DE69620825T2

DE69620825T2 - Trockenes analytisches Element für Acetaminophenassay

Info

Publication number: DE69620825T2
Application number: DE69620825T
Authority: DE
Inventors: Thomas C. Arter; John C. Mauck; James R. Schaeffer; Robert F. Winterkorn
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1995-06-22
Filing date: 1996-06-21
Publication date: 2002-10-10
Anticipated expiration: 2016-06-22
Also published as: ATE216776T1; CA2178048C; CN1114103C; EP0750197A3; EP0750197B1; CA2178048A1; JPH09298A; AU713196B2; JP4001953B2; CN1155658A; AU5592996A; DE69620825D1; EP0750197A2

Description

ERFINDUNGSGEBIET

Diese Erfindung betrifft einen spektrophotometrischen Assay für den Nachweis von Acetaminophen in wäßrigen Flüssigkeiten, der mit einem trockenen analytischen Element durchgeführt wird.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Acetaminophen ist ein in großem Umfang eingesetztes Analgetikum. Es ist ohne Verschreibung erhältlich und wird oft verwendet, wenn Aspirin für einen Patienten Probleme darstellen könnte. Bei therapeutischen Dosen liegt die Serumkonzentration üblicherweise unter 50 mg/l. Toxizität wird üblicherweise beobachtet, wenn die Serumkonzentration vier Stunden nach Einnahme des Arzneimittels höher ist als 300 mg/l. Ein Effekt einer Überdosis ist Lebertoxizität. Das Bedürfnis nach einem genauen Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Acetaminophen in Serum ist daher offensichtlich.
Bekannte Verfahren zum Testen auf Anilide wie etwa Acetaminophen setzen Arylacylamidase (E.C.3.5.1.13) und ein Oxidationsmittel ein. Arylacylamidase spaltet die Amidbindung des Anilids, um Acetat und ein Anilin wie etwa p-Aminophenol zu liefern. Das Anilin läßt man anschließend mit einer farbbildenden Verbindung wie Phenol in der Gegenwart eines Oxidationsmittels wie etwa Permanganat oder den Metallsalzen von Kupfer oder Eisen reagieren, um eine Farbverbindung wie Indophenol zu bilden, die bei 615 nm nachgewiesen werden kann. Andere Verfahren verwenden Oxidationsmittel wie Periodate oder Persulfate. US-Patente 4,999,288 und 4,430,433 sind typisch.
Ein Nachteil dieser Verfahren ist, daß die meisten Metallsalze das Anilin sehr langsam oxidieren, sofern sie nicht bei alkalischem pH liegen, eine Bedingung, die Arylacylamidase inaktiviert.
US-Patent 4,675,290 (erteilt am 23. Juni 1987 für Matsumoto) offenbart ein Verfahren zum Testen von Peptidase auf Enzymaktivität, welches das Behandeln eines synthetischen dibromierten Amids (als Substrat) mit einer Probe, die Peptidase enthält, wodurch ein dibromiertes Anilin freigesetzt wird; Oxidieren des so freigesetzten dibromierten Anilins mit einer Oxidase (z. B. Ascorbatoxidase), die Sauerstoff verbraucht und Pigment durch oxidative Kondensation von besagtem Anilin in Gegenwart eines Kopplungsmittels mit einer definierten Formel bildet, umfaßt. Diese Reaktion findet in Lösung statt.
Matsumotos Verfahren verwendet ein Enzym und könnte daher die Probleme überwinden, auf die man mit den anorganischen Oxidationsmitteln aus dem Stand der Technik trifft. Matsumoto setzt jedoch ein synthetisches dibromiertes Substrat ein und ist daher nicht direkt auf einen Test auf Acetaminophen anwendbar. Es gibt Belege im Stand der Technik, daß im Falle oxidativer Kopplung von Phenolen zur Farbbildung die Farbausbeute erhöht werden kann, wenn bestimmte Halogenphenole in der farbbildenden Reaktion verwendet werden. Acetaminophen, wie es in zu testenden biologischen Flüssigkeiten auftritt, ist jedoch nicht halogeniert und ist daher chemisch von dem dibromierten synthetischen Substrat, das in Matsumotos Verfahren verwendet wird, unterscheidbar.
Weiterhin offenbart Matsumoto einen Lösungsassay. Ein alternativer und bequemerer Assay umfaßt "trockene" Chemie, ein Begriff, der sich auf Verfahren und Techniken bezieht, die unter Verwendung von chemischen Reagenzien durchgeführt werden, die in verschiedenen "sich trocken anfassenden" Testelementen enthalten sind, wie etwa "Eintauchen-und-Ablesen"- Teststreifen, mehrschichtigen Testelementen und dergleichen. "Trockene" Verfahren erfordern keine andere Flüssigkeit zur Rekonstitution oder Analyse als die Testprobe.
In Lösungsassays eingesetzte Reagenzien zeigen oft keine gute Leistung, wenn sie auf ein Trockenformat adaptiert werden. Trockene Elemente setzen sehr geringe Mengen von Reagenzien und Testproben ein und somit ist es, bei einem Trockenelement für einen Acetaminophen-Assay, wichtig, Reagenzien einzusetzen, die ein deutliches und genaues Farbsignal geben, wenn Anilin oxidativ an ein Kopplungsmittel gekoppelt wird, um Farbe zu liefern.
Der Bereich von Verbindungen, die als potentielle Kopplungsmittel ausgewählt werden könnten, ist sehr breit. Matsumoto schlägt jene farbbildenden oxidativen Kopplungsmittel, die bei Trockenchemie eine gute Leistung zeigen würden, weder vor noch gibt irgendeinen Hinweis hierfür. Das Problem ist, daß die Auswahl eines geeigneten oxidativen Kopplungsmittels für ein trockenes Element im wesentlichen empirisch ist.
Es wäre wünschenswert, einen Trockenassay zur Bestimmung von Acetaminophen in biologischen Flüssigkeiten zur Verfügung zu haben, der Enzyme oder andere Reagenzien umfaßt, die aktiv bleiben, wenn sie zusammengebracht und in trockenem Format als Überzug aufgebracht werden, und die ein deutliches und genaues Signal bei oxidativer Kopplung mit einem geeigneten Kopplungsmittel geben.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung wählt ein Kopplungsagens zur Verwendung aus, das eine nachweisbare Farbveränderung und genaue Bestimmung von Acetaminophen in einem Trockenformat liefert. Es wurde entdeckt, daß ein wasserlösliches Kopplungsagens erforderlich war und daß ein wasserunlösliches Kopplungsagens, selbst wenn es ausreichend dispergiert ist, nicht gut funktionierte.
Das Element der vorliegenden Erfindung vermeidet die anorganischen Oxidationsmittel, die vom Stand der Technik gelehrt werden, und verwendet statt dessen milde Oxidationsmittel, die ein Ferricyanid umfassen. In trockenen analytischen Elementen ist von Oxidationsmittel wie Cu&spplus;&spplus;- und den meisten Fe&spplus;&spplus;&spplus;-Salzen bekannt, daß sie eine Gelatinematrix durch Vernetzung und somit Aushärten der Gelatine angreifen.
Das Ferricyanid ist nicht ein so starkes Oxidationsmittel wie die meisten Fe&spplus;&spplus;&spplus;-Salze oder andere Metall-Oxidationsmittel (siehe Tabelle A). Es ist daher unerwartet, daß ein Ferricyanid in der Lage wäre, schnelle Reaktionskinetiken bei neutralen pHs zu liefern, ohne daß es die Trockenelementstruktur schädigt. Geeignete Ferricyanide schließen die Alkalimetall- und Erdalkalimetallferricyanide ein, wie etwa z. B. Kalium-, Natrium- und Calciumferricyanid. Die bevorzugten Ferricyanide sind die Alkalimetallferricyanide.
Demgemäß wird ein analytisches Element zur Bestimmung von Acetaminophen in einer wäßrigen Flüssigkeit bereitgestellt, welches einen Träger umfaßt, auf dem mindestens eine Reagenzschicht aufgebracht ist, und wobei in der Reagenzschicht oder den Reagenzschichten enthalten ist:
ein Arylacylamidaseenzym;
ein Ferricyanid, das in der Lage ist, Paraaminophenol unter Bildung einer Farbkomponente oxidativ an ein Kopplungsagens zu binden;
ein wasserlösliches, farbbildendes Kopplungsagens der allgemeinen Struktur:
wobei R eine wasserlöslich machende Gruppe ist, ausgewählt aus -(CH&sub2;)nX, wobei n 1 bis 5 und X -SO&sub3;M ist, wobei M Wasserstoff, ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder ein Ammonium(NH&sub4;&spplus;)-Kation ist oder -N(R&sub7;)&sub3;&spplus;Z&supmin;, wobei jedes R&sub7; unabhängig aus Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie etwa Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl, ausgewählt ist und 2 ein Säureanion ist, wie etwa Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid, p-Toluolsulfonat und dergleichen, oder X (-OCH&sub2;CH&sub2;)yOH ist, wobei y 2 bis 5 ist;
R&sub1; und R&sub6; zusammengenommen eine Ethylen-, Trimethylen- oder Tetramethylengruppe darstellen, welche einen partiell ungesättigten Ring bildet;
R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung von Acetaminophen in einer wäßrigen Flüssigkeit bereit, welches die Schritte umfaßt:
Kontaktieren einer Probe der wäßrigen Flüssigkeit mit dem oben beschriebenen analytischen Element; und
Korrelieren der Menge der gebildeten Farbkomponente mit der Konzentration des Acetaminophens in der Flüssigkeit.
Ein Vorteil der Erfindung ist, daß die Kopplung des wasserlöslichen Kopplungsagens und des Ferricyanids eine schnelle Reaktion ermöglichen. Wir waren in der Lage, ein nachweisbares Farbsignal in 57 Sekunden zu entwickeln. Wasserunlösliche Kopplungsagentien bringen sehr viel langsamere Reaktionen mit sich.
Vorzugsweise ist das Ferricyanid ein Ferricyanidsalz eines Alkalimetalls.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist ein Diagramm, das die Leistung eines Vergleichselementes zeigt, wenn 1-(3-Sulfopropyl)-1,2,3,4-tetrahydrochinolin (Verbindung Nr. 2, THQSO&sub3;H) als das Kopplungsagens verwendet wird.
Fig. 2 ist ein Diagramm, das die Leistung eines Vergleichselementes unter Verwendung von 1-(n-Butyl)-1,2,3,4-tetrahydrochinolin (Verbindung Nr. 1, BTHQ) als das Kopplungsagens zeigt.
Fig. 3 ist ein Diagramm, das die Leistung eines weiteren Vergleichselementes unter Verwendung von 1,2,3,5,6,7-Hexahydrobenzo[ij]chinolizin (Verbindung Nr. 4, Julolidin) als das Kopplungsagens zeigt.
Fig. 4 ist ein Diagramm, das die Leistung eines analytischen Elementes der Erfindung unter Verwendung von 1-(3-Sulfopropyl)-1,2,3,4- tetrahydrochinolin (Verbindung Nr. 2, THQSO&sub3;H) als das Kopplungsagens und unter Verwendung von Kaliumferricyanid als das Oxidationsmittel zeigt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung offenbart einen kolorimetrischen Assay zur Bestimmung von Acetaminophen auf der Basis der enzymatischen Hydrolyse von Acetaminophen und dem anschließenden Nachweis eines Metaboliten der Hydrolyse. Genauer gesagt verwendet der Assay ein Enzym, Arylacylamidase (E.C.3.5.1.13), um die Amidbindung von Acetaminophen zu spalten, um Essigsäure und p-Aminophenol zu erzeugen. Ferricyanid wird verwendet, um das p- Aminophenol zu oxidieren, so daß es an ein wasserlösliches Kopplungsagens, wie hierin definiert, koppelt, um einen Farbstoff zu bilden. Der Farbstoff ist bei 670 nm nachweisbar. Die Reaktion läuft wie folgt ab:
Die wasserlöslichen Kopplungsagentien, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, wurden durch Screening und Auswahl unter mehreren verschiedenen Kopplungsmitteln ähnlicher Struktur identifiziert. Diejenigen, die unlöslich waren, lieferten nicht genügend Kopplung (Farbstoffbildung) unter den Testbedingungen, um genügend Extinktion für die analytische Diskrimination eines breiten dynamischen Bereiches von Analytkonzentrationen zu erzeugen. Diejenigen mit der hierin zuvor beschriebenen Struktur und wobei R&sub1; und R&sub6; zusammengenommen Trimethylen darstellen, d. h. einen partiell gesättigten 6-gliedrigen, stickstoffhaltigen heterozyklischen Ring vervollständigen, besitzen besonders wünschenswerte Absorptionsmaxima (etwa 670 nm) und sind besonders nützlich in analytischen Elementen, weil die Absorption nicht durch Interferenten maskiert wird, wie etwa Bilirubin, die bei niedrigeren Wellenlängen absorbieren. Die bevorzugte wasserlösliche Spezies ist 1-(3-Sulfopropyl)-1,2,3,4-tetrahydrochinolin. Die Screeningverfahren und ihre Ergebnisse sind im folgenden hierin beschrieben. Die Menge an Farbkomponente, die am Ende der Reaktion gebildet wird, zeigt die Konzentration an Acetaminophen in der Testprobe an.
Die oben beschriebenen Reagenzien werden auf einen Träger als Überzug aufgebracht, um ein trockenes analytisches Element der Erfindung zu liefern. Elemente können in einer Vielzahl von Formen konfiguriert werden, einschließlich länglicher Bänder jeder gewünschten Breite, Blätter, Objektträger oder Chips.
Die Elemente können in manuellen oder automatisierten Assaytechniken verwendet werden. Im allgemeinen wird die Acetaminophen-Bestimmung, bei Verwendung der Elemente, durchgeführt, indem das Element von einer Vorratsrolle, aus einem Chippaket oder aus einer anderen Quelle entnommen und es physikalisch mit einer Probe (z. B. bis zu 200 ml) der zu testenden Flüssigkeit in Kontakt gebracht wird, so daß die Probe und die Reagenzien sequentiell innerhalb des Elementes in Wechselwirkung treten und sich vermischen. Ein solcher Kontakt kann in jeder gewünschten Art und Weise erreicht werden, z. B. durch Eintauchen oder Untertauchen des Elementes in die Probe und vorzugsweise durch Tüpfeln des Elementes von Hand oder Maschine mit einem Tropfen der Probe mit einer geeigneten Zuführeinheit.
Nach Aufbringen der Probe wird das Element für einen Zeitraum von bis zu 5 Minuten inkubiert, um die Farbentwicklung zu erleichtern. Mit Inkubation ist gemeint, daß die Reagenzien bei 37ºC für einen Zeitraum von bis zu 5 Minuten miteinander in Kontakt gehalten werden, bevor Farbmessungen durchgeführt werden. Wäßrige Flüssigkeiten, die im Assay getestet werden können, schließen Vollblut, Plasma, Seren, Lymphe, Gallenflüssigkeit, Urin, Rückenmarksflüssigkeit, Speichel, Schweiß und dergleichen sowie Stuhlausscheidungen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Es ist auch möglich, Flüssigpräparationen von menschlichem oder tierischem Gewebe, wie etwa Skelettmuskel, Herz, Niere, Lungen, Gehirn, Knochenmark, Haut und dergleichen, zu testen.
Trockenanalytische Elemente, die für den Assay von Flüssigkeiten nützlich sind, können gemäß den Lehren von US 3,992,158 und US 4,357,363 hergestellt werden.
Kurz gesagt umfaßt das analytische Element dieser Erfindung eine oder mehrere Schichten, die auf einen geeigneten Träger aufgebracht sind. Alle Reagenzien können in einer einzigen Schicht vorliegen, die auf den Träger aufgebracht ist. Vorzugsweise werden die Reagenzien in zwei getrennten Reagenzschichten aufgebracht, wie in Tabelle I unten dargestellt. Unabhängig davon, ob sie in derselben oder in verschiedenen Schichten des Elementes enthalten sind, müssen alle Reagenzien in Fließkontakt miteinander stehen, was bedeutet, daß die Reagenzien und Reaktionsprodukte innerhalb einer Schicht und zwischen übereinanderliegenden Regionen benachbarter Schichten übergehen können. Mit anderen Worten werden, wenn das Element mit einer wäßrigen Flüssigkeit in Kontakt gebracht wird, alle Reagenzien der analytischen Zusammensetzung dieser Erfindung sequentiell vermischt, wie hierin zuvor angegeben.
Der Träger kann jedes geeignete, dimensionsmäßig stabile und vorzugsweise nicht-poröse und durchsichtige (d. h. strahlungsdurchlässige) Material sein, das elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge zwischen etwa 200 und etwa 900 nm hindurchläßt. Ein strahlungsdurchlässiger Träger ist besonders bevorzugt, um die Bestimmung nachweisbarer Veränderungen, die in diesen Elementen auftreten, durch Verwendung verschiedener Strahlungsnachweisverfahren zu verstärken und zu erleichtern. Ein Träger der Wahl für ein bestimmtes Element sollte kompatibel sein mit dem beabsichtigten Nachweismodus (Reflexions-, Transmissions- oder Fluoreszenzspektroskopie). Nützliche Trägermaterialien schließen Polystyrol, Polyester (z. B. Poly(ethylenterephthalat)), Polycarbonate, Celluloseester (z. B. Celluloseacetat), etc. ein.
Wenigstens eine Reagenzschicht ist auf den Träger aufgebracht. Die Reagenzschicht(en) enthält (enthalten) die Indikatorzusammensetzung, die ein oder mehrere Reagenzien umfaßt, die in einem oder mehreren synthetischen oder natürlichen Bindemittelmaterialien dispergiert sind, wie etwa Gelatine oder andere natürlich vorkommende Kolloide, sowie verschiedene synthetische hydrophile Polymere, wie etwa Polyacrylamid, Poly(N-vinyl-2- pyrrolidon), Poly(acrylamid-co-N-vinyl-2-pyrrolidon), Copolymere der obigen und Polymere und Copolymere, zu denen vernetzbare Monomere zugesetzt worden sind.
Die Reagenzschicht kann einen Puffer enthalten. Nützliche Puffer schließen Phosphat, Pyrophosphat, Tris(hydroxymethyl)ami-nomethan (TRIS), 2{[Tris-hydroxymethyl)methyl]amino}-1-ethan-sulfonsäure (TES), 4-(2- Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), 3-[4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl]propansulfonsäure (EPPES), 2-Hydroxy-3-(N- [tris(hydroxymethyl)methyl]-amino}-propansulfonsäure (TAPSO) und andere Puffer mit einem pH im Bereich von 6,5 bis 8,5, vorzugsweise 7,5, ein. Der Puffer kann in irgendeiner oder allen Schichten des Elementes vorliegen oder er kann in einer separaten Schicht vorliegen, die frei von anderen Reagenzien ist.
Mehrere Tenside, wie etwa Olin-10G®, TX®-102, TX-405®, Zonyl FSN®, aber bevorzugt TX-100® und TX-165® (wobei die TX-Tenside eine Familie von nichtionischen Octylphenoxypolyethoxyethanol-Tensiden sind, die von Union Carbide vertrieben werden), können fakultativ in der Reagenzschicht eingeschlossen sein. Mehrere verschiedene Vernetzungsmittel sind ebenfalls fakultativ, wie etwa Bisvinylsulfonylmethan, Glutaraldehyd, etc..
Das Element kann mit einer porösen, reflektierenden Verteilerschicht versehen sein, um die flüssige Testprobe gleichförmig über das Element zu verteilen. Die Verteilerschicht kann Reagenzien enthalten, vorzugsweise ist sie aber eine getrennte Schicht, wie in Tabelle I unten dargestellt. Materialien zur Verwendung in Verteilerschichten sind im Stand der Technik zur Herstellung trockener analytischer Elemente gut bekannt, wie z. B. in US 4,258,001 und den oben zitierten Patenten offenbart.
Nützliche Verteilerschichten können hergestellt werden unter Verwendung von Fasermaterialien, entweder vermischt mit einem geeigneten Bindemittelmaterial oder zu einem Gewebe verwoben, wie beschrieben in US 4,292,272 (erteilt am 29. September 1981 für Kitajima et al.), polymeren Zusammensetzungen oder teilchenförmigen Materialien,. z. B. einem Blush- Polymer, wie etwa offenbart in US 3,992,158, Perlen, die mit oder ohne Bindungshaftmitteln miteinander verbunden sind, wie beschrieben in US 4,258,001 (erteilt am 24. März 1981 für Pierce et al.) und US 4,430, 436 (erteilt am 7. Februar 1984 für Koyama et al.) und Japanische Patentveröffentlichung 57(1982)-1760. Besonders nützliche Verteilerschichten umfassen Bariumsulfat oder Titandioxid. Da die Probe im allgemeinen direkt auf die Verteilerschicht aufgebracht wird, ist es wünschenswert, daß die Verteilerschicht isotropisch porös ist, was bedeutet, daß die Porosität in jeder Richtung in der Schicht dieselbe ist, wie bewirkt durch untereinander verbundene Hohlräume oder Poren zwischen Teilchen, Fasern oder Polymersträngen. Eine beispielhafte Verteilerschicht ist in Tabelle I angegeben.
Das vorliegende analytische Element kann weiter Maleimid, vorzugsweise in der Verteilerschicht, enthalten. In einer Ausführungsform enthält die Verteilerschicht N-Ethylmaleimid, eine Verbindung, die sich als nützlich beim Blockieren bestimmter Interferenten erwiesen hat, die in der Testflüssigkeit vorhanden sein können. Die US-Anmeldung von T.C. Arter et al. derselben Inhaberin mit dem Titel Sulfhydryl Complexing Agents in Clinical Test Elements offenbart diese Erfindung und ist am gleichen Datum hiermit eingereicht.
Andere fakultative Schichten, z. B. Zwischenschichten, strahlungsblockierende Schichten, etc.., können nach Wunsch einbezogen werden. Die Schichten des Elementes können eine Vielzahl von anderen wünschenswerten, aber fakultativen Komponenten enthalten, einschließlich Tensiden, Verdickungsmitteln, Puffern, Härtern, Bakteriostaten, Antioxidationsmitteln, Kopplerlösungsmittel und anderen im Stand der Technik bekannten Materialien. Die Mengen dieser Komponenten liegen ebenfalls im Bereich der Fähigkeiten eines Durchschnittsfachmannes.
Veränderungen im Element können nachgewiesen werden mit geeigneten spektrophotometrischen Apparaten, üblicherweise einem Reflektometer, unter Verwendung von allgemein bekannten Verfahren, die z. B. in US 3,992,158 in den Spalten 14-15 und US 4,357,363 in Spalte 27 offenbart sind. In einer enzymatischen Reaktion wird das resultierende Produkt durch z. B. Messen der Rate der Veränderung der Reflexion oder Transmissionsdichte in einem finiten Bereich des Elementes, das mit der Assayprobe in Kontakt kommt, bestimmt. Die gemessene Fläche liegt im allgemeinen bei etwa 3 bis etwa 5 mm.
Vergleichs- bzw. repräsentative Elemente dieser Erfindung sind in den Tabellen Ia und Ib unten angegeben. Tabelle Ia Acetaminophen-Element unter Verwendung von Oxidase-Enzym

LEGENDE

* g/m² mit Ausnahme für Ascorbinsäureoxidase und Arylacylamidase, die IU/m² sind.
TX-405®, TX-100®, TX-165®: Eine Familie von Octylphenoxypolyethoxyethanolen, vertrieben von Union Carbide
Triton X-100º:
THQSO&sub3;H: Verbindung 2 von Tabelle 1, d. h. 1-(3-Sulfopropyl)-1,2,3,4- tetrahydrochinolin
Estan: Ein Polyester/Polyurethan-Polymer, vertrieben von B.F. Goodrich
HEPES: 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure Tabelle Ib Acetaminophen-Element unter Verwendung von Ferricyanid

LEGENDE

* g/m² mit Ausnahme für Arylacylamidase, die IU/m² ist.
TX-405®, TX-100®, TX-165®: Eine Familie von Octylphenoxypolyethoxyethanolen, vertrieben von Union Carbide
Triton X-100®:
THQSO&sub3;H: Verbindung 2 von Tabelle 1, d. h. 1-(3-Sulfopropyl)-1,2,3,4- tetrahydrochinolin
Estan: Ein Polyester/Polyurethan-Polymer, vertrieben von B.F. Goodrich
HEPES: 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure

Testen auf nützliche Kopplungsagentien

Das folgende Verfahren wurde verwendet, um Kopplungsagentien zu identifizieren, die p-Aminophenol in Gegenwart von Ascorbinsäureoxidase koppeln, um eine starke Farbkomponente in Lösung zu ergeben. Solche Kopplungsagentien wurden weiter auf ihre Leistung in einem trockenen analytischen Element für quantitativen Test auf Acetaminophen getestet.
3 ml eines 0,1 M TRIS-Puffer bei pH 7,5 wurden gemischt mit 300 ul einer Lösung, die 0,04 M des zu testenden Kopplungsagens enthielt. Zu dieser Lösung wurden 150 ul Ascorbinsäureoxidase-Lösung (4.000 U/ml), 150 ul Arylacylamidase-Lösung (70 U/ml) und 150 ul einer Acetaminophen-Lösung (300 mg/l) zugegeben. Nach 5 Minuten wurde die Extinktion bei 37ºC bei einer Wellenlänge gemessen, die für die λmax für jeden Farbstoff beobachtet wurde. Ein Spektrum jeder Farbstofflösung wurde zwischen λ = 300 und 800 nm erstellt, um die λmax für jeden Farbstoff zu bestimmen. Kopplungsagentien, die eine größere Extinktion als 0,3 nach 5 Minuten besaßen, wurden als befriedigend zur Verwendung in einem trockenen analytischen Element angesehen (der 0,3-Wert wurde bestimmt durch Abziehen des Wertes des Kopplungsagens bei der Wellenlänge der λmax des Farbstoffes). Die Extinktionswerte bei 300 mg/l Acetaminophen für eine repräsentative Anzahl von Kopplungsmitteln sind in Tabelle II aufgelistet. Die folgenden neun Verbindungen wurden unter diesen als potentielle Kopplungsagentien getestet: Tabelle II Auswahl von Kopplungsagentien für Acetaminophen-Assay Tabelle II - Forts. Auswahl von Kopplungsagentien für Acetaminophen-Assay Tabelle II - Forts. Auswahl von Kopplungsagentien für Acetaminophen-Assay
* Verbindungen sind wasserunlöslich. Eine DMF-Lösung der verwendeten Verbindung wurde zur analytischen Lösung zugegeben.
Die Daten von Tabelle II zeigen, daß, von den angegebenen Kopplungsagentien, nur die Verbindungen 1, 2 und 4 Extinktionskriterien erfüllen und es daher Wert waren, für Verwendung in einem trockenen analytischen Element getestet zu werden (d. h. λ = 670, größere Extinktion als 0,3), wobei Verbindung 2 die höchste Unempfindlichkeit erzeugte. Verbindungen 1 und 4 waren nicht löslich ohne die Zugabe von Dimethylformamid (DMF). Wenn diese Verbindungen in einem Kopplerlösungsmittel (2,4-Di-n-pentylphenol) gelöst wurden und in einem trockenen Element der Erfindung aufgebracht wurden (Beispiele 1, 2 und 3 unten), erzeugten sie weniger Signal als Verbindung Nr. 2. Die Ergebnisse sind in den Fig. 1, 2 und 3 dargestellt.

Herstellung von 1-(3-Sulfopropyl)-1,2,3,4-tetrahydrochinolin (Verbindung Nr. 2, THQSO&sub3;H)

Eine Mischung aus 1, 2,3,4-Tetrahydrochinolin (4,76 g, 40 mmol) und 1,3-Propansulton (4,88 g, 40 mmol) in 50 ml Acetonitril mit Reagenzqualität wurde unter einer Stickstoffatmosphäre erhitzt und über Nacht unter Rückfluß gekocht. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur, anschließend auf Eisbadtemperatur, wurde der resultierende weiße Farbstoff abfiltriert und mit kaltem Acetonitril gewaschen. Die Ausbeute betrug 8,1 g (84%) und das Produkt hatte einen Schmelzpunkt von mehr als 200ºC. Kernmagnetische Resonanz (NMR) und Elementaranalyse zeigten, daß das Produkt konsistent mit der zugeordneten Struktur war. NMR (D&sub2;O): 7,45 (s, 4H), 2,8-4,0 (m, 8H), 2,2 (T, 2H).

Vergleichsbeispiel 1: Kopplungsagens THQSO&sub3;H (Nr. 2) in analytischem Element

Nach Herstellung wurde Kopplungsverbindung Nr. 2 im Vergleichselement, das in Tabelle 1a dargestellt ist, aufgebracht und auf seine Leistung beim Testen verschiedener bekannter Konzentrationen von Acetaminophen in Wasser getestet (1,0, 5,4, 10,0, 19,0, 30,0, 39,0, 52,0, 98,0, 202,0 und 294,0 mg/l). Das Beschichten des Elements kann durchgeführt werden gemäß den Lehren der US-Patente 3,992,158, 4,357,363 und 4,258,001.
Kinetische Reaktion, dargestellt in Fig. 1, zeigt, daß mit diesem Kopplungsmittel gute Empfindlichkeit über den gesamten beabsichtigten dynamischen Bereich (1 bis 30 mg/dl) zu sehen ist.

Vergleichsbeispiel 2: Kopplungsagens 1-(n-Butyl)-1,2,3,4-tetrahydrochinolin (Verbindung Nr. 1, BTHQ) in analytischem Element

Analytische Elemente wurden hergestellt und mit Proben mit verschiedenen Konzentrationen von Acetaminophen wie in Beispiel 1 betüpfelt, mit der Ausnahme, daß Kopplungsverbindung Nr. 1 (BTHQ) anstelle von Verbindung Nr. 2 (THQSO&sub3;H) verwendet wurde. Auch mußte sie, weil Verbindung Nr. 1 nicht wasserlöslich ist, in 2,4-Di-n-pentylphenol dispergiert werden.
In Fig. 2 dargestellte Ergebnisse zeigen, daß dieses Kopplungsagens im analytischen Element nicht brauchbar ist und einen sehr engen dynamischen Bereich liefert.

Vergleichsbeispiel 3: Kopplungsagens 1,2,3,5,6,7- Hexahydrobenzo[i,j]chinolizin, (Verbindung Nr. 4, Julolidin) in analytischem Element

Analytische Elemente wurden hergestellt und mit Proben variierender Konzentrationen von Acetaminophen wie in Beispiel 1 betüpfelt, mit der Ausnahme, daß Kopplungsverbindung Nr. 4 (Julolidin) anstelle von Verbindung Nr. 2 (THQSO&sub3;H) verwendet wurde. Weil Verbindung Nr. 4 nicht wasserlöslich ist, mußte sie in 2,4-Di-n-pentylphenol dispergiert werden.
In Fig. 3 dargestellte Ergebnisse zeigen, daß dieses Kopplungsagens einen sehr engen dynamischen Bereich liefert und somit für unsere Zwecke nicht brauchbar ist.

Vergleichsbeispiel 4: Tyrosinase als Oxidationsmittel im Element

Dieses Beispiel wurde wie in Vergleichsbeispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 6.400 U/m² eines anderen Oxidationsmittels, Tyrosinase, anstelle von 175.000 U/m² Ascorbinsäureoxidase verwendet wurde. Dichtereaktion wurde gemessen unter Verwendung von Reflexionsdensitometrie bei 670 nm. Vorhersagen wurden getroffen durch Ableitung eines Dichte/Vorhersage- Splines für die erzeugten Dichten und Vorhersagen des Acetaminophen- Gehaltes der Probe aus seiner Dichte.
Vorhersagen, die auf der Basis der Dichtereaktion des Elementes (Tabelle III) getroffen wurden, korrelieren gut mit der bekannten Acetaminophenkonzentration in den Testflüssigkeiten, die zum Test auf das Element aufgetüpfelt worden sind. Beispiel unter Verwendung von Tyrosinase als Oxidationsmittel in Element Tabelle III

Beispiel 5: Verwendung von Kaliumferricyanid als Oxidationsmittel im Element

Nach Herstellung wurde Kopplungsverbindung Nr. 2 im Element der Erfindung unter Verwendung von Kaliumferricyanid als dem Oxidationsmittel aufgebracht, wie dargestellt in Tabelle 1b. Es wurde auf seine Leistung beim Testen verschiedener bekannter Konzentrationen von Acetaminophen in Humanserum getestet (0,0, 10, 24, 50, 100, 146, 193, 247, 295, 350 und 391 mg/l).
Kinetische Reaktion, dargestellt in Fig. 4, zeigt, daß das Ferricyanid gute Empfindlichkeit über den gesamten geplanten dynamischen Bereich (1 bis 30 mg/dl) liefert. Verwendung anderer Metallsalze (Tabelle A) in der Elementstruktur von Tabelle 1b waren zu langsam. Es war unerwartet, daß das Ferricyanid schnellere Kinetiken erzeugen würde, beruhend auf seinem niedrigeren Redoxpotential, verglichen mit den anderen untersuchten Oxidationsmitteln. Tabelle A
Die Erfindung ist im Detail unter besonderer Bezugnahme auf eine bevorzugte Ausführungsform derselben beschrieben worden, man wird aber verstehen, daß Variationen und Modifikationen innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung vorgenommen werden können.

Claims

1. Analytisches Element zur Bestimmung von Acetaminophen in einer wäßrigen Flüssigkeit, welches einen Träger umfaßt, auf dem mindestens eine Reagenzschicht aufgebracht ist, und wobei in der Reagenzschicht oder den Reagenzschichten enthalten ist:

(a) ein Arylacylamidaseenzym;

(b) ein Ferricyanid, das in der Lage ist, Paraaminophenol unter Bildung einer Farbkomponente oxidativ an ein Kopplungsagens zu binden; und

(c) ein wasserlösliches, farbbildendes Kopplungsagens der allgemeinen Struktur:

wobei R eine wasserlöslich machende Gruppe ist, ausgewählt aus -(CH&sub2;)nX, wobei n 1 bis 5 und X -SO&sub3;M ist, wobei M Wasserstoff, ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder ein Ammoniumkation (NH&sub4;&spplus;) ist, oder -N(R&sub7;)&sub3;&spplus;Z&supmin;, wobei jedes R&sub7; unabhängig aus Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist; und Z ein Säureanion ist; oder X (-OCH&sub2;CH&sub2;)yOH ist, wobei y 2 bis 5 ist;

R&sub1; und R&sub6; zusammengenommen eine Ethylen-, Trimethylen- oder Tetramethylengruppe darstellen, welche einen partiell gesättigten Ring bildet;

R&sub2;, R&sub3;, und R&sub4; unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.

2. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin eine poröse Verteilerschicht auf der Seite der Reagenzschicht, aber entfernt vom Träger umfaßt.

3. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Ferricyanid ein Ferricyanidsalz eines Alkalimetalls ist.

4. Analytisches Element nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Kopplungsagens 1-(3-Sulfopropyl)- 1,2,3,4-tetrahydrochinolin ist.

5. Analytisches Element nach einem der Ansprüche 1, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine erste Reagenzschicht auf den Träger aufgebracht ist, wobei die erste Reagenzschicht das Kopplungsagens enthält, und eine zweite Reagenzschicht auf die erste Reagenzschicht, wobei besagte zweite Reagenzschicht die Arylacylamidase und das Ferricyanid enthält.

6. Analytisches Element nach einem der Ansprüche 1, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Puffer zur Aufrechterhaltung des pHs des Elementes im Bereich von 6,5 bis 8,5 enthält.

7. Analytisches Element nach einem der Ansprüche 1, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin Maleimid enthält.

8. Analytisches Element nach den Ansprüchen 2 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Maleimid in der Verteilerschicht vorliegt.

9. Verfahren zur Bestimmung von Acetaminophen in einer wäßrigen Flüssigkeit, welches folgende Schritte umfaßt:

(a) Kontaktieren einer Probe der wäßrigen Flüssigkeit mit dem analytischen Element nach einem der Ansprüche 1 bis 8; und

(b) Korrelieren der Menge der gebildeten Farbkomponente mit der Konzentration des Acetaminophens in der Flüssigkeit.