DE69132681T2

DE69132681T2 - Klonierung und Expression von Borrelia Lipoproteinen

Info

Publication number: DE69132681T2
Application number: DE69132681T
Authority: DE
Inventors: Alan G. Barbour; John J. Dunn
Original assignee: Brookhaven Science Associates LLC
Current assignee: Brookhaven Science Associates LLC
Priority date: 1990-12-21
Filing date: 1991-12-18
Publication date: 2001-11-22
Anticipated expiration: 2011-12-19
Also published as: US5571718A; EP0492964A2; JP2706397B2; CA2057536A1; AU656159B2; NO915051L; FI105924B; NO303453B1; IE914449A1; CA2057536C; AU8983491A; PT99918B; FI916023A0; ATE204020T1; DE69132681D1; ZA919965B; PT99918A; FI916023A; IE66473B1; JPH0641195A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft eine rekombinante Variante des äußeren Oberflächenproteins A (OspA) von Borrelia burgdorferi, der Spirochäte, die für die Lyme-Krankheit verantwortlich ist, und ein Verfahren zu deren Herstellung.
Borrelia-Spirochäten sind für verschiedene Krankheiten, wie die Lyme-Krankheit, verantwortlich. Die Lyme-Krankheit ist eine Infektion, die durch die Spirochäte Borrelia burgdorferi, die von Zecken übertragen wird, verursacht wird. Die Spirochäte wird auf Menschen und Tiere durch den Biss einer Zecke übertragen und kann ernste dermatologische, arthritische, neurologische und andere pathologische Erkrankungen bei einem infizierten Wirt verursachen. In der letzten Zeit ist die Lyme-Krankheit zu einem ernsten epidemiologischen Problem in Nordamerika wie auch in Europa, Asien und der Sovietunion geworden.
Es ist gut dokumentiert, dass Personen und Tiere, die durch Borrelia-Pathogene infiziert worden sind, typischerweise Antikörper in Reaktion auf die Anwesenheit von verschiedenen Borrelia- Antigenen, einschließlich Lipoproteinen der äußeren Membran, entwikkeln. Beispielsweise entwickeln Patienten, die mit der Lyme- Krankheit infiziert sind, Antikörper gegen das äußere Oberflächenprotein A (OspA), ein Lipoprotein der Borrelia burgdorferi- Spirochäte. Siehe Craft, J. E., Fischer, D. K., Shimamoto, G. T., und Steere, A. C., "Antigens of Borrelia burqdorferi recognised during Lyme disease. Appearance of a new immunoglobulin in response and expansion of the immunoglobulin G response late in the illness", J. Clin. Invest., 78 : 934-939 (1986). Siehe auch Barbour, A. G., Heiland, R. A., und Howe, T. R., "Heterogeneity of major proteins in Lyme disease borrelia: a molecular analysis of North American and European isolates", J. Infect Dis., 152: 474-484 (1985). Das äußere Oberflächenprotein A (OspA) ist ein Lipoprotein, das von der Nukleotidsequenz des ospA-Gens, das in der DNA der B. burgdorferi- Spirochäte vorhanden ist, kodiert wird. Die Nukleotidsequenz, die das Volllängen-Wildtyp-OSpA kodiert, (siehe SEQ ID NO: 1) ist bereits früher für B31, den nordamerikanischen Stamm von B. burgdorferi, bestimmt worden. Siehe Bergstrom, S., Bundoc, V. G., & Barbour, A. G., "Molecular Analysis of linear plasmid-encoded major surface proteins, OspA and OspB of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi", Mol. Microbiol., 3: 479-486 (1989). Folglich ist die Aminosäuresequenz von OspA aus den Nukleotiddaten vorhergesagt worden (siehe SEQ ID NO: 2).
Von einem klinischen Standpunkt aus ist es hochgradig wünschenswert, ein Verfahren zu entwickeln, um große Mengen von hoch gereinigten Borrelia-Lipoproteinen in einer löslichen Form für eine Verwendung in Immunoassays und anderen diagnostischen Screening- Tests, die die Anwesenheit von Antikörpern gegen diese Proteine in den Seren von Patienten, die mit Borrelia-Spirochäten infiziert sind, nachweisen, zu erzeugen. Darüber hinaus wären lösliche, hoch gereinigte Formen dieser Lipoproteine potentiell als klinische Immunogene zum Impfen sowohl von Menschen als auch Tieren gegen Borrelia-Pathogene wie auch als nützliche Forschungswerkzeuge für nachfolgende im Labor erfolgende Manipulationen, die das Trennen und Reinigen von Antikörpern gegen solche Proteine umfassen, wertvoll.
Vom Standpunkt der Technik der in vitro-DNA-Rekombination aus ist es hochgradig wünschenswert, eine Nukleotidsequenz oder ein Gen zu erhalten, das bis zu einem sehr hohen Ausmaß in einem rekombinanten Wirt/Vektor-Expressionssystem exprimiert werden kann (Überexpression), um große Mengen des resultierenden rekombinanten Proteins zu erhalten, während die gewünschte spezifische Reaktivität beibehalten wird.
Es sind frühere Versuche unternommen worden, um gereinigte, lösliche Borrelia-Lipoproteine durch das Züchten und die nachfolgende Reinigung von Borrelia-Zellkulturen zu isolieren. Es gibt jedoch mehrere Nachteile bei diesem Ansatz. Die Züchtung und die nachfolgende Reinigung dieser Proteine aus rohen Zellextrakten von Borrelia ist sehr zeitaufwändig und teuer. Zusätzlich bedingen die Züchtung und die Manipulation von lebenden Borrelia-Kulturen zusätzliche signifikante Risiken für das Laborpersonal. Am wichtigsten ist jedoch, dass die Volllängen-Wildtyp-Versionen von Borrelia-Lipoproteinen, die durch dieses Verfahren erhalten wurden, schlechte Löslichkeitseigenschaften aufweisen, da diese Proteine einen hydrophoben, lipidhaltigen Charakter wahrscheinlich aufgrund von deren Assoziierung mit der Zellmembran der Spirochäte während der Expression haben. Folglich werden Detergentien benötigt, um diese lipidhaltigen Proteine zu solubilisieren.
In diesem Fachgebiet ist anerkannt, dass die Behandlung von Lipoproteinen mit Detergentien die Löslichkeit verbessert, aber oftmals die Reaktivität beeinträchtigt, indem die Faltungskonfiguration des Zielproteins wie auch die Epitopenstellen verändert oder zerstört werden. Folglich wäre es wünschenswert, eine rekombinante Variante von OspA wie auch von anderen Borrelia-Lipoproteinen zu entwickeln, die ohne Exposition gegenüber Detergentien löslich sind, während sie die spezifische Reaktivität gegenüber Antikörpern gegen deren Volllängen-Wildtyp-Lipoproteinanaloga beibehalten. Zusätzlich zu den vorangegangenen Löslichkeitsproblemen erzeugt auch die Assoziierung der Borrelia-Lipoproteine mit der äußeren Zellmembran der Spirochäte Probleme bei der Abtrennung und Reinigung dieser Proteine aus rohen Zellextrakten.
Alternativ können bestimmte Techniken der in vitro-DNA- Rekombination eingesetzt werden, um Borrelia-Gene unter Verwendung eines Wirt/Vektor-Expressionssystems, wie E. coli, das in diesem Fachgebiet bekannte rekombinante Klonierungsvektoren enthält, zu exprimieren. Ein geeigneter rekombinanter Klonierungsvektor würde ein Plasmid sein, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die modifiziert werden könnte, so dass sie eine Insertion von Wildtyp-Borrelia-DNA akzeptiert. Obwohl diese Rekombinationstechniken die Notwendigkeit von lebenden Borrelia-Kulturen vermeiden, haben sie mehrere Nachteile.
Beispielsweise weisen rekombinante Versionen des unter Verwendung von E. coli produzierten Borrelia buradorferi-Volllängen- Wildtyps schlechte Löslichkeitseigenschaften in Abwesenheit von Detergentien auf, vermutlich aufgrund der Assoziierung des Proteins mit der äußeren Zellmembran des Wirts während der Expression. Folglich bringen nachfolgende Manipulationen, die auf die Abtrennung und Reinigung des resultierenden Proteinprodukts gerichtet sind, Probleme mit sich, die ähnlich sind zu jenen, auf die man stößt, wenn versucht wird, OspA aus lebenden B. buradorferi-Kulturen zu isolieren und zu reinigen.
Ein anderer Nachteil des obigen Ansatzes besteht darin, dass rekombinante Versionen des Volllängen-Wildtyp-OspA-Gens nur eine schlechte überexpression in einem E. coli-Wirt erfahren. Diese schlechte Expression beruht wahrscheinlich auf den akkumulierten toxischen Effekten der OspA-Proteinlokalisierung an der E. coli- Zellmembran während des Verlaufs der Expression.
Die Erfindung ist unter einem Aspekt auf die Bereitstellung eines nicht-lipidhaltigen Proteins gerichtet, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Sequenz SEQ ID NO: 10 mit einem oder mehreren Alanin- und/oder Methioninresten an dem N-terminalen Ende der SEQ ID NO: 10-Sequenz besteht.
Die Erfindung stellt folglich eine rekombinante Variante des äußeren Oberflächenproteins A (OspA) von B. burgdorferi bereit, die ohne Exposition gegenüber Detergentien löslich ist, während sie die spezifische Reaktivität gegenüber Antikörpern gegen B. burgdorferi- Wildtyp-OspA beibehält.
Das modifizierte OspA ist während der Expression nicht mit der Zellmembran des Wirts assoziiert.
Die Erfindung ist zusätzlich auf ein Verfahren zum Bereitstellen einer verkürzten Version einer Nukleotidsequenz, die das Borrelia burgdorferi-Lipoprotein OspA kodiert, gerichtet, welches umfasst:
Bereitstellen einer DNA-Matrize, die die Nukleotidsequenz umfasst, die das Borrelia-Lipoprotein kodiert, wobei die Matrize eine potentielle Signalpeptidase II-Signalsequenz enthält, wobei die Signalsequenz ein 5'-Ende und ein 3'-Ende hat, wobei das 3'-Ende mit einem Codon für einen Cysteinrest endet; und
Synthetisieren eines Satzes von Oligonukleotidprimern, der einen ersten und einen zweiten Primer umfasst, wobei der erste Primer eine Region umfasst, die zu einem ersten DNA-Strang der DNA-Matrize ausreichend komplementär ist, um die Amplifizierung des ersten DNA- Strangs in einer 5'→3'-Richtung wirksam zu initiieren bzw. zu primen, und ein zweiter Primer eine Region umfasst, die zu einem zweiten DNA-Strang der DNA-Matrize ausreichend komplementär ist, um die Amplifizierung des zweiten DNA-Strangs in einer 5'→3'-Richtung wirksam zu initiieren bzw. zu primen, und Verwenden der Primer in einer DNA-Amplifizierungsreaktion, in der der erste Primer eine DNA- Polymerisation an einem Nukleotid, das sich auf der DNA-Matrize stromabwärts von dem Cysteinrest in einer 3'-Richtung befindet, initiiert. Folglich wird eine Nukleotidsequenz bereitgestellt, die in einem Wirtsorganismus, wie E. coli, hoch exprimiert wird und die eine rekombinante Variante von B. burgdorferi-OspA, die ohne Exposition gegenüber Detergentien löslich ist, während sie die spezifische Reaktivität gegenüber Antikörpern gegen B. burcidorferi-Wildtyp-OspA beibehält, kodiert.
Das Verfahren zum Bereitstellen des Proteins der Erfindung umfaßte, eine verkürzte Version des B. buradorferi-Wildtyp-OspA-Gens zu erzeugen, die in einem rekombinanten Wirt unter Erzeugung eines löslichen Produkts hoch exprimiert werden konnte. Unter Verwendung einer DNA-Matrize, die B. burgdorferi-DNA enthielt, wurden speziell gestaltete Oligonukleotidprimer in einer Polymerasekettenreaktion eingesetzt, um einen Abschnitt des Wildtyp-OsvA-Gens zu amplifizieren, der die ersten 17 Codons, die eine Signalpeptidase II- Signalsequenz enthalten, nicht umfasste. Das resultierende Amplifizierungsprodukt wurde in einem T7-Bakteriophagen-Expressionssystem unter Verwendung von in diesem Fachgebiet bekannten Techniken der in vitro-DNA-Rekombination exprimiert.
Ein DNA-Plasmid, pET9-OspA, das die Nukleotidsequenz beherbergt, die das Protein der Erfindung kodiert, wird ebenfalls bereitgestellt zusätzlich zu einem E. coli-Stamm, der durch dieses transformiert ist.
Das Protein der Erfindung ist hochgradig vorteilhaft, da es Reaktivität gegenüber Antikörpern gegen B. burgdorferi-Wildtyp-OspA bewahrt, während es gegenüber von lebenden Kulturen oder mittels anderen Rekombinationstechniken abgeleitetem OspA verbesserte Löslichkeitseigenschaften beibehält. Diese verbesserte Löslichkeit ist besonders vorteilhaft in immundiagnostischen Assays wie auch bei Manipulationen im Labor, da das Protein in Abwesenheit von Detergentien, die die Reaktivität beeinträchtigen oder zerstören können, löslich ist.
Ein anderer Vorteil des Proteins der Erfindung besteht darin, dass es mit der Zellmembran des Wirts rekombinant nicht assoziiert ist. Folglich kann das Protein der Erfindung unter Einsatz von Rekombinationstechniken bis zu einem hohen Ausmaß exprimiert werden, da es für den Wirtsorganismus nicht so toxisch ist wie Wildtyp-OspA. Die verbesserte rekombinante Expression liefert hohe Ausbeuten des Zielproteins, während die Risiken von und Aufwendungen für lebende (n) Borrelia-Zellkulturen vermieden werden.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass sie ein Verfahren zum Herstellen einer rekombinanten Variante von stark exprimierten Borrelia-Lipoproteinen bereitstellt, die verbesserte Löslichkeit in Abwesenheit von Detergentien aufweist, während sie die spezifische Reaktivität gegenüber Antikörpern gegen deren Wildtyp- Lipoproteinanaloga bewahrt. Vor der Methode der Erfindung waren Detergentien erforderlich, um diese Lipoproteine für eine Verwendung in Immungssays und andere Manipulationen im Labor zu solubilisieren, wodurch reaktive Epitopenstellen den potentiell schädigenden Wirkungen der Detergentien ausgesetzt wurden.
Dementsprechend wird unter einem breiten Aspekt der Erfindung ein Protein bereitgestellt, das von einer Nukleinsäuresequenz kodiert wird, die einen ersten und einen zweiten Abschnitt umfasst, wobei der zweite Abschnitt ein 5'-Ende und ein 3'-Ende hat und SEQ ID NO: 10 umfasst und wobei der erste Abschnitt sich an dem 5'-Ende des zweiten Abschnitts befindet und aus einer Nukleotidsequenz besteht, die eine Aminosäuresequenz von mindestens einem von Alanin und Methionin kodiert. Die Aminosäuresequenz kann SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8, wie nachfolgend aufgeführt, umfassen und die Nukleotidsequenz kann SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7, wie nachfolgend aufgeführt, umfassen.
Unter einem anderen breiten Aspekt der Erfindung wird ein Protein, das von einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 10, wie nachfolgend aufgeführt, kodiert wird, wie auch eine Nukleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz kodiert, die SEQ ID NO: 9 umfassen kann, bereitgestellt.
Weitere spezielle Aspekte der Erfindung umfassen ein pET9- Plasmid zum Transformieren eines Wirtsorganismus, das pET-OspA umfasst, einen transformierten E. coli-Stamm, der das Plasmid pET9- OspA enthält, wobei der Stamm BL21(DE3)/pLysS, pET9-OspA ist, und einen Oligonukleotidprimer, der für eine Amplifizierung eines Abschnitts einer Nukleotidsequenz, die ein Borrelia-Lipoprotein kodiert, nützlich ist, wobei der Primer SEQ ID NO: 11 ist.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt eine verkürzte Version einer das Borrelia burgdorferi-Lipoprotein OspA kodierenden Nukleotidsequenz bereit, welche umfasst: (a) Bereitstellen einer DNA- Matrize, die die Nukleotidsequenz umfasst, die das Borrelia- Lipoprotein kodiert, wobei die Matrize eine potentielle Signalpeptidase II-Signalsequenz enthält, wobei die Signalsequenz ein 5'-Ende und ein 3'-Ende hat, und wobei das 3'-Ende mit einem Codon für einen Cysteinrest endet; und (b) Synthetisieren eines Satzes von Oligonukleotidprimern, der einen ersten und einen zweiten Primer umfasst, wobei der erste Primer eine Region umfasst, die zu einem ersten DNA- Strang der DNA-Matrize ausreichend komplementär ist, um die Amplifizierung des ersten DNA-Strangs in einer 5'→3'-Richtung wirksam zu initiieren bzw. zu primen, und ein zweiter Primer eine Region umfasst, die zu einem zweiten DNA-Strang der DNA-Matrize ausreichend komplementär ist, um die Amplifizierung des zweiten DNA-Strangs in einer 5'→3'-Richtung wirksam zu initiieren bzw. zu primen, wobei der erste Primer eine DNA-Polymerisation an einem Nukleotid, das sich auf der DNA-Matrize stromabwärts von dem Cysteinrest in einer 3'- Richtung befindet, initiiert.
Ein zusätzlicher Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zum Bereitstellen einer rekombinanten Variante des Borrelia burgdorferi- Lipoproteins OspA bereit, welches umfasst: (a) Bereitstellen einer DNA-Matrize, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die das Borrelia- Lipoprotein kodiert, wobei die Matrize eine potentielle Signalpeptidase II-Signalsequenz enthält, wobei die Signalsequenz ein 5'-Ende und ein 3'-Ende hat, wobei das 3'-Ende mit einem Codon, das einen Cysteinrest kodiert, endet; (b) Synthetisieren eines Satzes von Oligonukleotidprimern, der einen ersten und einen zweiten Primer umfasst, wobei der erste Primer eine Region umfasst, die zu einem ersten DNA-Strang der DNA-Matrize ausreichend komplementär ist, um die Amplifizierung des ersten DNA-Strangs in einer 5'→3'-Richtung wirksam zu initiieren bzw. zu primen, und ein zweiter Primer eine Region umfasst, die zu einem zweiten DNA-Strang der DNA-Matrize ausreichend komplementär ist, um die Amplifizierung des zweiten DNA-Strangs in einer 5'→3'-Richtung wirksam zu initiieren bzw. zu primen, wobei der erste Primer eine DNA-Polymerisation an einem Nukleotid, das sich auf der DNA-Matrize stromabwärts von dem Cysteinrest in einer 3'- Richtung befindet, initiiert; (c) Reagierenlassen der Primer in einer Polymerasekettenreaktion, wodurch ein Satz von Amplifizierungsprodukten bereitgestellt wird; (d) Isolieren einer verkürzten Version der Nukleotidsequenz aus dem Satz von Amplifizierungsprodukten; (e) Klonieren der verkürzten Version in einen geeigneten Expressionsvektor; (f) Transformieren eines geeigneten Wirtsorganismus unter - Verwendung des Expressionsvektors und (g) Züchten des Wirtsorganismus für eine Produktion der rekombinanten Variante des Lipoproteins. Für ein besseres Verständnis der Erfindung zusammen mit anderen und weiteren Gegenständen wird auf die folgende Beschreibung zusammen mit den begleitenden Zeichnungen Bezug genommen und deren Umfang wird in den beigefügten Ansprüchen erläutert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt schematisch die Nukleotidsequenz des Oligonukleotidprimers 201 → 216.
Fig. 2 zeigt schematisch die Nukleotidsequenz des Oligonukleotidprimers 958 ← 972.
Fig. 3 zeigt schematisch die Nukleotidsequenz des Oligonukleotidprimers 151 → 171.
Fig. 4 zeigt schematisch das Wildtyp-osvA-Gen, wobei die Positionen, wo die Primer 201 → 216 und 958 ← 972 sich unter Hybridisierung anlagern, hervorgehoben sind.
Fig. 5 zeigt schematisch das Wildtyp-osuA-Gen, wobei die Positionen, wo die Primer 151 → 171 und 958 ← 972 sich unter Hybridisierung anlagern, hervorgehoben sind.
Fig. 6 zeigt das Produkt, das aus der Amplifizierung des Wildtyp-ospA-Gens durch Primer 201 → 216 und Primer 958 ← 972 resultiert.
Fig. 7 ist eine Photographie eines mit Ethidiumbromid angefärbten 1%-Agarosegels, auf dem man die Amplifizierungsprodukte einer Chromatographie unterzogen hat.
Fig. 8 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pET9.
Fig. 9 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pET9- OspA.
Fig. 10 ist eine Photographie eines mit Coomassie Blau angefärbten 12,5%-SDS-PAGE-Gels, auf dem man verschiedene zelluläre Proteinproben nach einer Entfernung aus der Induktion nach angegebenen Zeitspannen einer Chromatographie unterzogen hat.
Fig. 11 ist eine Photographie eines SDS-PAGE-Gels, auf dem Proben von nicht-induzierten Zellen mit Proben von induzierten Zellen, die in einstündigen Zeitabständen nach der Induktion abgenommen worden sind, verglichen wurden.
Fig. 12 ist eine Photographie eines SDS-PAGE-Gels, auf dem OspA-Proben einer Chromatographie unterzogen worden sind. Die Proben wurden in verschiedenen Stadien der Reinigung genommen.
Fig. 13 ist ein Autoradiogramm einer immunchemischen Western- Blot-Analyse von OspA- und OspB-Proteinen aus ganzen B. burcidorferi- Zellen wie auch von OspA und preOspA.
Fig. 14 ist eine Photographie eines mit Coomassie Blau angefärbten 12,5%-SDS-PAGE-Gels, auf dem Zellen, die pET9-preOspA trugen, und Zellen, die pET9-OspA trugen, mit ganzen B. burgdorferi- Zellen verglichen wurden.
Fig. 15 ist ein Autoradiogramm des in Fig. 14 photographierten Gels.
Fig. 16 ist ein Autoradiogramm des Nitrocellulose-Blots des in Fig. 14 photographierten Gels vor einer weiteren Western-Analyse.
Fig. 17 ist ein Autoradiogramm des Nitrocellulose-Blots des in Fig. 14 photographierten Gels nach Reagierenlassen mit Antikörpern.
Fig. 18 ist eine Photographie des abgeschlossenen Western-Blots des in Fig. 14 photographierten Gels nach Behandlung mit alkalische Phosphatase-Farbentwicklungsreagenzien.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Zum Zwecke des Verständnisses der Erfindung werden die folgenden Begriffe definiert:
"Bakterien" sind prokaryotische Organismen, die eine starke Schutzhülle aufweisen, die als eine Zellwand bekannt ist, unterhalb von welcher eine Zellmembran ein einzelnes zytoplasmatisches Kompartiment, das DNA, RNA, Proteine und kleine Moleküle enthält, umschließt. Beispiele umfassen Spirochäten und Escherichia coli.
"Uberexpression" ist eine in hohem Ausmaß erfolgende Expression von klonierten Genen. Die RNA-Polymerase des Bakteriophagen T7 kann eine Transkription in hohem Ausmaß ausgehend von einem T7-Promotor auf einem Mehrkopienplasmid (Multicopy-Plasmid) steuern, wodurch nahezu jede DNA, die mit einem T7-Promotor verknüpft ist, effizient transkribiert wird. Dies führt zu einer in hohem Ausmaß erfolgenden Expression der damit verknüpften DNA.
Ein "Plasmid" ist ein doppelsträngiges, geschlossenes, zirkuläres DNA-Molekül, das unabhängig vom Chromoson ist und ein intaktes Replicon umfasst, so dass das Plasmid in einer Wirtszelle repliziert wird. Wenn das Plasmid in eine Zelle eines einzelligen Organismus eingebracht wird, können die Eigenschaften des Organismus verändert werden. Unter den Phänotypen, die von Plasmiden verliehen werden, befinden sich Resistenzen gegen Antibiotika und die Produktion von Restriktions- und Modifizierungsenzymen.
"Primer" bezieht sich auf ein Oligonukleotid (eine kurze Nukleinsäurekette), das in der Lage ist, als eine Initiationsstelle der Synthese zu wirken, wenn es unter Bedingungen gestellt wird, unter denen die Synthese eines Primerverlängerungsprodukts, das komplementär zu einem Nukleinsäurestrang ist, induziert wird. Der Primer kann in der Natur vorkommen, wie in einem gereinigten Restriktionsverdau, oder kann synthetisch hergestellt werden.
Es ist jetzt festgestellt worden, das ein Umgestalten des Wildtyp-ospA-Gens (siehe SEQ ID NO: 1) unter Entfernung der ersten 17 Codons von der Nukleotidsequenz eine verkürzte Nukleotidsequenz ergibt, die in einem Wirtsorganismus, wie E. coli, überexprimiert werden kann unter Erzeugung einer rekombinanten Variante von B. burgdorferi-OspA, die ohne Exposition gegenüber Detergentien löslich ist, aber eine selektive Reaktivität gegenüber Antikörpern gegen B. burgdorferi-Wildtyp-OspA beibehält. Es ist die Anwesenheit der ersten 17 Codons, die für die Fehlschläge bei den Versuchen des Standes der Technik zur Reproduktion einer löslichen rekombinanten Form von OspA, die in E. coli stark exprimiert wird, verantwortlich gewesen ist.
Genauer tritt eine Region von Nukleotiden (siehe SEQ ID NO: 14) innerhalb der Leader-Sequenz (den ersten 17 Codons in dem B. burgdorferi-Wildtyp-ospA-Gen) auf, die ein Signal kodiert, das die Lipidierung des resultierenden Proteins auslöst, wodurch sowohl die Löslichkeit als auch die Expression während der Prozessierung innerhalb eines rekombinanten Wirts, wie E. coli, beeinträchtigt wird.
DNA, die das Volllängen-Wildtyp-ospA-Gen aus B. burgdorferi (Stamm B31) enthält, wurde isoliert und gereinigt. Ein Satz von Oligonukleotidprimern (siehe SEQ ID NO: 11/Fig. 1 und SEQ ID NO: 12/Fig. 2) wurde für eine Verwendung in der Polymerasekettenreaktion, die die spezifizierte Amplifizierung einer verkürzten Version des ospA-Gens, dem die ersten 17 Codons fehlen, erlaubt wie auch Restriktionsstellen vor und nach der kodierenden Sequenz des amplifizierten Produkts bereitstellt, synthetisiert. Ein zweiter Satz von Oligonukleotidprimern (siehe SEQ ID NO. 13/Fig. 3 und SEQ ID NO: 12/Fig. 2) wurde ebenfalls für eine Verwendung in der Polymerasekettenreaktion synthetisiert, um die spezifizierte Amplifizierung des vollständigen Wildtyp-osnA-Gens als Kontrollmechanismus zu ermöglichen.
Die durch die Polymerasekettenreaktion erzeugten resultierenden Nukleotidfragmente wurden gereinigt und durch Restriktionsstellenanalyse ausgewählt und nachfolgend in einen geeigneten Plasmid- Expressionsvektor, der vom Standpunkt der Restriktionsstellen aus kompatibel war, subkloniert. Die resultierenden Plasmide wurden dann in einen Wirtsexpressionsstamm für die Proteinproduktion transferiert.

BEISPIEL 1

Um das Protein der Erfindung zu konstruieren, war es erforderlich, eine Quelle von B. burgdorferi-Wildtyp-DNA bereitzustellen, die die OspA kodierende Nukleotidsequenz enthielt. Diese DNA diente als Matrize für die Amplifizierung des gewünschten Abschnitts des Wildtyp-ospA-Gens (siehe SEQ ID NO: 1) während der Polymerasekettenreaktion. Es ist in diesem Fachgebiet wohlbekannt, dass Ausgangsmaterial für DNA-Rekombinationsmanipulationen DNA sein kann, die aus Kulturen des Wildtyporganismus von Interesse oder rekombinanten Trägern, wie Plasmiden, die gentechnologisch manipuliert worden sind, so dass sie klonierte Kopien der Ziel-DNA enthalten, isoliert worden ist. Der letztgenannte Ansatz ist vorteilhaft, da er die Homogenität fördert und die Mutationshäufigkeit in dem DNA-Fragment von Interesse verringert.
In dem bevorzugten Verfahren zum Erzeugen des Proteins der Erfindung war die anfängliche Quelle von Matrizen-DNA die das Volllängen-Wildtyp-ospA-Gen enthielt, ein rekombinanter Klon des os A-Gens, der von einem zuvor gentechnologisch hergestellten Plasmid, pTRH44, erhalten worden ist. Das Plasmid pTRH44, das ein 1,6 kb- Restriktionsfragment aufweist, das das B. burgdorferi-Volllängen- Wildtyp-ospA-Gen kloniert in pUC9 enthält, ist bereits früher beschrieben worden. Siehe Howe, T. R., LaQuier, F. R., und Barbour, A. G. "Organization of genes encoding two outer membrane proteins of the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi within a single transcrip - tional unit", Infec. Immun. 54: 207-212 (1986).
Alternativ hätte Borrelia buradorferi-Gesamt-DNA durch Phenolextraktion oder Lysozym-Proteinase K-SDS-Extraktion von aus stationäre Phase-Kulturen geernteten Zellen für eine Verwendung als Matrizen-DNA isoliert und gereinigt werden können. Techniken für die Isolierung und Reinigung von Matrizen-DNA sind in diesem Fachgebiet allgemein bekannt. Siehe beispielsweise Howe, T. R., Mayer, L. W., & Barbour, A. G. "A single recombinant plasmid expressing two major outer surface proteins of the Lyme disease spirochete", Science 227: 645-646 (1985). Für Beispiele hinsichtlich der Kultivierung und Isolierung von B. burordorferi siehe Barbour, A. G. "Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes", Yale J. Biol. Med. 57: 521-525 (1984).
Ein erster und ein zweiter Satz von Oligonukleotidprimern wurden in einer Microsyn 1450-DNA-Synthetisiervorrichtung (erhältlich von Systec, Minneaolis, Minnesota) synthetisiert. Die resultierenden Produkte wurden nachfolgend unter Verwendung von Poly-Pak®-Reinigungskartuschen (erhalten von Glen Research Corporation, Herndon, Virginia) gemäß den Angaben des Herstellers gereinigt. DNA-Synthese- und nachfolgende Reinigungstechniken sind in dem Fachgebiet der in vitro-DNA-Rekombinationstechnologie wohlbekannt. Jegliche geeigneten Techniken zum Erzielen dieser Schritte wären akzeptabel.
Der erste Satz von Oligonukleotidprimern wurde für die Amplifizierung einer Nukleotidsequenz, die eine rekombinante Variante von B. buradorferi-OspA kodierte, gestaltet, während der zweite Satz von Primern für die Amplifizierung des vollständigen Wildtyp-ospA-Gens von B. burgdorferi gestaltet wurde. Jeder Primer enthielt ein 5'- Ende und ein 3'-Ende. Das 3'-Ende jedes Primers enthielt einen Abschnitt mit einer Nukleotidsequenz, die zu einer speziellen Nukleotidsequenz, die an einem bestimmten Abschnitt des B. buradorferi- Wildtyp-ospA-Gens, das innerhalb des B. buradorferi-Genoms vorhanden ist, auftritt, komplementär war. Es war dieser Bereich des Primers, der mit der B. burgdorferi-DNA-Matrize hybridisierte, um die Polymerisation während der Polymerasekettenreaktion zu fördern. Die Nukleotidsequenz für das Wildtyp-ospA-Gen (siehe SEQ ID NO: 1) ist bereits früher bestimmt worden. Siehe Bergstrom, S., Bundoc, V. G., & Barbour, A. G. "Molecular Analysis of linear plasmid-encoded major surface proteins, OspA and OspB, of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi", Mol. Microbiol. 3: 479-486 (1989).
Das 5'-Ende jedes Primers enthielt eine Nukleotidsequenz, die zu der B. burgdorferi-DNA-Matrize nicht-komplementär war und die Restriktionsstellen in die während der Amplifizierung erzeugten Fragmente einführte. Es war die Anwesenheit der Restriktionsstellen, die das Klonieren der resultierenden Fragmente in einen Expressionsvektor vereinfachte. Die Verwendung von Restriktionsstellen zur Vereinfachung der Klonierung ist in der Technologie der in vitro-DNA- Rekombination wohlbekannt.
Der erste Satz von Oligonukleotidprimern umfasste einen ersten und einen zweiten Primer. Der erste Primer wurde als Primer 201→216 bezeichnet und wurde synthetisiert, um die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 11), die in Fig. 1 gezeigt ist, zu erhalten. Die Zahlen 201-216 geben die speziellen Nukleotidpositionen auf dem Volllängen-WildtypospA-Gen an, zu denen der Primer komplementär war. Unter Bezugnahme auf Fig. 1 zeigt der unterstrichene Bereich den Abschnitt des Primers an, der zu dem Volllängen-Wildtyp-ospA-Gen an den Nukleotidpositionen 201 bis 216 komplementär war. Die in Fettdruck gezeigten Nukleotide zeigen eine Restriktionsstelle an, die durch das Restriktionsenzym NdeI erkannt wird. Die Schrägstrich-Markierung gibt die Stelle an, wo das NdeI-Enzym später den Strang spaltete, um das Klonieren in den Expressionsvektor zu vereinfachen.
Der Primer 201→216 wurde verwendet, um ein 5'-Ende für das verkürzte o spA-Gen (die Nukleotidsequenz, die die rekombinante Variante von OspA kodierte) neu zu gestalten, wobei eine Ndel-Restriktionsstelle bereitgestellt wurde und die Amplifizierung ausgehend von dem Volllängen-Wildtyp-ospA-Gen initiiert bzw. geprimt wurde, indem die Polymerisation an dem 18. Codon initiiert wurde. In der Wildtyp-Version des ospA-Gens tritt zwischen dem 16. und 17. Codon eine potentielle Erkennungsstelle für die Lipoproteinsignalpeptidase II auf.
Der exakte Mechanismus für die Lipidierung des Volllängen- Wildtyp-OspA innerhalb der Borrelia-Spirochäte ist nicht bekannt. Jedoch wird jetzt in diesem Fachgebiet allgemein anerkannt, dass die Aminosäuresequenz Leu-x-y-Cys (wobei x und y im allgemeinen unterschiedliche Aminosäuren, die nicht-polare Seitenketten aufweisen, sind), die in der Leadersequenz von bestimmten bakteriellen Lipoproteinen auftritt, ein Prozessierungssignal kodiert, um die Proteinprozessierung durch das bakterielle Enzym, die Signalpeptidase II, zu initiieren. Dieses Enyzm ist schließlich dafür verantwortlich, den N-terminalen Abschnitt der Leadersequenz an dem Aminoende des Cysteinrests zu spalten, was das N-terminale Cystein für eine kovalente Verknüpfung mit Fettsäuren, die dem restlichen Protein einen hochgradig lipidhaltigen Charakter nach der Anheftung geben, zur Verfügung stellt. Viele prokaryotische Zellen, wie E. coli, nutzen das vorerwähnte Prozessierungsschema, um ihre eigenen zellulären Lipoproteine zu prozessieren und zu der Membran der Zelle zu transferieren. Siehe Bergstrom, S., Bundoc, V. G., und Barbour, A. G. "Molecular Analysis of linear plasmid-encoded major surface proteins, OspA and OspB, of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi", Mol. Microbiol., 3: 479-486 (1989). Siehe auch Brandt, M. E., Riley, B. S., Radolf, J. D., und Norgard, M. V. "Immunogenic integral membrane proteins of Borrelia burgdorferi are lipoproteins", Infect. Immun., 58: 983-991 (1990).
Obwohl die vollständige Aminosäuresequenz der Wildtypversion von B. burgdorferi-OspA durch Aminosäureanalyse aufgrund von mit dem Protein zusammenhängenden Problemen noch nicht bestätigt worden ist, ist die Sequenz bereits früher beruhend auf der bekannten Nukleotidsequenz des Volllängen-Wildtyp-osuA-Gens von B. burgdorferi (B31) vorhergesagt worden. Siehe Bergstrom, S., Bundoc, V. G., and Barbour, A. G., "Molecular Analysis of linear plasmid-encoded major surface proteins, OspA and OspB, of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi", Mol. Microbiol., 3: 479-486 (1989). SEQ ID NO: 2 veranschaulicht die vorhergesagte Aminosäuresequenz des Volllängen- Wildtyp-OspA aus B. burgdorferi wie zuvor abgeleitet.
Unter Bezugnahme auf SEQ ID NO: 2 kann festgestellt werden, dass der Leader-Abschnitt oder (der) vorhergesagten Aminosäuresequenz einen Abschnitt mit den aufeinanderfolgenden Aminosäureresten Leu-Ile-Ala-Cys (siehe SEQ ID NO: 15) enthält. Diese Reste entsprechen dem Format des Prozessierungssignals für die Signalpeptidase II in E. coli, wie oben erwähnt. Folglich tritt in der Wildtypversion des os A-Gens eine potentielle Erkennungsstelle für die Lipoproteinsignalpeptidase II zwischen dem 16. und 17. Codon aufgrund der Sequenzhomologie zwischen dem bekannten Signalsequenzformat für die Signalpeptidase II und der potentiellen Signalsequenz, die in der vorhergesagten Aminosäuresequenz des Volllängen-Wildtyp-OspA aus B. burgdorferi auftritt, auf.
Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass das resultierende rekombinante Protein während der Uberexpression nicht lipidiert bzw. nicht mit Lipidresten versehen wird, wurde der komplementäre Abschnitt des Primers 201216 so gestaltet, dass er den Cysteinrest nicht enthielt und die Amplifizierung an dem Abschnitt des B. burgdorferi-Wildtyp-ospA-Gens, der an dem 18. Codon beginnt, initiierte, um die potentielle Erkennungsstelle für die Lipidierung vollständig zu entfernen. Es wurde gehofft, dass die Entfernung dieser potentiellen Erkennungsstelle die Löslichkeit erhöhen und die Expression des resultierenden Proteins verbessern würde, ohne die spezifische Reaktivität gegenüber Antikörpern gegen B. burgdorferi- Wildtyp-OspA zu beeinträchtigen.
Vor der vorliegenden Erfindung war unbekannt gewesen, ob die potentielle Signalseguenz, die in der Aminosäuresequenz von B. burctdorferi-Wildtyp-OspA vorhanden ist, für die Lipidierung des reifen Proteins verantwortlich ist. Es war des weiteren unbekannt, ob die potentielle Signalsequenz an einer ähnlichen Lipidierung oder (von) einer in einem rekombinanten Wirt erzeugten rekombinanten Version von Wildtyp-OspA beteiligt sein würde. Es war ferner unbekannt, ob die Eliminierung eines Abschnitts des Wildtyp-ospA-Gens, der die potentielle Signalsequenz enthält, zu einem verkürzten ospA-Gen führen würde, das effektiv unter Verwendung von Rekombinationsmethoden exprimiert werden könnte, um ein Protein mit verbesserter Löslichkeit in Abwesenheit von Detergentien, während die Reaktivität gegenüber Antikörpern gegen die Wildtyp-Version des Proteins beibehalten wird, zu erzeugen.
Es ist in dem Fachgebiet der Technologie der in vitro-DNA- Rekombination allgemein anerkannt, dass, je größer das Ausmaß der Modifizierung ist, das einer ein Protein kodierenden natürlich vorkommenden Nukleotidsequenz auferlegt wird, das Risiko umso größer wird, dass das resultierende rekombinante Protein unter einer veränderten Reaktivität leiden wird, sofern es denn überhaupt exprimiert wird. Tatsächlich kann sich ein solcher rekombinanter Transfer für den Wirtsorganismus als toxisch oder tödlich erweisen, wodurch die Expression des gewünschten Produkts verringert oder eliminiert wird.
Unter Bezugnahme auf Fig. 1 benötigte die bevorzugte Konstruktion von Primer 201→216, dass ein nicht-komplementäres Segment (GCT), das einen Alaninrest kodierte, zwischen dem komplementären Segment des Primers und der NdeI-Restriktionsstelle angeordnet war. Die NdeI-Restriktionsstelle, die sich innerhalb des Primers 201→216 befindet, umfasste ein Triplett (ATG), das Methionin kodierte, einen terminalen Aminosäurerest, der als Initiationsstelle während der Proteinproduktion wirkt. Das Alanin kodierende Triplett wurde hinzugefügt, da Alanin eine der Aminosäuren ist, die die Entfernung von Methionin aus dem fertigen Proteinprodukt erleichtert. Andere Aminosäuren, die für das Vereinfachen der Entfernung von Methionin geeignet sind, wären auch akzeptabel. Siehe Hirel, P-H., Schmitter J- M., Dessen, P., Fayat, G., & Blanquet, S., "Extent of N-terminal methionine excision from Escherichia coli proteins is governed by the side-chain length of the penultimate amino acid", Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 86: 8247-8251 (1989). Es ist allgemein bekannt, dass ein an dem terminalen Ende oder (von) einer Aminosäuresequenz zum Zwecke der Translationsinitiation auftretendes Methionin für die Eigenschaften des resultierenden Proteins nicht von Bedeutung ist und üblicherweise aus der Aminosäuresequenz entfernt wird.
In der bevorzugten Form der Erfindung wies die Aminosäuresequenz, die aus dem verkürzten ospA-Gen resultierte, einen zusätzlichen Alaninrest an dem aminoterminalen Ende auf. Da die ersten 17 Codons aus der verkürzten Version des ospA-Gens entfernt worden waren, war das Nukleotidtriplett, das den Alaninrest kodierte, so positioniert, dass es dem einen Lysinrest kodierenden Nukleotidtriplett, das das 18. Codon in dem Wildtyp-ospA-Gen sein würde, voranging. Methionin war in der reifen Form des exprimierten Proteins entfernt. Die resultierende Aminosäuresequenz, in der das Methionin entfernt ist, ist in SEQ ID NO: 6 veranschaulicht. Die entsprechende Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NO: 5 gezeigt.
Alternativ könnte der zusätzliche Alaninrest ausgelassen worden sein. Die resultierende Aminosäuresequenz einschließlich des die Initiation bewirkenden Methionins ist in SEQ ID NO: 8 veranschaulicht. Die entsprechende Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NO: 7 gezeigt. Die Entfernung des Methionins führt zu der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 10. Die entsprechende Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NO: 9 gezeigt.
Der zweite Primer wurde als Primer 958←972 bezeichnet und wurde synthetisiert, um die in Fig. 2 gezeigte Sequenz (siehe SEQ ID NO: 12) zu erhalten. Unter Bezugnahme auf Fig. 2 zeigt der unterstrichene Bereich des Primers den Abschnitt an, der zu dem WildtyposnA-Gen an den Positionen 958 bis 972 komplementär war, während die in Fettdruck erscheinenden Nukleotide eine Restriktionsstelle, die durch das Restriktionsenzym BglII erkannt wird, anzeigen. Die Querstrichkennzeichnung steht für die Stelle, wo das BglII-Enzym später den Produktstrang spaltete, um das Klonieren in den Expressionsvektor zu vereinfachen. Unter Bezugnahme auf SEQ ID NO: 12 kann festgestellt werden, dass die vollständige Sequenz in einem nichtkodierenden Format gezeigt ist im Gegensatz zu dem in SEQ ID NOS: 11 und 13 gezeigten Format, das Primer 201→216 bzw. Primer 151→171 entspricht. Das nicht-kodierende Format wurde verwendet, da die Sequenz von Primer 958←972 so gestaltet ist, dass die Amplifizierung des Nicht-Sinn-Strangs des osnA-Gens anstelle des Sinn-Strangs initiiert bzw. geprimt wird.
Der Primer 958←972 war in beiden Sätzen von Oligonukleotidprimern vorhanden. Was den ersten Satz von Primern betraf, wurde der Primer 958←972 verwendet, um ein 3'-Ende für das verkürzte os A-Gen unter Bereitstellung einer BglII-Restriktionsstelle umzugestalten und die Amplifizierung in einer antiparallelen Richtung zu der Richtung der durch den Primer 201→216 gesteuerten Amplifizierung zu initiieren bzw. zu primen.
Unter Bezugnahme auf Fig. 4 ist das Wildtyp-osuA-Gen schematisch dargestellt. Die zwei Bereiche von unterstrichenen Nukleotiden heben die Positionen hervor, wo Primer 201→216 und Primer 958972 an die Matrizen-DNA hybridisierten, um die Amplifizierung zu fördern. Die Pfeilköpfe bezeichnen die Richtung der Polymerisation, die durch den Primer, der an der angegebenen Position hybridisierte, initiiert wurde.
Der zweite Satz von Oligonukleotidprimern, der für die Amplifizierung des vollständigen B. burgdorferi-Wildtyp-osnA-Gens als Kontrolle gestaltet war, umfasste auch einen ersten und einen zweiten Primer. Der erste Primer wurde als Primer 151→171 bezeichnet und wurde synthetisiert, um die in Fig. 3 gezeigte Nukleotidsequenz (siehe SEQ ID NO: 13) zu erhalten. Unter Bezugnahme auf Fig. 3 zeigt der unterstrichene Bereich den Abschnitt des Primers an, der zu dem Wildtyp-ospA-Gen an den Nukleotidpositionen 151 bis 171 komplementär war. Die in Fettdruck erscheinenden Nukleotide zeigen eine durch das Restriktionsenzym NdeI erkannte Restriktionsstelle an. Der Querstrich zeigt die Stelle an, wo das NdeI-Enzym später den Produktstrang spaltete, um die Klonierung in den Expressionsvektor zu vereinfachen.
Der zweite Primer, Primer 958972, war, wie zuvor erwähnt, in beiden Sätzen von Oligonukleotiden enthalten. Was den zweiten Satz von Primern betraf, führte Primer 958972 eine BglII-Restriktionsstelle ein und initiierte bzw. primte die Amplifizierung des Wildtyp-ospA-Gens in einer antiparallelen Richtung zu der Richtung der durch Primer 151→171 gesteuerten Amplifizierung.
Unter Bezugnahme auf Fig. 5 ist das Wildtyp-ospA-Gen schematisch dargestellt. Die zwei Bereiche von unterstrichenen Nukleotiden heben die Positionen hervor, wo Primer 151→171 und Primer 958←972 hybridisierten, um die Amplifizierung zu fördern. Die Pfeilköpfe bezeichnen die Richtung der Polymerisation, die durch den Primer, der an der angegebenen Position hybridisierte, initiiert wurde.
Fig. 6 ist eine schematische Darstellung des Produkts, das aus der Amplifizierung der verkürzten Version des ospA-Gens ausgehend von dem Wildtyp-ospA-Gen mittels Primer 201216 und Primer 958←972 resultiert. Der Fettdruck bezeichnet die durch die Primer bereitgestellten Restriktionsstellen, während die unterstrichenen Bereiche den Abschnitt des Primers angeben, der mit dem Wildtyp-ospA-Gen vor der Amplifizierung hybridisierte.
Die grundlegenden Methoden zum Amplifizieren einer gewünschten Zielnukleinsäuresequenz unter Verwendung von Oligonukleotidprimern sind in diesem Fachgebiet allgemein bekannt und werden in dem U. S. - Patent Nr. 4,683,202 von Mullis und dem U. S. -Patent Nr. 4,800,159 von Mullis et al., die beide in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen werden, veranschaulicht. Für zusätzliche Informationen betreffend Klonierungstechniken siehe Maniatis, T., Fritsch, E. F., & Sambrook, J., Molecular Clonincr: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982). Siehe auch Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K., Current Protocols in Molecular Bioloqv, John Wiley & Sons, New York, N. Y. (1989).
Unter Verwendung der Primer 151→171, 201→216 und 958972 wurden Polymerasereaktionsamplifizierungen in 50 ul-Reaktionsvolumen, die 1 Einheit AmpliTaq-DNA-Polymerase (erhalten von Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT), jeden Primer in einer Konzentration von 1 uM und ungefähr 0,1 ug-Matrizen-DNA enthielten, ausgeführt. Die Reaktionsmischung enthielt auch 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,05% Tween 20, 0,05% Nonedet P-40, 0,26 mM dATP, 0,26 mM dTTP, 0,14 mM dCTP und 0,14 mM dGTP.
In dem bevorzugten Amplifizierungsverfahren spiegelte die verwendete dNTP-Konzentration den bekannten DNA-Basengehalt von 29% G + C für B. burgdorferi wieder, um die Möglichkeit oder (von) unerwünschten Mutationen zu beseitigen. Siehe Schmid, G. P., Steigerwalt, A. G., Johnson, S., Barboug, A. G., Steere, A. C., Robinson, I. M. und Brenner, D. J., "DNA characterization of Lyme disease spirochetes", Yale J. Biol. Med., 57: 539-542 (1984).
Vor der Amplifizierung wurde die Reaktionsmischung mit Mineralöl überschichtet und die Amplifizierung wurde über 25 Zyklen in einem DNA Thermal Cycler (erhalten von Perkin-Elmer Cetus, Minneapolis, MN) ausgeführt, wobei jeder Zyklus aus 1 min bei 94ºC, 1 min bei 47ºC und 3 min bei 72ºC bestand. Die Amplifizierung wurde durch eine abschließende 10-minütige Inkubation bei 72ºC abgeschlossen. Die amplifizierten Produkte wurden mit Phenol extrahiert, mittels Ethanol präzipitiert, mit den geeigneten Restriktionsenzymen gespalten und dann durch Elektrophorese auf 1%-igen Gelen von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (erhalten von Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) gereinigt. Andere Techniken, die in diesem Fachgebiet für die Reinigung von amplifizierten DNA-Produkten bekannt sind, wie eine Elektrophorese auf Acrylamidgelen, wären annehmbar. Es ist in diesem Fachgebiet wohlbekannt, dass die amplifizierten Produkte gereinigt und mit den geeigneten Restriktionsenzymen (für das vorliegende Beispiel NdeI und BglII) behandelt werden müssen, bevor die Expression initiiert werden kann.
Die Amplifizierungsprodukte wurden auf einem 1%-igen Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen, mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Beleuchtung photographiert. Unter Bezugnahme auf Fig. 7 enthalten die Bahnen 1, 6 und 11 mittels HaeII verdaute T7-DNA als Moleküllängenmarker. Die Größen sind in Kilobasen (kB) angegeben. Die Bahnen 2, 4, 7 und 9 enthalten 1/5 Volumen der Produkte der Reaktionen mit B. burgdorferi-Gesamt-DNA, während die Bahnen 3, 5, 8 und 10 1/50 Volumen der Reaktionsmischung, die aus der Amplifizierung unter Verwendung des Plasmids pTRH44 als Matrize resultierte, enthalten. Die aufgetragenen Proben wurden unter Verwendung von Primern, die die vollständige kodierende ospA-Sequenz (Bahnen 2, 3, 7 und 8) oder die Region, beginnend an Lys¹&sup8; (Bahnen 4, 5, 9 und 10), amplifizieren, erzeugt. Wie in den Bahnen 7-10 gezeigt, kann die amplifizierte DNA mit EcoRI geschnitten werden, wodurch Produkte mit den aus einem Schneiden an der einzigen EcoRI-Stelle in ospA erwarteten Mobilitäten (662 + 182 bzw. 623 + 182) erhalten werden.

BEISPIEL 2

Um die amplifizierte Version des verkürzten ospA-Gens wie auch die amplifizierte Version des Volllängen-Wildtyp-ospA-Gens zu exprimieren, wurden die aus einer Amplifizierung durch die Polymerasekettenreaktion resultierenden DNA-Fragmente schließlich in einen Plasmidvektor für die Proteinproduktion kloniert. Der bevorzugte Plasmidvektor für die Proteinproduktion in der Erfindung war pET9, in dem das os A-Gen unter die Kontrolle eines T7-Promotors und von effizienten Translationsinitiationssignalen aus dem Bakteriophagen T7 gestellt ist. Die pET9- und pLysS-Expressionsvektoren, die bakteriellen Wirte für die Klonierung, Wachstumsmedien und die Verfahren, die eingesetzt wurden, um die Expression von klonierten Genen durch T7-RNA-Polymerase zu steuern, sind bereits früher beschrieben worden. Siehe Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J. & Dubendorff, J. W., Meth. Enzymol., "Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes", 185: 60-89 (1990). Die Klonierung und Expression des Gens für die Bakteriophage T7-RNA-Polymerase wird auch in dem U. S.-Patent Nr. 4,952,496 von Studier et al., das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben. Obwohl ein T7- Promotorsystem das bevorzugte Expressionssystem in der vorliegenden Erfindung ist, soll die Expression des verkürzten ospA-Gens hinsichtlich des Expressionsformats nicht derartig beschränkt sein, vorausgesetzt, dass das Expressionssystem der Wahl mit dem Wirtsorganismus verträglich ist.
Die resultierenden Plasmide wurden als pET9-preOspA als Bezeichnung für diejenigen Plasmide, die das amplifizierte DNA- Fragment, das das als Kontrolle verwendete Volllängen-Wildtyp-OspA kodierte, erhalten hatten, und als pET9-OspA als Bezeichnung für diejenigen Plasmide, die das amplifizierte DNA-Produkt, das die rekombinante Variante von OspA kodierte, erhalten hatten, bezeichnet.
In der bevorzugten Form der Erfindung wurde der pET9-vektor verwendet, da er ein kan-Gen als dessen selektiven Marker anstelle des bla-Gens enthält. Folglich wird kein Ampicillin während der Zellvermehrung verwendet und dementsprechend besteht keine Möglichkeit, dass ein immunogenes Ampicilloyl/OspA-Zielprotein-Konjugat gebildet werden kann. Es wird angenommen, dass Konjugate dieses Typs die hauptsächlichen antigenen Determinanten bei der Penicillin- Allergie sind, und deren Anwesenheit könnte geplante immunologische Studien verkomplizieren. Siehe Yvon. M., Anglade, P., & Wal, J-M., "Identification of the binding sites of benzyl penicilloyl, the allergenic metabolite of penicillin, on the serum albumin molecule", FEBS, 263: 237-240 (1990). Eine schematische Darstellung der pET9- und pET9-OspA-Plasmide ist in den Fig. 8 bzw. 9 gezeigt.
Die Plasmide pET9-preOspA und pET9-OspA wurden anfänglich in DH5α kloniert, einen Wirt, dem T7-RNA-Polymerase fehlt. In diesem Wirt ist die Hintergrundexpression minimal, da ausgehend von dem T7- Promotor keine Initiation durch die bakterielle RNA-Polymerase erfolgt. Im Prinzip können stabile rekombinante Plasmide in diesem Wirt hergestellt werden sogar obwohl das Zielgenprodukt für E. coli toxisch ist. Die Korrektheit der resultierenden Plasmide wurde durch umfassende Restriktionsstellenanalyse und Standard-Didesoxy-Sequenzierung der vollständigen kodierenden ospA-Sequenzen bestätigt.
Obwohl die hier verwendeten Primer speziell gestaltet worden waren, so dass sie bestimmte Segmente der Wildtyp-ospA-Sequenz aus B. burgdorferi-Gesamt-DNA amplifizierten, wurden aus praktischen Gründen und da die Mutationswahrscheinlichkeit mit der Anzahl von Amplifizierungszyklen zunimmt, die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Plasmide unter Verwendung von NdeI/BglII-Fragmenten, die aus Reaktionsmischungen, die das os A-Plasmid pTRH44 enthielten, erhalten worden waren, als DNA-Matrize konstruiert. Nachfolgend wurden die resultierenden 824 und 779 bp-NdeI/BglII-Fragmente aus jeder Reaktion getrennt in den T7-Expressionsvektor pET9, der mit NdeI und BamHI verdaut worden war, subkloniert, dephosphoryliert und durch Elektrophorese auf 1%-igen Gelen mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt. Das Plasmid pTRH44, das ein 1,6 kb-Restriktionsfragment aufwies, das das in pUC9 klonierte Volllängen-Wildtp-aspA-Gen enthielt, ist bereits früher beschrieben worden. Siehe Hows, T. R., LaQuier, F. R., & Barbour, A. G., "Organization of genes encoding two outer membrane proteins of the Lyme disease agent Borrelia buradorferi within a single transcriptional unit", Infec. Immun., 54: 207-212 (1986).
Unter Bezugnahme auf die Fig. 8 und 9 erzeugte ein Verdau der amplifizierten DNAs mit NdeI/BglII und nachfolgende Ligation in NdeI/BamHI-verdauten pET9 pET9-preOspA und pET9-OspA, die 5127 bzw. 5082 bp aufweisen. Φ10-S10 steht für den Φ10-Promotor für die RNA- Polymerase des Bakteriophagen T7 und die Ribosomenbindungs- und Translationsstartstelle für das T7-Gen 10. TΦ ist das Transkriptionsterminationssignal für die T7-RNA-Polymerase.

BEISPIEL 3

Für die Proteinproduktion wurden die Plasmide in den Expressionsstamm BL21(DE3)/pLysS transferiert, einen Wirtsstamm, der eine chromosomale Kopie des Gens für die T7-RNA-Polymerase unter Kontrolle des induzierbaren lacUVS-Promotors und ein auf pACYC184 basierendes Plasmid, pLysS, das geringe Konzentrationen von T7-Lysozym, einem natürlichen Inhibitor der T7-RNA-Polymerase, spezifiziert, enthält. Für zusätzliche Informationen siehe Moffatt, B. A. & Studier, F. W., "T7 Lysozyme inhibits transcription by T7 RNA polymerase", Cell, 49: 221-227 (1989). In uninduzierten Zellen verringert Lysozym die basale Aktivität der T7-RNA-Polymerase und erhöht das Spektrum von Zielgenen, die stabil in dem Expressionswirt bewahrt werden können.
Kulturen von BL21(DE3)/pLysS, die unterschiedliche Plasmide trugen, wurden bis zur Mitte der logarithmischen Phase gezüchtet und ein Teil von jeder wurde mit IPTG induziert. Es wurde festgestellt, dass das Plasmid pET9-preOspA nach der Induktion relativ geringe Mengen von induzierbarem Protein produzierte, das basierend auf einer Analyse von SDS-Polyacrylamidgelen in der Mobilität sehr ähnlich war zu Wildtyp-OspA-Protein, das in Gesamtextrakten von B. burgdorferi vorhanden war. Unter Bezugnahme auf Fig. 10 wurden Proben (1,5 ul) für eine Analyse durch 12,5%-SDS-PAGE zu den unten angegebenen Zeitpunkten entfernt. Proteine wurden durch Anfärben mit Coomassie Blau sichtbar gemacht. Die Bahnen 1, 5 und 9 entsprechen ganzen B. buradorferi-Zellen (5 · 10&sup7; Zellen), während die Bahnen 2, 3 und 4 pET9-preOspA, das für 1, 3 oder 18 h induziert worden ist, entsprechen. Die Bahnen 6, 7 und 8 entsprechen pET9-OspA, das für 1, 3 oder 18 h induziert worden ist. Die Positionen von Molekulargewichtsmarkern (94, 67, 43, 30 und 20) sind angegeben. Die Molekülmassen von Proteinen sind in Kilodalton angegeben.
Es wurden Pulse-chase-Experimente ausgeführt, um zu zeigen, dass die Synthese oder (des) preOspA-Proteins eine bis zwei Stunden nach der Induktion verursachte (endete), ein Ergebnis, das implizierte, dass das Protein für E. coli toxisch war. Im Gegensatz dazu wurde eine viel höhere und anhaltende Expressionsrate beobachtet, wenn pET9-OspA induziert wurde.
Fig. 11 zeigt die Induktion der rekombinanten Variante von OspA, gefolgt von SDS-PAGE. Bahn 1 wurde mit ganzen Zellen von nicht-induziertem BL21(DE3)/pLysS, pET9-OspA beladen. Die Bahnen 2-7 wurden mit Proben von ganzen Zellen, die in einstündigen Abständen nach der Induktion gewonnen worden waren, beladen. Bahn 8 enthielt Molekulargewichtsmarker. Fig. 12 zeigt die SDS-PAGE der rekombinanten Version von OspA in unterschiedlichen Stadien der Reinigung, wie folgt: Bahn 1, Molekulargewichtsmarker; Bahn 2, Rohextrakt vor der Zentrifugation; Bahn 3, Rohextrakt nach der Zentrifugation; Bahn 4, Durchfluss durch Q-Sepharose; Bahn 5, S-Sepharose-Gradienten- Fraktion; und Bahn 6, Hydroxylagatit-Fraktion. Die Bahnen 2-6 enthalten jeweils 0,01% des in jeder Fraktion vorhandenen Gesamtproteins. Die Proteine wurden auf einem 10-20%-Acrylamid-Gradientengel analysiert. Es wurde ebenfalls eine Western-Blot-Analyse mit zwei monoklonalen Antikörpern, H5332 und H3TS, die bekanntermaßen unterschiedliche Epitope innerhalb von Wildtyp-OspA erkennen, ausgeführt, um zu verifizieren, dass diese Banden authentische OspA-Sequenzen enthielten. Siehe Brandt, M. E., Riley, B. S., Radolf, J. D., und Norgard, M. V., "Immunogenic integral membrane proteins of Borrelia burqdorferi are lipoproteins", Infect. Immun., 58: 983-991 (1990). Siehe auch Howe, T. R., Mayer, L. W., and Barbour, A. G., "A single recombinant plasmid expressing two major outer surface proteins of the Lyme disease spirochete", Science 227: 645-646 (1985).
Unter erneuter Bezugnahme auf Fig. 10 war das auf pET9-OspA gerichtete Protein deutlich kleiner als jenes, das durch pET9-preOspA produziert wurde, sogar obwohl erwartet wurde, dass beide Proteine ungefähr die gleiche Anzahl von Aminosäureresten nach der Prozessierung zur Entfernung entweder der 17 Reste langen Sequenz im Falle von Wildtyp-OspA oder nur des anfänglichen Methionins aus der rekombinanten Variante von OspA enthalten. Die wahrscheinlichste Erklärung für den Unterschied war, dass die Anwesenheit von kovalent angeheftetem N-terminalem Lipid die Mobilität des prozessierten pET9- preoOspA-Produkts verringerte. Auf einigen Gelen (siehe beispielsweise Fig. 13) wanderte das preOspA-Produkt als zwei eng nebeneinander liegende Banden, die Zwischenstufen der Prozessierung dargestellt haben könnten. Dieses Ergebnis legte nahe, dass die prozessierten Formen und Vorläuferformen dieses Proteins bei einer eindimensionalen SDS-PAGE ähnliche Mobilitäten aufweisen.

BEISPIEL 4

Um die subzelluläre Lokalisierung zu bestimmen, wurde eine 20 ml-Kultur von BL21(DE3)/pLysS, pET9-preOspA 3¹/&sub2; h nach der IPTG- Induktion durch Zentrifugation bei 8000 UpM geerntet. Das Pellet wurde in einer 10 ml-Mischung, enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM NaCl und 2 mM EDTA, suspendiert. Die Zellen wurden nachfolgend durch Einfrieren und Auftauen lysiert. Das Lysat wurde mit DNase und Mg&spplus;&spplus; behandelt, dann 90 min bei 33000 UpM sedimentiert. Die Pelletfraktion wurde in einer 5 ml-Mischung, enthaltend 0,25 M Sucrose, 3,3 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM DTT und 1 mM EDTA, resuspendiert. Die erneute Suspension wurde durch Zentrifugation für 1 h bei 50000 UpM erneut pelletiert. Das Pellet wurde in 1 ml 25% (Gew./Gew.) Sucrose, 5 mM EDTA und 1 mM DTT resuspendiert und nachfolgend als Schicht auf einen diskontinuierlichen Sucrosegradienten aufgetragen. Es wurde eine Zentrifugation bei 30000 UpM bei 4ºC für 16 h ausgeführt. Nach der Zentrifugation wurden 0,5 ml-Fraktionen gesammelt und 20 ul- Proben wurden durch SDS-PAGE und Western-Blotting analysiert. Der Bereich der äußeren Membran des Gradienten wurde anhand seiner Reaktivität gegenüber einem Antikörper gegen OmpA, einer gut charakterisierten Komponente der äußeren Membran von E. coli, bestimmt. Siehe Zimmerman, R., und Wickner, W., "Energetics and intermediates of the assembly of protein OmpA into the outer membrane of Escherichia coli", J. Biol. Chem., 258: 3920-3925 (1983).
Nahezu die Gesamtmenge des Volllängen-Wildtyp-OspA, die aus pET9-preOspA resultierte, wurde in der Niedergeschwindigkeitspellet- Fraktion des mittels Einfrierens und Auftauens erzeugten Zelllysats rückgewonnen. Das Pellet wurde durch Zentrifugation durch diskontinuierliche Sucrosegradienten in die innere und die äußere Membran fraktioniert. Das meiste Protein wurde in Fraktionen, die an Komponenten der inneren Membran angereichert waren, gefunden.
Weitere Studien zeigten, dass diese rekombinant abgeleitete Wildtyp-Version von OspA nur unter Bedingungen, die bekanntermaßen die innere Membran von E. coli selektiv solubilisieren, extrahiert werden konnte. Solche Bedingungen erforderten die Behandlung der Proteinfraktion mit einem Detergens, wie Triton X-100 oder Natrium- N-laurylsarcosinat. Siehe beispielsweise Forst, S., Delgado, J., Ramakrishnan, G., & Inouye, M., "Regulation of ompC and ompF expression in Escherichia coli in the absence of envZ", J. Bacteriol., 170: 5080-5085 (1988). Andererseits ist jedoch das Produkt von pET9-OspA in Abwesenheit von jeglichem Detergens löslich (50 mg/ml) und signifikante Mengen dieser rekombinanten Variante von OspA (50% des gesamten zellulären Proteins) können ausgehend von diesem Plasmid mehrere Stunden nach einer Induktion mit IPTG produziert werden (siehe Fig. 11). Wenn die Induktion von pET9-OspA länger als 6 Stunden fortgesetzt wurde, begannen die Zellen zu lysieren und schließlich wurde das gesamte Produkt im Kulturuberstand gefunden.

BEISPIEL 5

Um die rekombinante Variante von OspA zu reinigen, wurde ein Drei-Schritt-Verfahren eingesetzt. Eine 500 ml-Kultur von E. coli BL21(DE3)/pLysS, das pET9-OspA enthielt, wurde in 2 l-Schüttelkolben bei 37ºC in Trypton-Brühe, ergänzt mit M9-Salzen, 0,4% Glucose, 25 ug/ml Chloramphenicol und 25 ug/ml Kanamycinsulfat, gezüchtet, bis die OD 600 0,6 erreichte, an welchem Punkt IPT6 bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM zugesetzt wurde. Zusätzliche 100 ug/ml Kanamycin wurden zusammen mit dem IPTG zugesetzt, um ein Überwachsen der Kultur durch jegliche Zellen, die das Zielplasmid verloren haben könnten, zu verhindern. Sechs Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und in 25-30 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,7) resuspendiert und bei -20ºC gelagert. Der Rohextrakt wurde hergestellt durch Auftauen der resuspendierten Zellen bei 4ºC, was ermöglicht, dass das von pLysS kodierte Lysozym die Zellen effizient lysiert. Dem folgte die Zugabe von MgCl&sub2; und DNase (Endkonzentrationen von 2,5 mM bzw. 5 ug/ml). Nach 30 min bei 4ºC wurden die Zellrückstände durch Zentrifugation (15 min. 15000 g) entfernt. Das resultierende Pellet wurde mit 10 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,7), enthaltend 10 mM NaCl (Puffer A), extrahiert. Nach erneuter Zentrifugation wurden die Überstände vereinigt, wodurch ungefähr 40 ml Rohextrakt erhalten wurden.
Der Rohextrakt wurde bei Raumtemperatur auf ein vorgepacktes 25 ml-Bett von Q-Sepharose Fast Flow, das mit einem Puffer A äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit 50 ml Puffer A eluiert. Im wesentlichen das gesamte Zielprotein wurde in dem als Durchfluss hindurchfließenden Puffer zurückgewonnen.
Die Zielprotein enthaltenden Fraktionen wurden über Nacht bei 4ºC gegen 2 · 2 l-Wechsel von 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0), enthaltend 5 mM NaCl (Puffer B), dialysiert, durch Zentrifugation bei 10000 g geklärt und dann bei Raumtemperatur auf eine 20 · 1,5 cm-Säule von S-Sepharose Fast Flow, äquilibriert mit Puffer B, aufgetragen. Nach Waschen der Säule mit 100 ml Puffer B, um ungebundene Proteine und Verunreinigungen, die stark bei 260 nm absorbieren, zu entfernen, wurde das gebundene Zielprotein mit einem linearen 300 ml-Gradienten von 0-100 mM NaCl in Puffer B eluiert, wobei die Elution des Zielproteins bei ungefähr 35 mM NaCl auftrat. Q-Sepharose Fast Flow und S-Sepharose Fast Flow wurden von Pharmacia, Piscataway, NJ, erhalten.
Die vereinigten Fraktionen des Zielproteins, die aus dem S- Sepharose-Schritt resultierten, wurden auf ein 20 ml-Bett von Bio- Gel HTP-Hydroxylapatit, das zuvor mit Puffer B äquilibriert worden war, aufgeladen. Die Säule wurde bei Raumtemperatur betrieben und mit 50 ml Puffer B gewaschen. Das Protein wurde mit einem linearen 300 ml-Gradienten von 100-400 mM Natriumphosphat (pH 6,0) eluiert. Fraktionen, die das Zielprotein, das als breiter Peak zwischen 150 und 300 mM Natriumphosphat eluiert, enthielten, wurden vereinigt und in einer Ultrafiltrationszelle auf ein Endvolumen von 5 ml konzentriert. Die konzentrierte Proteinlösung wurde gegen 10 mM Natriumphosphat (pH 6,0), 50 mM NaCl (Puffer D) dialysiert und bei 4ºC gelagert. Bio-Gel HTP-Hydroxylapatit wurde von Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, erworben.
Die vorangegangene Methode zur Reinigung des rekombinanten Proteinprodukts veranschaulicht lediglich einen geeigneten Ansatz zur Reinigung des Proteins der Erfindung. Andere geeignete Techniken, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, könnten alternativ für die Reinigung eingesetzt werden. Beispielsweise kann die S-Sepharose- Fraktion konzentriert und auf eine Säule von Sephacryl S-200 (erhalten von Pharmacia, Piscataway, NJ) oder anderen geeigneten Gelfiltrationsmatrices aufgetragen werden.
Die resultierende Ausbeute war 60-70 mg der rekombinanten Variante von OspA, die ausgehend von einer 500 ml Ausgangskultur produziert wurden. Unter Bezugnahme auf Fig. 11 beträgt diese Gesamtausbeute ungefähr 50%, wie abgeschätzt ausgehend von der SDS-PAGE von individuellen Fraktionen, was eine gute Überexpression der verkürzten Version des osnA-Gens in E. coli anzeigt.

BEISPIEL 6

Proteinproben der rekombinanten Variante von OspA wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen analysiert. Für die Technik siehe Studier, F. W., "Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gelsº, J. Mol. Biol., 79: 237-248 (1973). Gele wurden fixiert und mit Coomassie Blau angefärbt oder die aufgetrennten Proteine wurden elektrophoretisch auf Nitrocellulosemembranen transferiert und durch Umsetzen mit [¹²&sup5;I] - markiertem Protein A auf gebundenes Immunglobulin getestet. Siehe Barbour, A. G., "Biology of the Borrelia species", Yale J. Biol. Med., 57, 581-586 (1984). [¹²&sup5;I]-markiertes Protein A (5 · 10&sup5; cpm/ml) wurde von DuPont-New England Nuclear erhalten.
In einigen Fällen wurden die Nitrocellulosemembranen mit 3% Gelatine in 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 500 mM NaCl (TBS) mindestens 1 h blockiert und dann vor der Reaktion mit Antikörper mit TBS, enthaltend 0,05% Tween 20, (TTBS) gewaschen. Nach der Entfernung von ungebundenem Antikörper durch mehrere Waschschritte in TTBS, wurden reaktive Proteine durch Verwendung von affinitätsgereinigtem, mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-anti-Maus-Antikörper und alkalische Phosphatase-Farbentwicklungsreagentien nachgewiesen. Die native Molekülmasse von OspA wurde durch Chromatographie oder (des) gereinigten Proteins in Puffer A, enthaltend 200 mM NaCl, bei einer Flussrate von 1,5 ml/min auf einer kalibrierten 2,5 · 120 cm Sephacryl S-200-Säule bei 4ºC bestimmt. Zwanzig Aminosäurereste, die der N-terminalen Nukleotidsequenz entsprachen, wurden unter Verwendung der Edman-Abbauprozedur an einem Applied Biosystems 470A Microsequencer bestimmt. Eine aminoterminale Sequenzierung der ersten 20 Reste der rekombinanten Variante von OspA ergab eine Sequenz, die identisch war mit jener, die aus der DNA-Sequenz nach einer Prozessierung zur Entfernung des ersten Methioninrests vorhergesagt worden war. Der molare Extinktionskoeffizient des Proteins wurde aus der Kenntnis von dessen Aminosäurezusammensetzung aus der Gleichung EM,nat = (AbSnat) (EM,Gdn.HCl)/AbsGdn.HCl) berechnet. Siehe Gill, S. C., & von Hippel, P. H., "Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data", Anal. Biochem. 182: 319-326 (1989). Der resultierende molare Extinktionskoeffizient (E&sub2;&sub8;&sub0;) war 10,59 · 10³ M&supmin;¹. Es wurde festgestellt, dass dieser Wert hervorragend übereinstimmte (± 5%) mit jenem, der aus einer Analyse der Aminosäurezusammensetzung von Säurehydrolysaten, die aus der rekombinanten Variante von OspA hergestellt worden waren, erhalten wurde, wie auch mit den Zahlen bezüglich der resultierenden Proteinausbeute konsistent war.

BEISPIEL 7

Die Reaktivität der rekombinanten Variante von OspA wurde gegenüber menschlichen Antikörpern gegen das Wildtyp-OspA getestet. Seren von Patienten mit Lyme-Krankheit enthalten Antikörper gegen mehrere äußere Membranproteine von B. burgdorferi, einschließlich OspA. Reaktive Synovia von Patienten mit chronischer, mit der Lyme- Krankheit in Zusammenhang stehender Arthritis und der OspA-spezifische Antikörper H3TS sind bereits früher beschrieben worden. Siehe Barbour, A. G., Burgdorfer, W., Grunwaldt, E., und Steere, A. C., "Antibodies of patients with Lyme diseaase to components of the Ixodes dammini spirochete", J. Clin. Invest., 72: 504-515 (1983). Siehe auch Barbour, A. G., Heiland, R. A., & Howe, T. R., "Heterogeneity of major proteins in Lyme disease borrelia: a molecular analysis of North American and European isolates", J. Infect. Dis., 152: 478-484 (1985).
Unter Bezugnahme auf Fig. 13 reagierten Antikörper, die in der Synovia von einem Patienten mit mit der Lyme-Krankheit in Zusammenhang stehender Arthritis vorhanden waren, in Western-Blots stark mit den 31 kDa- und 34 kDa-Wildtyp-OspA- und -OspB-Proteinen aus B. burgdorferi. Zusätzlich reagierten auch beide Formen von OspA, die in E. coli synthetisiert wurden (die rekombinante Variante oder (von) OspA wie auch die Volllängen-Wildtyp-Version oder (von) OspA, die als Kontrolle synthetisiert wurde) stark.
Unter erneuter Bezugnahme auf Fig. 13 enthielt Bahn 1 Ganzzell- Lysate (2 · 10&sup6; Zellen) von B. burgdorferi (B31)-Spirochäten, während die Bahnen 2-4 induzierte E. coli-Zellen enthielten. Bahn 5 enthielt die gereinigte rekombinante Variante von OspA (0,5 ug). Die Proben, die auf die Bahnen 2-5 aufgetragen wurden, waren 3 h nach der Induktion von Zellen gewonnen worden (6 ul), die das pET9-Vektorplasmid, pET9-preOspA bzw. pET9-OspA trugen. Mittels 12,5%-iger SDS-PAGE getrennte Proteine wurden auf Nitrocellulose transferiert, über Nacht in 2% Rinderserumalbumin blockiert und dann ließ man sie mit Synovia von einem Patienten mit Lyme-Krankheit reagieren, Die Blots wurden gewaschen, mit [¹²&sup5;I]-markiertem Protein A inkubiert und dann gegenüber einem Film für die Autoradiographie exponiert. Die Positionen von B. burgdorferi-Wildtyp-OspA und -OspB sind angegeben.
Obwohl die Ergebnisse zeigen, dass beide Plasmide immunreaktives OspA-Protein exprimieren, schien das ausgehend von pET9-preOspA exprimierte Protein stärker zu reagieren als eine äquivalente Menge von Protein, die ausgehend von pET9-OspA produziert wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn ImmobilonTM eine auf hydrophobem Polyvinylidendifluorid basierende Membran, als feste Phase für das Protein-Blotting verwendet wurde. Es wurde postuliert, dass dieser offensichtliche Unterschied in der Reaktivität durch einen schlechteren Transfer oder eine schlechtere Retention der rekombinanten Variante von OspA auf die bzw. auf der Nitrocellulosemembran verursacht worden sein könnte. Die vorerwähnte Theorie wurde nachfolgend überprüft, indem induzierte Kulturen mit [³&sup5;S]-Methionin (erhalten von DuPont-New England Nuclear; spezifische Aktivität = 1165 Ci/mmol) markiert wurden. Es wurde eine Autoradiographie eingesetzt, um die relativen Mengen von Wildtyp-OspA wie auch der rekombinanten Variante von OspA, die während jedes Schritts der Western-Blot- Analyse vorhanden waren, zu verfolgen.
Kulturen von BL21(DE3)/pLysS-Zellen, die pET9-preOspA oder pET9-OspA trugen, wurden bei 37ºC bis zur Mitte der logarithmischen Phase in M9-Medium gezüchtet und mit IPTG induziert. Eine Stunde später wurde jede Kultur mit 20 uCi/ml [³&sup5;S]-Methionin 5 min markiert und es wurden 10 ul-Portionen nach einer Elektrophorese auf 12,5%- igen Gelen analysiert. Unter Bezugnahme auf die Fig. 14 bis 18 enthielt Bahn 1 in jedem Feld ganze, unmarkierte B. burgdorferi-Zellen (5 · 10&sup7; Zellen). Die Bahnen 2 und 3 enthielten induzierte, markierte Zellen, die pET9-preOspA bzw. pET9-OspA trugen. Die Proteine wurden durch Anfärben mit Coomassie Blau, wie in Fig. 14 gezeigt, oder durch Autoradiographie des Gels, wie in Fig. 15 gezeigt, sichtbar gemacht. In den Fig. 16 und 17 werden die Proteine nach elektrophoretischem Transfer auf Nitrocellulosepapier sichtbar gemacht. Fig. 16 zeigt ein Autoradiogramm der Nitrocellulose vor einer weiteren Western-Analyse. Fig. 17 zeigt ein Autoradiogramm nach Reagierenlassen mit Antikörpern. Fig. 18 zeigt eine Photographie des fertigen Western-Blots nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase-Farbentwicklungsreagenzien. Die durchgezogenen Pfeile deuten auf die rekombinante Variante oder (von) OspA wie auch die pET9-preOspA-Proteine, die in den Bahnen 1 bzw. 2 gezeigt sind. Die gestrichelten Pfeile zeigen die Position des pET9-OspA-Proteinprodukts, das in Bahn 3 auftritt, an.
Unter nun erfolgender Bezugnahme auf die Fig. 14 bis 18 ist ersichtlich, dass sich die relativen Mengen des Wildtyp-OspA und der rekombinanten Variante von OspA während der Blotting-Prozedur verändert haben. Die Menge der rekombinanten Variante von OspA, die nach dem Blot zurückblieb, die man mit Antikörpern reagierenließ und die nachfolgend gewaschen wurde, war beträchtlich verringert bezogen auf die Menge, die anfänglich transferiert worden war. Im Gegensatz dazu wurde die Wildtyp-Version von OspA während jedes Schritts gut zurückgehalten. Die Ergebnisse zeigten, dass der offensichtliche Unterschied in der Reaktivität der zwei OspA-Formen (der rekombinanten Variante und der Wildtyp-Version) primär auf einem selektiven Verlust der hochgradig löslichen, rekombinanten Variante von OspA während der Western-Blot-Analyse beruhte.

SCHLUSSFOLGERUNGEN UND ZUSAMMENFASSUNG DER DATEN

Obwohl die vorangegangene Methode zur Herstellung einer rekombinanten Version eines Proteins auf das äußere Oberflächenprotein A von Borrelia burgdorferi gerichtet war, ist die Methode in gleicher Weise auf andere Borrelia-Lipoproteine anwendbar, vorausgesetzt, dass die Signalsequenz für die Signalpeptidase II in dem das in Frage stehende Lipoprotein kodierenden Gen auftaucht.
Die verkürzte Version des ospA-Gens war ein hervorragender Überproduzent aufgrund von deren fehlender Assoziierung mit der Zellmembran des Wirtsorganismus. Die resultierende rekombinante Variante von OspA machte nach einigen Stunden Induktion mehr als 50% des gesamten zellulären Proteins aus. Siehe Beispiele 4, 5 und 6. Zusätzlich ist die rekombinante OspA-Variante nicht lipidiert und ist in Abwesenheit von Detergentien hochgradig löslich (≥ 50 mg/ml). Siehe Beispiel 4. Darüber hinaus können 60-70 mg reines Protein aus so wenig wie 0,5 Litern Ausgangskultur nach einer einfachen Reinigungsprozedur aufgrund der guten Überexpression in dem Wirtsorganismus erhalten werden. Siehe Beispiele 5 und 6. Western-Blots der rekombinanten Variante von OspA zeigten, dass diese ihre immunreaktiven Epitopstellen beibehielt. Siehe Beispiele 3 und 7. Diese Reaktivität in Verbindung mit den Hochreinheits- und Löslichkeitseigenschaften des Proteins der Erfindung machen dieses zu einem guten Kandidaten für ein diagnostisches Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit von Lyme-Krankheit bei klinischen Isolaten wie auch für ein potentielles Immunogen für einen Impfstoff gegen B. buradorferi.
Obwohl veranschaulichende Ausführungsformen der Erfindung hier unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben worden sind, versteht es sich, dass die Erfindung nicht auf jene exakten Ausführungsformen beschränkt ist und dass verschiedene andere Veränderungen und Modifizierungen darin von Fachleuten auf diesem Gebiet vorgenommen werden können, ohne von dem Umfang der Erfindung, wie er nachfolgend beansprucht wird, abzuweichen.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN
(i) ANMELDER: Dunn, John J.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Klonierung und Expression von Borrelia-Lipoproteinen
(iii)ANZAHL DER SEQUENZEN: 15
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Brookhaven National Laboratory Associated Universities, Inc.
(B) STRASSE:
(C) STADT: Upton
(D) BUNDESSTAAT: New York
(E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika
(F) POSTLEITZAHL: 11973
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: 5,25-Zoll, 360 kb-Diskette
(B) COMPUTER: IBM XT-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: MS DOS
(D) SOFTWARE: WORD PERFECT 4.2
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1.
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 822 Basen
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2.

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 273 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2.

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3.

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 777 Basen
(β) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3.

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 258 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5.

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 774 Basen
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 257 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 774 Basen
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 257 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 771 Basen
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 256 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 32 Basen
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Basen
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

GATATCIAGA TCTTTATTTT AAAGCGTT 28

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 31 Basen
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 12 Basen
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15.

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

Claims

1. Nicht-lipidhaltiges Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Sequenz SEQ ID NO: 10 mit einem oder mehreren Alanin- und/oder Methioninresten an dem N-terminalen Ende der SEQ ID NO: 10-Sequenz besteht.

2. Protein nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 ist.

3. Protein, das aus einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 10 besteht.

4. Nukleotidsequenz, die eine Aminosäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.

5. Nukleotidsequenz nach Anspruch 4, die eine Aminosäuresequenz nach Anspruch 2 kodiert, wobei die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 ist.

6. Nukleotidsequenz nach Anspruch 4, die die Aminosäuresequenz von Anspruch 3 kodiert und wobei die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 9 ist.

7. Verfahren zum Bereitstellen einer verkürzten Version einer Nukleotidsequenz, die das Lipoprotein OspA aus Borrelia buradorferi kodiert, umfassend:

Bereitstellen einer DNA-Matrize, die die Nukleotidsequenz umfasst, die das Borrelia-Lipoprotein kodiert, wobei die Matrize eine potentielle Signalpeptidase II-Signalsequenz enthält, wobei die Signalsequenz ein 5'-Ende und ein 3'-Ende hat, wobei das 3'-Ende mit einem Codon für einen Cysteinrest endet; und

Synthetisieren eines Satzes von Oligonukleotidprimern, der einen ersten und einen zweiten Primer umfasst, wobei der erste Primer eine Region umfasst, die zu einem ersten DNA- Strang der DNA-Matrize ausreichend komplementär ist, um die Amplifizierung des ersten DNA-Strangs in einer 5'→3'-Richtung wirksam zu initiieren bzw. zu primen, und ein zweiter Primer eine Region umfasst, die zu einem zweiten DNA-Strang der DNA- Matrize ausreichend komplementär ist, um die Amplifizierung des zweiten DNA-Strangs in einer 5'→3'-Richtung wirksam zu initiieren bzw. zu primen, und wobei eine Verwendung der Primer eine DNA-Polymerisation an einem Nukleotid, das sich auf der DNA- Matrize stromabwärts von dem Cysteinrest in einer 3'-Richtung befindet, initiiert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Nukleotid sich unmittelbar stromabwärts von dem Cysteinrest in der 3'-Richtung befindet.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Nukleotidsequenz des Borrelia-Lipoproteins eine Leader-Sequenz, die ein 5'-Ende und ein 3'-Ende aufweist, enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Leader-Sequenz die Signalsequenz enthält oder teilweise enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Leader-Sequenz an dem 3'-Ende mit der Signalsequenz endet und die Signalsequenz sich unmittelbar stromabwärts von dem 3'-Ende der Leader- Sequenz befindet.

12. Verfahren zum Bereitstellen einer rekombinanten Variante des Lipoproteins OspA aus Borrelia burgdorferi, umfassend:

Bereitstellen einer DNA-Matrize, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die das Borrelia-Lipoprotein kodiert, wobei die Matrize eine potentielle Signalpeptidase II-Signalsequenz enthält, wobei die Signalsequenz ein 5'-Ende und ein 3'-Ende hat, wobei das 3'-Ende mit einem Codon, das einen Cysteinrest kodiert, endet;

Synthetisieren eines Satzes von Oligonukleotidprimern, der einen ersten und einen zweiten Primer umfasst, wobei der erste Primer eine Region umfasst, die zu einem ersten DNA- Strang der DNA-Matrize ausreichend komplementär ist, um die Amplifizierung des ersten DNA-Strangs in einer 5'→3'-Richtung wirksam zu initiieren bzw. zu primen, und ein zweiter Primer eine Region umfasst, die zu einem zweiten DNA-Strang der DNA- Matrize ausreichend komplementär ist, um die.Amplifizierung des zweiten DNA-Strangs in einer 5'→3'-Richtung wirksam zu initiieren bzw. zu primen, wobei der erste Primer eine DNA-Polymerisation an einem Nukleotid, das sich auf der DNA-Matrize stromabwärts von dem Cysteinrest in einer 3'-Richtung befindet, initiiert;

Reagierenlassen der Primer in einer Polymerasekettenreaktion, wodurch ein Satz von Amplifizierungsprodukten bereitgestellt wird;

Isolieren einer verkürzten Version der Nukleotidsequenz aus dem Satz von Amplifizierungsprodukten;

Klonieren der verkürzten Version in einen geeigneten Expressionsvektor;

Transformieren eines geeigneten Wirtsorganismus unter Verwendung des Expressionsvektors und

Züchten des Wirtsorganismus für eine Produktion der rekombinanten Variante des Lipoproteins.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Expressionsvektor ein Plasmid ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Expressionsvektor ein pET9-Plasmid ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Plasmid pET9-OspA ist, das, wie in Fig. 9 gezeigt, durch die Insertion der in SEQ ID NO: 10 gezeigten verkürzten OspA-Nukleotidsequenz in das Plasmid pET9 konstruiert worden ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei der Wirtsorganismus ein E. coli-Stamm ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der E. coli-Stamm BL21 (DE3)pLysS ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei ein T7- Bakteriophagen-Expressionssystem eingesetzt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das T7-Bakteriophagen-Expressionssystem eine T7-RNA-Polymerase einsetzt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 19, wobei das Borrelia-Lipoprotein ein Borrelia burgdorferi-Lipoprotein ist.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Borrelia burgdorferi- Lipoprotein das äußere Oberflächenprotein A (OspA) ist.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 21, wobei der erste Primer von einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 11 kodiert wird.

23. Transformierter E. coli-Stamm, der das Plasmid pET9-OspA, wie in Anspruch 15 definiert, enthält, wobei der Stamm BL21 (DE3)/pLysS, pETO-OspA ist.

24. Oligonukleotidprimer, der zu einer Amplifizierung eines Abschnitts einer Nukleotidsequenz, die ein Borrelia-Lipoprotein kodiert, nützlich ist, wobei der Primer SEQ ID NO: 11 ist.