DE69519856T2

DE69519856T2 - Expression von albumin in hefe

Info

Publication number: DE69519856T2
Application number: DE69519856T
Authority: DE
Inventors: Alan Victor Quirk; Patricia Carol Wood
Original assignee: Delta Biotechnology Ltd
Current assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Priority date: 1994-06-07
Filing date: 1995-06-07
Publication date: 2001-07-19
Anticipated expiration: 2015-06-08
Also published as: PT764209E; EP0764209B1; JPH10501123A; GB2302329B; ES2156602T3; CA2190373C; EP0764209A1; GB9622229D0; GB9411356D0; CA2190373A1; JP3667339B2; WO1995033833A1; US5783423A; DE69519856D1; GB2302329A; GR3035568T3; DK0764209T3; KR100380532B1; ATE198624T1; AU2626295A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von heterologen Proteinen durch Hefespezies und genauer auf eine Anpassung der Hefe, in der das Protein erzeugt wird.

Hintergrund und Stand der Technik

In den vergangenen Jahren ist Hefe umfangreich als Wirtsorganismus für die Herstellung von heterologen Proteinen (Übersicht von Romanos et al. 1992), einschließlich rekombinantem humanen Albumin (rHA) (Sleep et al. 1990, 1991; Fleer et al. 1991) verwendet worden. Hefen sind genetischer Manipulation leicht zugänglich, können auf simplen Medien zu hoher Zelldichte gezogen werden und sind als Eukaryoten für die Erzeugung sowohl von sekretierten als auch von zytosolen Proteinen geeignet.
Wenn Hefen verwendet werden, um ein gewünschtes heterologes Protein durch Sekretion in ein Wachstumsmedium zu erzeugen, kann zusätzlich eine große Anzahl von auf den Wirt zurückgehenden Proteinen vorliegen, einschließlich anderer Proteine, die durch den Wirt sekretiert werden, aber auch intrazellulärer Proteine, die in dem Überstand als Resultat eines Auslaufens oder eines Abbaus von Zellen vorliegen. In Prozessen, in denen das Protein nicht sekretiert wird, gibt es natürlich ein noch höheres Niveau an Verunreinigungen mit intrazellulären Hefeproteinen. Es ist notwendig, das gewünschte Protein aufzureinigen und diese verunreinigenden Proteine von der Präparation zu entfernen; solche Methoden sind in der WO 92/04367 und der EP 524 681 beschrieben worden. Die Mehrzahl der verunreinigenden Proteine werden physikalisch-chemische Eigenschaften haben, die sich von dem gewünschten Protein so hinreichend unterscheiden, daß sie eine wirksame Trennung durch Standardtechniken erlauben, wie beispielsweise Ionenaustausch- oder Größenausschlußchromatographie. Der Stand der Technik vermittelt den Eindruck, daß solche Proteine durch solche Techniken in zufriedenstellender Weise entfernt werden können; siehe z. B. die EP 524 681 (Gist-brocades), EP 570 916 (Green Cross) und EP 464 590 (Green Cross). Tatsächlich haben wir komplizierte chromatographische Techniken (nicht publiziert) entwickelt, um verunreinigende Proteine von den gewünschten Proteinen zu entfernen.

Zusammenfassung der Erfindung

Wir haben jetzt auch einen anderen Ansatz gemacht und das Gen, nämlich das HSP150-Gen identifiziert, das für ein Protein verantwortlich ist, welches zusammen mit rekombinantem Albumin (rA) aufgereinigt wird. Gemäß der Erfindung eliminieren wir das verunreinigende Protein in der anfänglichen Fermentation, statt hochkomplizierte und komplexe Mittel zum Entfernen während der Aufreinigung zu entwickeln. Von diesem Protein war es bislang nicht bekannt, daß es eine Verunreinigung ist, die mitaufgereinigt wird.
Nach einem Aspekt der Erfindung wird das HSP150-Gen funktional von dem Genom des Wirts entfernt. Dies hat keine negativen Auswirkungen auf die Erzeugung des gewünschten Proteins verursacht, und entfernt eine potentielle Verunreinigung, die sich als schwierig durch Standardreinigungstechniken zu entfernen erwiesen hat. Trotz der Anwesenheit von mindestens zwei nahe verwandten Genen, die mit PIR1 und PIR3 Hsp150 sehr ähnliche Proteine in solcher modifizierter Hefe codieren, enthält von diesen Organismen aufgereinigtes rA keine nachweisbaren Niveaus von irgendeinem Protein dieser Familie.
Das S. cerevisiae-Hsp 150-Protein wurde ursprünglich von Russo et al (1992) beschrieben, und es wurde gezeigt, daß es als Nebenprodukt anfällt, weitgehend O-glykosiliert ist und effizient in das Wachstumsmedium sekretiert wird. Ein siebenfacher Anstieg in dem Niveau des Hsp150-Proteins wurde gesehen, wenn bei 28ºC gezogene Zellen auf 37ºC überführt wurden. Makarow hat vorgeschlagen, Fusionen von Hsp 150 (oder Fragmenten davon) und einem gewünschten Protein zu präparieren, um eine verbesserte, steuerbare Sekretion zu erreichen (WO 93/18167). Das HSP150-Gen codiert ein primäres Translationsprodukt von 413 Aminosäuren, einschließlich einer N-terminalen Sekretionssignalsequenz von 18 Aminosäuren, die nicht bei dem reifen Protein vorliegt. Ein weiteres post-translationales Verarbeitungsereignis tritt C-terminal an einem Paar von basischen Resten auf, was zwei Untereinheiten von 54 und 341 Aminosäuren ergibt, die assoziiert bleiben. Die 341 Aminosäuren-Untereinheit enthält 11 Tandemwiederholungen einer 19 Aminosäuren- Sequenzen, deren Funktion unbekannt ist. Homologe des HSP150-Gens wurden in Torulaspora delbrueckii, Kluyveromyces marxianus und Schizosaccharomyces pombe gefunden (Russo et al. 1992).
Dasselbe Protein ist von Toh-e et al (1993) als das PIR2-Protein bezeichnet worden. Von dem HSP150/PIR2-Gen wurde gezeigt, daß es ein Mitglied einer Familie von mindestens drei Genen ist (PIR1, PIR2 und PIR3), von denen alle ähnliche interne Tandemwiederholungen von ungefähr 19 Aminosäuren umfassen. Homologe der PIR-Gene wurden auch in Kluyveromyces lactis und Zygonosaccharomyces rouxii nachgewiesen (Toh-e et al. 1993). Unterbrechungen des HSP150/PIR2-Gens zeigten, daß dies kein essentielles Gen ist. (Russo et al. 1992; Toh-e et al. 1993).
In dieser Beschreibung beziehen wir uns auf rA als das gewünschte Protein.
Unsere Studien haben ergeben, daß das Hsp150-Protein durch Ionenaustauschchromatographie nur ineffizient von rHA getrennt wird. Überraschenderweise tritt Hsp150 jedoch nicht in der der rHA-Fraktion äquivalenten Fraktion auf, wenn rHA abwesend ist. Wenn z. B. ein rHA enthaltender Kulturüberstand durch eine Kationenaustauschsäule unter Bedingungen hindurchgeführt wird, die das Binden des rHA an die Säule sicherstellen (beispielsweise pH 4,5, Leitfähigkeit < 7 mS), bindet Hsp150 ebenfalls an die Säule an und wird unter denselben Bedingungen wie rHA eluiert und verunreinigt so die rHA-Präparation. Wenn jedoch Kulturüberstand von einer Hefe, die kein rHA sekretiert, durch solch eine Säule unter denselben Bedingungen hindurchgeführt wird, bindet das Hsp150-Protein nicht an die Matrix an, sondern tritt direkt durch die Säule hindurch. Die Eluatfraktion enthält in der Abwesenheit von rHA kein Hsp 150. Gleichermaßen bindet das Hsp 150-Protein in der Abwesenheit von rHA nicht an eine Anionenaustauschsäule an, die unter Bedingungen betrieben wird, welche in das Binden von Albumin (beispielsweise pH 5,5, 1,5 mS) resultieren würden; aber es liegt in der rHA-Eluatfraktion vor, wenn rHA vorliegt. Überraschenderweise haben wir herausgefunden, daß die Anwesenheit von rHA in dem Kulturüberstand das Verhalten von einigen Hefeproteinen während der chromatographischen Aufreinigung des rHAs so ändert, daß Proteine mit physikalisch-chemischen Eigenschaften, die andeuten, daß sie vom Albumin beispielsweise durch Ionenaustauschchromatograhie getrennt werden sollten, tatsächlich die rHA-Präparation verunreinigen und schwer zu entfernen sind.
Ein Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Albumins aus Hefe bereit, welches das Kultivieren der Hefe und das Gewinnen des Albumins umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß es der Hefe an Hitzeschockprotein 150 (Hsp150) mangelt.
Der bequemste Weg, dieses zu erreichen, ist es, eine Hefe zu erzeugen, die einen Defekt in ihrem Genom aufweist, so daß ein reduziertes Niveau an Hsp150-Protein erzeugt wird. Z. B. kann es eine Auslassung, einen Einsatz oder eine Transposition in der codierenden Sequenz oder den regulatorischen Bereichen (oder in einem anderen Gen, das die Expression des HSP150-Gens reguliert) geben, so daß wenig oder kein Hsp150-Protein produziert wird. Alternativ könnte die Hefe transformiert werden, um ein Anti-Hsp150-Mittel zu produzieren, wie beispielsweise einen anti-Hsp150-Antikörper.
Um das HSP150-Gen so zu modifizieren, daß ein reduziertes Niveau des Proteins, das mitaufgereinigt wird, erzeugt wird, können platzgerichtete Mutagenisierungen oder andere bekannte Techniken verwendet werden, um einzelne oder mehrfache Mutationen zu erzeugen, wie beispielsweise Austauschungen, Einsetzungen, Weglassungen und Transpositionen, wie sie in Botstein und Shortle, "Strategies and Applications of In Vitro Mutagenesis", Science, 229: 193-210 (1985), welcher Artikel hier durch Bezugnahme einbezogen wird, beschrieben sind. Geeignete Mutationen umfassen Kettenbeendigungsmutationen (natürlich werden Stop-Kodons, die nahe dem 3'-Ende eingeführt werden, wohl einen unzureichenden Effekt auf die Genproduktion haben, um nützlich zu sein; der Fachmann wird leicht in der Lage sein, um eine Mutation in den 5' drei Vierteln der codierenden Sequenz zu erzeugen), Punktmutationen, die den Leserahmen ändern, kleine bis große Weglassungen in der codierenden Sequenz, Mutationen beim Promotor oder beim Terminator, die die Genexpression beeinflussen, und Mutationen, die die mRNA destabilisieren. Einige wünschenswerte Punktmutationen oder spezifische Aminosäurensubstitutionen können das chromatographische Verhalten durch Ändern der Ladungsverteilung beeinflussen. Mit anderen Worten hat das erzeugte Protein eine ähnliche primäre Aminosäurensequenz wie diejenige von nativem Hsp150, es ist aber funktional unterschiedlich, so daß es nicht zusammen mit dem gewünschten Protein aufgereinigt wird. Solch ein modifiziertes Protein wird nicht als Hsp150 angesehen. Spezifische Mutationen können durch eine Erweiterung der Genunterbrechungstechnik eingeführt werden, die als Genumsetzung (Transplacement) bekannt ist (Winston, F. et al (1983) Methods Enzymol. 101, 211-228).
Jegliche Polypeptide, die in das Hsp 150-Protein eingesetzt werden, sollten keine Liganden für das gewünschte Protein sein oder solche erzeugen. Der Fachmann kann durch einfache Bindungstests einfach bestimmen, ob ein Ligand verwendet oder erzeugt worden ist. Im allgemeinen verwendet man einen auswählbaren Marker, um eine Gensequenz zu unterbrechen, doch muß dies nicht der Fall sein, insbesondere wenn man das Unterbrechungsereignis phenotypisch detektieren kann. In vielen Fällen wird das Einfügen einer Zwischenfrequenz so erfolgen, daß ein Stop-Kodon in dem Rahmen mit der Hsp150-Sequenz vorliegt, und die eingesetzte codierende Sequenz nicht translatiert wird. Alternativ kann die eingesetzte Sequenz in einem anderen Leserahmen als Hsp150 sein.
Das Gen kann einen oder mehrere Abschnitte (optional einschließlich Regelbereichen, bis zu dem gesamten Gen) aufweisen, die ausgelöscht oder invertiert sind, oder es kann einen eingesetzten Abschnitt haben, um als Ergebnis entweder keine Produktion des Proteins von dem HSP150-Ort oder die Produktion von Protein von dem HSPI150-Ort zu erhalten, das nicht dieselbe Mitaufreinigungseigenschaften wie das gewünschte Protein aufweist.
Vorzugsweise sekretiert die Hefe das rekombinante Albumin, das dann von dem Fermentationsmedium aufgereinigt wird. Die Aufreinigung kann anderswo erfolgen; somit ist die Herstellung von Kulturmedium, das Albumin enthält, wobei das Niveau von Hsp150-Protein niedrig oder null ist, ein Ziel ansich.
Ein Protein wird im allgemein als mit Hsp150 mitaufreinigend angesehen, falls die beiden nach zwei unterschiedlichen chromatographischen Trenntechniken (von denen eine eine Affinitätschromatographie für das gewünschte Protein ist) noch zusammen vorliegen, oder, wenn eine Affinitätschromatographie nicht verwendet wird, falls die Proteine nach drei unterschiedlichen Schritten (z. B. ein Anionenaustausch-, ein Kationenaustausch- und ein Gelpermeationsschritt) immer noch zusammen vorliegen.
Humanes Serumalbumin (HSA) ist ein Protein von 585 Amionosäuren, das in humanem Serum mit einer Konzentration von 35 bis 45 g/L vorliegt und etwa 60% des gesamten Serumproteins ausmacht. HSA ist verantwortlich für einen signifikanten Anteil des osmotischen Drucks von Serum und dient auch als Träger für endogene und exogene Liganden. Es wird klinisch in der Behandlung von Patienten mit schweren Verbrennungen, Schock oder Blutverlust verwendet und wird derzeit kommerziell durch Extraktion aus humanem Blut produziert. Die Produktion von rekombinantem humanen Albumin (rHA) in Mikroorganismen ist in der EP 330 451 und der EP 361 991 offenbart worden.
Das Albumin kann eine Variante von normalem HSA/rHA sein. Mit "Varianten" schließen wir Einsätze, Weglassungen und Substitutionen, entweder konservativ oder nichtkonservativ, ein, wenn solche Änderungen die onkotischen, die nützlichen ligandenbindenden oder die nicht-immunogenen Eigenschaften von Albumin nicht wesentlich ändern. Insbesondere schließen wir natürlich vorkommende polymorphe Varianten von humanem Albumin, Fragmente von humanem Albumin, beispielsweise jene Fragmente, die in der EP 322 094 offenbart sind (nämlich HSA (1-n), wobei n gleich 369 bis 419 ist), und Fusionen von Albumin mit anderen Proteinen, z. B. der Art, wie sie in der WO 90/13653 offenbart ist, mit ein.
Durch "konservative Substitutionen" sind Austauschungen innerhalb von Gruppen, so wie Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; und Phe, Tyr gemeint.
Ein zweiter Hauptaspekt der Erfindung stellt eine Hefe bereit, die transformiert ist, um ein rekombinantes Albumin, welches in chromatographischen Techniken gemeinsam mit Hsp150 aufgereinigt wird, zu expressivieren, dadurch gekennzeichnet, daß es der Hefe an Hsp150 mangelt.
Zusätzlich zu den transformierten Wirtszellen selbst, betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Kultur solcher Zellen, vorzugsweise eine monoklonale (klonal homogene) Kultur oder eine Kultur, die von einer monoklonalen Kultur erhalten wurde, in einem Nährmedium.
Das rekombinante Albumin wird auf konventionelle Weise erzeugt, z. B. von einer codierenden Sequenz, die in das Hefechromosom eingesetzt oder auf ein freies Plasmid gelegt wurde. Die Hefen werden mit einer codierenden Sequenz für das Albumin auf jegliche übliche Weise transformiert, beispielsweise durch Elektroporation. Verfahren zum Transformieren von Hefe durch Elektroporation sind in Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182 offenbart.
Erfolgreich transformierte Zellen, d. h. Zellen, die ein DNA-Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten, können durch wohlbekannte Techniken identifiziert werden. Z. B. können Zellen, die aus der Einführung eines Expressionskonstrukts resultieren, gezogen werden, um das rekombinante Albumin zu erzeugen. Die Zellen können geerntet und zersetzt werden und ihr DNA-Gehalt kann auf die Anwesenheit der DNA unter Anwendung einer Methode wie beispielsweise jener untersucht werden, die von Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 oder Behrent et al (1985) Biotech. 3, 208 beschrieben wurde. Alternativ kann die Anwesenheit des Albumins in dem Überstand unter Verwendung von Antikörpern nachgewiesen werden.
Verwendbare Hefeplasmidvektoren umfassen pRS403-406 und pRS413-416 und sind allgemein von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA erhältlich. Die Plasmide pRS403, pRS404, pRS405 und pRS406 sind Hefe integrierende Plasmide (Yeast Integrating plasmids = YIps) und schließen die auswählbaren Hefemarker HIS2, TRPl, LEU2 und URA3 ein. Die Plasmide pRS413-416 sind Hefezentrom-Plasmide (Yeast Centromere Plasmids = YCps).
Eine Vielzahl von Methoden ist entwickelt worden, um, DNA über koplementär kohäsive Termini funktionell an Vektoren anzubinden. Z. B. können komplementäre Homopolymerzüge an das DNA-Segment angefügt werden, welches in die Vektor-DNA einzusetzen ist. Der Vektor und das DNA-Segment werden dann durch Wasserstoffbindungen zwischen den komplementären homopolymeren Endbereichen verbunden, um rekombinante DNA-Moleküle auszubilden.
Synthetische Linker, die einen oder mehrere Restriktionsplätze enthalten, stellen eine alternative Methode des Verbindens des DNA-Segments mit Vektoren dar. Das DNA- Segment, das durch Endonukleaserestriktionszersetzung, wie sie zuvor beschrieben wurde, erzeugt wurde, wird mit Bakteriophage T4-DNA-Polymerase oder E. coli-DNA-Polymerase I behandelt, das sind Enzyme, die vorstehende 3'-Einfachstrangtermini mit ihren 3'-5'- exonukleolytischen Aktivitäten entfernen und die zurückstehenden 3'-Enden mit ihren polymerisierenden Aktivitäten auffüllen.
Die Kombination dieser Aktivitäten erzeugt somit stumpf endende DNA-Segmente. Die stumpf endenden Segemente werden dann mit einem großen molaren Überschuß von Linkermolekülen in der Anwesenheit eines Enzyms inkubiert, das in der Lage ist, die Ligation von stumpf endenden DNA-Molekülen zu katalysieren, wie beispielsweise Bakteriophage T4- DNA-Ligase. So sind die Produkte der Reaktion DNA-Segmente, die polymerische Linkersequenzen an ihren Enden tragen. Diese DNA-Segmente werden dann mit dem geeigneten Restriktionsenzym gespalten und an einen Expressionsvektor angebunden, der mit einem Enzym gespalten worden ist, welches mit den Termini des DNA-Segments kompatible Termini erzeugt.
Synthetische Linker, die eine Vielzahl von Restriktionsendonukleaseplätzen enthalten, sind aus einer Anzahl von Quellen kommerziell verfügbar, einschließlich International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, USA.
Ein wünschenswerter Weg, die DNA gemäß der Erfindung zu modifizieren, ist es, die Polymerasekettenreaktion anzuwenden, wie sie von Saiki et al (1988) Science 239, 487-491 offenbart wurde. In diesem Verfahren wird die enzymatisch zu verstärkende DNA von zwei spezifischen Oligonukleotidprimern flankiert, die ihrerseits in die verstärkte DNA eingebaut werden. Diese spezifischen Primer können Restriktionsendonukleaseerkennungsplätze enthalten, die unter Anwendung von im Stand der Technik bekannten Methoden zum Klonen in Expressionsvektoren verwendet werden können.
Jede Hefe, die ein Hsp150-Protein erzeugt, kann gemäß der Erfindung modifiziert werden. Exemplarische Hefearten, die als in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendbar angesehen werden, sind Pichia (Hansenula), Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis und dergleichen.
Bevorzugte Arten sind jene, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, und Torulaspora besteht. Beispiele für Saccharomyces-Spezies sind S. cerevisiae, S. italicus und S. rouxii. Beispiele für Kluyvermoyces-Spezies sind K. fragilis, K. lactis und K. marxianus. Eine geeignete Torulaspora-Spezies ist T. delbrueckii. Beispiele für Pichia (Hansenula)-Spezies sind P. angusta (früher H. polymorpha), P. anomala (früher H. anomala) und P. pastoris.
Es ist bereits gezeigt worden, daß Homologe von HSP150 in einem weiten Bereich von unterschiedlichen Hefearten vorliegen: Torulaspora-Spezies, Kluyveromyces-Spezies, Schizosaccharomyces-Spezies und Zygosaccharomyces-Spezies (Russo et al. 1992; TOH-e et al. 1993). Zusätzlich haben unsere eigenen Studien durch Southern Blotting gezeigt, daß Pichia-Spezies ein Homolog von HSP150 besitzen.
Methoden zur Transformation von S. cerevisiae werden allgemein in der EP 251 744, der EP 258 067 und der WO 90101063 gelehrt, die hier alle durch Bezugnahme einbezogen werden.
Geeignete Promotoren für S. cerevisiae schließen jene ein, die mit dem PGK1-Gen, den GAL1- oder GAL10-Genen, CYC1, PHO5, TRP1, ADH1, ADH2, und den Genen für Glyzerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphorfructokinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglukoseisomerase, Glukokinase, α- Paarungsfaktorpheromon, α-Paarungsfaktorpheromon assoziiert sind, den PRBl -Promotor, den GUT2-Promotor, den GPDl -Promoter und Hybridpromotoren, welche Hybride von Teilen von 5'-Regulatorregionen mit Teilen von 5'-Regulatorregionen anderer Promotoren oder mit stromauf gelegenen Aktivierungsplätzen betreffen (beispielweise der Promotor gemäß EP-A-258 067).
Bequem regulierbare Promotoren zur Verwendung bei Schizosaccharomyces Pombe sind der thiaminunterdrückbare Promotor aus dem nmt-Gen, wie er von Maundrell (1990) J. Biol. Chem. 265, 10857-10864 beschrieben worden ist, und der glukoseunterdrückbare fbpl- Genpromotor, wie er von Hoffman & Winston (1990) Genetics 124, 807-816 beschrieben worden ist.
Methoden zum Transformieren von Pichia für die Expression von fremden Genen werden beispielsweise in Cregg et al (1993) und verschiedenen Philips-Patenten (beispielsweise US 4 857 467, durch Bezugnahme hier einbezogen) allgemein gelehrt; und Pichia-Expressionskits sind kommerziell von Invitrogen BV, Leek, Niederlande und Invitrogen Corp., San Diego, Kalifornien verfügbar. Geeignete Promotoren schließen AOX1 und AOX2 ein.
Das Paper von Gellissen et al (1992), welches oben erwähnt wurde, und Gleeson et al (1986) J. Gen. Microbiol. 132, 3459-3465 umfassen Informationen zu Hansenula-Vektoren und zur Hansenula-Transformation, wobei MOXI und FMD1 geeignete Promotoren sind; während EP 361 991, Fleer et al (1991) und andere Publikationen von Rhône-Poulenc Rorer lehren, fremde Proteine in Kluyveromyces-Spezies zu expressivieren, wobei PGKI ein geeigneter Promotor ist.
Das Transkriptionsbeendigungssignal ist vorzugsweise die 3'-flankierende Sequenz eines eukaryotischen Gens, die geeignete Signale für die Transkriptionsbeendigung und die Polyadenylation enthält. Geeignete 3'-flankierende Sequenzen können beispielsweise jene von Genen sein, die natürlich mit der verwendete Expressionskontrollsequenz verbunden sind, d. h. sie können dem Promotor entsprechen. Alternativ können sie unterschiedlich sein, in welchem Fall dann das Beendigungssignal des S. cerevisiae ADHI-Gens bevorzugt ist.
Das rekombinante Albumin kann zu Beginn mit einer Sekretionsleadersequenz expressiviert werden, die jeder in der ausgewählten Hefe wirksame Leader sein kann. Leader, die bei S. cerevisiae einsetzbar sind, schließen denjenigen von dem Paarungsfaktor-α-Polypeptid (Mating Factor α Polypeptid = MFα-1) und die Hybridleader gemäß EP-A-387 319 ein. Solche Leader (oder Signale) werden durch die Hefe abgespalten, bevor das reife Albumin in das umgebende Medium entlassen wird. Weitere solche Leader schließen solche von S. cerevisiae-Invertase (SUC2), wie offenbart in JP 62-096086 (erteilt als 91/036516), saure Phosphatase (PH05), die Vorsequenz von MFα-1, β-Glukanase (BGL2) und Killertoxin; S. diastaticus-Glukoamylase II; S. carlsbergensis-α-Galactosidase (MELI); K. lactis-Killertoxin; und Candida-Glucoamylase ein.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Bevorzugte Aspekte der Erfindung werden jetzt detaillierter unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben werden, in denen
Fig. 1 ein Schema ist, das die Präparation eines EcoRI-HSP150-URA3-HSP150-Fragments zeigt, das zum Transformieren eines Hefestamms (DBU3) verwendet wird und das das HSP150-Gen (Beispiel 1) unterbricht; und
Fig. 2 ein Schema ist, das die Präparation eines weiteren EcoRI-Fragments zeigt, das zum vollständigen Entfernen der HSP150-codierenden Sequenz verwendet wird (Beispiel 2).
Alle Standardverfahren zu rekombinanter DNA sind in Sambrook et al (1989) beschrieben, soweit nichts anderes angegeben ist. Die DNA-Sequenzen, die rHA codieren, werden von der cDNA erhalten, die in der EP 201 239 beschrieben ist.

Beispiel 1

Das HSP150-Gen wurde durch das Verfahren der Genunterbrechung (Rothstein, 1983) mutiert, was effektiv Teile der HSP150-codierenden Sequenz zerstörte, so daß die Produktion von Hsp150 verhindert wurde.
Vier Oligonukleotide, die für die PCR-Verstärkung des 5'- und 3'-Endes des HSP150-Gens geeignet sind (Russo et al. 1992) wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems 380B Oligonucleotide Synthesizer synthetisiert.

5'Ende

LRE45: 5'-CTATTTCCTATTTCGGGAATTCTTAAAGACAAAAAAGCTC-3'
LRE46: 5'-GGCTGTGGTGCTGCAGATGATGCGCTGG-3'

3'Ende

LRE47: 5'-GCTACTTCCGCTTCTGCAGCCGCTACCTCC-3'
LRE48: 5'-GCCGTGTAGCGAGGGAATTCTGTGGTCACGATCACTCG-3'
Es ist zu beachten, daß LRE45 und LRE48 Änderungen in der HSP150-Gensequenz enthalten, um EcoRI-Plätze in das 5'- oder das 3'-Ende des HSP150-Gen-PCR-Produkts einzuführen. LRE46 und LRE47 enthalten jeweils PstI-Plätze, die natürlich in der HSP150- Gensequenz (SEQ1) vorliegen.
Eine PCR wurde durchgeführt, um die 5'- und 3'-Enden des HSP150-Gens unter Verwendung von LRE45 und LRE46 bzw. LRE47 und LRE48 aus der DNA von genomischer S. cerevisiae-DNA (Clontech Laboratories, Inc.) individuell zu verstärken.
Die Bedingungen waren wie folgt: 1 ug/ml genomische DNA, 1,2 · 10&supmin;¹&sup0; Mol von jedem Primer, denaturiere bei 94ºC für 61 sec., lasse an bei 37ºC für 121 sec., DNA-Synthese bei 72ºC für 181 sec. für 30 Zyklen, mit einer 10 sec. Verlängerung des DNA- Syntheseschritts nach jedem Zyklus, gefolgt von Einweichen bei 4ºC. Die PCR wurde unter Verwendung eines Perkin-Elmer-Cetus Thermal Cycler durchgeführt, und ein Perkin-Elmer- Cetus PCR-Kit wurde gemäß den Anforderungen des Herstellers verwendet. PCR-Produkte wurden durch Gelelektrophorese analysiert, und es wurde herausgefunden, daß sie von der erwarteten Größe war. Jedes PCR-Produkt wurde mit EcoRI und PstI aufgeschlossen und in mit EcoRI/PstI-aufgeschlossenes pUC19 (Yanisch-Perron et al. 1985) geklont, um pAYE503 (das 5'-Ende des HSP150-Gens enthaltend) und pAYE504 (das 3'-Ende des HSP150-Gens enthaltend) auszubilden (s. Fig. 1).
Das Plasmid-DNA-Sequenzieren wurde an pAYE503 und pAYE504 durchgeführt, um zu bestätigen, daß die Einsätze die gewünschten Sequenzen waren. pAYE503 und pAYE504 wurden mit EcoRI und Hindill aufgeschlossen, und die HSPI50 Genfragmente wurden isoliert und zusammen in pUC19XH (ein Derivat von pUC19, dem ein HindIII-Platz in seinem Polylinker fehlt) geklont, um pAYE505 auszubilden. Das URA3-Gen wurde von YEp24 (Botstein et al. 1979) als ein HindII-Fragment isoliert und in den HindIII-Platz von pAYE505 geklont, um pAYE506 auszubilden (Fig. 1). pAYE506 enthält einen anwählbaren Marker (URA3) der von den 5'- und 3'-Regionen, des HSP150-Gens flankiert wird.
Um einen Stamm zu konstruieren, dem die Kapazität zur Produktion von Hsp150 fehlt, wurde ein ura3-Derivat von DB1 cirº pAYE316 (Sleep et al. 1991) durch zufällige chemische Mutagenisierung und Selektion nach Resisitivität gegen 5-Fluororotsäure (Boeke et al. 1987) erhalten. Das Plasmid pAYE316 basiert auf dem 2 um-Plasmid und enthält eine codierende Sequenz für humanes Albumin unter der Steuerung des Hefe PRB1-Promotors, mit einem ADH1-Terminator und einem selektierbaren LEU2-Marker.
Der Stamm wurde über Nacht in 100 mL gepuffertem Minimalmedium (Hefesticksoffbasis [ohne Aminosäuren, ohne Amoniumsulphat, Difco], (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;5 g/L, Zitronensäuremonohydrat 6,09 g/L, NaHPO&sub4; 20,16 g/L, Sucrose 20 g/L, pH 6,5) gezogen und die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und dann einmal mit sterilem Wasser gewaschen. Die Zellen wurden dann in 10 mL sterilem Wasser resuspendiert, und 2 mL Aliquots wurden in getrennten 15 mL Falcon-Röhrchen angeordnet. Eine 5 mg/mL-Lösung von N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin (NTG) wurde dann wie folgt in die Röhrchen gegeben: 0uL, 20uL, 40uL, 80uL bzw. 160uL. Die Zellen wurden dann bei 30ºC für 20 min. inkubiert und dann zentrifugiert und dreimal mit sterilem Wasser gewaschen. Zum Schluß wurden die Zellen in 1 mL YEP (1% Gewicht/Volumen Hefeextrakt [= Yeast Extract], 2% Gewicht/Volumen Bakto-Pepton) resuspendiert und bei 4ºC gelagert. Der Prozentsatz der Zellen, die die mutagene Behandlung überlebten, wurde durch Verteilen von Lösungen der Proben auf YEP-Platten, die 2% Gewicht/ Volumen Sucrose enthielten, und Inkubieren bei 30ºC für drei Tage bestimmt. Zellen, die nach der Behandlung ungefähr 50 % Überlebende ergaben, wurden auf YEP-Platten, die 2% Gewicht/ Volumen Sucrose enthielten, gezogen und dann auf YNB-(Yeast Nitrogen Base = Hefestickstoffbasis)- Minimalmedium, das 2% Gewichts/Volumen Sucrose enthielt und dem 5-Fluororotsäure (1 mg/mL) und Uracil (50 ug/mL) zugesetzt waren, abgedrückt. Kolonien, die in der Lage waren, auf diesem Medium zu wachsen, wurden gereinigt und getestet, um zu verifizieren, daß sie nicht in der Lage waren, in der Abwesenheit der Uracilzugabe zu wachsen, und daß dieser Effekt durch Einführen des URA3-Gens durch Transformation korrigiert werden konnte.
Der ura3-Stamin, DBU3 cirº(pAYE316), wurde mit mit EcoRI aufgeschlossenem pAYE506 transformiert, und Ura&spplus;-Transformanten wurden selektiert. Die Unterbrechung des HSP150- Gens in diesen Transformanten wurde durch Southern Blot-Analyse unter Verwendung eines Fragments als Sonde bestätigt, daß die 5'- und 3'-Enden des HSP150-Gens (das EcoRI- Fragment von pAYE505) aufwies.
Die Hefe wurde dann durch in Minimalmedium in einen Fermentationsbehälter eingespeiste Ansatzkultur auf hohe Zelldichte gezogen (Collins, 1990). Kurz gesagt wurde ein Fermentationsbehälter mit 10 L Arbeitsvolumen bis auf 5 L mit einem Anfangsansatzmedium, das 50 mL/L einer konzentrierten Salzmischung (Tabelle 1), 10 mL/L einer Spurenelementlösung (Tabelle 2), 50 mL/L einer Vitaminmischung (Tabelle 3) und 20 g/L Sucrose enthielt, befüllt. Ein gleiches Volumen an Speisemedium, das 100 mL/L der Salzmischung, 20 mL/L der Spurenelementmischung, 100 mL/L der Vitaminlösung und 500 g/L Sucrose enthielt, wurde in einem separaten Behälter gehalten, der mit dem Fermentationsbehälter über eine Dosierpumpe verbunden war. Der pH-Wert wurde durch die automatische Zugabe von Amoniumhydroxyd oder Schwefelsäure bei 5,7 ± 0,2 gehalten, und die Temperatur wurde bei 30ºC gehalten. Die Rührergeschwindigkeit wurde eingestellt, um eine Spannung von gelöstem Sauerstoff von > 20% Luftsättigung bei 1 Volumen/Volumen/min. Luftstromrate zu ergeben.

Tabelle 1. Salzmischung

Chemikalie Konzentration (g/L)

KH&sub2;PO&sub4; 114.0
MgSO&sub4; 12.0
CaCl&sub2; · 6H&sub2;O 3.0
Na&sub2;EDTA 2.0

Tabelle 2. Spurenelementelösung

Chemikalie Konzentration (g/L)

ZnSO&sub4; · 7H&sub2;O 3.0
FeSO&sub4; · 7H&sub2;O 10.0
MnSO&sub4; · 4H&sub2;O 3.2
CuSO&sub4; · 5H&sub2;O 0.079
H&sub3;BO&sub3; 1.5
KI 0.2
Na&sub2;MoO&sub4; · 2H&sub2;O 0.5
CoCl&sub2; · 6H&sub2;O 0.56
H&sub3;PO&sub4; 75 mL/L

Tabelle 3. Vitaminlösung

Chemikalie Konzentration (g/L)

Ca-Pantothenat 1.6
Nikotinsäure 1.2
m-Inositol 12.8
Thiamin HCl 0.32
Pyridoxin HCI 0.8
Biotin 0.008
Der Fermentationsbehälter wurde mit 100 mL einer Übernachtkultur von S. cerevisiae, die in gepuffertem Minimalmedium (Hefestickstoffbasis [ohne Aminosäuren, ohne Amoniumsulphat, Difco] 1,7 g/L, (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 5g/L, Zitronensäuremonohydrat 6,09 g/L, Na&sub2;HPO&sub4; 20, 16 g/L, Sucrose 20 g/L, pH 6,5) gezogen worden war, geimpft. Die anfängliche Ansatzfermentation schritt fort, bis die Kohlenstoffquelle aufgebraucht worden war; an diesem Punkt wurde die Dosierpumpe angeschaltet, und die Zugabe von Speisemedium wurde computergesteuert (das Micro MFCS System, B. Braun, Melsungen, Deutschland) unter Verwendung eines Algorythmus, der auf demjenigen basierte, welcher von Wang et al (1979) entwickelt wurde. Ein Massenspektrometer wurde in Verbindung mit dem Computersteuersystem zum Überwachen der Abgase der Fermentation und zum Steuern der Zugabe des Speisemediums benutzt, um eine vorgegebene Wachstumsrate (beispielsweise 0,1 h&supmin;¹) einzuhalten. Eine maximale Umwandlung von Kohlenstoffsubstrat in Biomasse wird durch Halten des Atmungskoeffizienten unter 1,2 erreicht (Collins, 1990), und auf diese Weise können Zelldichten von ungefähr 100 g/L Zelltrockengewicht erreicht werden.
Die Fermentationssubstanz wurde zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen, und dann wie folgt einer Affinitätschromatographischen Aufreinigung unterworfen. Der Kulturüberstand wurde durch eine Cibacron Blue F3GA Sepharosesäule (Pharmacia) hindurchgeführt, die dann mit 0,1M Phosphatglycinpuffer, pH 8,0, gewaschen wurde. Das rHA wurde dann von der Säule mit 2M NaCl, 0,1M Phosphatglycin, pH 8,0, eluiert. Das Albumin kann von dem Kulturmedium alternativ durch jede einer Vielzahl von bekannten Techniken für das Aufreinigen von Albumin von Serum oder Fermentationskulturmedium aufgereinigt werden, z. B. jene, die in der WO 91104367, bei Maurel et al (1989), bei Curling (19809) und in der EP 524 681 offenbart sind:
Analysen von rHA, das von HSP150-Stämmen aufgereinigt wurde, ergab, daß kein Hsp150- Protein in diesen Proben vorlag. Hsp150-Protein wird unter Anwendung von Techniken aus dem Stand der Technik bestimmt, wie beispielsweise ELISA oder Western Blotting.
Anti-Hsp150-Antikörper sind bei Russo et al (1992) Proc. Nat. Acad. Sci (USA) 89, 3671- 3675 offenbart.

Beispiel 2

Die HSP150-proteincodierende Sequenz wurde unter Verwendung alternativer Fragmente der geklonten HSP150-Sequenzen wie folgt zerstört.
Das URA3 HindIII-Fragment von YEp24 (s. Beispiel 1) wurde in pIC19R (Marsh J. L. et al (1984) Gene 32, 481-485) bei Hindill geklont, um pAYE601 auszubilden, und dann als ein SalI/ClaI-Fragment entfernt und an den XhoI- und CIaI-Plätzen in pAYE505 eingesetzt, um pAYE602 auszubilden (Fig. 2). Dieses Plasmid wurde mit EcolRI aufgeschlossen und dann verwendet, um DBO3 cirº(pAYE316) zu transformieren und nach Ura&spplus;-Transformanten auszuwählen. Diese Unterbrechung des HSP150-Gens in diesem Transformanten wurde durch Southern Blot Analyse wie in Beispiel 1 beschrieben, bestätigt.
So wurde in diesem Beispiel die gesamte HSP150-codierende Sequenz entfernt, während in Beispiel 1 die Sequenz unterbrochen wurde, um ein nicht-funktionales Protein zu ergeben.

Beispiel 3

Southern Blotting hat einen HSP150-Homolog in Hansenula Polymorpha (jetzt genannt: Pichia Angusta) ergeben. Das P. Angusta-Gen kann auf Wegen funktional zerstört werden, die denjenigen in den Beispielen 1 und 2 analog sind.

Literaturliste

Boeke, J. D. et al (1987) Methods Enzymol. 154, 164-175.
Botstein, D. et al (1979) Gene 8, 17-24.
Collins, S. H. (1990) In Protein Production by Biotechnology (Harris, T. J. R., Herausgeber) Seiten 61-77, Elsevier, Barking, Essex.
Curling (1980) "Albumin Purification by Ion Exchange Chromatography", in "Methods of Plasma Protein Purification", Ed. Curling, J. M., Academic Press, London.
Fleer, R. et al (1991) Bio/Technology 9, 968-975.
Maurel et al (1989) "Biotechnology of Plasma Proteins", Colloque INSERM 175, 19-24.
Romanos, M. et al (1992) Yeast 8, 423-488.
Rothstein, R. J. (1983) Methods Enzymol. 101, 202-211.
Russo, P. et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3671-3675
Sambrook, J. et al (1989) Molecular Cloning: a Labaratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Labaratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Sleep, D. et al (1991) Bio/Tecnology 9, 183-187.
Toh-e et al (1993) Yeast 9, 481-494.
Wang, H. Y et al (1979) Biotechnology & Bioeng. 21, 975
Yanisch-Perron, C. et al (1985) Gene 33, 103-119.

SEQUENZLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:

(i) ANMELDER
(A) NAME: Delta Biotechnology Limited
(B) STRASSE: Castle Court, Castle Boulevard
(C) ORT: Nottingham
(E) LAND: Vereinigtes Königreich
(F) POSTKODE (ZIP): NG7 1FD

(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Hefestämme

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 6
(iv) COMPUTERLESBARE FORM;
(A) MEDIUM TYP: Floppy Disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patenfin Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
(vi) VORANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNG NUMMER: GB 9411356.0
(B) ANMELDETAG: 07-JUNI-1994

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NR: 1:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 40 Basispaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) ORT: 1..40
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /beachte = "Oligonucleotid für PCR-Versträrkung des 5'-Endes des Hsp150-Gens." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NR: 2:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 28 Basispaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) ORT: 1..28
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /beachte = "Oligonucleotid für PCR-Versträrkung des 5'-Endes des Hsp150-Gens." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NR: 3:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 30 Basispaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) ORT: 1..30
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /beachte = "Oligonucleotid für PCR-Verstärkung des 3'-Endes des Hsp150-Gens." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 3:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NR: 4:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 38 Basispaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) ORT: 1..38
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /beachte = "Oligonucleotid für PCR-Verstärkung des 3'-Endes des Hsp150-Gens." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 3:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NR: 5:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 2048 Basispaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Saccharomyces cerevisiae
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/ SCHLÜSSEL: CDS
(B) ORT: 397..1638 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 5:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NR: 6:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 413 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 6:

Claims

1. Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Albumins aus Hefe, welches das Kultivieren der Hefe und das Gewinnen des Albumins umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß es der Hefe an Hitzeschockprotein 150 (Hsp150) mangelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hefe einen Defekt in ihrem Genom aufweist, so daß ein reduziertes Niveau an Hsp150-Protein erzeugt wird.

3. Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Albumins aus Hefe, welches das Kultivieren der Hefe und das Gewinnen des Albumins umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß kein Hsp150-Protein von der Hefe erzeugt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Albumin ein humanes Albumin ist.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Hefe eine Torulaspora-, Kluyveromyces-, Schizosaccharomyces-, Pichia- oder Saccharomyces-Spezies ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Hefe S. cerevisia ist.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das rekombinante Albumin von der Hefe in das umgebende Medium sekretiert wird und hieraus aufgereinigt wird.

8. Hefe transformiert zum Expressivieren eines rekombinanten Albumins, dadurch gekennzeichnet, daß es der Hefe an Hsp150 mangelt.

9. Hefe nach Anspruch 8, wobei die Hefe einen Defekt in ihrem Genom aufweist, so daß ein reduziertes Niveau an Hsp150-Protein erzeugt wird.

10. Hefe nach Anspruch 8, wobei im wesentlichen kein Hsp150-Protein von der Hefe erzeugt wird.

11. Hefe nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das Albumin ein humanes Albumin ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die Hefe eine Torulaspora-, Kluyveromyces-, Schizosaccharomyces- oder Saccharomyces-Spezies ist.

13. Hefe nach Anspruch 12, wobei die Hefe S. cerevisiae ist.

14. Hefe nach einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei die Hefe mit einem DNA-Konstrukt transformiert ist, so daß das rekombinante Albumin von der Hefe sekretiert wird, während sie kultiviert wird.

15. Verfahren zum Herstellen einer Hefe nach einem der Ansprüche 8 bis 14, welches die Schritte aufweist:

(i) Transformieren der Hefe mit einer codierenden Sequenz für die Expression des rekombinanten Albumins und

(ii) Unterbrechen des Genoms der Hefe, so daß die Hefe ein abnormal niedriges Niveau an Hsp150 aufweist,

wobei die Schritte (i) und (ii) in jeder Reihenfolge oder gleichzeitig ausgeführt werden können.