DE69323568T2

DE69323568T2 - Antimikrobielle Zusammensetzungen und pharmazeutische Präparate hiervon

Info

Publication number: DE69323568T2
Application number: DE69323568T
Authority: DE
Inventors: Nobuo Kato; Michio Ohta
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1992-03-30
Filing date: 1993-03-29
Publication date: 1999-10-07
Anticipated expiration: 2013-03-30
Also published as: EP0563844A1; US5610139A; JP3361830B2; JPH05271096A; DE69323568D1; EP0563844B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft antimikrobielle Zusammensetzungen; sie betrifft weiterhin antimikrobielle Agenzien, welche diese Zusammensetzung als Wirkstoff enthalten und zur Vorbeugung und Behandlung opportunistischer Infektionskrankheiten besonders geeignet sind.

Beschreibung des Standes der Technik

Bei Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus (im Folgenden wird die Abkürzung MRSA verwendet) handelt sich um Staphylococcus aureus-Stämme, die gegen verschiedene antimikrobielle Agenzien wie z. B. Methicillin, Cephem-Antibiotika, usw. resistent sind. Diese Stämme sind in jüngerer Zeit als Krankheitserreger von in Krankenhäusern auftretenden Infektionen wie z. B. opportunistischen Infektionen erwähnt worden, und das Auffinden von Gegenmaßnahmen gegen diese heutigen Infektionskrankheiten stellt ein ernstes Problem der medizinischen Versorgung dar. Einige MRSA sind nicht nur gegen Cephem-Antibiptika sondern auch gegen Chloramphenicol-Antibiotika resistent.
Die antimikrobielle Wirksamkeit der aus Königskrabben- Hämocyten isolierten Peptide gegen gram-positive und gram-negative Bakterien und Pilze ist bekannt (PCT-Veröffentlichung WO 89/01492; ungeprüfte Japanische Patentveröffentlichungen (Al) Nr. 2-53799, 2-152987, 2-270897 und 4-82840).
Diese Peptide können indessen bei alleiniger Verabreichung keine hinreichende antimikrobielle Wirksamkeit entfalten: beispielsweise liegt die minimale Inhibitionskonzentration (MIC) gegen Staph. aureus bei 3,1-6,2 ug/ml. Eine hohe Dosierung dieser antimikrobiellen Peptide zum Erreichen hinreichender antimikrobieller Wirksamkeit hat toxische Nebenwirkungen zur Folge. Die Peptide sind kostspielig und nicht leicht zugänglich, da diese Peptide aus der natürlichen Königskrabbe isoliert werden. Daher konnten diese aus den Hämocyten der Königskrabbe isolier ten antimikrobiellen Peptide nicht leicht als antimikrobielle Agenzien verwendet werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Untersuchungen durchgeführt, um ein niedrig dosiertes, weniger toxisches antimikrobielles Agens gegen MRSA zu entwickeln. Als Ergebnis fanden sie, daß Kombinationen der aus den Hämocyten der Königskrabbe isolierten antimikrobiellen Peptide mit einem beta- Lactam-Antibiotikum oder einem Chloramphenicol-Antibiotikum bei geringer Dosierung das Wachstum gram-positiver Bakterien einschließlich MRSA und gram-negativer Bakterien effektiv hemmen, und vervollständigten so die vorliegenden Erfindung.
Somit bestand eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, antimikrobielle Zusammensetzungen bereitzustellen, die für eine medizinische Behandlung besonders geeignet sind und nicht nur das Wachstum von MRSA sondern auch von anderen gram- positiven sowie gram-negativen Bakterien in niedrigen Konzentrationen bei verringerter Toxizität hemmen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, auf der oben aufgezeigten Wirkung basierende Agenzien zur Vorbeugung und Behandlung opportunistischer Infektionen bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Lösung der oben genannten Probleme bereit und betrifft antimikrobielle Zusammensetzungen, umfassend antimikrobielle Peptide, die von der Königskrabbe abgeleitet sind, ihre Derivate oder pharmazeutisch verträglichen Salze und ein beta-Lactam-Antibiotikum oder ein Chloramphenicol-Antibiotikum.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin antimikrobielle Zusammensetzungen, welche die besagten Zusammensetzungen enthalten, insbesondere Agenzien zur Vorbeugung und Behandlung opportunistischer Infektionskrankheiten.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die antibakterielle Wirkung von Tachyplesin I gegenüber 55 Stämmen klinisch isolierter MRSA.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Die von der Königskrabbe abgeleiteten antimikrobiellen Peptide der vorliegenden Erfindung umfassen Tachyplesin I, Tachyplesin II, Tachyplesin III, Polyphemusin I, Polyphemusin II und Gigasin I (PCT- Veröffentlichung WO 89/01492; ungeprüfte Japanische Patentveröffentlichungen (A1) Nr. 2-53799, 2-152987, 2- 270879). Diese Peptide, die in den Hämocyten der Königskrabbe gefunden wurden, sind basische Peptide mit 17-18 Aminosäuren, die in ihren Molekülen vier Cysteine aufweisen, welche unter Bildung cyclischer Strukturen zwei intramolekulare S-S- Bindungen ausbilden. Diese Peptide besitzen antimikrobielle Wirkung gegen gram-positive und gram-negative Bakterien, aber sie weisen auch relativ hohe MICs auf. Die geringen Unterschiede zwischen ihren MICs und ihren toxischen Konzentrationen macht ihre klinische Anwendung sehr schwierig.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung umfassen nicht nur die von der Königskrabbe abgeleiteten natürlichen antimikrobiellen Peptide, sondern auch ihre Derivate mit einer oder mehreren z. B. durch Substitution, Deletion oder Elongation modifizierten Aminosäuren, die ähnliche antimikrobielle Wirkung zeigen (im Folgenden als Derivate bezeichnet). Diese Derivate umfassen Peptide, deren basische und/oder aromatische Aminosäuren jeweils durch andere basische und/oder aromatische Aminosäuren ersetzt wurden (siehe Europäische Patentanmeldung (A1) Nr. 0502198).
Die obengenannten antimikrobiellen Peptide könnten aus den Hämocyten von Königskrabben wie z. B. Limulus polyphemus, Vorkommen: U.S.A., Tachvpleus tridentatus, Vorkommen China und Japan, Tachypleus gigas, Vorkommen: Thailand und Malaysische Halbinsel, und Carcinoscorpius rotundicauda, Vorkommen: Thailand, mittels bekannter Verfahren extrahiert werden. Diese Peptide können mittels bekannter Peptidsyntheseverfahren wie z. B. Festphasensynthese und Flüssigphasensynthese erhalten werden oder mittels gentechnischer Verfahren unter Verwendung transformierter oder transfizierter Mikroorganismen und Tierzellen, die eine diese Peptide kodierende Gen-DNA aufweisen. Darüber hinaus können diese Peptide an ihrer C-terminalen Aminosäure in Säureamid-Form vorliegen.
Diese aus Königskrabben isolierten antimikrobiellen Peptide enthalten viele basische Aminosäuren wie z. B. Arginin und Lysin, weisen basische Eigenschaften auf und können mit Säuren Salze binden.
In der vorliegenden Erfindung können pharmazeutisch verträgliche Salze wie z. B. Hydrochlorid, Sulfat, Nitrat, Phosphat, Formiat, Acetat, Lactat, Oxalat, Maleat, Fumarat, Succinat, Trifluoracetat, P-Toluolsulfonat und Methansulfonat verwendet werden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten beta-Lactam- Antibiotika umfassen Cephalosporine und Penicilline, jedoch können alle bekannten Antibiotika für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Beispielhaft können hier Cephalosporin- Antibiotika wie z. B. Cefazolin, Cephalexin, Cefamandol, Cefoxitin, Cefmetazol, Cefotaxim und Cefotetan sowie Penicillin- Antibiotika wie z. B. Ampicillin, Hetacillin, Talampicillin, Bacampicillin und Carbenicillin genannt werden.
In der vorliegenden Erfindung kann darüber hinaus auch Chloramphenicol verwendet werden.
Die antimikrobiellen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die aus antimikrobiellen Peptiden, welche aus der Königskrabbe isoliert wurden, ihren Derivaten oder pharmazeutisch verträglichen Salzen und einem beta-Lactam-Antibiotikum oder Chloramphenicol-Antibiotikum zusammengesetzt sind, zeigen in geringen Konzentrationen stark antimikrobielle Wirkung gegen gram-positive Bakterien einschließlich der MRSA und gram- negative Bakterien. Daher sind diese Zusammensetzungen als antimikrobielle medizinische Wirkstoffe zur Vorbeugung und Behandlung von Infektionen des Atmungstraktes, von Wunden und des Urogenitaltraktes, von HNO-Infektionen und ophthalmologischen Infektionen sowie von Sepsis geeignet.
Die Zusammensetzungen können zur Vorbeugung und Behandlung von durch orale Mikroorganismen bedingter Stomatits, Peridentitis, dentaler Karies, usw. verwendet werden.
Die Zusammensetzungen sind in geringen Konzentrationen sehr wirksam gegen MRSA; sie können somit zur Vorbeugung und zur Behandlung von Patienten angewendet werden, die sich aufgrund von MRSA-Infektionen tiefer liegender Organe in kritischem Zustand befinden, sowie zur Behandlung opportunistische Infektions krankheiten von durch die Verabreichung von Antikrebsmitteln oder immunosupressiven Mitteln immungeschwächten Patienten.
Die obengenannten Zusammensetzungen können ferner für Gurgellösungen und Desinfektionsmittel verwendet werden, um die Übertragung von in Krankenhäusern auftretenden MRSA-Infektionen von infizierten Patienten oder Trägen auf andere, MRSA-freie stationäre Patienten oder auf Institutsangehörige zu verhindern.
Die antimikrobiellen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können unter Anwendung bekannter Verfahren und unter Verwendung üblicher Arzneimittelträger, Füllstoffe, Bindemittel, Desintegrationsmittel, Schmiermittel, Süßstoffe, usw. zur Herstellung verschiedener pharmazeutischer Zubereitungen verwendet werden.
Die resultierenden Zusammensetzungen können in Form fester Zubereitungen wie z. B. Tabletten, Kapseln, Granalien, Pulverzubereitungen und Pastillen sowie in Form von flüssigen Zubereitungen wie z. B. Sirups und Elixieren oral verabreicht werden. Die Zusammensetzungen können auch in Form von Injektionslösungen wie z. B. intravenösen und intramuskulären Injektionslösungen parenteral verabreicht werden sowie in Form von Sprays wie z. B. Aerosol-Zubereitungen. Die Zubereitungen können ferner in Form von Zubereitungen zur äußerlichen Anwendung vorliegen wie z. B. Zäpfchen, Salben und Pflaster.
In den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung liegen die Gewichtsverhältnisse der aus der Königskrabbe abgeleiteten antimikrobiellen Peptide, ihren Derivaten und pharmazeutisch verträglichen Salzen und beta-Lactam-Antibiotika oder Choramphenicol-Antibiotika in allgemeinen zwischen 1 : 0,5 und 1 : 50; sie können aber entsprechend den Eigenschaften der Antibiotika modifiziert werden. Die resultierenden Zusammensetzungen werden vorzugsweise in mehren Portionen in Dosen von 0,1-100 mg/kg/Tag verabreicht, obgleich die Dosis mit den Symptomen und dem Alter der Patienten variieren kann. Die Zusammensetzungen weisen minimale antimikrobielle Inhibitionskönzentrationen auf, die der Hälfte oder weniger als der Hälfte der Dosierung der aus der Königskrabbe abgeleiteten antimikrobiellen Peptide bei alleiniger Verabreichung entsprechen, wobei die toxischen Nebenwirkungen geringer sind.
Die antimikrobielle Wirkung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wird anhand der folgenden Experimente erläutert.

(1) Isolation von MRSA

Die in den unten aufgeführten Experimenten verwendeten MRSA wurden wie folgt isoliert: Urin-, Sputum-, und Eiter-Proben von stationären Patienten des Nagoya University, School of Medicine Krankenhauses wurden auf ein Blut-Agar Medium aufgeschmiert und kultiviert. Aus den gewachsenen Kolonien wurde Staphylococcus aureus isoliert und identifiziert. Seine Sensitivität wurde mittels BBL Test Disks, welche ein ug Oxacillin enthielten (BBL Microbiology System Co., Ltd.), untersucht, und Stämme, die eine Inhibitionszone von 10 mm oder darunter aufweisen, wurden als MRSA-Stämme klassifiziert. Es wurden insgesamt 55 MRSA- Stämme mit den Nrn. 170, 199, 3-50, 3-53, usw. isoliert. Ihre Sensitivität wurde mit einem Agarplatten-Verdünnungsverfahren unter Verwendung eines Mueller-Hinton Agarmediums von BBL (BBL Microbiology System Co., Ltd.) bestätigt, welches 100, 50, 25, 12,5, 6,3, 3,2, 1,6 oder 0,8 ug/ml Methicillin (Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.) enthielt.

(2) Bestimmung der minimalen Inhibitionskonzentration (MIC)

Die mit dem vorstehenden Verfahren erhalten MRSA wurden in L-Medium (1% Bactotrypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, pH 7,2) über Nacht kultiviert und mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) 40fach verdünnt.
Unabhängig davon wurde Tachyplesin I in zwei Verfahren, bei denen M9-Medium (ein synthetisches Medium, dem 1% Casaminosäure zugesetzt wurde) oder T-Bouillon (0,5% Bactotrypton und 0,5% NaCl) verwendet wurde, auf Konzentrationen von 200-0,4 ug/ml verdünnt; in eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen wurden jeweils 100 ul/Vertiefung gegeben.
Die 40fach verdünnte Bakterienlösung wurde mit dem M9-Medium bzw. der T-Bouillon nochmals 10fach verdünnt; jeweils 100 ul wurden in die obengenannten Vertiefungen gegeben, die vereinigten Lösungen wurden gemischt und ergaben Endkonzentra tionen von 100-0,2 ug/ml Tachyplesin 1. Die Bakterienkonzentration wurde auf etwa 10&sup6; cfu/Vertiefung eingestellt (cfu = koloniebildende Einheit).
Die resultierenden gemischten Lösungen der Bakterien- und Tachyplesin I-Lösungen wurden über Nacht (18 h) bei 37ºC kultiviert.
Das Bakterienwachstum wurde anhand der Trübung des Mediums bestimmt, und die zu seiner Hemmung nötige minimale Konzentration wurde als minimale Inhibitionskonzentration (MIC) ermittelt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 wiedergegeben.
Wie in Fig. 1 zu sehen ist, betrugen bei einer Gesamtzahl von 55 Stämmen die MICs für Tachyplesin I: 3,2 ug/ml bei sieben Stämmen (13% der Gesamtzahl der Stämme), 6,3 ug bei 47 Stämmen (85%) und 12,5 ug/ml bei einem Stamm (2%).

(3) MICs gegen MRSA

Die MICs verschiedener, von der Königskrabbe abgeleiteter antimikrobieller Peptide gegen 55 Stämme klinisch isolierter MRSA wurden mit einem dem oben beschriebenen Verfahren ähnlichen Verfahren ermittelt. Wie in der nachfolgenden Tabelle angegeben ist, hatten die meisten antimikrobiellen Peptide MICs von ca. 3,2 ug/ml.
Antimikrobielles Peptid MIC (ug/ml)
Tachyplesin I 3,2
Tachyplesin II 3,2
Polyphemusin I 3,2
Polyphemusin II 6,3
Man nimmt an, daß die antimikrobiellen Mechanismen der Peptide wie z. B. der Tachyplesine gegen MRSA den Mechanismem gegen Escherichia coli und Salmonella spp. ähneln. Es existiert ein Energieerzeugungsmechanismus mittels oxidativer Phosphorylierung in der Cytoplasma-Membran der Bakterien, der mit dem Mem bran-Potential gekoppelt ist. Der Wirkungsmechanismus gegen E. coli wurde in künstlichen Vesikeln unter Verwendung von innerer Membran des E. coli modelliert, und die Wirkung von Tachyplesin I wurde in vitro untersucht. Es zeigt sich, daß Tachyplesin I das in der Cytoplasma-Membran erzeugte Membran-Potential depolarisiert. Dies deutet darauf hin, daß die Erzeugung einer energiereichen Phosphatbidung gehemmt wird, was die bakterizide Wirkung gegenüber den Zellen zur Folge hat. Dieser Mechanismus zeigt auch, daß Tachyplesin I eine starke antimikrobielle Wirkung gegen gram-positive Bakterien, die keine äußere Membran wie MRSA aufweisen, besitzt.

(4) Synergistische, gegen MRSA gerichtete antimikrobielle Wirkung von Kombinationen von Tachyplesin mit Antibiotika

Die synergistischen antimikrobiellen Wirkungen von Kombinationen von Tachyplesin I mit beta-Lactam-Antibiotika oder Choramphenicol-Antibiotika gegen die obengenannten, klinisch isolierten MRSA wurde untersucht und die Ergebnisse im Falle des MRSA-Stamms Nr. 3-50 in den nachfolgenden Tabellen wiedergegeben. (i) Kombinationen von Tachyplesin I (TAC-I) mit Cefazolin (CEZ) Tabelle 1
In der Tabelle bedeuten: + Wachstum
- kein Wachstum (ii) Kombinationen von Tachyplesin I (TAC-I) mit Ampicillin (ABPC). Tabelle 2
In der Tabelle bedeuten: + Wachstum
- kein Wachstum (iii) Kombinationen von Tachyplesin I (TAC-I) mit Chloramphenicol (CP) Tabelle 3
In der Tabelle bedeuten: + Wachstum
- kein Wachstum
Wie aus den obigen Tabellen hervorgeht, zeigte eine gleichzeitige Verabreichung von Tachyplesin I und Cefazolin, Ampicillin oder Chloramphenicol bei einer Konzentration von 1,6 ug/ml Tachyplesin I im Vergleich zur alleinigen Verabreichung von 3,2 ug/ml Tachyplesin I einen merklich verbesserten antimikrobiellen Effekt. Auch Kombinationen von Polyphemusin II mit den obengenannten Antibiotika wurden untersucht; die Verabreichung als Kombination bzw. die alleinige Verabreichung zeigte MIC- Werte von 1,6 bzw. 6,3 ug/ml. Somit konnten deutliche synergistische Effekte einer Kombination von Tachyplesin mit den anderen Antibiotika bestätigt werden.
Die vorliegenden Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele pharmazeutischer Zubereitungen im Detail erläutert.

Beispiel 1

Tachyplesin I 5 mg
Cefazolin 95 mg
Lactose 130 mg
Kartoffelstärke 60 mg
Magnesiumstearat 10 mg
Summe 300 mg
Tachyplesin I, Cefazolin, Lactose und Kartoffelstärke wurden homogen vermischt, mit Wasser geknetet und mit einem Granulator granuliert. Die resultierenden Granalien wurden mit einem Strom warmer Luft getrocknet. Die getrockneten Granalien wurden mit Magnesiumstearat gemischt und mit einer Tablettierungsmaschine zu Tabletten tablettiert.

Beispiel 2

In einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 1 wurden Tabletten unter Verwendung von Tachyplesin II und Chloramphenicol hergestellt.

Beispiel 3

10 mg Tachyplesin I und 100 mg Cefazolin wurden in einer Salzlösung gelöst. Die resultierende Lösung wurde aseptisch filtriert und in Ampullen abgefüllt; man erhielt Lösungen zur intravenösen Injektion.

Beispiel 4

In einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 3 wurden unter Verwendung von Polyphemusin II und Cefazolin Lösungen zur intravenösen Injektion hergestellt.

Beispiel 5

Tachyplesin I 10 mg
Ampicillin 190 mg
Lactose 120 mg
Summe 320 mg
Die obengenannten Komponenten wurden homogen vermischt und zur Herstellung von Kapselzubereitungen in harte Kapseln gefüllt.

Beispiel 6

In einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 5 wurden Kapselzubereitungen unter Verwendung von Polyphemusin I und Cefazolin hergestellt.

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend ein antimikrobielles Peptid, das aus Königskrabben-Hämocyten isoliert worden ist, sein Derivat oder sein pharmazeutisch verträgliches Salz, im Gemisch mit mindestens einem Antibiotikum, das aus einem beta-Lactam- Antibiotikum und einem Chloramphenicol-Antibiotikum ausgewählt wurde.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das aus Königskrabben-Hämocyten isolierte antimikrobielle Peptid mindestens ein Peptid, ausgewählt aus Tachyplesin I, Tachyplesin II, Tachyplesin III, Polyphemusin I, Polyphemusin II und Gigasin II ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das beta-Lactam- Antibiotikum mindestens ein Cephalosporin-Antibiotikum, ausgewählt aus Cefazolin, Cephalexin, Cefamandol, Cefoxitin, Cefmetazole, Cefotaxime und Cefotetan, ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das beta-Lactam- Antibiotikum mindestens ein Penizillin-Antibiotikum, ausgewählt aus Ampicillin, Hetacillin, Talampicillin, Bacampicillin und Carbenicillin, ist.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein antimikrobielles Peptid, das aus Königskrabben-Hämocyten isoliert worden ist, sein Derivat oder sein pharmazeutisch verträgliches Salz, im Gemisch mit mindestens einem Antibiotikum, ausgewählt aus einem beta-Lactam-Antibiotikum und einem Chloramphenicol-Antibiotikum.

6. Zusammensetzung gegen opportunistische Infektionen, umfassend ein antimikrobielles Peptid, das aus Königskrabben- Hämocyten isoliert worden ist, sein Derivat oder sein pharmazeutisch verträgliches Salz, im Gemisch mit mindestens einem Antibiotikum, ausgewählt aus einem beta-Lactam- Antibiotikum und einem Chloramphenicol-Antibiotikum.