DE69231058T3

DE69231058T3 - Hochaffine humanisierte monoklonale antikoerper

Info

Publication number: DE69231058T3
Application number: DE69231058T
Authority: DE
Inventors: Sze Kim TAN
Original assignee: KS Biomedix Ltd
Current assignee: KS Biomedix Ltd
Priority date: 1991-03-04
Filing date: 1992-03-04
Publication date: 2007-07-19
Anticipated expiration: 2012-03-05
Also published as: EP0574461B2; WO1992015699A1; JPH06504916A; GB9104498D0; ES2148172T3; DK0574461T4; GR3034106T3; DE69231058T2; DE69231058D1; ATE193059T1; EP0574461B9; ES2148172T5; DK0574461T3; EP0574461A1; EP0574461B1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft monoklonale Antikörper mit hoher Affinität und deren therapeutische Verwendung.
Hintergrund der Erfindung
Monoklonale Maus- und Ratten-Antikörper sind in großem Umfang erhältlich, jedoch aufgrund der humanen Antikörper-Reaktion auf fremde Proteine für die therapeutische Anwendung bei Menschen im allgemeinen ungeeignet. Zur Bewältigung dieses Problems wurde vorgeschlagen, monoklonale Nager-Antikörper zu „humanisieren" durch Kombination der variablen Region des monoklonalen Antikörpers mit der von Human-Immunglobulin stammenden konstanten Region. Um diese in großer Menge herzustellen, kann das Gen für einen chimären oder anderen Antikörper dieses Typs in Myelom-Zellen oder irgendeine andere Wirts-Zelllinie transfiziert und davon exprimiert werden.
Ein weiterer Nachteil, der mit Nager-Antikörpern verbunden ist, ist deren niedrige Spezifität und Affinität. Die Affinitätskonstante (Ka) von beispielsweise einem monoklonalen Maus-Antikörper kann bis zu 10¹⁰ betragen. Eine Humanisierung wird oft den Ka-Wert reduzieren, der ursprüngliche Wert kann jedoch durch sorgfältige Wahl der Materialien und Versuchsbedingungen im wesentlichen erhalten werden. Dies war der Weg zu hochaffinen monoklonalen Antikörpern, die für die therapeutische Verwendung beim Menschen bestimmt waren.
Flynn et al., Immunology 69 (1990) 1–7, beschreiben die Produktion eines monoklonalen Schaf-Antikörpers gegen synthetische Peptide des Maul-und-Klauenseuche-Virus von einem Schaf/Maus-Heterohybridom-Fusionspartner. Es werden keine Daten bezüglich der Stabilität der Linie oder der Niveaus des sekretierten Antikörpers präsentiert, obwohl festgestellt wird, dass die hergestellten Linien keine oder schlechte Neutralisations/Schutz-Eigenschaften aufwiesen. Als mögliche Gründe dafür werden angegeben, dass (i) nur einmal vorkommende Epitope an der/dem Neutralisation/Schutz nicht beteiligt sind, (ii) Antikörperniveaus in den Überständen zu niedrig sind und (iii) nicht genug monoklonale Antikörper gegen diese Determinanten getestet wurden.
Groves et al., J. Endocrinol. 126 (1990) 217–222, beschreiben einen stabilen hochaffinen monoklonalen Schaf-Antikörper gegen Progesteron nach Fusion mit dem Maus-NS1-Myelom, obwohl eine parallele Fusion mit deren Heterohybridom-Fusionspartner durchgeführt wurde, welche zu höheren Fusionseffizienzen als die NS1-Zellen geführt hatte. Diese spezielle Linie war seit 28 Monaten stabil und sekretiert 5–10 μg/10⁶ Zellen/24 Stunden. Dies nimmt sich günstig aus im Vergleich zu der von Groves et al., Res. Vet. Sci. 43 (1987) 253–256, mitgeteilten früheren Arbeit, wo eine ähnliche NS1 × Schaf-Fusion in zwei Zelllinien resultierte: eine beendete die Sekretion nach 2 Monaten, die andere produzierte jedoch nach 4 Subklonierungsschritten 4 Monate nach der Fusion 2,5 ng/ml bei Konfluenz.
WO 91/09966 ist Stand der Technik gemäß Artikel 54(3) EPÜ. Sie offenbart eine CDR-gepfropfte, schwere Antikörperkette mit einer Domäne einer variablen Region, umfassend ein Akzeptor-Gerüst und Donor-Antigenbindungsregionen an bestimmten Positionen. Die CDR-gepfropften Antikörper sind vorzugsweise humanisierte Antikörper mit nicht-humanen Akzeptor-Gerüsten. Die Antikörper sind im allgemeinen von Nagern abgeleitet.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein chimärer monoklonaler Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst einen monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 1. Ferner umfasst für die Zwecke der Herstellung eines solchen Antikörpers neue heterologe DNA ein chimäres Gen, umfassend DNA der variablen Region, die für die schweren und leichten Ketten des monoklonalen Schaf- oder Rind-Antikörpers kodiert, und die Human-DNA der konstanten Region. Die Erfindung stellt ebenfalls ein Antikörper-Fragment nach Anspruch 5 bereit.
Ein Antikörper der Erfindung kann hergestellt werden nach Techniken, welche analog zu den für die Produktion und Chimärisierung von monoklonalen Maus-Antikörpern bekannt sind. Das Produkt kann jedoch eine viel höhere Affinität aufweisen.
Beschreibung der Erfindung
Zur Herstellung von Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung können verschiedene Techniken eingesetzt werden. Das Produkt ist überwiegend humanen Ursprungs, so dass es zufriedenstellend in einem Therapieverfahren, das bei einem Menschen durchgeführt werden soll, eingesetzt werden kann.
Ein vollständiger Antikörper umfasst schwere und leichte Ketten und konstante und variable Regionen. Die variablen Regionen umfassen ein variables Gerüst und hypervariable Regionen, innerhalb welcher die antigenbindenden Stellen lokalisiert sind. Die Erfindung schließt Antikörper-Fragmente ein, welche F(ab')₂- oder Fab-Fragmente sind, vorausgesetzt, dass mindestens ein Teil davon von Human-Immunglobulin stammt.
Konkreter umfasst ein „chimärer" vollständiger Antikörper der Erfindung die variable Region des hochaffinen Antikörpers und die konstante Region von Human-Immunglobulin. In allen Fällen ist das Produkt eine Kombination des hochaffinen Antikörpers und humaner Antikörper-Sequenzen.
Ein Produkt der Erfindung kann hergestellt werden durch ein Verfahren, welches im wesentlichen drei Schritte beinhaltet. Zuerst wird ein geeignetes Tier unter Verwendung eines Antigens immunisiert und B-Zellen, die einen Antikörper gegen dieses Antigen sekretieren, werden erhalten. Zweitens werden hochaffine monoklonale Antikörper und die dafür kodierenden Gene erhalten. Drittens werden diese Antikörper chimärisiert.
Das Tier, welches einer Immunisierung unterworfen wird, ist kein Nager, jedoch ein Säugetier, welches so ausgewählt ist, dass es Antikörper mit höherer Affinität ergibt. Geeignete Tiere sind Rinder und, zum Zwecke der weiteren Erläuterung, Schafe. Die Immunisierung von Schafen ergibt eine gute immunogene Reaktion auf eine Vielfalt von Antigenen. Deren Größe und Lebensdauer bedeutet, dass ihnen Antigen auf einer Vielzahl von Verabreichungswegen und über einen längeren Zeitraum als Nager verabreicht werden kann.
Wie im folgenden in Beispiel 1 erläutert, kann der hochaffine monoklonale Antikörper durch klassische Hybridom-Technologie, umfassend die Fusion der B-Zellen, welche hochaffine Schaf- oder Rind-Antikörper sekretieren, mit Myelomzellen und die Selektion resultierender Hybridome, erhalten werden. Alternativ können die B-Zellen der relevanten Spezies ausplattiert, selektioniert und amplifiziert werden, z.B. unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion; Phagen-Gewinnung kann ebenfalls eingesetzt werden, um mRNA aus ausgewählten Lymphozyten zu erhalten und damit die Antikörper-Gene.
Es folgt die Chimärisierung. Der monoklonale Antikörper, welcher in der vorliegenden Erfindung für diesen Zweck der Chimärisierung eingesetzt wird, besitzt vorzugsweise eine Affinitätskonstante von mindestens 10¹², bevorzugter mindestens 5 × 10¹², und am meisten bevorzugt mindestens 10¹³, z.B. bis zu 10¹⁴, 10¹⁵ l/Mol oder höher.
Es können verschiedene Chimärisierungstechniken eingesetzt werden, von denen alle den Zusammenbau von Sequenzen aus dem hochaffinen Antikörper und Sequenzen aus humanen Antikörpern beinhalten. Ein chimärer vollständiger Antikörper der Erfindung umfasst die variable Region des ersteren und die konstante Region des letzteren. Techniken zur Herstellung chimärer ganzer Antikörper sind bekannt.
Eine rekombinante Technologie zum Zwecke der Herstellung eines Antikörpers der Erfindung kann einen ersten Schritt umfassen, in dem eine große Anzahl von vollständigen Schaf- oder Rind-Antikörper-Molekülen von der „Hinge"-Region aufwärts sequenziert werden, z.B. für ein Spektrum von Schaf-IgG1's. Dies kann erfolgen entweder durch Isolierung von mRNA aus einer Anzahl von B-Zell-Klonen, möglicherweise unter Anwendung von PCR und somit Sequenzierung der DNA, oder durch Sequenzierung von affinitätsgereinigten polyklonalen IgG1-Antikörpern oder einer großen Anzahl von monoklonalen Antikörpern, falls verfügbar. Die Sequenzen können dann eingesetzt werden, um die Grenze zwischen den konstanten, variablen und hypervariablen Regionen für sowohl die schweren als auch die leichten Ketten zu definieren. Strukturmodellierung kann dann zum Zwecke des Vergleichs mit konstanten Human- und Maus-Regionen eingesetzt werden, um zu bestimmen, wieviel von der Sequenz des hochaffinen monoklonalen Antikörpers, d.h., der variablen Region, dem humanen Gen der konstanten Region hinzugefügt werden soll, um das Gesamtprodukt zu ergeben.
Ein Antikörper der Erfindung kann zur Therapie eingesetzt werden. Es ist wahrscheinlich, dass er von besonderem Wert bei der Behandlung von Krebs, Entzündung, z.B. rheumatoider Arthritis, und septischem Schock nach einer Organtransplantation, bei der Immunmodulation, für die passive Immuntherapie bei der Behandlung von Viren und zur Bereitstellung von Antikörpern gegen Bakterien sein wird. Für diesen Zweck kann der Antikörper zu einer geeigneten Zusammensetzung mit einem physiologisch annehmbaren Exzipienten, Verdünnungsmittel oder Träger formuliert werden.
Spezielle Vorteile von hochaffinen Antikörpern für die Therapie sind:

(i) Die Affinität steht in Beziehung zur biologischen Reaktion. Je höher die Affinität, desto besser ist wahrscheinlich die Reaktion.
(ii) Höher affine Antikörper werden zu einer schnelleren Bindung der Antikörper an die Target-Zellen oder zu schnellerer Immunneutralisierung führen. Dies bedeutet, dass mehr Antikörper an den Target-Stellen konzentriert sein werden, was direkt zu einer besseren Lokalisierung von Antikörper oder Antikörper-Konjugat durch Verringerung der nicht-spezifischen Bindung an andere Stellen führt. Dies ist ein wichtiger Gesichtspunkt bei der Krebsbehandlung, wo die Bindung an den Tumor auf Kosten der Bindung an andere Gewebe wie Nieren, Knochenmark und Leber erwünscht ist.
(iii) Eine höhere Affinität bedeutet, dass weniger Antikörper pro Dosis eingesetzt werden können, was zu mehr wirtschaftlich tragbaren Therapien führt. Dies ist ein relevanter Gesichtspunkt, wenn Konkurrenzreaktionen beteiligt sind, z.B. Bindung an ein Virus oder Lymphokin gegenüber der Virus- oder Lymphokin-Bindung an eine Zelloberfläche oder an einen Rezeptor.

Das folgende Beispiel 1 erläutert die Herstellung eines monoklonalen Schaf-Antikörpers mit hoher Affinität („Guildhay" bezieht sich auf Guildhay Antiseren, Guildford, Großbritannien).
BEISPIEL 1
Herstellung des Heteromyelom-Fusionspartners SFP1
SFP1 ist ein Schaf-Heteromyelom-Fusionspartner, der ursprünglich von der NSI-Zelllinie abgeleitet ist. Die Linie sekretiert weder Maus- noch Schaf-Immunglobuline. Die SFP1-Zellen wurden mit 8-Azoguanin oder 6-Thioguanin behandelt, durch Grenzverdünnung kloniert und auf HAT-Sensitivität überprüft. Die Zelllinie kehrte im Verlauf eines Zeitraums von 3 Jahren nicht zu HAT-Resistenz zurück.
1. RIA für Anti-T3-Schaf-Antikörper
Das Niveau der Antikörpersekretion war unbekannt, wahrscheinlich zuerst Subnanogramm-Mengen. Der RIA für das Screening des Kulturüberstandes mußte empfindlich sein und wurde von einem routinemäßig eingesetzten T3-Assay adaptiert. In Kürze, Kulturüberstände wurden mit iodiertem T3 inkubiert und gebundener Tracer unter Anwendung einer PEG-Sekundärantikörper-Prozedur abgetrennt.
Alle Verdünnungen erfolgten in 0,05 M Barbiton-Puffer (pH 8,6), enthaltend 0,1% BSA, RIA-Grad (Sigma). 100 μl iodiertes T3, 7,4 × 10⁵ S^–1/ml (20 μCi/ml) [> 4,44 × 10⁷ S^–1/μg (> 1,2 mCi/μg) T3, Amersham International] wurden zu 100 μl 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure (4 mg/ml), 200 μl Kulturüberstand, 100 μl Anti-Schaf-Esel-Immunglobulin (Guildhay) und 75 μl Gewebekulturmedium zugegeben. Ein Aliquot von polyklonalem Schaf-Antikörper gegen T3 (Guildhay), der 30% Bindung der gesamten Zählimpulse ergab, war in dem Screening-Assay als positive Kontrolle eingeschlossen. Die Röhrchen wurden mechanisch aufgewirbelt („gevortext") und 2 Stunden lang bei 37°C oder über Nacht bei 4°C inkubiert vor der Auftrennung durch Zugabe von 500 μl 6% Gew./Vol. PEG 6000 (BDH), Vortexen und 30-minütiges Zentrifugieren mit 3000 UpM. Die Pellets wurden 60 Sekunden lang gezählt.
2. Schaf-IgG-ELISA
200 μl einer Lösung von 7,5 μg/ml affinitätsgereinigtem Anti-Schaf-Esel-Immunglobulin (Guildhay), vorbehandelt, um Antikörper zu entfernen, die mit in fötalem Kalbsserum (FCS) vorhandenen Immunglobulinen kreuzreagieren, in Bicarbonatpuffer (pH 9,6) wurden 2 Stunden lang bei 37°C oder über Nacht bei 4°C an 96-Mulden-Mikrotiterplatten (Nunc Maxisorp) adsorbiert. Die Platten wurden mit PBS, enthaltend 0,1% Gelatine und 0,05% Tween^® 20, pH 7,4 (PBSGT) gewaschen. 200 μl Gewebekultur-Überstand oder Schaf-Gammaglobulin-Standards (Sigma), 1–1000 ng/ml, verdünnt in Gewebekulturmedium, wurden den Vertiefungen zugegeben und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden mit PBSGT gewaschen und 200 μl Meerrettichperoxidase-markiertes Anti-Schaf-Esel-Immunglobulin (Guildhay) den Vertiefungen zugegeben. Die Platten wurden 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert und mit PBSGT gewaschen.
200 μl Substrat, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) (Boehringer-Mannheim) in Citrat-Phosphat-Puffer, pH 5,5, + 0,04% H₂O₂ wurden zugegeben und die Farbentwicklung 30 Minuten lang bei 37°C gestattet. Die Reaktion wurde beendet durch die Zugabe von 50 μl 2,5 M H₂SO₄ und die Extinktion wurde bei 450 nm mit einem Titertek Multiskan Plus^® (Flow Labs) abgelesen.
Fusion
Die Lymphozyten für die Fusion wurden aus der Milz eines Schafes erhalten, welches wiederholt mit T3-BSA-Konjugaten über einen Zeitraum von 15 Jahren immunisiert worden war, um polyklonales Antiserum gegen T3 zu erhalten. Die letzte Auffrischung war 1 Woche für der Fusion. Ein kleines Gebiet der Milz wurde zerzupft, um eine Zellsuspension zu ergeben (große Klumpen undissoziierter Zellen wurden verworfen). Die Zellsuspension wurde gewaschen und zweimal in RPMI (kein FCS oder Ergänzungen) zentrifugiert. Keine weiteren Prozeduren, d.h. Mitogene, Anreicherungen oder Vorkultur, wurden vor der Fusion durchgeführt.
Parallele Fusionen wurden unter Verwendung des Heteromyelom-Fusionspartners SFPI und des Maus-NS2-Myeloms durchgeführt. Die Fusionen erfolgten in einem Verhältnis von 8 Milzzellen zu einer Myelomzelle, mit einer Gesamtzellzahl von 9 × 10⁸ in jedem Fall, unter Verwendung von 1 ml 50%iges PEG 1500 (BDH) in RPMI im Verlauf von 2 Minuten, gefolgt von langsamer Verdünnung mit 20 ml RPMI im Verlaufe von weiteren 8 Minuten. Die Fusionen wurden wie folgt ausplattiert:

i. 20% FCS, RPMI, Pyruvat (1 mM), Glutamin (2 mM), HAT (Gibco) pus Mäusemilz-Feeder-Zellen.
ii. 20% FCS, RPMI, Pyruvat, Glutamin, HAT + keine Feeder-Zellen.
iii.
iv. 10% FCS, 10% Schafserum, Pyruvat, Glutamin, HAT plus Feeder-Zellen.
v. 10% FCS, 10% Schafserum, Pyruvat, Glutamin, HAT, keine Feeder-Zellen.

Jede Fusion erfolgte in 3 × 96-Mulden-Platten von jedem der vier Parameter (24 × 96 Mulden insgesamt). Während der ersten Woche wurden Penicillin und Streptomycin den Kulturen zugegeben, als die Milz entfernt und unter nicht-sterilen Bedingungen transportiert wurde (Überführungszeit etwa 2 Stunden). 14 Tage nach der Fusion wurde HAT durch HAT ersetzt.
Ergebnisse
Die Anzahl der Klone, die aus den verschiedenen Behandlungen erhalten wurden, ist in Tabelle 1 zu sehen. Es ist eindeutig, dass aus der SFPI-Kreuzung (insgesamt 634) mehr Hybridom-Zelllinien resultierten als bei NS2 (insgesamt 634). Obwohl nicht so signifikant, scheinen Maus-Feeder-Zellen in diesem System hinsichtlich der Anzahl der gebildeten Hybridome vorteilhaft zu sein. Das Schafserum erhöhte die Anzahl der gebildeten Hybridome trotz gegenteiliger Hinweise in der Literatur nicht.
Zwei Monate nach der Fusion waren 57 Linien immer noch schwach positiv; eine Linie wurde für die weitere Untersuchung ausgewählt, da sie beträchtlich stärker war als die anderen. Diese stammte aus einer SFP1 × Milz-Kreuzung, die in 20% FCS ohne Feeder-Zellen gezüchtet worden war. Die resultierende Zelllinie 17C6 war unter dem Mikroskop 11 Tage nach der Fusion sichtbar (die frühesten Linien waren 4 Tage nach der Fusion sichtbar), wurde jedoch nicht als groß genug zum Screenen bis 22 Tage nach der Fusion betrachtet. Obwohl in diesem Stadium gemäß RIA stark positiv bezüglich T3-Antikörper, war sie für die Überführung zu 2-ml-Vertiefungen weitere 2 Wochen lang nicht konfluent genug, wonach HAT in dem Medium durch HT ersetzt wurde. Die Linie wurde 33 Tage nach der Fusion subkloniert (die Niveaus der Antikörpersekretion waren nicht verringert) und erneut 3 Monate nach der Fusion subkloniert. Trotz dieser anfangs sehr langsamen Wachstumsrate nahm die Rate so zu, dass sich die Linie derzeit mit Raten teilt, welche mit üblichen Maus- und Humanlinien vergleichbar sind, d.h., etwa 26 Stunden.
Tabelle 2 zeigt die Auswirkung von FCS- und Lammserum-Konzentrationen auf die Antikörperproduktion. Andere Experimente zur Untersuchung der Wirkungen von Lammserum und Mischungen von Lammserum und FCS oder FCS allein über einen 5–20%-Bereich auf exponentiell wachsende Kulturen zeigten, dass nach 1 Woche in Kultur die Niveaus der T3-Bindungsaktivität für FCS über den getesteten Bereich hinweg gleich waren, wobei etwa 85% der verfügbaren T3 gebunden wurden (konfluente Kulturen würden 100% binden). Über denselben Bereich wurden in Lammserum etwa 45% der T3 gebunden, wohingegen die Mischung von FCS und Lammserum eine dazwischenliegende 55%ige Bindung nach 1 Woche zeigte. Nach 48 Stunden Wachstum schien es, dass das Lammserum für die Zelllinie am besten war.
Antikörper-Charakteristiken
Die Assoziationskonstante K_a für den monoklonalen Schaf-Antikörper 17C6 wurde als 2,6 × 10¹³ l/Mol befunden, welches sich vergleichsweise gut gegenüber 1,39 × 10¹³ l/Mol für Serum aus einer frühen Blutentnahme und 2,13 × 10¹³ l/Mol von der besten polyklonalen Blutentnahme (4 Monate vor der Fusion) ausnimmt. Die Kreuzreaktivitäten dieser drei Antikörper sind in Tabelle 3 dargestellt. Die Standardkurven für das beste klonale Antiserum und den monoklonalen Antikörper 17C6 waren ähnlich.
17C6 wurde unter Verwendung von monoklonalem Schaf-IgG1, -IgG2, -IgA, -IgM und leichten Ketten auf einem Dot-Blot-System auf Nitrocellulose-Basis subklassifiziert und als ein IgG1 befunden.
Die Zelllinie 17C6 ist in kontinuierlicher Kultur stabil. Seit dem zweiten Subklon gab es keine Hinweise auf einen Überwuchs durch nicht-sekretierende Zellen oder Verringerung der Antikörperproduktion. Die Linie wurde zweimal erneut subkloniert und alle resultierenden Subklone bei beiden Gelegenheiten sekretierten identische Mengen an Antikörper. Die Zelllinie wurde erfolgreich eingefroren, wieder aufgetaut und fuhr fort, normale Mengen an Antikörper zu produzieren. Versuche zur Destabilisierung der Zelllinie durch „Stress" schlugen fehl, wobei die Linie ähnliche Niveaus an Antikörper in 2,5–20% FCS sekretierte. Bei Verwendung des Ansatzes von FCS, in dem die Fusion durchgeführt wurde, wurde keine Variation in den Antikörper-Sekretionsniveaus nachgewiesen. Im Verlauf einer vergleichbaren Zeitspanne in serumfreiem Ultroser-Medium nahmen die Sekretionsraten allerdings ab, wurden jedoch bei Rückkehr zu serumhaltigen Medien wiedererhalten. Die Wirkung betrifft somit eher die Umgebung der Zellen als eine Veränderung innerhalb der Zelle. Von anderen Hybridom-Linien der Maus und des Menschen wurde gezeigt, dass sie vergleichbare Mengen an Immunglobulin sowohl in Serum-Medien als auch serumfreien Medien sekretieren. Dies legt nahe, dass chemisch definierte Medien, welche sowohl Maus- als auch Human-Hybridom-Wachstum unterstützen und Sekretionsraten, die mit Serum vergleichbar sind, modifiziert werden können, um es Schaf-Linien zu ermöglichen, unter solchen Bedingungen gezüchtet zu werden. Der erforderliche zusätzliche Faktor, der für diese Zelllinie benötigt wird, wird in Maus-Feeder-Zellen nicht gefunden.
Andere Versuche zur Destabilisierung der Zelllinie beinhalteten die Subklonierung in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren oder Feeder-Zellen. Die Zelllinie war unter diesen Bedingungen gut zu subklonieren und widerstand der Art von Stress, den viele widerstandsfähige Maus-Linien nicht ertragen können. Es wurde gezeigt, dass die Zelllinie das Hindurchgehen durch eine Adaptionsphase nicht benötigt, um den Scherkräften zu widerstehen, wenn sie von statischen zu Schleuderkulturen in 2,5% FCS überführt wird, im Gegensatz zu einigen Maus-Linien, welche eine Akklimatisierung benötigen.
Das folgende Beispiel 2 erläutert die Humanisierung des hochaffinen monoklonalen Antikörpers von Beispiel 1.
BEISPIEL 2
Der Antikörper von Beispiel 1 wird einer Chimärisierung nach irgendeinem der oben beschriebenen bekannten Techniken unterworfen. Das Produkt ist ein Antikörper, welcher die vorliegende Erfindung verkörpert, geeignet zur Verabreichung an Menschen. TABELLE 1
TABELLE 2
TABELLE 3 Darstellung der prozentualen Kreuzreaktivitäten eines monoklonalen Schaf-Antikörpers im Vergleich zu polyklonalem Antiserum

Claims

Chimärer monoklonaler Antikörper umfassend die konstante Region von Human-Immunglobulin und die variable Region eines monoklonalen Schaf-Antikörpers oder eines monoklonalen Antikörpers vom Rind mit einer Affinität von mindestens 10¹¹ l/Mol.
Antikörper nach Anspruch 1, worin die Aktivität mindestens 10¹² l/Mol beträgt.
Antikörper nach Anspruch 1, worin die Aktivität mindestens 5 × 10¹² l/Mol beträgt.
Antikörper nach Anspruch 1, worin die Aktivität mindestens 10¹³ l/Mol beträgt.
Antikörper-Fragment, welches ein F(ab')₂- oder Fab-Fragment eines Antikörpers nach Anspruch 1 ist, in dem mindestens ein Teil von Human-Immunglobulin stammt.
Antikörper-Fragment nach Anspruch 5, worin die Aktivität mindestens 10¹² l/Mol beträgt.
Antikörper-Fragment nach Anspruch 5, worin die Aktivität mindestens 5 × 10¹² l/Mol beträgt.
Antikörper-Fragment nach Anspruch 5, worin die Aktivität mindestens 10¹³ l/Mol beträgt.
Verwendung eines Antikörpers nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung eines menschlichen Patienten, der ein Antigen beherbergt, an welches der Antikörper bindet.
Verwendung eines Antikörper-Fragments nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung eines menschlichen Patienten, der ein Antigen beherbergt, an welches das Antikörper-Fragment bindet.