JP4001953B2 - アセトアミノフェンを測定するための分析要素及び方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、乾式分析要素を用いて実施される、水性流体中のアセトアミノフェンを測定するための分光光度法によるアッセイに関する。
【０００２】
【従来の技術】
アセトアミノフェンは広く用いられている鎮痛剤である。これは処方箋がなくても入手することができるので、アスピリンが患者に問題を起こしうる場合によく用いられる。治療的投与量では、その血清中濃度は一般に５０ｍｇ／Ｌ未満である。この薬物を注入してから４時間後の血清中濃度が３００ｍｇ／Ｌよりも高い場合には一般に毒性が観測される。過剰投与による作用の一つが肝臓毒性である。従って、アセトアミノフェンの血清中濃度を正確に測定する必要がある。
アセトアミノフェンのようなアニリドを測定する公知の方法として、アリールアシルアミダーゼ(E.C.3.5.1.13)及び酸化剤を利用する方法がある。アリールアシルアミダーゼは、該アニリドのアミド結合を切断することによりアセテートとアニリン、例えばｐ−アミノフェノールを生成する。次いで、このアニリンを過マンガン酸塩又はその銅若しくは鉄の金属塩のような酸化剤の存在下でフェノールのような発色性化合物と反応させて、６１５ｎｍで検出することができるインドフェノールのような着色化合物を生成させる。別の方法として過ヨウ素酸塩や過硫酸塩のような酸化剤を使用する方法もある。米国特許第４，９９９，２８８号及び同第４，４３０，４３３号明細書が典型的である。
【０００３】
これらの方法の欠点の一つとして、アリールアシルアミダーゼを不活化してしまう条件であるアルカリ性ｐＨでない限り、アニリンの酸化速度がほとんどの金属塩では非常に遅くなることが挙げられる。
米国特許第４，６７５，２９０号明細書（１９８７年６月２３日発行、松本）に、合成ジブロム化アミド（基質）をペプチダーゼを含有する試料で処理することによりジブロム化アニリンを遊離させ、この遊離ジブロム化アニリンを、酸素を消費し且つ定義された式のカプラーの存在下で前記アニリンの酸化的縮合によって顔料を生成させるオキシダーゼ（例、アスコルベートオキシダーゼ）によって酸化する工程を含む、ペプチダーゼの酵素活性を測定する方法が記載されている。この反応は溶液中で起こる。
【０００４】
松本の方法は酵素を利用するものであるため、従来技術の無機酸化剤にまつわる問題を解決することができる。しかしながら、松本の方法は合成ジブロム化基質を使用しており、従って、アセトアミノフェンの検査に直接適用することができない。当該技術分野では、発色にフェノールの酸化的カップリングを利用した場合、その発色反応に特定のハロゲノフェノールを使用すると発色量を増加させることができるという証拠がある。しかしながら、被検体である生物学的流体中に存在するアセトアミノフェンはハロゲン化されていないため、松本の方法で用いられるジブロム化合成基質とは化学的に区別できる。
さらに、松本は溶液アッセイを開示している。代わりとなるより便利なアッセイとして「乾式」化学法がある。この用語は、各種の「指触乾燥状態の」検査要素、例えば、「ディップ・アンド・リード」検査用ストリップ、多層検査要素、等に含まれる化学試薬を用いて実施される方法及び技術を意味する。「乾式」法は、検査試料以外には再構成及び分析に液体をまったく必要としない。
【０００５】
溶液アッセイ用の試薬は、乾式フォーマットに適合させた場合に、十分に機能しないことがしばしばある。乾式要素では微量の試薬及び検査試料が用いられるので、アセトアミノフェンのアッセイ用乾式要素では、アニリンがカプラーに酸化的カップリングされて発色するときにクリアで正確な色信号を与える試薬を使用することが重要である。
潜在的なカプラーとして選ぶことができる化合物は広範囲にわたる。松本は、乾式分析法で十分に機能するような発色性酸化的カプラーについては提案も示唆も何らされていない。問題は、乾式要素に適した酸化的カプラーの選定が本質的に経験に基づいていることである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
組み合わされて乾式フォーマットで塗布された際には活性を残存し且つ適当なカプラーとの酸化的カップリング時には明確な信号を与える酵素及びその他の試薬を含む、生物学的流体中のアセトアミノフェンを測定するための乾式アッセイが望まれている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、乾式フォーマットにおいて検出可能な色変化を提供してアセトアミノフェンを精密に測定するためのカップリング剤を選定するものである。水溶性のカップリング剤が必要であって、水不溶性のカップリング剤は、たとえ適切に分散された場合でも、十分には機能しないことが発見された。
本発明の要素は、従来技術が教示している無機酸化剤は使用せず、代わりに温和な酸化剤、例えば、酵素又はフェリシアン化物を使用する。乾式分析要素では、Ｃｕ++やほとんどのＦｅ+++ の塩は、ゼラチンを架橋、硬化させることによりゼラチンマトリックスを攻撃することが知られている。この問題は、酸化剤として酵素を使用することにより解決される。好適な酸化性酵素としてアスコルビン酸オキシダーゼ、ラクターゼ及びチロシナーゼが挙げられる。
【０００８】
フェリシアン化物は、ほとんどのＦｅ+++ 塩やその他の金属系酸化剤ほど強い酸化剤ではない（表Ａを参照のこと）。それゆえ、フェリシアン化物が、そうでなければ乾式要素構造を損なう中性ｐＨにおいて迅速な反応速度を提供できるということは意外である。好適なフェリシアン化物として、アルカリ金属及びアルカリ土類金属のフェリシアン化物、例えば、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウム及びフェリシアン化カルシウムが挙げられる。特に好適なフェリシアン化物はアルカリ金属のフェリシアン化物である。
本発明によると、支持体表面に少なくとも一つの試薬層を含み、前記試薬層中に下記（ａ）〜（ｃ）を含有する、水性流体中のアセトアミノフェンを測定するための分析要素が提供される。
（ａ）アリールアシルアミダーゼ酵素；
（ｂ）パラアミノフェノールをカップリング剤に対して酸化的カップリングさせて着色化合物を生成することができるフェリシアン化物又は酸化性酵素；及び
（ｃ）下記一般式で示される水溶性の発色性カップリング剤：
【０００９】
【化４】
【００１０】
上式中、Ｒは−（ＣＨ2 ）n Ｘから成る群より選ばれた水可溶化基であるが、ここでｎは１〜５であり、そしてＸは−ＳＯ3 Ｍ〔但し、Ｍは水素、アルカリ金属、アルカリ土類金属若しくはアンモニウム（ＮＨ4 + ）カチオンである〕又は−Ｎ（Ｒ7 ）3 + Ｚ- 〔但し、各Ｒ7 は各々独立に炭素原子数１〜４個のアルキル、例えばメチル、エチル、プロピル及びブチル、から選ばれ且つＺは酸アニオン、例えば塩化物、臭化物、ヨウ化物、フッ化物、ｐ−トルエンスルホネート、等、である〕であるか、或いはＸは（−ＯＣＨ2 ＣＨ2 ）y ＯＨ〔但しｙは２〜５である〕であり、
Ｒ1 とＲ6 が一緒になって、部分飽和環を形成するエチレン、トリメチレン又はテトラメチレン基を表し、
Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 は各々独立に水素、炭素原子数１〜４個のアルキル基及び炭素原子数１〜４個のアルコキシ基から選ばれる。
【００１１】
本発明の別の実施態様として、
（ａ）上記の分析要素に水性液体試料を接触させる工程；及び
（ｂ）着色化合物の生成量を前記液体試料中のアセトアミノフェン濃度と相関させる工程
を含む、水性液体中のアセトアミノフェンを測定するための方法が提供される。
【００１２】
本発明の有利な効果は、水溶性カップリング剤と酵素触媒酸化的カップリング又はフェリシアン化物カップリングのいずれかとによって迅速な反応が可能になることである。本発明者らは、検出可能な色信号を５７秒以内に発生させることができた。水不溶性カップリング剤でははるかに遅い反応となる。
許容量の着色生成物を所望の時間内（５分以内）に得るために、水溶性カップリング剤と酵素を組み合わせる必要があることを見い出したことは意外であった。溶液アッセイの場合でさえ、５分以内で結果を得るためには、酸化性酵素（例、アスコルベートオキシダーゼ）を水溶性カップリング剤と予め混合してから緩衝液で希釈する必要があった。この理由はわからない。科学的理論によって拘束されることを望むものではないが、本出願人は、カップリング剤の水溶性によって、保存中（すなわち、製造時と使用時の間）の分析要素においてカップリング剤と酵素が十分に混合されると考えている。十分な発色反応を５分以内に行わせるためには、反応前にカップリング剤と酸化性酵素とを予め接触させる必要があるようである。
【００１３】
本発明は、アセトアミノフェンの酵素加水分解とそれに続く該加水分解による生成物の検出に基づいてアセトアミノフェンを測定するための比色定量法によるアッセイを開示するものである。より具体的には、本発明によるアッセイでは、アセトアミノフェンのアミド結合を切断して酢酸とｐ−アミノフェノールを生成させるために、第一の酵素としてアリールアシルアミダーゼ(E.C.3.5.1.13)が用いられる。第二の酵素、例えば、アスコルビン酸オキシダーゼ(E.C.1.10.3.3)、チロシナーゼ(E.C.1.14.18.1) 又はラクターゼ(E.C.1.10.3.2)がｐ−アミノフェノールを酸化してこれを本明細書中で定義した水溶性カップリング剤に結合させて色素を生成させる。ｐ−アミノフェノールの酸化にはフェリシアン化物を使用することもできる。この色素は６７０ｎｍで検出することができる。この反応は下記のように進行する。
【００１４】
【化５】
【００１５】
本発明において有用な水溶性のカップリング剤は、構造の類似した数種類のカプラーの中からスクリーニング及び選定することによって同定された。水不溶性のカプラーは、この検査条件下では、幅広いダイナミックレンジのアナライト濃度を分析差別化するに十分な吸光度を与える程十分なカップリング（色素生成）を提供しなかった。上記構造のものであって、Ｒ1 とＲ6 が一緒になってトリメチレンを表す、すなわち部分飽和六員窒素含有複素環式環を形成するものは、特に望ましい吸収極大（約６７０ｎｍ）を示し、分析要素では特に有用である。というのは、この吸収は、より短波長側で吸収するビリルビンのような妨害因子によって遮蔽されることがないからである。好適な水溶性種は１−（３−スルホプロピル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリンである。このスクリーニング手順とその結果については後述する。反応終了時における着色化合物の生成量は、その検査試料中のアセトアミノフェン濃度を示す。
【００１６】
上記の試薬を支持体表面に塗布することで本発明の乾式分析要素が得られる。この分析要素は、所望の任意の幅を有する細長いテープ状、シート状、スライド状、チップ状をはじめとして様々な形状をとることができる。
本発明の分析要素は、手動式又は自動式いずれのアッセイ法でも使用することができる。一般に、分析要素を使用する際には、その要素を供給用ロール、チップパケット又はその他のソースから取り出し、それを被検液体試料（例、２００ｍＬ以下）と物理的に接触させることにより、要素の内部で試料と試薬を逐次的に相互作用させて混合させることによって、アセトアミノフェンを測定する。このような接触は適当な任意の方法で、例えば、分析要素を試料液に浸漬する方法や、好ましくは適当な分配手段で試料の液滴を手動で又は機械で分析要素に点着する方法によって、行うことができる。
【００１７】
試料をアプライした後、その分析要素を最長で５分間インキュベーションし、発色を促進させる。インキュベーションとは、測色前に、試薬を互いに接触させた状態で３７℃において最長で５分間維持する工程を意味する。このアッセイで検査することができる水性液体には、全血、血漿、血清、リンパ液、胆汁、尿、脊髄液、唾液、汗、等の他、排泄物も含まれるが、これらに限定はされない。また、ヒト又は動物の細胞、例えば、骨格筋、心臓、腎臓、肺、脳、骨髄、皮膚、等の流体調製物を検定することも可能である。
【００１８】
液体のアッセイに有用な乾式分析要素は、米国特許第３，９９２，１５８号及び同第４，３５７，３６３号明細書の教示に従い製造することができ、本明細書ではその記載を援用する。
簡単に説明すると、本発明の分析要素は適当な支持体表面に塗布された単一又は複数の層を含む。支持体表面に塗布された単一の層にすべての試薬が含まれていてもよい。好ましくは、下記表１に示すように、区別された二つの試薬層に試薬を塗布する。分析要素の同じ層に含まれる場合でも異なる層に含まれる場合でも、すべての試薬が互いに液絡可能な状態になければならない。つまり、試薬と反応生成物が層の内部及び隣接層の重畳領域間を通過できることが必要である。換言すれば、分析要素を水性流体と接触させた時に、上述したように本発明の分析組成物のすべての試薬が逐次混合される。
【００１９】
支持体は、寸法安定性があり、そして好ましくは非孔質且つ波長約２００〜約９００ｎｍの電磁輻射線を透過する透明な（すなわち、輻射線透過性）材料であれば適当ないずれの材料であってもよい。各種輻射線検出法を利用してこれら分析要素で起こる検出可能な変化の測定を向上、促進するためには、輻射線透過性支持体が特に好ましい。個別の要素に対する支持体の選定は、所期の検出様式（反射、透過又は蛍光分光光度分析）に適合させるべきである。有用な支持体材料としてポリスチレン、ポリエステル〔例、ポリ（エチレンテレフタレート）〕、ポリカーボネート、セルロースエステル（例、酢酸セルロース）、等が挙げられる。
この支持体の表面には少なくとも一つの試薬層が塗布される。この試薬層は、一種又は二種以上の合成又は天然のバインダー物質、例えばゼラチン若しくはその他の天然コロイド、並びに種々の合成親水性ポリマー、例えばポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（アクリルアミド−コ−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、これらのコポリマー、及び架橋性モノマーを添加したポリマー若しくはコポリマー、の中に一種又は二種以上の試薬が分散している指示組成物を含有する。
【００２０】
この試薬層は緩衝剤を含有することができる。有用な緩衝剤として、ホスフェート、ピロホスフェート、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、２｛〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕アミノ｝−１−エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＥＳ）、２−ヒドロキシ−３−｛Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕アミノ｝−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）及びその他ｐＨが約６．５〜約８．５の範囲に、好ましくは約７．５である緩衝剤が挙げられる。緩衝剤は、分析要素のいずれかの層に含まれても、またすべての層に含まれてもよく、さらには他の試薬を含まない独立した層に含まれてもよい。
この試薬層には、必要に応じていくつかの界面活性剤、例えば、Ｏｌｉｎ−１０Ｇ（商標）、ＴＸ−１０２（商標）、ＴＸ−４０５（商標）、Ｚｏｎｙｌ ＦＳＮ（商標）、好ましくはＴＸ−１００（商標）及びＴＸ−１６５（商標）（これらＴＸ系界面活性剤はＵｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ社より市販されているオクチルフェノキシポリエトキシエタノール系非イオン性界面活性剤の一族である）を含めることができる。さらに、数種類の架橋剤、例えば、ビスビニルスルホニルメタン、グルタルアルデヒド、等も任意に含めることができる。
【００２１】
本発明の分析要素には、液体被検試料を要素全体に均一に分布させるために多孔質の反射性展開層を設けることができる。この展開層は試薬を含有してもよいが、下記表１に示すように別個の層であることが好ましい。展開層用の材料については、例えば米国特許第４，２５８，００１号明細書や先に引用した特許明細書に開示されているように、乾式分析要素の製造分野ではよく知られている。
有用な展開層は、米国特許第４，２９２，２７２号明細書（１９８１年９月２９日発行、北島ら）に記載されているように適当なバインダー物質と混合するか又は織物にした繊維材料を用いて、米国特許第３，９９２，１５８号明細書に記載されているように高分子組成物又は粒状材料、例えばブラシポリマーを用いて、米国特許第４，２５８，００１号（１９８１年３月２４日発行、Ｐｉｅｒｃｅら）及び米国特許第４，４３０，４３６号明細書（１９８４年２月７日発行、小山ら）並びに特開昭５７−１０１７６０号公報に記載されているように接着剤を使用するか又は使用せずにビーズを用いて、調製することができる。特に有用な展開層は硫酸バリウム又は二酸化チタンを含む。一般に、展開層には試料が直接アプライされるので、展開層は等方性多孔質であること、すなわち粒子間、繊維間又は高分子ストランド間の内部連続空間又は気孔によって生じた多孔性が層内の各方向において同等であることが望ましい。展開層の一例を表１に示す。
【００２２】
ある実施態様では、展開層は、検査流体中に存在しうる特定の妨害因子をブロックするのに有用であることが知られている化合物のＮ−エチルマレイミドを含有する。この発明については、１９９５年６月２２日出願のＴ．Ｃ．Ａｒｔｅｒらの発明の名称「Sulfhydryl Complexing Agents in Clinical Test Elements」の共有米国特許出願明細書に記載されている。
下塗層、輻射線遮断層、等のその他の層を所望であれば必要に応じて含めることもできる。本発明の要素の層は、その他の任意ではあるが望ましい成分を各種含有することができる。そのような成分として、界面活性剤、増粘剤、緩衝剤、硬膜剤、静菌剤、酸化防止剤、カプラー溶剤、その他当該技術分野で公知の物質が挙げられる。これら成分の量についても当業者であれば適宜選定することができる。
【００２３】
分析要素における変化は、例えば、米国特許第３，９９２，１５８号明細書の第１４〜１５欄及び米国特許第４，３５７，３６３号明細書の第２７欄に記載されている公知の方法を用いて、適当な分光光度計装置、通常は反射計、によって検出することができる。酵素反応の場合、例えば、検定試料を接触させた本発明の要素の有限領域内の反射濃度又は透過濃度の変化速度を計測することによって、得られた生成物を測定する。測定領域は一般に約３〜約５ｍｍの範囲である。
本発明の代表的な要素を下記表１ａ及び表１ｂに示す。
【００２４】
表１ａ：オキシダーゼ酵素を用いたアセトアミノフェン分析要素
被覆量；ｇ／ｍ 2 *
試薬／展開層 有用な範囲 実例
硫酸バリウム 75-120 100
セルロース 1-20 8
界面活性剤 TX-405(商標) 0.2-4 1.6
Estane 1-15 12.3
マレイミド 0.1-3.0 1.0
下塗層
ポリビニルピロリドン 0.5-2.5 1.0
試薬層１
未硬化ゼラチン 4-24 6
界面活性剤 TX-165(商標) 0.005-0.1 0.01
HEPES 緩衝剤 2-10 2.4
アスコルビン酸オキシダーゼ 50,000-300,000 IU/m2 175,000 IU/m2
アリールアシルアミダーゼ 1,000-50,000 IU/m2 5,000 IU/m2
試薬層２
硬化ゼラチン 4-24 6
カプラー THQSO3H 0.2-2 1.0
HEPES 緩衝剤 2-10 4.8
界面活性剤 TX-165(商標) 0.005-0.1 0.01
略号解
* アルコルビン酸オキシダーゼとアリールアシルアミダーゼはＩＵ／ｍ2
TX-405 (商標):
TX-100 (商標):オクチルフェノキシポリエトキシの一族
TX-165 (商標): Union Carbideより市販されているエタノール
Triton X-100 (商標):
THQSO3H:表１の化合物２、すなわち１−（３−スルホプロピル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン
Estane: B.F. Goodrich より市販されているポリエステル／ポリウレタン系ポリマー
HEPES:４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
【００２５】
表１ｂ：フェリシアン化物を用いたアセトアミノフェン分析要素
被覆量；ｇ／ｍ 2 *
試薬／展開層 有用な範囲 実例
硫酸バリウム 75-120 100
セルロース 1-20 8
界面活性剤 TX-405(商標) 0.2-4 1.6
Estane 1-15 12.3
マレイミド 0.1-3.0 1.0
下塗層
ポリビニルピロリドン 0.5-2.5 1.0
試薬層１
未硬化ゼラチン 4-24 6
界面活性剤 TX-165(商標) 0.005-0.1 0.01
HEPES 緩衝剤 2-10 2.4
フェリシアン化カリウム 0.1-5.0 1.8
アリールアシルアミダーゼ 1,000-50,000 IU/m2 5,000 IU/m2
試薬層２
硬化ゼラチン 4-24 6
カプラー THQSO3H 0.2-2 1.0
HEPES 緩衝剤 2-10 4.8
界面活性剤 TX-165(商標) 0.005-0.1 0.01
略号解
* アリールアシルアミダーゼはＩＵ／ｍ2
TX-405 (商標):
TX-100 (商標):オクチルフェノキシポリエトキシの一族
TX-165 (商標): Union Carbideより市販されているエタノール
Triton X-100 (商標):
THQSO3H:表１の化合物２、すなわち１−（３−スルホプロピル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン
Estane: B.F. Goodrich より市販されているポリエステル／ポリウレタン系ポリマー
HEPES:４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
【００２６】
【実施例】
有用なカップリング剤についての試験
下記の手順によって、アスコルビン酸オキシダーゼの存在下でｐ−アミノフェノールと結合して溶液中に色の強い化合物を生ぜしめるカップリング剤を同定した。さらに、これらの化合物を、アセトアミノフェンを定量検定するための乾式分析要素における性能について試験した。
ｐＨ７．５の０．１Ｍ ＴＲＩＳ緩衝液３ｍＬと０．０４Ｍの試験すべきカップリング剤を含有する溶液３００μＬとを混合した。この溶液に１５０μＬのアスコルビン酸オキシダーゼ溶液（４０００Ｕ／ｍＬ）と、１５０μＬのアリールアシルアミダーゼ溶液（７０Ｕ／ｍＬ）と、１５０μＬのアセトアミノフェン溶液（３００ｍｇ／Ｌ）とを添加した。５分後、各色素のλmax に対応する波長における吸光度を３７℃で測定した。各色素のλmax を決定するため、各色素溶液のスペクトルをλ＝３００〜８００ｎｍの範囲で作成した。５分後の吸光度が０．３よりも高いカップリング剤は乾式分析要素用として十分であるものと見なした（０．３の値は、色素のλmax 波長におけるカップリング剤の値を差し引いて求めた値である）。代表的カップリング剤のアセトアミノフェン３００ｍｇ／Ｌにおける吸光度値を表２に記載する。下記の９種類の化合物が潜在的なカップリング剤として試験したものの一部である。
表２：アセトアミノフェンを検定するためのカップリング剤の選択
【００２７】
【化６】
【００２８】
【化７】
【００２９】
【化８】
【００３０】
【化９】
【００３１】
【化１０】
【００３２】
＊この化合物は水不溶性であるため、そのＤＭＦ溶液を分析溶液へ添加した。
表２のデータは、示したカップリング剤のうち、化合物１、２及び４だけが吸光度の基準を満たしており（すなわち、λ＝６７０、吸光度０．３超）、乾式分析要素用としての試験をする価値があった。化合物２が最高の不感受性を示した。化合物１及び４はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を添加しないと溶解しなかった。これらの化合物をカプラー溶剤（２，４−ジ−ｎ−ペンチルフェノール）に溶解して本発明の乾式分析要素に塗布した場合（下記実施例１、２及び３）、化合物２よりも有意に小さい信号が発生した。これらの結果を図１、図２及び図３に示す。
【００３３】
１−（３−スルホプロピル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン（化合物２、ＴＨＱＳＯ 3 Ｈ）の合成
試薬グレードのアセトニトリル５０ｍＬに１，２，３，４−テトラヒドロキノリン（４．７６ｇ、４０ミリモル）と１，３−プロパンスルトン（４．８８ｇ、４０ミリモル）とを含む混合物を窒素雰囲気中で加熱して一晩還流させた。室温まで冷却した後に氷浴温度まで冷却し、得られた白色固形分を濾過して低温のアセトニトリルで洗浄した。収量は８．１ｇ（８４％）であり、その生成物の融点は２００℃よりも高かった。核磁気共鳴（ＮＭＲ）及び元素分析によって、その生成物の構造を確認した。ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ）：７．４５（ｓ，４Ｈ）、２．８−４．０（ｍ，８Ｈ）、２．２（Ｔ，２Ｈ）。
【００３４】
実施例１：分析要素におけるカップリング剤ＴＨＱＳＯ 3 Ｈ（第２番）
合成後、カップリング化合物２を表１ａに示した本発明の分析要素に塗布し、そして各種既知濃度（１．０、５．４、１０．０、１９．０、３０．０、３９．０、５２．０、９８．０、２０２．０及び２９４．０ｍｇ／Ｌ）のアセトアミノフェン水溶液をアッセイする際の性能について試験した。分析要素のコーティングは米国特許第３，９９２，１５８号、同第４，３５７，３６３号及び同第４，２５８，００１号明細書の教示に従い実施した。
図１に示した反応速度応答は、このカプラーによると、実施したダイナミックレンジ（１〜３０ｍｇ／ｄＬ）の全体にわたり良好な感度が得られることを示唆している。
【００３５】
比較例１：分析要素におけるカップリング剤１−（ｎ−ブチル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン（化合物１、ＢＴＨＯ）
実施例１と同様に分析要素を作製して各種濃度のアセトアミノフェン試料を点着したが、但し、化合物２（ＴＨＱＳＯ3 Ｈ）の代わりに化合物１（ＢＴＨＯ）を使用した。また、化合物１は水溶性ではないため、２−４−ジ−ｎ−ペンチルフェノール中に分散させなければならなかった。
図２に示した結果は、このカップリング剤は分析要素において有用ではなく、得られるダイナミックレンジは非常に狭いことを示唆している。
【００３６】
比較例２：分析要素におけるカップリング剤１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロベンゾ〔Ｉ．Ｊ〕キノリジン（化合物４、ジュロリジン）
実施例１と同様に分析要素を作製して各種濃度のアセトアミノフェン試料を点着したが、但し、化合物２（ＴＨＱＳＯ3 Ｈ）の代わりに化合物４（ジュロリジン）を使用した。化合物４は水溶性ではないため、２−４−ジ−ｎ−ペンチルフェノール中に分散させなければならなかった。
図３に示した結果は、このカップリング剤で得られるダイナミックレンジは非常に狭いため、本発明の目的には有用ではないことを示唆している。
【００３７】
実施例２：分析要素における酸化剤としてのチロシナーゼ
この実施例は実施例１と同様に実施したが、但し、１７５，０００Ｕ／ｍ2 のアスコルビン酸オキシダーゼの代わりに別の酸化剤として６，４００Ｕ／ｍ2 のチロシナーゼを使用した。反射率濃度法により６７０ｎｍにおける濃度応答を測定した。得られた濃度について濃度／予測値スプライン(spline)を作成し、その濃度から試料のアセトアミノフェン濃度を予測した。
分析要素の濃度応答に基づいて行われた予測（表３）は、試験用要素に点着した検査流体中の既知のアセトアミノフェン濃度とよく相関している。
【００３８】
分析要素における酸化剤としてチロシナーゼを使用した例
表３
アセトアミノフェン濃度 (mg/dL) 濃度応答 (670 nm) 予測値 (mg/dL)
０．１ ０．１６５ ０．１
０．５ ０．１７８ ０．５
１．０ ０．１９０ ０．９
１．９ ０．２２０ １．９
３．０ ０．２５１ ３．０
３．９ ０．２８０ ４．１
５．２ ０．３０７ ５．２
９．８ ０．４９５ １０．０
２０．９ ０．６５０ ２０．８
２９．４ ０．７２３ ２９．４
【００３９】
実施例３：分析要素における酸化剤としてフェリシアン化カリウムを使用した例合成後、カップリング化合物２を表１ｂに示したように酸化剤としてフェリシアン化カリウムを用いた本発明の分析要素に塗布した。その要素を、各種既知濃度（０．０、１０、２４、５０、１００、１４６、１９３、２４７、２９５、３５０及び３９１ｍｇ／Ｌ）のヒト血清中のアセトアミノフェンをアッセイする際の性能について試験した。
図４に示した反応速度応答は、このフェリシアン化物によると、実施したダイナミックレンジ（１〜３０ｍｇ／ｄＬ）の全体にわたり良好な感度が得られることを示唆している。表１ｂの要素構造において別の金属塩を使用した場合には、反応速度が非常に遅くなった（表Ａ）。フェリシアン化物が、他の試験した酸化剤と比較して低い酸化還元電位に基づいてより迅速な反応速度を提供することは意外であった。
【００４０】
表Ａ
物質 酸化還元電位 反応速度
硫酸第二銅 ＋０．３４Ｖ 遅い
塩化第二銅 ＋０．３４Ｖ 遅い
硝酸第二鉄 ＋０．７７Ｖ 非常に遅い
硝酸銀 ＋０．５９Ｖ 非常に遅い
硝酸銀 ＋０．８１Ｖ 非常に遅い
フェリシアン化カリウム ＋０．４６Ｖ 非常に速い
【００４１】
本発明をその好ましい実施態様を特に参照しながら説明してきたが、本発明の精神及び範囲内で各種変更が可能であることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の分析要素の性能を示すグラフである。
【図２】比較例の分析要素の性能を示すグラフである。
【図３】別の比較例の分析要素の性能を示すグラフである。
【図４】本発明の分析要素の性能を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、乾式分析要素を用いて実施される、水性流体中のアセトアミノフェンを測定するための分光光度法によるアッセイに関する。
【０００２】
【従来の技術】
アセトアミノフェンは広く用いられている鎮痛剤である。これは処方箋がなくても入手することができるので、アスピリンが患者に問題を起こしうる場合によく用いられる。治療的投与量では、その血清中濃度は一般に５０ｍｇ／Ｌ未満である。この薬物を注入してから４時間後の血清中濃度が３００ｍｇ／Ｌよりも高い場合には一般に毒性が観測される。過剰投与による作用の一つが肝臓毒性である。従って、アセトアミノフェンの血清中濃度を正確に測定する必要がある。
アセトアミノフェンのようなアニリドを測定する公知の方法として、アリールアシルアミダーゼ(E.C.3.5.1.13)及び酸化剤を利用する方法がある。アリールアシルアミダーゼは、該アニリドのアミド結合を切断することによりアセテートとアニリン、例えばｐ−アミノフェノールを生成する。次いで、このアニリンを過マンガン酸塩又はその銅若しくは鉄の金属塩のような酸化剤の存在下でフェノールのような発色性化合物と反応させて、６１５ｎｍで検出することができるインドフェノールのような着色化合物を生成させる。別の方法として過ヨウ素酸塩や過硫酸塩のような酸化剤を使用する方法もある。米国特許第４，９９９，２８８号及び同第４，４３０，４３３号明細書が典型的である。
【０００３】
これらの方法の欠点の一つとして、アリールアシルアミダーゼを不活化してしまう条件であるアルカリ性ｐＨでない限り、アニリンの酸化速度がほとんどの金属塩では非常に遅くなることが挙げられる。
米国特許第４，６７５，２９０号明細書（１９８７年６月２３日発行、松本）に、合成ジブロム化アミド（基質）をペプチダーゼを含有する試料で処理することによりジブロム化アニリンを遊離させ、この遊離ジブロム化アニリンを、酸素を消費し且つ定義された式のカプラーの存在下で前記アニリンの酸化的縮合によって顔料を生成させるオキシダーゼ（例、アスコルベートオキシダーゼ）によって酸化する工程を含む、ペプチダーゼの酵素活性を測定する方法が記載されている。この反応は溶液中で起こる。
【０００４】
松本の方法は酵素を利用するものであるため、従来技術の無機酸化剤にまつわる問題を解決することができる。しかしながら、松本の方法は合成ジブロム化基質を使用しており、従って、アセトアミノフェンの検査に直接適用することができない。当該技術分野では、発色にフェノールの酸化的カップリングを利用した場合、その発色反応に特定のハロゲノフェノールを使用すると発色量を増加させることができるという証拠がある。しかしながら、被検体である生物学的流体中に存在するアセトアミノフェンはハロゲン化されていないため、松本の方法で用いられるジブロム化合成基質とは化学的に区別できる。
さらに、松本は溶液アッセイを開示している。代わりとなるより便利なアッセイとして「乾式」化学法がある。この用語は、各種の「指触乾燥状態の」検査要素、例えば、「ディップ・アンド・リード」検査用ストリップ、多層検査要素、等に含まれる化学試薬を用いて実施される方法及び技術を意味する。「乾式」法は、検査試料以外には再構成及び分析に液体をまったく必要としない。
【０００５】
溶液アッセイ用の試薬は、乾式フォーマットに適合させた場合に、十分に機能しないことがしばしばある。乾式要素では微量の試薬及び検査試料が用いられるので、アセトアミノフェンのアッセイ用乾式要素では、アニリンがカプラーに酸化的カップリングされて発色するときにクリアで正確な色信号を与える試薬を使用することが重要である。
潜在的なカプラーとして選ぶことができる化合物は広範囲にわたる。松本は、乾式分析法で十分に機能するような発色性酸化的カプラーについては提案も示唆も何らされていない。問題は、乾式要素に適した酸化的カプラーの選定が本質的に経験に基づいていることである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
組み合わされて乾式フォーマットで塗布された際には活性を残存し且つ適当なカプラーとの酸化的カップリング時には明確な信号を与える酵素及びその他の試薬を含む、生物学的流体中のアセトアミノフェンを測定するための乾式アッセイが望まれている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、乾式フォーマットにおいて検出可能な色変化を提供してアセトアミノフェンを精密に測定するためのカップリング剤を選定するものである。水溶性のカップリング剤が必要であって、水不溶性のカップリング剤は、たとえ適切に分散された場合でも、十分には機能しないことが発見された。
本発明の要素は、従来技術が教示している無機酸化剤は使用せず、代わりに温和な酸化剤、例えば、酵素又はフェリシアン化物を使用する。乾式分析要素では、Ｃｕ++やほとんどのＦｅ+++ の塩は、ゼラチンを架橋、硬化させることによりゼラチンマトリックスを攻撃することが知られている。この問題は、酸化剤として酵素を使用することにより解決される。好適な酸化性酵素としてアスコルビン酸オキシダーゼ、ラクターゼ及びチロシナーゼが挙げられる。
【０００８】
フェリシアン化物は、ほとんどのＦｅ+++ 塩やその他の金属系酸化剤ほど強い酸化剤ではない（表Ａを参照のこと）。それゆえ、フェリシアン化物が、そうでなければ乾式要素構造を損なう中性ｐＨにおいて迅速な反応速度を提供できるということは意外である。好適なフェリシアン化物として、アルカリ金属及びアルカリ土類金属のフェリシアン化物、例えば、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウム及びフェリシアン化カルシウムが挙げられる。特に好適なフェリシアン化物はアルカリ金属のフェリシアン化物である。
本発明によると、支持体表面に少なくとも一つの試薬層を含み、前記試薬層中に下記（ａ）〜（ｃ）を含有する、水性流体中のアセトアミノフェンを測定するための分析要素が提供される。
（ａ）アリールアシルアミダーゼ酵素；
（ｂ）パラアミノフェノールをカップリング剤に対して酸化的カップリングさせて着色化合物を生成することができるフェリシアン化物又は酸化性酵素；及び
（ｃ）下記一般式で示される水溶性の発色性カップリング剤：
【０００９】
【化４】
上式中、Ｒは−（ＣＨ2 ）n Ｘから成る群より選ばれた水可溶化基であるが、ここでｎは１〜５であり、そしてＸは−ＳＯ3 Ｍ〔但し、Ｍは水素、アルカリ金属、アルカリ土類金属若しくはアンモニウム（ＮＨ4 + ）カチオンである〕又は−Ｎ（Ｒ7 ）3 + Ｚ- 〔但し、各Ｒ7 は各々独立に炭素原子数１〜４個のアルキル、例えばメチル、エチル、プロピル及びブチル、から選ばれ且つＺは酸アニオン、例えば塩化物、臭化物、ヨウ化物、フッ化物、ｐ−トルエンスルホネート、等、である〕であるか、或いはＸは（−ＯＣＨ2 ＣＨ2 ）y ＯＨ〔但しｙは２〜５である〕であり、
Ｒ1 とＲ6 が一緒になって、部分飽和環を形成するエチレン、トリメチレン又はテトラメチレン基を表し、
Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 は各々独立に水素、炭素原子数１〜４個のアルキル基及び炭素原子数１〜４個のアルコキシ基から選ばれる。
【００１１】
本発明の別の実施態様として、
（ａ）上記の分析要素に水性液体試料を接触させる工程；及び
（ｂ）着色化合物の生成量を前記液体試料中のアセトアミノフェン濃度と相関させる工程
を含む、水性液体中のアセトアミノフェンを測定するための方法が提供される。
【００１２】
本発明の有利な効果は、水溶性カップリング剤と酵素触媒酸化的カップリング又はフェリシアン化物カップリングのいずれかとによって迅速な反応が可能になることである。本発明者らは、検出可能な色信号を５７秒以内に発生させることができた。水不溶性カップリング剤でははるかに遅い反応となる。
許容量の着色生成物を所望の時間内（５分以内）に得るために、水溶性カップリング剤と酵素を組み合わせる必要があることを見い出したことは意外であった。溶液アッセイの場合でさえ、５分以内で結果を得るためには、酸化性酵素（例、アスコルベートオキシダーゼ）を水溶性カップリング剤と予め混合してから緩衝液で希釈する必要があった。この理由はわからない。科学的理論によって拘束されることを望むものではないが、本出願人は、カップリング剤の水溶性によって、保存中（すなわち、製造時と使用時の間）の分析要素においてカップリング剤と酵素が十分に混合されると考えている。十分な発色反応を５分以内に行わせるためには、反応前にカップリング剤と酸化性酵素とを予め接触させる必要があるようである。
【００１３】
本発明は、アセトアミノフェンの酵素加水分解とそれに続く該加水分解による生成物の検出に基づいてアセトアミノフェンを測定するための比色定量法によるアッセイを開示するものである。より具体的には、本発明によるアッセイでは、アセトアミノフェンのアミド結合を切断して酢酸とｐ−アミノフェノールを生成させるために、第一の酵素としてアリールアシルアミダーゼ(E.C.3.5.1.13)が用いられる。第二の酵素、例えば、アスコルビン酸オキシダーゼ(E.C.1.10.3.3)、チロシナーゼ(E.C.1.14.18.1) 又はラクターゼ(E.C.1.10.3.2)がｐ−アミノフェノールを酸化してこれを本明細書中で定義した水溶性カップリング剤に結合させて色素を生成させる。ｐ−アミノフェノールの酸化にはフェリシアン化物を使用することもできる。この色素は６７０ｎｍで検出することができる。この反応は下記のように進行する。
【００１４】
【化５】
本発明において有用な水溶性のカップリング剤は、構造の類似した数種類のカプラーの中からスクリーニング及び選定することによって同定された。水不溶性のカプラーは、この検査条件下では、幅広いダイナミックレンジのアナライト濃度を分析差別化するに十分な吸光度を与える程十分なカップリング（色素生成）を提供しなかった。上記構造のものであって、Ｒ1 とＲ6 が一緒になってトリメチレンを表す、すなわち部分飽和六員窒素含有複素環式環を形成するものは、特に望ましい吸収極大（約６７０ｎｍ）を示し、分析要素では特に有用である。というのは、この吸収は、より短波長側で吸収するビリルビンのような妨害因子によって遮蔽されることがないからである。好適な水溶性種は１−（３−スルホプロピル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリンである。このスクリーニング手順とその結果については後述する。反応終了時における着色化合物の生成量は、その検査試料中のアセトアミノフェン濃度を示す。
【００１６】
上記の試薬を支持体表面に塗布することで本発明の乾式分析要素が得られる。この分析要素は、所望の任意の幅を有する細長いテープ状、シート状、スライド状、チップ状をはじめとして様々な形状をとることができる。
本発明の分析要素は、手動式又は自動式いずれのアッセイ法でも使用することができる。一般に、分析要素を使用する際には、その要素を供給用ロール、チップパケット又はその他のソースから取り出し、それを被検液体試料（例、２００ｍＬ以下）と物理的に接触させることにより、要素の内部で試料と試薬を逐次的に相互作用させて混合させることによって、アセトアミノフェンを測定する。このような接触は適当な任意の方法で、例えば、分析要素を試料液に浸漬する方法や、好ましくは適当な分配手段で試料の液滴を手動で又は機械で分析要素に点着する方法によって、行うことができる。
【００１７】
試料をアプライした後、その分析要素を最長で５分間インキュベーションし、発色を促進させる。インキュベーションとは、測色前に、試薬を互いに接触させた状態で３７℃において最長で５分間維持する工程を意味する。このアッセイで検査することができる水性液体には、全血、血漿、血清、リンパ液、胆汁、尿、脊髄液、唾液、汗、等の他、排泄物も含まれるが、これらに限定はされない。また、ヒト又は動物の細胞、例えば、骨格筋、心臓、腎臓、肺、脳、骨髄、皮膚、等の流体調製物を検定することも可能である。
【００１８】
液体のアッセイに有用な乾式分析要素は、米国特許第３，９９２，１５８号及び同第４，３５７，３６３号明細書の教示に従い製造することができ、本明細書ではその記載を援用する。
簡単に説明すると、本発明の分析要素は適当な支持体表面に塗布された単一又は複数の層を含む。支持体表面に塗布された単一の層にすべての試薬が含まれていてもよい。好ましくは、下記表１に示すように、区別された二つの試薬層に試薬を塗布する。分析要素の同じ層に含まれる場合でも異なる層に含まれる場合でも、すべての試薬が互いに液絡可能な状態になければならない。つまり、試薬と反応生成物が層の内部及び隣接層の重畳領域間を通過できることが必要である。換言すれば、分析要素を水性流体と接触させた時に、上述したように本発明の分析組成物のすべての試薬が逐次混合される。
【００１９】
支持体は、寸法安定性があり、そして好ましくは非孔質且つ波長約２００〜約９００ｎｍの電磁輻射線を透過する透明な（すなわち、輻射線透過性）材料であれば適当ないずれの材料であってもよい。各種輻射線検出法を利用してこれら分析要素で起こる検出可能な変化の測定を向上、促進するためには、輻射線透過性支持体が特に好ましい。個別の要素に対する支持体の選定は、所期の検出様式（反射、透過又は蛍光分光光度分析）に適合させるべきである。有用な支持体材料としてポリスチレン、ポリエステル〔例、ポリ（エチレンテレフタレート）〕、ポリカーボネート、セルロースエステル（例、酢酸セルロース）、等が挙げられる。
この支持体の表面には少なくとも一つの試薬層が塗布される。この試薬層は、一種又は二種以上の合成又は天然のバインダー物質、例えばゼラチン若しくはその他の天然コロイド、並びに種々の合成親水性ポリマー、例えばポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（アクリルアミド−コ−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、これらのコポリマー、及び架橋性モノマーを添加したポリマー若しくはコポリマー、の中に一種又は二種以上の試薬が分散している指示組成物を含有する。
【００２０】
この試薬層は緩衝剤を含有することができる。有用な緩衝剤として、ホスフェート、ピロホスフェート、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、２｛〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕アミノ｝−１−エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＥＳ）、２−ヒドロキシ−３−｛Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕アミノ｝−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）及びその他ｐＨが約６．５〜約８．５の範囲に、好ましくは約７．５である緩衝剤が挙げられる。緩衝剤は、分析要素のいずれかの層に含まれても、またすべての層に含まれてもよく、さらには他の試薬を含まない独立した層に含まれてもよい。
この試薬層には、必要に応じていくつかの界面活性剤、例えば、Ｏｌｉｎ−１０Ｇ（商標）、ＴＸ−１０２（商標）、ＴＸ−４０５（商標）、Ｚｏｎｙｌ ＦＳＮ（商標）、好ましくはＴＸ−１００（商標）及びＴＸ−１６５（商標）（これらＴＸ系界面活性剤はＵｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ社より市販されているオクチルフェノキシポリエトキシエタノール系非イオン性界面活性剤の一族である）を含めることができる。さらに、数種類の架橋剤、例えば、ビスビニルスルホニルメタン、グルタルアルデヒド、等も任意に含めることができる。
【００２１】
本発明の分析要素には、液体被検試料を要素全体に均一に分布させるために多孔質の反射性展開層を設けることができる。この展開層は試薬を含有してもよいが、下記表１に示すように別個の層であることが好ましい。展開層用の材料については、例えば米国特許第４，２５８，００１号明細書や先に引用した特許明細書に開示されているように、乾式分析要素の製造分野ではよく知られている。
有用な展開層は、米国特許第４，２９２，２７２号明細書（１９８１年９月２９日発行、北島ら）に記載されているように適当なバインダー物質と混合するか又は織物にした繊維材料を用いて、米国特許第３，９９２，１５８号明細書に記載されているように高分子組成物又は粒状材料、例えばブラシポリマーを用いて、米国特許第４，２５８，００１号（１９８１年３月２４日発行、Ｐｉｅｒｃｅら）及び米国特許第４，４３０，４３６号明細書（１９８４年２月７日発行、小山ら）並びに特開昭５７−１０１７６０号公報に記載されているように接着剤を使用するか又は使用せずにビーズを用いて、調製することができる。特に有用な展開層は硫酸バリウム又は二酸化チタンを含む。一般に、展開層には試料が直接アプライされるので、展開層は等方性多孔質であること、すなわち粒子間、繊維間又は高分子ストランド間の内部連続空間又は気孔によって生じた多孔性が層内の各方向において同等であることが望ましい。展開層の一例を表１に示す。
【００２２】
ある実施態様では、展開層は、検査流体中に存在しうる特定の妨害因子をブロックするのに有用であることが知られている化合物のＮ−エチルマレイミドを含有する。この発明については、１９９５年６月２２日出願のＴ．Ｃ．Ａｒｔｅｒらの発明の名称「Sulfhydryl Complexing Agents in Clinical Test Elements」の共有米国特許出願明細書に記載されている。
下塗層、輻射線遮断層、等のその他の層を所望であれば必要に応じて含めることもできる。本発明の要素の層は、その他の任意ではあるが望ましい成分を各種含有することができる。そのような成分として、界面活性剤、増粘剤、緩衝剤、硬膜剤、静菌剤、酸化防止剤、カプラー溶剤、その他当該技術分野で公知の物質が挙げられる。これら成分の量についても当業者であれば適宜選定することができる。
【００２３】
分析要素における変化は、例えば、米国特許第３，９９２，１５８号明細書の第１４〜１５欄及び米国特許第４，３５７，３６３号明細書の第２７欄に記載されている公知の方法を用いて、適当な分光光度計装置、通常は反射計、によって検出することができる。酵素反応の場合、例えば、検定試料を接触させた本発明の要素の有限領域内の反射濃度又は透過濃度の変化速度を計測することによって、得られた生成物を測定する。測定領域は一般に約３〜約５ｍｍの範囲である。
本発明の代表的な要素を下記表１ａ及び表１ｂに示す。
【００２４】
表１ａ：オキシダーゼ酵素を用いたアセトアミノフェン分析要素
被覆量；ｇ／ｍ 2 *
試薬／展開層 有用な範囲 実例
硫酸バリウム 75-120 100
セルロース 1-20 8
界面活性剤 TX-405(商標) 0.2-4 1.6
Estane 1-15 12.3
マレイミド 0.1-3.0 1.0
下塗層
ポリビニルピロリドン 0.5-2.5 1.0
試薬層１
未硬化ゼラチン 4-24 6
界面活性剤 TX-165(商標) 0.005-0.1 0.01
HEPES 緩衝剤 2-10 2.4
アスコルビン酸オキシダーゼ 50,000-300,000 IU/m2 175,000 IU/m2
アリールアシルアミダーゼ 1,000-50,000 IU/m2 5,000 IU/m2
試薬層２
硬化ゼラチン 4-24 6
カプラー THQSO3H 0.2-2 1.0
HEPES 緩衝剤 2-10 4.8
界面活性剤 TX-165(商標) 0.005-0.1 0.01
略号解
* アルコルビン酸オキシダーゼとアリールアシルアミダーゼはＩＵ／ｍ2
TX-405 (商標):
TX-100 (商標):オクチルフェノキシポリエトキシの一族
TX-165 (商標): Union Carbideより市販されているエタノール
Triton X-100 (商標):
THQSO3H:表１の化合物２、すなわち１−（３−スルホプロピル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン
Estane: B.F. Goodrich より市販されているポリエステル／ポリウレタン系ポリマー
HEPES:４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
【００２５】
表１ｂ：フェリシアン化物を用いたアセトアミノフェン分析要素
被覆量；ｇ／ｍ 2 *
試薬／展開層 有用な範囲 実例
硫酸バリウム 75-120 100
セルロース 1-20 8
界面活性剤 TX-405(商標) 0.2-4 1.6
Estane 1-15 12.3
マレイミド 0.1-3.0 1.0
下塗層
ポリビニルピロリドン 0.5-2.5 1.0
試薬層１
未硬化ゼラチン 4-24 6
界面活性剤 TX-165(商標) 0.005-0.1 0.01
HEPES 緩衝剤 2-10 2.4
フェリシアン化カリウム 0.1-5.0 1.8
アリールアシルアミダーゼ 1,000-50,000 IU/m2 5,000 IU/m2
試薬層２
硬化ゼラチン 4-24 6
カプラー THQSO3H 0.2-2 1.0
HEPES 緩衝剤 2-10 4.8
界面活性剤 TX-165(商標) 0.005-0.1 0.01
略号解
* アリールアシルアミダーゼはＩＵ／ｍ2
TX-405 (商標):
TX-100 (商標):オクチルフェノキシポリエトキシの一族
TX-165 (商標): Union Carbideより市販されているエタノール
Triton X-100 (商標):
THQSO3H:表１の化合物２、すなわち１−（３−スルホプロピル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン
Estane: B.F. Goodrich より市販されているポリエステル／ポリウレタン系ポリマー
HEPES:４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
【００２６】
【実施例】
有用なカップリング剤についての試験
下記の手順によって、アスコルビン酸オキシダーゼの存在下でｐ−アミノフェノールと結合して溶液中に色の強い化合物を生ぜしめるカップリング剤を同定した。さらに、これらの化合物を、アセトアミノフェンを定量検定するための乾式分析要素における性能について試験した。
ｐＨ７．５の０．１Ｍ ＴＲＩＳ緩衝液３ｍＬと０．０４Ｍの試験すべきカップリング剤を含有する溶液３００μＬとを混合した。この溶液に１５０μＬのアスコルビン酸オキシダーゼ溶液（４０００Ｕ／ｍＬ）と、１５０μＬのアリールアシルアミダーゼ溶液（７０Ｕ／ｍＬ）と、１５０μＬのアセトアミノフェン溶液（３００ｍｇ／Ｌ）とを添加した。５分後、各色素のλmax に対応する波長における吸光度を３７℃で測定した。各色素のλmax を決定するため、各色素溶液のスペクトルをλ＝３００〜８００ｎｍの範囲で作成した。５分後の吸光度が０．３よりも高いカップリング剤は乾式分析要素用として十分であるものと見なした（０．３の値は、色素のλmax 波長におけるカップリング剤の値を差し引いて求めた値である）。代表的カップリング剤のアセトアミノフェン３００ｍｇ／Ｌにおける吸光度値を表２に記載する。下記の９種類の化合物が潜在的なカップリング剤として試験したものの一部である。
表２：アセトアミノフェンを検定するためのカップリング剤の選択
【００２７】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
＊この化合物は水不溶性であるため、そのＤＭＦ溶液を分析溶液へ添加した。
表２のデータは、示したカップリング剤のうち、化合物１、２及び４だけが吸光度の基準を満たしており（すなわち、λ＝６７０、吸光度０．３超）、乾式分析要素用としての試験をする価値があった。化合物２が最高の不感受性を示した。化合物１及び４はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を添加しないと溶解しなかった。これらの化合物をカプラー溶剤（２，４−ジ−ｎ−ペンチルフェノール）に溶解して本発明の乾式分析要素に塗布した場合（下記実施例１、２及び３）、化合物２よりも有意に小さい信号が発生した。これらの結果を図１、図２及び図３に示す。
【００３３】
１−（３−スルホプロピル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン（化合物２、ＴＨＱＳＯ 3 Ｈ）の合成
試薬グレードのアセトニトリル５０ｍＬに１，２，３，４−テトラヒドロキノリン（４．７６ｇ、４０ミリモル）と１，３−プロパンスルトン（４．８８ｇ、４０ミリモル）とを含む混合物を窒素雰囲気中で加熱して一晩還流させた。室温まで冷却した後に氷浴温度まで冷却し、得られた白色固形分を濾過して低温のアセトニトリルで洗浄した。収量は８．１ｇ（８４％）であり、その生成物の融点は２００℃よりも高かった。核磁気共鳴（ＮＭＲ）及び元素分析によって、その生成物の構造を確認した。ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ）：７．４５（ｓ，４Ｈ）、２．８−４．０（ｍ，８Ｈ）、２．２（Ｔ，２Ｈ）。
【００３４】
実施例１：分析要素におけるカップリング剤ＴＨＱＳＯ 3 Ｈ（第２番）
合成後、カップリング化合物２を表１ａに示した本発明の分析要素に塗布し、そして各種既知濃度（１．０、５．４、１０．０、１９．０、３０．０、３９．０、５２．０、９８．０、２０２．０及び２９４．０ｍｇ／Ｌ）のアセトアミノフェン水溶液をアッセイする際の性能について試験した。分析要素のコーティングは米国特許第３，９９２，１５８号、同第４，３５７，３６３号及び同第４，２５８，００１号明細書の教示に従い実施した。
図１に示した反応速度応答は、このカプラーによると、実施したダイナミックレンジ（１〜３０ｍｇ／ｄＬ）の全体にわたり良好な感度が得られることを示唆している。
【００３５】
比較例１：分析要素におけるカップリング剤１−（ｎ−ブチル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン（化合物１、ＢＴＨＯ）
実施例１と同様に分析要素を作製して各種濃度のアセトアミノフェン試料を点着したが、但し、化合物２（ＴＨＱＳＯ3 Ｈ）の代わりに化合物１（ＢＴＨＯ）を使用した。また、化合物１は水溶性ではないため、２−４−ジ−ｎ−ペンチルフェノール中に分散させなければならなかった。
図２に示した結果は、このカップリング剤は分析要素において有用ではなく、得られるダイナミックレンジは非常に狭いことを示唆している。
【００３６】
比較例２：分析要素におけるカップリング剤１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロベンゾ〔Ｉ．Ｊ〕キノリジン（化合物４、ジュロリジン）
実施例１と同様に分析要素を作製して各種濃度のアセトアミノフェン試料を点着したが、但し、化合物２（ＴＨＱＳＯ3 Ｈ）の代わりに化合物４（ジュロリジン）を使用した。化合物４は水溶性ではないため、２−４−ジ−ｎ−ペンチルフェノール中に分散させなければならなかった。
図３に示した結果は、このカップリング剤で得られるダイナミックレンジは非常に狭いため、本発明の目的には有用ではないことを示唆している。
【００３７】
実施例２：分析要素における酸化剤としてのチロシナーゼ
この実施例は実施例１と同様に実施したが、但し、１７５，０００Ｕ／ｍ2 のアスコルビン酸オキシダーゼの代わりに別の酸化剤として６，４００Ｕ／ｍ2 のチロシナーゼを使用した。反射率濃度法により６７０ｎｍにおける濃度応答を測定した。得られた濃度について濃度／予測値スプライン(spline)を作成し、その濃度から試料のアセトアミノフェン濃度を予測した。
分析要素の濃度応答に基づいて行われた予測（表３）は、試験用要素に点着した検査流体中の既知のアセトアミノフェン濃度とよく相関している。
【００３８】
分析要素における酸化剤としてチロシナーゼを使用した例
表３
アセトアミノフェン濃度 (mg/dL) 濃度応答 (670 nm) 予測値 (mg/dL)
０．１ ０．１６５ ０．１
０．５ ０．１７８ ０．５
１．０ ０．１９０ ０．９
１．９ ０．２２０ １．９
３．０ ０．２５１ ３．０
３．９ ０．２８０ ４．１
５．２ ０．３０７ ５．２
９．８ ０．４９５ １０．０
２０．９ ０．６５０ ２０．８
２９．４ ０．７２３ ２９．４
【００３９】
実施例３：分析要素における酸化剤としてフェリシアン化カリウムを使用した例合成後、カップリング化合物２を表１ｂに示したように酸化剤としてフェリシアン化カリウムを用いた本発明の分析要素に塗布した。その要素を、各種既知濃度（０．０、１０、２４、５０、１００、１４６、１９３、２４７、２９５、３５０及び３９１ｍｇ／Ｌ）のヒト血清中のアセトアミノフェンをアッセイする際の性能について試験した。
図４に示した反応速度応答は、このフェリシアン化物によると、実施したダイナミックレンジ（１〜３０ｍｇ／ｄＬ）の全体にわたり良好な感度が得られることを示唆している。表１ｂの要素構造において別の金属塩を使用した場合には、反応速度が非常に遅くなった（表Ａ）。フェリシアン化物が、他の試験した酸化剤と比較して低い酸化還元電位に基づいてより迅速な反応速度を提供することは意外であった。
【００４０】
表Ａ
物質 酸化還元電位 反応速度
硫酸第二銅 ＋０．３４Ｖ 遅い
塩化第二銅 ＋０．３４Ｖ 遅い
硝酸第二鉄 ＋０．７７Ｖ 非常に遅い
硝酸銀 ＋０．５９Ｖ 非常に遅い
硝酸銀 ＋０．８１Ｖ 非常に遅い
フェリシアン化カリウム ＋０．４６Ｖ 非常に速い
【００４１】
本発明をその好ましい実施態様を特に参照しながら説明してきたが、本発明の精神及び範囲内で各種変更が可能であることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の分析要素の性能を示すグラフである。
【図２】比較例の分析要素の性能を示すグラフである。
【図３】別の比較例の分析要素の性能を示すグラフである。
【図４】本発明の分析要素の性能を示すグラフである。
Claims (10)
- 支持体表面に少なくとも一つの試薬層を含み、前記試薬層中に下記（ａ）〜（ｃ）を含有する、水性流体中のアセトアミノフェンを測定するための分析要素：
（ａ）アリールアシルアミダーゼ酵素；
（ｂ）パラアミノフェノールをカップリング剤に対して酸化的カップリングさせて着色化合物を生成することができるアルカリ金属又はアルカリ土類金属のフェリシアン化物；並びに
（ｃ）下記一般式で示される水溶性の発色性カップリング剤：
Ｒ1とＲ6が一緒になって、部分飽和環を形成するエチレン、トリメチレン又はテトラメチレン基を表し、
Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は各々独立に水素、炭素原子数１〜４個のアルキル基及び炭素原子
数１〜４個のアルコキシ基から選ばれる｝。 - マレイミドをさらに含有する、請求項１に記載の分析要素。
- 支持体表面に、前記支持体から順に、
（ａ）アリールアシルアミダーゼ酵素と、パラアミノフェノールを発色性カプラーに対して酸化的カップリングさせて着色化合物を生成することができるフェリシアン化物と、請求項１に記載の水溶性の発色性カップリング剤とを内部に有する単一又は複数の層；及び
（ｂ）多孔性展開層を液絡可能に含む、水性流体中のアセトアミノフェンを測定するための請求項１に記載の多層分析要素。 - 前記フェリシアン化物がアルカリ金属のフェリシアン化物塩である、請求項１に記載の分析要素。
- 前記カップリング剤が１−（３−スルホプロピル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリンである、請求項１に記載の分析要素。
- 前記分析要素のｐＨを６．５〜８．５の範囲内に維持するための緩衝剤をさらに含有する、請求項１に記載の分析要素。
- 支持体表面に、前記支持体から順に、
１−（３−スルホプロピル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリンを内部に有する第一の試薬層；
フェリシアン化物塩及びアリールアシルアミダーゼを内部に有する第二の試薬層；並びに
多孔性展開層；
を含む、水性流体中のアセトアミノフェンを測定するための請求項１に記載の多層分析要素。 - マレイミドをさらに含有する、請求項７に記載の分析要素。
- 前記マレイミドが前記展開層中に存在する、請求項８に記載の分析要素。
- （ａ）請求項１又は７に記載の分析要素に水性液体試料を接触させる工程；及び
（ｂ）着色化合物の生成量を前記液体試料中のアセトアミノフェン濃度と相関させる工程
を含む、水性液体中のアセトアミノフェンを測定するための方法。
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