitor ein monoklonaler Anti-Protein C-Antikörper ist.

21. Verwendung nach Anspruch 4, die weiters die Verabreichung eines weiteren Antitumormittels umfasst.

22. Verwendung nach Anspruch 21, worin das Antitumormittel ein Anti-Tumor-Endothelzellen-Immunotoxin ist.

23. Zusammensetzung zur Behandlung eines Tumors bei einem Patienten, umfassend eine therpeutisch wirksame Menge einer Kombination aus einem Prokoagulanten und einem Cytokin oder einem Inducer von Cytokin-Produktion.

24. Zusammensetzung zur Behandlung eines Tumors bei einem Patienten, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer Kombination aus einem Thrombomodulin-inhibitor und einem Cytokin oder einem lnducer von Cytokin-Produktion.

25. Antikörper, der zur spezifischen Bindung an die Thrombomodulin-Bindungsstelle von Thrombin fähig ist, ohne Thrombin zu inaktivieren.

26. Antikörper, der zur spezifischen Bindung an die Thrombin-Bindungsstelle von Thrombomodulin fähig ist.

27. Antikörper, der zur spezifischen Bindung an den Thrombin/Thrombomodulin- Komplex fähig ist und im Wesentlichen unfähig zur Bindung von Thrombin ist.

28. Hybridom-Zelllinie, die zu Sekretierung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 25 bis 27 fähig ist.