DE69431050T2

DE69431050T2 - PYRIDO[2,3-b](1,4)BENZODIAZEPINONE ALS M2-REZEPTORLIGAND ZUR BEHANDLUNG NEUROLOGISCHER STÖRUNGEN

Info

Publication number: DE69431050T2
Application number: DE69431050T
Authority: DE
Inventors: R. Tyler Mccabe; A. Rhodes; R. Wilson
Original assignee: Pharmaceutical Discovery Corp
Current assignee: Mannkind Corp
Priority date: 1993-04-05
Filing date: 1994-04-05
Publication date: 2003-03-13
Anticipated expiration: 2014-04-06
Also published as: DK0693070T3; PT693070E; WO1994022861A1; DE69431050D1; AU688318B2; US5712269A; EP0693070A1; ATE221067T1; ES2180575T3; EP0693070B1; JP3638950B2; CA2159815A1; EP1120416A1; AU6626194A; JPH08510999A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet von neuralen Rezeptoren, insbesondere auf dem Gebiet von Liganden für den Muscarin&sub2;-Rezeptor.

Cholinerge Muscarinrezeptoren

Acetylcholin triggert zwei Klassen von Membranrezeptoren: Nicotin- und Muscarinrezeptoren. Der Nicotinrezeptor ist ein kationenspezifischer Kanal in postsynaptischen Membranen, während der Muscarinrezeptor ein Sieben-Helix- Transmembranprotein, das G-Proteine triggert, ist. Eine Blockade des cholinergen Muscarinrezeptors beeinträchtigt die Gedächtnisleistung, während eine Verstärkung der Muscarinrezeptoraktivität die Gedächtnisfunktion verbessert.
Molekularbiologische Untersuchungen ergaben die Existenz von mindestens fünf Subtypen des cholinergen Muscarinrezeptors, wie bei T. I. Bonner, Trends Neurosci, 12: 145- 151 (1989) zusammengefasst ist. Die mit der Synthese dieser Rezeptorsubtypen verbundene Messenger-RNA (mRNA) wurde unter Verwendung der Technik der In-situ-Hybridisierung, die bei N. J. Buckley et al., J. Neurosc, 8: 4646-4652 (1989) beschrieben ist, lokalisiert. Diese Muscarinrezeptoren sind im das Zentralnervensystem (ZNS) weit verbreitet, mit Ausnahme des M&sub2;-Rezeptors, der relativ spezialisiert zu sein scheint und sich nur in einigen wenigen singulären Regionen findet, wie von C.-F. Liao et al., J. Biol Chem., 264: 7328- 7337 (1989) berichtet wurde. Die Existenz von cholinergen Muscarinrezeptorsubtypen verspricht die Entwicklung neuer Arzneimittel, die auf nur einen Rezeptor zielgerichtet sind, während sie andere nicht beeinflussen. Die vielen Nebenwirkungen cholinerger Verbindungen, die sich bisher ergaben, die von D. Colleton, Neurosci, 19(1): 1-28 (1986) zusammengefasst sind, machen diesen Ansatz zu einem sehr erstrebenswerten. Ein stärker spezifisches Arzneimittel, das nur auf einem Rezeptorsubtyp wirkt, sollte sich stärker auf dessen Wirkungen konzentrieren.

Der Muscarin&sub2;-Rezeptor

Die Freisetzung von Acetylcholin (ACh) scheint durch präsynaptische Rezeptoren des Muscarin&sub2; (M&sub2;)-Typs moduliert zu sein. Während der letzten vergangenen Jahre sammelten sich Belege an, dass M&sub2;-Rezeptoren sich an mehreren Stellen des ZNS an präsynaptischer Stelle befinden, wie dies von D. G. Spencer et al., Brain Res., 380: 59-68 (1986) zusammengefasst wurde, und diese Stellen sind bei Alzheimer-Krankheit vermindert, wie dies von D. C. Mash et al., Science, 288: 1115-1117 (1985) und R. Quirion et al., TIPS, Dez.- Suppl. 80-84 (1989) berichtet wurde. Die präsynaptischen M&sub2;-Rezeptoren an cholinergen Neuronen stellen Autorezeptoren dar, die die Freisetzung von Ach von dem cholinergen Neuron regulieren, wie dies von Z. Pittel et al., J. Neurochem., 55: 665-672 (1990) berichtet wurde. Die Verwendung eines spezifischen M&sub2;-Liganden, der diese Stellen blockiert, sollte die ACh-Spiegel an der Synapse erhöhen, wodurch die Effektivität von ACh als Neurotransmitter an der Synapse und in Bereichen, in denen dessen Konzentration durch eine Abnahme der cholinergen Neuronen, wie er bei Alzheimer-Krankheit beobachtet wird, vermindert wurde, erhöht wird. Mehrere relativ spezifische M&sub2;-Antagonisten wurden entwickelt. Diese Antagonisten durchdringen jedoch die Blut-Hirn-Schranke nicht.

Neurologische Erkrankungen

Demenz

Demenz ist eine fortschreitende Abnahme der mentalen Funktion, des Gedächtnisses und erworbener mentaler Fähigkeiten. Etwa 11% der Personen in den Vereinigten Staaten eines Alters von über 65 Jahren zeigen eine schwache bis starke mentale Beeinträchtigung und ab einem Alter von 75 nimmt das Auftreten von Demenz mit jedem Lebensjahr um 2% zu. Derzeit leiden über 1 Million Personen in den Vereinigten Staaten an einer schweren Demenz und schätzungsweise 120 000 davon sterben jedes Jahr an mit schwerer Demenz in Verbindung stehenden Ursachen, wie dies von J. Goldman und L. Côté, Principles of Neural Science, 3. Auflage, Hrsg. Kandel et al., 974-983 (Elsevier New York 1991) berichtet wurde.
Etwa 70% aller Fälle von Demenz beruhen auf Alzheimer-Krankheit, während ein geringer Prozentsatz der Fälle mit anderen neurodegenerativen Erkrankungen, wie Chorea Huntington oder Parkinson-Krankheit, verbunden sind.

Alzheimer-Krankheit

Alzheimer-Krankheit (AD) ist durch eine Zellabnahme im cholinergen System, im Septohippocampuspfad und in den Fortsätzen vom Nucleus basalis zur Hirnrinde gekennzeichent, D. Colleton, Neurosci., 19(1): 1-28 (1986) und G. Smith, Brain Res. Rev. 13: 103-118 (1988). Die Beteiligung von cholinergen Arzneimittelwirkstoffen an der Gedächtnisfunktion ist gut dokumentiert. Beispielsweise beeinträchtigen cholinerge Muscarinantagonisten, wie Scopolamin, die Gedächtnisfunktion. Mehrere cholinerge Agonisten wurden entwickelt, die die Bindung an Muscarinrezeptorstellen beeinflussen. Cholinerge Agonisten und Anticholinesterasen wurden erfolgreich zur Verbesserung des Gedächtnisses bei ausgewählten Patienten verwendet, wie dies von D. Colleton, Neurosci. 19(1): 1-28 (1986) berichtet wurde. Diese Verbindungen wirken jedoch kurzzeitig und ihre Nebenwirkungen werden für den behandelten Patienten bald unerträglich, wie dies von D. Colleton, Neurosci., 19(1): 1- 28 (1986) berichtet wurde.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung von Verbindungen, die zur Behandlung neurologischer Erkrankungen verwendbar sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Verbindungen zur Behandlung von Demenz, die die Blut-Hirn-Schranke in effektiver therapeutischer Weise durchdringen und die entweder oral, intravenös oder parenteral verabreicht werden können.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Verbindungen zur Behandlung von Demenz, die die mit den derzeitigen Verfahren zur Behandlung neurologischer Erkrankungen verbundenen Nebenwirkungen minimieren und für eine Langzeitbehandlung geeignet sind.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Muscarin-M&sub2;-Rezeptorliganden, die zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen geeignet sind und die mit minimalen Nebenwirkungen verabreicht werden können, werden beschrieben.
Die hier beschriebenen Verbindungen besitzen die folgende allgemeine Struktur:
Die Liganden werden durch Reaktion von Verbindung 2 (Fig. 1) mit einem Überschuss eines sekundären Amins hergestellt. Das sekundäre Amin kann auf drei Wegen hergestellt werden:
(1) Reaktion eines Säurechlorids mit N,N-Dialkyldiaminoalkanen,
(2) Reaktion eines primären Amins und einer aktivierten N,N-Dialkylalkansäure und
(3) Reaktion eines primären Amins mit einem Chloralkanoylchlorid, wobei ein Alkylchlorid erhalten wird, das dann mit einem sekundären Amin umgesetzt wird.
Die Verbindungen können oral, intraperitoneal, intravenös, intramuskulär oder topisch in einer therapeutisch wirksamen Dosierung, d. h. die eine Verstärkung der Wahrnehmungsfunktion mit einem therapeutischen Index von 2 oder mehr ergibt, vorzugsweise oral einmal täglich in einer Dosierung von 10 mg Verbindung/kg Körpergewicht zur Wahrnehmungsverstärkung bei einer Person, die eine derartige Verstärkung benötigt, verabreicht werden.
Keine toxischen Nebenwirkungen wurden bei Verwendung therapeutisch wirksamer Dosen beobachtet. Beispiele zeigen die Effektivität mehrerer Verbindungen bei standardgemäßen pharmakologischen In-vivo-Tests.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 sind tricyclische aromatische Vorläuferverbindungen für Muscarin&sub2;-Antagonistenverbindungen.
Fig. 2A, 2B und 2C sind Reaktionsschemata für drei Wege zur Synthese von sekundären Aminen, die bei der Synthese von Muscarin&sub2;-Antagonistenverbindungen verwendet werden.
Fig. 2A verwendet ein Säurechlorid plus ein Diamin und eine anschließende Reduktion. Fig. 2B verwendet ein Amin plus eine Dialkylaminosäure und eine anschließende Reduktion.
Fig. 2C verwendet ein Amin plus ein Chloralkylsäurechlorid und dann ein sekundäres Amin und eine anschließende Reduktion.
Fig. 3 zeigt eine Ausführungsform der Synthese von 11- [[[2-(Diethylamino)ethyl]cyclohexylmethylamino]-acetyl]- 5,11-dihydro-6H-pyrido[2,3-b][1,4]-benzodiazepin-6-on (hier als "PDC008.004" bezeichnet).
Fig. 4 ist ein Diagramm der Hemmung der Bindung von [³H]AF-DX-384 an M&sub2;-Rezeptoren in Rattenhirn durch PDC008.004, die als % der spezifischen Bindung von [³H]AF- DX-384 bestimmt wurde, gegenüber log[PDC008.004] in nM.
Fig. 5 ist ein Diagramm des Dosisansprechens von PDC008.004 auf die hervorgerufene Hippocampus-Acetylcholinfreisetzung, die Acetylcholinfreisetzung als Prozentsatz der Kontrolle gegenüber der Konzentration (M) von PDC008.004 (leere Quadrate)und AF-DX 116 (volle Quadrate).
Fig. 6 ist ein Diagramm der Wirkung von verschiedenen Dosen von PDC008.004 auf die Pulszahl bei männlichen Sprague-Dawley-Ratten, die kumulative Dosen von PDC008.004 (0,1-31,1 mg/kg) (getüpfelte Balken) erhielten, wobei die Pulszahl mittels EKG etwa 15 min nach jeder Dosis festgestellt wurde. Kontrolltiere erhielten ein gleiches Volumen Vehikel (Emulphor : Kochsalzlösung : DMSO, 18 : 72 : 10%) (voller Balken) oder (-)-Norepinephrinbitartrat (1 mg/Ratte) (leerer Balken).
Fig. 7 ist ein Diagramm der mittleren Bewegungsmusterveränderungen bei mit PDC008.004 behandelten Mäusen und bei unbehandelten (Kontroll-)Mäusen in einem Wasserirrgarten. Bewegungstyp: 1, An-der-Wandhängen; 2, Wand/Durchqueren; 3, Durchqueren; 4, Durchqueren/Ziel; und 5, Ziel.
Fig. 8 ist ein Diagramm der Ziellatenz (Sekunden) nach dem vierten Versuch bei mit PDC008.004 behandelten Mäusen (getüpfelter Balken) und unbehandelten (Kontroll-)Mäusen (leerer Balken) in einem Wasserirrgarten.
Fig. 9 ist ein Diagramm der Zeit bis zum Ziel (Sekunden) im Zeitverlauf (Tagen) für Kontrolltiere (leere Kreise) und mit PDC008.004 behandelte Tiere (volle Kreise).

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Muscarin (M)&sub2;-Rezeptorliganden, die zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen geeignet sind und die mit minimalen Nebenwirkungen verabreicht werden können, werden beschrieben. Ein Verfahren zur Verabreichung dieser Verbindungen zur Behandlung von Demenz wird ebenfalls beschrieben, sowie ein Verfahren zur Synthese dieser Verbindungen.
Die Verbindungen sind geeignet zur Behandlung von Demenz, die - ohne hierauf beschränkt zu sein - mit den folgenden Störungen verbunden ist: Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Chorea Huntington, senile Demenz, Alkoholismus, Meningitis, neonatale Hypoxie, Schlaganfall oder globale Hirnischämie.

Synthese von M&sub2;-Rezeptorliganden

Im folgenden gelten die folgenden Definitionen:
Der Ausdruck "Alkyl" bezeichnet, falls nicht anders definiert, eine gerade oder verzweigte Alkylgruppe mit C&sub1; bis C&sub2;&sub0; und er umfasst insbesondere Methyl, Isopropyl- und tert.-Butyl.
Der Ausdruck "Cycloalkyl" bezeichnet, falls nicht anders definiert, eine cyclische Alkylgruppe mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen.
Der Ausdruck "Alkoxy" bezeichnet, falls nicht anders definiert, eine Einheit der Struktur O-Alkyl.
Der Ausdruck "Aryl" bezeichnet, falls nicht anders definiert, ein Phenyl oder Benzyl oder ein substituiertes Phenyl oder substituiertes Benzyl, wobei der Substituent
(A) Alkyl, beispielsweise Methyl, Isopropyl oder tert.- Butyl;
(B) Cycloalkyl, beispielsweise Cyclopentyl, Cyclohexylmethyl oder Adamantyl; Arylalkyl, beispielsweise Benzyl, Naphthylmethyl oder Phenylpropyl; Alkyl- oder Arylcarbonyl, beispielsweise Cyclohexancarbonyl oder Benzoyl; Alkyl- oder Arylsulfonyl, beispielsweise Methansulfonyl oder Naphthalinsulfonyl; Alkyl- oder Arylharnstoff, beispielsweise Cyclohexylharnstoff oder Phenylharnstoff, ist; und
(C) optional substituiert ist mit den folgenden Gruppen: Alkyl, Aryl, Alkoxy, Aryloxy, Amino, Halogen, Nitro, Alkyl- oder Arylcarbonyl, Alkyl- oder Arylsulfonyl, Alkyl- oder Arylsulfamido, Alkyl- oder Arylcarbonamido, Alkyl- oder Arylharnstoff.
Die Verbindungen sollten selektiv an den M&sub2;-Rezeptor mit einer Affinität im Nanomolbereich binden und eine geringe Toxizität (LD&sub5;&sub0;-Wert von weniger als 37,5 mg/kg, intraperitoneal und weniger als 45 mg/kg, oral) aufweisen. Diese Verbindungen besitzen einen Molekulargewichtsbereich zwischen 300 und 1500 g/mol. Wie hier definiert, sind die Verbindungen, die zur Behandlung eines Patienten verwendbar sind, solche mit einem therapeutischen Index von 2 oder größer, wobei der therapeutische Index die letale Dosis (LD)&sub5;&sub0; geteilt durch die wirksame Dosis (ED)&sub5;&sub0; ist.
Die Verbindungen sollten auch säurestabil sein, um eine orale Verabreichung zu ermöglichen.
Die hier beschriebenen modifizierten Verbindungen besitzen die folgende allgemeine Struktur: M&sub2;-Ligand der 1. Generation
R¹, R² und R³ sind in unabhängiger Weise Alkyl, beispielsweise Methyl, Isopropyl oder tert.-Butyl; Cycloalkyl, beispielsweise Cyclopentyl, Cyclohexylmethyl oder Adamantyl; Arylalkyl, beispielsweise Benzyl, Naphthylmethyl oder Phenylpropyl; ohne auf diese Alkyl-, Cycloalkyl- oder Arylalkylgruppen beschränkt zu sein, und sie sind optional substituiert mit den folgenden Gruppen: Alkyl, Aryl, Alkoxy, Aryloxy, Amino, Alkylthio, Arylthio, Halogen, Nitro, Alkyl- oder Arylcarbonyl, Alkyl- oder Arylsulfonyl, Alkyl- oder Arylsulfamido, Alkyl- oder Arylcarbonamido, Alkyl- oder Arylharnstoff;
wobei n zwischen 1 und 20 ist.

Synthese der M&sub2;-Liganden

Die M&sub2;-Liganden werden durch Reaktion von Verbindung 2 (Fig. 1) mit einem Überschuss eines sekundären Amins hergestellt. Das sekundäre Amin kann auf drei Wegen hergestellt werden:
(1) Reaktion eines Säurechlorids mit N,N-Dialkyldiaminoalkanen,
(2) Reaktion eines primären Amins und einer aktivierten N,N-Dialkylalkansäure, und
(3) Reaktion eines primären Amins mit einem Chloralkanoylchlorid, wobei ein Alkylchlorid erhalten wird, das dann mit einem sekundären Amin umgesetzt wird (Fig. 2).

Pharmazeutische Zusammensetzungen

Die Verbindungen werden in Abhängigkeit von der Anwendung topisch, lokal oder systemisch verabreicht. Bei einer systemischen Verabreichung wird die Verbindung vorzugsweise oral oder intravenös verabreicht, obwohl sie intraperitoneal, intramuskulär oder topisch in einem entsprechenden pharmazeutischen Träger, wie normaler Kochsalzlösung, oder in Tablettenform verabreicht werden kann. Zur topischen Anwendung wird die Verbindung vorzugsweise in einer Salbe oder Cremebasis oder mittels eines Hautpflasters verabreicht. Die Verbindung kann auch durch Vorrichtungen zur gesteuerten Abgabe, wie biologisch abbaubare Polymere, oder durch Inhalation, Hochziehen oder ein Nasenspray verabreicht werden. Geeignete Träger sind Fachleuten auf dem pharmazeutischen Gebiet bekannt.
Die Verbindungen werden oral, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan oder topisch in einer therapeutisch wirksamen Dosierung zur Wahrnehmungsverstärkung oder anderweitigen Linderung der Symptome der neurologischen Erkrankung verabreicht. In der bevorzugten Ausführungsform werden die Verbindungen oral einmal täglich in einem Dosisbereich, der 10 mg/kg äquivalent ist, verabreicht. Bei Mäusen beträgt der LD&sub5;&sub0;-Wert zur oralen Verabreichung 45 mg/kg und der LD&sub5;&sub0;-Wert zur intraperitonealen Verabreichung 37,5 mg/kg. Nur Verbindungen mit einem therapeutischen Index von 2 oder größer werden an einen Patienten verabreicht.
Die Konzentration der aktiven Verbindung in der Arzneimittelzusammensetzung hängt von der Absorption, der Inaktivierung und den Ausscheideraten des Arzneimittels sowie anderen, einem Fachmann bekannten Faktoren ab. Es ist anzumerken, dass Dosierungswerte auch mit dem Zustand des behandelten Objekts variieren. Ferner ist klar, dass für ein spezielles Objekt spezifische Dosierungsprotokolle entsprechend den individuellen Bedürfnissen und der professionellen Beurteilung der Person, die die Zusammensetzungen verabreicht oder deren Verabreichung überwacht, im Zeitverlauf eingestellt werden sollen und dass die hier angegebenen Konzentrationsbereiche lediglich Beispiele sind und den Umfang oder die Durchführung der beanspruchten Zusammensetzung nicht beschränken sollen.
Zur oralen Abgabe können die Verbindungen in Kapseln eingeschlossen, zur Tabletten gepresst, mikroverkapselt, in Liposomen eingearbeitet, in Lösung oder Suspension, allein oder in Kombination mit einem substratimmobilisierenden Material, wie Stärke, oder schlecht absorbierbaren Salzen, wie Immodium, sein. Pharmazeutisch kompatible Bindemittel können als Teil der Zusammensetzung umfasst sein. Die Tabletten oder Kapseln können beispielsweise einen der folgenden Bestandteile oder Verbindungen einer ähnlichen Natur enthalten: ein Bindemittel, wie mikrokristalline Cellulose, Tragantgummi oder Gelatine; ein Streckmittel, wie Stärke oder Lactose; ein den Zerfall förderndes Mittel, wie Alginsäure, Primogel® oder Maisstärke; eine Gleitsubstanz, wie Magnesiumstearat oder Sterotes; ein Gleitmittel, wie kolloides Siliciumdioxid; ein Süßungsmittel, wie Saccharose oder Saccharin; oder einen Geschmacksstoff, wie Pfefferminze, Methylsalicylat oder Orangengeschmack. Wenn die Dosiseinheitsform eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu Material des obigen Typs einen flüssigen Träger enthalten. Außerdem können Dosiseinheitsformen verschiedene andere Materialien, die die physische Form der Dosiseinheit modifizieren, beispielsweise Überzüge aus Zucker, Schellack oder anderen enterischen Mitteln, enthalten.
Die vorliegende Erfindung lässt sich unter Bezug auf die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele genauer verstehen.

Beispiel 1

Synthese von M&sub2;-Rezeptorliganden

Die hier beschriebenen Verbindungen besitzen ein tricyclisches aromatisches Ringsystem. Das tricyclische aromatische Ringsystem ist an eine aminhaltige Seitenkette über eine Acetylgruppe gebunden. Das tricyclische aromatische 5,11-Dihydro-6H-pyrido[2,3-b][1,4]-benzodiazepin-6-on 1 und dessen Chloracetylderivat 5,11-Dihydro-11-(chloracetyl)-6H-pyridol[2,3-b][1,4]-benzodiazepin-6-on 2 wurden gemäß Standardverfahren hergestellt und besaßen physikalische und spektroskopische Eigenschaften, die mit den von W. W. Engel et al., J. Med. Chem. 32: 1718-1724 (1989), US- Patent Nr. 3 406 168, 1968, berichteten Werten identisch waren. Das Chloracetylderivat 2 wurde bei allen Synthesen verwendet. Siehe Fig. 1 für Strukturen.
Die herstellten M&sub2;-Liganden besitzen die in der im vorhergehenden beschriebenen Formel angegebene allgemeine Struktur. Sie wurden in einer Ausbeute von 65-85% durch Reaktion des Acetylchlorids 2 mit einem Überschuss eines sekundären Amins hergestellt. Die sekundären Amine können auf drei Wegen hergestellt werden, die alle über ein Amid laufen, das in der letzten Stufe reduziert wird, wobei das sekundäre Amin erhalten wird, wie in Fig. 2 angegeben.
Der erste in Fig. 2A angegebene Weg umfasst die Reaktion von Säurechloriden mit N,N-Dialkyl-diaminoalkanen. Der zweite, in Fig. 2B angegebene Weg umfasst die Reaktion eines primären Amins und einer aktivierten N,N-Dialkylalkansäure. N,N-Dicyclohexylcarbodiimid oder ein anderes einem Fachmann bekanntes Mittel kann zur Aktivierung der Säure für einen nukleophilen Angriff durch das Amin verwendet werden. Auf dem dritten, in Fig. 2C angegegebenen Weg wird ein primäres Amin mit einem Chloralkanoylchlorid umgesetzt, wobei ein Alkylchlorid erhalten wird, das dann mit einem sekundären Amin, wie Diethylamin, umgesetzt wird, wobei das gewünschte Amid hergestellt wird.
Alle für die Synthese des sekundären Amins verwendeten Reagenzien sind ohne weiteres bei Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI, erhältlich.

Synthese

Die Synthese von PDC008.004 und verwandten Verbindungen ist in Fig. 3 angegeben.
N-[2-(Diethylamino)ethyl]-cyclohexancarboxamid 3: Cyclohexancarbonylchlorid (55,9 mmol) wurde unter Rühren in 650 ml Aceton in einem 1-l-Dreihalsrundkolben gelöst. Wasserfreies Kaliumcarbonat (55,0 mmol) wurde in einer Portion zu dem Kolben gegeben. Ein Kühler, ein 125-ml-Zugabetrichter und ein Stopfen wurden in den einzelnen drei Hälsen plaziert. N,N-Diethylethylendiamin (43,0 mmol) wurde in 100 ml Aceton gelöst und in den Zugabetrichter übertragen. Während das Reaktionsgemisch bei 25ºC gerührt wurde, wurde die Amin/Acetonlösung während eines Zeitraums von 1,6 h zugegeben. Nach 19 h Reaktion bei 25ºC war das gesamte Cyclohexancarbonylchlorid aufgebraucht, wobei ein neuer Flecken durch Dünnschichtchromatographie bei Rf 0,25 (Silicagel GF, 250 um, 1 : 9 : 90 Ammoniumhydroxid : Methanol : Chloroform, Sichtbarmachen mit Iod) gebildet wurde. Die Feststoffe wurden abfiltriert und mit Aceton gewaschen und das Aceton wurde auf einem Rotationsverdampfer abgedampft. Der Rückstand wurde in 200 ml Chloroform gelöst und mit 3 100-ml- Portionen einer 10-%igen wässrigen Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die vereinigten Bicarbonatwaschflüssigkeiten wurden mit 300 ml Chloroform rückextrahiert und die vereinigten Chloroformschichten wurden mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen. Das Chloroform wurde abgedampft und verbliebenes Lösemittel wurde unter Vakuum unter leichtem Erhitzen entfernt, wobei weißliche Kristalle erhalten wurden. Umkristallisieren aus Hexanen und Ethylacetat ergab weiße Kristalle, die einen Schmelzpunkt von 105-107ºC aufwiesen (30,9 mmol, Ausbeute 72%). Die spektroskopischen Eigenschaften waren mit der vorgeschlagenen Struktur konsistent.
N-[2-Diethylamino)ethyl]cyclohexanmethylamin, 4: Die Verbindung 3 (11,2 mmol) wurde in 150 ml Diethylether in einem 250-ml-Kolben, der mit Argon gespült war, gelöst. Lithiumaluminiumhydrid (16,8 mmol, 1,0 M in Diethylether) wurde in einer Portion über eine gasdichte Spritze zugegeben. Nach 1 h ist die Verbindung 3 (Rf 0,5) vollständig aufgebraucht, wobei ein neuer Flecken bei Rf 0,4 (Silicagel GF, 250 um, 1 : 9 : 90 Ammoniumhydroxid : Methanol : Chloroform) gebildet wurde. Zum Quenchen von etwaigem verbliebenem Hydrid wurden 0,65 ml Wasser unter Rühren, anschließend 0,65 ml einer 15-%igen wässrigen Natriumhydroxidlösung, anschließend 1,95 ml Wasser zugegeben. Der weiße Niederschlag wurde abfiltriert und mit 100 ml Diethylether gewaschen. Der Ether wurde über Natriumsulfat getrocknet und unter nur leichtem Erwärmen auf einem Rotationsverdampfer eingedampft. Eine klare farblose Flüssigkeit wurde erhalten (9,05 mmol, 81% Ausbeute), die mit der vorgeschlagenen Struktur konsistente spektroskopische Eigenschaften aufwies.
PDC008.004, 5: In einen 500-ml-Rundhalskolben, der ein Rührstäbchen enthielt, wurden 4,41 mmol 2, 7,06 mmol 4, 7,06 mmol Natriumcarbonat und 170 ml Acetonitril gegeben. Nicht das gesamte 2 war bei 25ºC löslich. Bei Erhitzen unter Rückflußkühlung (90ºC) lösten sich alle Feststoffe. Nach 22 h zeigt Dünnschichtchromatographie (Silicagel GF, 250 um, 1 : 9 : 90 Ammoniumhydroxid : Methanol : Chlorofom), dass 2 (Rf 0,5, UV- und iodaktiv) vollständig aufgebraucht ist, wobei ein neuer Flecken bei Rf 0,2 (UV- und iodaktiv) gebildet wurde. Etwas nicht-umgesetztes 4 (Rf 0,4, iodaktiv) ist immer noch vorhanden. Bei Abkühlen der Lösung auf Raumtemperatur fallen weiße Feststoffe aus Acetonitril aus. Das Natriumcarbonat wird abfiltriert und mit Acetonitril gewaschen. Das Lösemittel wird abgedampft und aus Acetonitril umkristallisiert, wobei weiße nadelähnliche Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 208-209ºC (3,77 mmol, 86% Ausbeute) erhalten werden. Dieses Material besaß mit der vorgeschlagenen Struktur konsistente spektroskopische Eigenschaften. Der Extinktionskoeffizient bei 285 nm in 1-Octanol beträgt 8199 ± 616 M&supmin;¹cm&supmin;¹. Der Verteilungskoeffizient (log P) zwischen 1-Octanol und 0,1 M Phosphat beträgt 0,78 ± 0,18.
11-[[[2-(Diethylamino)ethyl]cyclohexylmethylamino]- acetyl]-5,11-dihydro-6H-pyrido[2,3-b][1,4]-benzodiazepin-6- on-hydrochloridsalz, 6: Verbindung 5 (1,29 mmol) wurde durch Auflösen derselben in absolutem Ethanol, das mit wasserfreiem Chlorwasserstoff gesättigt war, bis zu einem pH- Wert der Lösung von kleiner als 2 (etwa 10 ml) in deren Hydrochloridsalz umgewandelt. Das Salz wurde durch Zugabe von 100 ml wasserfreiem Diethylether zur siedenen ethanolischen Lösung kristallisiert. Die weißen pulverigen Feststoffe, die sich bildeten, wurden abfiltriert und mit zwei 50-ml- Portionen Ether gewaschen. Dieses Verfahren wurde wiederholt und es wurde ein feines weißes Pulver erhalten, das sich bei 190ºC zersetzte, bevor es schmolz (1,22 mmol, Ausbeute 94%). Der weiße Feststoff besaß mit der vorgeschlagenen Struktur konsistente physikalische und spektroskopische Eigenschaften. Der Extinktionskoeffizient bei 281 nm in 0,1 M Phosphat beträgt 9060 M&supmin;¹cm&supmin;¹. Der Verteilungskoeffizient (log P) zwischen 0,1 M Phosphat und 1-Octanol beträgt 0,16.

Synthese verwandter Verbindungen

11-[[[2-(Diethylamino)ethyl]amino]-acetyl]-5,11-dihydro-6H- pyrido[2,3-b][1,4]-benzodiazepin-6-on, 7: N,N-Diethylethylendiamin (10,7 mmol) und 2 (3,52 mmol) wurden in 200 ml Acetonitril, das Natriumcarbonat (5,22 mmol) und ein Rührstäbchen enthielt, gelöst. Das Gemisch wurde 18 h lang bei 95ºC unter Rückflußkühlung erhitzt. Dünnschichtchromatographie (Silicagel GF, 250 um; 1 : 9 : 90 Ammoniumhydroxid : Methanol : Chloroform) zeigte einen fast vollständigen Verbrauch von 2 (Rf 0,55, UV- und iodaktiv), das Vorhandensein von etwas N,N-Diethylethylendiamin (Rf 0,1, iodaktiv) und einen neuen Hauptflecken bei Rf 0,45 (UV- und iodaktiv). Die Feststoffe wurden aus dem Reaktionsgemisch abfiltriert und mit Acetonitril gewaschen. Das Lösemittel wurde abgedampft und der Rückstand wurde in Ethylacetat und einer 10-%igen wässrigen Natriumbicarbonatlösung gelöst. 125 ml Ethylacetatlösung wurden mit drei 50-ml-Portionen einer 10- %igen wässrigen Bicarbonatlösung gewaschen. Bicarbonat wurde mit Ethylacetat (75 ml) rückextrahiert, und die organischen Phasen wurden vereinigt und mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Ethylacetatlösung wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und vom Lösemittel befreit. Der erhaltene Rückstand wurde aus Ethanol und Wasser umkristallisiert, wobei ein weißlicher Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 96-97ºC (0,206 mmol, Ausbeute 6%) erhalten wurde. Die physikalischen und spektroskopischen Eigenschaften waren mit der vorgeschlagenen Struktur konsistent.
N-[2-(Diethylamino)ethyl]-5-dimethylamino-1-naphthalinsulfonamid, 8: 5-Dimethylamino-1-naphthalinsulfonylchlorid, DANSYL-Chlorid (0,56 mmol) wurde in 5 ml Aceton unter Rühren bei 25ºC gelöst. Kristallwasserfreies Kaliumcarbonat (0,56 mmol) wurde in einer Portion zugegeben und N,N-Diethylethylendiamin (0,43 mmol) in 3 ml Aceton wurde aus einem weiteren Trichter über einen Zeitraum von 5 min zugegeben. Nach 18 h bei 26ºC zeigte eine Dünnschichtchromatographie (Silicagel GF, 250 um, 1 : 9 : 90 Ammoniumhydroxid : Methanol : Chloroform) etwas N,N-Diethylethylendiamin (Rf 0,25, iodaktiv), etwas DANSYL-Chlorid (Rf 0,0, UV-aktiv) und einen größeren neuen fluoreszierenden gelben Flecken bei Rf 0,65 (iod- und UV-aktiv). Die Feststoffe wurden abfiltriert und mit Aceton gewaschen und das Aceton wurde abgedampft. Der fluoreszierende Flecken bei Rf 0,65 wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie isoliert (Silicagel G, 1000 um, 1 : 9 : 90 Ammoniumhydroxid : Methanol : Chloroform). Die größte Bande bei Rf 0,45-0,65 wurde aus dem Silica mit 250 ml Ethylacetat entfernt. Das Ethylacetat wurde mit 100 ml Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Abdampfen des Lösemittels ergab einen gelbgrünen Film (0,210 mmol, Ausbeute 49%), der ein mit der vorgeschlagenen Struktur konsistentes Proton-NMR-Spektrum aufwies.
Die im folgenden angegebenen Verbindungen wurden durch den im vorhergehenden beschriebenen ähnliche Verfahren synthetisiert.
R = H
R = -CH&sub2;(CH&sub2;)&sub1;&sub3;CH&sub3;

Beispiel 2

Physikalische und chemische Charakterisierung mehrerer Chargen von 11-[[[2-(Diethylamino)ethyl]cyclohexylmethylamino]-acetyl]-5,11-dihydro-6H-pyrido[2,3-b][1,4]-benzodiazepin-6-on (PDC008.004)

Zur Bestimmung der Reinheit beim Scale-up von Synthesechargen wurden Dünnschichtchromatographie und Schmelzpunkt zur ersten Bestimmung verwendet. Proton-NMR und HPLC wurden dann zur Bestätigung von Struktur und Reinheit verwendet.
1. Kernresonanzspektrum von PDC008.004, Charge PDC020.031 (¹H-NMR, CDCl&sub3;, ppm): 8,35 (1H, 7,95 (d, 1H), 7,60 (m, 4H), 7,45 (t, 1H), 7,3 (dd, 1H), 3,5 (m, 2H), 2,60 (t, 2H), 2,50 (q, 4H), 2,40 (m, 2H), 2,30 (d, 2H), 1,60 (dd, 4H), 1,25 (m, 1H), 1,10 (m, 4H), 0,95 (t, 6H), 0,70 (m, 2H). Die Spektren der Chargen PDC008.004, PDC015.091, PDCO20.005 und PDC020.011 sind identisch.
2. Massenspektrometrie von PDC008.004, Charge PDC020.031: Eine direkte Einführung in die Sonde wurde aufgrund der geringen Flüchtigkeit dieser Verbindung verwendet, um Massenspektren mit chemischer Ionisierung und Elektronenstoß zu erhalten. Chemische Ionisierung mit Erfassung positiver Ionen ergab einen starken Peak bei 464,43 (MH&spplus;) mit Fragmenten bei einem m/z-Verhältnis von 377,32 und 212,17. Elektronenstoß zeigte das Molekülion bei einem m/z-Verhältnis von 463, Fragmente bei 377 und 211 und den Basispeak bei 86. Das berechnete Molekulargewicht von PDC008.004 beträgt 463,63 g/mol.
3. UV-Absorptionsspektrum von PDC008.004: Diese Verbindung besitzt eine starke Absorption bei 190-250 nm mit einer Schulter bei 285 nm in 1-Octanol. Der Extinktionskoeffizient bei 285 nm in 1-Octanol beträgt 8199 ± 616 M&supmin;¹cm&supmin;¹ (Mittelwert der Chargen PDC008.034, PDC008.055 und PDC020.023).
4. Schmelzpunkte von mehreren Synthesechargen von PDC008.004: Umkristallisieren aus Acetonitril oder Ethanol und Wasser ergibt weiße Flocken. Einzelne Schmelzpunkte lagen im Bereich von 206-207 (eine Charge) und 208-209ºC (vier Chargen).
5. Dünnschichtchromatographie von PDC008.004: Der Retentionsfaktor für PDC008.004 beträgt 0,2 auf Silicagel GF (fluoreszierend), 250 um, unter Verwendung von 1 : 9 : 90 Ammoniumhydroxid/Methanol/Chloroform zur Elution unter Sichtbarmachung durch UV oder bd.
6. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie von PDC008.004: PDC008.004 eluiert bei 8,4 min und wird bei 285 nm sichtbar gemacht. Die Standardbedingungen sind eine Gradientenelution von 50% bis 100% Methanol (mit 1% Tetrahydrofuran und 1% Triethylamin) in Wasser mit einem linearen Gradienten bei einer Ströinungsrate von 2 ml/min unter Verwendung einer 10-cm-C18-Säule.
7. Verteilungskoeffizient für PDC008.004 : log P wurde zu 0,78 ± 0,18 bestimmt. Die Gleichgewichtseinstellungen wurden bei 23ºC durch Auflösen von PDC008.004 in 1-Octanol (0,01-0,1 mM) und Rühren mit einem äquivalenten Volumen von 0,1 M Natriumphosphat bei einem pH-Wert von 7,4 zwischen 1 und 24 h durchgeführt. Der Verteilungskoeffizient ist unabhängig von der Konzentration oder Gleichgewichtseinstellungsdauer.

Beispiel 3

Biochemische Pharmakologie von 11-[[[2-(Diethylamino)- ethyl]cyclohexylmethylamino]-acetyl]-5,11-dihydro-6H- pyrido[2,3-b][1,4]-benzodiazepin-6-on (PDC008.004)

Untersuchungen, die die Hemmung der Bindung von [³H]AF-DX-384 an M&sub2;-Rezeptoren im Rattenhirn durch PDC008.004 prüften, ergaben einen Ki-Wert von 422 nm, wie in Fig. 4 angegeben. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Verbindung eine Affinität für M&sub2;-Rezeptoren im Nanomolbereich aufweist. Daher besitzen Verbindungen mit einer Affinität im Nanomolbereich wahrscheinlich therapeutische Wirksamkeit.
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wurde zur Bestimmung der Konzentration im Hirn verwendet und Massenspektrometrie wurde zur Bestätigung, dass PDC008.004 tatsächlich vorhanden war, verwendet.
Hirnextraktionsverfahren: Ratten erhielten zwischen 10 und 30 mg/kg PDC008.004 auf IP- und PO-Verabreichungswegen verabreicht und wurden 60 min später getötet. Die Hirne wurden entfernt und nach dem Homogenisieren in 1 ml PBS mit 4 ml Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde unter einem Argonstrom eingedampft und die Probe wurde in 200 ul Methanol wiederhergestellt. Die Proben wurden bei -20ºC bis zur Verwendung eingefroren.
Unter Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie beträgt die Konzentration im Hirn etwa 2 uM durch Vergleich mit mit Hirngewebe versetzten Proben bekannter Konzentration. Die verwendeten HPLC-Bedingungen waren mit den im vorhergehenden angegebenen identisch.
Eine selektive Ionenüberwachung der Masse 464 (MH&spplus;) durch Massenspektrometrie mit chemischer Ionisierung zeigte, dass PDC008.004 tatsächlich in Hirngewebeproben mit einer Konzentration von zwischen 1 und 10 pH vorhanden war.

Beispiel 4

Untersuchungen der Spezifität und Selektivität von 11-[[[2- (Diethylamino)ethyl]cyclohexylmethylamino]-acetyl]-5,11- dihydro-6H-pyrido[2,3-b][1,4]-benzodiazepin-6-on: Hemmung einer Radioligandenbindung in verschiedenen Geweben

Die Gewebe wurden hergestellt und die Bindungstests wurden durchgeführt wie im vorhergehenden beschrieben. Membranen wurden in Gegenwart der in Tabelle 1 angegebenen Radioliganden mit unterschiedlichen Konzentrationen von PDC008.004 getestet. Die Werte (mittlere% der spezifischen Bindung) wurden unter Verwendung der Gleichung Ki = IC&sub5;&sub0;/l + [L]/KD berechnet. Die Anstiege waren nahe bei 1,0, was Einheit und das Auftreten einer Bindung an einer einzigen Population von Stellen anzeigte. Ki-Werte konnten für eine Hemmung der Radioligandenbindung durch PDC008.004 nicht ermittelt werden, waren daher größer als die angegebenen Konzentrationen. Es wurde beobachtet, dass der Ki-Wert für eine Hemmung der Bindung von [³H]Pirenzepin an M&sub1;-Stellen durch PDC008.004 teilweise auf einer Lösemittelwechselwirkung beruhte, was durch Lösemittelkontrollen bestimmt wurde. Die Bindung von [³H]QNB erfolgte in Gegenwart von zugegebenem 10 uM AF-DX 384. Die Datenanalyse wurde unter Verwendung von GraphPad (ISS Software) durchgeführt. Diese Daten belegen klar die Spezifität und Selektivität für den M&sub2;-Rezeptorsubtyp. TABELLE 1 Zusammenfassung der Untersuchungen der Spezifität und Selektivität von PDC008.004: Hemmung einer Radioligandenbindung in verschiedenen Geweben.
Zitierstellen der Verfahren:
1. Aubert et al., Eur. J. Pharmacol., 217: 173-184 (1992); Entzeroth und Meyer, Biochem. Pharmacol., 40: 1674-1676 (1990); Hammer et al., Life Sci., 38: 1653-1662 (1986).
2. Dawson und Wamsley, Brain Res. Bull., 25: 311-317 (1990); Dawson et al., Neurobiol. Aging, 13: 25-32 (1991); Michel et al., Eur. J. Pharmacol., 166: 459-466 (1989).
3. Dawson and Wamsley, Brain Res. Bull., 25: 311-317 (1990); Dawson et al., Neurobiol. Aging, 13: 25-32 (1991).
4. Martin et al., J. Pharmacol. Exper. Therapeu., 266: 157-163 (1983); Sloan et al., Pharmacol. Biochem. Behav., 30: 255- 267 (1988).
5. Yamamura et al., (Hrsg.), In: Neurotransmitter Receptor Binding, 2. Auflage (1988); McCabe et al., FASEB J., 4: 2934-2940 (1990).
6. Lee und Reddington, Brain Res., 368: 394-398 (1986).
7. Billard et al., Life Sci., 35: 1885-1893 (1984).
8. Woodruffund Freedman, Neuroscience, 6: 407-410 (1981).
9. Engel et al., Naunyn Schmiedeberg s Arch. Pharmacol., 324: 116-124 (1983).
10. Lynch und Steer, J. Biological Chem., 256: 3298-3303(1981).

Beispiel 5

Wirkung von 11-[[[2-(Diethylamino)ethyl]cyclohexylmethylamino]-acetyl]-5,11-dihydro-6H-pyrido[2,3-b][1,4]-benzodiazepin-6-on auf Carbachol-venuittelte cAMP-Reduktionen in m&sub2;-CHO-Zellen

m&sub2;-Muscarinrezeptoren sind bekanntlich negativ an Adenylatcyclase gekoppelt, so dass eine Stimulierung dieses Rezeptors zu einer Hemmung dieses Enzyms führt. Die Wirkung kann mit klassischen Muscarinantagonisten, wie Atropin, blockiert werden. Adenylatcyclase wandelt intrazelluläre ATP in cAMP um. Ein Weg zur Ermittlung einer durch den Muscarinrezeptor vermittelten Hemmung von Adenylatcyclase besteht darin, die davon herrührende Abnahme der intrazellulären cAMP-Spiegel zu ermitteln. Da diese Spiegel jedoch ursprünglich niedrig sind, ist es einfacher, zunächst Adenylatcyclase mit beispielsweise Forskolin, das die cAMP- Spiegel erhöht, zu stimulieren und dann nach einer anschließenden Abnahme der cAMP-Spiegel zu suchen.
Das folgende Experiment wurde so gestaltet, dass bestimmt werden kann, ob sich PDC008.004 wie ein Muscarinantagonist hinsichtlich der Blockierung einer durch Carbachol-vermittelten Hemmung der cAMP-Spiegel in mit m&sub2;- transfizierten CHO-Zellen verhält.

Verfahren

CHO-Zellen, die mit m²-Muscarinrezeptoren transfiziert waren, wurden von Dr. Mark Brann (Univ. Vermont) erhalten und in 24-Vertiefungen-Platten bis zu 90% Zusammenfließen gezüchtet. Da intrazelluläres cAMP verstoffwechselt wird, wurden die Zellen mit 1 mM IBMX (ein Phosphodiesteraseinhibitor) in DMEM-HEPES eines pH-Werts von 7,2 vorbehandelt. Antagonisten (entweder AQ-RA 741 oder PDC008.004) und Agonisten (5 uM Carbachol) wurden dann zugegeben und 10 min lang vorinkubiert, und danach wurde Adenylatcyclase mit 1 uM Forskolin aktiviert. Nach 10 min bei 37ºC wurde die Reaktion gestoppt und die cyclischen Nucleotide wurden extrahiert und auf cAMP durch RIA getestet.

Ergebnisse

Die Carbacholstimulierung von m&sub2;-transfizierten CHO- Zellen führte zu einer etwa 50-%igen Hemmung der intrazellulären cAMP-Spiegel. Die Grundlinie-cAMP-Werte betrugen 5,4 ± 0,1 pMol cAMP. Diese Hemmung wurde vollständig blockiert durch Atropin (1 uM) und AQ-RA 741 (1 uM). Dosisansprechkurven für AQ-RA 741 und für PDC008.004 ergaben IC&sub5;&sub0;- Werte von 0,17 uM bzw. 5,2 uM. Der 1050-Wert von PDC008.004 zeigte einen Mittelwert von 3,7 ± 1,0 uM in drei getrennten Experimenten. Zellen, die mit 10 pH PDC008.004 ohne Carbachol behandelt wurden, besaßen cAMP-Spiegel (4,9 ± 0,5 pHol), die von unbehandelten Zellen nicht unterscheidbar waren, wodurch gezeigt wurde, dass PDC008.004 keine Agonistenaktivität besaß.

Schlussfolgerungen

PDC008.004 ist ein m²-Muscarinantagonist, der einen IC&sub5;&sub0;-Wert von 3,7 ± 1,0 pH zur Hemmung von durch Carbachol vermittelte cAMP-Reduktionen in m&sub2;-transfizierten CHO- Zellen besaß. Im gleichen Test besitzt der Muscarinantagonist AQ-RA 741 einen IC&sub5;&sub0;-Wert von 0,17 uM. PDC008.004 besitzt keine erfassbare Muscarin-Agonistenaktivität.

Beispiel 6

Wirkung von 11-[[[2-(Diethylamino)ethyl]cyclohexylmethylmino]-acetyl]-5,11-dihydro-6H-pyrido[2,3-b][1,4]-benzodiazepin-6-on als Modulator einer Acetylcholinfreisetzung im Rattenhirn

In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen im Hirn legten nahe, dass negative Muscarinautorezeptoren, die die Freisetzung von Acetylcholin (ACh) kontrollieren, vorwiegend vom pharmakologischen M&sub2;-Subtyp (der die molekular definierten m&sub2;- und M&sub4;-Subtypen umfasst) sind. Der Beweis hierfür stammt hauptsächlich aus Experimenten unter Verwendung von vorzugsweise M&sub2;-Rezeptorantagonisten der AF-DX-Reihe gegenüber M&sub1;-Blockern, wie dies beispielsweise bei Lapchak et al., 1989, "Binding sites for [³H]AF-DX 116 and Effect of AF-S 116 on endogenous acetylcholine ("ACh") release from rat brian slices", Brain Res., 496, 285-294; und Quirion et al., 1993, "Muscarinic and nicotinic modulation of cortical acetylcholine release monitored by in vivo microdialysis in freely moving edult rats", Synapse., beschrieben ist. Daher hemmt ein Muscarinagonist die ACh- Freisetzung, während ein M&sub2;-Antagonist diese erleichtert.
Das Ziel dieser Studie war die Untersuchung der Wirkungen von PDC008.004 auf die In-Vitro-Freisetzung von ACh in Hirnschnitten des Rattenhippocampus. Die erhaltenen Daten wurden mit denen eines Prototyps eines M&sub2;-Blockers, AF- DX 116 (Lapchak) verglichen.

Materialien und Verfahren

Die In-vitro-Freisetzung von ACh von Hippocampusschnitten von ausgewachsenen Ratten wurde gemäß der Beschreibung bei Hanish et al. 1993, "Modulation of hippocampal acetylcholine release: a potent central action of interleukin-2", J. Neurosci., 13, 3368-3374, untersucht. Kurz gesagt, wurden Hippocampusschsnitte von ausgewachsenen Ratten (0,4 mm) präpariert und unter Verwendung einer Brandel-Superfusionsvorrichtung 1 h lang in normalen Krebspuffer (pH-Wert 7,4) und anschließend 25 mM K&spplus;-Krebspuffer (pH-Wert 7,4) mit oder ohne PDC008.004 (10&supmin;&sup9;M bis 10&supmin;&sup4;M) eine weitere Stunde superfundiert. Die Superfusate wurden dann gewonnen, extrahiert und anschließend auf Acetylcholin unter Verwendung eines radioenzymatischen Verfahrens analysiert. Die Daten wurden unter Verwendung der Spreadsheet Software Lotus 1-2-3 analysiert.

Ergebnisse

PDC008.004 stimulierte die Freisetzung von ACh mit uM- Konzentrationen signifikant, während es bei niedrigeren Konzentrationen keine statistisch signifikanten Wirkungen besaß, wie in Fig. 5 angegeben. Die maximale Wirkung auf die ACh-Freisetzung wurde bei 10&supmin;&sup5; M beobachtet, wobei eine etwas geringere Stärke bei 10&supmin;&sup4; M beobachtet wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung von AF-DX 116 erhalten, wie ebenfalls in Fig. 5 angegeben ist, wobei die maximale Wirkung von PDC008.004 etwas höher als die von AF-DX 116 (189 gegenüber 152% gegenüber Kontrollen) ist.
Wenn Daten als Funktion der Zeit über einen Zeitraum von 60 min ausgedrückt werden, ist ersichtlich, dass PDC008.004 vorübergehend (in den ersten 20 min) die ACh- Freisetzung mit nM-Konzentrationen hemmte (Tabelle 2). Diese Wirkung verschwindet über den vollen Zeitraum von 60 min.

Diskussion

Aus diesen Daten ist klar, dass sich PDC008.004 als starker Antagonist der negativen M&sub2;-Autorezeptoren im Rattenhirn verhält. Tatsächlich ist dieses Molekül etwas stärker als AF-DX 116, der Prototyp eines M&sub2;-Blockers, hinsichtlich einer Erleichterung der ACh-Freisetzung. PDC008.004 ist daher eines der stärksten Moleküle, die bisher in diesem Modell getestet wurden. Die Signifikanz der mit nM-Konzentrationen erfassten vorübergehenden Hemmwirkung ist derzeit unklar. Sie kann mit der unterschiedlichen Affinität von PDC008.004 für m&sub2;- gegenüber m&sub4;-Rezeptoren, die beide als Autorezeptoren wirken, jedoch unterschiedliche Wirkungen auf die ACh-Freisetzung haben, in Verbindung stehen. TABELLE 2 Wirkungen von PDC008.004 auf eine durch K hervorgerufene ACh-Freisetzung im Hippocampus in vitro und als Funktion der Zeit

Beispiel 7

Toxizitätsuntersuchungen von 11-[[[2-(Diethylamino)ethyl]- cyclohexylmethylamino]-acetyl]-5,11-dihydro-6H-pyrido[2,3- b][1,4]-benzodiazepin-6-on

Die Wirkung verschiedener Dosen von PDC008.004 auf die Pulszahl bei männlichen Sprague-Dawley-Ratten, die kumulative Dosen von PDC008.004 (0,1-31,1 mg/kg) erhielten, wobei die Pulszahl durch EKG etwa 15 min nach jeder Dosis festgestellt wurde, wurde bestimmt. Kontrolltiere erhielten ein gleiches Volumen Vehikel (Emulphor : Kochsalzlösung : DMSO, 18: 72 : 10%) oder (-)-Norepinephrinbitartrat (1 mg/Ratte).
Die Ergebnisse sind in Fig. 6 angegeben. Diese Daten zeigen, dass PDC008.004 die Pulszahl im Vergleich zu Vehikelkontrollen nicht signifikant änderte. Die Verabreichung von (-)-Norepiephrinbitartrat erhöhte die Pulszahl signifikant 43% über eine Vehikelkontrolle.

Beispiel 8

Bewertung von 11-[[[2-(Diethylamino)ethyl]cyclohexylmethylamino]-acetyl]-5,11-dihydro-6H-pyrido[2,3-b][1,4]-benzodiazepin-6-on in Wasserirrgartenverhaltensstudien

Die folgenden Verfahren sind Standardverfahren, die routinemäßig von Fachleuten verwendet werden (R. G. M. Morris, 1981).

Materialien

1. TIERE

Männliche C57BL/6-Mäuse eines Körpergewichts von 30 g. Minimum von 50 Tieren. Erhältlich bei The Jackson Laboratories, Bar Harbor, Rt. 3, Maine 04609. CL-1-Mäuse wurden ebenfalls mit dem gleichen Ergebnissen verwendet.
Die Tiere benötigen mindestens eine Woche zur Akklimatisierung an die Kolonie vor den Experimenten. Käfige: Standardumgebung, jedoch möglichst ruhig.

2. AUSRÜSTUNG

2A. Wassertank und Zubehör:

Runder Wassertank aus stabilem (mindestens 10 mm dickem) schwarzem (oder sehr dunklem opakem) Lucit oder einem anderen Kunststoff. Durchmesser des Tanks: 1 m; Wandhöhe: 509 cm. Der Tank muss ein mit einem Wasserfüll/Entleerungskunststoffschlauch eines großen Durchmessers (mindestens 1,5 cm Innendurchmesser, Minimallänge 10 ft) verbundenes Ventil besitzen.

2B. Zielpunkte:

Zwei Zielpunkte, wobei einer aus dem gleichen Kunststoff wie der Wassertank besteht (der "schwarze Zielpunkt") und der andere aus einer durchscheinenden Varietät besteht. Basis, die aus schwerem Lucit (Dicke 1 inch), das als Quadrat mit Seiten von 10 inch geformt ist, besteht. Höhe zwischen der oberen Oberfläche der Basis und der unteren Oberfläche der Zielplattform: 20 cm. Zielplattformträger: 20 cm langer runder Stab (Durchmesser 1 inch). Kreisförmige Zielplattform von 8 cm Durchmesser, die aus 0,5 cm dickem Kunststoff besteht und mit einem rutschfesten Material (chirurgisches Tape kann verwendet werden) bedeckt ist, die entweder schwarz oder weiß (in Abhängigkeit vom Zielpunkt) gestrichen ist.
Zielorientierungen: Weiße Blätter, die entweder oberhalb des Randes der Tankwand oder am Rand der Tankwand aufgehängt sind und die leicht erkennbare Muster zeigen.
Einen Vorrat von Magermilchpulver, um das Wasser im Tank einzutrüben. Tankreinigungsvorrichtungen (Alconox, Schwämme u. dgl.).

2B. Ausrüstung zur Datensammlung

Standard-PC mit Festplatte und 3,5-inch-Diskettenlaufwerken, Monitor und Tastatur auf einem beweglichen Ständer. Der Computer sollte während der Dauer der Untersuchung dieser gewidmet sein.
WATERMAZ -Datensammlungsprogramm Infallible Software, INcl., Durham, N. C.).
Statistiksoftware.

3. Umgebung

Der Wassertank wurde an einem Ort mit Zugang zu einem Abflussbecken und sowohl Kalt- als auch Warmwasserleitungen aufgestellt. Der Tank war von zwei Seiten zugänglich. Der Raum wurde durch einen ruhigen isolierten Raum mit verschließbarer Tür und nicht zu hell fluoreszierender Deckenbeleuchtung bereitgestellt. Der Raum besaß eine stabile Temperatur von etwa 22ºC.

4. Verfahren

4A. Protokolle:

Protokoll "A" besteht aus einem verzahnten Ablauf von Injektionen von entweder Arzneimittel(n) oder Kochsalzlösung und Schwimmen. Die Injektionen werden in einer Folge: Injektion - 24 h - Schwimmen - 2 h - Injektion - 24 h - Schwimmen - 2 h - Injektion ... usw., bis ein stabiles Plateau der "Zeit bis zum Zielpunkt" unter den Kontrollen erreicht ist, verabreicht. Falls gewünscht, kann dieses Protokoll auf einen Zeitraum von weiteren 5-7 Tagen ausgedehnt werden, um zu beobachten, ob sich die Daten in der behandelten Gruppe bzw. den behandelten Gruppen schließlich in Bezug auf die Kontrollen ändern.
Protokoll "B" besteht aus Tieren, denen Kochsalzlösung oder Arzneimittel injiziert wurde, wobei die Mittel 7 Tage vor dem Schwimmen verabreicht wurden; danach ein Tag ohne Injektion (Auswaschpe riode) folgte und ein Training auf den Zielpunkt, bis ein stabiles Kontrollplateau erreicht ist, erfolgte.
Mäuse sind sehr schnell erschöpft. Daher sind, falls nicht unbedingt nötig, "Massenversuche" (d. h. mehr als ein Versuch pro Tag) nicht angeraten, da unweigerlich ein physischer Stressfaktor eingeführt wird. Ein Versuch/Tag beseitigt das Problem.
Zehn Tiere/Gruppe liefern eine ausreichend hohe statistische Zuverlässigkeit. Jedoch ist das Training von mehr als 40 Tieren/Tag (d. h. vier Gruppen) inpraktikabel wegen der zum Neufüllen des Tanks mit frischem Wasser notwendigen Unterbrechungen, Problemen der Injektionsfolgen und einer großen Menge erzeugter Daten, die anschließend die Effizienz der statistischen Analyse vermindern (einige Programme können eine sehr große derartige Zahl von Dateneinträgen nicht akzeptieren).
Verlauf des Experiments und gewonnene Daten:
Die Experimente wurden in der folgenden Reihenfolge durchgeführt: Zeit bis zum untergetauchten Zielpunkt (7 Tage) - freies Schwimmen [entfernter Zielpunkt (1 Tag)] - Zeit bis zum untergetauchten Target (7 Tage) - freies Schwimmen (1 Tag) ... usw. (bis zu Plateau) - umgedrehter Zielpunkt [Zielpunkt in neuer Position (bis zu Plateau, typischerweise 3 bis 5 Tage)] - sichtbar (schwarzes Target, bis zum Plateau). Maximale Zeit bis zum Zielpunkt, die erlaubt ist: 120 s.
Maximale Zeit im Tank während des freien Schwimmens: 60 s Daten: Zeit bis zum Zielpunkt
Quadrantenbevorzugung (Zeit/Quadrant)
Immobilität
Zahl von Mittelpunktdurchquerungen
Bewegungsmuster.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in Fig. 7 und 8 angegeben. Die Ergebnisse sind für 10 Kontrolltiere, die intraperitoneal mit 10 mg/kg Vehikel behandelt wurden und 10 Tiere, die intraperitoneal mit 10 mg/kg PDC008.004 behandelt wurden. Fig. 8 zeigt eine wesentliche und signifikante (P < 0,01) Bewegungsmusteränderung bei den mit dem Arzneimittel (11-[[[2- (Diethylamino)ethyl]cyclohexylmethylamino]-acetyl]-5,11- dihydro-6H-pyrido[2,3-b][1,4]-benzodiazepin-6-on) behandelten Mäusen, die aus einer raschen Verschiebung von thygmotaktischem Verhalten (An-die-Wand-Hängen) zu Mittelpunktdurchquerung und Mittelpunktdurchquerung/zielorientiertem Verhalten bestand. Dieses Verhalten ist konsistent mit einer erhöhten motorischen Aktivität, die nach einer einzigen Injektion des Arzneimittels (10 mg/kg, intraperitoneal) und einer anschließenden Zeitspanne von 24 h vor einem Verhaltenstest beobachtet wurde. In der Kontrollgruppe ist eine langsame Verschiebung von Thygmotaxie zu Thygmotaxie/Mittelpunktdurchquerung evident, wobei jedoch An-die-Wand- Hängen vorherrscht. Das Verhalten der Kontrollen ist konsistent mit dem von Tieren mit Kochsalzinjektion, das in mehreren früheren Untersuchungen beobachtet wurde. R. G. M. Morris, Learning and Motivation, 1981.
Fig. 9 zeigt eine wesentliche statistisch signifikante (P < 0,05) Abnahme der Zeit, die erforderlich ist, um einen verborgenen Zielpunkt zu finden, nach dem vierten Versuch unter Verwendung von Mäusen, die mit täglichen Injektionen von PDC008.004 (10 mg/kg, intraperitoneal) behandelt wurden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die beobachteten Wirkungen direkt mit zentralen Wirkungen von M&sub2;-Rezeptoren durch das verabreichte Mittel PDC008.004 (10 mg/kg, intraperitoneal, täglich) verbunden sind. Außerdem stützt das Vorhandensein von Dyskinesie, Ataxie und das Nichtvorhandensein von schlaffer Lähmung, das bei Tieren beobachtet wurde, die das Arzneimittel mit 100 mg/kg intraperitoneal injiziert erhielten, diese Schlussfolgerung. Das sehr schnelle Auftreten (maximal 2 min) von Verhaltensanzeichen (Dyskinesie und zentrale cholinerg vermittelte Ereignisse) zeigt das rasche Eindringen in den Intrazerebralraum.
Weitere Untersuchungen wurden durchgeführt, die zeigen, dass ähnliche Ergebnisse bei zwei unterschiedlichen Mäusestämmen, C57BL/6 und CL-1, erhalten wurden. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. TABELLE 3: Vergleich von zwei Mäusestämmen
Durchgeführte Vorergebnisse unter Verwendung des Morris-Wasserirrgarten-Verhaltensmodells zeigten eine wirksame Dosis von etwa 5-10 mg/kg (IP und PO). Auf der Basis dieser Daten beträgt der TI (therapeutische Index) zwischen 7,5 und 10 für IP- bzw. PO-Verabreichung. Weitere Untersuchungen zeigen, dass die wirksame Dosis von PDC008.004 weniger als 5 mg/kg mit einem entsprechend besseren TI betragen kann.
Infolgedessen zeigen die während vier Verhaltenstests erhaltenen Ergebnisse die potentiellen therapeutischen Anwendungen des Mittels PDC008.004 und von dessen verwandten Verbindungen bei akuten und chronischen Erkrankungen, bei denen kognitive Prozesse stark beeinflusst werden. Beispiele für diese Erkrankungen sind: Schlaganfall, globale Hirnischämie (nach Herzstillstand), Alzheimer-Krankheit und verwandte Erkrankungen bei fortgeschrittenem Alter (d. h. senile Demenz), Parkinson-Krankheit und Chorea Huntington, chronische Suchterkrankungen (d. h. Alkoholismus) und entzündliche Erkrankungen des Hirns (d. h. Meningitis). Neonatale Hypoxie und verwandte kognitive Defizite sind ebenfalls einer derartigen Behandlung zugänglich.
Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind einem Fachmann durch die vorhergehende detaillierte Beschreibung offensichtlich. Diese Modifikatinen und Variationen sollen innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche liegen.

Claims

1. Verbindung der Formel

worin

R¹, R² und R³ unabhängig voneinander C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkyl, C&sub3;&submin;&sub1;&sub0;-Cycloalkyl, Benzyl, Naphthylmethyl oder Phenylpropyl bedeuten, die optional mit den folgenden Gruppen substituiert sind: C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkyl, Phenyl, Benzyl, C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkoxy, Phenoxy, Benzyloxy, Amino, C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkylthio, Benzolthio, Benzylthio, Halogen, Nitro, C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkyl- oder Phenyl- oder Benzylcarbonamido, C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkyl- oder Phenyl- oder Benzylharnstoff, und n zwischen 1 und 20 liegt.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung selektiv an den Muscarin&sub2;-Rezeptor bindet, die Blut-Hirn-Schranke durchdringt und eine therapeutische Breite von größer als 2 hinsichtlich Verstärkung der Wahrnehmung aufweist.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 mit der Formel:

4. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verstärkung der Wahrnehmung bei einer diese benötigenden Person, das das Einarbeiten einer wirksamen Menge einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der pharmazeutische Träger aus der Gruppe von Trägern zur intravenösen Verabreichung, oralen Verabreichung, Verabreichung über dem Atmungstrakt, subkutanen Verabreichung, intramuskulären Verabreichung, rektalen Verabreichung und topischen Verabreichung ausgewählt ist, das ferner die Verabreichung der Verbindung auf einem für den Träger geeigneten Weg umfasst.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.

7. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung in der Medizin.

8. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der eine Wahrnehmungsverstärkung benötigt.

9. Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die eine Wahrnehmungsverstärkung benötigende Person an einer Erkrankung oder Störung leidet, die aus der aus Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Chorea Huntington, seniler Demenz, Alkoholismus, Meningitis, neonataler Hypoxie, Schlaganfall und globaler Hirnischämie bestehenden Gruppe ausgewählt ist.