CN100422696C - 用铕原子标记法比对与校准移液器容量精确度的方法 - Google Patents

用铕原子标记法比对与校准移液器容量精确度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，包括如下工作步骤：1.标准移液器吸液：将标准移液器的滴头浸入铕标记溶液内，滴头完全吸满；2.标准移液器放液：将标准移液器移至聚乙烯板条内壁底部并排空其内的铕标记溶液；3.重复上述过程，利用标准移液器加样若干孔；4.平行试验：用待检移液器吸取同一铕标记溶液，重复上述1-3步骤，用待检移液器也加样相同数量孔；5.结果测定：将上述已加样的聚乙烯板条同时放到时间分辨检测仪上测荧光读数，通过测得荧光值(CPS值)来反映溶液内的荧光物质颗粒数量，对标准移液器和待检移液器进行容量比对与校准。本发明方法具有灵敏度高、重复性好、操作简便等优点。

Description

用铕原子标记法比对与校准移液器容量精确度的方法
技术领域
本发明涉及到一种对移液器容量的精确度进行比对与校准的方法，具体地说是一种采用铕原子标记法对移液器容量的精确度进行比对与校准的鉴定方法。
背景技术
移液器是采用空气排代原理的量出式加样器，广泛应用于医药卫生、环境检测、食品安全、精细化工等技术领域，是各科研所、实验室定量分析的常用工具。移液器容量的精确度，直接关系到实验结果的可靠性。目前，国内外移液器容量精确度的校准方法有两种：①重量分析法。《中华人民共和国国家计量检定规程》JJG 646-90规定，用蒸馏水称重法作为移液器容量精确度检定的标准方法，但该操作繁琐，实验受到气温、湿度、气压等影响，同时检测灵敏度较低，仅为0.1mg，实验误差较大，且3次称重结果很难判别误差引起的原因，此法适用于容量为20μl以上移液器的校准。②分光光度测定法。如重铬酸钾法、曙红法等，此方法应用“朗拜-比耳”比色原理，缺陷是对高浓度、低浓度溶液存在线性偏差，检测灵敏度为10-3-10-4g/L。另外，对容量小于20ul的微量移液器，国内外至今尚未提出或建立起有效的比对与校准方法，而小容量移液器正是分子生物学、基因工程、蛋白质工程实验的主要加样工具。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提出一种灵敏度高、重复性好、操作简便的用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法。
为解决上述技术问题，本发明用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法包括如下工作步骤：1、标准移液器吸液：将标准移液器的滴头浸入铕标记溶液内，滴头完全吸满；2、标准移液器放液：将标准移液器移至聚乙烯板条内壁底部并排空其内的铕标记溶液；3、重复上述过程，利用标准移液器加样若干孔；4、平行试验：用待检移液器吸取同一铕标记溶液，重复上述1-3步骤，用待检移液器也加样相同数量孔；5、结果测定：将上述已加样的聚乙烯板条同时放到时间分辨检测仪上测荧光读数，通过测得荧光值(CPS值)来反映溶液内的荧光物质颗粒数量，对标准移液器和待检移液器进行容量比对与校准。
上述用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，利用标准移液器和待检移液器各加样20孔。
上述用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，在吸液前，先将标准移液器和待检移液器及吸液嘴与铕标记溶液在室温平衡30分钟。
上述用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，在吸液前，先将铕原子溶液用增强液稀释，最终将浓度控制在CPS值为100000/100μl-200000/100μl之间，使溶液充分混均。
上述用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，在吸液前先进行预吸液，即选择洁净、合适的吸液嘴安置在标准移液器套筒上，压紧吸液嘴使之与套筒之间无空气间隙，预吸入铕标记溶液并排回原容器中，吸液、排液重复多次。
上述用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，吸液时，将标准移液器和待检移液器的滴头浸入铕标记溶液液面下2-3mm处，然后缓慢平稳地放松按钮，待1-2秒钟滴头完全吸满后，滴头离开液面，贴壁停留2-3秒，淌走多余的液体。
上述用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，放液时，将标准移液器和待检移液器移至已编号的聚乙烯板条内壁底部，保持垂直状态，轻轻压下按钮至第一停点位置，等待1-2秒钟，移动滴头贴内壁，完全揿下按钮，以排尽滴头内的铕标记溶液，然后将滴头沿内壁向上移开。
上述用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，所述时间分辨荧光仪的激发波长为336～337nm，测定波长为610～613nm。
上述用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，测定得到CPS值后计算出两移液器的CPS均值，利用公式变异系数CV＝标准偏差SD/CPS均值×100％和相对误差R＝[待检移液器CPS均值-标准移液器CPS均值]/标准移液器CPS均值×100％分别计算出CV值(表示移液器的精密度---反映随机误差)及相对误差R(表示待检移液器的准确度---反映系统误差)；对CV值超过标准规定误差范围的移液器弃用；如待检移液器的CV值符合规定但与标准移液器的CPS均值不相等时，调节移液器顶部旋钮，调整其容量大小；再次重复检测步骤1-5及上述计算调整步骤，直至待检移液器CPS均值与标准移液器的CPS均值相等，即R趋向于0为止。
本发明由于采用了上述方法，它通过测定标准移液器与待检移液器对同一铕标记溶液吸样的荧光值，计算出各自的相关数据。由于在同一铕标记浓度下，颗粒数的多少反映容量的大小，从而可对两移液器的容量进行比对，并计算出相对误差。测定结果的CV值应在《定量、可调移液器计量检定规程》JJG 646-90规定的允许误差范围之内。对CV值超过JJG 646-90规定误差范围的移液器应弃用；如CV符合规定，且待检移液器的CPS均值与标准移液器的CPS均值相等，则表示两者容量相同。如待检移液器的CV符合规定，但与标准移液器的CPS均值不相等时，表示两者容量不相同。这时，就需要对待检移液器的容量进行校准：用专用扳手调节移液器顶部旋钮，顺时针旋转，容量调大；逆时针旋转，容量调小，随后再进行20次标记溶液加样测定，直至待检移液器与标准移液器之间的CPS均值相等为止。它利用时间分辨荧光检测技术(time-resolvedfluoroimmunoassay，TR-FIA)所具有的高灵敏度与高稳定性特点，以镧系铕原子(Eu)作为示踪材料(原子序数63，原子半径2.56，原子体积28.9cm3/mol)，以β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)为荧光增强液，以336～337nm为激发波长，以610～613nm为测定波长，用时间分辨荧光仪检测鲁赫曼紫色荧光光谱，以《中华人民共和国国家计量检定规程》JJG 646-90为判断标准，建立起精确有效、简便快速的用铕原子标记技术对移液器容量精确度进行比对与校准的方法。它具有本底低(200～400cps)、灵敏度高(检测灵敏度达10-12～10-14g/L)、特异性强(激发光与发射光的STOKES位移大于200nm)、重复性好(CV＜1％)、示踪物稳定(铕半衰期长达上万年)、标准曲线线性范宽等检测优点。利用本发明方法，可以更好地执行关于医疗机构间医学检验、医学影像检查互认的有关规定，既是各实验室内部质量控制的具体要求，又为推进医疗机构间医学检验、检查结果“一单通”提供了技术保障。
附图说明
图1是本发明比对与校准方法的流程图。
具体实施方式：
下面以100μl待检移液器与100μl标准移液器的比对与校准方法为例进行具体说明。该方法包括如下工作步骤：
1、确定标准移液器：选用1支已经国家计量部门检定的100μl移液器作为本次实验的标准移液器。
2、容量设定：转动移液器顶部调节旋钮，将标准移液器及待检移液器的容量调节到100μl刻度。
3、将铕原子溶液用增强液(β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA))稀释，最终将浓度控制在CPS值为100000/100μl-200000/100μl之间，溶液充分混均。这样，CPS值的线性比较好，也可减少由于自然界中放射本底产生的误差。
4、温度平衡：先将标准移液器、待检移液器和吸液嘴与铕标记溶液在室温平衡30分钟。这样，可使吸液嘴的热胀冷缩度一致，同时溶液中溶质和溶剂能充分混合均匀，保证一致性。
5、预吸液：选择洁净、合适的吸液嘴安置在标准移液器套筒上，稍加扭转压紧吸液嘴使之与套筒之间无空气间隙。垂直握持移液器，预吸入铕标记溶液并排回原容器中，吸液、排液共重复5次，整个操作动作柔和，避免按钮急速弹回。由于水第一次接触到塑料吸液嘴时会有吸附性，通过5次预吸后就能使吸液嘴保持湿润度，即保证以后吸液和放液的吸附性保持一致。
6、吸液：垂直握持标准移液器，把按钮压至第一停点，滴头浸入铕标记溶液液面下2-3mm处，然后缓慢平稳地放松按钮，等1-2秒钟滴头完全吸满后，滴头离开液面，贴壁停留2-3秒，淌走多余的液体。
7、放液：将移液器移至已编号聚乙烯板条内壁底部，保持垂直状态，轻轻压下按钮至第一停点位置，等待1-2秒钟，移动滴头贴内壁，完全揿下按钮，以排尽滴头内的铕标记溶液，然后将滴头沿内壁向上移开，用标准移液器共加样20孔。
8、平行试验：用待检移液器吸取同一铕标记溶液，重复上述5-8步骤，用待检移液器也加样20孔。
9、结果测定：将上述已加样40孔的聚乙烯板条同时放到时间分辨检测仪上测荧光读数，通过测得CPS值来反映容液内的荧光物质颗粒数量。在同一浓度下，CPS的数值反映出了容量的大小，从而可对两移液器的容量进行相互比较。
10、计算方法：通过上述标准移液器与待检移液器各20次加样，应用时间分辨荧光法实测值，计算出两移液器的CPS均值、变异系数CV及相对误差R。计算公式为：变异系数CV＝标准偏差SD/CPS均值×100％；相对误差R＝[待检移液器CPS均值-标准移液器CPS均值]/标准移液器CPS均值×100％。
11、容量比对：待检移液器的CV值应在《定量、可调移液器计量检定规程》JJG 646-90规定的范围之内。对CV值超过JJG 646-90规定误差范围的移液器应弃用；如待检移液器的CV符合规定，且两者的CPS均值相等，则表示两者容量完全相同。
12、容量校准：当待检移液器CV符合规定，但与标准移液器的CPS均值不相等时，表示两者容量不相等。这时，就需要对待检移液器的容量进行校准：用专用扳手调节移液器顶部旋钮，顺时针旋转，容量调大；逆时针旋转，容量调小。随后再次重复5-12步骤，直至待检移液器CPS均值(XR)与标准移液器的CPS均值(XS)相等，即R趋向于0为止。
本发明方法中，移液器的加样孔数可以不是20次，如10次、25次等等，加样20孔以上的准确性会更高一些。

Claims (9)

1. 用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，其特征在于，它包括如下工作步骤：1、标准移液器吸液：将标准移液器的滴头浸入铕标记溶液内，滴头完全吸满；2、标准移液器放液：将标准移液器移至聚乙烯板条内壁底部并排空其内的铕标记溶液；3、重复上述过程，利用标准移液器加样若干孔；4、平行试验：用待检移液器吸取同一铕标记溶液，重复上述1-3步骤，用待检移液器也加样相同数量孔；5、结果测定：将上述已加样的聚乙烯板条同时放到时间分辨检测仪上测荧光读数，通过测得荧光值CPS值来反映溶液内的荧光物质颗粒数量，对标准移液器和待检移液器进行容量比对与校准。
2. 如权利要求1所述的用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，其特征在于，利用标准移液器和待检移液器各加样20孔。
3. 如权利要求1或2所述的用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，其特征在于，在吸液前，先将标准移液器和待检移液器及吸液嘴与铕标记溶液在室温平衡30分钟。
4. 如权利要求1或2所述的用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，其特征在于，在吸液前，先将铕原子溶液用增强液稀释，最终将浓度控制在CPS值为100000/100μl-200000/100μl之间，使溶液充分混均。
5. 如权利要求1或2所述的用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，其特征在于，在吸液前先进行预吸液，即选择洁净、合适的吸液嘴安置在标准移液器套筒上，压紧吸液嘴使之与套筒之间无空气间隙，预吸入铕标记溶液并排回原容器中，吸液、排液重复5次。
6. 如权利要求1或2所述的用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，其特征在于，吸液时，将标准移液器和待检移液器的滴头浸入铕标记溶液液面下2-3mm处，然后缓慢平稳地放松按钮，待1-2秒钟滴头完全吸满后，滴头离开液面，贴壁停留2-3秒，淌走多余的液体。
7. 如权利要求1或2所述的用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，其特征在于，放液时，将标准移液器和待检移液器移至已编号的聚乙烯板条内壁底部，保持垂直状态，轻轻压下按钮至第一停点位置，等待1-2秒钟，移动滴头贴内壁，完全揿下按钮，以排尽滴头内的铕标记溶液，然后将滴头沿内壁向上移开。
8. 如权利要求1或2所述的用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，其特征在于，所述时间分辨荧光仪的激发波长为336～337nm，测定波长为610～613nm。
9. 如权利要求1或2所述的用铕原子标记法对移液器容量精确度进行比对与校准的方法，其特征在于，测定得到CPS值后计算出两移液器的CPS均值，利用公式变异系数CV＝标准偏差SD/CPS均值×100％和相对误差R＝[待检移液器CPS均值-标准移液器CPS均值]/标准移液器CPS均值×100％分别计算出CV值及相对误差R；对CV值超过标准规定误差范围的移液器弃用；如待检移液器的CV值符合规定但与标准移液器的CPS均值不相等时，调节移液器顶部旋钮，调整其容量大小；再次重复检测步骤1-5及上述计算调整步骤，直至待检移液器CPS均值与标准移液器的CPS均值相等，即R趋向于0为止。
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