DE69313021T2

DE69313021T2 - Bilirubin-Bestimmung unter Verwendung quervernetzbarer Polymere

Info

Publication number: DE69313021T2
Application number: DE69313021T
Authority: DE
Inventors: Stephen C Hasselberg; Ignazio S Ponticello; David M Taylor
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1992-06-01
Filing date: 1993-06-01
Publication date: 1997-12-18
Anticipated expiration: 2013-06-02
Also published as: CA2094452C; CA2094452A1; DE69313021D1; JP3042745B2; US5286450A; EP0572977B1; EP0572977A1; JPH0634635A

Description

Die Erfindung betrifft einen Test für konjugiertes oder nicht-konjugiertes Bilirubin in der klinischen Chemie. Ferner betrifft die Erfindung ein trockenes analytisches Element, das für diesen Test geeignet ist, sowie bestimmte Polymere, die als Bindemittel in dem Element besonders geeignet sind.
Bilirubin ist ein Abbauprodukt von Hämoglobin. In einem gesunden Individuum wird Bilirubin, das aus gealterten oder geschädigten Erythrozyten im Körper freigesetzt worden ist, ausgeschieden oder zu anderen Derivaten abgebaut. In einigen Fällen kommt es jedoch im Fall von übermäßiger Hämolyse oder einer Leberschädigung zu einer unnormalen Bilirubinmenge im Körper. Es gibt Anzeichen dafür, daß übermäßige Bilirubinmengen im Blut zu einer unerwünschten Zunahme der Bilirubinkonzentration in den Körperzellen führen können, die verschiedene zelluläre Prozesse stören. Die klinische Bedeutung der Bilirubinbestimmung ist also für Untersuchungen von Leber und anderen verwandten Organfunktionen ersichtlich.
In menschlichen Körperflüssigkeiten, wie Galle und Serum, liegt das Bilirubin in mehreren unterschiedlichen Formen vor, wobei diese Formen im Stand der Technik im allgemeinen als konjugiertes Bilirubin (Bc, sowohl mono- als auch dikonjugierte Formen), nicht-konjugiertes Bilirubin (Bu, auch als indirektes Bilirubin bekannt), und Delta-Bilirubin (auch als Biliprotein bekannt) bezeichnet werden. Der gesamte Bilirubingehalt (BT) stellt die Summe aller Bilirubinformen dar.
Eine Vielzahl kolorimetrischer Tests für Bilirubin ist bekannt. Beispielsweise beschreibt US-Patent 4 069 017 einen Test für Bilirubin, der an einem trockenen mehrschichtigen analytischen Element durchgeführt wird, das ein interaktives Beizmittel in einer Reagenzschicht enthält, an die Bilirubin bindet, wodurch ein nachweisbares Produkt erzeugt wird. Ferner erhöht das Beizmittel das molare Absorptionsvermögen von Bilirubin und führt zu einer spektralen Verschiebung in dem nicht-konjugierten Teil, was die gleichzeitige Analyse von sowohl konjugiertem als auch nicht-konjugiertem Bilirubin durch Ablesen der Reflexionsdichte bei 400 und 460 nm ermöglicht. Das Element umfaßt ferner eine poröse Verteilungsschicht und eine strahlungsblockierende Schicht. Chromophore, die zu einer spektralen Störung führen, wie Hämoglobin und Deltabilirubin, werden in der Verteilungsschicht über der strahlungsblockierenden Schicht festgehalten. Die Bilirubinspezies Bu und Bc wandern durch die strahlungsblockierende Schicht, um an das Beizmittel zu binden. Das interaktive Beizmittel ist in einem Bindemittel, wie Gelatine oder einem Derivat davon, dispergiert.
Ungünstigerweise zeigen Gelatine und ihre Derivate im Laufe der Zeit im Spektralbereich von 400 bis 460 nm einen leichten Farbwechsel, was eine schlechte Stabilität des Systems bewirkt.
Eine erhebliche Fortentwicklung ist im US-Patent 4 788 153 (Ausgabetag: 29. November 1988, Detwiler) beschrieben. Der darin beschriebene Bilirubintest wird an einem analytischen Element durchgeführt, das in der Reagenzschicht im wesentlichen frei von Gelatine ist. Ein alternatives Polymeres, Poly-(acrylamid-co-N-vinylpyrrolidinon), wurde als Reagenzschichtträger verwendet.
Dieses Polymere ist jedoch nicht vernetzbar und der strukturelle Zusammenhalt des Elementes kann während der Analyse nicht aufrechterhalten werden, was zu Störungen durch Hämoglobin und Delta-Bilirubin führt.
Es ist deshalb wünschenswert, für die Reagenzschicht Bindemittel bereitzustellen, die im Spektralbereich von 400 bis 460 nm kein Licht absorbieren und den strukturellen Zusammenhalt aufrechterhalten.
Die vorstehend beschriebenen Probleme werden durch ein analytisches Element zur Bestimmung von konjugiertem oder nicht-konjugiertem Bilirubin gelöst, das einen Träger umfaßt, auf dem in der angegebenen Reihenfolge folgende Bestandteile angeordnet sind:
(A) eine Reagenzschicht, die ein positiv geladenes, interaktives Beizmittel für Bilirubin enthält, wobei das Beizmittel in einem Bindemittel dispergiert ist, bei dem es sich um ein Copolymeres handelt, das abgeleitet ist von:
(1) einem oder mehreren Monomeren, die aus der Gruppe Acrylamid und N-Vinylpyrrolidinon ausgewählt sind; und
(2) einem oder mehreren vernetzbaren Monomeren, die aus der Gruppe (i) primäre Aminogruppen enthaltende Monomere, (ii) aktive Methylengruppen enthaltende Monomere und (iii) aktivierte Halogengruppen enthaltende Monomere ausgewählt sind;
(B) eine strahlungsblockierende Schicht; und
(C) eine poröse Verteilungsschicht.
Ferner stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von konjugiertem oder nicht-konjugiertem Bilirubin in einer wäßrigen Flüssigkeit bereit, das folgende Stufen umfaßt:
(A) Kontaktieren der wäßrigen Flüssigkeit mit dem vorstehend beschriebenen analytischen Element; und
(B) Messen der Menge des konjugierten oder nicht-konjugierten Bilirubins, das an das interaktive Beizmittel gebunden ist.
Das erfindungsgemäße Element kann zur Bestimmung sowohl von konjugiertem als auch von nicht-konjugiertem Bilirubin verwendet werden. Aufgrund des vernetzbaren Polymerträgers in der Reagenzschicht ist es für eine Zersetzung weniger anfällig als aus dem Stand der Technik bekannte Elemente. Bestimmte Polymere darunter sind hydrolytisch stabil, so daß die Vernetzung intakt bleibt und der Zusammenhalt der Beschichtung aufrechterhalten wird. Das erfindungsgemäße Element zeigt eine bessere Stabilität und weniger Störungen durch Serumpigmente, wie Hämoglobin.
Die Feststellung war überraschend, daß die Einverleibung von bestimmten Monomeren, die zur Vernetzung mit üblichen Härtungsmitteln befähigt sind, zu polymeren Bindemitteln führen kann, die derartige erhebliche Verbesserungen zeigen. Diese Ergebnisse waren unerwartet, weil die Vernetzung die Diffusion in die Reagenzschicht und aus dieser heraus beeinträchtigt und deshalb zu erwarten war, daß sie die Diffusion von Reagenzien in dem Element beeinträchtigt. Wie nachstehend erläutert, ist es wichtig, daß alle Reagenzien in dem Element in Fluidkontakt stehen.
Darüber hinaus weisen einige erfindungsgemäße Monomere reaktive Methylengruppen auf, von denen unter hohen pH-Bedingungen zu erwarten ist, daß sie zur Bildung von Kondensationsprodukten führen, die gelb gefärbte Störprodukte ergeben. Überraschenderweise traten keine Farbstörungen auf.
EP-A-0 345 794 beschreibt Copolymere aus vernetzten N-[1-(2-Oxo-1- pyrolidinyl)-ethyl]-(meth)acrylamid-Monomeren und (Meth)acrylderivat-Monomeren und ihre Verwendung für weiche Kontaktlinsen und zu medizinischen Zwecken aufgrund von guten mechanischen und optischen Eigenschaften, und einer hohen Sauerstoffpermeabilität. EP-A-0 345 794 bezieht sich jedoch nicht auf mehrschichtige analytische Elemente.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bestimmung von Bilirubin (konjugiertes oder nicht-konjugiertes) in wäßrigen Flüssigkeiten. Insbesondere kann die Erfindung zur Bestimmung von biologischen Flüssigkeiten von Tieren oder Menschen, vorzugsweise jedoch von Menschen, verwendet werden. Solche Flüssigkeiten umfassen (ohne Beschränkung hierauf) Vollblut, Plasma, Serum, Lymphflüssigkeit, Gallenflüssigkeit, Urin, Rückenmarkflüssigkeit, Sputum, Schweiß und dergleichen sowie Stuhlsekrete. Ferner ist es ist möglich, flüssige Präparate von menschlichem oder tierischem Gewebe, wie Skelettmuskel, Herz, Niere, Lungen, Gehirn, Knochenmark, Haut und dergleichen, zu bestimmen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit einem trockenen mehrschichtigen analytischen Element durchgeführt werden, das einen Träger umfaßt, auf dem eine Mehrzahl von einzelnen Schichten ausgebildet ist. Die oberste Schicht ist eine Verteilungsschicht zur gleichmäßigen Verteilung der wäßrigen Flüssigkeit über das Element. Serumproteine und andere Pigmente, wie Hämoglobin, verbleiben aufgrund ihrer Molekülgröße in der Verteilungsschicht. Eine strahlungsblockierende Schicht direkt unterhalb der Verteilungsschicht, gestattet die Diffusion von Bilirubin in die darunter liegende Reagenzschicht, hält jedoch Licht von dem in der Verteilungsschicht festgehaltenen Pigmenten ab. Die Unterschicht enthält ein Beizmittel zur Bindung von Bilirubin. Dieses Beizmittel erhöht auch das molare Absorptionsvermögen von Bilirubin und führt zu einer spektralen Verschiebung im nicht-konjugierten Rest, wodurch die gleichzeitige Analyse sowohl von konjugiertem als auch nicht-konjugiertem Bilirubin durch Ablesen der Reflexionsdichte bei 400 und 460 nm ermöglicht wird.
Zusätzlich zu den spektralen Verstärkungseigenschaften des Beizmittels hängt dieses System von der erfolgreichen Abtrennung des gebeizten Bilirubins unterhalb der strahlungsblockierenden Schicht und anderer Serumpigmente über der strahlungsblockierenden Schicht ab. Die Beizmittel/Reagenzschicht muß also frei von Pigmenten sein, die Licht im Spektralbereich von 400 bis 460 nm absorbieren.
Beim Träger kann es sich um ein beliebiges geeignetes formstabiles und vorzugsweise nicht poröses und transparentes (d.h. strahlungsdurchlässiges) Material handeln, das elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge zwischen 200 und 900 nm durchläßt. Ein Träger der Wahl für ein besonderes Element sollte mit dem beabsichtigten Nachweismodus verträglich sein (beispielsweise Reflexionsspektroskopie). Geeignete Träger können aus Polystyrol, Polyestern, Polycarbonaten, Celluloseestern und anderen aus dem Stand der Technik bekannten Materialien hergestellt werden.
Die äußerste Schicht ist eine poröse Verteilungsschicht, die aus beliebigen geeigneten faserigen oder nicht-faserigen Materialien oder aus Mischungen von faserigen und/oder nicht-faserigen Materialien hergestellt ist. Der hier verwendete Ausdruck "porös" bedeutet voll von Poren, so daß eine Flüssigkeit durch Kapillarwirkung absorbiert werden kann und zu weiteren Schichten in Fluidkontakt mit der porösen Schicht hindurchtreten kann. Das Hohlvolumen und die durchschnittliche Porengröße dieser Zone können in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Flüssigkeit variiert werden. Geeignete Verteilungsschichten können unter Verwendung von faserigen Materialien, entweder im Gemisch mit einem geeigneten Bindemittel oder in Form eines Gewebes, wie im US-Patent 4 292 272 beschrieben, polymerer Zusammensetzungen oder teilchenförmiger Materialien, beispielsweise in Form von mit oder ohne Bindungsklebstoffen gebundenen Kügelchen, wie in den US-Patenten 3 992 158, 4 258 001 und 4 430 436 und in JP-B- 57(1982)-101760 beschrieben, hergestellt werden. Es ist wünschenswert, daß die Verteilungszone isotrop porös ist, was bedeutet, daß die Porösität in jeder Richtung in der Zone gleich ist, was durch die verbundenen Zwischenräume oder Poren zwischen den Teilchen, Fasern oder polymere Stränge bewirkt wird.
Die Elemente können mehr als eine Verteilungsschicht aufweisen, wobei die einzelnen Schichten aus dem gleichen oder aus unterschiedlichen Materialien hergestellt sind und gleiche oder unterschiedliche Porösitäten aufweisen.
Ferner umfaßt das Element eine strahlungsblockierende Schicht, die ein geeignetes strahlungsblockierendes Pigment, beispielsweise Titandioxid oder Bariumsulfat, enthält, das in einem geeigneten hydrophilen Bindemittel verteilt ist, bei dem es sich um das gleiche Bindemittel wie in der Reagenzschicht oder um ein anderes Bindemittel handeln kann.
Das interaktive Beizmittel, das zur Bindung mit Bilirubin unter Bereitstellung eines nachweisbaren Produktes erforderlich ist, ist in einer unterhalb der strahlungsblockierenden Schicht befindlichen Reagenzschicht angeordnet. Die in der erfindungsgemäßen Praxis geeigneten interaktiven Beizmittel entsprechen den im US-Patent 4 069 017 (vorstehend aufgeführt) und den in der GB-Patentveröffentlichung 2 085 581 beschriebenen hydrophoben Aminen, von denen man annimmt, daß aus ihnen positiv geladene Beizmittel entstehen. Im allgemeinen weisen diese Beizmittel eine oder mehrere Bindungsstellen für Bilirubin auf und umfassen mindestens einen Rest mit einer hydrophoben organischen Matrix und einer ladungstragenden kationischen Gruppe. Derartige Beizmittel können monomer oder polymer sein. Bevorzugte Beizmittel sind Homopolymere und Copolymere mit den vorstehend aufgeführten Eigenschaften. Sie binden sowohl konjugierte als auch nicht-konjugierte Formen von Bilirubin.
Ferner enthält die Reagenzschicht ein hydrophiles Bindemittel, das für Bilirubin durchlässig ist. Wie vorstehend erwähnt, ist es bevorzugt, daß das Bindemittel keine Gelatine oder ein Gelatinderivat enthält. Dieses Bindemittel muß auch nicht-störend sein, d.h. es darf nicht den Beiz- bzw. Fixiervorgang von Bilirubin an das vorstehend beschriebene Beizmittel stören. Mit anderen Worten, sollte es zur Bindung oder Beizung bzw. Fixierung an Bilirubin fähig sein.
Eine Liste von geeigneten Beizmitteln und Bindemitteln ist US-Patent 4 788 153 aufgeführt. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten spezifischen hydrophilen Bindemittel sind nachstehend genauer beschrieben.
Weitere Schichten, beispielsweise Grund- oder Filterschichten, können gegebenenfalls im Element enthalten sein. Alle Schichten in dem Element stehen im allgemeinen in Fluidkontakt miteinander, was bedeutet, daß die Flüssigkeiten und die nicht-gebeizten Reagenzien und Reaktionsprodukte zwischen den übereinander gelagerten Bereichen von benachbarten Schichten hindurchtreten oder transportiert werden können.
Die erfindungsgemäßen Elemente sind abgesehen von den nachstehend beschriebenen interaktiven Beizmitteln frei von jeglichen interaktiven Zusammensetzungen, die eine kolorimetrische oder fluorimetrische Reaktion in Gegenwart von Bilirubin ergeben. Insbesondere sind sie frei von Diazoniumsalzen und nachweisbaren Liganden zur Bildung von nachweisbaren Spezies, die aus dem Stand der Technik zur Bilirubinbestimmung bekannt sind, beispielsweise aus den US-Patenten 4 069 016 und 4 548 905.
Die besonders geeigneten Bindemittel der vorliegenden Erfindung halten den strukturellen Zusammenhalt des Elements aufrecht, ohne Licht bei 400 oder 460 nm zu absorbieren. Die Bindemittel der vorliegenden Erfindung umfassen vernetzbare Copolymere, die abgeleitet sind von:
A) einem oder mehreren Monomeren, die 0 bis 99, vorzugsweise 40 bis 60 und insbesondere 45 bis 55 Gewichtsprozent des gesamten Bindemittelpolymeren umfassen, wobei das oder die Monomeren aus der aus Acrylamid- Monomeren und monomerem 1-Vinyl-2-pyrrolidinon bestehenden Gruppe ausgewählt sind. Beispiele für geeignete Acrylamid-Monomere sind Acrylamid, N- Isopropylacrylamid, N-(1,1-Dimethyl-3-oxobutyl)-acrylamid, 2-Acrylamido- 2-hydroxymethyl-1,3-propandiol, N-(3-Dimethylaminopropyl)-acrylamid, N,N- Dimethylacrylamid, N,N-Diethylacrylamid und 3-(2-Dimethylaminoethyl)- acrylamid, wobei unsubstituiertes Acrylamid besonders bevorzugt ist; und
B) einem oder mehreren Monomeren, die 1 bis 10 und vorzugsweise 2 bis 5 Gewichtsprozent des gesamten Bindemittelpolymeren umfassen, wobei das oder die Monomeren reaktive Gruppen aufweisen, die mit einem Vernetzungsmittel unter Vernetzung des Copolymeren reagieren können, und die aus folgenden Gruppen ausgewählt sind:
(i) primäre Aminogruppen enthaltende Monomere und Säureadditionssalze davon, wie N-(3-Aminopropyl)-methacrylamid-hydrochlorid, 2-Aminoethylmethacrylat-hydrochlorid und p-Aminostyrol;
(ii) aktive Methylengruppen enthaltende Monomere, d.h. Monomere mit einer Seitenkette der Formel
- - CH&sub2; - R&sub2;
worin R&sub2; eine Cyano-, Acyl- oder Alkoxycarbonylgruppe bedeutet, wobei es sich bei geeigneten Beispielen für Acrylester-Monomere, die solche Gruppen enthalten, um 2-Acetoacetoxyethylacrylat, 2-Acetoacetoxyethylmethacrylat, Ethyl-α-Acetoacetoxymethylacrylat sowie 2-Cyanoacetoxyethylmethacrylat handelt (beschrieben in den US-Patenten 3 459 790 und 3 554 987); Vinylmonomere, die derartige Gruppen enthalten, beispielsweise Ethylacryloylacetat, 6-(m- und p-Vinylphenyl)-2,4-hexandion (60:40); Ethyl-5-(m- und p-vinylphenyl)-3-oxopentanoat (60:40) und die entsprechenden Methylester sind in den US-Patenten 3 929 482, 3 939 130 und 3 904 418 beschrieben; Amid-Monomere, die derartige aktive Methylengruppen enthalten, beispielsweise N-(2-Acetoacetoxyethyl)-acrylamid, N-(2-Acetoacetamidoethyl)-methacrylamid, 4-Acetoacetyl-1-methacryloylpiperazin, Acetoacetamidoethylmethacrylat und N-(3-Acetoacetamidopropyl)- methacrylamid, sind in den US-Patenten 4 247 673 und 4 215 195 beschrieben;
(iii) aktivierte Halogengruppen enthaltende Monomere mit Halogenmethylaryl-, Halogenmethylcarbonyl-, Halogenmethylsulfonyl-, Halogenethylcarbonyl- und Halogenethylsulfonylseitenketten, die nach der Polymerisation ebenfalls eine Vernetzung mit einem geeigneten Vernetzungsmittel, wie einem Diamin, Dithiol, Diol und dergl., eingehen. Monomere mit derartigen Halogenmethylarylgruppen, beispielsweise Vinylbenzylchlorid und Vinylbenzylbromid, sind im US-Patent 4 017 442 beschrieben. Geeignete Monomere mit Halogenethylsulfonylseitenketten, beispielsweise m- und p-(2- Chlorethylsulfonylmethyl)-styrol und N-(4-Chlorethylsulfonylmethylphenyl)-acrylamid, sind in den US-Patenten 4 161 407 und 4 548 870 beschrieben. Zu Monomeren, die vernetzbare Halogenmethylcarbonyl-Gruppen bereitstellen, gehören Vinylchloracetat, N-(3-Chloracetamidopropyl)-methacrylamid, 2-Chloracetamidoethylmethacrylat, 4-Chloracetamidostyrol, m- und p-Chloracetamidomethylstyrol, N-(3-Chloracetamidocarbonyliminopropyl)-methacrylamid, 2-Chloracetamidocarbonyliminoethylmethacrylat, 4-Chloracetamidocarbonyliminostyrol, m- und p-Chloracetamidocarbonyliminomethylstyrol, N-Vinyl-N'-(3-chlorpropionyl)-harnstoff, 4-(3-Chlorpropionamido)-styrol, 4-(3-Chlorpropionamidocarbonylimino)-styrol, 2-(3- Chlorpropionamido)-ethylmethacrylat und N-[2-(3-Chlorpropionamido)ethyl]- methacrylamid.
Es ist bekannt, daß die Halogenethylsulfonyl- und Halogenethylcarbonylgruppen von Polymeren, die von derartigen Gruppen enthaltenden Monomeren abgeleitet sind, leicht zu Vinylsulfonyl- und Vinylcarbonylgruppen dehydrohalogeniert werden können, die ebenfalls mit den Amin- und Sulfhydrylgruppen leicht vernetzbar sind, die die erfindungsgemäßen Vernetzungsmittel enthalten. Derartige abgeleitete Polymere fallen ebenso unter die erfindungsgemäß geeigneten Polymeren.
Polymere mit aktiven Methylen- oder primären Amingruppen werden zweckmäßigerweise vernetzt mit herkömmlichen Gelatinehärtungsmitteln, wie Formaldehyd, Glyoxal und Dialdehyden, wie Succinaldehyd und Glutaraldehyd, z.B. gemäß US-Patent 3 232 764; aktiven Estern gemäß US-Patent 3 542 558; aktiven Halogenverbindungen gemäß US-Patenten 3 106 468 und 3 957 882; s-Triazinen gemäß US-Patent 3 325 287; Aziridinen gemäß US-Patent 3 575 705; aktiven Olefinen gemäß US-Patenten 3 490 911 und 3 640 720; Vinylsulfonen, wie ein Bis-(vinylsulfonylmethyl)-ether und Bis-(vinylsulfonyl)-methan gemäß US-Patent 3 841 872 und US-Patent 3 539 644; halogensubstituierten Aldehydsäuren, wie Mucochlor- und Mucobromsäuren; und polymeren Härtungsmitteln, wie Dialdehydstärken; Poly-(acrolein-co- methacrylsäure); Poly-(acrylamid-co-2-chlorethylsulfonylmethylstyrol); und Poly-(acrylamid-co-vinylsulfonylmethylstyrol).
Polymere mit aktiviertem Halogen können mit Mitteln mit zwei oder mehr Amino- oder Mercaptogruppen, wie Ethylendiamin, 1,3-Propandiamin, 1,3-Propandithiol, Dithiothreit, Dithioerythrit und Butylendiamin, vernetzt werden.
Insbesondere handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Polymeren um solche der Strukturformel
worin:
(A) wiederkehrende Struktureinheiten von einem oder mehreren polymerisierten Acrylamid-Monomeren des vorstehend beschriebenen Typs bedeutet;
(B) wiederkehrende Struktureinheiten von polymerisiertem 1-Vinyl-2- pyrrolidinon bedeutet;
R¹ Wasserstoff oder Methyl bedeutet;
L eine verknüpfende Gruppe bedeutet, bei der es sich um mindestens eine und vorzugweise eine Kombination von mindestens zwei Typen von Gruppen handelt, die unter Alkylengruppen mit 1 bis 30 und vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatomen; Arylengruppen mit 6 bis 12 Ringkohlenstoffatomen, wie Phenylen, Tolylen, Xylylen und Naphthylen, -Z- und -C(= O)-Z- ausgewählt sind, wobei Alkylen ein gerades oder verzweigtkettiges Alkylen und mit Heteroatomen oder Heteroatome enthaltenden Gruppen, wie Oxy, Thio, Imino,
unterbrochenes oder terminiertes Alkylen bedeutet, worin R³ Wasserstoff oder ein Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen), Ester (-COO-), Amid (-CONH-), Ureylen (-NHCONH-), Sulfonyl (-SO&sub2;-) und Urethan (-NHCOO) bedeutet;
Z die Bedeutung 0, Imino
wie vorstehend definiert) oder eine N,N'-Heterocyclylengruppe mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen und Heteroringatomen, wie 1,4-Piperazinylen, bedeutet;
R² eine reaktive Gruppe bedeutet, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
i) primäre Aminogruppen und Säureadditionssalze davon, d.h. -NH&sub2; und -NH&sub2; HX, worin X ein Säureanion, wie Halogenid, z.B.Chlorid, Bromid, Fluorid und Iodid, ist;
ii) eine aktive Methylengruppe, d.h. eine Gruppe mit einem sauren Wasserstoffatom, das durch eine nucleophile Gruppe leicht ersetzt wird, vorzugsweise mit der Struktur (-C(=O)-CH&sub2;R&sup4;), worin R&sup4; Cyano, Acyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Acetyl, Propionyl, Butyryl und dergl., vorzugsweise Acetyl oder eine Estergruppe (-C(=O)OR&sup5;) bedeutet, worin R&sup5; eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; und
iii) eine aktivierte Halogengruppe, ausgewählt unter Halogenmethylaryl, wie Chlormethylphenyl, Halogenmethylcarbonyl, wie Chloracetyl, Halogenethylcarbonyl, wie 3-Chlorpropionyl, und Halogenethylsulfonyl, wie 2-Chlorethylsulfonyl, wobei die aktivierten Halogengruppen vorzugsweise die Struktur:
HALO-CH&sub2;-R&sup6;-
aufweisen, worin HALO ein Halogenatom, vorzugsweise Chlor oder Brom, bedeutet und -R&sup6;- Carbonyl, eine Ester- (-COO-), Amid- (-C(=O)NH-), Methylencarbonyl- oder Methylensulfonylgruppe oder eine kovalente Bindung der HALO-CH&sub2;-Gruppe direkt an den aromatischen Ring einer Arylengruppe in der verknüpfenden Kette, beispielsweise an eine Phenylen-, Tolylen-, Xylylen- oder Naphthylengruppe, in der verknüpfenden Kette bedeutet, und
x, y und z Gewichtsprozent, in der Summe 100, der Struktureinheiten bedeuten, so daß x 0 bis 99, vorzugsweise 40 bis 60 und insbesondere 45 bis 55 beträgt, y 0 bis 99, vorzugsweise 40 bis 60 und insbesondere 45 bis 55 beträgt, und z 1 bis 10 und vorzugsweise 2 bis 5 Gewichtsprozent beträgt.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Polymeren erfolgt über herkömmliche Additionspolymerisationstechniken, wie unter Verwendung von Redoxinitiatorsystemen, z.B. Persulfat-Bisulfit oder Wasserstoffperoxid, oder von organischen, löslichen, freie Radikale erzeugenden Initiatorsystemen, wie 2,2'-Azobis-(2-methylpropionitril). Wir ziehen die Verwendung eines Wasserstoffperoxidinitiators einem herkömmlichen Lösungspolymerisationsverfahren vor, vorzugsweise unter Verwendung eines Gemisches aus Wasser und Isopropanol als Lösungsmittel.
Die Menge an hydrophilem Bindemittel in der Beizschicht sollte ausreichend sein, um das Beizmittel darin ausreichend zu dispergieren und einen geeigneten Film zu bilden. Ferner hängt die Menge vom Typ des verwendeten Polymerbeizmittels ab. Handelt es sich beim Beizmittel um ein filmbildendes Polymeres, kann weniger Bindemittel erforderlich sein. Im allgemeinen beträgt die Menge an Bindemittel 2 bis 20 g/m², wobei Mengen von 5 bis 20 g/m² bevorzugt sind.
Weitere fakultative Additive (einschließlich Puffer, oberflächenaktive Mittel und dergleichen) können gegebenenfalls zu einer oder mehreren Schichten des Elements zugesetzt werden. Ferner sind im Element ein oder mehrere Bilirubin-Effektoren oder -Promotoren, wie sie ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt sind, von Nutzen. Zu derartigen Materialien gehören Natriumbenzoat, Coffein, Gummi arabicum, Salicylat, Gallensalze und deren Gemische. Vorzugsweise sind diese Materialien in der porösen Verteilungsschicht der Elemente enthalten.
Eine Vielzahl unterschiedlicher Elemente kann je nach dem Testverfahren in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Die Elemente können in einer Vielzahl von Formen, einschließlich länglichen Bändern von beliebiger gewünschter Breite, Bahnen, Objektträgern oder Chips, ausgebildet sein. Im allgemeinen handelt es sind bei den Elementen um einzelne Objektträger, die zusammen in Patronen zur Verwendung in automatischen Analysatoren verpackt werden.
Der erfindungsgemäße Test kann manuell oder automatisch durchgeführt werden. Im allgemeinen wird bei Verwendung der Trockenelemente die Bilirubinbestimmung durch Entnehmen des Elements von einer Vorratsrolle, einem Chip-Paket oder einer anderen Quelle und physikalisches Kontaktieren mit einer Probe (z.B. bis zu 200 µl) der zu untersuchenden Flüssigkeit durchgeführt, wobei die Probe und die Reagenzien (d.h. das interaktive Beizmittel) innerhalb des Elements vermischt werden. Ein derartiger Kontakt kann in einer beliebigen geeigneten Weise, wie durch Eintauchen des Elements in die Flüssigkeit oder vorzugsweise durch manuelles oder maschinelles Betupfen des Elements mit einem Tropfen der Flüssigkeit mit einer geeigneten Spendervorrichtung, ausgeführt werden.
Nach dem Auftragen der Flüssigkeit kann das Element einer Konditionierung, z.B. einer Inkubation, Erwärmung oder dergleichen, ausgesetzt werden, die erwünscht sein kann, um das Erhalten von beliebigen Testergebnissen zu beschleunigen oder anderweitig zu erleichtern.
Wenn das Beizmittel an Bilirubin bindet, ergibt sich eine nachweisbare Änderung, die unter Verwendung einer geeigneten Vorrichtung zur Reflexionsspektrophotometrie leicht gemessen wird. Eine derartige Vorrichtung ist auf dem einschlägigen Gebiet bekannt. Das Signal aus der so gemessenen, nachweisbaren Spezies stellt ein Maß für die Menge an Bilirubin in der getesteten Flüssigkeit dar.
Das Verfahren und die Elemente der Erfindung können zur Messung sowohl von konjugierten als auch nicht-konjugierten Formen von Bilirubin gemäß dem vorstehend genannten US-Patent 4 338 095 (auf das durch Verweis Bezug genommen wird) verwendet werden. Im allgemeinen wird diese selektive Messung einer oder beider Formen von Bilirubin durch Kontaktieren der Flüssigkeit und des Elements auf die vorstehend beschriebene Weise und durch Messen der Absorptions- oder Emissionsspektren bei zwei oder mehreren Wellenlängen und Vornehmen der geeigneten Berechnungen, durchgeführt.
Die im erfindungsgemäßen Element verwendeten, vernetzbaren Copolymeren werden wie folgt hergestellt.

Herstellung von N-(3-Acetoacetamidopropyl)-methacrylamid

Triethylamin (24 g, 0,24 Mol) wurde bei 0ºC in eine Lösung von N-(3- Aminopropyl)-methacrylamid-hydrochlorid (40 g, 0,24 Mol) und Diketen (20 g, 0,24 Mol) in Methanol (800 ml) getropft. Nach der Zugabe wurde die Temperatur 2 Stunden unter Rühren bei 0ºC gehalten. Der Rührvorgang wurde 20 Stunden bei 20ºC fortgesetzt. Das Lösungsmittel wurde sodann entfernt. Der Rückstand wurde in Chloroform (1 Liter) gelöst, mit 5%-iger Salzsäure (200 ml) gewaschen, mit gesättigtem NaHCO&sub3; (200 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das überschüssige Lösungsmittel wurde entfernt. Der Rückstand wurde aus Benzol (500 ml) und Ethylether (500 ml) umkristallisiert. Man erhielt N-(3-Acetoacetamidopropyl)-methacrylamid (Schmelzpunkt = 93º-94ºC) in einer Ausbeute von 50%.

Herstellung von N-(3-Chloracetamidopropyl)-methacrylamid

In einen mit einem Kühler, Rührer und 2 Tropftrichtern ausgerüsteten, 3 Liter fassenden Vierhalskolben wurden N-(3-Aminopropyl)-methacrylamid-hydrochlorid (157 g, 0,88 Mol) in Methanol (1,2 l) und 2,6-Di- tert.-butyl-p-cresol (1,0 g) vorgelegt. In einen Trichter wurde Chloracetylchlorid (100 g, 0,89 Mol) gegeben und in den zweiten Trichter wurde Triethylamin (178 g, 1,76 Mol) eingebracht. Die Lösung wurde auf 0-5ºC (Eis/Methanol) gekühlt und in einem langsamen Strom innerhalb von 30 Minuten mit Triethylamin versetzt. Das Chloracetylchlorid wurde innerhalb von 1 Stunde zugesetzt. Nach der Zugabe wurde die Temperatur für 2 Stunden bei 0ºC gehalten, das Eisbad wurde entfernt, und das Rühren bei Raumtemperatur über Nacht fortgesetzt. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und der Rückstand wurde mit heißem Ethylacetat (500 ml) versetzt. Die Mischung wurde zur Entfernung von Triethylamin-hydrochlorid filtriert. Der Feststoff wurde mit heißem Ethylacetat (500 ml) gewaschen und erneut filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde mit einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde aus Ethylacetat (400 ml) unter Erwärmen zur Bildung einer Lösung, Filtrieren zur Entfernung von etwaigen vorhandenen Feststoffen und Abkühlen auf 0ºC kristallisiert. Das rohe Monomere wurde durch Chromatographie an einer mit Kieselgel gepackten Säule gereinigt. Das Produkt wurde sodann aus der Säule unter Verwendung eines 1:1-Gemisches aus Ethylacetat und Dichloromethan (4 l) eluiert. Das gewonnene Lösungsmittel wurde abgedampft, und der Rückstand wurde aus Ethylacetat (300 ml) mit 2,6-Di-tert.-butyl-p-cresol (500 mg) kristallisiert. Man erhielt eine weiße kristalline Verbindung vom F. 85-90ºC in einer Ausbeute von 83 g (43 %). Analyse ber. für C&sub9;H&sub1;&sub5;ClN&sub2;O&sub2;: C, 49,4; H, 6,9; N, 12,8; Cl, 16,2. Gef.: C, 49,0; H, 7,6; N, 13,2; Cl, 17,3.

Herstellung von Poly-(acrylamid-co-N-vinyl-2-pyrrolidinon-co-N-(3- acetoacetamidopropyl)-methacrylamid] (Gewichtsverhältnis 48,75/48,75/2,5)

Eine Lösung von Acrylamid (105,3 g, 1,4 Mol), N-Vinyl-2-pyrrolidinon (105,3 g, 0,94 Mol), N-(3-Acetoacetamidopropyl)-methacrylamid (5,4 g, 0,024 Mol) und Wasserstoffperoxid (8,0 g, 30 % in Wasser) in H&sub2;O (1,8 l) und Isopropanol (400 ml), die mit Stickstoff entgast worden war, wurde bei 65-70ºC unter einer Stickstoffatmosphäre 5 Stunden erwärmt und sodann über Nacht bei Umgebungstemperatur stehengelassen. Am nächsten Tag wurde die Lösung bei geringer Hitze (40-50ºC) mit einem Rotationsverdampfer auf 1 l (20,5 % Feststoffgehalt) eingeengt. Diese Lösung wurde direkt für die Beschichtung verwendet.

Herstellung von Poly-[acrylamid-co-N-vinyl-pyrrolidinon-co-N-(3-aminopropyl)-methacrylamid-hydrochlorid] (Gewichtsverhältnis 48,75/48,75/2,5)

Dieses Material wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 3 hergestellt, mit der Ausnahme, daß das Polymere in Aceton (5 Gallonen) ausgefällt, filtriert, in einem Vakuumofen getrocknet und in H&sub2;O bei 17,4 % Feststoffgehalt wieder aufgelöst wurde. Ferner wurde N-(3-Aminopropyl)- methacrylamid-hydrochlorid anstelle von N-(3-Acetoacetamidopropyl)- methacrylamid verwendet.

Herstellung von Poly-[acrylamid-co-N-vinyl-pyrrolidinon-co-N-3- chloracetamidopropyl)-methacrylamid] (Gewichtsverhältnis 48,75/48,75/2,5)

Dieses Material wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 4 hergestellt, mit der Ausnahme, daß N-(3-Chloracetamidopropyl)-methacrylamid anstelle von N-(3-Aminopropyl)-methacrylamid-hydrochlorid verwendet wurde.

Beispiel 1 Vergleich der Elemente mit unterschiedlichen Bindungsmitteln in der Reagenzschicht

Dies ist ein Vergleich zwischen dem erfindungsgemäßen Element und zwei Kontrollelementen. Die zwei Kontrollelemente wurden in gleicher Weise wie das erfindungsgemäße Element hergestellt, mit der Ausnahme, daß ein Kontrollelement gehärtete Gelatine als Bindemittel in der Reagenzschicht und das andere Poly-(acrylamid-co-N-vinyl-2-pyrrolidon) (Gewichtsverhältnis 50/50) aufwies.
Das erfindungsgemäße Element entsprach in Aufbau und Bestandteilen den nachstehenden Angaben. Die zur Beschreibung des Gewichts der Komponenten verwendete Bezeichnung "trocken" gibt an, daß die Überzugsmenge als Trockengewicht nach den normalen Beschichtungs- und Trocknungsvorgängen bestimmt wurde. Tabelle I Beschichtungsaufbau

Erläuterung:

Polymer i ist Poly-(acrylamid-co-N-vinylpyrrolidion-co-N-(3-aminopropyl)-methacrylamid-hydrochlorid)
Polymer ii ist Poly-(acrylamid-co-N-vinyl-2-pyrrolidinon-co-N-(3- aceto-chloracetamidopropyl)-methacrylamid)
Polymer iii ist Poly-(acrylamid-co-N-vinylpyrrolidinon-co-N-(3-chloracetamidopropyl)-methacrylamid)
Triton X-405 ist ein Octylphenoxypolyethoxyethanol-Tensid der Fa. Rohm und Haas Co. (Rechte erworben durch die Fa. Union Carbide Co.).
Brij 78 ist ein Polyoxyethylenstearylether-oberflächenaktives Mittel, der Fa. ICI Americas Inc..
Estane ist ein Polyesterpolyurethan der Fa. B.F. Goodrich.
Ottasept ist ein bakterizides Mittel.
Gel ist entionisierte Gelatine.
Oberflächenaktives Mittel 10G ist ein Nonylphenoxypolyglycidol der Fa. Olin Chem. Co.
Daxad ist das Natriumsalz eines Carbonsäurepolymeren-Tensid/Dispersionsmittels der Fa. von W. R. Grace.
Das Beizmittel ist ein kationisches Polymerbeizmittel des im US-Patent 4 338 095 beschriebenen Typs.
Bicine ist ein N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-glycin-Puffer.
Die Wirksamkeit des Bindemittels in der Reagenzschicht von fünf verschiedenen Elementen wurde wie folgt bewertet. Ein Pool von Seren von Neugeborenen wurde in fünf Pools unterteilt und mit 0, 50, 100, 200 und 300 mg/dl Hämoglobin in der Form eines Hämolysats versetzt. Die Pools mit diesen Zusätzen wurden dann untersucht. Bu- und Bc-Vorhersagen wurden erhalten. Die zu testenden Objektträger wurden an einem KODAK EKTACHEM-Analysator unter Verwendung von Standardkalibratoren kalibriert. Die Änderungen der vorhergesagten Bu- und Bc-Konzentrationen wurden als eine Funktion der Hämoglobinkonzentration tabellarisch zusammengestellt.
Tabelle II veranschaulicht die Ergebnisse für die fünf Typen der getesteten Elemente. Tabelle II Änderungen in den vorhergesagten Konzentrationen aufgrund der Hämoglobinzugabe:
Das Polymere iii wurde mit Dithiothreit (DTT) vernetzt. Die anderen Bindemittel wurden mit Bis-(vinylsulfonylmethylether (BVSME) vernetzt.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß alle vernetzbaren Bindemittel (Gelatine und Polymere i, ii und iii) eine geringere, auf Hämoglobin zurückzuführende Änderung ergeben. Insbesondere zeigt das Polymere ii die geringste Änderung. Somit sind diese Polymeren und Gelatine gegen den Einfluß von Hämoglobin weniger empfindlich. Diese Polymeren sind hydrolytisch stabil und so ist zu erwarten, daß die Vernetzung intakt bleibt und der Zusammenhalt des Überzugs erhalten bleibt.

Claims

1. Analytisches Element zur Bestimmung von konjugiertem oder nicht-konjugiertem Bilirubin, umfassend einen Träger, auf dem in der angegebenen Reihenfolge vom Träger aus angeordnet sind:

(A) eine Reagenzschicht, die ein positiv geladenes, interaktives Beizmittel für Bilirubin enthält, wobei das Beizmittel in einem Bindemittel dispergiert ist;

(B) eine strahlungsblockierende Schicht; und

(C) eine poröse Verteilungsschicht;

dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim Bindemittel um ein Copolymeres handelt, das abgeleitet ist von:

(1) einem oder mehreren Monomeren, die aus der Gruppe Acrylamid und N-Vinylpyrrolidinon ausgewählt sind; und

(2) einem oder mehreren vernetzbaren Monomeren, die aus der Gruppe (i) primäre Aminogruppen enthaltende Monomere; und (ii) aktivierte Halogengruppen enthaltende Monomere ausgewählt sind.

2. Analytisches Element nach Anspruch 1, wobei das Bindemittel in der Reagenzschicht folgende Strukturformel aufweist

worin:

(A) Struktureinheiten von einem oder mehreren polymerisierten Acrylamid-Monomeren bedeutet;

(B) Struktureinheiten von polymerisiertem 1-Vinyl-2-pyrrolidinon bedeutet;

R¹ Wasserstoff oder Methyl bedeutet;

R² eine reaktive Gruppe bedeutet, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist:

i) eine primäre Aminogruppe und Säureadditionssalze davon; und ii) eine aktivierte Halogengruppe;

L eine verknüpfende Gruppe bedeutet; und

x, y und z die gewichtsprozentualen Anteile der Struktureinheiten im Bindemittel-Polymeren bedeuten, wobei x = 0- 99, y = 0-99 und z = 1-10.

3. Analytisches Element nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich beim Bindemittel in der Reagenzschicht um Poly- [acrylamid-co-N-vinylpyrrolidinon-co-N-(3-aminopropyl)- methacrylamid-hydrochlorid] handelt.

4. Analytisches Element nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich beim Bindemittel in der Reagenzschicht um Poly- [acrylamid-co-N-vinylpyrrolidinon-co-N-(3-chloracetamidopropyl)-methacrylamid] handelt.

5. Element nach Anspruch 1 oder 2, wobei die strahlungsblockierende Schicht anorganische Pigmentteilchen umfaßt, die in einem Bindemittel ähnlich dem Bindemittel in der Reagenzschicht dispergiert sind.

6. Element nach Anspruch 1 oder 2, wobei die strahlungsblockierende Schicht anorganische Pigmentteilchen umfaßt, die in einem Bindemittel, das vom Bindemittel in der Reagenzschicht abweicht, dispergiert sind.

7. Analytisches Element zur Bestimmung von konjugiertem oder nicht-konjugiertem Bilirubin, umfassend einen Träger, auf dem in der angegebenen Reihenfolge angeordnet sind:

(A) eine Reagenzschicht, die ein positiv geladenes, interaktives Beizmittel für Bilirubin umfaßt, wobei das Beizmittel in einem ersten hydrophilen Bindemittel dispergiert ist;

(B) eine strahlungsblockierende Schicht, die ein anorganisches Pigment umfaßt, das in einem zweiten hydrophilen Bindemittel dispergiert ist; und

(C) eine poröse Verteilungsschicht; dadurch gekennzeichnet, daß das erste Bindemittel aus der Gruppe Poly-[acrylamid-co-N-vinylpyrrolidinon-co-N-(3- aminopropyl)-methacrylamid-hydrochlorid] und Poly-[acrylamid- co-N-vinylpyrolidinon-co-N-(3-chloracetamidopropyl)- methacrylamid] ausgewählt ist.

8. Verfahren zur Bestimmung von konjugiertem oder nicht-konjugiertem Bilirubin, umfassend folgende Stufen:

(A) Kontaktieren einer wäßrigen Flüssigkeit mit dem analytischen Element von Anspruch 1; und

(B) Messen der Menge des konjugierten oder nicht-konjugierten Bilirubins, das an das interaktive Beizmittel gebunden ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das konjugierte und nicht-konjugierte Bilirubin durch spektrophotometrische Messungen bei mehr als einer Wellenlänge bestimmt werden.