FI105924B - Borrelia-lipoproteiinien kloonaus ja ilmentäminen - Google Patents

Description

105924

Rorre/m-lipoproteiinien kloonaus ja ilmentäminen Kloning och uttryckande av Borrelia-lipoproteiner 5 Esillä oleva keksintö liittyy patologisten aineiden ulomman pinnan proteiinien yhdistelmä-DNA-teknisiin muunnoksiin ja yhdistelmä-DNA-tekni^iin menetelmiin näiden muunnosten jälleenmuodostamiseksi. Erityisesti esillä olevan keksintö koskee menetelmää villityyppiä olevien Borrelia-lipoproteiinien yhdistelmä-DNA-teknisten muunnosten tuottamiseksi. Vielä erityisemmin esillä olevaan kek-10 sintöön liittyy Borrelia burgdorferm ulomman pinnan A-proteiinin yhdistelmä-DNA-tekninen muunnos, joka B. burgdorferi on spirokeetta, joka on syypää Ly-men sairauteen, sekä menetelmä tämän valmistamiseksi.

2to/re//a-spirokeetat ovat syypäitä erilaisiin sairauksiin kuten Lymen sairauteen.

15 Lymen sairaus on infektio, joka on Borrelia burgdorferi -spirokeetan, aiheuttama, jota punkit kantavat eteenpäin. Spirokeetta kulkeutuu ihmisiin ja eläimiin punkin pureman välityksellä ja voi aiheuttaa vakavia ihotauteja, niveltulehdusta, sekä neurologisia ja muita patologisia sairaudentiloja tartunnan saaneessa. Viime aikoina Lymen sairaus on ollut epidemiologinen huolenaihe, johon on suhtauduttu 20 vakavasti Pohjois-Amerikassa kuten myös Euroopassa, Aasiassa ja Neuvostoliitossa.

•

On osoitettu, että ihmiset ja eläimet, joissa on Borrelian tartuttama infektio, tyypillisesti kehittävät vasta-aineita vasteena erilaisille Borrelia-antigeeneille mu-25 kaanlukien ulomman membraanin lipoproteiinit. Esimerkiksi potilaissa, joihin on tarttunut Lymen sairaus, kehittyy vasta-aineita ulomman pinnan proteiinia A vas-. . taan (OspA), joka on Borrelia burgdorferi -spirokeetan lipoproteiini. Katso Craft, J.E., Fischer, D.K., Shimamoto, G.T., ja Steere, A.C., "Antigens of Borrelia burgdorferi recognized during Lyme disease. Appearance of a new immunoglobulin in 30 response and expansion of the immunoglobulin G response late in the illness," J. Clin. Invest., 78: 934-939 (1986). Katso myös Barbour, A.G., Heiland, R.A. ja 2 105924

Howe, T.R. "Heterogeneity of major proteins in Lyme disease Borrelia: a molecular analysis of North American and European isolates", J. Infect., Dis., 152: 474-484 (1985). Ulomman pinnan proteiini A (OspA) on lipoproteiini, jota ospA geenin nukleotidisekvenssi koodittaa, joka OspA-geeni on läsnä B. burgdorferi -5 spirokeetin DNA:-ssa. Nukleotidisekvenssi, joka koodittaa täysipituisen villityyp-pisen OspA:n (katso SEQ ID NO: 1), on viime aikoina määritelty B31 :lle, joka on B. burgdorferin Pohjois-Amerikan kanta. Katso Bergstrom, S., Bundoc, V.G. & Barbour, A.G., "Molecular Analysis of linear plasmidencoded major surface proteins, OspA and OspB of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi". Mol. 10 Microbiol.. 3: 479-486 (1989). Siten OspA:n aminohapposekvenssi on voitu ennustaa nukleotiditiedoista (katso SEQ ID NO: 2).

Kliiniseltä näkökannalta on hyvin toivottavaa kehittää menetelmä hyvin puhtaiden Borrelia-lipoproteiinien suurten määrien valmistamiseksi liukenevassa muodossa 15 käytettäviksi immuunikokeisiin ja muihin diagnostisiin seulontatesteihin, jotka ilmaisevat näiden proteiinien vasta-aineiden läsnäolon niiden potilaiden seerumissa, joilla on Borrelia-spirokeettien tartunta. Lisäksi näiden lipoproteiinien liukenevat, hyvin puhtaat muodot olisivat mahdollisesti arvokkaita kliinisinä vastustuskykyä aiheuttavina aineina sekä ihmisten että eläinten rokottamiseksi tautia 20 aiheuttavaa Borreliaa vastaan, kuten myös käyttökelpoisia tutkimusvälineitä myöhemmässä laboratoriokäsittelyssä, johon liittyy näiden proteiinien vasta-aineiden erottaminen j a puhdistus.

Yhdistelmä-DNA-teknologian näkökannalta on hyvin toivottavaa saada nukleoti-25 disekvenssi tai geeni, joka voidaan ilmentää tehokkaasti (hyperilmentäminen) yhdistelmä-DNA-teknisestä isännästä ja vektorista muodostetussa ilmentämisjär-• V . jestelmässä tuloksena saadun yhdistelmä-DNA-teknisen proteiinin suurten määri en saamiseksi, samalla kun haluttu spesifinen reaktiivisuus säilytetään.

30 Aikaisemmin on yritetty eristää puhdistettuja liukenevia Borrelia-liporoteiineja kasvattamalla Borrelia-soluviljelmiä ja puhdistamalla sen jälkeen. Tällä menetel- .105924 3 mällä on kuitenkin useita haittoja. Näiden proteiinien kasvuja sen jälkeinen puhdistus Borrealiavi solujen raakauutteista on hyvin aikaavievää ja kallista. Lisäksi elävien Borrelia-viljelmien kasvu ja käsittely lisää merkittävästi laboratoriohenkilökunnan vaaratilanteiden mahdollisuutta. Mikä tärkeintä, villityyppisillä täysi-5 pituisilla 5orre/z'a-lipoproteiiniversioilla, jotka saadaan tällä menetelmällä, on heikot liukoisuusominaisuudet, koska näillä proteiineilla on hydrofobinen lipi-diominaisuus, luultavasti siksi, että ne liittyvät spirokeetan solukalvoon ilmentämisen aikana. Siten näiden lipidoitujen proteiinien saattamisessa liukoiseen muotoon tarvitaan pinta-aktiivisia aineita.

10

Alalla on hyvin tunnettua, että lipoproteiinien käsittely pinta-aktiivisilla aineilla parantaa liukoisuutta, mutta haittaa usein reaktiivisuutta, koska nämä muuttavat tai tuhoavat kohteena olevan proteiinin poimuttuneen avaruusrakenteen, kuten myös epitooppiset paikat. Siten olisi toivottavaa kehittää OspA:n kuten myös 15 muiden Borrelia-lipoproteiinien yhdistelmä-DNA-tekniset muunnokset, jotka liukenevat ilman, että tarvitsee käyttää pinta-aktiivisia aineita samalla kun niiden spesifinen reaktiivisuus täysipituisia villityyppisiä lipoproteiinianalogeja vastaan kehittyneiden vasta-aineiden kanssa säilytetään. Edellä olevien liukoisuusongel-mien lisäksi, ito/re/za-lipoproteiinien liittyminen spirokeetan ulompaan solukal-20 voon tuottaa myös ongelmia näiden proteiinien erottamisessa ja puhdistuksessa solujen raakauutteista.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää eräitä yhdistelmä-DNA-tekniikoita Borrelia-geenien ilmentämiseksi käyttämällä isäntä/vektori-ilmentämisjäijestelmää kuten 25 E. coin, joka sisältää alalla tunnettuja yhdistelmä-DNA-teknisiä kloonausvekto-reita. Sopiva yhdistelmä-DNA-tekninen kloonausvektori olisi plasmidi, jolla on sellainen nukleotidisekvenssi, joka voitaisiin muuntaa hyväksymään villityyppi-sen Borrelia DNA:n sisällyttäminen. Samalla kun näillä yhdistelmä-DNA-tekniikoilla vältetään elävien 2?orre/z'a-viljelmien tarve, niillä on useita puutteita.

30 , 105924 4

Esimerkiksi täysipituisten villityyppisen Borrelia burgdorferin yhdistelmä-DNA-teknisillä versioilla, jotka tuotetaan käyttämällä E. colia, on huonot liukoisuus-ominaisuudet ilman pinta-aktiivisia aineita luultavasti johtuen siitä, että proteiinit liittyvät isännän ulompaan solukalvoon ilmentämisen aikana. Siksi sen jälkeisiin 5 toimenpiteisiin, jotka kohdistuvat tuloksena saadun proteiinituotteen erottamiseen ja puhdistukseen, liittyy ongelmia, jotka ovat samantapaisia kuin ne, joita kohtaa, kun pyritään eristämään ja puhdistamaan OspA elävistä B. burgdorferi-viljelmistä.

10 Edellä olevan lähestymistavan toinen huono puoli on se, että täysipituisen villi-tyyppisen ospA-geenin yhdistelmä-DNA-teknisten versioiden hyperilmentyminen E. coli -isännässä on huono. Tämä heikko ilmentyminen luultavasti johtuu OspA-proteiinin E. coli -solukalvossa olevasta sijainnista johtuvista varastoituneista myrkyllisistä vaikutuksista ilmentämisen aikana.

15

Esillä olevan keksinnön eräässä suoritusmuodossa saadaan aikaan menetelmä, jolla tuotetaan villityyppisten Borrelia-lipoproteiinien yhdistelmä-DNA-teknisiä muunnoksia, jotka liukenevat ilman pinta-aktiivisten aineiden läsnäoloa ja joilla on hyvä ilmentyminen isäntäorganismissa, kuten E. colissa., samalla kun niiden 20 spesifinen reaktiivisuus niitä vastaavia villityyppisiä Borrelia-lipoproteiinianalogeja vastaan muodostuneiden vasta-aineiden kanssa säilyy.

Esillä oleva keksintö kohdistuu myös menetelmään, jossa tuotetaan B, burgdorfe-rin ulomman pinnan proteiini-A:n (OspA) yhdistelmä-DNA-teknisiä muunnoksia, 25 jotka liukenevat ilman pinta-aktiivisten aineiden läsnäoloa samalla kun spesifinen reaktiivisuus villityyppisen B. burgdorferin OspA:n vasta-aineita vastaan säilyy.

§ P

«

Esillä olevan keksinnön eräs toinen suoritusmuoto kohdistuu B. burgdorferin ulomman pinnan proteiini A:n (OspA) yhdistelmä-DNA-teknisen muunnoksen 30 aikaansaamiseen, joka on liukeneva ilman pinta-aktiivisten aineiden läsnäoloa, mutta jonka spesifinen reaktiivisuus villityypin B. burgdorferin OspA:ta vastaan 5 105924 « kohdistuvien vasta-aineiden kanssa säilyy, ja joka ei liity isännän solukalvoon ilmentämisen aikana, mutta jonka spesifinen reaktiivisuus luonnollisen B. burg-dorferin OspArta vastaan kohdistuvien vasta-aineiden kanssa säilyy.

5 Esillä oleva keksintö kohdistuu lisäksi nukleotidisekvenssin aikaansaamiseen, joka ilmentyy voimakkaasti isäntäorganismissa, kuten E. colissa ja joka koodittaa B. burgdorferi OspA:n yhdistelmä-DNA-teknistä muunnosta, joka liukenee ilman pinta-aktiivisten aineiden läsnäoloa samalla kun spesifinen reaktiivisuus villityyp-pisen B. burgdorferin OspA:n vasta-aineiden kanssa säilyy.

10

Esillä olevan keksinnön vielä eräänä kohteena on saada aikaan DNA-plasmideja, jotka sisältävät nukleotidisekvenssin, joka koodittaa B. burgdorferin OspA:n yh-distelmä-DNA-teknistä muunnosta, joka on liukoinen ilman pinta-aktiivisten aineiden läsnäoloa ja joka ei liity isäntäsolukalvoon ilmentämisen aikana, mutta 15 jonka spesifinen reaktiivisuus villityyppisen B. burgdorferin OspA:n vasta-aineiden kanssa säilyy.

Lopuksi esillä olevan keksinnön kohteena on saada aikaan E. colin muunneltu kanta, jossa on DNA-plasmideja, jotka sisältävät nukleotidisekvenssin, joka koo- 20 dittaa B. burgdorferin OspA:n yhdistelmä-DNA-teknistä muunnosta, joka on liukoinen ilman pinta-aktiivisten aineiden läsnäoloa ja joka ei liity isäntäsolukalvoon ilmentämisen aikana, mutta jonka spesifinen reaktiivisuus täyspituisten villityyp-pisten B. burgdorferin OspA:n vasta-aineiden kanssa säilyy.

25 Esillä oleva keksintö saa aikaan liukenevan, voimakkaasti ilmentyvän Borrelia burgdorferi -proteiini A:n (OspA) ulomman pinnan yhdistelmä-DNA-teknisen . muunnoksen ja menetelmän tämän valmistamiseksi. Aminohapposekvenssi, joka koodittaa OspA:n yhdistelmä-DNA-teknistä muunnosta, on esitetty taulukossa SEQ ID NO: 4, kuten jäljempänä on esitetty.

30 9 6 105924

Menetelmään esillä olevan keksinnön mukaisen proteiinin aikaansaamiseksi liittyi villityyppisen B. burgdorferi OspA-geenin katkaistun muunnoksen valmistami- nen, joka voitiin ilmentää tehokkaasti yhdistelnä-DNA-teknisessä isännässä liukenevan tuotteen saamiseksi. Käyttämällä DNA-mallinetta, joka sisältää B. burg-5 dorferi DNA:ta, erityisellä tavalla muodostettuja oligonukleotidialukkeita käytettiin polymeraasiketjureaktiossa villityyppisen ospA-geenilohkon monistamiseksi, josta lohkosta puuttuivat ensimmäiset 17 kodonia, jotka sisältävät signaalipepti-daasin Π signaalisekvenssin. Tuloksena saatu monistettu tuote ilmennettiin T7-bakteriofaagi-ilmentämisjäijestelmässä käyttämällä alalla tunnettuja yhdistelmä-10 DNA-teknisiä DNA -tekniikoita.

Samoin on aikaansaatu DNA-plasmidi, pET9-OspA, joka käsittää nukleotidise-kvenssin, joka koodittaa esillä olevan keksinnön proteiinia, ja sen lisäksi tällä transformoitu E. colin kahta.

15

Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä on yhtä hyvin sovellettavissa muiden £orre//a-lipoproteiinien yhdistelmä-DNA-teknisten muunnosten tuottamiseen sillä edellytyksellä, että lipoproteiini sisältää vaadittavan signaalisekvenssin sig-naalipeptidaasia II varten.

20

Esillä olevan keksinnön mukainen proteiini on hyvin edullinen siinä, että sen reaktiivisuus villityyppisiä B. burgdorferi OspA:n vasta-aineita vastaan säilyy samalla kun saadaan paremmat liukoisuusominaisuudet sellaiseen OspA:-han nähden, joka on saatu elävistä viljelmistä tai muilla yhdistelmä-DNA-tekniikoilla.

25 Tämä parempi liukoisuus on erityisen edullinen immuunidiagnostisissa määritysmenetelmissä kuten myös laboratoriokäsittelyissä, koska proteiini on liukeneva .’· ilman pinta-aktiivisia aineita, jotka voisivat vaikuttaa haitallisesti reaktiivisuuteen tai tuhota sen.

30 Esillä olevan keksinnön mukaisen proteiinin toinen etu on siinä, että se ei liity isäntäsolukalvoon ilmentämisen aikana toisin kuin villityyppinen OspA, joka il- 105924 mennetään yhdistelmä-DNA-teknisesti. Siksi esillä olevan keksinnön mukaista proteiinia voidaan ilmentää tehokkaasti käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikoita, koska se ei ole niin myrkyllinen isäntäorganismille kuin villityypin OspA. Paran-, nettu yhdistelmä-DNA-tekninen ilmentäminen johtaa kohteena olevan proteiinin 5 korkeampiin saantoihin samalla kun vältetään eläviin 5orre/ia-soluviljelmiin liittyvät vaarat ja kustannukset.

Esillä olevan keksinnön vielä yhtenä etuna on, että se saa aikaan menetelmän voimakkaasti ilmentyvän 2?orre//a-lipoproteiinien yhdistelmä-DNA-teknisen 10 muodon valmistamiseksi, jolla on parempi liukoisuus ilman pinta-aktiivisia aineita samalla kun spesifinen reaktiivisuus niiden villityyppisten lipoprote-iinianalogien vaikutuksesta muodostuneiden vasta-aineiden kanssa säilyy. Ennen esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää pinta-aktiiviset aineet olivat välttämättömiä näiden lipoproteiinien saamiseksi liukoiseen muotoon immuunikokeissa 15 ja muissa laboratoriokäsittelyissä käyttöä varten, jolloin reaktiiviset epitooppiset paikat altistuivat pinta-aktiivisten aineiden mahdollisille haitallisille vaikutuksille.

Sen mukaisesti esillä olevan keksinnön laajan näkökannan mukaisesti saadaan aikaan proteiini, jota koodittaa aminohapposekvenssi, joka käsittää ensimmäisen 20 ja toisen osan, jossa toisessa osassa on 5' ja 3' -pää ja käsittää sekvenssin SEQ ID NO: 10, ja joka ensimmäinen osa sijaitsee toisen osan 5' -päässä ja muodostuu aminohappojäännöksistä, joka voi olla alaniini ja/tai metioniini, kuten myös nuk-leotidisekvenssi, joka koodittaa tätä aminohapposekvenssiä. Aminohapposekvenssi saattaa käsittää sekvenssin SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 tai SEQ ID NO: 8, 25 jotka on esitetty jäljempänä, ja nukleotidisekvenssi voi käsittää sekvenssin SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 tai SEQ ID NO: 7, jotka on esitetty jäljempänä.

Keksinnön erään toisen laajan näkökulman mukaisesti saadaan aikaan proteiini, jota koodittaa aminohapposekvenssi SEQ ID NO: 10, kuten on esitetty jäljempä-30 nä, kuten myös nukleotidisekvenssi, joka koodittaa aminohapposekvenssiä, joka voi käsittää SEQ ID NO: 9.

8 105924

Keksinnön muut erityiset suoritusmuodot ovat pET9-plasmidi isäntäorganismin transformoimiseksi, joka käsittää pET-OspA:n; E. colin transformoitu kanta, joka sisältää plasmidin pET9-OspA, jossa kanta on BL21 (DE3)/pLysS, pET9-OspA; ja 5 oligonukleotidialuke, joka onO käyttökelpoinen 5orre//'a-lipoproteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin osan monistamiseksi, joka aluke on SEQ ID NO: 11.

Keksinnön eräs toinen suoritusmuoto saa aikaan Zto/r^/za-lipoproteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin katkaistun muodon, siten, että (a) saadaan aikaan DNA-10 malline, joka käsittää nukleotidisekvenssin, joka koodittaa So/re/ia-lipoproteiinin, jolloin malline sisältää mahdollisen signaalipeptidaasi II signaalisekvenssin, jossa signaalisekvenssissä on 5' -pää ja 3' -pää, jolloin 3' -pää loppuu kodoniin, joka koodittaa kysteiinijäännöstä; ja (b) syntetisoidaan oligonukleotidialukkeiden joukko, joka käsittää ensimmäisen ja toisen alukkeen, jolloin ensimmäinen aluke 15 käsittää alueen, joka on riittävän komplementti DNA-mallineen ensimmäiselle DNA-juosteelle toimiakseen alukkeena ensimmäisen DNA-juosteen tehokkaaksi monistamiseksi 5' - 3' suunnassa ja toisen alukkeen, joka käsittää alueen, joka on riittävän komplementti toisen DNA-mallineen DNA-juosteelle toimiakseen alukkeena toisen DNA-juosteen tehokkaaksi monistamiseksi 5' - 3' suunnassa, jossa 20 ensimmäinen aluke käynnistää DNA -polymeroinnin nukleotidissa, joka sijaitsee DNA-mallineessa kysteiinijäännöksen jälkeen 3'-suunnassa tarkastellen.

Keksinnön lisäsuoritusmuodon mukaisesti saadaan aikaan Borrelia-lipoproteiinin yhdistelmä-DNA-tekninen muunnos siten, että: (a) saadaan aikaan DNA-malline, 25 joka käsittää nukleotidisekvenssin, joka koodittaa mainittua Borrelia-lipoproteiinia, mallineen sisältäessä mahdollisen signaalipeptidaasi II signaalisekvenssin, jossa signaalisekvenssissä on 5' -pää ja 3' -pää, joka 3' -pää loppuu kodoniin, joka koodittaa kysteiinijäännöstä; (b) syntetisoidaan oligonukleotidialukkeiden joukko, joka käsittää ensimmäisen ja toisen alukkeen, ensimmäisen aluk-30 keen käsittäessä alueen, joka on riittävän komplementti ensimmäisen DNA-mallineen DNA-säikeeseen nähden toimiakseen alukkeena ensimmäisen DNA- 9 105924 säikeen tehokkaaksi monistamiseksi 5' - 3' -suunnassa ja toisen alukkeen käsittäessä alueen, joka on riittäväsn komplementti DNA-mallineen toiseen DNA-juosteeseen nähden toimiakseen alukkeena toisen DNA-jousteen tehokkaaksi mo-« nistamiseksi 5' - 3' -suunnassa, jossa ensimmäinen aluke käynnistää DNA- 5 polymeroinnin nukleotidissa, joka sijaitsee mainitussa DNA-mallineessa kyste-iinijäännöksen jälkeen 3'-suunnassa; (c) antamalla alukkeiden reagoida polymeraasiketjureaktiossa, jolloin saadaan aikaan monistettujen tuotteiden joukko; (d) eristetään nukleotidisekvenssin katkaistu muoto monistettujen tuotteiden joukosta; (e) kloonataan katkaistu muoto sopivaan ilmentämisvektoriin; (f) sopiva isäntäor-10 ganismi transformoidaan käyttämällä tätä ilmentämisvektoria; ja (g) viljellään isäntäorganismia lipoproteiinin yhdistelmä-DNA-teknisen muunnoksen tuottamiseksi.

Esillä olevan keksinnön sekä toisten ja lisäkohteiden ymmärtämiseksi paremmin 15 viitataan seuraavaan selostukseen, ja siihen liittyviin piirustuksiin ja sen laajuus esitetään liitteenä olevissa vaatimuksissa.

Kuvio 1 esittää kaavionomaisesti oligonukleotidialukkeen 201 ->216 nukleotidi-sekvenssiä.

20

Kuvio 2 esittää kaavionomaisesti oligonukleotidialukkeen 958 —> 972 nukleoti-disekvenssiä.

Kuvio 3 esittää kaavionomaisesti oligonukleotidialukkeen 151 -> 171 nukleoti-25 disekvenssiä.

Kuvio 4 esittää kaavionomaisesti villityyppistä ospA-geeniä, jossa on korostettu kohdat, joissa alukkeet 201 —> 216 ja 958 <— 972 kiinnittyvät.

30 Kuvio 5 esittää kaavionomaisesti villityyppistä ospA-geeniä, jossa on korostettu kohdat, jossa alukkeet 151 -> 171 ja 958 <- 972 kiinnittyvät.

I0 · 105924

Kuvio 6 esittää tuotetta, joka on tuloksena villityypin ospA-geenin monistamisesta alukkeella 201 -> 216 ja alukkeella 958 <— 972.

5 Kuvio 7 on valokuva 1 %:sesta agaroosigeelistä, joka on väijätty etidiumbromi-dilla, ja jolla monistustuotteet ajettiin.

Kuvio 8 on plasmidin pET9 kaaviollinen esitys.

10 Kuvio 9 on plasmidin pET9-OspA kaaviollinen esitys.

Kuvio 10 on valokuva SDS-12,5% PAGE -geelistä, joka on väijätty Coomassie-sinisellä, ja jonka avulla erilaiset soluproteiininäytteet ajettiin tietyillä aikaväleillä indusoinnista poistamisen jälkeen.

15

Kuvio 11 on valokuva SDS-PAGE -geelistä, jolla indusoimattomia soluja verrattiin indusoituihin soluihin, joista oli otettu näytteet yhden tunnin välein indusoi-misen jälkeen.

20 Kuvio 12 on valokuva SDS-PAGE -geelistä, jolla OspA-näytteet ajettiin. Näytteet otettiin puhdistuksen eri vaiheissa.

Kuvio 13 on kokonaisista B. burgdorferi-soluista saatujen OspA ja OspB -proteiinien, kuten myös OspA:n ja preOasA:n immuunikemiallisen Westem-blot-25 analyysin autoradiogrammi.

f i ’ Kuvio 14 on valokuva SDS-12,5 % PAGE -geelistä, joka oli värjätty Coomassie- sinisellä, jonka avulla soluja, jotka sisälsivät pET9-preOspA:ta ja soluja, jotka sisälsivät pET9-OspA:ta, verrattiin kokonaisiin B. burgdorferi -soluihin.

Kuvio 15 on kuvion 14 valokuvan mukaisen geelin autoradiogrammi.

30 Π 105924

Kuvio 16 on kuviossa 14 olevan geelin nitroselluloosasiirroksen autoradiogrammi ennen seuraavaa Westem-analyysiä.

5 Kuvio 17 on kuviossa 14 olevan geelin nitroselluloosasiirroksen autoradiogrammi koettimina käytetyillä vasta-aineilla merkitsemisen jälkeen.

Kuvio 18 on valokuva kuviossa 14 kuvatun geelin loppuun suoritetusta Westem-blot-analyysistä aikalisillä fosfataasivärikehitysreagensseilla käsittelyn jälkeen.

10

Esillä olevan keksinnön ymmärtämiseksi määritellään seuraavat käsitteet: "Bakteerit" ovat prokaryoottisia organismeja, joilla on tiivis suojapäällystys, joka tunnetaan soluseinämänä, jonka alla oleva solukalvo sisällyttää yhden ainoan sy-15 toplasmaosaston, joka sisältää DNA:ta, RNA:ta, proteiineja ja pieniä molekyylejä.

Esimerkkejä ovat spirokeetat ja Escherichia coli.

"Hyperilmentäminen" on kloonattujen geenien voimakas ilmentäminen. Bakteriofagi T7 RNA -polymeraasi voi saada aikaan voimakkaan kopioitumisen T7 -20 promoottorista monena kopiona esiintyvään plasmidiin, joka tehokkaasti kopioi melkein mitä tahansa DNA:ta, joka on liittynyt T7 -promoottoriin. Tämä johtaa liitetyn DNA:n voimakkaaseen ilmentymiseen.

"Plasmidi" on kaksijuosteinen, suljettu, pyöreä DNA -molekyyli, joka on riippu-25 maton kromosomista ja käsittää ehjän replikonin niin, että plasmidi replikoituu isäntäsolussa. Kun plasmidi sijoitetaan yksisoluisen organismin soluun, organismin ominaisuudet voidaan transformoida. Niihin fenotyyppeihin, joihin voidaan vaikuttaa plasmideilla, kuuluu vastustuskyky antibiootteja vastaan sekä restriktio-ja muunnosentsyymien tuottaminen.

30 12 105924 "Aluke" on oligonukleotidi (lyhyt nukleiinihappoketju), joka kykenee toimimaan synteesin käynnistymispisteenä, kun se saatetaan olosuhteisiin, jossa alukkeen monistustuotteen, joka on komplementti nukleiinihappojuosteelle, synteesi alkaa. Aluke voi esiintyä luonnossa, kuten puhdistetussa restriktiopilkkeessä, tai se voi-5 daan tuottaa synteettisesti.

Nyt on havaittu, että kun rakennetaan villityyppinen ospA-geeni (katso SEQ ID NO: 1) uudelleen ensimmäisten 17 kodonien poistamiseksi nukleotidisekvenssis-tä, saadaan katkennut nukleotidisekvenssi, joka voidaan hyperilmentää isäntäor-10 ganismissa, kuten E. colissa, B. burgdorferi OspA:n yhdistelmä-DNA-teknisen muunnoksen tuottamiseksi, joka muunnos on liukoinen ilman pinta-aktiivisia aineita, mutta joka säilyttää selektiivisen reaktiivisuuden villityyppistä B. burgdorferi OspAita vastaan kohdistuvien vasta-aineiden kanssa. Ensimmäiset 17 koodia ovat syypäänä vastoinkäymisiin, joita on kohdattu tekniikan tasossa OspA:n liu-15 kenevan yhdistelmä-DNA-teknisen -muodon tuottamisessa, joka on hyvin ilmennettävissä E. colissa.

Tarkemmin sanottuna nukleotidialue (katso SEQ ID NO: 14) esiintyy johtose-kvenssissä (ensimmäiset 17 kodonia villityyppisessä B. burgdorferi OspA-20 geenissä), jonka alueen koodittama signaali laukaisee tuloksena saatujen proteiinien lipidoitumisen ja täten häiritsee sekä liukoisuutta että ilmentymistä yhdistel-mä-DNA-teknisessä isännässä kuten E. colissa tapahtuvan prosessin aikana.

Esillä olevan keksinnön käyttämiseksi on suoritettava useita toimenpiteitä. Muita 25 toimenpiteitä voidaan mainittaessa lisätä, poistaa tai muuntaa, muiden sovellutus-vaihtoehtojen saamiseksi. Kun esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää ku-vataan siinä mielessä, että valmistetaan Borrelia burgdorferi OspA:n yhdistelmä-DNA-tekninen muunnos, menetelmä on yhtä hyvin sovellettavissa muihin Borre-//ö-lipoproteiineihin sillä edellytyksellä, että lipoproteiini sisältää tarpeellisen sig-30 naalisekvenssin signaalipeptidaasia II varten, kuten seuraavassa on kuvattu. Katkaistun nukleotidisekvenssin tuottaminen (katso SEQ ID NO: 3), joka koodittaa 13 105924

OspA:n yhdistelmä-DNA-teknisen muunnoksen edullista suoritusmuotoa (katso SEQ ID NO: 4), tapahtuu yleisesti ottaen kuten seuraavassa on kuvattu.

DNA, joka sisältää täysipituisen villityyppisen B. burgdorferi (B31 -kanta) ospA -5 geenin, eristettiin ja puhdistettiin. Oligonukleotidialukkeiden joukko (katso SEQ ID NO: 11/Fig. 1 ja SEQ ID NO: 12/Fig. 2) syntetisoitiin käytettäväksi polymeraasiketjureaktiossa, jonka avulla voitiin erityisesti monistaa OspA-geenin katkaistu versio, josta puuttuivat ensimmäiset 17 kodonia, kuten myös restriktiokoh-tien saamiseksi ennen monistetun tuotteen koodaussekvenssiä ja sen jälkeen. Toi-10 nen joukko oligonukleotidialukkeita (katso SEQ ID NO: 13/Fig. 3 ja SEQ ID NO: 12/Fig. 2) syntetisoitiin myös käytettäväksi polymeraasiketjureaktiossa luonnollisen kokonaisen OspA-geenin erityiseksi monistamiseksi saamiseksi kontrollimekanismina.

15 Tuloksena saadut nukleotidikappaleet, jotka tuotettiin polymeraasin ketjureaktiolla, puhdistettiin ja valittiin restriktiokohtiin perustuvan analyysin avulla ja sen jälkeen alikloonattiin sopivaan plasmidi-ilmentämisvektoriin, joka oli yhteensopiva restriktiokohtien suhteen. Tuloksena saadut plasmidit siirrettiin sitten ilmentävään isäntäkantaan proteiinin tuottoa varten.

20 ESIMERKKI 1

Esillä olevan keksinnön mukaisen proteiinin tekemiseksi oli välttämätöntä saada aikaan villityyppisen B. burgdorferi DNA:n lähde, joka sisältää nukleotidise-25 kvenssin, joka koodittaa OspA:ta. Tämä DNA toimi mallineena villityyppisen OspA-geenin halutun lohkon monistamiseksi (katso SEQ ID NO: 1) polymeraasin " ketjureaktion aikana. Alalla on hyvin tunnettua, että lähtöaine yhdistelmä-DNA- teknisissä manipuloinneissa voi olla DNA, joka on eristetty mielenkiinnon kohteena olevien villityyppisten organismien viljelmistä tai yhdistelmä-DNA-30 teknisistä kuljettimista, kuten plasmideista, joita on muokattu geneettisesti kohde-DNA:n kloonattujen kopioiden sisällyttämiseksi niihin. Jäljempänä mainittu lä- 14 105924 hestymistapa on edullinen siinä, että se edesauttaa homogeenisuutta ja vähentää mutaatioita mielenkiinnon kohteena olevassa DNA-kappaleessa.

Edullisessa menetelmässä esillä olevan keksinnön mukaisen proteiinin tuottami-5 seksi malline-DNA:n alkuperäinen lähde, joka sisältää täysipituisen villityyppisen ospA-geenin, oli ospA-geenin yhdistelmä-DNA-tekninen klooni, joka oli saatu aikaisemmin käsitellystä plasmidista pTRH44. pTRH44 -plasmidi, jossa on 1,6-kb restriktiokappale, joka sisältää täysipituisen villityyppisen B. burgdorferi ospA-geenin, joka on kloonattu plasmidiin pUC9, on kuvattu aikaisemmin. Katso Ho-10 we, T.R., LaQuier, F.R. ja Barbour, A.G., "Organization of genes encoding two outer membrane proteins of the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi within a single transcriptional unit", Infec. Immun.. 54: 207-212 (1986).

Vaihtoehtoisesti kokonainen Borrelia burgdorferi DNA olisi voitu eristää ja puh-15 distaa fenoliuutolla tai lysotsyymiproteinaasi K-SDS -uutteella soluista, jotka on saatu kiinteistä faasiviljelmistä käytettäväksi DNA-mallineena. Tekniikat malline -DNA:n eristämiseen ja puhdistukseen ovat yleisesti hyvin tunnettuja alalla. Katso esimerkiksi Howe, T.R., Mayer, L.W. & Barbour, A.G. "A single recombinant plasmid expressing two major outer surface proteins of the Lyme disease spi-20 rochete", Science 227: 645-646, (1985). B. burgdorferinn viljelyksen ja eristämisen suhteen katso esimerkiksi Barbour, A.G., "Isolation and cultivation of Lyme disease spriochetes," Yale J. Biol. Med.. 57:521-525(1984).

Oligonukleotidialukkeiden ensimmäinen ja toinen joukko syntetisoitiin Microsyn 25 1450 DNA -syntetisaattorilla (saatavilla yhtiöstä Systec, Minneapolis, Minnesota).

Tuloksena saadut tuotteet puhdistettiin sen jälkeen käyttämällä Poly-Pak®-puhdistuspakkauksia (saatu yhtiöstä Glen Research Corporation, Hemdon, Virginia) valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA-synteesi ja sen jälkeiset puhdistustek-niikat ovat hyvin tunnettuja yhdistelmä-DNA-teknologian alalla. Mitä tahansa 30 sopivaa tekniikkaa näiden vaiheiden suorittamiseksi voitaisiin soveltaa.

15 105924

Ensimmäinen oligonukleotidialukkeiden joukko suunniteltiin sen nukleotidise-kvenssin monistamiseksi, joka koodittaa B. burgdorferi OspA:n yhdistelmä-DNA-teknistä muunnosta, kun taas toinen alukkeiden joukko suunniteltiin villityyppisen B. burgdorferi kokonaisen ospA-geenin monistamiseksi. Jokainen aluke sisälsi 5' 5 -pään ja 3' -pään. Jokaisen alukkeen 3' -pää sisälsi alueen, jossa oli nukleotidise-kvenssi, joka oli komplementti erityiselle nukleotidisekvenssille, joka ilmeni luonnollisen B. burgdorferi ospA -geenin tietyssä segmentissä, joka oli läsnä B. burgdorferi genomissa. Juuri tämä alukkeen alue kiinnittyi B. burgdorferi DNA-mallineeseen polymeroinnin edistämiseksi polymeraasiketjureaktion aikana.

10 Nukleotidisekvenssi villityypin ospA-geenille (katso SEQ ID NO: 1) on määritelty aikaisemmin. Katso Bergström, S., Bundoc, V.G. & Barbour, A.G., "Molecular Analysis of linear plasmid-encoded major surface proteins, OspA and OspB, of the Lyme disease spriochetes Borrelia burgdorferi." Mol. Microbiol.. 3: 479-486 (1989).

15

Jokaisen alukkeen 5' -pää sisälsi nukleotidisekvenssin, joka oli ei-komplementti B. burgdorferi DNA-mallineelle, jolloin restriktiokohtia sisällytettiin kappaleisiin, jotka tuotettiin monistamisen aikana. Näiden restriktiokohtien läsnäolo helpotti tuloksena saatujen kappaleiden kloonausta ilmentämisvektoriin. Restriktiokohtien 20 käyttö kloonauksen helpottamiseksi on hyvin tunnettua yhdistelmä-DNA-teknologiassa.

Oligonukleotidialukkeiden ensimmäiseen joukkoon sisältyi ensimmäinen ja toinen aluke. Ensimmäinen aluke merkittiin alukkeeksi 201 —> 216 ja syntetisoitiin nuk-25 leotidisekvenssin (SEQ ID NO: 11) saamiseksi, joka on esitetty kuviossa 1. Numerot 201 - 216 tarkoittavat niitä erityisiä nukleotidiasemia, jotka ovat täysipitui-sessa villityypin ospA-geenissä, jota aluke täydensi. Viitaten kuvioon 1, alleviivattu alue esittää alukkeen segmenttiä, joka oli komplementti täysipituiselle villi-tyypin ospA-geenille nukleotidiasemissa 201 - 216. Nukleotidit, jotka näkyvät 30 puolilihavalla painatuksella, osoittavat restriktiopaikkaa, joka tunnistetaan rajoi- 16 105924 tusentsyymillä Ndel. Kautta-merkki edustaa paikkaa, jossa Ndel-entsyymi myöhemmin halkaisi juosteen ilmentämisvektoriin kloonauksen helpottamiseksi.

Aluketta 201 ->216 käytettiin suunnittelemaan uudestaan 5' -pääty katkaistulle 5 ospA-geenille (nukleotidisekvenssi, joka koodittaa OspA:n yhdistelmä-DNA-teknistä muunnelmaa) Ndel-restriktiopaikan saamiseksi ja monistamiseksi aluk-keen avulla täysipituisesta villityypin ospA-geenistä aloittamalla polymerointi 18. kodonissa. ospA-geenin villityypin versiossa mahdollinen tunnistuspaikka lipo-proteiinisignaalipeptidaasille Π on 16. ja 17. kodonin välillä.

10 Täysipituisen villityypin OspA:n lipidoinnin tarkka mekanismi Borrelia -spirokeetassa ei ole tunnettu. Yleisesti on kuitenkin hyväksytty alalla, että aminohapposekvenssi Leu-x-y-Cys (jossa x ja y yleisesti ottaen ovat eri aminohappoja, jossa on ei-polaariset sivuketjut), joka ilmenee eräiden bakteereiden lipoproteiini-15 en johtosekvenssissä, koodittaa käsittelysignaalia proteiinin käsittelyn alkamiseksi bakteerientsyymillä signaalipeptidaasi II. Tämä entsyymi on viime kädessä vastuussa kysteiinijäännöksen aminopäädyn pääsekvenssin N-päätteisen osan halkaisemisesta jättäen N-päätteisen kysteiinin kovalenttisesti sidotuksi rasvahappoihin, jotka antavat jäljellä olevalle proteiinille hyvin lipidisen luonteen kiinnityksen 20 yhteydessä. Monet prokaryootiset solut, kuten E. coli, käyttävät hyväksi edellä olevaa käsittelykaaviota niiden omien solulipoproteiinien käsittelemiseen ja siir-tämiseen solun membraaniin. Katso Bergstrom, S., Bundoc, V.G. ja Barbour, A.G., "Molecular Analysis of linear plasmid-encoded major surface proteins, Os-pA and OspB, of the Lyme disease spriochete Borrelia burgdorferi." Mol. Micro-25 biol.. 3: 479-486 (1989). Katso myös Brandt, M.E., Riley, B.S., Radolf, J.D. ja , Norgard, M.V., "Immunogenic integral membrane proteins of Borrelia buredorfe- ' Hare lipoproteins,"Infect. Immun.. 58: 983-991 (1990).

Vaikka B. burgdorferi OspA.n villityypin koko aminohapposekvenssiä ei ole vah-30 vistettu aminohappoanalyysillä ongelmien takia, jotka ovat itse proteiinissa, sekvenssi on aikaisemmin ennustettu perustuen täyspituisen luonnollisen B. burg- 17 105924 dorferi (B31) ospA-geenin tunnettuun nukleotidisekvenssiin. Katso Bergstrom, S., Bundoc, V.G. ja Barbour, A.G., "Molecular Analysis od linear plasmid-encoded major surface proteins, OspA and OspB, of the Lyme disease spriochete Borrelia burgdorferi." Mol. Microbiol.. 3: 479-486 (1989). SEQ ID NO: 2 kuvaa täysipi-5 tuisen luonnollisen B. burgdorferi OspA:n ennalta määritettyä aminohapposekvenssiä kuten aikaisemmin on mainittu.

Viitaten sekvenssiin SEQ ID NO: 2 voidaan nähdä, että ennustetun aminohapposekvenssin pääosa sisältää segmentin, jossa on peräkkäiset aminohappojään-10 nökset Leu-Ile-Ala-Cys (katso SEQ ID NO: 15). Nämä jäännökset vahvistavat käsittelysignaalin muodon signaalipeptidaasia II varten E. colissa, kuten mainittiin edellä. Siten ospA-geenin luonnossa esiintyvässä muodossa mahdollinen tunnis-tuspaikka lipoproteiinisignaalipeptidaasia II:lle on 16 ja 17 kodonin välissä johtuen signaalipeptidaasi II:fi tunnetun signaalisekvenssimuodon ja mahdollisen sig-15 naalisekvenssin välillä vallitsevasta sekvenssihomologiasta, joka viimeksi mainittu ilmenee ennakoidussa täysipituisen villityypin B. burgdorferi OspA:n aminohapposekvenssissä.

Sen todennäköisyyden lisäämiseksi, että tuloksena saatu yhdistelmä-DNA-20 tekninen proteiini ei lipidoituisi hyperilmentämisen aikana, alukkeen 201 —>216 komplementti segmentti suunniteltiin sulkemaan pois kysteiinijäännöksen ja aloittamaan monistuksen luonnollisen ospA-geenin B. burgdorferi -osassa, joka alkaa 18:sta kodonista lipidoinnin mahdollisen tunnistuspaikan eliminoimiseksi kokonaan. Toivottiin, että tämän mahdollisen tunnistuspaikan eliminoiminen li-25 säisi liukoisuutta ja parantaisi tuloksena saadun proteiinin ilmentämistä haittaamatta erityistä reaktiivisuutta luonnollisen B. burgdorferi OspA:n vasta-aineita vastaan.

Ennen tätä keksintöä ei tiedetty, oliko mahdollinen signaalisekvenssi, joka ilme-30 nee villityypin B. burgdorferi OspA:n aminohapposekvenssissä, vastuussa täysin kehittyneen proteiinin lipidoimisesta. Ei myöskään tiedetty, liittyisikö mahdolli- 18 105924 nen signaalisekvenssi villityypin ospA:n yhdistelmä-DNA-teknisen muunnelman samantapaiseen lipidointiin, jota tuotettiin yhdistelmä-DNA-teknisessä isännässä. Lisäksi oli vielä tuntematonta, olisiko villityypin ospA-geenin osan eliminoimisesta, joka sisälsi mahdollisen signaalisekvenssin, tuloksena katkaistu ospA-geeni, 5 joka tehokkaasti voitaisiin ilmentää käyttämällä yhdistelmä-DNA-teknistä menetelmää sellaisen proteiinin saamiseksi, jonka liukoisuus olisi parempi ilman pinta-aktiivisia aineita samalla, kun säilytettäisiin reaktiivisuus proteiinin luonnollisen version vasta-aineita vastaan.

10 Yhdistelmä DNA-tekniikan alalla on hyväksytty, että mitä suurempi on se muutos, joka tehdään luonnossa esiintyvän nukleotidisekvenssiin, joka koodittaa proteiinia, sitä suurempi on riski, että tuloksena saadun yhdistelmä-DNA-teknisen proteiinin reaktiivisuus muuttuu, jos se edes ilmentyy ollenkaan. Tosiasiassa sellainen yhdistelmä-DNA-tekninen siirtymä saattaa osoittautua myrkylliseksi tai 15 kohtalokkaaksi isäntäorganismille ja täten vähentää tai eliminoi halutun tuotteen ilmentämistä.

Viitaten kuvioon 1, alukkeen 201 -» 216 edullinen rakenne edellytti ei-komplementtia segmenttiä (GCT), joka koodittaa aianiinijäännöstä sijoitettavaksi 20 alukkeen komplementti segmentin ja Ndel-restriktiopaikan välillä. Ndel-restriktiopaikkaan, joka sijaitsee alukkeessa 201 -> 216, sisältyi triplikaatti (ATG), joka koodittaa metioniinia, ja on pääteaminohappojäännös, joka toimii aloituspaikkana proteiinin tuottamisen aikana. Triplikaatti, joka koodittaa alanii-nia, lisättiin, koska alaniini on yksi niistä aminohapoista, joka helpottaa metionii-25 nin poistoa lopullisesta proteiinituotteesta. Myös muut aminohapot, jotka ovat sopivia metioniinin poistamisen helpottamiseksi, olisivat hyväksyttäviä. Katso Hirel, P-H., Schmitter, J-M., Dessen, P., Fayat, G. & Blanquet, S., "Extent of N-terminal methionine excision from Escherichia coli proteins is governed by the side chain length of the penultimate amino acid," Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.. 30 86: 8247-8251 (1989). On yleisesti tunnettua, että metioniini, joka ilmenee ami- 19 105924 nohapposekvenssin loppupäässä luennan aloittamiseksi, ei ole tärkeä tuloksena saadun proteiinin ominaisuuksille ja se poistetaan tavallisesti aminohappo-sekvenssistä.

5 Esillä olevan keksinnön edullisessa muodossa, aminohapposekvenssillä, joka on tuloksena katkaistusta ospA-geenistä, oli ylimääräinen alaniinij äännös aminopää-dyssä. Koska ensimmäiset 17 kodonia eliminoitiin ospA-geenin katkaistusta versiosta, nukleotiditriplikaatti, joka koodittaa alaniinijäännöstä, sijoitettiin edeltämään nukleotiditriplikaattia, joka koodittaa lysiinijäännöstä siinä, jossa olisi 18.

10 kodoni villityypin ospA-geenissä. Metioniini poistettiin ilmennetyn proteiinin täysin kehittyneestä muodosta. Tuloksena saatu aminohapposekvenssi, josta metioniini on poistettu, on kuvattu sekvenssissä SEQ ID NO: 6. Vastaava nukleoti-disekvenssi on esitetty sekvenssissä SEQ ID NO: 5.

15 Vaihtoehtoisesti ylimääräinen alaniinijäännös olisi voitu jättää pois. Tuloksena saatu aminohapposekvenssi, johon sisältyy aloittava metioniini, on kuvattu sekvenssissä SEQ ID NO: 8. Vastaava nukleotidisekvenssi on esitetty sekvenssissä SEQ ID NO: 7. Metioniinin poiston tuloksena on aminohapposekvenssi SEQ ID NO: 10. Vastaava nukleotidisekvenssi on SEQ ID NO: 9.

20

Toista aluketta kutsuttiin alukkeeksi 958 <- 972 ja syntetisoitiin sekvenssin saamiseksi (katso SEQ ID NO: 12), joka on esitetty kuviossa 2. Viitaten kuvioon 2, alukkeen alleviivattu alue esittää segmenttiä, joka oli komplementti villityypin ospA-geenille asemissa 958 - 972, kun taas nukleotidit, jotka esitetään puoliliha- 25 valla tekstillä, esittää restriktiopaikkaa, joka tunnetaan restriktioentsyymillä Bglll. Kautta-merkki edustaa paikkaa, jossa Bglll-entsyymi myöhemmin pilkkoi tuote- « juosteen kloonauksen helpottamiseksi ilmentämisvektoriksi. Viitaten sekvenssiin SEQ ID NO: 12, voidaan nähdä, että koko sekvenssi on esitetty ei-koodittavassa muodossa vastakohtana muodolle, joka on esitetty sekvensseissä SEQ ID NOT: 30 11 ja 13, joka vastaa aluketta 201 —» 216 ja aluketta 151 —> 171. Ei-koodittavaa muotoa käytettiin, koska alukkeen 958 <- 972 sekvenssi itseasiassa on suunniteltu 20 105924 merkityksettömän ospA-geenijuosteen monistamiseksi alukkeen avulla pikemminkin kuin merkityksellisen juosteen monistamiseksi.

Aluke 958 <- 972 oli yhteinen oligonukleotidialukkeiden molemmille joukoille. 5 Niin kauan kuin alukkeiden ensimmäinen erä on kyseessä, käytettiin aluketta 958 <- 972 suunnittelemaan uudelleen 3' -pääty katkaistulle OspA-geenille, joka tarjosi Bglll-restriktiopaikan ja toteuttamaan monistamisen suunnassa, joka oli vastakkainen monistuksen suunnalle, jonka aluke 201 ->216 ohjasi.

10 Viitaten kuvioon 4, villityypin ospA-geeni esitetään kaaviomaisesti. Nukleotidien kaksi alleviivattua aluetta korostavat paikkoja, jossa aluke 201 —> 216 ja aluke 958 <- 972 on kytketty malline-DNAihan monistamisen edistämiseksi. Nuolen päät kuvaavat polymeroinnin suuntaa, jonka aluke aloitti ja kiinnittyi merkittyyn asemaan.

15

Oligonukleotidialukkeiden toinen joukko, joka on suunniteltu koko villityypin B. burgdorferi ospA-geenin monistamiseksi vertailuna, sisälsi myös ensimmäisen ja toisen alukkeen. Ensimmäinen aluke merkittiin alukkeeksi 151 -> 171 ja syntetisoitiin nukleotidisekvenssin saamiseksi (katso SEQ ID NO: 13), joka on esitetty 20 kuviossa 3. Viitaten kuvioon 3, alleviivattu alue kuvaa sen alukkeen segmenttiä, • joka oli komplementti villityypin ospA-geenille nukleotidiasemissa 151 —> 171.

Nukleotidit, jotka esitetään puolilihavalla, kuvaavat restriktiopaikkaa, jonka re-striktioentsyymi Ndel tunnisti. Kautta-merkki kuvaa paikkaa, jossa Ndel-entsyymi myöhemmin pilkkoi tuotteen juosteen kloonauksen helpottamiseksi il-25 mentämis-vektoriksi.

Toinen aluke, aluke 958 <— 972, oli yhteinen molemmille oligonukleotidijoukolle, kuten aikaisemmin mainittiin. Mitä toiseen alukkeiden joukkoon tulee, aluke 958 <- 972 sai aikaan Bglll-restriktiopaikan ja toteutti villityypin ospA-geenin mo- 21 105924 nistamisen alukkeen avulla päinvastaiseen suuntaan kuin alukkeiden 151 -» 171 määräämä monistus.

Viitaten kuvioon 5, villityypin ospA-geeni esitetään kaavionomaisesti. Nukleoti-5 dien kaksi alleviivattua aluetta korostavat asemia, joihin aluke 151 —> 171 ja aluke 958 ·<- 972 kiinnittyivät monistuksen edistämiseksi. Nuolenpäät merkitsevät alukkeen käynnistämän polymoinnin suuntaa, joka aluke oli kiinnittynyt merkittyyn asemaan.

10 Kuvio 6 on sen tuotteen kaaviomainen kuvaus, joka on tuloksena ospA-geenin katkaistun muunnelman monistamisesta villityypin ospA-geenistä alukkeen 201 —> 216 ja alukkeen 958 <- 972 avulla. Puolilihava painatus merkitsee restrik-tiopaikkoja, jotka alukkeet saavat aikaan, kun taas alleviivatut alueet merkitsevät niitä alukkeen alueita, jotka kytkeytyivät villityypin ospA-geeniin ennen monis-15 tusta.

Perusmenetelmät halutun kohdenukleiinihapposekvenssin monistamiseksi käyttämällä oligonukleotidialukkeita ovat yleisesti tunnettuja alalla ja niitä on kuvattu Mullis:in US-patentissa n:o 4 683 202 ja Mullis et al:n US-patentissa n:o 4 800 20 159, jotka molemmat sisällytetään tähän viittauksen omaisesti. Haluttaessa lisä- . , tietoja kloonaustekniikoista pyydetään tutustumaan seuraaviin: Maniatis, T.,

Fritsch, E.F. & Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982). Katso myös Ausu-bel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & 25 Struhl, K., Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1989).

Käyttämällä alukkeita 151 —» 171, 201 -> 216 ja 958 <— 972 polymeraasi reak-tiomonistukset suoritettiin 50 μ1:η reaktion tilavuuksissa, jotka sisälsivät yhden 30 yksikön AmpliTaq DNA-polymeraasia (saatu yhtiöstä Perkin-Elmer Cetus, Nor- 22 105924 walk, CT) jokaista aluketta konsentraatiossa 1 μΜ an ~ 0,1 μg malline DNA:ta. Reaktioseos sisälsi myös 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM KCI, 1,5 mM MgCL, 0,05 % Tween 20, 0,05 % Nonedet P-40, 0,26 mM dATP, 0,26 mM dTTP, 0,14 mM dCTP ja 0,14 mM dGTP.

5

Edullisessa monistusmenetelmässä käytetty dNTP-konsentraatio heijasti tunnettua DNA-emässisältöä 29 % G + C B. burgdorferin tapauksessa, ei-haluttujen mutaatioiden mahdollisuuden eliminoimiseksi. Katso Schmid, G.P., Steigenvalt, A.G., Johnson, S., Barbourg, A.G., Steere, A.C., Robinson, I.M. ja Brenner, D.J.

10 "DNA characterization of Lyme disease spirochetes," Yale J. Biol. Med.. 57: 539 -542(1984).

Ennen monistusta reaktio peitettiin mineraaliöljyllä ja monistus suoritettiin 25 syklin verran laitteessa DNA Thermal Cycler (saatu yhtiöstä Perkin-Elmer Cetus, 15 Minneapolis, MN.) jokaisen syklin kestäessä 1 min lämpötilassa 94 °C, 1 min lämpö-tilassa 47 °C ja 3 min lämpötilassa 72 °C. Monistus päätettiin inkuboimalla lopuksi lämpötilassa 72 °C 10 minuuttia. Monistustuotteet uutettiin fenolilla, sa-ostettiin etanolilla, pilkottiin sopivilla restriktioentsyymeillä ja puhdistettiin sitten elektroforeesilla 1 %:lla matalan sulamispisteen omaavilla agaroosigeeleillä (saatu 20 yhtiöstä Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD). Muita alalla tun-. , nettuja tekniikoita monistettujen DNA-tuotteiden puhdistamiseksi, kuten elektro foreesi akryyliamidigeeleillä, olisivat hyväksyttäviä. Alalla on hyvin tunnettua, että monistetut tuotteet on puhdistettava ja käsiteltävä sopivilla restriktioentsyymeillä (Ndel ja Bglll tässä olevassa esimerkissä) ennen kuin ilmentäminen voi-25 daan aloittaa.

• ·

Monistustuotteet ajettiin 1 %:lla agaroosigeelillä, värjättiin etidiumbromidilla ja valokuvattiin valaisemalla UV-valolIa. Viitaten kuvioon 7 kaistat 1, 6 ja 11 sisältävät Haell pilkottua T7 DNA:ta molekyylipituuden merkkeinä. Koot ovat ki-30 loemäspareina (kB). Kaistat 2,4, 7 ja 9 sisältää 1/5 (til) reaktioiden tuotteista kokonaisella B. burgdorferin DNA:lla, kun taas kaistat 3, 5, 8 ja 10 sisältävät 1/50 23 105924 (Kl) reaktioseoksesta, joka on tuloksena monistamisesta, jossa käytettiin plasmi-dia pTRH44 mallineena. Käytetyt näytteet tuotettiin käyttämällä alukkeita, jotka monistavat koko OspA:ta koodittavan sekvenssin (kaistat 2,3,7 ja 8) tai alueen, joka alkaa kohdasta Lys18 (kaistat 4,5,9 ja 10). Kuten on esitetty (kaistat 7-10), 5 monistettu DNA voidaan katkaista EcoRT.lla tuotteiden saamiseksi, joiden liikkuvuudet ovat odotettavissa yhden ainoan EcoRI-paikan katkaisemisesta ospA.ssa (662 + 182 ja 623 + 182 bp vastaavasti).

ESIMERKKI 2 10

Katkaistun ospA-geenin monistetun version, kuten myös täysipituisen villityypin ospA-geenin monistetun version ilmentämiseksi, DNA-fragmentit, jotka ovat tuloksena polymeraasiketjureaktion monistamisesta, kloonattiin lopuksi plasmidi-vektoriksi proteiinin tuotantoa varten. Edullinen plasmidivektori proteiinin tuot-15 tamista varten esillä olevassa keksinnössä oli pET9, jossa ospA-geeni sijoitetaan T7 -promoottorin ja bakteriofagista T7 tuleviin tehokkaiden luennanaloitus-signaalien kontrolliin. pET9 ja pLysS-ilmentämisvektorit, bakteeri-isännät kloonausta varten, kasvun väliaineet ja menetelmät, joita käytettiin kloonattujen geenien suoraa ilmentämistä varten T7 RNA -polymeraasilla, on kuvattu aikaisem-20 min. Katso Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J. & Dubendorf, J.W.. Meth. Enzvmol.· "Use ofT7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes," 185: 60-89 (1990). Geenin kloonaus ja ilmentäminen bakteriofagi T7 RNA-polymeraasia varten on myös esitetty Studier et al.:n US-patentissa n:o 4 952 496, joka sisällytetään tähän viittauksena. Vaikka T7 -promoottorisysteemi on edulli-25 nen ilmentämissysteemi esillä olevassa keksinnössä, katkaistun OspA-geenin il- , mentämistä ei pidä rajoittaa ilmentämismuodon suhteen, sillä edellytyksellä että « valittu ilmentämisjäijestelmä sopii yhteen isäntäorganismin kanssa.

Tuloksena saadut plasmidit merkittiin pET9-preOspA, jotka merkitsevät plasmi-30 deja, jotka vastaanottivat monistetun DNA-fragmentin, joka koodasi täysipituista villityypin OspA:ta, jota käytettiin kontrollina ja pET9-OspA, joka merkitsi plas- 24 105924 mideja, jotka vastaanottivat monistetun DNA-tuotteen, joka koodasi OspA:n yh-distelmä-DNA-teknistä muunnelmaa.

Esillä olevan keksinnön edullisessa muodossa käytettiin pET9-vektoria, koska 5 sillä on kan-geeni selektiivisenä merkitsijänä bla-geenin sijasta. Siksi ampisilliiniä ei käytetä solukasvun aikana ja siksi ei ole mahdollisuutta siihen, että voi muodostua immunogeeninen ampisilloyyli/OspA -kohdeproteiinikonjugaatti. Tämän tyyppisten konjugaattien uskotaan muodostavan pääosan määräävistä vasta-aineiden muodostumiseen vaikuttavista tekijöistä penisilliiniallergiassa ja niiden 10 läsnäolo tekisi suunnitellut immunologiset tutkimukset monimutkaisiksi. Katso Yvon, M., Anglade, P. & Wal, J-M., "Identification of the binding sites of benzyl penicilloyl, the allergenic metabolite of penicillin, on the serum albumin molecule," FEBS. 263: 237-240 (1990). pET9- ja pET9-OspA -plasmidien kaaviollinen esitys on esitetty kuvioissa 8 ja 9.

15

Plasmidit pET9-preOspA ja pET9-OspA kloonattiin alunperin HD5a:ksi, joka on isäntä, josta puuttuu T7 RNA -polymeraasi. Taustailmentäminen on minimaalista tässä isännässä, koska bakteeri RNA-polymeraasi ei käynnisty T7 -promoottorista. Periaatteessa stabiileja yhdistelmä-DNA-teknisiä plasmideja voidaan saada aikaan 20 tässä isännässä, vaikka kohdegeenituote on myrkyllinen E. coliYit. Vahvistettiin, että tuloksena saadut plasmidit olivat oikeat laajamittaisella restriktiopaikka- I « « r analyysillä ja koko ospA:ta koodittavien sekvenssien standardi-dideoksisekvensoimalla.

25 Vaikkakin käytettyjä alukkeita erityisesti suunniteltiin monistamaan villityypin ospA-sekvenssin erityisiä segmenttejä koko B. burgdorferi DNA:sta, käytännölli- • » . sistä syistä ja koska mutaation mahdollisuus suurenee monistussyklien lukumää rän kasvaessa, esillä olevassa keksinnössä käytetyt plasmidit rakennettiin käyttämällä Ndel/Bglll-kappaleita, jotka saatiin reaktioista, jotka sisälsivät OspA-30 plasmidin, joka on pTRH44, DNA-mallineena. Sen jälkeen tuloksena saadut 824 ja 779 bp Ndel/Bglll-kappaleet jokaisesta reaktiosta alikloonattiin erikseen T7:n 25 105924 ilmentämisvektoriksi pET9, joka oli pilkottu Ndel:llä ja BamHLllä, jotka defosfo-ryloitiin ja puhdistettiin elektroforeesilla 1 %:lla, alhaisen sulamispisteen omaavilla geeleillä. Plasmidi pTRH44, jossa on 1,6-kb restriktiokappale, sisälsi täysi-pituisen villityypin ospA-geenin, joka kloonattiin pUC9:ksi, on kuvattu aikai-5 semmin. Katso Hows, T.R., LaQuier, F.R. & Barbour, A.G., "Organization of genes encoding two outer membrane proteins of the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi within a single trans cirptional unit," In fee. Immun.. 54: 207-212 (1986).

10 Viitaten kuvioihin 8 ja 9, monistettujen DNA-molekyylien pilkkominen

NdeI/BglII:lla ja sen jälkeinen ligatointi Ndel/BamHI- pilkottuun pET9:een tuotti pET9-preOspA:a ja pET9-OspA:a, jotka ovat 5127 ja 5082 bps. ΘΙΟ-SIO edustaa ΘΙΟ-promoottoria bakteriofagi T7 RNA-polymeraasille ja ribosomin sitoutumisen ja luennan käynnistyspaikkaa T7 geenille 10. ΤΘ on T7 RNA-polymeraasin tran-15 skriptiopäätesignaali.

ESIMERKKI 3

Proteiinin tuotantoa varten plasmidit siirrettiin ilmentämiskantaan 20 BL21(DE3)/pLysS, joka on isäntäkanta, joka sisälsi T7 RNA -polymeraasin gee- , nin kromosomaalisen kopion indusoitavan IacUV5-promoottorin ja pA- * CYC1184:ään perustuvan plasmidin, pLysS kontrolloimana, joka plasmidi määrittää T7 -lysotsyymin T7 RNA -polymeraasin luonnollisen inhibiittorin alhaisia arvoja. Lisätietoja varten katso Moffatt, B.A. & Studier, F.W., "77 Lysozome in-25 hibits transcription by T7 RNA polymerase," cell, 49: 221-227 (1987). Indusoi- , mattomissa soluissa lysotyymi vähentää T7 RNA -polymeraasin perusaktiivi- •« suutta ja lisää sellaisten kohdegeenien määrä, joita voidaan stabiilisesti ylläpitää i lmentäm i sisännässä.

30 BL21 (DE3)/pLysS -viljelmiä, joissa on erilaisia plasmideja, kasvatettiin mid-log 26 105924 -faasiin ja osa kustakin indusoitiin IPTG:llä. Induktion aikana plasmidin pET9-preOspA havaittiin tuottavan suhteellisen pieniä indusoitavan proteiinin määriä, jotka CDS-polyakryyliamidigeelien analyysin mukaan olivat hyvin samantapaisia liikkuvuuden suhteen kuin villityypin OspA-proteiini, joka on läsnä B. burgdorfe-5 rin kokonaisuutteissa. Viitaten kuvioon 10, näytteet (1,5-μ1) poistettiin analyysiä varten SDS-12,5 % PAGE:lla, ajankohtina, jotka on merkitty seuraavassa. Proteiinit tehtiin näkyviksi värjäämällä ne Coomassie sinisellä. Kaistat 1, 5 ja 9 vastaavat kokonaisia B. burgdorferi -soluja (5 x 107 solua), kun taas kaistat 2, 3 ja 4 vastaavat pET9-preOspA:ta, jota oli indusoitu 1, 3 tai 18 tuntia. Kaistat 6, 7 ja 8 10 vastaavat pET9-OspA:ta, jota oli indusoitu 1, 3 tai 18 tuntia. Molekyylipainon merkkien asema (94, 67, 43, 30 ja 20) on esitetty. Proteiinien molekyylimassat ovat yksikössä kilodalton.

Pulsechase kokeita suoritettiin sen osoittamiseksi, että synteesi tai preOspA-15 proteiini sai aikaan 1-2 tuntia induktion jälkeen tuloksen, joka merkitsee sitä, että proteiini oli myrkyllinen E. colille. Sitä vastoin havaittiin paljon korkeampi ja ylläpidetty ilmentämisnopeus, kun indusoitiin pET9-OspA:ta.

Kuvio 11 esittää OspA-yhdistelmä-DNA-teknisen muunnelman induktiota, jota 20 seurasi SDS-PAGE. Kaista 1 kuormitettiin ei-indusoitujen BL21(DE3)/pLysS pET9-OspA kokosoluilla. Kaistat 2-7 kuormitettiin kokosoluilla, joista oli otettu näyte yhden tunnin väliajoin induktion jälkeen. Kaista 8 sisälsi molekyylipaino-merkkejä. Kuvio 12 esittää OspArn yhdistelmä-DNA-teknisen version SDS-PAGE:n puhdistuksen eri vaiheissa seuraavasti: Kaista 1, molekyylipainomerkit; 25 kaista 2, raakauute ennen sentrifugointia; kaista 3, raakauute sentrifugoinnin jälkeen; kaista 4, Q-sefaroosiläpivirtaus; kaista 5, S-sefaroosin gradienttifraktio; ja kaista 6, hydrok-syyliapatiittifraktio. Kaistat 2-6 sisältävät kukin 0,01 % kaikesta proteiinista, joka oli läsnä jokaisessa fraktiossa. Proteiinit analysoitiin 10-20 %:lla akryyliamidigradienttigeelillä. Western blot -analyysi kahdella monoklo-30 naalisella vasta-aineella, H5332 ja H3TS, joiden tiedetään tunnistavan eri epi-tooppeja luonnollisessa OspAissa suoritettiin myös sen osoittamiseksi, että nämä 27 105924 alueet sisälsivät autenttisia OspA-sekvenssejä. Katso Brandt, M.E., Riley, B.S., Radolf, J.D. ja Norgard, M.V., "Immunogenic integral membrane proteins of Bor-relia burgdorferi are lipoproteinsInfect. Immun.. 58: 983-991 (1990). Katso myös Howe, T.R., Mayer, L.W. ja Barbour, A.G., "A single recombinant plasmid 5 expressing two major outer surface proteins of the Lyme disease spirochetes," Science 227: 645-646 (1985).

Viitaten taas kuvioon 10, proteiini, joka kohdistettiin pET9-OspA:han, oli huomattavasti pienempi kuin se, jonka pET9-preOspA tuotti, vaikkakin molempien 10 proteiinien odotettiin sisältävän suunnilleen sama lukumäärä aminohappo-jäännöksiä käsittelyn jälkeen, joko 17 jäännöksen pituisen sekvenssin poistamiseksi luonnollisessa OspA:n tapauksessa tai vain aloittavan metioniinin OspA:n poistamiseksi yhdistelmä-DNA-teknisestä muunnelmasta. Todennäköisin selitys erolle oli se, että kovalenttisesti liittyneen N-päätelipidin läsnäolo vähensi käsi-15 tellyn pET9-preOspA -tuotteen liikkuvuutta. Joillakin geeleillä (katso kuvio 13 esimerkiksi) preOspA-tuote liikkui kahden pienen välimatkan päässä toisistaan olevien vyöhykkeiden tavoin, jotka saattoivat olla käsiteltyjä välituotteita. Tämä tulos antoi ymmärtää, että tämän proteiinin käsitellyillä muodoilla ja esimuodoilla on samat liikkuvuudet yhden ulottuvuuden SDS-PAGElla.

20 ESIMERKKI 4 «

Solunsisäisen sijainnin määrittämiseksi BL21(DE3)/pLysS, pET9-preOspA 20 mL:n viljelmää otettiin talteen 3,5 tuntia IPTG-induktion jälkeen sentrifugoimalla 25 nopeudella 8000 rpm. Pelletti suspensoitiin 10 mL:n seokseen, joka sisälsi 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM NaCl ja 2 mM EDTA. Sen jälkeen solut rikottiin jää-V dyttämällä ja sulattamalla. Lysaatti käsiteltiin DNase:lla ja Mg++ -ioneilla, sitten sedimentoitiin 90 minuuttia nopeudella 33000 rpm. Pellettifraktio suspensoitiin jälleen 5 mL:n seokseen, joka sisälsi 0,25 M sakkaroosia, 3,3 mM Tris-HCl (pH 30 8,0), ImM DTT ja 1 mM EDTA. Uudestaan saatu suspensio pelletoitiin uudestaan sentrifugoimalla 1 turmin ajan nopeudella 50000 rpm. Pelletti suspensoitiin jälleen 28 105924 1 mL:aan 25 %:sta (p/p) sakkaroosia, 5 mM EDTA:ta ja 1 mM DTT:ta ja sen jälkeen kerrostettiin epäjatkuvalle sakkaroosigradientille. Sentrifugointi suoritettiin nopeudella 30000 rpm 16 tuntia lämpötilassa 4 °C. Sentrifugoinnin jälkeen 0,5 mL fraktiot kerättiin ja 20 mL:n näytteet analysoitiin SDS-PAGE-ja Western blot 5 -menetelmillä. Gradientin ulompi membraanialue määritettiin sen vasta-ainereaktiivisuuden avulla OmpA:ta vastaan, joka on hyvin karakterisoitu E. colin ulompi membraanikomponentti. Katso Zimmerman, R. ja Wickner, W., "Energetics and intermediates of the assembly of protein OmpA into the outer membrane of Escherichia coli. " J. Biol. Chem.. 258: 3920-3925 (1983).

10

Melkein kaikki täysipituisesta villityypin OspA:sta, joka oli tuloksena pET9-preOspA.sta, saatiin talteen jäädytys-sulatussolulysaatin alhaisen nopeuden pelletti fraktiosta. Pelletti fraktioitiin sisempiin ja ulompiin membraaneihin sentrifu-goimalla epäjatkuvien sakkaroosigradienttien läpi. Suurin osa proteiinista löydet-15 tiin fraktioista, joka oli rikastunut sisempiin membraanikomponentteihin.

Lisätutkimukset osoittivat, että tämä yhdistelmä-DNA-teknisesti johdettu, OspA:n villityypin versio voitiin ainoastaan uuttaa olosuhteissa, jotka ovat alalla tunnetut E. coli -bakteerien sisemmän membraanin selektiivisesti liuottamiseksi. Tällaiset 20 olosuhteet vaativat proteiinifraktion käsittelyn pinta-aktiivisella aineella, kuten Triton X-100 tai natrium-N-lauryylisarkosinaatti. Katso esimerkiksi Forst, S., *

Delgado, J., Ramakrisghnan, G. & Inouye, M., "Regulation of ompC and ompF expression in Escherichia coli in the absence of env2," J. Bacteriol.. 170: 5080-5085 (1988). Toisaalta pET9-OspA:n on kuitenkin liukoinen ilman minkäänlaista 25 pinta-aktiivista ainetta (> 50 mg/mL) ja merkittäviä määriä tätä OspA:n yhdistel-. mä-DNA-teknistä muunnelmaa (> 50 % koko soluproteiinista) voidaan tuottaa tästä plasmidista useita tunteja IPTG:n induktion jälkeen (katso kuvio 11). Kun pET9-OspA:n induktiota jatkettiin pidempään kuin 6 tuntia, solut alkoivat hajota ja lopulta kaikki tuote oli löydettävissä viljelmän supematantista..

30 29 105924 ESIMERKKI 5

OspA:n yhdistelmä-DNA-teknisen muunnelman puhdistamiseksi käytettiin kolmen vaiheen menetelmää. E. colin BL21(DE3)/pLysS 500 mL:n viljelmä, joka 5 sisälsi pET9-OspA:ta, kasvatettiin ravistamalla 2 l:n pulloissa lämpötilassa 37 °C tryptoniliemessä, jota oli täydennetty M9-suoloilla, 0,4 %:lla glukoosia, 26 pg/ml:lla kloramfenikolia ja 25 pg/mL:lla kanamysiinisulfaattia, kunnes OD 600 saavutti 0,6, jona ajankohtana IPTG lisättiin niin, että lopullinen konsentraatio oli 0,5 mM. Vielä 100 pg/mL kanamysiiniä lisättiin IPTG:n mukana viljelmän sel-10 laisten solujen liikakasvamisen ehkäisemiseksi, joista olisi voinut kadota kohde-plasmidi. 6 tuntia myöhemmin solut kerättiin sentrifugoimalla ja suspensoitiin jälleen 25 - 30 mL:aan 20 mM natriumfosfaattipuskuria (pH 7,7) ja varastoitiin lämpötilassa -20 °C. Raakauute valmistettiin sulattamalla jälleen suspensoidut solut lämpötilassa 4 °C, joka sallii sen, että lysotsyymi, jota koodittaa pLysS, te-15 hokkaasti liuottaa solut. Tämän jälkeen seurasi MgC^m ja DNase:n lisäys (lopul liset konsentraatiot 2,5 mM ja vast. 5 pg/mL). 30 minuutin jälkeen lämpötilassa 4 °C, solujäte poistettiin sentrifugoimalla (15 min, 15000 g). Tuloksena saatu pelletti uutettiin 10 mL:lla 10 mM natriumfosfaattipuskuria (pH 7,7), joka sisälsi 10 mM NaCl (puskuri A). Jälleensentrifugoinnin jälkeen supematantit yhdistettiin, 20 jolloin saatiin 40 mL raakauutetta.

Raakauute lisättiin huoneen lämmössä esipakattuun Q Sefaroosin nopean virran 25 mL pedille, joka oli tasapainoitettu puskurilla A. Kolonnia eluoitiin 50 mL:lla puskuria A. Olennaisesti kaikki kohdeproteiini otettiin talteen virtaan puskurin 25 läpi.

Fraktiot, jotka sisälsivät kohdeproteiinia, dialysoitiin yön yli lämpötilassa 4 °C 2x2 litraan muutoksia (pH 6,0) 10 mM:n natriumfosfaattipuskuria vastaan, joka sisälsi 5 mM NaCl (puskuri B), selkeytettiin sentrifugoinnin avulla nopeudella 30 10000 g, ja sitten laitettiin huoneen lämmössä S Sefaroosin nopean virran 20 x 1,5 30 105924 cm:n kolonniin, joka oli tasapainoitettu puskurilla B. Sen jälkeen kun kolonni oli pesty 100 mL:lla puskuria B, sitoutumattomien proteiinien ja kontaminanttien poistamiseksi, jotka absorboivat vahvasti aallonpituudessa 260 nm, sidottu kohde-proteiini eluoitiin 0-100 mM:n NaCl 300 mL puskurissa B lineaarisella gradien-5 tiliä, kohdeproteiinin eluointi tapahtui kohdassa noin 35 mM NaCl. Q Serafoosi nopea virtaus ja S Sefaroosi nopea virtaus saatiin Pharmaciarsta, Piscataway, NJ.

Kohdeproteiinin yhdistetyt fraktiot, jotka olivat tuloksena S Sefaroosi-vaiheesta, lisättiin Bio-Gel HTP hydroksyyliapatatiitti 20 mL pedille, joka aikaisemmin oli 10 tasapainoitettu puskurilla B. Kolonnia ajettiin huoneen lämmössä ja pestiin 50 mL.llä puskuria B. Proteiini eluoitiin 100 - 400 mM natriumfosfaatin 300 mL lineaarisella gradientilla (pH 6,0). Fraktiot, jotka sisälsivät kohdeproteiinin, joka eluoituu leveänä piikkinä välillä 150 - 300 mM natriumfosfaattia, yhdistettiin ja väkevöitiin ultrasuodatussolussa lopulliseksi 5 mL tilavuudeksi. Väkevä prote-15 iiniliuos dialysoitiin 10 mM natriumfosfaattia (pH 6,0), 50 mM NaCl (puskuri D) vastaan ja varastoitiin 4 °C lämpötilassa. Bio-Gel HTP -hydroksiapatiittia saatiin yhtiöstä Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA.

Edellä oleva menetelmä yhdistelmä-DNA-teknisen proteiinituotteen puhdistami-20 seksi kuvaa vain sopivaa lähestymistapaa esillä olevan keksinnön mukaisen proteiinin puhdistamiseksi. Muita sopivia tekniikoita, joita alalla tunnetaan, voitaisiin vaihtoehtoisesti käyttää puhdistamiseen. Esimerkiksi S Sefaroosi fraktio voidaan väkevöidä ja asettaa Sephacryl S-200 -kolonniin (saatu yhtiöstä Pharmacia, Piscataway, NJ) tai muihin sopiviin geelisuodatusmatriiseihin.

25

Tuloksena oleva saanto oli 60 - 70 mg OspA:n yhdistelmä-DNA-teknistä muun-’· nelmaa, jota oli tuotettu 500 mL:sta Iähtöviljelmää. Viitaten kuvioon 11 tämä ko konaissaanto on noin 50 % arvioituna SDS-PAGE:stä yksittäisistä fraktioista, joka oli merkkinä ospA-geenin katkaistun muunnelman hyvästä hyperilmentämisestä 30 E. colissa.

31 105924 ESIMERKKI 6

OspA:n yhdistelmä-DNA-tenisen muunnelman proteiininäytteitä analysoitiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla denaturoivissa olosuhteissa. Tekniikan 5 osalta katso Studier, F.W., "Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels," J. Mol. Biol.. 79: 237 - 248 (1973). Geelit kiinnitettiin ja värjättiin Coomassie sinisellä tai erotetut proteiinit siirrettiin elektroforeesin avulla nitroselluloosamembraaneihin ja tutkittiin [l25I] -merkityllä proteiinilla A sidotun immunoglobuliinin suhteen. Katso Barbour, A.G., "Biology of the Borrelia spe-10 cies" Yale J. Biol. Med.. 57: 581 - 586 (1984). [125I] -merkityt proteiinit A (5 x 105 cpm/mL) saatiin yhtiöstä DuPont-New England Nuclear.

Joissakin tapauksissa nitroselluloosamembraanit käsiteltiin 3 %:lla gelatiinilla 20 mM:ssa Tris-HCl (pH 7,5), 500 mM:ssa NaCl (TBS) ainakin tunnin ajan ja pestiin 15 sitten TBS:llä, joka sisälsi 0,05 % Tween 20 (TTBS), ennen reaktiota vasta-aineen kanssa. Sitoutumattoman vasta-aineen poistamisen jälkeen useiden pesujen avulla TTBSdlä, reaktiiviset proteiinit tunnistettiin käyttämällä affiniteetin osalta puhdistettua alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vuohen hiirenvastaista vasta-ainetta ja aikalisiä fosfataasin värikehitysreagenssejä.

20

OspA:n natiivi molekyylipaino määritettiin kromatografialla tai puhdistettu prote-iini puskurissa A, joka sisälsi 200 mM NaCl virtausnopeudella 1,5 mL/min kalibroidulla 2,5 x 120 cm Sephacryl S-200 -kolonnilla lämpötilassa 4 °C. Kaksikymmentä aminohappojäännöstä, jotka vastasivat N-päätteistä nukleotidisekvenssiä, 25 määritettiin käyttämällä Edman-hajotusmenetelmää Applied Biosystem 470A . Mikrosequencer-laitteella. OspA:n yhdistelmä-DNA-teknisen muodon ensim mäisten 20 jäännösten aminoterminaalinen sekvensointi antoi sekvenssin, joka oli sama kuin se, joka ennakoitiin DNA -sekvenssistä käsittelyn jälkeen ensimmäisen metioniinijäännöksen poistamiseksi. Proteiinin molaarinen ekstinktiokerroin las-30 kettiin, kun tiedettiin sen aminohappokoostumus yhtälöstä EM>nat = (Absnat) (EM.GdtrHc/Abs^dn.HcO· Katso Gill, S.C. & von Hippel, P.H., "Calculation of pro- 32 105924 tein extinction coefficients from amino acid sequence data," Anal. Biochem.. 182: 319 - 326 (1989). Tuloksena saatu molaarinen ekstinktiokerroin (E2bo) oli 10,59 x 103 M'1. Tämän arvon havaittiin vastaavan erinomaisesti (±5 %) sitä, joka saatiin happohydrolysaattien, jotka oli johdettu OspA:n yhdistelmä-DNA-teknisestä 5 muodosta aminohappokoostumuksen analyysistä ja se oli myös yhtäpitävä kuvioiden kanssa, jotka koskivat tuloksena saatua proteiinisaantia.

ESIMERKKI 7 10 OspA:n yhdistelmä-DNA-teknisen muodon reaktiivisuus testattiin ihmisen vasta-aineita vastaan luonnolliseen OspA:han nähden. Seerumi potilaista, joilla on Ly-men sairaus, sisältävät vasta-aineita useita B. burgdorferin ulomman membraanin proteiineja vastaan, jotka sisältävät OspA:ta. Reaktiivista nivelvoidenestettä potilaista, joilla oli krooninen Lymen sairauteen liittyvä niveltulehdus ja OspA-15 spesifinen vasta-aine H3TS, on aikaisemmin kuvattu. Katso Barbour, A.G., Burg-dorfer, W., Grunwaldt, E. ja Steere, A.C., "Antibodies of patients with Lyme disease to components of the Ixodes dammini spriochete," J. Clin. Invest.. 72: 504-515 (1983). Katso myös Barbour, A.G., Heiland, R.A. & Howe, T.R., "Heterogeneity of major proteins in Lyme disease Borrelia: a molecular analysis of North 20 American and European isolates," J. Infect. Pis.. 152: 478-484 (1985).

Viitaten kuvioon 13, vasta-aineet, jotka ovat läsnä potilaan nivelvoidenesteessä, jolla on Lymen sairauteen liittyvä niveltulehdus, reagoivat vahvasti Western blot -analyysissä 31-kDa ja 34-kDa villityypin OspA:n ja OspB:n B. burgdorferista 25 olevien proteiinien kanssa. Molemmat OspA:n muodot, jotka syntetisoitiin E. co-Zissa (OspA:n yhdistelmä-DNA-tekninen muunnelma, kuten myös täysipituinen, OspA:n villityypin versio, joka syntetisoitiin vertailuna) reagoivat myös vahvasti.

Viitaten taas kuvioon 13, kaista 1 sisälsi koko solulysaatit (2 x 106 solua) B.

30 burgdorferin (B31) spirokeetoista, kun taas kaistat 2-4 sisälsivät indusoituja E. coli -soluja. Kaista 5 sisälsi puhdistetun OspA:n yhdistelmä-DNA-teknisen 33 105924 muunnelman (0,5 pg). Näytteet, jotka laitettiin kaistoille 2 - 5, oli saatu soluista (6 μΐ), jotka kantoivat pET9-vektoriplasmidia, pET9-preOspA tai pET9-OspA:ta, 3 tuntia induktion jälkeen. SDS-12,5 % PAGE erotettuja proteiineja siirrettiin nitro-selluloosalle, käsiteltiin yön yli 2 %:ssa häränseerumialbumiinissa ja annettiin 5 sitten reagoida nivelvoidenesteen kanssa, joka oli saatu potilaasta, jolla oli Lymen sairaus. Täplät pestiin, inkuboitiin [l25I] -merkityllä proteiinilla A ja siitä otettiin filmi autoradiografiaa varten. Villityypin B. burgdorferi OspA:n ja OspB:n paikat on merkitty.

10 Kun tulokset osoittavat, että molemmat plasmidit ilmentävät immunoreaktiivista OspA-proteiinia, pET9-preOspA:sta ilmennetty proteiini näytti reagoivan vahvemmin kuin sama määrä proteiinia, joka oli saati pET9-OspA:sta. Samanlaiset tulokset saatiin, kun Immobilon™ , hydrofobinen polyvinylidiinidifluoridiin perustuvaa membraania, käytettiin kiinteänä faasina proteiinin analysointiin. Päätel-15 tiin, että tämä ilmeinen ero reaktiivisuudessa saattoi olla OspA:n yhdistelmä-DNA-teknisen muodon huonomman siirron tai retention aikaansaama nitrosellu-loosamembraanissa. Edellä oleva teoria testattiin sen jälkeen merkitsemällä indusoituja viljelmiä [35S]-metioniinilla (saatu yhtiöstä DuPont-New England Nu-clear/specific activity =1165 Ci/mmol.). Autoradiografiaa käytettiin seuraamaan 20 villityypin OspA:n suhteellisia määriä, kuten myös OspA:n yhdisteimä-DNA-, teknistä muunnelmaa jokaisen Western blot -analyysivaiheen aikana.

BL21(DE3)/pLysS solujen viljelmien, jossa oli pET9-preOspA tai pET9-OspA, kasvatettiin lämpötilassa 37 °C keskilogaritmifaasiin M9 väliaineessa ja indusoi-25 tuna IPTG:llä. Yhden tunnin jälkeen jokainen viljelmä merkittiin 20 °Ci/mL (35S] ·, -metioniinilla 5 minuutiksi ja 10 pL:n annokset analysoitiin elektroforeesin jäl keen 12,5 %:illa geeleillä. Viittaamalla kuvioihin 14-18 kaista 1 jokaisessa paneelissa sisälsi kokonaisia merkkaamattomia B. burgdorferi -soluja (5 x 107 solua). Kaistat 2 ja 3 sisälsivät indusoituja, merkattuja soluja, joissa oli pET9-30 preOspA tai pET9-OspA. Proteiinit tehtiin näkyväksi värjäämällä Coomassie sinisellä kuten on esitetty kuviossa 14 ja geelin autoradiografialla kuten on esitetty 34 105924 kuviossa 15. Kuvioissa 16 ja 17 proteiinit on visualisoitu elektroforeettisen siirron jälkeen nitroselluloosapaperille. Kuvio 16 esittää nitroselluloosan autoradio-grammia ennen Western -lisäanalyysiä. Kuvio 17 esittää autoradiogrammia tutkimuksen jälkeen vasta-aineilla. Kuvio 18 esittää valokuvaa loppuun suoritetusta 5 Western blot -analyysistä käsittelyn jälkeen alkalifosfataasivärikehitysreagens-seilla. Kiinteät nuolet osoittavat yhdistelmä-DNA-teknisen muunnelman tai Os-pA:n päätä kuten myös pET9-preOspA -proteiinit, jotka on esitetty kaistoilla 1 ja 2. Katkoviivoilla piirretyt nuolet esittävät pET9-OspA proteiinituotteen paikkaa, joka ilmenee kaistasta 3.

10

Viitaten nyt kuvioihin 14 - 18 on ilmeistä, että luonnollisen OspA:n ja OspA:n yhdistelmä-DNA-teknisen muunnelman suhteelliset osuudet muuttuivat ana-lyysimenettelyn aikana. OspA.n yhdistelmä-DNA-teknisen muunnelman määrä, joka säilyi analyysin jälkeen, oli tuotettu vasta-aineilla ja sen jälkeen pesty, väheni 15 huomattavasti suhteessa alun perin siirrettyyn määrään. Sitä vastoin OspA:n vil-lityypin versio säilyi hyvin jokaisen vaiheen aikana. Tulokset osoittivat, että ilmeinen ero kahden OspA-muodon reaktiivisuuden välillä (yhdistelmä-DNA-tekninen muunnelma ja villityypin versio) ensisijaisesti johtui hyvin liukenevan, OspA -yhdistelmä-DNA-teknisen muunnelman selektiivisestä menetyksestä 20 Western blot -analyysin aikana.

JOHTOPÄÄTÖKSIÄ JA YHTEENVETO TIEDOISTA

Vaikka edellä oleva menetelmä proteiinin yhdistelmä-DNA-teknisen muunnelman 25 tuottamiseksi kohdistui Borrelia burgdorferm ulomman pinnan proteiiniin A, menetelmä soveltuu myös käytettäväksi muihin Sorre/ia-lipoproteiineihin sillä edellytyksellä, että signaaliseksvenssi signaalipeptidaasille II ilmenee geenin koodauksessa kyseessä olevalle lipoproteiinille.

30 OspA-geenin katkaistu muunnelma oli erinomainen ylituottaja, koska se ei liittynyt isäntäorganismin solukalvoon. Tuloksena saatu OspA:n yhdistelmä-DNA- 35 105924 tekninen muunnelma muodosti enemmän kuin 50 % kokonaissoluproteiinista muutama tunti induktion jälkeen. Katso esimerkit 4, 5 ja 6. Lisäksi OspA:n yh-distelmä-DNA-tekninen muunnelma ei ole lipidoitu ja liukenee hyvin (> 50 mg/ml) ilman pinta-aktiivista ainetta. Katso esimerkki 4. Lisäksi 60 - 70 mg puh-5 dasta proteiinia on saatavilla niin pienimääräistä kuin 0,5 litrasta lähtöviljelmää yksinkertaisen puhdistusmenetelmän jälkeen johtuen hyvästä hyperilmentämisestä isäntäorganismissa. Katso esimerkit 5 ja 6. OspA:n yhdistelmä-DNA-teknisen muunnelman Western blot -analyysit osoittivat, että se säilytti immunoreaktiiviset epitooppiset paikat. Katso esimerkit 3 ja 7. Tämä reaktiivisuus yhdessä esillä ole-10 van keksinnön proteiinin hyvin puhtaus- ja liukoisuusominaisuuksien kanssa tekee sen varteenotettavaksi valinnaksi diagnostisena aineena Lymensairauden toteamiseksi kliinisissä eristeissä kuten myös mahdollisena immunogeeniä rokotteena B. burgdorferia vastaan.

15 Vaikka esillä olevaa keksintöä kuvaavia suoritusmuotoja on kuvattu viittaamalla liitteen piirustuksiin, ei ole tarkoitus rajoittaa keksintöä juuri näihin suoritusmuotoihin ja alan ammattihenkilö voi suorittaa erilaisia muutoksia ja muunnelmia poikkeamatta keksinnön hengestä tai piiristä.

m « 105924 36

SEKVENSSILUETTELO

(1) YLEISET TIEDOT: (i) HAKIJA: Dunn, John J.

5 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Borrelia -lipoproteiinien kloonaus ja ilmentäminen (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 15 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE: (A) OSOITE: Brookhaven National Laboratoiy Associated 10 Universities, Inc.

(B) KATU: (C) KAUPUNKI: Upton (D) VALTIO: New York

(E) MAA: USA

15 (F) ZIP: 11973 (v) LUETTAVA TIETOKONEMUOTO: (A) ALUSTATYYPPI: disketti - 5,25", 360 Kb (B) TIETOKONE: IBM XT yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: MS DOS

20 (D) OHJELMA: Word Perfect 4.2 (2) SEQ ID NO: 1 - SEKVENSSIN TIEDOT: : (i) SEKVENSSI OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 822 emästä (B) TYYPPI: Nukleiinihappo 25 (C) JOUSTEISUUS: Kaksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: Lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID WO: 1: ATG AAA AAA IÄT TTA TTG GGA ATA CCT CT A ATA TT A 6CC TTA ATA GCA 48

Het ly» ly» Tyr leu leu Gly Ile Gly leu Ile Itu Ala leu 11« Ala ’5 10 15 . TGT **c CAA AAT CTT AGC AGC CTT GAC GAG AAA AAC A6C GTT TCA GTA 96

Cy» ly» Gin Aan Vai Ser Ser leu Asp Glu ly* A*n Ser Vai Ser Vai 20 25 30 37 105924 GAT TTG CCT GGT GAA ATG AAA 6TT CTT GTA AGC AAA GAA AAA AAC AAA 144

Asp Leu Pro Gly Glu Het Lys Val Leu val Ser lys Glu Lys Am Lys 35 40 45 GAC GGC AAC TAC CAT CTA ATT GCA ACA GTA GAC AAC CTT GAG CTT AAA 192

Asp Gly Lys lyr Asp Leu lie Ala Thr val Asp Lys Leu Glu Leu Lys 50 55 60 GGA ACT TCT GAT AAA AAC AAT GCA TCT GGA GTA CTT GAA GGC GTA AAA 240

Gly Thr Ser Asp Lys Asn Atn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys 65 70 75 flO

GCT GAC AAA ACT AAA GTA AAA TTA ACA ATT TCT GAC GAT CTA GGT CAA 288

Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr lie Ser Asp Asp Leu Gly Gin 85 90 95 ACC ACA CTT GAA CTT TTC AAA GAA CAT GGC AAA ACA CTA GTA TCA AAA 336

Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Vel Ser Lys 100 105 110 AAA GTA ACT TCC AAA GAC AAG TCA TCA ACA GAA GAA AAA TTC AAT GAA 384

Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu lys Phe Asn Glu 115 120 125 AAA GGT GAA GTA TCT GAA AAA ΑΤΑ ATA ACA AGA GCA GAC CCA ACC ACA 432

Lys Gly Glu Vel Ser Glu Lys lie lie Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg *30 135 140 CTT GAA TAC ACA GGA ATT AAA ACC GAT GGA TCT GGA AAA CCT AAA GAG 460

Leu Clu Tyr Thr Gly lie Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ale Lys Glu 145 150 155 160 GTT TTA AAA GGC TAT GTT CTT GAA GGA ACT CTA ACT CCT GAA AAA ACA 528

Val Leu Lys Gly Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala Glu I ft Thr 165 170 175 ACA TTG GTG GTT AAA CAA CCA ACT GTT ACT TTA AGC AAA AAT ATT TCA 576

Thr Leu Val Val Lys Clu Gly Thr Vel Thr Leu Ser Lys Asn lie Ser 180 185 190 AAA TCT GGG GAA GTT TCA GTT GAA CTT AAT GAC ACT GAC ACT ACT GCT 624

Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala 195 200 205 GCT ACT AAA AAA ACT GCA CCT TGG AAT TCA GGC ACT TCA ACT TTA ACA 672

Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Cly Thr Ser Thr Leu Thr 210 215 220 ATT ACT CTA AAC ACT AAA AAA ACT AAA GAC CTT GTG ITT ACA AAA GAA 720 ’ ll* Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu 225 230 235 240 AAC ACA ATT ACA GTA CAA CAA TAC CAC TCA AAT GGC ACC AAA TTA GAC 768

Asn Thr lie Thr val Gin Gin Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu 245 250 255 GGG TCA GCA GTT GAA ATT ACA AAA CTT CAT GAA ATT AAA AAC GCT TTA 816 . Gly Ser Ala Val Glu lie Thr Lys Leu Asp Glu Me lys Asn Ala Leu 260 265 270 — AAA TAA 522 iy* 38 105924 (2) SEQ ID NO:2 - SEKVENSSIN TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: 5 (A) PITUUS: 273 Aminohappoa (B) TYYPPI: Aminohappo (D) TOPOLOGIA: Lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID WO: 2: 10 «et Ly* Ly* lyr Leu Leu Cty Ile Cly Leu Ile Leu AI. leu Ile AI.

’ 5 10 ,5

Cy* Ly* Gin A*n v.l Ser ser l*u A*o Glu Ly* A*n Ser v.I Ser v.l 20 23 30 A«p Leu Pro Gly Glu Met Ly* V.l Leu V.l Ser Ly* Glu Ly* Asn Ly* « 40 45 A*p Gly Ly* Tyr A*p Leu Ile AI. Thr v.l Asp Ly* Leu Glu Leu Ly* 50 55 60

Gly Thr ser A«p Ly* A*n Atn Cly Ser Gly v.l Leu Glu Gly vei i-.r 65 70 75 du

Ai. A.p Ly* ser Ly* V.l Ly* Leu Thr lie Ser Asp A.p Leu G'.» Gl' 85 90 v5

Thr Thr Leu Glu V.l Phe Ly. Glu A*p Gly Ly* Thr Leu V.l ser Li s 100 105 Π0

Ly. V.l Thr s.r Ly. A.p Ly. Ser Ser Thr Glu Glu ly*. Ph· ul-i 115 120 125

Ly. Gly Glu v.l S.r Glu Ly* II* II* Thr Arg AI. A.p Gly Thr Arg 130 135 140

Leu Glu Tyr Thr Gly II* Ly. Ser Asp Gly Ser Gly Ly. AI. Ly* tiu H5 150 155 160 - V.l Leu Ly* Gly Tyr V.l Leu Glu Cly Thr Leu Thr AI. Glu Ly* Thr 165 170 175

Thr leu V.l V.l Ly* Glu Gly Thr V.l Thr Leu Ser Ly* Asn Ile Ser ISO 185 190

Ly* Ser Gly Glu v.l Ser v.l Glu Leu Asn A.p Thr Asp Ser Ser AI.

195 ZOO 205 AI. Thr Ly* Lys Thr AI. AI. Trp A*n Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr 210 215 220 39 105924

Ile Thr Vai Asn Ser ly* Ly* Thr ly* A*o Leu vai Phe Thr Ly* Clu 225 230 235 240 5

Aan Thr lla Thr Vai Gin Gin Tyr Aap Ser Aan Gly Thr Ly* Leu Glu 245 250 255

Gly Ser Ala Vai Glu Ile Thr Ly* Leu Aap Glu Ile Ly* A*n Ala Leu Z60 265 270

Ly* 10 (2) SEQ ID NO:3 - SEKVENSSIN TIEDOT: 15 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 777 emästä (B) TYYPPI: Nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: Kaksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: Lineaarinen 20 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID WO: 3: ATG GOT AAG CAA AAT GTT AGC AGC CTT CAC GAG AAA AAC AGO GTT TCA 48

Het Ala Ly* Gin Aan Vai Ser Ser Leu A*p Glu Ly* Asn Ser Vai Ser 1 5 10 15 CT* CAT ITC CCT CGI CAA ATG AAA GTT CTT GT A AGC AAA GAA AAA AAC 96 V*1 **° Leu Pro Gly Clu Het Ly* Vai Leu vai Ser Ly* Glu Ly* Asn 20 25 30 40 105924 AAA CAC CCC AAC TAC CAT CTA ATT CCA ACA GTA GAC AAG r 'T C.AG C’1 U4 lyi A*p Gly lys Tyr Asp Leu Ile Ale Thr Vai Acp Ly» L»u Clu Leu 35 40 45 AAA CCA ACT TCT CAT AAA AAC AAT CCA TCT CCA CTA CTT "AA t_: L'A 192

Ly» Gly Thr Ser A«p Ly» A»n Asn Cly Scr Cly Val Lau C.u Cly vil SO 55 60 AAA CCT CAC AAA ACT AAA CTA AAA TTA ACA ATT TCT CAC CAT CA CCT /40

Ly* Ala Asp Ly» Ser Ly» Vai Ly» Lau Thr Ile Sar A«p *,p lsu My 65 TO 75 60 CAA ACC ACA CTT CAA CTT TTC AAA CAA CAT CCC AAA ACA CTA CTA TCA 288

Cln Thr Thr Lau Clu Vai Pha Ly» Clu Asp Cly Ly» Thr l·.' Val Sar 85 90 95 AAA AAA CTA ACT TCC AAA CAC AAC TCA TCA ACA CAA CAA AAA TTC AAT 336

Ly* ty* V»l Thr Sar Ly* A*p ly* Ser Ser Thr Clu Clu Ly* Pha A»n 100 105 110 CAA AAA CCT CAA CTA TCT CAA AAA ΑΤΑ ATA ACA ACA CCA CAC CCA ACC 384

Clu Lys Cly Clu Val Ser Clu Lys Me Me Thr Arg Ala Asp Cly Thr 115 120 125 ACA CTT CAA TAC ACA CCA ATT AAA ACC CAT CCA TCT CCA AAA CCT AAA 432

Arg Leu Clu Tyr Thr Cly Me Lys Ser Asp Cly Ser Cly Ly* Ala Lys 130 135 140 CAC CTT TTA AAA CCC TAT CTT CTT CAA GCA ACT CTA ACT CCT CAA AAA 480

Clu V»l Leu Lys Gly lyr Val Leu Clu Cly Thr Leu Thr Ala Clu Lys 145 150 155 160 ACA ACA TTC CTC CTT AAA CAA CCA ACT CTT ACT TTA ACC AAA AAT ATT 528

Thr Thr Leu Val Val Lys Clu Cly Thr Val Thr Leu Ser Lys Aan Me 165 170 173 TCA AAA TCT CCC CAA CTT TCA CTT CAA CTT AAT CAC ACT CAC ACT ACT 576

Ser Lys Ser Cly Clu Val ser val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser . 180 185 190 CCT CCT ACT AAA AAA ACT CCA CCT TCC AAT TCA CCC ACT TCA ACT TTA 624

Ala Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Irp Asn Ser Cly Thr Ser Thr Leu 195 200 205 ACA ATT ACT CTA AAC ACT AAA AAA ACT AAA CAC CTT CTC TTT ACA AAA 672

Thr lie Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu val Phe Thr Lys 210 215 220 GAA AAC ACA ATT ACA CTA CAA CAA TAC CAC TCA AAT CCC ACC AAA TTA 720

Clu A*n Thr Me Thr Val Cln Cln Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 CAC CCC TCA CCA CTT CAA ATT ACA AAA CTT GAT CAA ATT AAA AAC CCT 768

Glu Cly Ser Ala Val Clu Me Thr Lys Leu Asp Clu Me Lys Asn Ala 245 250 255 TTA AAA TAA 777

Leu Lys 41 105924 (2) SEQ ID NO:4 - SEKVENSSIN TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 258 Aminohappoa 5 (B) TYYPPI: Aminohappo (D) TOPOLOGIA: Lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID WO: 4:

Het AI· ly» Gin A*n vai S«r S«r l«u A*p Glu ly» Aen itr v*i S»r 15 10 15

Vai Aap lau Pro Cly Clu Hat ly» Vai leu Vai Sar ly» Glu ly» A»n 20 25 30 ly» A»p Gly ly» Tyr Asp leu lie Ala Thr Vai Asp ly» lau Glu Lau 35 *0 *5 ly» Gly Thr Ser Asp ly» Asn Asn Gly Sar Gly Vai lau Glu Cly Vai 50 55 60 lys Ala Asp lys Ser lys Vai lys leu Thr Ile Ser Asp Asp leu Gly 65 70 75 80 cm Thr Thr ueu Glu Vai Phe lys Glu Asp Gly lys Thr leu vai Ser 85 90 95 lys Lys Vai Thr Ser lys Asp lys Ser Ser Thr Glu Glu lys Phe Asn 100 105 110

Glu lys Gly Glu Vai Ser Glu lys Ile Ile Thr Arg Ala Aso Gly Thr 115 120 125

Arg leu Glu Tyr Thr Gly Ile lys Ser Asp Gly Ser Gly ly» Ala lys 130 135 HO

Glu Vai leu lys Gly Tyr Vai leu Glu Gly Thr leu Thr Ala Glu lys 145 150 155 160

Thr Thr leu Vai Vai lys Clu Gly Thr Vai Thr leu Ser lys Asn [le 165 170 175

Ser lys Sar Gly Glu Vai Ser vai Glu leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser 180 185 190

Ala Ala Thr lys lys Thr Ala Ala Tro Asn Ser Gly Thr Ser Thr leu 195 200 205

Thr Ile Thr Vai Asn Ser lys lys Thr Lys Asp leu Vai Phe Thr lys • 210 215 220 „ 105924 42

Glu Α*η Thr Ile Thr Vai Gin Gin Tyr Asp Ser Asn Gly Thr lys leu 225 230 235 240

Glu Gly Ser Ala Vai Glu Ile Thr Lys leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala 245 250 255

Leu Lys 5 (2) SEQ ID NO:5 - SEKVENSSIN TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 774 emästä 10 (B) TYYPPI: Nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: Kaksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: Lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID WO: 5: 15 GCT AAG CAA AAT GTT ACC AGC CTT GAC GAG AAA AAC ACC GTT TCA GTA 48

Ala Lya Gin Asn vai Ser Ser Leu Asp Glu lys Aan Ser Vai Ser Vai 15 10 15 GAT TTG CCT CGT CAA ATG AAA GTT CTT GTA ACC AAA CAA AAA AAC AAA 96

Aap Leu Pro Gly Glu Het Lya Vai Leu vai Ser Lys Glu Lya Aan Lya 20 25 30 GAC GGC AAG TAC CAT CTA ATT GCA ACA GTA GAC AAC CTT GAG CTT AAA 144

Asp Gly Lya Tyr Asp Leu lla Ala Thr vai Aap lya Leu Glu Leu Lys 35 40 45 • GGA ACT TCT GAT AAA AAC AAT CCA TCT CGA GTA CTT GAA GCC GTA AAA 192

Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Cly $*r Gly Vai Leu Glu Gly Vai lys 50 55 &0 GCT GAC AAA ACT AAA GTA AAA TTA ACA ATT TCT GAC GAT CTA GGT CAA 240

Ala Asp Lys Ser Lys Vai Lys Leu Thr He Ser Asp Asp Leu Cly Gin 65 70 75 80 * ACC ACA CTT CAA C7T TTC AAA CAA MT CCC AAA ACA CTA GTA TCA AAA 288 : . Thr Thr Leu Glu Vai Phe Lys Glu Asp Cly lys Thr Leu vai Ser lys 85 90 9; AAA GTA ACT TCC AAA GAC AAG TCA TCA ACA GAA GAA AAA TTC AAT CAA 336

Lys Vai Thr Ser Lys Asp Lys Ser s,r Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu 100 105 no AAA GGT GAA CTA TCT GAA AAA ΑΤΑ ATA ACA AGA GCA GAC GGA ACC AGA 384 L^· Cl* Slu Vel S*r 6lu Lv· »« He Thr Arg Ala Asp Gly Thr Ar,

115 120 12S

., 105924 43 CTT GA* TAC ACA GCA ATT AAA ACC GAT CGA TCT GGA AAA CCT AAA GAG 432

Leu Glu Tyr Thr Gly 11« Lys S«r Asp Gly Ser Gly Lys Al« ly* Glu 130 135 ’<·0 5 CTT TTA AAA GGC TAT GTT CTT GAA GGA ACT CTA ACT GCT GAA AAA ACA 480

Val Leu Lys Gly lyr val Leu Glu Gly Thr Leu thr Ala Glu Lys Thr 145 150 155 ’60 ACA TTG CTG CTT AAA GAA CGA ACT GTT ACT TTA ACC AAA AAT ATT TCA 528

Thr Leu Vai V«l Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn lie Ser 165 170 175 10 AAA TCT GGG GAA GTT TCA GTT GAA CTT AAT GAC ACT CAC ACT ACT CCT 576 Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala 180 185 190 GCT ACT AAA AAA ACT GCA GCT TGG AAT TCA GCC ACT TCA ACT TTA ACA 624

Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr

195 200 ZOS

ATT ACT GTA AAC ACT AAA AAA ACT AAA CAC CTT GTG TTT ΛΓ.Α AAA ΓΑ» &72 lie Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu val Phe Thr Lys Clu 210 215 220 AAC ACA ATT ACA GTA CAA CAA TAC GAC TCA AAT GCC ACC AAA TTA LAC 720

Asn Thr lie Thr val Gin Gin Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lya Leu Clu 225 230 235 260 GGG TCA GCA CTT CAA ATT ACA AAA CTT GAT GAA ATT AAA AAC GCT TTA 768

Gly Ser Ala Vai Glu Ile Thr Lya Leu Aap Glu Ile Ly* Asn A-l *.«j 245 250 255

AAA TAA 77A

iy· 44 105924 (2) SEQ ID NO:6 - SEKVENSSIN TIEDOT: (j) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 257 aminohappoa (B) TYYPPI: Aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: Lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID WO: 6: AI» lys Gin Asn Vai Ser Ser leu Asp Glu lys Asn Ser Vei Ser Vai t 5 10 15 10

Asp Leu Pro Gly Glu net lys V»l leu Vai Ser lys Glu lys Asn lys 20 25 30

Asp Gly lys Tyr Asp leu Ile Ala Thr Vai Asp lys leu Glu Itu lys 35 40 45

Gly Thr Ser Asp lys Asn Asn Gly Ser Gly Vai leu Glu Cly Vai lys 50 55 60 15

Ala Asp lys Ser lys Vai lys leu Thr Ile Ser Asp Asp leu Gly Gin 65 70 75 50

Thr Thr leu Glu Vai Phe lys Glu Asp Gly lys Thr leu Vai Ser lys 55 90 95 lys Vai Thr Ser lys Aso lys Ser Ser Thr Glu Glu lys Phe Asn Glu 100 105 110 20 lys Gly Glu Vai Ser Glu lys Ile Ile Thr Arg Ala Asp Cly Thr Arj 115 120 125

V

leu Glu Tyr Thr Gly Ile lys Ser Asp Gly Ser Gly lys Ala lys Glu 130 135 140

Vai leu lys Gly Tyr Vai leu Clu Gly Thr leu Thr Ala Glu lys Thr 145 150 155 160 25

Thr leu Vai Vai lus Glu Cly Thr Vai Thr leu Ser lys Asn Ile Ser 165 170 175

Ly* Ser Gly Glu Vai Ser Vsl Clu leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala 150 155 190 30 45 105924

Ala Thr ly· ly1 Thr Ala Ala Trp Aan Sar Cly Thr Scr Thr luu Thr 195 200 205

Ile Thr vai Aan Sar ly· ly· Thr ly· Α·ρ lau »ai Pha Thi lv· Clu 210 215 220 5 Aan Thr (ia Thr Vai Oln Gin Tyr A1p Sar Aan Gly Thr ly· lau Clu 225 230 235 2(0

Gly Sar Ala Vai Glu Ile Thr ly· lau Aap Glu lla ly· /·r. Ala lau 2(5 250 255 ly· 10 (2) SEQ Π) N0:7 - SEKVENSSIN TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) . PITUUS: 774 emästä 15 (B) TYYPPI: Nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: Kaksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: Lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID WO: 7: 20 • ATG AAG CAA AAT CTT ACC AGC CTT GAG GAG AAA AAC AGC CTT TCA CTA 48

Net ly1 Gin Aan Vai Sar Sar lau Atp Glu ly1 Atn Ser Vai Sar Vai 15 10 15 GAT TTG CCT GGT CAA ATG AAA GTT CTT GTA AGC AAA GAA AAA AAC AAA 96

Aip leu 1ro Gly Clu Het ly1 Vai leu Vai Ser ly1 Glu ly1 A1n ly1

20 25 JO

• GAC CGC AAG TAC GAT CTA ATT GCA ACA GTA GAC AAG CTT GAG CTT AAA 1(( . A1P (y» ly **P leu <l1 M» Thr Vai Asp iy1 Lau Glu lau ly1 35 40 45 GGA ACT TCT GAT AAA AAC AAT GGA TCT GGA GTA CTT GAA GGC GTA AAA 192

Gly Thr Sar Asp ly, Asn Asn Gly Ser Gly Vai leu Glu Gly Vei ly1 50 55 60 · 105924 CCT CAC AAA ACT AAA CTA AAA TTA ACA ATT TCT GAC CAT CTA CCT CAA Z40 **· **° *·*· *«Γ *·ν» w»‘ Lys Leu »hr lie Ser Asp Asp leu Cly Gin 65 70 75 80 ACC ACA CTT CAA CTT TTC AAA CAA CAT CCC AAA ACA CTA CTA TCA AAA 2#8 5 Thr Thr Leu Clu Vai Phe lys Clu Asp Gly Lys Thr Leu vei *er Lys 45 90 95 AAA CTA ACT TCC AAA GAC AAC TCA TCA ACA CAA CAA AAA TTC AAT CAA 336

Ly· vel Thr Ser Ly· Asp Ly· Ser Ser Thr Clu Clu Ly· Phe Asn Clu 100 105 110 AAA CCT CAA CTA TCT CAA AAA ΑΤΑ ATA ACA ACA CCA CAC CCA ACC ACA 364 lys Cly Clu Vel Ser Clu Lys lie lie Thr Arg Ale Asp Cly Ihr Arg 10 115 120 125 CTT CAA TAC ACA CCA ATT AAA ACC CAT CCA TCT CCA AAA CCT AAA CAC 432

Leu Clu Tyr Ihr Cly lie Lys Ser Asp Cly Ser Cly Lys Ale Lys Clu 130 135 140 CTT TTA AAA CCC TAT CTT CTT CAA CCA ACT CTA ACT CCT CAA \»A * \ ς30 ν·1 Leu Ly· Cly Tyr Vel L*u Clu Cly Thr Leu Thr At· C>>. »ye Th: |5 1*5 150 155 160 ACA TTC CTC CTT AAA CAA GCA ACT CTT ACT TTA ACC AAA Α·Τ ATT τ.ι j-j

Thr Leu vel vel Lys Clu Cly Thr vel Thr Leu Ser Lys Ain Ur f.ei 165 170 1J5 AAA TCT CCC CAA CTT TCA CTT CAA CTT AAT CAC ACT CAC AC' LOT CCT *76

Lys Ser Cly Clu Vel Ser Vel Clu Leu Α·η Asp Thr As: ·'»' »i ai* 140 185 no 20 CCT ACT AAA AAA ACT CCA CCT TCC AAT TCA CCC ACT TCA ACT TTA ACA 624

Ale Thr Lys Lye Thr Ale Ale Trp Asn Ser Cly Thr Ser Thr Leu Thr . 195 200 205

P

·« ATT ACT CTA AAC ACT AAA AAA ACT AAA CAC CTT CTC TTT ACA AAA CAA 672 lie Thr Vel Asn Ser Lys Lys Ihr Lys Asp Leu Vel Phe Thr Lys Clu 210 215 220 AAC ACA ATT ACA CTA CAA CAA TAC CAC TCA AAT CCC ACC AAA TTA GAC 720

Asn Thr lie Thr vsl Gin Cln Tyr Asp Ser Asn Cly Thr lys Leu Clu 225 230 235 2*° CCC TCA CCA CTT CAA ATT ACA AAA CTT CAT CAA ATT AAA AAC CCT TTA 768 ‘ Cly Ser Ale vel Clu lie Thr Lys leu Asp Clu lie Lys Asn Ala Leu 245 250 255 AAA TAA 774

Lys » • e 47 105924 (2) SEQ ID NO:8 - SEKVENSSSIN TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 257 aminohappoa (B) TYYPPI: Aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: Lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID WO: 8:

Het Ly* Gin Asn V·! Ser Ser Leu Asp Glu Ly» Asn Ser v«l Ser Vai 15 10 15 ASP Leu Pre Gly Glu Het Ly» Vei Leu Vai Ser Ly* Glu Ly* A*n Ly* 20 25 30

Asp Gly Ly* lyr Asp Leu Ile Ala Thr vai Asp Lys Leu Glu Leu Ly* 35 40 45

Gly Thr Ser Asp Ly· Asn Asn Gly Ser Gly Vsl Leu Glu Gly Vai Lys 50 SS 60

Ala Asp Lys Ser Lys Vai Lys Leu thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gin 65 70 75 80

Thr Thr Leu Glu Vai Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Vai Ser Lys 85 90 95

Lys Vai Thr Ser Ly» Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu lys Phe Asn Glu 100 105 Π0

Lys Gly Glu Vai Ser Glu Lys Ile Ile Thr Aro Ala Asp Gl. Thr Aro - 115 120 125

Leu Glu Tyr Thr Gly lie lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ale Lyt C>u 130 135 140

Vai Leu Lys Gly Tyr Vai Leu Glu Gly Thr Leu Thr Als Glu Lys Thr 145 150 155 160

Thr Leu vai Vai Lys Glu Gly Thr vai Thr Leu Ser Lys Asr Ile Ser . 165 170 175 • . -

Lys Ser Gly Glu Vai Ser Vai Glu Lau Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala

180 185 IVO

Ala Thr Ly» Ly» Thr Ala Ala Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr 195 200 205 48 105924 lit Thr Vtl Atn Str Ly· lr» Thr ly» A»p leu Vtl *h# Thr ly* Glu 210 215 220

Atn Thr Ile Thr Val Gin Gin Tyr Aip Ser Atn Gly Thr lys leu Glu 225 230 235 240

Sly Ser Ala Val Glu lie Ihr lys leu Asp Glu lie lys Aan Ala leu 5 245 250 255 iy* (2) SEQ ID NO:9 - SEKVENSSIN TIEDOT: 10 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 771 emästä (B) TYYPPI: Nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: Kaksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: Lineaarinen 15 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID WO: 9: AAC CAA AAT GTT AGC AGC CTT GAC GAG AAA AAC AGC CTT TCA CIA CAT 48 lya Gin Atn Vai Ser Ser leu asp Glu lys Atn Ser vai Ser vai Atp 15 10 15 ..... TTG CCT CGT GAA AT G AAA CTT CTT GTA AGC AAA CAA AAA AAC AAA GAC 96

leu Pro Gly Glu Het lys Vai leu vai Ser lys Glu lys Atn lys Atp 20 25 JO

CGC AAG TAC GAT CT A ATT CCA ACA GTA GAC AAG CTT CAG CTT AAA GGA 144

Gly lyt Tyr Atp itu lie Ala Thr Vai Asp lys Itu Glu leu ly» Gly 35 40 45 ACT TCT CAT AAA AAC AAT CCA TCT GGA GTA CTT GAA GGC CIA AAA GCT 192

Thr Ser Atp lyt Atn Atn Gly Ser Gly Vai leu Glu Gly vai lyt Ala 50 55 60 GAC AAA ACT AAA GTA AAA TT A ACA ATT TCT GAC GAT CTA CCT CAA ACC 240

Atp ly» Ser ly» vai ly» leu Ihr Ile Ser Atp Asp l*u Cly Gin Thr 65 70 73 80 49 105924 ACA CTT CAA CTT TTC AAA CAA GAT GCC AAA ACA CTA GTA TCA AAA A.· 133

Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly lys Thr Leu Vat Ser Lye tys 8S 90 95 GTA ACT TCC AAA CAC AAG TCA TCA ACA CAA GAA AAA TTC AAT *AA Ml 136

Vat Thr Sar Lys Asp Lys Sar Sar Thr Glu Glu Lys Pha ash Glu Lya 100 105 110 GCT CAA GTA TCT GAA AAA ΑΤΑ ATA ACA AGA CCA GAC CCA ACC AGA lΤ', 384

Gly Glu Val Sar Glu Lyt 11a lit Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg if.

115 120 125 GAA TAC ACA CCA ATT AAA ACC GAT GGA TCT CGA AAA GCT. AAA GAG CTT 432

Glu Tyr Thr Gly I la Lys Sar Asp Gly Sar Gly Lys Ala Lys 61- Val 130 135 140 TTA AAA CGC TAT CTT CTT GAA GGA ACT CTA ACT GCT GAA AAA ACA ACA 480

Leu Lys Gly Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala Glu Lys Thr Thr 145 150 155 160 TTC GTG GTT AAA GAA GGA ACT GTT ACT TTA AGC AAA AAT ATT TCA AAA 528

Leu Val Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asrt lie Ser Lys 165 170 175 TCT GGG CAA GTT TCA GTT GAA CTT AAT GAC ACT CAC ACT ACT GCT GCT 576

Ser Gly Glu val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala Ala 180 . 185 190 ACT AAA AAA ACT CCA GCT TGG AAT TCA GCC ACT TCA ACT TTA ACA ATT 624

Thr lys lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr leu Thr lie 195 200 205 ACT GTA AAC ACT AAA AAA ACT AAA CAC CTT GTG TTT ACA AAA GAA AAC 672

Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn 210 215 220 ACA ATT ACA GTA CAA CAA TAC GAC TCA AAT CGC ACC AAA TTA GAG CGG 720

Thr lie Thr Val Gin Gin Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu Gly 225 230 235 240 TCA CCA GTT GAA ATT ACA AAA CTT GAT GAA ATT AAA AAC GCT TTA AAA 768

Ser Ala Val Clu lie Thr Lys Leu Asp Glu lie Lys Asn Ala Leu Lys 245 250 255 TAA 771 50 105924 (2) SEQ ID NO: 10 - SEKVENSSIN TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 256 Aminohappoa (B) TYYPPI: Aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: Lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID WO: 10:

Ly» Gin A»n Vai S*r Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Vai Ser Vai Asp '5 10 15 l«u Pro Gly Glu Net Lys Vai Leu vai Ser Lys Glu Lys Asn lys Asp 20 25 30

Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Vai Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly 35 40 45

Thr Ser Aap Lya Aan Asn Gly Sar Gly Vai Leu Glu Gly Vai l ya Ala 50 55 60

Asp Lys Ser Lys Vai Lys Leu Thr tla Ser Asp Asp Leu Gly Gin Thr

65 70 75 SO

Thr Leu Glu vai Phe Lys Glu Asp Gly Lya Thr Leu Vai Sar Lya Ly· 85 90 95

Vai Thr Sar Lya Aap Lys Sar Ser Thr Glu Glu Lys Pha Aan Glu Lya 100 105 110

Gly Glu Vai Sar Glu Lys lla Ile Thr Ars Ala Asp Gly Thr Ar· Leu 115 120 125 • Glu Tyr Thr Gly lla Lys Sar Asp Gly Sar Gly Lys Ala Lya Glu Vai 130 135 140

Leu Lys Cly Tyr Vai Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ali Glu Lys Thr Thr US ISO 155 160

Leu Vai Vai Lus Glu Gly Thr Vai Thr Leu Ser Lys Asn lla Ser Lys 165 170 175

Ser Gly Glu Vai Ser Vai Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala Ala ' 180 185 190

Thr Lys Lys Thr Ala AI* Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr Ile 195 200 205

Thr vai Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu vai Phe Thr Lys Glu Asn Z10 215 220 si 105924 5 (2) SEQ ID NO:l 1 - SEKVENSSIN TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 32 emästä (B) TYYPPI: Nukleiinihappo 10 (C) JUOSTEISUUS: Kaksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: Lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID WO: 11: 15 CCGGGATCCA T ATG GCT AAG CAA AAT GTT AGC 32

Met Ala Lys Gin Asn Vai Ser 1 5 20 (2) SEQ ID NO: 12 - SEKVENSSIN TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 28 emästä (B) TYYPPI: Nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: Yksijuosteinen 25 (D) TOPOLOGIA: Lineaarinen ' L . (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID WO: 12: GATATCTAGA TCTTTATTTT AAAGCGTT 28 30 52 105924 (2) SEQ ID NO: 13 - SEKVENSSIN TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 31 emästä (B) TYYPPI: Nukleiinihappo 5 (C) JUOSTEISUUS: Yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: Lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID WO: 13: 10 CCGGATCCAT ATG AAA AAA TAT TT A TTG GGA 31

Met Lys Ly s Tyr Leu Leu Gly 1 5 15 (2) SEQ ID NO:14-SEKVENSSIN TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 12 emästä (B) TYYPPI: Nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: Kaksijuosteinen 20 (D) TOPOLOGIA: Lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID WO: 14: TT A AT A GCA TGT 12 25 Leu Ile Ala Lys 1 53 105924 (2) SEQ ID NO: 15 - SEKVENSSIN TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 4 Aminohappoa 5 (B) TYYPPI: Aminohappo (D) TOPOLOGIA: Lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID WO: 15: 10 Leu Ile Ala Cys 1

Claims (22)

105924

1. Menetelmä Borrelia burgdorferi ulomman pinnan (OspA) -lipoproteiinia koo-daavan nukleotidisekvenssin katkaistun muodon saamiseksi, tunnettu siitä, 5 että menetelmässä saadaan aikaan mainitun, Borrelia -lipoproteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin käsittävä DNA-malline, joka malline sisältää signaalipeptidaasi II:n mahdollisen signaalisekvenssin, jolla signaalisekvenssillä on 5'-pää ja 3'-pää, joka 3'-pää päät-10 tyy kysteiinij äännöstä koodaavaan kodoniin; ja syntetisoidaan oligonukleotidialukkeiden joukko, joka käsittää ensimmäisen aluk-keen ja toisen alukkeen, ensimmäisen alukkeen käsittäessä alueen, joka on riittävän komplementti mainitun DNA-mallineen ensimmäiselle DNA-juosteelle toi-15 miakseen alukkeena mainitun ensimmäisen DNA-juosteen tehokkaaksi monista miseksi 5'- 3' -suunnassa, ja toisen alukkeen käsittäessä alueen, joka on riittävän komplementti mainitun DNA-mallineen toiselle DNA-juosteelle toimiakseen alukkeena mainitun toisen DNA-juosteen tehokkaaksi monistamiseksi 5'- 3' -suunnassa, ja käyttämällä mainittuja alukkeita käynnistetään DNA-polymerointi 20 nukleotidissa, joka sijaitsee mainitussa DNA-mallineessa mainitun kysteiinijään- nöksen jälkeen 3'suunnassa. • ·

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu nukleotidi sijaitsee välittömästi mainitun kysteiinij äännöksen jälkeen mainitussa 25 3’-suunnassa.

• · · 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mai nitun Borrealia-lipoproteiinin mainittu nukleotidisekvenssi sisältää johtosekvens-sin, jossa on 5'-pää ja 3'-pää. 30 105924

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu johtosekvenssi sisältää kokonaan tai osittain mainitun signaalisekvenssin.

5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mai-5 nittu johtosekvenssi päättyy mainittuun 3'-päähän, jossa on mainittu signaali- sekvenssi, ja mainittu signaalisekvenssi sijaitsee välittömästi mainitun johtose-kvenssin jälkeen mainitusta 3'-päästä.

6. Menetelmä Borrelia burgdorferi ulomman pinnan (OspA) -lipoproteiinin yh-10 distelmä-DNA-teknisen muunnoksen aikaansaamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä: saadaan aikaan mainitun, Borrelia-lipoproteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin käsittävä DNA-malline, joka mainittu malline sisältää signaalipeptidaasi Π:η 15 mahdollisen signaalisekvenssin, jolla mainitulla signaalisekvenssillä on 5'- ja 3' -pää, mainitun 3' -pään päättyessä kysteiinijäännöstä koodaavaan kodoniin; syntetisoidaan oligonukleotidialukkeiden joukko, joka käsittää ensimmäisen ja toisen alukkeen, joka mainittu ensimmäinen aluke käsittää alueen, joka on riittä-20 vän komplementti mainitun DNA-mallineen ensimmäiselle DNA-juosteelle toimiakseen alukkeena mainitun ensimmäisen DNA-juosteen tehokkaaksi monistamiseksi 5'- 3' -suunnassa, ja joka toinen aluke käsittää alueen, joka on riittävän komplementti mainitun DNA-mallineen toiselle DNA-juosteelle toimiakseen alukkeena mainitun toisen DNA-juosteen tehokkaaksi monistamiseksi 5' - 3' -25 suunnassa, joka mainittu ensimmäinen aluke käynnistää DNA-polymeroinnin nukleotidissa, joka sijaitsee mainitussa DNA-mallineessa mainitun kysteiinijään-” nöksen jälkeen 3'suunnassa; annetaan mainittujen alukkeiden reagoida polymeraasiketjureaktiossa, jolloin saa-30 daan aikaan monistustuotteiden joukko; 105924 eristetään mainitun nukleotidisekvenssin katkaistu versio mainitusta monistus-tuotteiden joukosta; kloonataan mainittu katkaistu versio sopivaan ilmentämisvektoriin; 5 sopiva isäntäorganismi transformoidaan mainitulla ilmentämisvektorilla; ja viljellään mainittua isäntäorganismi a mainitun lipoproteiinin yhdistelmä-DNA-teknisen muunnoksen tuottamiseksi. 10

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä proteiinin valmistamiseksi, joka käsittää aminohapposekvenssin, tunnettu siitä, että aminohapposekvenssi käsittää SEQ ID NO: 10 -sekvenssin, jossa SEQ ID NO: 10 - sekvenssin N-terminaalisessa päädyssä on yksi tai useampia alaniini-ja metioniinijäännös. 15

8. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen menetelmä proteiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että mainittu aminohapposekvenssi on SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 tai SEQ ID NO: 8.

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä proteiinin valmistamiseksi, tun nettu siitä, että proteiini käsittää aminohapposekvenssin SEQ ID NO: 10.

10. Nukleotidisekvenssi, tunnettu siitä, että sekvenssi koodaa patenttivaatimuksen 7, 8 tai 9 mukaista aminohapposekvenssiä. 25

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen nukleotidisekvenssi, joka koodaa patentti- ·· vaatimuksen 8 mukaista aminohapposekvenssiä, tunnettu siitä, että mainittu nukleotidisekvenssi on SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 tai SEQ ID NO: 7. 105924

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen nukleotidisekvenssi, joka koodaa patenttivaatimuksen 9 mukaista aminohapposekvenssiä, tunnettu siitä, että mainittu nukleotidisekvenssi on SEQ ID NO: 9.

13. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ilmentämisvektori on plasmidi.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ilmentämisvektori on pET9-plasmidi joka on rakentunut kuviossa 8 esitetyllä 10 tavalla.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu plasmidi on pET9-OspA, joka on rakentunut kuviossa 9 esitetyllä tavalla, jossa katkaistu OspA nukleotidisekvenssi on lisätty pET9-plasmidiin. 15

; ' 16. Jonkin patenttivaatimuksen 6, 13 - 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu isäntäorganismi on E. coli -kanta.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että E. coli - 2. kanta on BL21 (DE3)/pLyS.

18. Jonkin patenttivaatimuksen 6, 13- 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään T7 -bakteriofagi-ilmentämisjäijestelmää.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mai nittu T7 -bakteriofagi-ilmentämisjäijestelmä käyttää hyväksi T7 RNA -polyme-raasia,

20. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 6, 13 - 19 mukainen menetelmä, tunnettu 30 siitä, että mainittua ensimmäistä aluketta koodaa mainittu nukleotidisekvenssi SEQ ID NO: 11. 105924

21. Plasmidi isäntäorganismin transformoimiseksi, tunnettu siitä, että plas-midi on patenttivaatimuksen 15 mukainen pET9-OspA, joka on esitetty kuviossa 9. 5

22. Oligonukleotidialuke, joka on käyttökelpoinen Borrelia burgdorferi ulomman pinnan (OspA) -lipoproteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin osan monistamiseen, tunnettu siitä, että mainittu aluke on SEQ ID NO: 11, joka on esitetty kuviossa 1. 10 * · • · • · * 105924