DE69330402T2

DE69330402T2 - In vitro herstellung eines kornea aequivalenten modells

Info

Publication number: DE69330402T2
Application number: DE69330402T
Authority: DE
Inventors: S. Mason; R. Olsen; L. Parenteau
Original assignee: Harvard College; Organogenesis Inc
Current assignee: Harvard College; Organogenesis Inc
Priority date: 1992-11-13
Filing date: 1993-11-15
Publication date: 2002-05-29
Anticipated expiration: 2013-11-16
Also published as: GR3036778T3; OA10089A; PT621766E; CN1091320A; ES2160116T3; EP0621766A4; EP0621766A1; DK0621766T3; CA2127120A1; CN1080130C; JPH08500041A; ATE202688T1; WO1994010940A1; EP0621766B1; US5374515A; DE69330402D1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung gehört zu dem Gebiet von Gewebekultursystemen und betrifft ein Organäquivalent der Kornea des Auges: ein Kornea äquivalentes Modell. Das Gewebekulturverfahren zur Bildung des Kornea äquivalenten Modells ergibt ein Konstrukt, das der Kornea des Auges in vivo analog ist. Das Korneaäquivalent ist ein in vitro Modell des Auges, das zur in vivo Transplantation oder Implantation oder in vitro Durchmusterung von Verbindungen verwendet werden kann.

Hintergrund der Erfindung

Gewebekulturtechniken werden erfolgreich in der Entwicklung von Gewebe- und Organäquivalenten verwendet. Die Basis für diese Techniken umfaßt Kollagenmatrixstrukturen, die durch die richtige Kombination von lebenden Zellen, Nährmedien und Kultivierungsbedingungen zu funktionellem Gewebe und Organen umgeformt werden können. Gewebeäquivalente wurden in vielen Patenten ausführlich beschrieben, einschließlich U.S. Patent Nr. 4,485,096; 4,485,097; 4,539,716; 4,546,500; 4,604,346; und 4,837,379.
Eine erfolgreiche Anwendung des Gewebeäquivalents ist das Äquivalent lebender Haut, dessen Morphologie ähnlich der tatsächlichen Haut des Menschen ist. Das Äquivalent lebender Haut besteht aus zwei Schichten: der obere Teil besteht aus differenzierten und mehrschichtigen Human-Epidermalkeratozyten, die eine dickere, untere Schicht aus Human- Dermalfibroblasten in einer Kollagenmatrix bedecken. Bell, et al., "Recipes for Reconstituting Skin", J. of Biochemical Engineering, 113: 113-119 (1991).
Es wurden Studien zur Kultivierung von Epithel- und Endothelzellen der Kornea durchgeführt. Xie, et al., "A simplified technique for the short-term tissue culture of rabbit corneal cells", In Vitro Cellular & Developmental Biology, 25: 20-22 (1989), und Simmons, et al., "Corneal Epithelial Wound Closure in Tissue Culture: An in vitro Model of Ocular Irritancy", Toxicology and Applied Pharmacology, 88: 13-23 (1987). Die Entwicklung eines in vitro Organäquivalents der Kornea des Auges ist von besonderem Interesse zur Verwendung in in vitro Toxizitätstests, wo es als exaktes und kostengünstiges, nicht-tierisches Vorhersagemodell des in vivo Augen- und Hautreizungspotentials für viele Arten von Produkten und Rohmaterialien dient.
Insler et al. (Current Eye Research, 5(12), 967-972 (1986)) beschreiben ein Verfahren, in dem das Endothel von einer Augenbank-Kornea entfernt wird, wonach die Kornea mit einer Suspension aus kultivierten neonatalen Endothelzellen in Kultur beimpft wird.
US 4,760,020 betrifft ein in vitro Verfahren zur Testung von Substanzen zur Bioverträglichkeit. Das Verfahren umfaßt die Behandlung von Zellen, zum Beispiel kornealen Endothelzellen, so daß ein wiederholbares Aufbrechen der Zellen gegeben ist, das In-Kontakt-Bringen der Zellen mit der Testsubstanz, und das Inkubieren der Zellen unter Bedingungen, von welchen bekannt ist, daß sie den Verschluß der Bruchstelle fördern. Das Ausmaß des Verschlusses in der Zellkultur, die mit der Testsubstanz behandelt wurde, wird mit jenem einer unbehandelten Kontrolle verglichen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft ein Organäquivalent der Kornea des Auges. Die Bildung des Korneaäquivalents gemäß dieser Erfindung beinhaltet die Erzeugung der drei verschiedenen Zellschichten in der Kornea durch Gewebekultur: der äußeren Schicht, eines mehrschichtigen, squamösen Epithels; der mittleren Schicht, Kollagenfasern; und der inneren Schicht, eines einfachen squamösen Epithels, das auch als Korneaendothel bezeichnet wird. Das Verfahren zur Bildung des Korneaäquivalents ergibt eine Struktur, die der in vivo Kornea des Auges analog ist.
Diese Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung, daß das Einfügen einer Endothelschicht notwendig ist, nicht nur wegen der Transparenz der Kornea in vivo, sondern auch wegen einer besseren Morphologie, Expression biochemischer und physiologischer Marker, Zellausbreitung, epithelen Anheftung an die Matrix, und Gleichförmigkeit der Epithelbedeckung in vivo. Das Endothel fördert die Basalmembranentwicklung in dem Korneaäquivalent. Die Ergebnisse auf den Einfluß des Endothels zum Erreichen eines höheren Maßes an in vitro Epitheldifferenzierung waren unerwartet.
Aufgrund dieser Entdeckung zeigte sich, daß die Verwendung des Endothels in anderen Gewebe- und Organäquivalenten auch die Basalmembranentwicklung fördert. Somit betrifft diese Erfindung auch die Verwendung von Endothelzellen in jenen Gewebe- und Organäquivalentkonstrukten, die Kollagen oder Epithelzellen verwenden.

BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt Photomikrographien A und B von Korneaäquivalenten, die mit und ohne Endothelzellschicht gebildet sind. Die Photomikrographie A des dreizelligen Korneakonstrukts wurde nach 14 Tagen bei feuchter Grenzfläche aufgenommen. Das normale Kaninchenepithel (EP) besteht aus etwa sieben Zellschichten. Aufgrund des Vorhandenseins der mehrschichtigen transformierten Maus-Endothelschicht (EN), sind die normalen Stromafibroblasten (FIB) des Kaninchens nicht hyperproliferativ. Dies ermöglicht das epitheliale Anheften und schließt die Entwicklung einer fibroblastischen Haut aus. Ohne Endothelschicht (B) haftet das Epithel schlecht und ist in seiner Dicke und Organisation unterschiedlich, wie durch die drei Pfeile gezeigt wird; Vergrößerung = 160X.
Fig. 2 zeigt Photomikrographien A, B und C von Korneaäquivalenten, nachdem sie versenkt kultiviert wurden, bei einer feuchten Grenzfläche und einer trockenen Grenzfläche. Die Photomikrographien zeigen das histologische Erscheinungsbild von Korneaäquivalenten, die unter verschiedenen Umgebungsbedingungen kultiviert wurden. Plastische Schnitte, die mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt wurden, zeigen die verschiedenen Morphologien, die unter Verwendung verschiedener Kulturumgebungen erhalten wurden. Wenn die Epithelzellen auf dem Gitter 14 Tage in einer versenkten Kultur (A) gezüchtet werden, ist das Ergebnis ein minimal organisiertes, verdicktes Epithel. Dieses Epithel weist auch aufgrund der ungleichmäßigen Ausbreitung der Epithelzellen unterschiedliche Dicken auf. Wenn die Kultur auf eine feuchte Grenzfläche gehoben wird, wird das Epithel organisierter (B). Wenn es auf eine trockene Grenzfläche gehoben wird, entwickeln sich Stratum corneum-artige Schichten (C) wie durch viele Schichten verhornter Zellen bewiesen wird.
OBEN: versenkt, 200X
UNTEN LINKS: Airlift, feuchte Grenzfläche, 400X
UNTEN RECHTS: Airlift, trocken, 200X
Fig. 3 zeigt immunofluoreszierende Photomikrographien A-D der Verteilung von Enolase unter verschiedenen Umgebungsbedingungen. Die Photomikrographien zeigen 14 Tage alte Korneakonstrukte, die eine Änderung in der Enolasefärbung aufweisen. Enolase ist ein Marker für die proliferative Zellpopulation im Korneaepithel. Sie ist für gewöhnlich in Basalzellen der limbalen Region vorhanden (Zieske, 1992). Das gesamte Epithel färbt, positiv für Enolase, wenn die Kultur versenkt wird (A), was auf einen hyperproliferativen Zustand und ein Fehlen von Spezialisierung oder Differenzierung hinweist. Wenn die Kultur entweder auf eine feuchte (B, C) oder trockene Grenzfläche (D) gehoben wird, wird die Färbung in den suprabasalen Schichten verringert, annähernd dahingehend, wie bei einer in vivo Beobachtung.
OBEN LINKS: versenkt, 200X
OBEN RECHTS: Airlift, feucht, 200X
UNTEN LINKS: Airlift, feucht, 400X
UNTEN RECHTS: Airlift, trocken, 200X
Fig. 4 sind immunofluoreszierende Photomikrographien A-D, welche die Verteilung von Keratin 3 unter verschiedenen Umgebungsbedingungen zeigen. Keratin 3 ist ein Marker, der für korneale Epithelzellen spezifisch ist, und für gewöhnlich in allen suprabasalen Zellschichten des Perikornealrings und den Zellen der zentralen Kornea vorhanden ist (Shermer et al., 1986). Die 14 Tage alten Korneaäquivalente, die versenkt kultiviert wurden, weisen geringe Mengen an Keratin 3-Markierung auf (markiert unter Verwendung von AE5 Antikörper in einigen wenigen der meisten oberflächlichen Zellen (A)). Wenn die Kulturen entweder auf eine feuchte oder trockene Grenzfläche angehoben werden (B, C, D), ist die Färbung stark und nun in allen suprabasalen Schichten vorhanden, wie bei einem normalen Perikornealring in vivo.
OBEN LINKS: versenkt, 200X
OBEN RECHTS: Airlift, feucht, 200X
UNTEN LINKS: Airlift, trocken, 200X
UNTEN RECHTS: Airlift, trocken, Phase von links, 200X
Fig. 5 sind immunofluoreszierende Photomikrographien A-D, welche den Unterschied in der Enolase-, Keratin 3- und Vinculinverteilung mit und ohne Endothelzellschicht zeigen. Korneaäquivalente, welche die Endothelschicht enthalten, nachdem sie 14 Tage bei einer feuchten Grenzfläche waren, weisen eine richtige Verteilung von Alpha-Enolase (A) (Zieske et al., 1992) und Keratin 3-Färbung auf (markiert mit Antikörper AES, (Shermer et al., 1986) (D)). Die Überproduktion von Vinculin in einer Probe, die ohne Endothelschicht bei der feuchten Grenzfläche war (B) ist auf eine punktierte Färbung in einer Probe verringert, die eine Endothelschicht hat (C). Vergößerung = 200X
OBEN: Feuchter Airlift plus Endothelschicht; Alpha-Enolase
MITTE LINKS: Feuchter Airlift: Vinculin
MITTE RECHTS: Feuchter Airlift plus Endothelschicht; Vinculin
UNTEN: Feuchter Airlift plus Endothelschicht; AES
Fig. 6 zeigt immunofluoreszierende Photomikrographien A-F von Korneaäquivalenten, welche die Verteilung von Laminin und Typ VII in Korneaäquivalenten mit und ohne Endothelzellschicht zeigen. Korneakonstrukte nach 14 Tagen bei einer feuchten Grenzfläche ohne Endothelschicht weisen eine geringe Menge an Laminin (A) und Typ VII Kollagen (B) auf. Wenn die Endothelschicht in das Konstrukt eingefügt wird (C, D, E, F), sind Laminin (C) und Typ VII Kollagen (D, E, F) in einer ungebrochenen Linie an der Stroma-Epithel- Verbindung vorhanden.
OBEN LINKS: Feuchter Airlift, Laminin, 400X
OBEN RECHTS: Feuchter Airlift, Typ VII, 400X
MITTE LINKS: Feuchter Airlift plus Endo, Laminin, 100X
MITTE RECHTS: Feuchter Airlift plus Endo, Type VII, 100X
UNTEN LINKS: Feuchter Airlift plus Endo, Type VII, 200X
UNTEN RECHTS: Feuchter Airlift plus Endo, Type VII, 400X
Fig. 7-10 sind Transmissionselektronenmikroskopien von Korneakonstrukten. Für die Transmissionselektronenmikroskopie wurden Korneaäquivalente, die eine Endothel-, Stroma- und Epithelzellschicht enthielten, 1 Woche nach MA/L 4 Stunden in einer Lösung aus 2,0% Paraformaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd, 1% Acrolein und 1% Lanthanumnitrat in 0,1 M Natriumkakodylat, pH 7,4, fixiert. Proben wurden in 1% OsO&sub4; (in 0,1 M Natriumkakodylat) nachfixiert und en bloc mit 2% Uranylacetat (wäßrig) gefärbt. Proben wurden in Ethanol entwässert und in Epoxidharz eingebettet.
Fig. 7 ist eine Transmissionselektronenmikrographie, die keinen Hinweis auf eine abnormale squamöse Differenzierung nach der Kultur bei feuchter Grenzfläche zeigt. Das Epithelkonstrukt hatte eine säulenförmige Basalschicht und mehrschichtige Suprabasalzellen ohne morphologischen Hinweis auf eine Differenzierung. Bar = 2 um.
Fig. 8 ist eine Transmissionselektronenmikrographie, welche die Bildung von Basalschichten in dreischichtigen Korneaäquivalenten zeigt. Eine Basalschicht wurde bei der Stroma-Epithel-Verbindung mit zahlreichen Halbdesmosomen (Sternchen), einer gut definierten Lamina densa (große Pfeilspitzen); Bindungsfilamenten (kleine Pfeilspitzen), und zugehörigen Bindungsplaques (Pfeile) beobachtet. Das Stroma direkt unterhalb der Basalschicht (SM) bestand aus einer Mischung aus Kollagenfibrillen (weißer Pfeil) und kurzen feinen Fibrillen (weiße Pfeilspitzen), die für die Bowman-Membran charakteristisch sind. Bar = 0,1 um.
Fig. 9 ist eine Transmissionselektronenmikrographie, die wurmförmige Stege auf der Epitheloberfläche zeigt. Die Apikalzellen der Kultur exprimierten wurmförmige Stege entlang der Vorderfläche (Pfeilspitzen). Bar = 1 um.
Fig. 10 ist eine Transmissionselektronenmikroskopie von Lanthanum-behandelten dreischichtigen Korneaäquivalenten, welche die Gegenwart von Verschlußkontakten zeigt. Verschlußkontakte wurden zwischen Zellen in den Apikalschichten des Epithels (Pfeilspitzen) beobachtet. Bar = 0,1 um.
Fig. 11 ist eine Photomikrographie eines Korneaäquivalents, das in Gegenwart einer Endothelzell-Monoschicht, nicht in direktem Kontakt mit dem Äquivalent, kultiviert wurde. Ein sieben Tage altes Korneakonstrukt, bei dem Endothelzellen als Versorgungsschicht am Boden der Vertiefung ausgestrichen sind, und nicht in das Gitter eingefügt sind. Die Fibroblasten wandern und vermehren sich unter dem Epithel und schieben (Pfeile) das Epithel von dem Gitter. Vergrößerung = 320X.
Fig. 12 ist eine Photomikrographie eines Korneaäquivalents, das mit einer Endothelzellschicht gebildet ist, die durch die Behandlung mit Mitomycin C verringert ist. Ein 14 Tage altes Korneakonstrukt, das Endothelzellen enthielt, wurde mit Mitomycin C verdünnt. Die Endothelzellen (Pfeil) beendeten die Teilung, waren aber nicht imstande, Chemotaxis und Hyperproliferation der Fibroblasten zu verhindern. Die Fibroblasten (Pfeilspitze) schieben das desorganisierte Epithel vom Gitter. Vergrößerung = 320X.
Fig. 13 ist ein Diagramm eines Auges (A), das in einer meridionalen Ebene geschnitten ist, die horizontal durch den Äquator des Auges geht und das Auge in eine obere und eine untere Hälfte teilt. Das Diagramm (B) ist ein Schnitt durch die Kornea des Menschen und zeigt die fünf Schichten. (Diagramm aus Functional Histology, Borysenko et al., Little Brown, Herausgeber, Seiten 216-217, 1979).

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die äußerste Schicht des Auges ist die äußere Augenhaut (Tunica fibrosa), die aus dichtem, avaskulärem Bindegewebe besteht. Die Fibrosa tunica hat zwei verschiedene Bereiche: die Sklera und die Kornea. Die Sklera, das "Weiße" des Auges, bildet den hinteren Abschnitt der Tunica fibrosa. Das vordere Sechstel der Tunica fibrosa ist zur Bildung der transparenten Kornea modifiziert (Fig. 13A).
Die Kornea ist an beiden Flächen von einer Epithelschicht bedeckt. Die äußere Schicht, ein mehrschichtiges squamöses Epithel, geht an der Sklera-Kornea-Verbindungsstelle in die Bindehaut des Augapfels (Tunica conjunctiva bulbaris) über. Ein einfaches squamöses Epithel, das auch als Korneaendothel bezeichnet wird, kleidet die Innenfläche der Kornea aus. Die mittlere Schicht der Kornea ist klar, das Ergebnis der regelmäßigen Anordnung ihrer Kollagenfasern. Es sind zwei Membrane vorhanden, welche das Stroma von der Epithelschicht und der Endothelschicht trennen: die Bowman-Membran und die Descemet- Membran (Fig. 13B).

1. Konstruktion eines in vitro Korneamodells

Die Konstruktion des Korneaäquivalents gemäß dieser Erfindung beinhaltet die Gewebekultivierung und Erzeugung der drei verschiedenen Zellschichten in der Kornea: der äußeren Schicht, eines mehrschichtigen, squamösen Epithels; der mittleren Schicht, Kollagenfasern; und der inneren Schicht, eines einfachen squamösen Epithels, das auch als Korneaendothel bezeichnet wird. Das Verfahren zur Konstruktion des Korneaäquivalents ergibt eine Struktur, die der in vivo Kornea des Auges analog ist.
Die folgende Beschreibung des bevorzugten Ausführungsbeispiels des Korneaäquivalents soll als Beispiel und nicht als Einschränkung dienen. Modifizierungen können bei den Zellen und den Kultivierungsparametern vorgenommen werden und weiterhin im Umfang der Erfindung liegen.
Im ersten Schritt zur Konstruktion des in vitro Korneamodells werden die Endothelzellen auf Membrane eines Zellkultureinschubs geimpft.
Die Wände des Zellkultureinschubs können aus Polystyrol, Polycarbonat, Harz, Polypropylen (oder einem anderen bioverträglichen Kunststoff) bestehen, mit einer porösen Membranbasis aus Polycarbonat oder einer anderen kulturverträglichen porösen Membran, wie Membrane aus Kollagen, Zellulose, Glasfaser oder Nylon, die an den Boden geheftet ist, auf welcher die Zellen kultiviert werden können. Die Porosität der Membran kann von 0,2 um bis 10 um reichen, wobei 3 um bevorzugt sind. Der Einschub hängt oder steht in der Kulturschale, so daß Kulturmedium zu der Unterseite der Kultur gelangen kann. Eine azelluläre Kollagenschicht wird auf die Zellkulturmembran gegossen und bei Raumtemperatur zum Gelieren gebracht. Die Menge an ausgegossener azellulärer Schicht hängt von der verwendeten Zellkulturmembran ab, beträgt aber für gewöhnlich 1 ml bis etwa 5 ml.
In der bevorzugten Methode wird ein K-Harzkultureinschub mit einer 3 um porösen Polycarbonatmembranbasis mit eine Fläche von etwa 2 cm² verwendet. Eine 1 ml azelluläre Schicht wird auf die Polycarbonatmembran gegossen und gelieren gelassen. Die azelluläre Kollagenschicht umfaßt 686 ug säureextrahiertes Rindersehnenkollagen in 0,05% Essigsäure, 8,1% 10X Eagle-Minimalmedium, 4 mM 1-Glutamin, 50 ug/ml Gentamicin, 1,8 mg/ml Natriumbicarbonat und 10% Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), 10% Serum von neugeborenen Kälbern ("newborn calf serum" - NBCS). Sobald dies geliert ist, werden 3 · 10&sup4; Endothelzellen (6,7 · 10³/cm²) auf das Gel geimpft. Die Endothelschicht wird dann 4 Tage bei 37ºC, 10% CO&sub2; in DMEM versenkt, das 10% NBCS, 4 mM 1- Glutamin und 50 ug/ml Gentamicin enthält. Als Alternative kann die azelluläre Kollagenschicht weggelassen werden und die Endothelzellen können direkt auf die poröse Membran geimpft werden. Die Verwendung einer azellulären Schicht ist bevorzugt, wenn transformierte Endothelzellen verwendet werden, um ein Überwuchern der nicht am Kontakt gehinderten Zellen an der Unterseite der Membran zu verhindern. Als Alternative, kann die azelluläre Schicht aus Typ IV Kollagen, Laminin oder einem Hydrogel hergestellt werden.
Die Endothelzellen, die zur Bildung der Endothelschicht verwendet werden, können von einer Reihe von Quellen abgeleitet werden. Es wurden korneale Endothelzellen verwendet, die vom Schaf, Kaninchen oder der Maus abgeleitet wurden. Die Maus-Endothelzellen wurden mit dem großen T-Antigen von SV40 (Muragaki, et al., 1992) transformiert. Die bevorzugten Zelltypen sind die transformierte korneale Maus-Endothelzellinie, oder die normalen kornealen Endothelzellen, die vom Schaf oder Kaninchen abgeleitet werden. Besonders bevorzugt sind die normalen kornealen Kaninchen-Endothelzellen. Die normalen Endothelzellen werden von enzymatisch gespaltenem Korneaendothel oder von Korneaexplantaten abgeleitet und seriell in MSBM Medium kultiviert (Johnson et al., 1992), das durch die Zugabe von 50 ug/ml Heparin und 0,4 ug/ml Heparinbindungswachstumsfaktor-1 (MSBME) modifiziert wurde. Transformierte Endothelzellen werden in DMEM-10% NBCS kultiviert.
Endothelzellen nichtkornealen Ursprungs können ebenfalls in dieser Erfindung verwendet werden. Die Endothelzellen nichtkornealen Ursprungs, die in dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen vaskuläre und Human-Nabelvenen-Endothelzellen.
Die Endothelzellen können mit einem rekombinanten Retrovirus transformiert sein, welches das große T-Antigen von SV40 enthält (Muragaki et al., 1992). Transformierte Zellen wachsen in dem Korneaäquivalent weiter und bilden aufgrund ihres Mangels an Kontakthemmung Hügel an der Oberseite der azellulären Schicht. Nichttransformierte Zellen bilden eine Monoschicht, die unter der Stromazell-Kollagenschicht liegt. Als Alternative können normale Endothelzellen wie zuvor transfektiert werden, aber mit der Zugabe eines wärmeempfindlichen Gens. Dadurch können die Zellen unter verringerter Temperatur in kontinuierlicher Kultur wachsen. Nach der Bildung einer konfluenten Endothelzellschicht, kann die Temperatur erhöht werden, um das transformierende Gen zu deaktivieren, so daß die Zellen ihre normale Regulierung wieder aufnehmen können, und eine Kontakthemmung aufweisen, um eine Endothelzellenmonoschicht ähnlich den nicht-transformierten Zellen zu bilden. Die meisten Peptide sind wärmeempfindlich (mit Ausnahme der Hitzeschockproteine), so daß eine große Auswahl an Peptiden zur Verfügung steht, die durch Erhöhen der Kultivierungstemperatur deaktiviert werden können. Eine derartige Transformation erleichtert auch die Verwendung von schwer erhältlichen und zu kultivierenden Zelltypen, wie der kornealen Human- Endothelzellen.
Im zweiten Schritt wird Kollagen mit kornealen Keratozyten (Stromafibroblastzellen) gemischt, um eine Zellen-Kollagen-Mischung zu erhalten. Die Zellen-Kollagen-Mischung enthält etwa 100 Stromafibroblastzellen pro ug säureextrahiertem Rindersehnenkollagen. Die Fibroblasten kontrahieren das Gel und bilden eine erhabene Fläche (Mesa) von etwa 2,5 cm².
Kollagen, das zur Verwendung geeignet ist, ist säureextrahiertes Rindersehnenkollagen, enzymextrahiertes Rindersehnenkollagen oder Rattenschwanzkollagen. Als Alternative kann das Kollagen auch aus einer Mischung von Kollagen vom Typ I und Typ III bestehen, das im allgemeinen von der Dermis extrahiert wird, oder aus einer Mischung vom Typ I, V und VI, das von dem kornealen Stroma extrahiert wird. Vorzugsweise wird gereinigtes, säureextrahiertes Kollagen vom Typ I, das von Rindersehnen extrahiert ist, als Anfangsgel verwendet. In dem organotypischen Konstrukt synthetisieren die Stromafibroblasten zusätzliche Kollagentypen, wie V und VI, wie auch zusätzliches Kollagen vom Typ I, da sie die Kollagenmatrix während der Kultivierung modifizieren. Die Epithelzellen liefern Kollagen vom Typ IV und VII am Epithel-Stroma-Verschlußkontakt, und die Endothelzellen liefern Kollagen vom Typ XII (Muragaki, et al., 1992) am Endothel-Stroma- Verschlußkontakt.
Alle Säugetier-Stromafibroblasten können in dieser Zellschicht verwendet werden. Es können alle Bindegewebe-Fibroblasten, wie jene, die von der Sklera, der Dermis, der Sehne, oder Faszie abgeleitet sind, verwendet werden. Wenn Korneazellen verwendet werden, sind Fibroblasten bevorzugt, die von dem kornealen Kaninchen- oder Human-Stroma abgeleitet sind. Die Zellen werden enzymatisch von dem normalen kornealen Stroma abgespalten, in DMEM-10% NBCS kultiviert und seriell übertragen. Die Zellen, die in das Konstrukt eingearbeitet werden, werden im Übertrag 4 verwendet.
Sobald die Endothelzellkultur fertig ist, wird zur Vorbereitung der zweiten Zellschicht, der Zell-Kollagen-Mischung, das Medium von den Zellkultureinschüben entfernt, welche die konfluenten Endothelschichten enthalten (für gewöhnlich 1,7-2,5 · X10 · 5 Zellen/Einschub). Die Zellen-Kollagen-Mischung wird übertragen und mit der Oberfläche der Endothelzellschicht in Kontakt gebracht. Die Zellen-Kollagen-Mischung enthält dieselben Anteile von Materialien wie die azelluläre Schicht, mit der Zugabe von 5 · 10&sup4; Stromafibroblasten/ml gegossener Mischung. Drei ml dieser Mischung werden in jeden Zellkultureinschub pipettiert und gelieren gelassen. Das Konstrukt wird dann in DMEM-10% NBCS getaucht und bei 37ºC, 10% CO&sub2; sieben Tage kontrahieren gelassen.
Diese beiden Schichten, die schließlich die Endothelschicht und die Kollagenschicht des Korneamodells umfassen, werden unter Kultivierungsbedingungen kultiviert, die dem Fachmann bekannt sind, um ein kondensiertes Kollagengitter zu erhalten, vorzugsweise durch Eintauchen in DMEM-10% NBCS, bei 37ºC, 10% CO&sub2; über sieben Tage, um eine zentrale erhabene Fläche oder "Mesa" zu bilden, die durch die Kontraktion des Kollagens durch Stromafibroblasten entsteht, die ein kondensiertes Kollagengitter bilden. Normale Kaninchen-Stromafibroblasten werden sieben Tage kultiviert, aber die Kultur kann länger oder kürzer sein (für gewöhnlich 2-10 Tage), abhängig von der verwendeten Spezies, der Zellart und -anzahl. DMEM 10% NBCS ist das bevorzugte Kulturmedium, aber es kann jedes Medium verwendet werden, das für gewöhnlich das Wachstum von Fibroblasten unterstützt.
Sobald das kondensierte Kollagengitter gebildet ist, werden im dritten Schritt korneale Epithelzellen auf die erhöhte Fläche des Kollagens ausgestrichen. Die kornealen Epithelzellen können von einer Vielzahl von Säugetierquellen abgeleitet werden. Die bevorzugte Epithelzelle ist eine korneale Kaninchen- oder Human-Epithelzelle (korneale Keratinozyte), aber es kann jede korneale Keratinozyte von einem Säugetier verwendet werden. Andere Epithel-Keratinozyten, wie jene, die von der Sklera (äußerer weißer, undurchsichtiger Abschnitt) des Auges oder der Epidermis abgeleitet sind, können eingesetzt werden, aber korneale Keratinozyten sind bevorzugt.
Das Medium wird von dem Kultureinschub (der die kontrahierte stromale Matrix und Endothelschicht enthält) und seiner Umgebung entfernt. Normale korneale Kaninchen-Epithelzellen, Übertrag 4, werden trypsiniert und auf die Oberseite der Membran mit einer Dichte von 7,2 · 10&sup4;-1,4 · 10&sup5; Zellen/cm² geimpft. Die Konstrukte werden dann ohne Medium vier Stunden bei 37ºC, 10% CO&sub2; inkubiert, so daß die Epithelzellen anhaften können. Nach der Inkubation werden die Konstrukte in korneales Erhaltungsmedium ("Corneal Maintainance Medium" - CMM") getaucht (Johnson et al., 1992).
Die Epithelzellen werden kultiviert, bis die Mesa mit den Epithelzellen bedeckt ist. Die Vollständigkeit der Epithelbedeckung kann durch eine Vielzahl von Verfahren nachgewiesen werden, wie zum Beispiel durch Färben der Kultur mit einer Lösung aus Nilblau- Sulfat (1 : 10000 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung).
Sobald die Mesa bedeckt ist, nach etwa sieben Tagen, werden die Konstrukte aseptisch zu neuen Kulturschalen mit ausreichendem kornealen Erhaltungsmedium (CMM) übertragen, um einen Fluidpegel gerade bis zur Oberfläche des Konstrukts zu erreichen, um eine feuchte Grenzfläche ohne Eintauchen der Epithelschicht aufrecht zu erhalten. Die Konstrukte werden bei 37ºC, 10% CO&sub2; und mehr als 60% Feuchtigkeit mit dem CMM inkubiert, wobei das Medium nach Bedarf getauscht wird, für gewöhnlich dreimal pro Woche.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff "feuchte Grenzfläche" eine Kulturumgebung bezeichnen, die so reguliert ist, daß die Oberfläche des Konstrukts feucht, mit hoher Feuchtigkeit, aber nicht trocken oder eingetaucht ist. Der genaue Wert der Feuchtigkeit in der Kulturumgebung ist nicht kritisch, es sollte aber ausreichend feucht sein, um die Bildung verhornter Zellen zu verhindern. Eine feuchte Grenzfläche kann so charakterisiert werden, daß versucht wird, ähnliche Feuchtigkeitswerte wie beim Auge des Menschen zu erreichen.
Ein morphologischer und immunozytochemischer Vergleich der Inkubation des Konstrukts (1) bei einer wahren Luftgrenzfläche (trocken) gegenüber (2) einer versenkten Inkubation gegenüber (3) einer feuchten, aber nicht versenkten Inkubation, zeigte, daß nur die feuchte oder trockene Grenzfläche ein Epithel ergab, das annähernd der normalen Kornea entsprach. Die Inkubation bei trockener Grenzfläche bewirkte jedoch, daß das korneale Epithel eine abnormale squamöse (Hautlinien-) Differenzierung erfuhr.
Es gibt mehrere Alternativen, um eine feuchte Grenzfläche der Epithelschicht und des Mediums zu erreichen.
Eine alternative Methode zum Erreichen einer feuchten Grenzfläche an der Epithelschicht verwendet eine Lipid/Muzin-Mischung zur Simulierung des Tränenfilms. Der besondere Tränenfilm kann unter Verwendung einer physiologischen gepufferten Salzlösung formuliert werden, die oberflächenaktive Protein-Lipid-Substanzen oder Lipide und/oder Muzin, Glycosaminoglycane, Hyaluronsäure oder andere feuchtigkeitsspeichernde Substanzen enthält. Der Filmtropfen wird auf die Oberseite der Mesa aufgebracht, um eine feuchte Sperrschicht zwischen dem Epithel und der Atmosphäre aufrecht zu erhalten. Der Film wird für gewöhnlich ersetzt, wenn das Medium getauscht wird. Als Alternative können eine oder mehrere der Komponenten des Tränenfilms direkt dem Medium zugegeben werden, die sich während der Kultur an der feuchten Oberflächengrenzfläche über die Oberfläche des Konstrukts saugen.
Als Alternative kann das Aufrechterhalten einer feuchten Grenzfläche auch durch die Verwendung einer künstlichen Schicht unterstützt werden, die Feuchtigkeit über die Oberfläche der Kultur ziehen und halten kann. Dies kann durch das Auftragen einer dünnen Schicht erreicht werden, die aus Agarose, Hydrogel oder Alginat besteht.
In einer anderen Alternative, kann eine feuchte Grenzfläche unter Verwendung einer Dialysemembran oder eines Polymers, wie eines Kontaktlinsenmaterials, erreicht werden, das etwas größer als die Mesa geschnitten ist, welches dazu verwendet werden kann, Flüssigkeit anzuziehen und zu halten und einen Feuchtigkeitsverlust zu verhindern.

2. Verwendung des Endothels in anderen Organäquivalenten

Der Einschluß einer Endothelschicht fördert eine verbesserte Morphologie, die Expression biochemischer und physiologischer Marker, die Zellverteilung, das epitheliale Anheften an die Matrix, und eine Gleichförmigkeit der Epithelbedeckung in vivo. Die Ergebnisse auf den Einfluß des Endothels beim Erreichen eines höheren epithelialen Differenzierungswertes in vitro und bei der Förderung der Bildung einer Basalmembran wurden in anderen in vitro Kulturmethoden für ein Gewebeäquivalent angewandt.
Bei der Herstellung von Gewebe- oder Organäquivalenten unter Verwendung von Kollagen, kann eine erste Schicht von Endothelzellen, wie zuvor in Abschnitt (1) beschrieben, kultiviert werden, bevor Kollagen auf die Endothelschicht gegossen wird. Beispiele für Gewebeäquivalente, die gemäß dieser Erfindung modifiziert werden können, umfassen das US Patent Nr. 5,536,656, erteilt am 16. Juli, 1996.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird die Endothelzellschicht zur Modifizierung von in vitro Hautäquivalentmodellen verwendet, wie jenen, die in U.S. 4,485,096 beschrieben sind, um die Epitheldifferenzierung und Basalmembranbildung zu unterstützen.

3. Verwendungen für das Korneaäquivalentmodell

Der Draize-Augenreizungstest (Draize et al., 1944) diente in den letzten 45 Jahren als Standard für die Bewertung eines Augenreizpotentials eines Produktes.
Eine Reihe von Testmodellen und Protokollen wurde für die in vitro Durchmusterung zur Bewertung der Augenreizung vorgeschlagen (Booman et al., 1988). Zellkulturen, die in Verbindung mit quantifizierbaren, objektiven Endpunkten zur Bewertung der Zytotoxizität verwendet wurden, haben eine gute Korrelation mit in vivo Datensätzen gezeigt (Bruner et al., 1991). Zellen in Monoschichtkulturen sind jedoch an sich Grenzen als Modellsysteme zur Vorhersage der Reizung in komplexen Organen, wie dem Auge, gesetzt. Für gewöhnlich sind Zellen in Monoschichtkulturen für Reizungen bei Konzentrationen anfällig, die weit unter jenen liegen, die eine Reizung in vivo herbeiführen. Testproben müssen zuerst in Zellkulturmedium löslich gemacht werden, bevor sie in das Kultursystem eingebracht werden. Dies kann zu sekundären Toxizitäten aufgrund der Wirkungen auf die Osmolarität, den pH oder die Mediumkomponenten führen. Ferner können Artefakte, die durch die Verdünnung der Testprobe entstehen, die Toxizität maskieren und zu einer Unterschätzung des Reizungspotentials einer Probe führen. Der Wert der epidermalen Differenzierung, der in Monoschichtkultur erhalten wird, gibt das Ausmaß der Differenzierung, die in vivo beobachtet wird, nur schlecht wieder. Die schützende Sperrfunktion des kornealen Epithels, einschließlich der Zytoskelett-Keratingeflechte, Desmosome und Verschlußkontakte, von welchen bekannt ist, daß sie eine wichtige Rolle beim Schutz des okulären Gewebes vor einer chemischen Belastung spielen (Holly, 1985), sind nicht vorhanden. Das hier vorgeschlagene organotypische Modell überwindet einige der vorhandenen Einschränkungen einer Monoschichtkultur durch die Bereitstellung eines Modellsystems, die das Zielorgan von Interesse besser simuliert. Zusätzlich ermöglicht die physische Konfiguration dieser Testkornea die topische Anwendung von Testproben in Vehikeln (z.B. Petrolat und Mineralöl), welche dem in vivo Belastungsmodus nahekommen.
Forscher haben sowohl Tiermodelle als auch kultivierte Zellen in dem Bemühen verwendet, die Bedingungen beim Menschen annähernd zu erreichen. Es gibt jedoch in der direkten Anwendbarkeit eine große Kluft. Tiere könnten in ihrer physiologischen Reaktion auf eine Verletzung zu unterschiedlich sein, und die Analyse unter Verwendung einer traditionellen Zellkultur könnte für direkte Korrelationen zu wahrscheinlichen in vivo Reaktionen des Menschen zu sehr vereinfacht sein. Während diese Methoden zwar notwendig und zweckdienlich sind, trägt die Verwendung von organotypischen Human-Konstrukten dazu bei, den Unterschied zwischen der Reaktion beim Menschen und Tier zu beseitigen, und überbrückt die Kluft zwischen kultivierten Zellen und dem komplexen Organismus. Wechselwirkungen zwischen Zellen und die Reaktion auf eine Verletzung oder pharmakologische Mittel können leicht in einer kontrollierten, organotypischen Umgebung untersucht werden.
Die organotypische Kulturmethode kann auch zur Bildung von transplantierbarem Humangewebe entweder als Zusatz zu einer herkömmlichen Transplantation oder als Ersatz verwendet werden. Es wurde bereits gezeigt, daß die Verwendung von kultivierten kornealen Endothelzellen als Ersatz für das häufig beschädigte oder inadäquate Endothel von Transplantatmaterial günstig ist (Insler und Lopez, 1986). Es wurde auch gezeigt, daß die Verwendung eines kultivierten kornealen Epithels auch einen gewissen Nutzen bei der Begünstigung des Wundverschlusses hat (Roat und Thoft, 1988). Das organotypische Korneakonstrukt, das ein Endothel, Stroma und Epithel umfaßt, könnte für den okulären Wundverschluß und die Reparatur in voller Dicke der Kornea verwendet werden. Obwohl in vitro nicht transparent, wird erwartet, daß die Endothelzellen, die von dem Konstrukt bereitgestellt werden, den Fluidtransport zu dem Korneastroma regulieren und ferner die Stromafibroblasten stimulieren, mit der Organisation der Matrix fortzufahren und die geeigneten Kollagene und Glycosaminoglycane zu erzeugen, die für die Klarheit der Kornea wichtig sind. Das in vitro Korneaäquivalent kann mit mehr oder weniger extrazellulärer Matrix oder Stroma konstruiert werden, um ein Umformen zu erleichtern. Der Wundverschluß würde durch die Gegenwart des gut haftenden Korneaepithels aufrecht erhalten werden, wodurch die Hyperproliferation und Vernarbung der Stromamatrix eingeschränkt wird.

Zitierte Referenzen

Booman, K. A., De Prospo, J., Demetrulias, J., Driedger, A., Griffith, J. F., Grochoski, G., Kong, B., McKormick, W. C., North-Root, H., Rosen, M. G., Sedlak, R. L, "In vitro methods for estimating eye irritancy of cleaning products, Phase I: Preliminary assessment", J. Toxicel. Cut. & Ocular Toxicol. 7: 173-185 (1988).
Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O., "Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes", J. Pharmacel. Exp. Ther. 82: 377-390 (1944).
Bruner, L. H., Kam, D. J., Roberts, D. A., Parker, R. D., "Evaluation of seven in vitro alternatives for ocular safety testing", Fund. Appl. Toxicol 17: 136-149 (1991).
Holly, F. J., "Physical chemistry of the normal and disordered tear film", Trans. Ophthalmol. Soc. U.K. 104: 374-380 (1985).
Insler, M. S., Lopez, J. G., "Transplantation of cultured human neonatal corneal endothelium", Curr. Eye Res. 5(12):967-72 (1986).
Johnson, W. E., Meunier, S. F., Roy, C. J. und Parenteau, N. L., "Serial Cultivation of Normal Human Keratinocytes: A Defined System Studying the Regulation of Growth and Differentiation", In Vitro Cell. Dev. Biol. 28A:429-435 (1992).
Muragaki, Y., Shiota, C., Inoue, M. Ooshima, A., Olsen, B. R., und Ninomiya, Y., "Alpha-1-VIII collagen gene transcripts encode a short-chain collagen polypeptide and are expressed by various epithelial endothelial and mesenchymal cells in newborn mouse tissues", Eur. J. Biochem. 207(3): 895-902 (1992).
Roat, M. I, Thoft, R. A., "Ocular surface epithelial transplantation", Int. Ophthalmo. Clin. 28(2):169-174 (1988).
Schermer, A., Galvin, S., und Sun, T. T., "Differentiation-related expression of a major 64K corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of cornea epithelial stem cells", J. Cell. Biol. 103: 49 (1986).
Zieske, J. D., Bukusoglu, G., Yankauckas, M. A., "Charaterization of a potential marker of corneal epithelial stem cells", Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33: 143-152 (1992). Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, die in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen sind.

Beispiel 1: Das korneale Erhaltungsmedium (CMM), das in der Bildung des Korneaäquivalents verwendet wurde, hatte die folgenden Komponenten:

3 : 1 Kalziumfreies, Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium : Ham F-12
1,1 uM Hydrokortison
5 ug/ml Insulin
5 ug/ml Transferrin
20 pM Triiodthyronin
10 -4 M Ethanolamin
10 -4 M O-Phosphoryl-ethanolamin
1 mM Strontiumchlorid
50 ug/ml Gentamicin
4 mM 1-Glutamin
90 uM Adenin
3 · 10-6 M Selen
1,8 mM Kalziumchlorid
0,3% NBCS

Beispiel 2: Das Modell, das eine Endothelzellschicht und eine feuchte Grenzfläche verwendet, zwei Schlüsselmerkmale, wurde auf folgende Weise hergestellt:

Eine seriell übertragene, korneale Maus-Endothelzellinie oder normale korneale Kaninchen-Endothelzellen wurden trypsiniert und auf Membrane eines Zellkultureinschubs (wie eines Costar-Transwell) mit 3 · 10&sup4; Zellen/Einschub in DMEM 10% Serum neugeborener Kälber oder serumfreien Medium (MSBME) geimpft und bei 37ºC, 10% CO&sub2; 4 Tage inkubiert.
Eine Mischung aus säureextrahiertem Rinderkollagen vom Typ I (0,9-1,2 mg/ml in 0,5% Essigsäure) wurde bei 4ºC unter Verwendung von 10X konzentriertem MEM neutralisiert, das Natriumbicarbonat, 10% Serum neugeborener Kälber und 20 mM 1-Glutamin enthielt. Die kalte, neutralisierte Kollagenmischung wurde mit einer Suspension von seriell übertragenen kornealen Kaninchen-Keratozyten (Stromazellen) gemischt, um eine Endzellenkonzentration von 5 · 10&sup4; Keratozyten/ml zu erhalten.
Das Medium wurde von den Endothelzellkulturen entfernt und 3 ml der Zellen- Kollagen-Mischung wurden auf die Oberfläche der Endothelzellschicht pipettiert. Das Kollagengel wurden dann erwärmt, um ein zelluläres Kollagengel zu bilden. Das Gel wurde durch die Keratozyten kontrahiert, so daß ein kondensiertes Kollagengeflecht mit einer in der Mitte erhabenen Fläche oder "Mesa" in etwa 7 Tagen entstand, die mit der Endothelschicht unterlegt war.
Am Tag 7 wurden die seriell übertragenen kornealen Epithelzellen trypsiniert und auf die Mesa bei einer Konzentration von 1,8 · 10&sup5; Zellen/Mesa ausgestrichen. Konstrukte wurden in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC, 10% CO&sub2; 4 Stunden inkubiert, so daß die Zellen an die Kollagenmatrix anheften konnten. Die Konstrukte wurden dann, versenkt, in 13 ml kornealem Erhaltungsmedium (CMM) inkubiert. Das Medium wurde dreimal pro Woche getauscht.
Am Tag 7 nach der Epithelisierung wurde eine Probe mit einer Lösung aus Nilblau- Sulfat (1 : 10000 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) gefärbt, um die Vollständigkeit der Epithelbedeckung zu überprüfen.
Wenn die Mesa 100% bedeckt war, wurden die Konstrukte aseptisch in neue Schalen überführt, die 11 ml Medium und 2 Wattebäusche enthielten, um den Kultureinschub zu stützen und die Bildung eines Meniskus zu verhindern. 11 ml Medium erreichten einen Fluidpegel, der gerade zu der Oberfläche des Konstruktes reichte (das in diesem Fall 1 mm oder weniger dick war). Dadurch wurde eine feuchte Oberfläche ohne Eintauchen aufrechterhalten. Die Konstrukte wurden dann wie oben mit einem Mediumaustausch dreimal/Woche inkubiert, wobei jedesmal 9 ml Medium getauscht wurden (die Wattebäusche hielten die übrigen 2 ml).

Beispiel 3: Die Wirkung der Umgebung der Korneadifferenzierung

Nachdem die epithelialisierten Korneakonstrukte eine Woche in CMM kultiviert worden waren, wurden sie entweder eingetaucht belassen, auf Wattebäuschen auf eine trockene Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche angehoben, oder auf Wattebäuschen mit ausreichendem Medium angehoben, um eine feuchte, aber nicht versenkte Epitheloberfläche zu erhalten. Die trockene Grenzfläche wurde erreicht, indem der Zellkultureinschub von seinem Träger entfernt und auf der Oberseite von zwei Wattebäuschen angeordnet wurde, die in einer Kulturvertiefung, einer Schale mit tiefer Vertiefung oder einer Schale, die genug Medium enthielt, das gerade die Wattebäusche erreichte, hingen. Das Medium wurde durch die Wattebäusche zu der unteren Oberfläche der Kultur gesaugt. Die feuchte Grenzfläche wurde auf ähnliche Weise erreicht, wobei aber das Volumen des Mediums, welches die Bäusche umgab, erhöht wurde, um den Flüssigkeitspegel zu den Schultern der Mesa zu bringen (mittlere erhöhte Fläche des Konstrukts). Für gewöhnlich erreichten in einer Kulturschale mit tiefer Vertiefung mit zwei Wattebäuschen neun ml Medium eine trockene Grenzfläche und elf ml Medium erreichten eine feuchte Grenzfläche. Das Medium wurde auf natürliche Weise über die Oberfläche der Mesa gezogen, ohne die Epitheloberfläche an der Oberseite der Mesa einzutauchen.
Der morphologische und immunozytochemische Vergleich der Inkubation des Konstruktes bei einer wahren Luftgrenzfläche (trocken) gegenüber einer versenkten Inkubation gegenüber einer feuchten Inkubation zeigte, daß nur die feuchte oder trockene Grenzfläche ein Epithel ergab, das annähernd der normalen limbalen Kornea in der Verteilung von Vinculin und Alpha-Enolase entsprach. Die Kultur an einer trockenen Grenzfläche bewirkte jedoch, daß das korneale Epithel eine abnormale squamöse (Hautlinien-) Differenzierung erfuhr.

Beispiel 4: Einschluß der Endothelzellschicht

Der Einschluß einer Endothelzellschicht macht das Konstrukt besser reproduzierbar und herstellbar. Dadurch wurde der Auswuchs des kornealen Epithels an der Matrix verbessert, das physikalische Anheften der Epithelschicht (leicht trennbar von der Matrix ohne Endothel, untrennbar mit) verbessert und ein Keratozyten-Auswuchs in und auf der Kollagenoberfläche beseitigt (ohne das Endothel erschienen die stromalen Keratozyten hyperproliferativ, und wurden, anscheinend durch chemotaktische Eigenschaften des Epithels, aus dem Gitter herausgezogen, und konkurrierten dann mit den Epithelzellen um die Gitteroberfläche).

Beispiel 5: Wirkungen des Einschlusses einer Endothelzellschicht.

Der Einschluß der Endothelschicht ergab auch ein Konstrukt mit stärkeren organotypischen Eigenschaften. Immunochemische Studien, in welchen feuchte Konstrukte mit und ohne Endothelschicht verglichen wurden, zeigten die verbesserte Expression von Kollagen vom Typ VII, der Komponente von Bindungsfilamenten und Laminin, einer Komponente der Basalmembran. (Basallamina- und Zellmatrix-Wechselwirkung sind wichtige Komponenten in der Untersuchung der kornealen Wundbehandlung; ein Fehlen dieser Komponenten verringerte die Nützlichkeit eines kornealen Konstruktes). Dreischichtige Konstrukte zeigten sogar eine noch stärkere limbalartige Lokalisierung von Alpha-Enolase (die auf die Basalschicht des Korneaepithels begrenzt ist).

Beispiel 6: Ultrastrukturelle Spezialisierungen des Korneaäquivalents.

Die morphologische Differenzierung des dreizelligen Konstrukts zeigte das Vorhandensein einer organisierten Basallamina, das Fehlen einer abnormalen squamösen Differenzierung und das Vorhandensein charakteristischer wurmförmiger Stege auf der Epitheloberfläche.

Beispiel 7: Direkter Kontakt der Endothelzellschicht mit dem Stromageflecht ist für eine optimale Wirkung notwendig.

Transformierte korneale Maus-Endothelzellen wurden in Gewebekulturschalen mit sechs Vertiefungen (6,7 · 10³ Zellen/cm²) in DMEM - 10% NBCS ausgestrichen und bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Ein Zellkultureinschub, der ein nicht kontrahiertes Stromageflecht enthielt, wurde in die Vertiefung eingebracht, so daß das konditionierte Medium von der Endothelschicht das Gitter baden konnte, während dieses sieben Tage kontrahierte. Am Tag sieben wurde das stromale Konstrukt normal epithelialisiert und in Gegenwart der Endothelzellschicht sieben Tage kultiviert. Proben wurden durch Histologie analysiert. Die Ergebnisse waren ähnlich Beispiel 3 mit einem desorganisierten Epithel und Fibroblastchemotaxis. Durch das Ausstreichen der Endothelzellen am Boden einer Kulturschale, getrennt von dem direkten Kontakt mit der stromalen Schicht, wurden auch nicht die gewünschten Ergebnisse erreicht.

Beispiel 8: Verminderung von Endothelzellen mit Mitomycin C hemmt deren Wirkung im Korneaäquivalent.

Transformierte Maus-Endothelzellen weisen keine Kontakt-Wachstumshemmung auf, und somit vermehren sie sich weiter und bilden Mehrfachschichten und Zellhügel unterhalb des Stromageflechts. Es wurden Studien in einem Versuch durchgeführt, die Zellen mit Mitomycin C vor der Bildung des Stromageflechts zu vermindern.
Transformierte Maus-Endothelzellen wurden direkt auf die Polycarbonatmembrane der Zellkultureinschübe geimpft und bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Vor dem Gießen der stromalen Schicht, wurden die Endothelzellen bei 37ºC, 10% CO&sub2;, eine oder zwei Stunden in Medium inkubiert, das entweder 2 oder 4 ug/ml Mitomycin C enthielt. Die Endothelzellen wurden zweimal mit DMEM - 10% NBCS gewaschen und die stromale Schicht auf die Oberseite pipettiert. Die Mitomycin C Behandlung verhinderte eine Endothelzellenüberwucherung und förderte die epitheliale Entwicklung, war jedoch nicht imstande, die Fibroblastchemotaxis zu verhindern. Eine Verminderung der Maus-Endothelzellen mit Mitomycin C zur Vermeidung einer weiteren Teilung der Maus-Endothelzellen (welchen eine Kontakthemmung vermutlich aufgrund ihrer SV40 Transformation fehlt), verringerte die Wirkung der Endothelschicht.

Beispiel 9: Entwicklung funktioneller Sperrschichteigenschaften in dem Korneaäquivalent

Die Gegenwart funktioneller Verschlußkontakte wurde unter Verwendung eines Fluoresceinpermeabilitätstests verifiziert. Die Permeabilitätssperrschicht verbesserte sich im Laufe der Zeit, wie in der Folge dargestellt ist. Es war auch offensichtlich, daß durch die Bereitstellung von Kulturen mit einer feuchten Grenzfläche die Permeabilitätssperrschicht verbessert wurde. Zusätzlich kann die Permeabilitätssperrschicht durch die Verwendung verschiedener Zellarten verbessert werden. Der Unterschied zwischen zwei Arten von Kaninchen-Korneaepithel ist in der Folge dargestellt.
Korneakonstrukte in den Zellkultureinschüben wurden in Schalen mit sechs Vertiefungen eingebracht, die zwei ml Hanks ausgewogene Salzlösung ("Hanks Balanced Salt Solution" - HBSS) mit Kalzium und Magnesium enthielten. Ein Polycarbonatring wurde auf die Oberseite der Mesa aufgebracht und mit einer Kugel Silikonfett versiegelt, um ein Aussickern zu vermeiden. Dadurch wurde ein Oberflächenbereich von 0,785 cm² freigelegt. Ein 50 ul Tropfen Natriumfluorescein (0,5 mg/ml in HBSS) wurde in den Ring auf die Oberseite des Korneaepithel pipettiert und, mit Folie bedeckt, dreißig Minuten bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Die Fluoresceinextinktion in HBSS in der Vertiefung wurde am Spektrophotometer bei 490 nm gemessen. Typische Ergebnisse sind in der Folge dargestellt. Die feuchten Kulturen zeigten eine höhere Beständigkeit gegenüber der Fluoresceinpermabilität, was auf die Entwicklung von Verschlußkontakten hinweist. Es zeigte sich, daß die Permeabilität abhängig von der Qualität (beurteilt nach Erscheinungsbild, Wachstumseigenschaften) der Epithelzellenart schwankte.

GLATTE FILTER (KONTROLLE)

2,565
2,552
2,549

KANINCHEN-EPITHELSTAMM 1259

9d feuchte Grenzfläche: 0,322
0,343
0,347
9d versenkt: 1,830
14d feuchte Grenzfläche: 0,130
0,102
0,821
14d versenkt: 0,932
0,508
0,616

KANINCHEN EPITHELSTAMM 12129

9d feuchte Grenzfläche: 0,064
0,054
0,037
14d versenkt: 0,030
0,023
0,03
Die vorangehende Erfindung wurde zwar in gewissen Einzelheiten als Veranschaulichung und Beispiel zum besseren Verständnis beschrieben, aber für einen Fachmann ist offensichtlich, daß gewisse Änderungen und Modifizierungen im Umfang der beiliegenden Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims

1. Korneaäquivalent, welches

(a) eine innere Endothelzellschicht aus kultivierten Endothelzellen;

(b) eine mittlere Schicht aus einer Stromazellen-Kollagen-Mischung; und

(c) eine äußere Epithelzellschicht aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die Stromazellen aus Säugetier-Stromafibroblastzellen kultiviert sind und die Epithelzellen aus Säugetier-Epithelzellen kultiviert sind.

2. Korneaäquivalent nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Endothelzellen der inneren Schicht aus Säugetier-Endothelzellen kultiviert sind, die mit dem großen T-Antigen von SV40 transformiert sind.

3. Korneaäquivalent nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Endothelzellen der inneren Schicht aus Säugetier-Endothelzellen kultiviert sind, die mit einem wärmeempfindlichen Gen transformiert sind.

4. Korneaäquivalent nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) die Endothelzellen der inneren Endothelzellschicht aus Kornea-Endothelzellen kultiviert sind;

(b) die Stromazellen der mittleren Schicht aus einer Stromazellen-Kollagen- Mischung aus Säugetier-Korneastromafibroblastzellen kultiviert sind; und

(c) die Epithelzellen der äußeren Epithelzellschicht aus Säugetier-Kornea-Epithelzellen kultiviert sind.

5. Verfahren zur Herstellung eines Korneaäquivalents, welches

(a) das Kultivieren von Endothelzellen zur Bildung einer Endothelzellschicht;

(b) das Kultivieren von Kollagen und Stromazellen zum Erhalten der Zellen-Kollagen-Mischung;

(c) das In-Kontakt-Bringen der Zellen-Kollagen-Mischung mit der Oberfläche der Endothelzellschicht;

(d) das Kultivieren der beiden Schichten, so daß die Kollagenschicht eine erhöhte mittlere Fläche bildet;

(e) das In-Kontakt-Bringen der Epithelzellen mit der Oberfläche der Zellen-Kollagen-Schicht;

(f) das Kultivieren der Epithelzellen, bis die Kollagenschicht mit den Epithelzellen bedeckt ist; und

(g) das fortgesetzte Kultivieren der Epithelzellen unter Bedingungen zum Erreichen einer feuchten Oberflächengrenzfläche zur Bildung eines Korneaäquivalents beinhaltet.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Endothelzellen der Endothelzellschicht mit dem großen T-Antigen von SV40 transformiert werden.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Endothelzellen der Endothelzellschicht mit einem wärmeempfindlichen Gen transformiert werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß:

(a) die Endothelzellen der inneren Endothelzellschicht aus Säugetier-Kornea- Endothelzellen kultiviert werden;

(b) die Stromazellen der mittleren Schicht aus einer Stromazellen-Kollagen- Mischung aus Säugetier-Korneastromafibroblastzellen kultiviert werden; und

(c) die Epithelzellen der äußeren Epithelzellschicht aus Säugetier-Kornea-Epithelzellen kultiviert werden.

9. Verfahren zur Testung der Wirkung einer Testsubstanz, welches

(a) das Aussetzen eines Korneaäquivalents nach einem der Ansprüche 1 bis 4 einer Testsubstanz; und

(b) das Bestimmen der Wirkung der Testsubstanz auf das Korneaäquivalent beinhaltet.

10. Korneaäquivalent nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwendung in einer Transplantation.

11. Gewebeäquivalent, das aus einer Kultur erhalten wird und eine Kollagenschicht aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Endothelzellschicht, die von Endothelialzellen kultiviert ist, in Kontakt mit der Kollagenschicht enthält.