DE69303279T2

DE69303279T2 - Modifizierung von biologischen makromolekülen durch mikrowellen

Info

Publication number: DE69303279T2
Application number: DE69303279T
Authority: DE
Inventors: Anil Jhingan
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1992-04-16
Filing date: 1993-04-16
Publication date: 1997-01-02
Anticipated expiration: 2013-04-17
Also published as: ATE139576T1; AU671644B2; ES2091005T3; DK0640148T3; WO1993021344A1; DE69303279D1; AU4290293A; EP0640148B1; PL305762A1; EP0640148A1; CA2118249A1; PL171601B1; GR3020867T3; US5350686A; NZ252853A; BR9306252A; JPH07508644A

Description

Technsiches Gebiet

Eine neue Technik, die Mikrowellenenergle zur enzymatischen Spaltung von DNA-Molekülen verwendet, wird offenbart.

Stand der Technik

Die enzymatische Spaltung isolierter DNA aus Procaryonten, Eucaryonten und Plasmiden ist ein zeitraubender, aber notwendiger Schritt zur weiteren Untersuchung von Genen und erfordert die konsistente Spaltung von DNA-Molekülen oder Segmenten an spezifischen Stellen. Einige Faktoren können das Ergebnis beeinflussen. Schwankungen in Ausbeute und Qualität der gespaltenen Fragmente ergeben sich wahrscheinlich von Spaltung zu Spaltung aus unbeständigen Temperaturen und enzymatischen Aktivitäten, die mit den Stunden auftreten, die zum erreichen einer vollständigen Spaltung von großen Makromolekülen notwendig sind. Verunreinigungen in DNA-Proben können die Bearbeitung verzögern und unbeständige Produkte erzeugen.
Traditionell werden Spaltungen von DNA mit Restriktions-Endonukleasen, in einem Puffer, der Salze und Reduktionsmittel enthält, in einem Inkubator bei 37ºC, was als Temperatur-Optimum der Aktivität der meisten Enzyme angesehen wird, durchgeführt. Sambrook, J., Fritsch, E.F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989). Die Inkubationszeit verändert sich mit dem Typ und der Qualität der DNA und der speziellen verwendeten Restriktions-Endonuklease. Obwohl die Spaltung von Plasmid-DNA, mit einigen Enzymen unter Verwendung einer großen Enzymmenge, in einer Stunde erreicht werden kann, benötigt i. a. die Spaltung genomischer DNA mit Restriktions-Endonukleasen acht Stunden bis übernacht und ist damit nach üblichen Verfahren eine zeitraubende Technik. Dementsprechend verbleibt ein Bedürfnis für ein schnelles, wirkungsvolles und beständiges Verfahren zur Spaltung von DNA.
Die Wirkungen von Mikrowellenenergie auf chemische Verfahren wurden über viele Jahre untersucht. Abramovitch, et al., Org. Prep. Proced. Int. (1991) 23:683-711. Mikrowellen wurden zum Antreiben der Synthese von Radioarzneimitteln (Hwang, et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun. (1987) 23:1799-801), Hydrolysen (Abramovitch, et al., (1991) Tetrahedron Let. 32:5251-54), Polymerisationen (U.S. Patent Serial No. 3,432,413), und der Synthese organischer Verbindungen (Gedye, et al., Can. J. Chem. (1991) 69:706-11; Ito, et al. J. Mol. Evol. (1990) 31:187-94) verwendet. Die Hydrolyse biologischer Substanzen wurde ebenso untersucht. Jahngen, et al., J. Org. Chem. (1990) 55:3406-9; Margolis, et al., J. Auto. Chem. (1991) 13:93-95; Feinberg, et al. (1991) Analusis 19:47-55.
Wurden jedoch lebende Systeme oder Gewebe einer konzentrierten Mikrowellenenergie ausgesetzt, so waren die Effekte in den meisten Fällen gesundheitsschädlich. Belkhode, et al., J. Microwave Power (1974) 9:23-29; Galli, et al., Meth. Enzymology (1982) 86:635-642; Huai, et al., J. Bioelecricity (1984) 3:361-366; Baranski S., Amer. J. Phys. Medicine (1972) 51:182-191. Microwellenstrahlung hemmt die Synthese von DNA und erhöht Chromosomenveränderungen. Garaj-Vrhovac, V., et al., Mutation Res. (1990) 243:87-93. Eine blockierte DNA-Synthese in bestrahlten Zellen und eine erhöhte Reproduktion in nicht verletzten Zellen wurden vorgeschlagen, um die anfängliche Abnahme, der ein Anstieg der Mitoseseaktivität von Myelocaryocyten nach Bestrahlung mit Mikrowellen folgt, zu erklären. Obukhan, E. I., Tsitol. Genet. (1984) 18:264-267 (Übersetzung mitgeliefert).
In einigen Untersuchungen waren die Ergebnisse der Strahlenbelichtung jedoch weniger eindeutig. Ein Ansteigen der zellulären Synthese oder Enzymaktivität wurde nicht beobachtet. Byus, et al., Cancer Res. (1988) 48:4222-4226. Einige Forscher fanden heraus, daß Mikrowellenbestrahlung keine Wirkung auf die Enzymaktivität oder die DNA-Reparatursynthese hat. Ward, et al., J. Microwave Power (1975) 10:315-320; Meltz, et al., Radiat. Res. (1987) 110:255-66. Andere Berichte zeigen sowohl eine Verstärkung als auch eine Unterdrückung der zellulären Enzymaktivität Dutta, S.K. und Verma, M., Curr. Sci. (1989) 58:58-63; Dutta, S.K. und Verma, M., Curr. Sci. (1988) 57:779-786.
Gleichgültig ob induzierend oder hemmend, die meisten beobachteten Mikrowellenwirkungen wurden der erhöhten Temperatur aufgrund der Energieexposition zugeordnet; Belkhode, et al., J. Microwave Power (1974) 9:23-29, jedoch deuten die Ergebnisse einiger Studien darauf hin, daß termische Effekte allein nicht für alle beobachteten Auswirkungen verantwortlich sind. Baranski, a. a. O.
Für die Synthesen, Hydrolysen und anderen Modifizierungen der großen Moleküle mit Mikrowellenstrahlung wurden nur einfache anorganische und organische Reagentien, wie Schwefelsäure oder Natriumhydroxid, verwendet. Wurde desweiteren Mikrowellenenergie angewendet, um beschränkte einstufige chemische Reaktionen anzutreiben, so waren die Ergebnisse unterschiedlich. Unbeständige Temperaturen, andere Reagentien und die Absorptionseigenschaften der Moleküle selbst, können für einen Großteil dieser Schwankungen verantwortlich sein. Gedye, a. a. O.; Belkhode, a. a. O.
Obwohl es Berichte gibt, über DNA-Moleküle, die Mikrowellenenergie absorbieren, zeigen andere Studien, daß Ionen und Wassermoleküle für diese Absorption verantwortlich sein können. Davis, et al., Biopolymers (1989) 28:1429-1433; Gabriel, et al., Biophys. J. (1989) 55:29-34; Maleev, et al., Biopolymers (1987) 26:1965-1970; Maleev, et al., Biopolim Kletka (1986) 2:35-38 (Übersetzung mitgeliefert). Radiation Research 127/2, 1991,pp. 164-170 beobachtet die spezifische Aktivität der RNAse L durch Abbau des synthetischen Oligonucleotids Poly (U)&supmin;³²P und vermerkt eine erhöhte Aktivität der RNAse L bei Bestrahlung der Probe mit Mikrowellen. Wie oben beschrieben, wurde bei untersuchungen über die DNA-Synthese oder -Reparatur nach Bestrahlung mit Mikrowellen eine Erhöhung der Hemmung oder Schädigung gemessen, was darauf hinweißt, daß DNA und die an der Synthese, Teilung und Reparatur beteiligten Enzyme durch die Bestrahlung mit Mikrowellen schädlich beeinflußt werden.
Jüngste Beobachtungen an isolierten DNA-Molekülen, die mit Mikrowellenenergie behandelt wurden, unterstützen diese Hypothese. Nach Bestrahlung mit Mikrowellenenergie zeigte Plasmid DNA Einzel-Strangbrüche, stellenweise Strangtrennung und Pseudo-Restriktionsspaltstellen. Narasimhan, V. und Huh, W. K., Biochem. International (1991) 25:363-370. Die Zahl der Einzel- und Doppelstrangbrüche steigt in einer linearen Beziehung sowohl zur angewendeten Leistung, als auch zu der Dauer der Mikrowellenexposition. Sagripanti, et al., Radiat. Res. (1987) 110:219-231. Kein Forscher bemühte sich darum, Enzym-katalysierte Reaktionen auf biologische Moleküle, im besonderen auf große Makromoleküle, wie DNA und RNA durch Verwendung von Mikrowellenenergie, anzutreiben. Tatsache ist, daß Mikrowellen scheinbar als eine Energiequelle für diese Stufe der makromolekularen Forschung vermieden wurden. Z. B. fand Stroop et al., Anal. Biochem. (1989) 182:222- 225, daß DNA nach einem Verfahren, das Mikrowellenenergie verwendet, ohne sichtbaren Schaden denaturiert werden konnte, aber dennoch wählten sie die enzymatische Spaltung der DNA nach Standardverfahren aus und nicht die Mikrowellendenaturierung.

Offenbarung der Erfindung

Es wurde nun entdeckt, daß die Mikrowellenstrahlenexposition eines Spaltansatzes, der Nukleinsäurenmoleküle und ein Enzym, das solche Moleküle spaltet, enthält, das enzymatische Spaltverfahren sauber, genau und in einer beträchtlich kürzeren Zeit als nach üblichen Verfahren vervollständigen kann. Während die allgemeine Erfahrung aus dem Mikrowellenkochen einen dazu verleiten könnte, eine Vergrößerung der Spaltgeschwindigkeit zu erwarten, steht die Entdeckung, daß die Reaktion sauber und genau ist, im Gegensatz zu veröffentlichten Berichten über Strangbrüche und andere DNA-Beschädigungen als ein Ergebnis der Bestrahlung. Sagripanti, a. a. O.; Narasimhan, a. a. O..
Während sich die hierin erläuterte spezifische Ausführungsform auf die empfindliche und komplexe Spaltung von DNA mit Restriktions-Endonukleasen richtet, wurde nun bestimmt, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Beschleunigung jeder Enzym-katalysierten Reaktion mit wenigen Handgriffen an der Bestrahlungszeit und der Energiehöhe angewendet werden kann. Alle getesteten Enzyme waren voll aktiv, nachdem sie über ihre Arbeitsexpositionsdauer eingesetzt waren. Die Reaktionen sind nach wenigen Minuten vollständig abgelaufen, die Ergebnisse sind in hohem Umfang reproduzierbar, und das Verfahren ist für die Automatisierung geeignet. Demzufolge liefert die Erfindung ein Verfahren zur enzymatischen Modifizierung eines biologischen Makromoleküls, das die Stufe des Betrahlens einer Zusammensetzung, die das biologische Makromolekül und ein Enzym enthält, mit ausreichender Mikrowellenenergie, zur Beschleunigung der Aktivität des Enzyms, enthält. Die erfindungsgemäß nützlichen biologischen Makromoleküle schließen DNA- und RNA-Stränge, Proteine, Polysaccharide, Mukopolysaccharide und ähnliche polymere Enzymsubstrate ein. Das Enzym kann ein oder mehrere der vielen Restriktions-Endonukleasen, im Falle von DNA oder RNA oder eine Protease, Saccharidase oder ein anderes Enzym, für das das Makromolekül ein Substrat ist, sein.
Ohne auf eine Theorie festgelegt werden zu wollen, scheint die DNA-Helix ausreichend Mikrowellenenergie zu absorbieren, um Teile des Moleküls zu rotieren oder sich durch lokalisiertes Übererhitzen von Teilen der Helix zu öffnen oder zu denaturieren, so daß die geeignete Orientierung für die enzymatische Spaltung der Stränge erreicht wird. Jedoch ist es gegenwärtig schwierig, über einen exakten Katalysemechanismus Vermutungen anzustellen.
Als ein Ergebnis stellt diese Verwendung der Mikrowellenbestrahlung eine bemerkenswerte Verringerung der Zeit, die zur Durchführung einer vollständigen und reproduzierbaren Spaltung von DNA, die nur 8 bis 11 Einheiten der meisten Enzyme verwendet, nötig ist, bereit. Das Verfahren ist besonders vielversprechend bei der Spaltung genomischer DNA, die routinemäßig von vielen Forschern angewendet wird und kann Ligierungs-, Clonierungs- und Vektorkonstruktionsexperimente ermöglichen. Die Schnelligkeit und Kostenersparnis dieses Verfahrens machen es zu einem potentiellen, neuen, allgemeinen Verfahren zur Spaltung von DNA und zur Bereitstellung einer Basis zur Automatisierung der Spaltung, ebenso wie anderer Typen molekularer Modifizierungen, die das Verwenden dieser Enzyme benötigen. Dementsprechend wird erfindungsgemäß in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zur enzymatischen Spaltung von Nukleinsäuren bereitgestellt, das die Stufe des Bestrahlens einer Zusammensetzung, die eine Nukleinsäure und ein Enzym enthält, mit ausreichender Mikrowellenenergie, um die Aktivität der Enzyme zu beschleunigen, enthält.
Mikrowellenenergie umfaßt wellenlängen von etwa 0.3 bis 30 cm, entsprechend den Frequenzen von 1-100 Gigahertz, und wird zwischen dem Radio- und dem Infrarotbereich des elektromagnetischen Spektrums gefunden. Die Menge elektromagnetischer Energie, die von einem lebenden Organismus absorbiert wird, ist durch die dielektrischen Eigenschaften des Gewebes, der Zellen und der biologischen Moleküle, bestimmt.
Die Erzeugung der Mikrowellenenergie ist nicht kritisch und kann auf jedem aus dem Stand der Technik bekannten Weg erfolgen. Tatsächlich ist eine besonders bevorzugte Einrichtung zur Anwendung von Mikrowellenstrahlung auf nicht-automatisierte Reaktionen der Mikrowellenofen, der ein Teil der Standardausrüstung der meisten biologischen Laboratoriern ist. Solche Mikrowellenöfen besitzen maximale Leistungspegel von etwa 500 Watt bis etwa 1 000 Watt. Selbst die kleinsten Öfen stellen einen genügend hohen Pegel an Mikrowellenstrahlung zur erfindungsgemäßen Verwendung bereit, und dementsprechend ist es angemessen, bei Öfen, deren Ausgangsleistung regulierbar ist, die untere Leistungseinstellung zu verwenden.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die unteren Leistungseinstellungen ebenso zur Zeitverteilung der angewendeten Leistung über ein längeres Zeitintervall verwendet und minimieren das Potential für eine lokalisierte Energieaufnahme und einen daraus resultierenden molekularen Schaden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Mikrowellenleistung auf die Probe über eine Serie von Intervallen mit "Ruhe-" Intervallen angewendet, bei denen die Mikrowellenenergie nicht auf die Probe angewendet wird. Intervalle, in denen die Leistung angewendet wird und "Ruhe-" Intervalle liegen angemessenerweise jeweils zwischen 1 und 60 Sekunden, wobei Intervalle, bei denen die Leistung angewendet wird, von 15 bis 60 Sekunden und Ruheintervalle von 0,5 bis 5 Sekunden bevorzugt werden. Am meisten bevorzugt wird die Leistung über Intervalle von 45 Sekunden angewendet, getrennt durch Ruheintervalle von 1 bis 2 Sekunden. Andere Intervalle wurden getestet, aber 45 Sekunden ergaben beständigere Ergebnisse als kürzere oder längere Perioden. Die dazwischenliegenden Ruheintervalle verhindern ungünstige thermische Wirkungen und können nur 1 bis 2 Sekunden kurz sein.
Es wird angenommen, daß in einer bevorzugten Variante der Ausführung der Erfindung, diese Anstrengungen zur Verteilung der angewendeten Leistung über die Zeit ergriffen werden müs sen, zusätzlich zum Verwenden der "Leistungs-" Einstellungen unterhalb des Maximums der Vorrichtung. Tatsächlich halten kommerzielle Mikrowellenöfen eine konstante Magnetron-Ausgangsleistung von 650 - 900 Watt und modulieren die angewendete Leistung durch Verändern des Arbeitszyklus des Magnetrons, wobei eine Einstellung von "1" mit einem 10 % Arbeitszyklus übereinstimmt und eine Einstellung von "9" mit einem 90 % Arbeitszyklus übereinstimmt. Am meisten bevorzugt werden Einstellungen von 1 bis 8 verwendet, d. h. ein Magnetron-Arbeitszyklus zwischen 10 und 80 % bei einer Ausgangsleistung von 700 bis 800 Watt. Diese Ausgangsenergie des Aggregats, die mit etwa 70 Watt-Sekunden bis 35 000 Watt-Sekunden korrespondiert, vorzugsweise mit 3 000 bis 3 500 Watt- Sekunden pro Intervall, wird in den oben beschriebenen Intervallen angewendet.
Die Zahl der in den Beispielen angewendeten Bestrahlungsintervalle liegt zwischen 1 und 42. Die zur Spaltung der isolierten DNA mit verschiedenen Restriktions-Endonukleasen benötigte optimale Zahl wurde durch Bestrahlen der Proben über einen Bereich von Intervallen, gekoppelt an eine Analyse der erhaltenen DNA-Produkte, zur gleichförmigen und vollstgndigen Spaltung, gefolgt von Elektrophorese und Ethidium-Bromidfärbung in Agrosegelen, bestimmt. Der bevorzugte Bereich der Gesamtbestrahlungszeit der meisten Enzyme lag zwischen 6 und 15 Minuten (8 bis 20 Intervalle) bei Leistungspegel 1. Innerhalb dieses Bereichs war die Mikrowellen-Energiebestrahlung ausreichend, um die Aktivität der Enzyme auf ein Niveau, das zu einer vollständigen Spaltung der Nukleinsäureprobe führt, zu beschleunigen.
Eine Erhöhung der Strahlungsmenge durch Verwenden einer höheren Leistungseinstellung wird in den meisten Fällen, wie oben beschrieben, die Gesamtbestrahlungszeit verringern. Jedoch gibt es bei den Mikrowellenöfen eine beträchtliche Schwankung der Wattleistung, aufgrund der Unterschiede in den individuellen Netzteil-Ausgangsleistungen, mit denen die Magnetrone der einzelnen Öfen ausgestattet sind. Als ein Ergebnis können die Magnetron-Ausgangsleistungen zwischen 600 bis 1 000 Watt variieren. Das Verwenden einer unteren Leistungseinstellung erhöht die Gesamtzeitdauer, über die ein individuelles Enzym arbeitet und vermindert die Möglichkeit, daß die Ausgangsleistung zu niedrig oder zu hoch für die optimale Aktivität eines Enzyms in einem bestimmten Ofen, ist. Desweiteren erlaubt ein vergrößerter Bereich der Bestrahlungszeiten die simultane Verwendung mehrerer unterschiedlicher Enzyme, die bei einem 100 %igen Aktivitätsniveau ohne Enzymabbau arbeiten. Bei dem am meisten bevorzugten Bestrahlungspegel, Leistungseinstellung 1, zeigt die Mehrheit der getesteten Enzyme 100 %ige Aktivität innerhalb der gleichen Gesamtbestrahlungsperioden.
Ebenso wurde die Maximalzahl an Intervallen bestimmt, oberhalb der die Enzymaktivität gehemmt wurde und die resultierende Spaltung unvollständig war. Vermutlich ist diese Hemmung eher auf den Abbau der Enzymstruktur zurückzuführen als auf eine alternative oder zusätzliche Beschädigung der DNA- Moleküle, da ein vollständiges Aussetzen der Enzymaktivität bei unterschiedlichen Zeiten unter Verwendung des gleichen DNA-Typs und unterschiedlicher Enzyme auftrat. Unter diesen Bedingungen wurden keine niedermolekularen Banden auf den Agarosegelen beobachtet, mit Ausnahme einer Bande in einer Probe bei einer sehr hohen Leistungseinstellung. Statt dessen wurde ein Anstieg des Gehalts an nicht-verdauter DNA oder hochmolekularer DNA beobachtet.
In den folgenden nicht-beschränkenden Beispielen waren die Mengen der für die Mikrowellenspaltung benötigten Enzyme mit den bei konventioneller Spaltungen verwendeten vergleichbar. Die getestete DNA-Menge war ebenfalls gleich, außer das 5 µg Plasmid DNA anstelle von 1 µg oder weniger bei allen Proben verwendet wurde.
Die über unterschiedliche Zeiten und Leistungseinstellungen angehäuften Daten deuten darauf hin, daß es einen vernünftigen Bereich gibt, über den Restriktions-Endonukleasen aktiv sind, zur vollständigen und konsistenten Spaltung. Daher ist es klar, daß zahlreiche spezifische, bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren optimiert werden können, um sich an das in Erwägung gezogene spezifische Reaktionssystem anzupassen. Desweiteren zeigt die erfindungsgemäße Einrichtung die Anwendbarkeit dieser Technik auf andere Mikrowellenausrüstungen mit unterschiedlichen Einstellungen und unterschiedlicher Ausgangsleistung.

Beispiel 1

Bestrahlungen wurden mit einem Mikrowellenofen der Marke Amana (Model R 311 T, 700 W) durchgeführt. Genomische DNA wurde aus einigen Pflanzenspezies nach Standardverfahren, die dem Stand der Technik gut bekannt sind und häufig angewendet werden, isoliert, ebenso wie nach der Methode von Jhingan, A. Meth. Mol. Cell. Biol. (1992) 3:15-22. Proben einiger unterschiedlicher DNA-Plasmidtypen wurden ebenso verwendet. 5 µg jeder genomischen DNA-Probe in einem 30 µl Reaktionsvolumen oder 5 µg Plasmid-DNA in einem 20 µl Reaktionsvolumen, das Puffer und 8 bis 11 Einheiten des geeigneten Restriktions-Enzyms (Boehringer Mannhein) in 1 µl (außer HindIII) enthielt, wurden während 45 Sekunden (45 s) Zeitintervallen in einer 0,5 ml Eppendorf-Röhre bestrahlt. Die Spaltungen mit HindIII benötigten doppelt soviel Enzym (20 Einheiten). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,5 M EDTA (pH 8) zu einer Endkonzentration von 10 mM und der Zugabe des Gelbeladungs-Farbstoffs beendet.
Identische Proben, die bei 37ºC über die gleiche Gesamtzeitdauer, die für die Mikrowellenspaltung benötigt wurde und über längere Zeiten (1 h, Plasmid DNA; 6 h, genomische DNA) behandelt wurden, dienten als Kontrolle. Zusätzlich wurden, um zu bestimmen ob die DNA-Proben als ein alleiniges Resultat der Bestrahlung degradieren oder brechen würden, Proben des Spaltansatzes ohne Enzym hergestellt, den gleichen Expositionszeiten in dem Mikrowellenofen wie die Enzym-enthaltenden Proben ausgesetzt. Die DNA in diesen Proben blieb nach der Behandlung ungespalten und Abbauprodukte konnten nicht beobachtet werden.
Die Ergebnisse der Mikrowellenbestrahlung und die Minimalanzahl an Perioden für eine vollständige Spaltung der genomischen Mais-DNA und einigen Plasmid-DNAs mit verschiedenen Restriktions-Endonukleasen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Anzahl der benötigten Bestrahlungsperioden zum Spalten der unterschiedlichen DNA-Proben mit individuellen Enzymen fielen in einen ziemlich engen Bereich. Daneben wurde für die verschiedenen Proben eine Analyse der Restriktions-Fragmente durchgeführt und genomische DNA-Spaltmuster wurden durch Southern-Blots analysiert. Es wurde herausgefunden, daß das Restriktionsmuster der Mikrowellen-bestrahlten Proben nach Elektrophorese identisch war zu Proben, die bei 37ºC über eine längere Zeitdauer unter konventionellen Bedingungen gespalten worden waren. Die meisten Kontrollproben, die bei 37ºC über die gleiche Zeitdauer inkubiert wurden, enthielten nur Teilspaltprodukte; einige Proben Plasmid-DNA waren nahezu vollständig gespalten.
Unterschiedliche EcoRI Spaltung einiger Plasmid DNAs legten den Schluß nahe, daß Verunreinigungen, die die Aktivität von EcoRI hemmten, in einigen der Plasmid-Präperate vorhanden waren. Dies entspricht dem Stand der Technik, aus dem hervorgeht, daß unreine DNA-Proben mehr Enzym und längere Inkubationszeiten, zur vollständigen Spaltung der DNA, benötigen. Jedoch ergab die Spaltung genomischer DNA, bei der EcoRI verwendete wurde, in hohem Umfang reproduzierbare Ergebnisse, was darauf hindeutet, daß die Quelle der Unterschiedlichkeit die verwendete Probe und nicht das Verfahren war.
Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, daß Mikrowellenbestrahlung eine schnellere und wirksamere Spaltung der DNA bewirkt als konventionelle Erhitzung. Tatsächlich war die Spaltrate mit Mikrowellenenergie 1 100 mal schneller als das konventionelle Erhitzungsverfahren, was darauf hinweißt, daß die Nützlichkeit dieser Technik, in Bezug auf bemerkenswerte Zeiteinsparungen und Herstellungsergebnisse im Gegensatz zu den veröffentlichten Berichten über die Inaktivierung von Enzymen durch Bestrahlung mit Mikrowellen stehen.

Beispiel 2

Um zu bestimmen, ob Kombinationen von Enzymen die DNA-Proben wirksam spalten würden, wurden EcoRI und PstI mit Plasmid DNA vereint und der Mikrowellenenergie ausgesetzt. Die Plasmid DNA war nach 8 Belichtungsintervallen auf Leistungspegel 1 vollständig gespalten. Das gesamte Verfahren benötigte ungefähr die gleiche Zeit, wie sie für die Enzyme bei alleiniger Verwendung benötigt wurde, und die Ergebnisse stimmten mit dem nach konventionellen Verfahren erhaltenen überein.

Beispiel 4

Ein Endpunkt des Spaltverfahrens wurde durch Erhöhung der Anzahl der Bestrahlungsintervalle über das Optimum des weiteren daraufhin erforscht, wann die Aktivität der Endonukleasen gehemmt wurde. Die Ergebnisse der Spaltung genomischer DNA sind in Tabelle II aufgeführt. Alle Enzyme benötigten eine mindestens doppelt so hohe Schwellenexposition, bevor eine verminderte Aktivität beobachtet wurde, ausgenommen HindIII, das einen engeren Bereich an optimaler Aktivität zu haben scheint.

Beispiel 5

Ein anderer Endpunkt des Spaltprozesses wurde durch Erhöhung der Leistungspegel ebenso erforscht, um herauszufinden, wann die Aktivität der Endonukleasen gehemmt wurde. Die Ergebnisse der Spaltung verschiedener Plasmid-DNAS sind in Tabelle III aufgeführt.
Abhängig von der Plasmid-DNA-Spezies trat eine Hemmung oder Deaktivierung über einen Bereich von Expositionsintervallen auf. Für ein Enzym (BamHI) führte eher die Expositionsdauer als ein höherer Energiepegel zu einer Hemmung. Alle anderen Enzyme jedoch wurden in kürzeren Zeiträumen gehemmt, wenn der Energiepegel erhöht wurde.

Claims

1. Verfahren zur enzymatischen Modifizierung eines biologischen Makromoleküls, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zusammensetzung, die das biologische Makromolekül und ein Enzym, für das das Makroinolekül ein Substrat ist, enthält, mit ausreichender Mikrowellenenergie, um die Aktivität des Enzyms zu beschleunigen, bestrahlt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Makromolekül DNA oder RNA ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Makromolekül DNA ist und daß das Enzym eine DNA-Restriktions-Endonuclease oder ein Gemisch davon ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung Mikrowellen mit einer Freguenz von 1800 bis 3000 MHz und einer Energie von 50 Watt bis 1000 Watt ausgesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamt-Bestrahlungszeit 1 bis 35 Minuten beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung während Intervallen von 1 bis 60 Sekunden bestrahlt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung periodisch bestrahlt wird, indem die Mikrowellenbestrahlung während Intervallen von 1 bis 60 Sekunden angewendet wird, die Intervalle bei der Einwirkung der Mikrowellenbestrahlung durch Intervalle, bei denen keine Mikrowellenbestrahlung erfolgt, von 1 bis 60 Sekunden getrennt sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestrahlungsintervalle etwa 45 Sekunden betragen und daß die Nicht-Bestrahlungsintervalle 1 bis 2 Sekunden betragen.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrowellenbestrahlung durch ein Magnetron mit einem Tastverhältnis während der Bestrahlungsintervalle von 10 bis 80% durchgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Magnetron eine Output-Energie von 650 bis 900 Watt besitzt. TABELLE I Schwelle für vollständige Spaltung durch Mikrowellenenergie bei Leistungsstufe 1 TABELLE II Schwelle für die Enzym-Inaktivierung durch Mikrowellenenergie TABELLE III Schwelle für die Enzym-Inaktivierung durch Mikrowellenenergie bei unterschiedlichen Leistungsstufen¹

¹ Leistungsstufen in diesem Beispiel korrespondieren zu 1/10 des %-Arbeitszyklus des Magnetrons, d. h., bei Stufe 2 strahlt das Magnetron während 20 % der Zeit. Einige Mikrowellenöfen kontrollieren die Ausgangsleistung des Magnetrons durch Verwenden von Schaltnetzteilen, die, mit oder ohne eine Zeitverschiebung, eine veränderbare Anzahl an AC-Zyklen an die Gleichrichterbrücke übermitteln und dadurch die Ausgangsleistung des DC-Netzteils an die Anode des Magnetrons kontrollieren. Während die Erfindung nicht an sich die spezifisch eingesetzte Mikrowellenapparatur betrifft, ist die Verwendung einer solchen Apparatur zur Erzeugung von Mikrowellenstrahlung vollständig beabsichtigt und liefert in der Praxis dieser Erfindung äquivalente Ergebnisse.