PT764209E - Estirpes de leveduras - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

Estirpes de leveduras

Campo da Invenção A presente invenção refere-se à produção de proteínas heterólogas por espécies de leveduras e mais particularmente a uma adaptação da levedura na qual a proteína é produzida.

Antecedentes e arte anterior

Nos últimos anos as leveduras têm sido amplamente utilizadas como organismos hospedeiros para a produção de proteínas heterólogas (revisão por Romanos et ai, 1992), incluindo albumina humana recombinante (rHA) (Sleep et a/., 1190; Fleer et al., 1991). As leveduras são facilmente receptivas a manipulação genética, podem ser crescidas até uma elevada densidade celular em meios simples e, como eucariotas, são adequadas para a produção de proteínas segregadas bem como citosólicas.

Quando se utilizam leveduras para produzir uma proteína heteróloga desejada por secreção no meio de crescimento, podem também estar presentes grandes números de proteínas derivadas do hospedeiro, incluindo outras proteínas segregadas pelo hospedeiro mas também proteínas intracelulares presentes no sobrenadante como resultado de fuga das células ou lise de células. Em processos em que a proteína não é segregada, existe evidentemente um nível ainda mais elevado de contaminação com proteínas intracelulares da levedura. É necessário purificar a proteína desejada e remover estas proteínas contaminantes da preparação; foram descritos métodos deste tipo em WO 92/04367 e EP 524 681. A maioria das proteínas contaminantes terá propriedades físico-químicas suficientemente diferentes das da proteína desejada para permitir uma separação eficiente por técnicas Standard, tais como cromatografia de permuta iónica ou de exclusão por tamanhos. A arte anterior dá a impressão de que estas proteínas podem ser removidas de modo satisfatório por estas técnicas; veja-se, por exemplo, EP 524 681 (Gist-brocades), EP 570 916 (Green Cross) e EP 464 590 (Green Cross). De

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EP 0 764 209/PT 2 facto, desenvolvemos técnicas cromatográficas sofisticadas (não publicadas) para remover proteínas contaminantes das proteínas desejadas.

Sumário da invenção

Adoptámos agora também uma abordagem diferente e identificámos o gene responsável por uma proteína, nomeadamente o gene HSP150, que co-purifica com albumina recombinante (rA). De acordo com a invenção, eliminámos a proteína contaminante da fermentação inicial, em vez de desenvolver meios altamente sofisticados e complexos para a remoção durante a purificação. Não se sabia anteriormente que esta proteína era um contaminante de co-purificação.

Num aspecto da invenção, o gene HSP150 é funcionalmente eliminado do genoma do hospedeiro. Isto não causou qualquer efeito prejudicial à produção da proteína desejada e remove um potencial contaminante que se provou difícil de remover por técnicas de purificação Standard. Apesar da presença de pelo menos dois genes estreitamente relacionados que codificam proteínas muito semelhantes à Hsp150, PIR1 e PIR3, nesta levedura modificada, a rA purificada a partir destes organismos não contém níveis detectáveis de qualquer proteína desta família. A proteína Hsp150 de S. cerevisiae foi originalmente descrita por Russo et al. (1992) e mostrou-se que era produzida constitutivamente, que era extensamente glicolisada em 0 e que era eficientemente segregada para o meio de crescimento. Foi observado um aumento de 7 vezes no nível da proteína Hsp150 quando as células que cresciam a 28°C foram desviadas para 37°C. Makarow propôs a preparação de fusões de Hsp150 (ou seus fragmentos) e uma proteína desejada, de modo a atingir uma secreção aumentada controlável (WO 93/18167). 0 gene HSP150 codifica um produto de tradução primária de 413 aminoácidos, incluindo uma sequência de sinal de secreção no terminal N de 18 aminoácidos que não está presente na proteína madura. Ocorre um evento de processamento pós-tradução adicional no terminal C num par de resíduos básicos para originar duas subunidades de 54 e 341 aminoácidos que permanecem associadas. A subunidade de 341 aminoácidos contém 11 repetições em série de uma sequência de 19 aminoácidos, cuja função se desconhece. Encontraram-se homólogos do gene HSP150 em

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Toru/aspora delbrueckii, Kluyveromyces marxianus e Schizosaccharomyces pombe (Russo et al. 1992). A mesma proteína foi designada a proteína PIR2 por Toh-e et ai (1993). Mostrou-se que o gene HSP150/P/R2 é um membro de uma família de pelo menos três genes (PIR1, PIR2 e PIR3) todos contendo repetições em série internas semelhantes de aproximadamente 19 aminoánidns. Mostrou-se que estavam presente homólogos dos genes PIR também em Kluyveromyces lactis e Zygosacharomyces rouxii (Toh-e et ai, 1993). A ruptura do gene HSP150/PIR2 mostrou que este não é um gene essencial (Russo et ai, 1992; Toh-e et ai, 1993).

Neste fascículo referimos rA como a proteína desejada.

Os nossos estudos revelaram que a proteína Hsp150 é separada de forma ineficiente da rHA por cromatografia de permuta iónica. Surpreendentemente, contudo, a Hsp150 não aparece na fraeção equivalente à fraeção de rHA quando a rHA está ausente. Por exemplo, quando o sobrenadante de uma cultura contendo rHA é passado através de uma coluna de permuta catiónica sob condições que asseguram a ligação da rHA à coluna (e.g. pH4,5, condutividade <7mS), a Hsp150 também se liga à coluna e é eluída nas mesmas condições que a rHA e assim contamina a preparação de rHA.

Contudo, quando o sobrenadante de uma cultura de uma levedura que não segrega rHA é passado através dessa coluna sob as mesmas condições, a proteína Hsp150 não se liga à matriz e passa directamente através da coluna. A fraeção de eluado não contém Hsp150 na ausência de rHA. De modo semelhante, a proteína Hsp150 não se liga a uma coluna de permuta aniónica em condições que resultariam na ligação da albumina (e.g., pH5,5, 1,5mS) na ausência de rHA, mas está presente na fraeção de eluado de rHA quando a rHA está presente. Verificámos surpreendentemente que a presença de rHA no sobrenadante da cultura altera significativamente o comportamento de algumas proteínas de leveduras durante a puriíicação cromatográfica da rHA de tal modo que proteínas com propriedades físico-químicas que indicam que seriam separadas da albumina, por exemplo por cromatografia de permuta iónica, na realidade contaminam a preparação de rHA e são difíceis de remover. 05 G29 ΕΡ 0 764 209/ΡΤ 4

Um aspecto da invenção proporciona um processo para a preparação de uma albumina recombinante a partir de uma levedura, compreendendo a cultura da levedura e a obtenção da albumina, caracterizado por a levedura ser deficiente em proteína de choque térmico 1 50 (Hsp1 50). O modo mais conveniente de o conseguir consiste em criar uma levedura que tenha um defeito no seu genoma de modo a que seja produzido um nível reduzido de proteína Hsp150. Por exemplo, pode haver uma deleção, uma inserção ou uma transposição na sequência de codificação ou nas regiões reguladoras (ou em outro gene que regule a expressão do gene de Hsp150) de modo a que pouca ou nenhuma proteína Hsp150 seja produzida. Alternativamente, a levedura poderá ser transformada para produzir um agente anti-Hsp150, tal como um anticorpo anti-Hsp150.

Para modificar o gene HSP150 de modo a que seja produzido um nível reduzido de proteína de co-purificação, podem ser empregues técnicas de mutagénese dirigida a locais ou outras técnicas conhecidas, para criar mutações simples ou múltiplas, tais como substituições, inserções, deleções e transposições, como descrito em Botstein e Shortle, "Strategies and Applications of In Vitro Mutagenesis", Science, 229: 193-210 (1985), que aqui se incorpora como referência. As mutações adequadas incluem mutações de terminação de cadeia (é evidente que códões de terminação introduzidos próximo da extremidade 3' podem ter um efeito insuficiente sobre o produto génico para serem benéficos; o perito na arte será prontamente capaz de criar uma mutação em, digamos, nos três quartos a 5' da sequência de codificação), mutações pontuais que alteram a estrutura de leitura, pequenas a grandes deleções da sequência de codificação, mutações no promotor ou no terminador que afectem a expressão do gene e mutações que destabilizem o ARNm. Algumas pontuações pontuais desejáveis ou substituições de aminoácidos específicos podem afectar o comportamento cromatográfico alterando a distribuição de carga. Portanto, a proteína produzida tem uma sequência de aminoácidos primária semelhante à da Hsp150 nativa, mas é funcionalmente distinta de modo que não co-purificará com a proteína desejada. Uma proteína assim modificada não é considerada como sendo a Hsp150. Podem ser introduzidas mutações específicas através de uma extensão da técnica de ruptura de genes conhecida como translocação génica (Winston, F. et al. (1983) Methods Enzymol. 101, 211-228). 85 629 ΕΡ Ο 764 209/ΡΤ

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Quaisquer polipéptidos inseridos na proteína Hsp150 não devem ser, e não devem criar, ligandos para a proteína desejada. Os peritos na arte podem prontamente determinar, por ensaios de ligação simples, se toi utilizado ou criado um ligando. De um modo geral utiliza-se um marcador detectável para romper uma sequência génica, mas não é necessariamente o caso, particularmente se for possível detectar a ruptura mesmo fenotipicamente. Em muitos casos a inserção da sequência interveniente será tal que está presente um códão de terminação em enquadramento com a sequência de Hsp150 e a sequência de codificação inserida não será traduzida. Alternativamente, a sequência inserida pode estar num enquadramento de leitura diferente do da Hsp1 50. O gene pode ter uma ou mais porções (incluindo opcionalmente regiões reguladoras, até ao gene completo) excisadas ou invertidas, ou pode ter uma porção inserida, de modo a resultar ou a não produção de proteína a partir do locus HSPT50 ou a produção de proteína a partir do locus HSP150 que não co-purifique com a proteína desejada.

Preferivelmente, a levedura segrega a albumina recombinante que é então purificada a partir do meio de fermentação. A purificação pode ocorrer noutro local; assim, a produção de meio de cultura, contendo albumina, em que o nível de proteína Hsp150 é baixo ou nulo, é por si só um fim.

Uma proteína é geralmente considerada como de co-purificação com a Hsp150 se as duas estiverem ainda associadas após duas técnicas de cromatográficas separação distintas (uma das quais é a cromatografia de afinidade para a proteína desejada) ou, se não for utilizada cromatografia de afinidade, se as proteínas ainda estiverem associadas após três passos distintos (por exemplo um passo de permuta aniónica, um de permuta catiónica e um de permeação em gel). A albumina sérica humana (HSA) ó uma proteína de 585 aminoácidos que está presente no soro humano a uma concentração de 35-45 g L'1 e representa cerca de 60% da proteína sérica total. A HSA é responsável por uma proporção significativa da pressão osmótica no soro, e também funciona como um transportador de ligandos endógenos e exógenos. É usada clinicamente no tratamento de pacientes com queimaduras graves, choque ou perda de sangue,

05 629 ΕΡ 0 764 209/ΡΤ e presentemente é produzida industrialmente por extracção a partir de sangue humano. A produção de albumina humana recombinante (rHA) em microorganismos foi descrita em EP 330 451 e EP 361 991. A albumina pode ser uma variante da HSA/rHA normal. No termo "variante" incluímos inserções, deleções e substituições, quer conservativas quer não conservativas, em que estas alterações não alteram substancialmente as propriedades oncóticas, de ligação a ligandos úteis ou não imunogénicas da albumina. Em particular, incluímos variantes polimórficas de ocorrência natural da albumina humana; fragmentos da albumina humana, por exemplo os fragmentos descritos em EP 322 094 (nomeadamente HSA (1-n), onde n é 369 a 419); e fusões de albumina com outras proteínas, por exemplo do tipo descrito em WO 90/13653.

Por "substituições conservativas" entendam-se trocas dentro de grupos tais como Gly, Ala; Vai, lie. Leu; Asp, Glu; Asn, Gin; Ser, Thr; Lys, Arg; e Phe, Tyr.

Um segundo aspecto principal da invenção proporciona uma levedura transformada para expressar uma albumina recombinante que irá co-purificar com a Hsp150 em técnicas cromatográficas, caracterizada por a levedura ser deficiente nessa Hsp150.

Em adição às próprias células hospedeiras transformadas, a presente invenção contempla também uma cultura dessas células, preferivelmente uma cultura monoclonal (homogénea do ponto de vista clonal), ou uma cultura derivada de uma cultura monoclonal, num meio nutriente. A albumina recombinante é produzida por meios convencionais, por exemplo a partir de uma sequência de codificação inserida no cromossoma da levedura ou num plasmídeo livre.

As leveduras são transformadas com uma sequência de codificação para a albumina de qualquer modo usual, por exemplo por electroporação. Métodos para transformação de leveduras por electroporação estão descritos em Becker & Guatente (1990) Methods Enzymol. 194, 182. 85 829 ΕΡ Ο 764 209/ΡΤ

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As células transformadas com sucesso, i.e., células que contêm uma construção de ADN da presente invenção, podem ser identificadas por técnicas bem conhecidas. Por exemplos, células resultantes da introdução de uma construção de expressão podem ser crescidas para produzir a albumina recombinante. As células podem ser recolhidas e lisadas e o seu conteúdo em ADN pode ser examinado quanto à presença de ADN utilizando um método tal como o descrito por Southern (1975) J. Mnl. Bicil. 98, 503 ou Berent et aí. (1985) Biotech. 3, 208. Alternativamente, a presença da albumina no sobrenadante pode ser detectada utilizando anticorpos.

Os vectores plasmídicos para leveduras úteis incluem pRS403-406 e pR413-416 e estão geralmente disponíveis de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA. Os plasmídeos pRS403, pRS404, pRS405 e pRS406 são plasmídeos de integração em leveduras ("Yeasts Integrating", Ylps) e incorporam os marcadores seleccionáveis de leveduras HIS3, TRP1, LEU2 e URA3. Os plasmídeos pRS413-416 são plasmídeos de centrómero em leveduras ("Yeast Centromere", YCps).

Foram desenvolvidos vários métodos para ligar operativamente ADN a vectores através de terminais coesivos complementares. Por exemplo, podem-se adicionar troços de homopolímero complementares ao segmento de ADN a inserir no vector de ADN. O vector e o segmento de ADN são então ligados por ligações de hidrogénio entre as caudas homopoliméricas complementares para formar moléculas de ADN recombinantes.

Ligantes sintéticos contendo um ou mais locais de restrição proporcionam um método alternativo para a ligação do segmento de ADN a vectores. O segmento de ADN, gerado por digestão com endonucleases de restrição conforme anteriormente descrito, é tratado com ADN-polimerase do bacteriófago T4 ou com ADN-polimerase I de E. coli, enzimas que removem terminais protuberantes em cadeia simples a 3' com as suas actividades 3'-5'-exonucleolíticas, e preenchem as extremidades 3' recuadas com as suas actividades de polimerização. A combinação destas actividades gera portanto segmentos de ADN de extremidades lisas. Os segmentos de extremidades lisas são então incubados com um grande excesso molar de moléculas ligantes na presença de uma ΕΡ Ο 764 209/ΡΤ 8

enzima que seja capaz de catalisar a ligação de moléculas de ADN de extremidades lisas, tal como a ADN-ligase do bacteriófago T4. Assim, os produtos da reacção são segmentos de ADN portadores de sequências ligantes poliméricas nas suas extremidades. Estes segmentos de ADN são então clivados com a enzima de restrição apropriada e ligados a um vector de expressão que tenha sido clivado com uma enzima que produz extremidades compatíveis com as do segmento de ADN.

Estão disponíveis no comércio ligantes sintéticos contendo vários locais para endonucleases de restrição, de várias fontes incluindo International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, EUA.

Um modo desejável de modificar o ADN de acordo com a invenção consiste em utilizar a reacção em cadeia com polimerase tal como descrito por Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491. Neste método o ADN que vai ser enzimaticamente amplificado é flanqueado por dois iniciadores oligonucleotídicos específicos que se incorporam por si no ADN amplificado. Os referidos iniciadores específicos podem conter locais de reconhecimento para endonucleases de restrição que podem ser utilizados para a clonagem em vectores de expressão utilizando métodos conhecidos na arte.

Qualquer levedura que produza uma proteína Hsp150 pode ser modificada de acordo com a invenção. São exemplos de géneros de leveduras contempladas como úteis na prática da presente invenção Pichia (Hansenuta), Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces,

Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobo/us, Endomycopsis e semelhantes. Os géneros preferidos são os seleccionados de entre o grupo que consiste em Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces e Torulaspora. São exemplos de Saccharomyces spp., S. cerevisiae, S. italicus e S. rouxii. São exemplos de Kluyveromyces spp., K. fragilis, K. lactis e K. morxiomus. Uma espécie de Torulaspora adequada ó T. delbrueckii. São exemplos de Pichia (Hansenula) spp., P. angusta (anteriormente H. polymorpha), P. anómala (anteriormente H. anómala) e P. pastoris. 85 620 ΕΡ 0 764 209/ΡΤ 9

Mostrou-se já que homólogos de HSP150 estão presentes numa vasta gama de géneros de leveduras diferentes: Tarulaspora sp., Kluyveromyces sp.# Schizosaccharomyces sp. e Zygosaccharomyces sp. (Kusso et al., 1992; Toh-e et al., 1993). Em adição, os nossos próprios estudos mostraram por Southern Blot que a Pichia sp. possui um homólogo de HSP150. São ensinados genericamente métodos para a transformação de S. cerevisiac em EP251 744, EP 258 067 e WO 90/01063, todos aqui incorporados por referência.

Promotores adequados para -S. cerevisiae incluem os que estão associados com o gene PGK1, com os genes GAL1 ou GAL10, CYC1, PH05, TRP1, ADHI, ADH2, os genes para gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofructoquinase, triose-fosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase, glucoquinase, feromona do factor α de acasalamento, feromona do factor a de acasalamento, o promotor de PRB1, o promotor de GUT2, o promotor de GPD 7, e promotores híbridos que envolvem híbridos de partes de regiões reguladoras a 5' com partes de regiões reguladoras a 5' de outros promotores ou com locais de activação a montante (e.g., o promotor de EP-A-258 067).

Os promotores reguláveis convenientes para utilização em Schizosaccharomyces pombe são o promotor repressível de tiamina do gene nmt como descrito por Maundrell (1990) J. Biol. Chem. 265, 10857-10864 e o promotor do gene fbpl repressível da glucose como descrito por Hoffman & Winston (1990) Genetics 124, 807-816. São ensinados métodos para a transformação de Pichia para expressão de genes estranhos em, por exemplo, Cregg et al. (1993) e várias patentes de Phillips (e.g. US 4 857 467, aqui incorporada por referência), e estão disponíveis no comércio estojos para expressão em Pichia de Invitrogen BV, Leek, Holanda, e Invitrogen Corp., San Diego, Califórnia. Os promotores adequados incluem A 0X1 e A 0X2. O artigo de Gellissen et al. (1992) mencionado acima e Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132, 3459-3465, incluem informação sobre vectores de Hansenula e transformação, sendo promotores adequados MOX1 e FMD1;

85 620 ΕΡ 0 764 209/ΡΤ 10 enquanto ΕΡ 361 991, Fleer et al. (1991) e outras publicações de Rhône-Poulenc Rorer ensinam como expressar proteínas estranhas em Kluyveromyces spp., sendo um promotor adequado o PGK1. O sinal de terminação da transcrição é preferivelmente a sequência flanqueadora a 3' de um gene eucariótico que contenha sinais apropriados para a terminação da transcrição e poliadenilação. As sequências flanqueadoras a 3' adequadas podem, por exemplo, ser as do gene naturalmente ligado à sequência de controlo da expressão utilizada, i.e. pode corresponder ao promotor. Alternativamente podem ser diferentes, caso em que se prefere o sinal de terminação do gene ADH1 de S. cerevisiae. A albumina recombinante pode inicialmente ser expressa com uma sequência de comando de secreção, que pode ser qualquer comando eficaz na levedura escolhida. Os comandos úteis em S. cerevisiae incluem os do polipéptido factor α de acasalamento (MFa-1) e os comandos híbridos de EP-A-387 319. Estes comandos (ou sinais) são clivados pela levedura antes da albumina madura ser libertada para o meio circundante. Adicionalmente, estes comandos incluem os da invertase de S. cerevisiae (SUC2) descritos em JP 62-096086 (concedida como 91/036516), da fosfatase ácida (PH05), da pré-sequência de MFa-1, da β-glucanase (BGL2) e da toxina assassina; da glucoamilase II de S. diastaticus; da α-galactosidade de S. car/sbergensis (MEL 7); da toxina assassina de K. lactis; e da glucoamilase de Candida.

Descrição detalhada da invenção

Os aspectos preferidos da invenção serão agora descritos com maior detalhe, com referência aos desenhos anexos, em que A Figura 1 é um esquema que mostra a preparação de um fragmento HSP150-URA3-HSP150 de EcoR\ utilizado para transformar uma estirpe de levedura (DBU3) e romper υ gene HSP150 (Exemplo 1); e A Figura 2 é um esquema que mostra a preparação de um outro fragmento de fcoRI utilizado para remover a sequência de codificação HSP150 toda junta (Exemplo 2).

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Todos os procedimentos Standard de ADN recombinante estão descritos em Sambrook et al (1989) a menos que especificado em contrário. As sequências de ADN que codificam rHA são derivadas do ADNc descrito em EP 201 239.

Exemplo 1 0 gene HSP150 foi mutado pelo processo de ruptura de genes (Rothstein, 1 983) que eliminou eficazmente parte da sequência de codificação de HSP150, evitando desse modo a produção de Hsp150.

Sintetizaram-se quatro oligonucleótidos para a amplificação por PCR das extremidades 5' e 3' do gene HSP150 (Russo et al·, 1992) utilizando um sintetizador de oligonucleótidos Biosystems 380B.

Extremidade 5' LRE45: 5' -CTATTTCCTATTTCGGGAATTCTTAAAGACAAAAAAGCTC-3' LRE46: 5' -GGCTGTGGTGCTGCAGATGATGCGCTGG-3'

Extremidade 3' LRE47: 5' -GCTACTTCCGCTTCTGCAGCCGCTACCTCC-3' LRE48: 5' -GCCGTGTAGCGAGGGAATTCTGTGGTCACGATCACTCG-3'

Note-se que LRE45 e LRE48 contêm alterações na sequência do gene HSP150 de modo a introduzir locais £coRI na extremidade 5' ou 3' dos produtos da PCR do gene HSP150. LRE46 e LRE47 contêm ambos locais Pst\, presentes naturalmente na sequência do gene HSP150 (SEQ 1). A PCR foi realizada para amplificar individualmente as extremidades 5' e 3' do gene HSP150, utilizando respectivamente LRE45 e LRE46 ou LRE47 e LRE48, a partir do ADN de ADN genómico de S. cerevisiae (Clontech Laboratories, Inc.).

As condições foram as seguintes: 1 pg/ml de ADN genómico, »*1,2x10'10 moles de cada iniciador, desnaturação a 94°C durante 61 segundos, hibridação a 37°C durante 121 segundos, síntese de ADN a 72°C durante

85 620 ΕΡ 0 764 209/ΡΤ 12 181 segundos e 30 ciclos, com um prolongamento de 10 segundos para o passo de síntese de ADN após cada ciclo, seguido de embebimento a 4°C. A PCR foi realizada utilizando um equipamento de ciclos térmicos Perkin-Elmer-Cetus e utilizou-se um estojo de PCR de Perkin-Elmer-Cetus de acordo com as recomendações do fabricante. Os produtos da PCR foram analisados por electroforese em gel e verificou-se serem do tamanho esperado. Cada produto de PCR foi digerido com EcoR\ e Pstl e clonado em pl)C19 digerido com EcoRI/Pstl (Yanisch-Perron et al., 1985) para formar pAYE503 (contendo a extremidade 5' do gene HSP150) e pAYE504 (contendo a extremidade 3' do gene HSP150) (veja-se Fig. 1).

A sequenciação do ADN plasmídico foi realizada para o pAYE503 e pAYE504 para confirmar que as inserções eram as sequências desejadas. Digeriram-se o pAYE503 e o pAYE504 com EcoR\ e Hind\\\ e isolaram-se os fragmentos do gene HSP150 e clonaram-se juntamente em pUC19XH (um derivado de pUC19 a que falta um local Hind\\\ no seu poliligante) para formar pAYE505. Isolou-se o gene URA3 a partir de Yep24 (Botstein et al., 1979) na forma de um fragmento Hind\\\ e clonou-se no local Hind\\\ de pAYE505 para formar o pAYE506 (Fig. 1). 0 pAYE506 contém um marcador seleccionável (URA3) flanqueado por regiões 5' e 3' do gene HSP150.

Para construir uma estirpe a que falte a capacidade de produzir HSP150, obteve-se um derivado ura3 de DB1 cir° pAYE316 (Sleep et al, 1991) por mutagénese química aleatória e selecção quanto a resistência ao ácido 5-fluoro-orótico (Boeke et al., 1987). 0 plasmídeo pAYE316 é baseado no plasmídeo de 2 μιτι e contém uma sequência de codificação para a albumina humana sob o controlo do promotor PRB1 de levedura, com um terminador ADH1 e um marcador seleccionável LEU2. A estirpe foi crescida durante a noite em 100 ml de meio mínimo tamponado (Yeast Nitrogen Base [sem aminoácidos, sem sulfato de amónio, Difco], (NH4)2S04 o 5 g/l, ácido cítrico mono-hidratado a 6,09 g/l, NaHP04 a 20,16 g/l, sacarose a 20 g/l, pH6,5) e recolheram-se as células por centrifugação e depois lavaram-se uma vez com água estéril. Ressuspenderam-se então as células em 10 ml de água estéril e colocaram-se alíquotas de 2 ml em tubos Falcon de 15 ml separados. Adicionou-se então uma solução a 5 mg/ml de N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) aos tubos, 85 620 ΕΡ 0 764 209/ΡΤ 13

como se segue: Ο μΙ, 20 μΙ, 40 μΙ, 80 μΙ ou 1 60 μΙ. Incubaram-se então as células a 30°C durante 20 minutos e depois centrifugou-se e lavou-se três vezes com água estéril. Finalmente, ressuspenderam-se as células em 1 ml de YEP (extracto de levedura a 1% p/v, Bactopeptona a 2% p/v) e armazenou-se a 4°C. A percentagem de células que sobreviveu ao tratamento mutagénico foi determinada espalhando diluições das amostras em placas de YEP contendo sanarnsfi a 2% p/v e incubando a 30°C durante 3 dias. As células provenientes do tratamento que originaram aproximadamente 50% de sobrevivência foram crescidas em placas de YEP contendo sacarose a 2% p/v e depois em placas réplica sobre meio mínimo YNB contendo sacarose a 2% p/v e suplementado com ácido 5-fluoro-orótico (1 mg/ml) e uracilo (50 pg/ml). As colónias capazes de crescer sobre este meio foram purificadas, testadas para verificar que eram incapazes de crescer na ausência de suplemento de uracilo e que este defeito podia ser corrigido por introdução do gene URA3 por transformação. A estirpe ura3, DBU3 cir° (pAYE316), foi transformada com pAYE506 digerido com fcoRI e seleccionaram-se os transformantes Ura + . A ruptura do gene HSP150 nestes transformantes foi confirmada por análise de Southern B/ot utilizando um fragmento compreendendo as extremidades 5' e 3' do gene HSP150 (o fragmento £coRI de pAYE505) como sonda. A levedura foi então crescida até uma alta densidade celular por cultura descontínua com alimentação ("fed batch") em meio mínimo num fermentador (Collins, 1990). Em resumo, um fermentador com volume de trabalho de 101 foi alimentado até 5 I com um meio inicial contendo 50 mg/ml de uma mistura concentrada de sais (Tabelai), 10ml/l de uma solução de elementos vestigiários (Tabela 2), 50 ml/l de uma mistura de vitaminas (Tabela 3) e 20 g/l de sacarose. Manteve-se um volume igual de meio de alimentação contendo 100 ml/l da mistura de sais, 20 ml/l da mistura de elementos vestigiários, 100 ml/l de solução de vitaminas e 500 g/l de sacarose, num recipiente separado, ligado ao fermentador através de uma bomba de medição. Manteve-se o pH a 5,7 ± 0,2 através da adição automática dc hidróxido de amónio ou ácido sulfúrico, e manteve-se a temperatura a 30°C. A velocidade de agitação foi ajustada de modo a originar uma tensão de oxigénio dissolvido >20% de saturação de ar a 1 v/v/min de caudal de ar. ΕΡ Ο 764 209/ΡΤ 14 S£ PJÍSS&&

Tabela 1. Mistura de sais

Produto químico Concentração (g/D J kh2po4 114,0 I MgS04 12,0 | CaCI2.6H20 3,0 Na2FDTA 2,0 |

Tabela 2. Solução de elementos vestigiários

Produto químico Concentração (g/l) ZnS04.7H20 3,0 FeS04.7H20 10,0 MnS04.4H20 3,2 CuS04.5H20 0,079 H3BO3 1,5 Kl 0,2 Na2Mo04.2H70 0,5 CoCI2.6H20 0,56 h3po4 75 ml/l

Tabela 3. Solução de vitaminas

Produto químico Concentração (g/l) I Pantotenato de Ca 1,6 Ácido nicotínico 1,2 m-inositol 12,8 Tiamina HCI 0,32 Piridoxina HCI 0,8 Biotina 0,008 0 fermentador foi inoculado com 100 ml de uma cultura de um dia para o outro de S. cerevisiae crescida em meio mínimo tamponado (Yeast Nitrogen Base [sem aminoácidos, sem sulfato de amónio, Difco] 1,7 g/l, (NH4)2S04 a 5 g/l, ácido cítrico mono-hidratado a 6,09 g/l, Na2HP04 a 20,16 g/l, sacarose a 20 g/l, pH6,5). A fermentação descontínua inicial prosseguiu até a fonte de <·- ζ/.ν £ ^ ιπί'Ο'·—^

85 629 ΕΡ Ο 764 209/ΡΤ 15 carbono ter sido consumida, ponto em que se ligou a bomba de medição e a adição de alimentação foi controlada por computador (o sistema micro MFCS, B. Braun, Melsungen, Alemanha) utilizando um algoritmo baseado no que foi desenvolvido por Wang et ai (1979). Utilizou-se um espectrómetro de massa em conjunto com o sistema de controlo por computador para monitorar os gases de saída do fermentador e para controlar a adição de alimentação de modo a manter uma taxo de crescimento regulada (e.g. 0,1 h'1). A conversão máxima de substrato de carbono em biomassa é conseguida mantendo o coeficiente de respiração inferior a 1,2 (Collins, 1990) e, deste modo, conseguem-se densidades celulares de aproximadamente 100 g/l em peso de células secas. O caldo de fermentação foi centrifugado para remover as células e depois submetido a purificação por cromatografia de afinidade como se segue. Passou-se o sobrenadante da cultura através de uma coluna de Sepharose Cibacron Blue F3GA (Pharmacia) que tinha sido lavada com tampão de fosfato de glicina 0,1 M, pH8,0. Eluiu-se então a rHA da coluna com NaCI 2 M, fosfato de glicina 0,1 Μ, pH8,0. A albumina pode alternativamente ser purificada a partir do meio de cultura através de várias técnicas conhecidas para purificação da albumina a partir de soro ou do meio de cultura da fermentação, por exemplo os descritos em WO 92/04367, Maurel et al. (1989), Curling (1980) e EP 524 681. A análise da rHA purificada a partir de estirpes de Hsp150 revelou que não estava presente nestas amostras a proteína HSP150. A proteína HSP150 é determinada utilizando técnicas da arte anterior tais como ELISA ou Western Blot.

Estão descrito anticorpos anti-HSP150 em Russo et al. (1992) Proc. Nat. Acad. Sei. (USA) 89, 3671-3675.

Exemplo 2

Eliminou-se a sequência de codificação da proteína HSP150 utilizando fragmentos alternados das sequências de HSP150 clonadas, como se segue. 85 629 ΕΡ Ο 764 209/ΡΤ 16

Ο fragmento URA3 Hind\\\ de Yep24 (veja-se o Exemplo 1) foi clonado em plC19R (Marsh J.L. et al. (1984) Gene 32, 481-485) em Hind\\\ para formar o pAYE601 e depois foi excisado na forma de um fragmento Sacl/C/al e inserido em pAYE505 nos locais Xho\ e C/al para formar o pAYE602 (Fig. 2). Este plasmídeo foi digerido com fcoRI e depois foi utilizado para transformar DBU3 cir° (pAYE316), seleccionando os transformantes Ura + . A ruptura do Qfinfi HSP150 nestes transformantes foi confirmada por análise de Southern Blot como descrito no Exemplo 1.

Assim, neste exemplo, é removida a sequência de codificação de HSP150 completa, enquanto no Exemplo 1 a sequência é destruída para originar uma proteína não funcional.

Exemplo 3 A análise de Southern Blot revelou um homólogo de Hsp150 em Hansenula polymorpha (agora denominada Pichia angusta). 0 gene de P. angusta pode ser funcionalmente eliminado por vias análogas às dos Exemplos 1 e 2.

Referências

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Collins, S.H. (1990) in Protein Production by Biotechnology (Harris, T.J.R., ed.) p. 61-77, Elsevier, Barking, Essex.

Curling (1980) "Albumin Purification by lon Exchange Chromatography", em "Methods of Plasma Protein Purification", Ed. Curlong, J.M., Academic Press,

London.

Fleer, R. et al. (1991) Bio/Technology 9, 968-975.

Maurel et al. (1989) "Biotechnology of Plasma Proteins", Colloque INSERM 175, 19-24. λά £Υ-·

85 62Θ ΕΡ Ο 764 209/ΡΤ 17

Romanos, Μ. et al. (1992) Yeast 8, 423-488.

Rothstein, R.J. (1983) Methods Enzymol. 101, 202-21 1.

Russo, P. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 3671-3675.

Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2a edição. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Sleep, D. et al. (1991) Bio/Technology 9, 183-187.

Toh-e et al. (1993) Yeast 9, 481-494.

Wang, H.Y. et al. (1979) Biotechnology & Bioeng. 21, 975.

Yanisch-Perron, C. et al. (1985) Gene 33, 103-119. ;

85 620 ΕΡ 0 764 209/ΡΤ 18

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: Delta Biotechnology Limited (B) RUA: Castle Court, castle Boulevard (C) CIDADE: Nottingham (E) PAÍS: Reino Unido

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): NG7 1FD (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Estirpes de Leveduras (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 6 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SUPORTE LÓGICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (EPO) (v) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: GB 9411356.0 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 07-JUN-1994 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feacture (B) LOCALIZAÇÃO: 1..40 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note = "Oligonucleotide for PCR amplification of 5' end of Hsp1 50 gene." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: 40

CTATTTCCTA TTTCGGGAAT TCTTAAAGAC AAAAAAGCTC

85 620 ΕΡ 0 764 209/ΡΤ 19 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: misc- CARACTERÍSTICAS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..28 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note= "Oligonucleotide for PCR amplification of the 5'end of the Hsp1 50 gene." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: GGCTGTGGTG CTCCAGATGA TGCGCTGG 28 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: misc-- CARACTERÍSTICAS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..30 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note= "Oligonucleotide for PCR amplification of 3'end of the Hsp150 gene." 85 629 ΕΡ Ο 764 209/ΡΤ

30 20 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: GCTACTTCCG CTTCTGCAGC CGCTACCTCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: misc- CARACTERÍSTICAS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..38 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note= "Oligonucleotide for PCR amplification of the 3'end of the Hsp1 50 gene." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: GCCGTGTAGC GAGGGAATTC TGTGGTCACG ATCACTCG 38 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2048 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE DE ORIGEM: (A) ORGANISMO: Saccharomyces cerevisiae

85 Θ29 ΕΡ Ο 764 209/ΡΤ 21 (ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: CDS (Β) LOCALIZAÇÃO: 397..1638 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: AGTGATCTTA CTATTTCCTA TTTCGGAAAT TATTAAAGAC AAAAAAGCTC ATTAATGGCT 60 TTCCGTCTGT AGTGATAAGT CGCCAACTCA GCCTAATTTT TCATTTCTTT ACCAGATCAG 120 GAAAACTAAT AGTACAAATG AGTGTTTTCT CAAGCGGAAC ACCACATTTT GAGCTAAATT 180 TAGATTTTGG TCAAAATAAG AAAGATCCTA AAAAAGGAAT GGTTGGTGAA AAATTTATTA 240 GCTTGAATGG TAGGAATCCT CGAGATATAA AAGGAACACT TGAAGTCTAA CGACAATCAA 300 TTTCGATTAT GTCCTTCCTT TTACCTCAAA GCTCAAAAAA ATATCAATAA GAAACTCATA 360 TTCCTTTTCT AACCCTAGTA CAATAATAAT AATATA ATG CAA TAC AAA AAG ACT 414 TTG GTT GCC TCT GCT TTG GCC GCT ACT Leu Vai Ala Ser Ala Leu Ala Ala Thr 10 15 TCT GAG CCT TGG TCC ACT TTG ACT CCA Ser Glu Pro Trp Ser Thr Leu Thr Pro 25 30 GTT ACC GAC TAC GCT TCC ACC TTC GGT Vai Thr Asp Tyr Ala Ser Thr Phe Gly 40 45 ACT ACA TCC AGC GCA TCA TCT GCA GCC Thr Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ala Ala 55 60 AAG AGA GCT GCT TCC CAA ATT GGT GAT Lys Arg Ala Ala Ser Gin Ile Gly Asp 75 ACT ACT GCT TCT GTC TCT ACC AAG AGT Thr Thr Ala Ser Vai Ser Thr Lys Ser 90 95 ATC GGT GAT GGT CAA ATC CAA GCT ACT Ile Gly Asp Gly Gin Ile Gin Ala Thr 105 110 GTC TCT CAA ATT GGT GAT GGT CAA ATT Vai Ser Gin Ile Gly Asp Gly Gin Ile 120 125 TCT GCT AAG ACT ACC GCC GCT GCC GTT Ser Ala Lys Thr Thr Ala Ala Ala Vai 135 140 ATC CAA GCT ACC ACC ACT ACT TTA GCC Ile Gin Ala Thr Thr Thr Thr Leu Ala 155

Met Gin Tyr Lys Lys Thr 1 5 ACA TTG GCC GCC TAT GCT CCA 462 Thr Leu Ala Ala Tyr Ala Pro 20 ACA GCC ACT TAC AGC GGT GGT 510 Thr Ala Thr Tyr Ser Gly Gly 35 ATT GCC GTT CAA CCA ATC TCC 558 Ile Ala Vai Gly Pro Ile Ser 50 ACC ACA GCC TCA TCT AAG GCC 606 Thr Thr Ala Ser Ser Lys Ala 65 70 GGT CAA GTC CAA GCT GCT ACC 654 Gly Gin Vai Gly Ala Ala Thr 80 85 ACC GCT GCC GCC GTT TCT CAG 702 Thr Ala Ala Ala Vai Ser Gin 100 ACT AAG ACT ACC GCT GCT GCT 750 Thr Lys Thr Thr Ala Ala Ala 115 CAA GCT ACC ACC AAG ACT ACC 798 Gin Ala Thr Thr Lys Thr Thr 130 TCT CAA ATC AGT GAT GGT CAA 846 Ser Gin Ile Ser Asp Gly Gin 145 150 CCA AAG AGC ACC GCT GCT GCC 894 Pro Lys Ser Thr Ala Ala Ala 160 165

ΕΡ 0 764 209/ΡΤ 22 GTT TCT CAA ATC GGT GAT GGT CAA GTT CAA GCT ACC ACC ACT ACT TTA 942 Vai Ser Gin Ile Gly Asp Gly Gin Vai Gin Ala Thr Thr Thr Thr Leu 170 175 180 GCC CCA AAG AGC ACC GCT GCT GCC GTT TCT CAA ATC GGT GAT GGT CAA 990 Ala Pro Lys Ser Thr Ala Ala Ala Vai Ser Gin Ile Gly Asp Gly Gin 185 190 195 GTT CAA GCT ACT ACT AAG ACT ACC GCT GCT GCT GTC TTT CAA ATT GGT 1038 Vai Gin Ala Thr Thr Lys Thr Thr Ala Ala Ala Vai Phe Gin Ile Gly 2UU 205 210 GAT GGT CAA GTT CTT GCT ACC ACC AAG ACT ACT CGT GCC GCC GTT TCT 1086 Asp Gly Gin Vai Leu Ala Thr Thr Lys Thr Thr Arg Ala Ala Vai Ser 215 220 225 230 CAA ATC GGT GAT GGT CAA GTT CAA GCT ACT ACC AAG ACT ACC GCT GCT 1134 Gin Ile Gly Asp Gly Gin Vai Gin Ala Thr Thr Lys Thr Thr Ala Ala 235 240 245 GCT GTC TCT CAA ATC GGT GAT GGT CAA GTT CAA GCA ACT ACC AAA ACC 1182 Ala Vai Ser Gin Ile Gly Asp Gly Gin Vai Gin Ala Thr Thr Lys Thr 250 255 260 ACT GCC GCA GCT GTT TCC CAA ATT ACT GAC GGT CAA GTT CAA GCC ACT 1230 Thr Ala Ala Ala Vai Ser Gin Ile Thr Asp Gly Gin Vai Gin Ala Thr 265 270 275 ACA AAA ACC ACT CAA GCA GCC AGC CAA GTA AGC GAT GGC CAA GTC CAA 1278 Thr Lys Thr Thr Gin Ala Ala Ser Gin Vai Ser Asp Gly Gin Vai Gin 280 285 290 GCT ACT ACT GCT ACT TCC GCT TCT GCA GCC GCT ACC TCC ACT GAC CCA 1326 Ala Thr Thr Ala Thr Ser Ala Ser Ala Ala Ala Thr Ser Thr Asp Pro 295 300 305 310 GTC GAT GCT GTC TCC TGT AAG ACT TCT GGT ACC TTA GAA ATG AAC TTA 1374 Vai Asp Ala Vai Ser Cys Lys Thr Ser Gly Thr Leu Glu Met Asn Leu 315 320 325 AAG GGC GGT ATC TTA ACT GAC GGT AAG GGT AGA ATT GGT TCT ATT GTT 1422 Lys Gly Gly Ile Leu Thr Asp Gly Lys Gly Arg Ile Gly Ser Ile Vai 330 335 340 GCT AAC AGA CAA TTC CAA TTT GAC GGT CCA CCA CCA CAA GCT GGT GCC 1470 Ala Asn Arg Gin Phe Gin Phe Asp Gly Pro Pro Pro Gin Ala Gly Ala 345 350 355 ATC TAC GCT GCT GGT TGG TCT ATA ACT CCA GAC GGT AAC TTG GCT ATT 1518 Ile Tyr Ala Ala Gly Trp Ser Ile Thr Pro Asp Gly Asn Leu Ala Ile 360 365 370 GGT GAC AAT GAT GTC TTC TAC CAA TGT TTG TCC GGT ACT TTC TAC AAC 1566 Gly Asp Asn Asp Vai Phe Tyr Gin Cys Leu Ser Gly Thr Phe Tyr Asn 375 380 385 390 TTG TAC GAC GAA CAC ATT GGT AGT CAA TGT ACT CCA GTC CAC TTG GAA 1614 Leu Tyr Asp Glu His Ile Gly Ser Gin Cys Thr Pro Vai His Leu Glu 395 400 405

85 629 ΕΡ Ο 764 209/ΡΤ 23 GCT ATC GAT TTG ΑΤΑ GAC TGT TAAGCAGAAA ACTATTAGTT CTTTTATCCT 1665 Ala Ile Αορ Leu Ilc Asp Cys 410 GATGACTTTT TCTCATTTGC ATTGATTAGA AAGGAAAAAA AGAAGTGTCC TTTTCTACTA 1725 CTACTCTAGT CGCATCCATT CCTTTGCATT TATCTTTTCT GCGGTTGGCC AATCCATTCT 1785 TCCGAGAATT TGGCTAGCCA TACTTGATGT TTTCCCATTA TTGGTTCGTT TGGCAATGCT 1845 AATTTTCTTA ATTGCCCCTT ATATACTCTT CCATAAAATG TTTTTTTTAT AACTAATTTT 1905 CTGTATATCA 7TATCTAATA ATCTTATAAA ATGTTAAAAA GACTTGGAAA GCAACGAGTG 1965 ATCGTCAGCA CATAATTGCC TCGCTACACG GCAAAAATAA GCCAGTCCTA ATGTGTATAT 2025 TAAAGGCTGC ATGTGGCTAC GTC 2048 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 413 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Met Gin Tyr Lys Lys Thr Leu Val Ala Ser Ala Leu Ala Ala Thr Thr 1 5 10 15 Leu Ala Ala Tyr Ala Pro Ser Glu Pro Trp Ser Thr Leu Thr Pro Thr 20 25 30 Ala Thr Tyr Ser Gly Gly Vai Thr Asp Tyr Ala Ser Thr Phe Gly Ile 35 40 45 Ala Vai Gin Pro Ile Ser Thr Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ala Ala Thr 50 55 60 Thr Ala Ser Ser Lys Ala Lys Arg Ala Ala Ser Gin Ile Gly Asp Gly 65 70 75 80 Gin Vai Gin Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ser Val Ser Thr Lys Ser Thr 85 90 95 Ala Ala Ala Vai Ser Gin Ile Gly Asp Gly Gin Ile Gin Ala Thr Thr 100 105 110 Lys Thr Thr Ala Ala Ala Vai Ser Gin Ile Gly Asp Gly Gin Ile Gin 115 120 125 Ala Thr Thr Lys Thr Thr Ser Ala Lys Thr Thr Ala Ala Ala Val Ser 130 135 140 Gin Ile Ser Asp Gly Gin Ile Gin Ala Thr Thr Thr Thr Leu Ala Pro 145 150 155 160 Lys Ser Thr Ala Ala Ala Val Ser Gin Ile Gly Asp Gly Gin Val Gin 165 170 175 24 05 629 ΕΡ 0 764 209/ΡΤ

Ala Thr

Gin Ile

Ala Vai 210 Thr Arg 22b

Thr Lys

Gin Ala

Gly Gin

Ser Asp 290 Ala Thr 305

Thr Leu

Arg Ile

Pro Pro

Asp Gly 370 Ser Gly 385

Thr Pro

Thr Thr Thr Leu Ala Pro Lys Ser Thr Ala Ala Ala Vai Ser 1 80 185 190 Gly Asp Gly Gin Vai Gin Ala Thr Thr Lys Thr Thr Ala Ala 195 200 205 Phe Gin Ile Gly Asp Gly Gin Vai Leu Ala Thr Thr Lys Thr 215 220 Ala Ala Vai Ser Gin Ile Gly Asp Gly Gin Vai Gin Ala Thr 230 235 240 Thr Thr Ala Ala Ala Vai Ser Gin Ile Gly Asp Gly Gin Vai 245 250 255 Thr Thr Lys Thr Thr Ala Ala Ala Vai Ser Gin Ile Thr Asp 260 265 270 Vai Gin Ala Thr Thr Lys Thr Thr Gin Ala Ala Ser Gin Vai 275 280 285 Gly Gin Vai Gin Ala Thr Thr Ala Thr Ser Ala Ser Ala Ala 295 300 Ser Thr Asp Pro Vai Asp Ala Vai Ser Cys Lys Thr Ser Gly 310 315 320 Glu Met Asn Leu Lys Gly Gly Ile Leu Thr Asp Gly Lys Gly 325 330 335 Gly Ser Ile Vai Ala Asn Arg Gin Phe Gin Phe Asp Gly Pro 340 345 350 Gin Ala Gly Ala Ile Tyr Ala Ala Gly Trp Ser Ile Thr Pro 355 360 365 Asn Leu Ala Ile Gly Asp Asn Asp Vai Phe Tyr Gin Cys Leu 375 380 Thr Phe Tyr Asn Leu Tyr Asp Glu His Ile Gly Ser Gin Cys 390 395 400 Vai His Leu Glu Ala Ile Asp Leu Ile Asp Cys 405 410

Lisboa,

Por DELTA BIOTECHNOLOGY LIMITED - O AGENTE OFICIAL -

Claims (15)

1. ΕΡ Ο 764 209/ΡΤ 1/2

   REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a preparação de uma albumina recombinante a partir de levedura, compreendendo a cultura da levedura e a obtenção da albumina, caracterizado por a levedura ser deficiente na proteína de choque térmico 150 (Hsp1 50).
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1 em que a levedura tem um defeito no seu genoma tal que é produzido um nível reduzido da proteína Hsp150.
3. 3. Processo para a preparação de uma albumina recombinante a partir de levedura, compreendendo a cultura da levedura e a obtenção da albumina, caracterizado por não ser produzida proteína Hsp150 pela levedura.
4. 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em que a albumina é uma albumina humana.
5. 5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a levedura é uma espécie de Torulaspora, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Pichia ou Saccharomyces.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5 em que a levedura é S. cerevisiae.
7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a albumina recombinante é segregada a partir da levedura para o meio circundante e a partir deste purificada.
8. 8. Levedura transformada para expressar uma albumina recombinante, caracterizada por a levedura ser deficiente em Hsp150.
9. 9. Levedura de acordo com a reivindicação 8 em que a levedura tem um defeito no seu genoma tal que produz um nível reduzido da proteína Hsp150. 85 629 ΕΡ Ο 764 209/ΡΤ 2/2
10. 10. Levedura de acordo com a reivindicação 8 em que substancialmente não é produzida proteína Hsp150 pela levedura.
11. 11. Levedura de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10 em que a albumina é uma albumina humana.
12. 12. Levedura de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11 em que a levedura é uma espécie de Torulaspora, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces ou Saccharomyces.
13. 13. Levedura de acordo com a reivindicação 12 em que a levedura é S. cerevisiae.
14. 14. Levedura de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13 em que a levedura é transformada com uma construção de ADN tal que a albumina recombinante é segregada a partir da levedura durante a sua cultura.
15. 15. Método de preparação de uma levedura de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14 compreendendo os passos de (i) transformação da levedura com uma sequência de codificação para a expressão da albumina recombinante, e (ii) ruptura do genoma da levedura de modo a que a levedura tenha um nível anormalmente baixo de Hsp150, em que os passos (i) e (ii) podem ser realizados em qualquer ordem ou em simultâneo. Lisboa, 21 'r/. 2'-.· Por DELTA BIOTECHNOLOGY LIMITED - O AGENTE OFICIAL -