DE69407975T2

DE69407975T2 - Reagenzsystem zur eichung von pipetten und anderen volumetrischen messgeräten

Info

Publication number: DE69407975T2
Application number: DE69407975T
Authority: DE
Inventors: Richard Curtis; Ann E Rundell
Original assignee: Artel Inc
Current assignee: Artel Inc
Priority date: 1993-07-09
Filing date: 1994-07-01
Publication date: 1998-04-30
Anticipated expiration: 2014-07-02
Also published as: EP0711404A1; WO1995002166A1; EP0711404B1; DE69407975D1; US5492673A; ATE162302T1

Description

Die Erfindung betrifft ein System zur genauen Bestimmung des Volumens eines Gefäßes wie zum Beispiel einer Labor-Pipette und insbesondere ein Reagenssystem zum Bestimmen des Volumens einer Pipette unter Anwendung eines Fotometers.
Pipetten sind Einrichtungen, die zum genauen Abgeben von flüssigen Volumenmengen verwendet werden. Die damit abgegebenen Volumina sind im allgemeinen kleiner als 10 ml. Pipetten werden häufig in klinischen, mobilen, pharmazeutischen und chemischen Labors verwendet. Manuell betätigte und automatisierte Pipetten üben ihre Funktion im allgemeinen durch Betätigung eines Kolbens in einem Zylinder aus. Wenn der Kolben in den Zylinder gezogen wird, wird ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit aus einem Vorrat gezogen. Wenn der Kolben in seine ursprungliche Position zurückgeführt wird, wird das Flüssigkeitsvolumen in einen zur Aufnahme der Flüssigkeit angeordneten Behälter ausgestoßen. Das Volumen der abgegebenen Flüssigkeit ist abhängig von dem den Kolben betätigenden Mechanismus, von dem von der Kolben/Zylinder-Kombination überstrichenen Bereich, dem Hub des Kolbens, dem Zustand verschiedener Komponenten in dem System, der Temperatur und anderen Faktoren, die von der Form der betreffenden Pipette bestimmt werden.
Bei vielen Anwendungen von Pipetten ist es wichtig zu wissen, welches mittlere Flüssigkeitsvolumen abgegeben wird (Genauigkeit der Abgabe), und in welchem Maße die Abgabe wiederholbar ist (Präzision der Abgabe). In dem Fall, in dem die Genauigkeit oder Präzision der Abgabe nicht bestimmte Anforderungen erfüllt, muß die Pipette eingestellt, repariert oder ersetzt werden. Die Häufigkeit, mit der eine bestimmte Pipette überprüft werden muß, hängt davon ab, wie kritisch die Verwendung der erzielten Ergebnisse ist und kann in Abhängigkeit von ihrer Anwendung im Bereich von zwischen Tagen und Jahren liegen.
Eine Möglichkeit, die Kalibrierung einer Pipette zu überprüfen, besteht darin, destilliertes Wasser in einen Behälter abzugeben und dieses Wasser zu wiegen. Die Nachteile bei der Anwendung dieses "gravimetrischen" Verfahrens bestehen unter anderem in dem Erfordernisse einer Waage mit einer geeignet hohen Genauigkeit und Empfindlichkeit, eines Gewichtssatzes, mit dem diese kalibriert wird, sowie eines geeigneten Ortes, der in hohem Maße gegen Vibrationen und Lufibewegungen isoliert ist, ferner in der Verdampfung der Wasserprobe, die zu fehlerhaften Ergebnissen führt und der Tatsache, daß die Waage nicht tragbar ist, so daß alle Pipetten zur Überprüfung der Kalibrierung zu der Waage gebracht werden müssen. Bei großen automatisierten Teilen von Pipetten-Ausrüstungen ist dieses Erfordernisse nur schwer oder gar nicht zu erfüllen.
Ein alternatives Verfahren zur Kalibrierung von Pipetten besteht darin, die Pipette zur Abgabe von Proben einer Farbstofflösung oder eines anderen absorbierenden chemischen Mittels zu verwenden. Die abgegebene Probe kann mit einem Verdünnungsmittel verdünnt werden, um die Absorptionsfähigkeit zu reduzieren und in einen Bereich zu bringen, der mit einem Fotometer zuverlässig gemessen werden kann. Wenn die Konzentration und die Absorptionseigenschafien der Farbstofflösung, das Volumen des Verdünnungsmittels und die Absorptionsfähigkeit der sich ergebenden Mischung bekannt sind, kann das mit der Pipette abgegebene Volumen einfach berechnet werden.
Dieses Verfahren, das auch als "colorimetrisches" Verfahren bezeichnet wird, hat bei kleinen Pipetten-Volumina (zum Beispiel weniger als 100 Mikroliter) besondere Vorteile, da die Gewichte von so kleinen Volumina von Wasser mit hoher Genauigkeit nur schwer zu bestimmen sind. Auch wenn gegenüber dem oben beschriebenen "gravimetrischen" Verfahren Verbesserungen erzielt werden, haben bekannte "colorimetrische" Proben im allgemeinen den Nachteil, daß die Farbstoff- Absorptionsfähigkeit nichtlinear ist, so daß komplizierte Korrekturberechnungen durchgeführt werden müssen.
In der US-PS 4.354.376 wird zum Beispiel ein colorimetrischer Pipetten- Kalibrierungssatz beschrieben, bei dem eine Mehrzahl von Probenlösungen mit vorbestimmten Konzentrationen eines Reagensmittels in einem Verdünnungsmittel verwendet werden, um eine Kalibrierungskurve zu ermitteln. Die zu kalibrierende Pipette wird zur Messung einer Menge des Reagensmittels verwendet, das einem vorbestimmten Volumen des Verdünnungsmittels zugesetzt werden muß. Die Absorptionseigenschafien dieser Lösung können dann mit der Kalibrierungskurve verglichen werden, um das tatsächliche Volumen des mit der Pipette abgegebenen Reagensmittels zu ermitteln.
In der EP-A-0.431.578 wird ein colorimetrisches Verfahren zur Kalibrierung einer Pipette beschrieben, bei dem die Absorptionsfähigkeit eines einzigen bekannten Volumens eines Reagensmittels mit der Absorptionsfähigkeit eines Volumens des gleichen Reagensmittels, das mit der zu untersuchenden Pipette abgegeben wurde, verglichen wird. Durch Multiplikation des bekannten Volumens mit dem Verhältnis zwischen der Absorptionsfähigkeit der abgegebenen Probe und der bekannten Probe kann das tatsächliche Volumen des mit der Pipette abgegebenen Reagensmittels berechnet werden.
Der Erfindung liegt die allgemeine Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Reagenssystem zur Kalibrierung des Volumens einer Pipette oder eines anderen Gefäßes unter Verwendung eines Fotometers zu schaffen.
Weiterhin liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Reagenssystem zum Bestimmen des Volumens einer Pipette mit hoher Genauigkeit zu schaffen.
Außerdem soll mit der Erfindung ein Reagenssystem zum Bestimmen des Volumens einer Pipette mit einem Fotometer geschaffen werden, das zur Messung keinen hochgenauen Behälter erfordert.
Schließlich soll mit der Erfindung ein Reagenssystem zum Bestimmen des Volumens einer Pipette geschaffen werden, das einfach anzuwenden und kostengünstig ist.
Erfindungsgemäß werden diese und andere Aufgaben und Vorteile unter Verwendung eines verbesserten Reagenssystems zum Bestimmen des Volumens eines Gefäßes, wie zum Beispiel einer Pipette, unter Verwendung eines Fotometers gelöst bzw. erzielt.
Unter einem ersten Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Reagenssystem zur Anwendung bei der Bestimmung des Volumens eines Gefäßes geschaffen, das folgende Merkmale aufweist:
a) eine Referenz-Lösung mit einem ersten pH-Puffer, einer ersten konservierenden Lösung, einem Anti-Agglomerationsmittel und einer absorbierenden Art mit einer ersten maximalen Absorptionsspitze und
b) eine Proben-Lösung, die einen zweiten pH-Puffer, eine zweite konservierende Lösung und einen organischen Farbstoff aufweist, wobei der organische Farbstoff eine zweite maximale Absorptionsspitze hat, die sich wesentlich von der ersten maximalen Absorptionsspitze unterscheidet.
Das erfindungsgemäße Reagenssystem kann mit einem spezifischen Kalibrierungssystem wie dem Artel PCS -Pipetten-Kalibrierungssystem oder in Verbindung mit einer anderen fotometrischen Ausrüstung für allgemeine Zwecke verwendet werden. Ein Beispiel für eine solche Anwendung ist die Prüfung der Kalibrierung einer automatisierten Vorrichtung, mit der wiederholt Volumina einer Flüssigkeit in spezialisierte Küvetten oder Behälter abgegeben werden. Einen solchen Fall stellt die Vorrichtung dar, die zum Einbringen von Proben und Reagenzien in Mikrotiter-Platten verwendet wird. Diese Platten werden aus klarem Kunststoff hergestellt und enthalten im allgemeinen 96 Kanäle mit einer Kapazität von jeweils näherungsweise 350 µl. Nach dem Auffüllen werden die Platten in die automatisierte fotometrische Einrichtung eingebracht, mit der die Absorptionsfähigkeit der Inhalte jeder der 96 Kanäle bestimmt wird.
Es gibt zahlreiche weitere Beispiele für Vorrichtungen, mit denen Flüssigkeitsvolumina mit hoher Genauigkeit abgegeben werden und deren Kalibrierung periodisch überprüft werden muß. Das hier beschriebene Reagenssystem ist allgemein zur Verwendung bei der Überprüfung der Genauigkeit und Präzision solcher Vorrichtungen zur Abgabe einer Flüssigkeit geeignet.
Das erfindungsgemäße Reagenssystem zeichnet sich durch seine Fähigkeit aus, die Ungenauigkeiten bei der Messung, die sich aus Problemen der Linearität, der Konservierung des Reagensmittels und vorzugsweise der Oberflächenspannung ergeben, zu überwinden. Auf all dieses wird nachfolgend noch eingegangen werden.
Bekannte Reagenssysteme sind nichtlinear, das heißt sie entsprechen nicht dem Gesetz von Beer, das wie folgt lautet:
A = &epsi; c l,
wobei A = Absorptionsgrad, &epsi; = molekularer Extinktionskoeffizient, c = Konzentration und l = Weglänge.
Bei bekannten Reagenssystemen war der Extinktions-Koeffizient &epsi; nicht konstant, sondern von der Konzentration abhängig. Bei früheren Systemen wurde diese Nichtlinearität teilweise mit einer quadratischen Kurvenanpassung korrigiert, wobei die Koeffizienten experimentell bestimmt wurden. Das Programm in der PCS korrigierte zum Beispiel automatisch die Daten unter Verwendung dieser Koeffizienten. In der Praxis stellte sich heraus, daß die Koeffizienten in Bezug auf die Zeit oder die Temperatur nicht stabil waren, was zu Fehlern bei den berechneten Volumina der Pipette führte. Bei dem hier beschriebenen Reagenssystem wird die Ursache für die Nichtlinearität mit chemischen Mitteln beseitigt, so daß die Korrektur überflüssig wird.
Ferner stellte sich bei bekannten Systemen heraus, daß die Art und die Konzentration des Konservierungsmittels ungeeignet war, um während der Lagerung ein mikrobiologisches Wachstum zu verhindern. Es wurde ein neues Konservierungsmiffel (bestehend aus drei Inhaltsstoffen) eingeführt, das nicht nur mikrobiologisch wesentlich wirksamer ist, sondern auch die Gesundheit oder die Umwelt in keiner bekannten Weise belastet. Außerdem zeigt es keine nachteiligen Reaktionen mit den anderen Inhaltsstoffen bzw. Bestandteilen.
Zusätzlich zeigte sich bei höheren Konzentrationen, daß die alte Probenlösung die Spitzen der Kunststoff-Pipette "benetzen", was dazu führt, das kleine Tropfen an der Innen- und der Außenseite zurückbleiben und die Meßergebnisse ungenau und unpräzise werden. Die neue Probenlösung hat eine höhere Oberflächenspannung und benetzt deshalb die Pipettenspitzen wesentlich weniger als die alte Lösung, so daß eine höhere Genauigkeit und Präzision insbesondere bei geringen Volumina (zum Beispiel 10 µl und weniger) erzielt wird.
Zum besseren Verständnis der Erfindung sowie anderer und weiterer Aufgaben, Vorteile und Besonderheiten wird nachfolgend auf die Zeichnung Bezug genommen. Es zeigt:
Fig. 1 eine perspektivische Ansicht eines Fotometers, das zur Anwendung in dem erfindungsgemäßen Kalibrierungsverfahren für Pipettenvolumen geeignet ist,
Fig. 2 eine schematische Ansicht eines Reagenssystems, das in Übereinstimmung mit der Erfindung mit dem Fotometer zur Kalibrierung des Pipettenvolumens verwendet wird,
Fig. 3 eine schematische Darstellung der Optiken des für die Absorptionsmessungen verwendeten Fotometers,
Fig. 4 ein Blockschaltbild der elektronischen Hauptkomponenten des Fotometers,
Fig. 5 eine grafische Darstellung des Absorptionsgrades als Funktion der Wellenlänge für die Absorptionsspektren von Kupferchlorid und Ponceau S,
Fig. 6 ein Flußdiagramm des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Kalibrierung eines Pipettenvolumens,
Fig. 7 ein Blockschaltbild einer Resonanzfrequenz-Mischvorrichtung in dem Fotometer zur Anwendung bei der Erfindung,
Fig. 8 eine grafische Darstellung des Extinktionskoeffizienten von Ponceau S in destilliertem Wasser und einer Pufferlösung und
Fig. 9 eine grafische Darstellung des Extinktionskoeffizienten von Ponceau S in einer Pufferlösung mit verschießenen Mengen eines zugesetzten Anti- Agglomerationsmittels.
Mit der Erfindung werden Verfahren und eine Vorrichtung zur genauen Bestimmung oder Kalibrierung (Eichung) des Volumens eines Gefäßes wie einer Laborpipette unter Verwendung eines Fotometers geschaffen. Das Verfahren wird im allgemeinen zur Kalibrierung des Volumens von Pipetten mit einer Größe im Bereich zwischen 5 und 500 Mikroliter anwendet. Die Erfindung kann jedoch auch zur Kalibrierung von Gefäßen mit Volumina anwendet werden, die außerhalb dieses Bereiches liegen. Die Hauptkomponenten, die zum Bestimmen des Volumens einer Pipette erforderlich sind, sind ein Fotometer und ein Kalibrierungs-Reagenssystem. Zur Aufzeichnung der Ergebnisse wird vorzugsweise ein Drucker verwendet.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt unter dem zweiten Gesichtspunkt folgende Schritte: Positionieren eines Behälte?s in einem Fotometer, wobei der Behälter eine bekannte Menge der Referenz-Lösung enthält, die unter dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert wurde und bei einer ersten Wellenlänge einen maximalen Absorptionsgrad atifweist, Messen des Absorptionsgrades des Behälters bei der ersten Wellenlänge und bei einer zweiten Wellenlänge, Berechnen der optischen Weglänge des Behälters bei der zweiten Wellenlänge aus den gemessenen Absorptionsgraden bei der ersten und der zweiten Wellenlänge, Einführen eines Aliquots aus einer Proben-Lösung in den Behälter aus einem zu kalibrierenden Gefäß, wobei die Proben-Lösung gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert ist und einen maximalen Absorptionsgrad bei der zweiten Wellenlänge aufweist und Mischen der Proben-Lösung mit der Referenz-Lösung zur Bildung einer Mischung, Messen des Absorptionsgrades der Mischung in dem Behälter bei der zweiten Wellenlänge, sowie Berechnen des Volumens des Aliquots aus dem Absorptionsgrad der Mischung und der optischen Weglänge des Behälters auf der Grundlage des bekannten Volumens und der Konzentration der Referenz-Lösung und der bekannten Konzentration der Proben-Lösung, wobei das Volumen des Aliquots das Volumen des Gefäßes darstellt und wobei die Referenz-Lösung und die Proben-Lösung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 definiert ist.
Das Gefäß weist im allgemeinen eine Pipette auf. Die Referenz-Lösung enthält vorzugsweise Kupferchlorid, das in einem Puffer mit einem pH-Wert von 6 gelöst ist und bei etwa 730 nm einen maximalen Absorptionsgrad aufweist. Die Proben- Lösung weist vorzugsweise Ponceau S (Aeid Red 112) auf, das in einem Puffer mit einem pH-Wert von 6 gelöst ist und bei etwa 520 nm einen maximalen Absorptionsgrad zeigt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Schritte des Einführens eines Aliquots der Proben-Lösung in den Behälter, des Messens des Absorptionsgrades der Mischung und des Berechnens des Volumens wiederholt, um mehrere Meßwerte für das Volumen des Gefäßes zu ermitteln, ohne den Behälter zu leeren oder den Behälter in seiner Position in dem Fotometer zu bewegen.
Der Schritt des Berechnens der optischen Weglänge umfaßt vorzugsweise eine Korrektur der optischen Weglänge für einen Nullwert-Offset, der eine Differenz zwischen dem Absorptionsgrad des Behälters bei der ersten Wellenlänge und dem Absorptionsgrad des Behälters bei der zweiten Wellenlänge darstellt. Der Schritt des Berechnens der optischen Weglänge umfaßt vorzugsweise ferner eine Korrektur der optischen Weglänge im Hinblick auf eine Differenz zwischen der Weglänge des Behälters bei der ersten Wellenlänge und der Weglänge des Behälters bei der zweiten Wellenlänge.
Der Schritt des Berechnens des Volumens umfaßt vorzugsweise eine Berechnung des Volumens unter Anwendung des Gesetzes von Beer.
Vor der Bestimmung des Volumens eines Gefäßes wird im allgemeinen die Umgebungstemperatur gemessen. Der Schritt des Berechnens der optischen Weglänge umfaßt vorzugsweise eine Korrektur des Absorptionsgrades der Referenz-Lösung im Hinblick auf eine Differenz zwischen dem Absorptionsgrad bei der gemessenen Umgebungsbedienung und dem Absorptionsgrad bei einer Bezugstemperatur. Der Schritt des Berechnens des Volumens umfaßt vorzugsweise eine Korrektur des gemessenen Absorptionsgrades der Mischung im Hinblick auf eine Differenz zwischen dem Absorptionsgrad bei der gemessenen Umgebungstemperatur und dem Absorptionsgrad bei einer Bezugstemperatur. Der Schritt des Berechnens des Volumens umfaßt vorzugsweise ferner eine Korrektur des berechneten Volumens im Hinblick auf eine Differenz zwischen dem Volumen bei der gemessenen Umgebungstemperatur und dem Volumen bei der Bezugstemperatur.
Ein bevorzugtes Fotometer zur Anwendung mit dem erfindungsgemäßen System und dem Verfahren ist in den Figuren 1, 3 und 4 gezeigt und im Detail in der US-PS 5.092.677 mit dem Titel "Photometer Having a Long Lamp Life, Reduced Warm-Up Period And Resonant Frequency Mixing" vom 3. März 1992 beschrieben. Die in Figur 1 gezeigte Fotometer-Vorrichtung 10 ist ein Wellenlängen-selektives Fotometer mit der Fähigkeit, die Erfordernisse für die Durchführung des Mischens und der fotometrischen Messung bei der Kalibrierung eines Pipettenvolumens zu erfüllen. Die Vorrichtung wird über ein Tastaturfeld 30 betätigt und übermittelt einer Bedienperson Informationen über eine alphanunmerische Anzeige 31, einen über ein Kabel 29 angeschlossenen Drucker 70 (Figur 4) und über akustische und visuelle Signale zu bestimmten Punkten während und zum Abschluß jeder Kalibrierung. Ein schwenkbarer Verschluß 41 bedeckt eine Küvette 27 (Figur 3), die eine zu analysierende Lösung enthält. Die Küvette 27 wird mit einem Halter 28 in einer Kammer unter dem Verschluß 41 gehalten, so daß Proben direkt aus einer Pipette 26 in die Küvette eingegeben werden können, während diese sich in dem Fotometer befindet.
In Figur 3 ist schematisch der optische Aufbau 23 des Fotometers gezeigt. Das von einer Lampe 44 erzeugte Licht wird mit einer Linse 46 zu parallelen Strahlen ausgeblendet. Eine Öffnung 49 begrenzt die Strahlen zu einem ausgeblendeten (kollimierten) Strahlenbündel mit kleinem Durchmesser. Die Lampe ist ein Kolben, der mit einem inerten Gas wie Krypton oder Argon gefüllt ist und einen Wolframdraht enthält. Diese Lampe hat eine reduzierte Warmlaufphase, wobei das inerte Gas die Verdampfung von Wolframatomen aus dem Draht minimiert, so daß höhere Betriebstemperaturen möglich sind. Das Strahlenbündel tritt durch ein Filter 40, mit dem eine für den laufenden Test geeignete Wellenlänge ausgewählt wird. Das Filter 40 ist eines aus einer Mehrzahl von Filtern, die in einem Filterrad 37 montiert sind, das über eine Welle 38 mit einem Filterradmotor 39 gedreht wird. Das Lichtstrahlenbündel wird dann mit einem teilweise reflektierenden Strahlteiler 50, der etwa 10% des Strahlenbündeis über eine Linse 47 zu einem Referenz-Fotodetektor 51 reflektiert, in zwei Teile aufgeteilt. 90% des Strahlenbündels tritt durch den Strahlteiler 50 und durch eine Lösung 11 in der Küvette 27 in dem Küvettenhalter 28. Ein Teil des Lichtstrahls wird durch die Lösung absorbiert, während der Rest durch eine Linse 48 zu einem Fotodetektor 52 übertragen wird. Die Stärke der Lampe 44 wird durch eine rückgekoppelte Steuerschaltung 53 geregelt, die von dem Referenz-Fotodetektor 51 ein Eingangssignal erhält und bewirkt, daß sich die Intensität der Quelle asymptotisch einem endgülhgen und stabilen Wert mit einer gleichmäßigen und im wesentliehen exponentiellen Kurve annähert. Der Absorptionsgrad der Lösung 11 in der Küvette 27 wird durch Vergleich der Ausgangssignale der Fotodetektoren 51 und 52 bestimmt. Die Ausgangssignale des Referenz- und des Proben-Fotodetektors werden zu verschiedenen Zeiten abgenommen, während sich die Intensität der Quelle einem endgültigen stabilen Wert annähert, um Schwankungen der Intensität der Lichtquelle während der Zeitperiode, in der die Ausgangssignale abgenommen werden, zu kompensieren.
In Figur 4 ist ein Blockschaltbild des elektronischen Teils des Fotometers gezeigt. Die Ausgangssignale der Fotodetektoren 51 und 52 werden durch Vorverstärker 61 bzw. 62 und einen Multiplexer 64 zu einem Analog-Digitalwandler 66 geführt. Der Analog-Digitalwandler 66 digitalisiert einen ausgewählten Fotodetektor-Ausgang und erzeugt ein Eingangssignal für einen Mikroprozessor 68. Der Mikroprozessor 68 empfängt die Meßwerte des Absorptionsgrades von den Fotodetektoren 51 und 52 und berechnet gemäß nachfolgender detaillierter Beschreibung das Volumen der Pipette. Weiterhin berechnet der Mikroprozessor 68 statistische Daten und führt die Ausgangssignale einem Drucker 70 zu.
Ein geeigneter Reagenssatz zur Durchführung der Kalibrierung einer Pipette ist schematisch Figur 2 gezeigt. Eine Anzahl von Referenz-Reagensküvetten 78, die der in Figur 3 gezeigten Küvette 27 entsprechen, enthalten jeweils ein vorbestimmtes Volumen einer nachfolgend noch beschriebenen Referenz-Lösung. Behälter 80, 81, 82 und 84 enthalten vorbestimmte Konzentrationen von Proben-Lösungen. Die Proben-Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen werden zum Messen der Pipetten in verschiedenen Größenbereichen verwendet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Behälter 82 eine Proben-Lösung für Pipetten im Bereich zwischen 2 und 9,9 Mikroliter, der Behälter 80 enthält eine Proben-Lösung zur Kalibrierung von Pipetten im Größenbereich von 10 bis 49,9 Mikroliter, der Behälter 81 enthält eine Proben-Lösung zur Kalibrierung von Pipetten im Größenbereich von 50 bis 199 Mikroliter, und der Behälter 84 enthält eine Proben-Lösung zur Kalibrierung von Pipetten im Größenbereich von 200 bis 5000 Mikroliter. Das Reagenssystem weist ferner Behälter au{ die eine Kalibrierungs-Lösung für die Vorrichtung und weggeworfene Pipetten enthalten, sowie Proben-Aliquot-Behälter.
Das Reagenssystem und das Meßverfahren basieren auf der Anwendung des Gesetzes von Beer, das wie folgt lautet:
(1) A=Cl&epsi;
Hierbei ist A der Absorptionsgrad der Lösung, C die Konzentration eines absorbierenden Mittels, 1 die Weglänge des Lichtes durch die Lösung und E die molare Absorptionsfähigkeit des Mittels. Wie später noch erläutert werden wird, werden die mit dem Fotometer durchgeführten Messungen des Absorptionsgrades zur Bestimmung des Volumens verwendet.
Das Kalibrierungssystem verwendet zwei Arten von Reagenzien, nämlich eine Referenz- (Verdünnungs-) Lösung und eine Proben-Lösung. Die Referenz-Lösung besteht aus Kupferchlorid (CuCl&sub2;), das in einem Phthalat-Puffer (0,02 M, pH 6) mit einem aus drei Komponenten bestehenden Konservierungsmittel in Lösung aufgelöst ist. Das Konservierungsmittel besteht aus 0,1 Gewichts% Methylparaben (Methyl 4-hydroxybenzoat), 0,2 Volumen% Phenoxytol (2-phenoxyethanol) und 0,1 Gewichts% EDTA, TSS (Ethylenediametetraacetic Säure, Tetranatriumsalz). Die Referenz-Lösung weist ferner ein Anti-Agglomerationsmittel wie PEG 200 (Polyethylenglycol, MW = 200) auf. Zur Anwendung bei einer Ausrüstung mit Ausnahme des oben beschriebenen Artel PCS -Systems wird das PEG 200 mit 3 Volumen% verwendet. Bei dem PCS -System wird das PEG 200 mit 10 Volumen% verwendet. Im diesem letztgenannten Fall weist die Referenz-Lösung ferner 6,588 x 10&supmin;³ M Kupferchloriddihydrat (CuCl&sub2; 2H&sub2;O) und zusätzlich 6,588 x 10&supmin;³ M EDTA, TSS auf. Das zusätzliche EDTA, TSS wirkt als Chelat-Mittel für Kupfer-Ionen und dient dem doppelten Zweck der Verbesserung des Absorptionsgrades der Kupfer- Ionen, während ihr Zusammenwirken mit dem Ponceau S Farbstoff verhindert wird.
Die in Figur 2 gezeigten Referenz-Reagensküvetten 78 sind mit genau 4,75 ml einer Referenz-Lösung vorgefüllt und mit einer Kappe dicht verschlossen.
Die Proben-Lösung wird unter Verwendung des gleichen Puffers und der Konservierungszusammensetzung wie bei der Referenz-Lösung hergestellt, der weiterhin der Farbstoff Ponceau S (Acid Red 112) {3 hydroxy-4-[2-sulfo-4-(4-sulfophenylazo) phenylazo]-2,7-naphthalenedisulfonic Säure, Tetranatriumsalz} zugesetzt wird. Der Farbstoff ist in Abhängigkeit von der vorgesehenen Anwendung mit einer Konzentration von etwa 2,5 x 10&supmin;&sup5; M bis 2,0 x 10&supmin;² M vorhanden. Wie oben bereits erläutert wurde, sind drei Konzentrationen von Proben-Lösungen vorhanden, um die Kalibrierung eines Bereiches von Pipetten-Volumina zu ermöglichen.
Die Referenz- und die Proben-Lösungen bilden Farbstoffe, die zur Erziehung einer genauen Kalibrierung des Pipettenvolumens zusammenarbeiten. Wie in Figur 5 gezeigt ist, haben die Farbstoffe unterschiedliche Absorptionsspitzen. Wie an dem Verlauf der in Figur 5 gezeigten Kurve 90 zu erkennen ist, hat Kupferchlorid (Farbstoff B) eine Absorptionsspitze bei etwa 730 nm. Wie sich aus dem Verlauf der Kurve 92 ergibt, hat Ponceau S (Farbstoff A) eine Absorptionsspitze bei etwa 520 nm. Außerdem haben die Absorptionsspektren eine nur geringe Überlappung Bei 520 nm ist der Absorptionsgrad von Kupferchlorid relativ klein, während bei 730 nm der Absorptionsgrad von Ponceau S relativ klein ist.
Es wird angenommen, daß der Grund für die Nichtlinearität von bekannten Reagenssystemen die Agglomeration von Farbstoffmolekülen in Gegenwart von anderen Ionen ist. Der Farbstoff an sich ist in einer wässrigen Lösung in einem großen Bereich linear. Durch die Gegenwart von anderen Inhaltsstoffen (Bestandteilen) werden die Ionen eingebracht, die die Nichtlinearität verursachen.
Andere Bestandteile, die in dem betreffenden Reagenssystem wünschenswert sind, sind ein Puffer zur Stabilisierung des pH-Wertes, da die Absorptionseigenschaften der untersuchten Farbstoffe alle von dem pH-Wert der Lösung abhängig sind, sowie Konservierungsstoffe zur Verhinderung eines mikrobiologischen Wachstums.
Bei den Reagenzien, die in dem Pipetten-Kalibrierungssystem Artel PCS verwendet werden, wird eine zweite absorbierenden Art mit einer Spitze, die deutlich von der Spitze des ersten Farbstoff beabstandet ist und die nur geringe oder keine Absorption in dem Bereich der Spitze des ersten Farbstoffs aufweist, ebenfalls verwendet.
Jeder dieser Bestandteile kann eine Agglomeration verursachten, was durch Absorptionsmessungen für eine Folge von Verdünnungen bestimmt werden kann. Ponceau S und alle anderen untersuchten organischen Farbstoffe zeigen das gleiche allgemeine Verhalten.
Die Agglomeration von Farbstoffmolekülen verursacht eine Nichtlinearität, die die in Figur 8 gezeigte Form annimmt. Die Daten wurden aus Versuchsergebnissen unter Verwendung der oben beschriebenen Bestandteile gewonnen. Kurve 1 stellt dabei Ponceau S in destilliertem Wasser dar, während Kurve 2 die Werte für Ponceau S in dem oben beschriebenen Verdünnungsmittel ohne den Zusatz eines Anti- Agglomerationsmittels wiedergibt. Ergebnisse dieser allgemeinen Art sind für eine Anzahl verschiedener Formulierungen beobachtet worden, bei denen sich organische Farbstoffe in Lösung mit Salzen mit erheblicher Konzentration (größer als diejenige des Farbstoffs) befinden.
Zur Verhinderung der Agglomeration werden zwei Mittel angewendet.
1. Die Konzentrationen aller Bestandteile mit Ausnahme des Farbstoffs werden bei einem absoluten Minimum gehalten. Der Puffer ist zum Beispiel in ausreichender Weise bei 0,02 M wirksam, im Vergleich zu bekannten Puffern mit 0,10 M.
2. Ein Anti-Agglomerationsmittel wird zur Minimierung der Agglomeration der Farbstoffmoleküle zugesetzt. Mittel, die bereits ausprobiert wurden und zu einem gewissen Grad eine entsprechende Funktion haben, sind: Ethylenglykole, Diethylenglykole, Triethylenglykole, Polyethylenoxide, Polyethylenglykole (MW im Bereich von 200 bis 10.000), Pyridine und Propylenglykole.
Es wird angenommen, daß das wirksamste Mittel Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 200 (PEG 200) ist. Die zur Sicherstellung einer ausreichenden Linearität erforderliche Menge hängt von der Konzentration der anderen Bestandteile ab. Bei der vorliegenden Formulierung werden 10% PEG 200 zu den Referenz- oder Verdünnungs-Lösungen zugesetzt. Figur 9 zeigt die Wirkung des Zusatzes von PEG 200 in verschiedenen Konzentrationen zu der oben beschriebenen Formel. Kurve 1 stellt Ponceau S in der oben beschriebenen Verdünnung ohne den Zusatz des Anti-Agglomerationsmittels dar. Die Kurven 2 bis 4 zeigen die Lösung gemäß Kurve 1 mit dem Zusatz des Anti-Agglomerationsmittels PEG 200 mit Anteilen von 3%, 5% bzw. 10%. Es ist zu erkennen, daß die Nichtlinearität im Bereich der Skala mit geringer Konzentration beseitigt ist, auch wenn die Nichtlinearität an dem anderen Ende verschlechtert ist, wobei bei geringer Konzentration ein Einsatz vorhanden ist. Bei Verwendung eines organischen Farbstoffs als absorbierendes Eichmittel ist es wichtig, daß das untere Ende linear gemacht wird. Dementsprechend kann das obere Ende der Nichtlinearität gemieden werden, indem niemals Konzentrationen verwendet werden, die über dem Punkt liegen, bei dem die Nichtlineantät beginnt.
Bei bekannten Reagenssystemen wird Natriumazid mit einer Konzentration von 0,01% w/w als Konservierungsmittel verwendet. Bei dieser Konzentration trat ein mikrobiologisches Wachstum aut, das die optische Klarheit der Reagenzien verschlechterte. Aufgrund der zweifelhaften Einflüsse von Natriumazid auf die Gesundheit wurde es nicht weiter verwendet, sondern ein Ersatzstoffe eingesetzt, der aus 0,1% w/w Methylparaben, 0,2% v/v Phenoxytol und 0,1% w/w EDTA, Tetranatriumsalz besteht.
Die beiden ersten Verbindungen sind allgemein in der Kosmetikindustrie bekannt, wo sie zur wirksamen und sicheren Steuerung des mikrobiologischen Wachstums dienen. Das EDTA wird zugesetzt, um die Wirkung von Methylparaben auf Gramnegative Bakterien zu verbessern.
Diese konservierende Kombination ist ausführlich in Verbindung mit dem Puffer (Phthalatpuffer, 0,02 M, pH 6,00) und Farbstoff (Ponceau S) untersucht worden.
Sie hatte nach einer dreimonatigen Untersuchung keine meßbaren nachteiligen Einflüsse auf den Farbstoff.
Der zuvor verwendete Farbstoff Acid Red 1 verursachte eine geringe Oberflächenspannung in konzentrierter wässriger Lösung, was zu ungenauen und unpräzisen Ergebnissen bei der Pipettenmessung führte. Ein möglicher Grund für diese geringe Oberflächenspannung ist das Vorhandensein von Verunreinigungen in den im Handel erhältlichen Zubereitungen. Der aktuelle Farbstoff Ponceau S (Acid Red 112) ist in hochreiner Form erhältlich. Diese reine Form kann der Grund für die hohe Oberflächenspannung auch bei sehr konzentrierten Lösungen (bis zu dem 20-fachen gegenüber den vorher verwendeten Acid Red 1 -Lösungen) sein. Diese Lösungen zeigen im Hinblick auf eine Pipette sehr ähnliche Eigenschaften wie destilliertes Wasser, das üblicherweise als Standard (Eichmaß) zum Vergleich verwendet wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung des Pipettenvolumens basiert im allgemeinen darauf, zunächst die optische Weglänge der Küvette zu bestimmen, die mit den zu messenden Lösungen in den Fotometer eingebracht wird. Es ist klar, daß Veränderungen des inneren Durchmessers der Küvette die optische Weglänge beeinflussen. In der Praxis hat sich herausgestellt, daß bei Küvetten zu normalen Preisen die optische Weglänge um etwa 2% schwankt. Ferner sind die Küvetten im allgemeinen nicht ganz rund, so daß Ihre optische Weglänge auch von ihrer Ausrichtung in dem Fotometer abhängig ist. Da angestrebt wird, das Pipettenvolumen mit einer Ungenauigkeiten von 1% oder weniger zu bestimmen, ist es notwendig, die optische Weglänge jeder Küvette zu ermitteln, wenn diese mit einer vorbestimmten Ausrichtung in den Fotometer eingesetzt wird.
Nachdem die optische Weglänge der Küvette bestimmt worden ist, wird das Volumen der zu kalibrierenden Pipette ermittelt. Das Volumen-Meßverfahren basiert im allgemeinen auf einer Verdünnung der Referenz-Lösung in der Küvette mit einer Proben-Lösung, die mit der zu kalibrierenden Pipette in die Küvette eingebracht wird. Das Aliquot der in die Küvette eingebrachten Proben-Lösung korrespondiert mit dem Volumen der Pipette. Die Referenz-Lösung und die Proben-Lösung werden gemischt. Der Absorptionsgrad der Mischung wird bei der Wellenlänge gemessen, bei der die Proben-Lösung einen maximalen Absorptionsgrad hat. Die Erhöhung des Absorptionsgrades der Mischung hängt von dem Volumen der Proben-Lösung, die mit der zu kalibrierenden Pipette hinzugefügt wurde, ab. Das Vorgehen bei der Kalibrierung des Pipettenvolumens wird nachfolgend im Detail beschrieben.
In Figur 6 ist ein Flußdiagramm des erfindungsgemäßen Ablaufs einer Volumenkalibrierung gezeigt. Zunächst wird in einem Schritt 102 das Nennvolumen und die Seriennummer der zu kalibrierende Pipette über ein Tastaturfeld 30 eingegeben. Diese Informationen werden nachfolgend zum Ausdrucken der Ergebnisse der Kalibrierung verwendet. In Schritt 104 führt dann der Fotometer eine Selbst-Kalibrierung durch, während der die Umgebungstemperatur gemessen und für eine spätere Verwendung gespeichert wird. Der Fotometer weist zur Messung der Umgebungstemperatur einen Thermistor auf. Anschließend führt der Anwender in Schritt 106 durch den scharnierartig aufgehängten Deckel 41 eine Referenz-Reagensküvette 78 in den Fotometer ein. Die Referenz-Reagensküvette 78 wird in den Fotometer in die Position der in Figur 3 gezeigten Küvette 27 eingebracht, so daß der Lichtstrahl durch die Küvette und die in dieser enthaltene Lösung hindurchtritt. Wie oben bereits erwähnt wurde, enthält die Referenz-Reagensküvette 78 ein vorbestimmtes Volumen von Kupferchlorid, das in einem pH 6,0 Puffer aufgelöst ist. Das Kupferchlorid hat eine bekannte Konzentration und ist im allgemeinen 0,006588 Molar. Im Schritt 108 führt der Fotometer Absorptionsgrad-Messungen der Referenz-Reagensküvette bei 520 nm und 730 nm durch. Anschließend wird in Schritt 110 der Nullwert berechnet, und in Schritt 112 die Weglänge der Referenz-Reagensküvette 78 berechnet.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Referenz-Reagensküvetten 78 Gefäße (Fläschchen) aus Borsilikat-Glas mit einem Nenndurchmesser von 21 mm. Die nominelle Weglänge beträgt 18,4 mm. Die Begriffe "Küvette" und "Gefäß" sind hier gleichbedeutend zu verwenden und beziehen sich auf den Behälter, der für die Absorptionsgrad-Messungen in den Fotometer eingebracht wird. Wie bereits oben erläutert wurde, besteht eine Toleranz der Weglänge von 2%. Außerdem sind die Gefäße nicht absolut rund, so daß die gemessene Weglänge von der Ausrichtung des Gefäßes in dem Fotometer abhängig ist.
Die relativ geringe Genauigkeit der Weglängen-Spezifikation würde die Gesamt- Genauigkeit der Volumen-Kalibrierung verschlechtern, wenn sie nicht korrigiert werden würde. Das zum Ausgleich dieser Ungenauigkeiten gewählte Verfahren besteht darin, die Weglänge jedes Gefäßes zu messen, wenn es in der zur Anwendung geeigneten Form in den Fotometer eingesetzt wird. Auf diese Weise werden Schwankungen der Weglänge, die entweder auf der Ausrichtung des Gefäßes in dem Fotometer oder auf Schwankungen des Durchmessers beruhen, bei der Berechnung der Ergebnisse berücksichtigt.
Die optische Weglänge wird individuell für jedes Gefäßes auffolgende Weise ermittelt. Wie oben bereits erwähnt wurde, wird als Referenz-Lösung in der Referenz- Reagensküvette 78 eine Kupferchlorid Farbstoff-Lösung mit einer Spitze des Absorptionsgrades bei 730 nm verwendet. Die Absorption von Kupferchlorid ist bei einer Wellenlänge von 520 nm sehr gering. Nachdem die Küvette in den Fotometer eingesetzt worden ist, werden Absorptionsgrad-Messungen bei diesen zwei Wellenlängen (Schritt 108) durchgeführt. Die Differenz der Werte der Absorptionsgrad- Messungen bei den zwei Wellenlängen ist auf die Differenz der Absorptionsfähigkeiten gemäß dem Gesetz von Beer bezogen, das in obiger Gleichung (1) angegeben ist. Diese Werte werden zur Auflösung der Gleichung nach der Weglänge 1 wie folgt verwendet:
Hierbei ist 1 die optische Weglänge, A&sub5;&sub2;&sub0; der gemessene Absorptionsgrad bei 520 rim, A&sub7;&sub3;&sub0; der gemessene Absorptionsgrad bei 730 nm, CB die bekannte Konzentration des Farbstoffs B (Kupferchlorid) und &epsi;B2 und &epsi;B1 die Absorptionsfähigkeiten bei einer Wellenlänge von 730 nm beziehungsweise 520 nm.
Die berechnete optische Weglänge wird mit zwei kleineren Korrekturen beaufschlagt, um die Bestimmung genauer zu machen. Eine erste Korrektur wird im Hinblick auf den Nullwert-Offset durchgeführt. Das Gefäß an sich absorbiert bei den zwei Wellenlängen mit geringfügig unterschiedlichen Werten, so daß ein mit destilliertem Wasser gefülltes Gefäß eine Differenz der Absorptionsgrade zwischen 520 nm und 730 nm zeigt. Die Differenz der Absorptionsgerade liegt bei näherungsweise 0,01. Außerdem tritt bei dieser Messung auch eine geringfügige Instrumentenschwankungen auf.
Der Nullwert-Offset wird immer dann gemessen, wenn der Fotometer eingeschaltet wird. Die Anzeige (Display) 31 veranlaßt den Benutzer, das CAL A Kalibrierungsgefäß 83 (Figur 2) einzusetzen, das destilliertes Wasser ohne Farbstoffe enthält. Die Differenz der Absorptionsgerade (Nullwert-Offset) Aoff wird gemessen und für eine spätere Verwendung an diesem Tag gespeichert. Der Nullwert-Offset wird zur Korrektur der Absorptionsgerade verwendet, die für die Referenz-Reagensküvette in dem entsprechenden Lauf gemessen wurden, so daß eine korrigierte Weglänge gemäß folgender Formel ermittelt wird:
Es wird angenommen, daß die Referenz-Reagensküvette 78 den gleichen Nullwert- Offset (innerhalb von 0,001) aufweist, wie das CAL A Kalibrierungsgefäß 83.
Mit einer zweiten Korrektur wird der Tatsache Rechnung getragen, daß die effektive optische Wegelänge des Gefäßes nicht von der Meß-Wellenlänge unabhängig ist. Der Grund für diese Abhängigkeit besteht darin, daß das Gefäß rund ist und der in das Gefäße eintretende Lichtstrahl ziemlich breit ist (etwa 4 mm im Durchmesser) und an dem Glas-Luft-Übergang sowohl beim Eintritt, als auch beim Austritt aus dem Gefäß gebrochen wird. Die Stärke der Brechung ist von dem Brechungsindex des Glases bei der Meß-Wellenlänge abhängig. Die Abhängigkeit der optischen Weglänge von der Wellenlänge wird gemäß nachfolgender Beschreibung gemessen, um einen Korrekturfaktor Fλcorr zu ermitteln, der bei der Berechnung der Weglänge zu verwenden ist. Nachdem der Korrekturfaktor Fλcorr bestimmt worden ist, wird er auf alle Kalibrierungsberechnungen angewendet. Es ist nicht notwendig, für jedes Gefäß den Korrekturfaktor erneut zu messen, da der Wert für die Gefäße consistent ist und nur von der Dispersion der zur Herstellung des Gefäßes verwendeten Art des Glases abhängig ist. Die optische Weglänge bei 520 nm ist somit durch folgende Formel gegeben:
Der Korrekturfaktor Fλcorr wurde wie folgt ermittelt. Es wurde eine hochpräzise quadratische Glas-Küvette mit einer optischen Weglänge verwendet, die im Bereich von 0,1% gegenüber dem mechanisch gemessenen Wert bekannt war. In die quadratische Küvette sowie in ein rundes Standard-Gefäß (Eichmaß) wurde jeweils eine Lösung aus Farbstoff B Kupferchlorid mit einer Absorptionsspitze bei 730 nm eingebracht. Die Absorptionsgrade wurden bei 730 nm für die quadratische Küvette und das runde Gefäß gemessen. Anschließend wurde der Versuch mit Farbstoff A Ponceau S bei 520 nm wiederholt. Da die quadratische Küvette ebene Seiten aufweist, die senkrecht zu einem gut kollimierten Lichtstrahl liegen, wurde angenommen, daß kein Grund für unterschiedliche Weglängen zwischen 730 nm und 520 nm bei der quadratischen Küvette besteht. Der gewünschte Korrekturfaktor ergibt sich somit wie folgt: Arund Aquadratisch
Hierbei stellen Arund (520), Aquadratisch (520), Aquadratisch (730) und Arund (730) Absorptionsgrad-Messungen der quadratischen Küvette und des runden Gefäßes bei den angegebenen Wellenlängen dar. Die Ergebnisse aus insgesamt fünf solcher Messungen führen zu Fλcorr = 1,0082+/-0,0002. Es wurde sehr sorgfältig darauf geachtet, jede Bewegung der quadratischen Küvette oder des runden Gefäßes während der Versuche zu vermeiden, da hierdurch die Genauigkeit der Ergebnisse erheblich verschlechtert worden wäre.
Alle Lösungen wurden mit der Pipette eingegeben und entnommen, wobei das Gefäß und die Küvette stationär in dem Fotometer verblieben.
Die Inhalte der Referenz-Reagensküvette 78 werden vor der Messung des Absorptionsgrades in Schritt 108 gemischt, wobei jegliche Partikel, die vorhanden sein können, aufgerührt werden, so daß sie Bestandteil der Nullwert-Messung bei 520 nm sind. Auch wenn der Abfüllvorgang mit großer Sorgfalt ausgeführt wird, um jegliche Partikel in den Gefäßen zu vermeiden, sind doch immer einige Artikel vorhanden. Es ist wichtig, daß die Nullwert-Messung unter genau den gleichen Bedingungen wie die nachfolgenden Messungen durchgeführt wird. Das Ergebnis der Absorptionsgrad-Messungen ist A(0) und wird relativ zu der CAL A -Ablesung angegeben, die zuvor an dem gleichen Tag ermittelt wurde, als das Instrument eingeschaltet wurde. Dieser Wert ist aus drei Gründen nicht Null:
a) Das CAL A -Gefäß und das für die Absorptionsgrad-Messungen während einer Kalibrierung eines Volumens verwendete Gefäß haben jeweils Unregelmäßigkeiten in den Glaswänden. Die Nullwerte können sich bei zwei verschiedenen Gefäßen oder sogar bei dem gleichen Gefäß nach einer Drehung um 0,01 unterscheiden. Diese Differenz wird A&sub0; genannt.
b) Der Nullwert an dem Fotometer kann sich während der dazwischen liegenden Zeitperiode verschoben haben, da das CAL A -Gefäß abgelesen wurde. Die Drift des Instrumentes ist in A&sub0; enthalten.
c) Die Referenz-Lösung von Kupferchlorid hat einen geringen Absorptionsgrad bei 520 nm, der durch &epsi;B1CBl relativ zu dem Absorptionsgrad von destilliertem Wasser in dem CAL A -Gefäß gegeben ist.
Somit ergibt sich A&sub0; zu
(6) A&sub0; = A(0) - &epsi;B1CBl
Nachdem die Weglänge des Gefäßes gemäß obiger Beschreibung bestimmt worden ist, werden die Messungen des Pipettenvolumens vorgenommen. Gemäß Figur 6 wird eine zu kalibrierende Pipette mit einem Volumen P&sub1; verwendet, um ein Aliquot der Proben-Lösung, die den Farbstoff A Ponceau S mit der Konzentration CA und J0 der Absorptionsfähigkeit &epsi;Al bei 520 nm enthält, in Schritt 114 in die Referenz-Reagensküvette 78 in dem Fotometer eingegeben. Die Proben-Lösung und die Referenz-Lösung werden in dem Gefäß durch den Fotometer in Schritt 116 gemischt, um eine Mischung entstehen zu lassen. Die Ausrichtung des Gefäßes in dem Fotometer wird während dieses Vorgangs nicht verändert, so daß sich auch A&sub0; nicht ändert. Das Gefäß enthielt anfänglich ein Volumen VB der Referenz-Losung mit dem Farbstoff B Kupferchlorid mit einer Konzentration CB und einer Absorptionsfähigkeit &epsi;B1 bei 520 nm. Der Absorptionsgrad A(l) des die Mischung enthaltenden Gefäßes ergibt sich bei 520 nm durch folgende Formel:
In Schritt 118 wird mit dem Fotometer der Absorptionsgrad A(1) gemessen. In Schritt 122 werden alle Korrekturen (das heißt Temperatur usw.) durchgeführt und das Volumen der Pipette berechnet. Das Pipettenvolumen P&sub1; ist das in Gleichung (7) zu bestimmende Volumen. Eine Auflösung der Gleichung (6) und (7) nach P&sub1; ergibt folgenden Ausdruck:
Da alle Größen auf der rechten Seite der Gleichung (8) bekannt sind oder gemessen wurden, kann das Pipettenvolumen P&sub1; berechnet werden.
Nachdem das Pipettenvolumen P&sub1; berechnet worden ist, wird der Vorgang der Volumenmessung eine vorbestimmte Anzahl von Malen wiederholt. Dies dient dazu, die Wiederholbarkeit der Pipettenbetätigung zu verifizieren und auch eine genauere Bestimmung des Pipettenvolumens zu erreichen. Im allgemeinen werden 10 Volumenmessungen vorgenommen. Nachdem die erste Volumenberechnung in Schritt 122 abgeschlossen worden ist, wird in Schritt 124 die Anzahl von Proben-Ablesungen geprüft. Wenn weniger als zehn Proben-Ablesungen abgeschlossen sind, wird die zu kalibrierende Pipette zum Einbringen eines zweiten Aliquots P&sub2; der Proben-Lösung in die Referenz-Reagensküvette 78 in dem Fotometer verwendet. Es ist wichtig, daß die Referenz-Reagensküvette 78 nicht geleert oder aus dem Fotometer entfernt bzw. in diesem bewegt wird. Dadurch wird sichergestellt, daß sich die optische Weglänge nicht aufgrund einer Rotation oder einer anderen Bewegung der Küvette ändert. Die Küvette enthält nun eine Proben-Lösung mit einem Volumen von P&sub1; + P&sub2; Das Volumen P&sub2; der zweiten Proben-Losung wird gemäß folgender Formel berechnet:
Hierbei ist A(2) der gemessene Absorptionsgrad des Gefäßes nach Zugabe des Volumens P&sub1; + P&sub2; der Proben-Lösung. Da P&sub1; bereits bekannt ist kann P&sub2; berechnet werden. Der Vorgang wird so lange wiederholt, bis die gewünschte Anzahl von Pipettenvolumina gemessen worden ist. Die Grenze im Hinblick daraul, wie viele Pipettenvolumina der Referenz-Lösung zugesetzt werden können, wird entweder dadurch bestimmt, daß der Absorptionsgrad der Küvetteninhalte nicht den Wert A = 1,40 überschreiten sollte, da die Nichtlinearität andernfalls zu hoch wird, oder dadurch, daß die Inhalte der Küvette 9,75 ml nicht übersteigen sollten, da andernfalls durch den Mischvorgang eine ausreichende Homogenität nicht sichergestellt werden kann.
Nachdem alle Volumenmessungen vorgenommen worden sind, werden in Schritt 126 die Statistiken berechnet. Die Statistiken können mittlere Standard- Abweichungen und Koeffizienten der Variation umfassen. Anschließend werden die Ergebnisse einschließlich der Seriennummer der Pipette, des Nennvolumens, der einzelnen Volumen-Ablesungen und die Statistiken in Schritt 128 ausgedruckt. Der Benutzer entfernt dann die Küvette aus dem Fotometer und bereitet dadurch den Fotometer für den Beginn einer weiteren Sequenz zur Volumenkalibrierung vor.
Die in dem System zur Pipettenkalibrierung verwendeten Farbstoffe A und B weisen eine Abhängigkeit des Absorptionsgrades von der Temperatur auf Die Temperaturabhängigkeit wurde für beide Farbstoffe unter Verwendung eines mit einem temperaturgesteuerten Küvettenhalter ausgerüsteten Spektrofotometers Varian Cary Model 219 gemessen. Der Absorptionsgrad beider Farbstoffe wurde im Bereich zwischen 15ºC und 30ºC gemessen. Es wurde herausgefunden, daß die Temperaturabhängigkeit der Absorptionsfähigkeit linear ist und folgende Form aufweist:
(10) &epsi;(T)=&epsi;&sub1;&sub5;{1+K(T-15)}
Hierbei bezeichnet &epsi;(T) den Wert der Absorptionsfähigkeit bei der Temperatur T, &epsi;&sub1;&sub5; den Wert der Absorptionsfähigkeit bei 15ºC und K eine Konstante. Die für K bestimmten Werte waren KA = -0,05%/ºC und KB = +0,164%/ ºC. Die Temperatur der Farbstoffe bei ihrer Verwendung während einer Pipettenkalibrierung wird dadurch aufrechterhalten, daß sie bei der gleichen Umgebungstemperatur wie der Fotometer aufbewahrt werden. Mit dem Fotometer wird zu Beginn einer Volumenkalibrierung in Schritt 104 genau die umgebende Raumtemperatur und somit auch die Temperatur der Farbstoffe gemessen.
Alle Ursprungsdaten der bei Umgebungstemperatur T gemessenen Absorptionsgrade werden unter Verwendung folgender Gleichung korrigiert gemessen
auf 25ºC korrigiert. Die Konzentrationen der Farbstoffe werden so eingestellt, daß korrekte Werte der Pipettenkalibrierung (ohne Anwendung von Temperatur-Korrekturfaktoren) bei einer Umgebungstemperatur von 25ºC erzielt werden. Die Gefäße werden mit 4,8563% und 0,0025 Gramm einer Farbstoff B Lösung gefüllt, die bei 25ºC ein Volumen von 4750 Mikrolitern einnimmt.
Das Volumen des Farbstoffs B bei der Volumen-Kalibrierungszeit ist von seiner Temperatur gemäß folgender Gleichung abhängig:
(12) VB(T) = VB(25C)[1 + KV(T - 25)]
Hierbei ist VB(25ºC) = 4750 Mikroliter und KV = 2,32 x 10&supmin;&sup4; pro ºC. Somit kann VB(T) berechnet und bei der Berechnung des Pipettenvolumens verwendet werden. Der Wert von KV wird so gewählt, daß er gleich dem Volumen- Expansionskoeffizienten für Wasser gemäß dem "Handbook of Physics and Chemistry" ist.
Um das Volumen-Kalibrierungssystem im Hinblick auf den Einfluß der Temperatur zu korrigieren, müssen zwei Korrekturen vorgenommen werden: a) beide Farbstoffe müssen im Hinblick auf die Abhängigkeit ihrer Absorptionsfähigkeiten von der Temperatur korrigiert werden und b) das Volumen des Farbstoffs B muß im Hinblick auf seine Abhängigkeit von der Temperatur korrigiert werden. Experimentell hat sich gezeigt, daß das Volumen-Kalibrierungssystem unter Verwendung dieser Faktoren auf weniger als 0,5% der Gesamt-Genauigkeit in einem Temperaturbereich von zwischen 18ºC und 28ºC korrigiert wird.
Figur 7 zeigt ein Blockdiagramm einer bevorzugten Vorrichtung zur Resonanzfrequenzmischung, wie zum Beispiel die in der obengenannten US-PS 5.092.677 beschriebene, die durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Offenbarung gemacht werden soll.
Um die Inhalte der Küvette 27 durch eine Resonanzfrequenz zu mischen, während diese sich in dem Fotometer befindet, ist die gesamte optische Anordnung 23 (gemäß der Darstellung in Figur 3) auf einer Blattfeder 24 montiert und an einem Permanentmagneten 64 befestigt, der von einem aktivierten Elektromagnet 65 beaufschlagt wird, der wiederum über einen Trägerarm 71 an der Instrumenten-Basisplatte 25 befestigt ist. Durch die elektromagnetische Kopplung zwischen dem Elektromagneten und dem Permanentmagneten wird eine schwingende Bewegung der optischen Anordnung in Richtung des Pfeiles 73 bewirkt. Der Elektromagnet wird in der Weise aktiviert, daß er die optische Anordnung 23 mit ihrer Resonanzfrequenz beaufschlagt, um eine optimale Durchmischung der Inhalte der Küvette zu erreichen.
Wie oben beschrieben wurde, weist der Farbstoff B Kupferchlorid mit einer Absorptionsspitze bei 730 nm, und der Farbstoff A Ponceau S mit einer Absorptionsspitze bei 520 nm auf Es ist klar, daß auch andere Farbstoffkombinationen in der erfindungsgemäßen Weise verwendet werden können. Die Anforderungen im Hinblick auf die Auswahl des Farbstoffs A und des Farbstoffs B werden im allgemeinen durch die Sicherheit für den Benutzer und die Umgebung, die Stabilität, das Ausbleiben einer Reaktion zwischen Farbstoff A und Farbstoff B, die Absorptionsspitzen im sichtbaren Wellenlängenbereich sowie eine relativ geringe Überlappung der Absorptionsspektren bestimmt. Die Farbstoffe A und B können somit aus einer großen Vielzahl von organischen und anorganischen Farbstoffen oder Absorptionsmedien ausge wählt werden, unter der Voraussetzung, daß sich die Absorptionsspektren gegenseitig nur geringfügig gemäß der Darstellung in Figur 5 überlappen. Die Meßwellenlängen werden im allgemeinen so ausgewählt, daß Sie mit den Absorptionsspitzen des Farbstoffs A und des Farbstoffs B korrespondieren. Weiterhin muß der in den Figuren 1, 3 und 4 gezeigte und oben beschriebene Fotometer nicht notwendigerweise verwendet werden. Erfindungsgemäß kann auch jedes andere Instrument, mit dem genaue Absorptionsmessungen durchgeführt werden können, verwendet werden. Der zur Berechnung der optischen Weglängen und des Volumens verwendete Mikroprozessor kann, sofern gewünscht, auch getrennt von dem Fotometer ausgeführt sein.

Claims

1. Reagenssystem zur Anwendung bei der Bestimmung des Volumens eines Gefäßes mit:

a) einer Referenz-Lösung mit einem ersten pH-Puffer, einer ersten konservierenden Lösung, einem Anti-Agglomerationsmittel und einer absorbierenden Art mit einer ersten maximalen Absorptionsspitze, und

b) einer Proben-Lösung, die einen zweiten pH-Puffer, eine zweite konservierende Lösung und einen organischen Farbstoff aufweist, der eine zweite maximale Absorptionsspitze zeigt, die sich wesentlich von der ersten maximalen Absorptionsspitze unterscheidet.

2. System nach Anspruch 1, bei dem das erste und/oder zweite konservierende Mittel eine Mischung aus Methylparaben, Phenoxytol und EDTA, TSS aufweist.

3. System nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der erste und/oder zweite Puffer ein Phthalat-Puffer ist.

4. System nach Anspruch 3, bei dem der Phthalat-Puffer eine Konzentration in einem Bereich von näherungsweise 0,01 M bis 0,1 M und einen pH-Wert in einem Bereich von näherungsweise 4 bis 6,2 aufweist.

5. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die absorbierende Art ein Kupfersalz aufweist.

6. System nach Anspruch 5, bei dem die absorbierenden Art Kupferchlorid aufweist.

7. System nach Anspruch 5 oder 6, bei dem die Referenz-Lösung weiterhin ein chelatierendes Mittel für Kupferionen aufweist.

8. System nach Anspruch 7, bei dem das chelatierende Mittel für Kupferionen EDTA, TSS ist.

9. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der organische Farbstoff Ponceau S ist.

10. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Anti- Agglomerationsmittel aus einer Gruppe ausgewählt ist, die Ethylenglykole, Diethylenglykole, Triethylenglykole, Polyethylenoxide, Polyethylenglykole, Pyridine und Propylenglykole aufweist.

11. System nach Anspruch 10, bei dem das Anti-Agglomerationsmittel ein Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von zwischen etwa 200 und 10.000 aufweist.

12. Verfahren zur Bestimmung des Volumens eines Gefäßes unter Anwendung eines Fotometers, mit folgenden Schritten: Positionieren eines Behälters in einen Fotometer, wobei der Behälter eine bekannte Menge einer Referenz-Lösung mit einer maximalen Absorption bei einer ersten Wellenlänge enthält, Messen der Absorption des Behälters bei der ersten Wellenlänge und bei einer zweiten Wellenlänge, Berechnen der optischen Weglänge des Behälters bei der zweiten Wellenlänge aus den gemessenen Absorptionen bei den ersten und zweiten Wellenlängen, Einbringen eines Aliquots einer Proben-Lösung in den Behälter aus einem zu kalibrierenden Gefäß, wobei die Proben-Lösung eine maximale Absorption bei der zweiten Wellenlänge aufweist und Mischen der Proben-Lösung mit der Referenz-Lösung zur Bildung einer Mischung, Messen der Absorption der Mischung in dem Behälter bei der zweiten Wellenlänge und Berechnen des Volumens des Aliquots aus der Absorption der Mischung und der optischen Weglänge des Behälters auf der Basis des bekannten Volumens und der Konzentration der Referenz-Lösung und der bekannten Konzentration der Proben-Lösung, wobei das Volumen des Aliquots das Volumen des Gefäßes darstellt und wobei die Referenz-Lösung und die Proben-Lösung nach einem der vorhergehenden Ansprüche definiert sind.

13. Verfahren nach Anspruch 12, das ferner eine Minimierung der Anwendung anderer Zusätze zu der Lösung, die eine Agglomeration des organischen Farbstoffs verursachen, beinhaltet.