PT99918B - Processo de producao de uma versao truncada de uma sequencia nucleotidica codificando uma lipoproteina de borrelia - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

O presente invento refere-se a variações recombinantes de proteínas de superfície externa de agentes patológicos e a processos recombinantes de reconstrução destas variações. Em particular, o presente invento refere-se a um processo de produção de variações recombinantes de lipoproteínas de Borrelia do tipo selvagem. Mais particulamente, o presente invento envolve uma variação recombinante da proteína A da superfície externa de Borrelia burgdorferi. a espiroqueta responsável pela doença de Lyme, e a um processo de produção da mesma.

As espiroquetas Borrelia são responsáveis por uma variedade de desordens como a doença de Lyme. A doença de Lyme é uma infecção causada pela espiroqueta Borrelia burgdorferi, que é transportada por carraças. A espiroqueta é transmitida aos humanos e animais através da picada de uma carraça e pode causar num hospedeiro infectado sérias desordens dermatológicas, artríticas, neurológicas e outras desordens patológicas. Recentemente a doença de Lyme tornou-se uma séria preocupação epidemiológica na América do Norte, assim como na Europa, Ásia e União Soviética.

Está bem documentado que pessoas e animais infectadas por patogénios de Borrelia desenvolvem, tipicamente, anticorpos em resposta à presença de vários antigénios de Borrelia. incluindo lipoproteínas da membrana externa. Por exemplo, doentes infectados com a doença de Lyme desenvolvem anticorpos contra a proteína A da superfície externa (OspA), uma lipoproteína da espiroqueta Borrelia burgdorferi. Ver Craft, J.E., Fischer, D.K., Shimamoto, G.T., e Steere, A.C., Antigens of Borrelia burgdoeferi recognized during Lyme disease. Appearance of a new immunoglobulin in response and expansion of the immunoglobulin G response late in the illness¹, J. Clin. Invest. . 78:934-939 (1986). Ver também, Barbour, A.G., Heiland, R.A. e Howe, T.R. , Heterogeneity of major proteins in Lyme disease borrelia: a molecular analysis of North American and European isolates, J. Infect. Dis.. 152:474-484 (1985). A proteína A da superfície

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-3externa (OspA) é uma lipoproteína codificada pela sequência nucleotídica do gene ospA presente no ADN da espiroqueta B. burgdorferi. A sequência nucleotídica que codifica a OspA de tipo selvagem de comprimento total (ver SEQ ID NO: 1) foi previamente determinada para B31, a estirpe de B. burgdorferi da América do Norte. Ver Bergstrom, S., Bundoc, V.G., & Barbour, A.G., Molecular Analysis of linear plasmid-encoded major surface proteins, OspA and OspB of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi, Mol. Microbiol., 3:479-486 (1989). Consequentemente, a sequência de aminoácidos OspA foi prevista através dos dados nucleotídicos (SEQ ID NO: 2).

Do ponto de vista clínico, é altamente desejável desenvolver um processo de produção de grandes quantidades de lipoproteínas de Borrelia altamente purificadas numa forma solúvel para utilização em imunoensaios e outros testes de pesquisa de diagnóstico que detectam a presença de anticorpos para estas proteínas em soros de doentes infectados com espiroquetas Borrelia. Além disso, formas altamente purificadas, solúveis, destas proteínas serão de potencial valor como imunogénios clínicos para vacinação de pessoas e animais contra patogénios de Borrelia. assim como instrumentos de utilidade para a investigação de subsequentes manipulações laboratoriais envolvendo a separação e a purificação de anticorpos para estas proteínas.

Do ponto de vista da tecnologia do ADN recombinante, é altamente desejável a obtenção de uma sequência nucleotídica ou gene gue pode ser expresso em níveis muito altos (hiperexpressão) num sistema de expressão recombinante vector/hospedeiro para produzir grandes quantidades da proteína recombinante resultante enquanto mantém a reactividade específica desejada.

Foram efectuadas tentativas prévias para isolar lipoproteínas de Borrelia. solúveis, purificadas através do crescimento e subsequente purificação de culturas celulares de Borrelia. Existem no entanto várias desvantagens para esta abordagem. 0 crescimento e subsequente purificação destas proteínas a partir

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de extractos celulares brutos de Borrelia consome muito tempo e é -dispendioso. Adicionalmente, o crescimento e manipulação de culturas vivas de Borrelia adiciona um risco significativo para o pessoal do laboratório. Mais importante, as versões de comprimento total, de lipoproteínas de tipo selvagem de Borrelia produzidas por este processo têm propriedades pobres de solubilidade, já que estas proteínas possuem um carácter hidrofóbico, lipídico, devido presumivelmente à sua associação com a membrana celular da espiroqueta durante a expressão.

Consequentemente, são necessários detergentes para solubilizar estas proteínas lipidifiçadas.

É bem aceite na arte que o tratamento de lipoproteínas com detergentes melhora a solubilidade, mas prejudica frequentemente a reactividade alterando ou destruindo a configuração de dobragem da proteína alvo, assim como dos locais epitópicos. Consequentemente, seria desejável desenvolver uma variação recombinante de OspA assim como de outras lipoproteínas de Borrelia que são solúveis sem exposição a detergentes enquanto mantêm a reactividade específica para anticorpos contra os seus análogos lipoproteicos de tipo selvagem de comprimento total. Para além dos referidos problemas de solubilidade, a associação das lipoproteínas de Borrelia com a membrana celular externa da espiroqueta cria também problemas na separação e purificação destas proteínas a partir de extractos celulares brutos.

Alternativamente, certas técnicas de ADN recombinante podem ser utilizadas para expressar genes de Borrelia utilizando um sistema de expressão vector/hospedeiro como a E. coli contendo vectores de clonagem recombinante conhecidos na arte. Um vector de clonagem recombinante adequado será um plasmídeo com uma sequência nucleotídica que pode ser modificada para aceitar uma inserção de ADN de Borrelia de tipo selvagem. Embora estas técnicas recombinantes evitem a necessidade de culturas vivas de Borrelia. têm algumas falhas.

Por exemplo, versões recombinantes da lipoproteína completa de Borrelia burqdorferi de tipo selvagem, produzida utilizando E.

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-5coli possuem propriedades de solubilidade pobres na ausência de detergentes, presumivelmente devido à associação da proteína com a membrana celular externa do hospedeiro durante a expressão. Consequentemente, manipulações subsequentes dirigidas para a separação e purificação do produto proteico resultante envolve problemas semelhantes aos encontrados quando se tenta isolar e purificar OspA de culturas vivas de B. burgdorferi.

Outra falha da abordagem anterior consiste em as versões recombinantes do gene ospA de tipo selvagem de comprimento total sofrerem a uma hiperexpressão pobre num hospedeiro E. coli. Esta expressão pobre é presumivelmente devida aos efeitos tóxicos acumulados da localização da proteína OspA na membrana celular de E. coli durante a duração da expressão.

O presente invento, num aspecto, está dirigido para a provisão de um processo para a produção de variações recombinantes de Borrelia do tipo selvagem que são solúveis sem exposição a detergentes e são altamente expressas num organismo hospedeiro como a E. coli enquanto retém a reactividade específica para anticorpos contra os seus correspondentes análogos lipoproteicos de Borrelia de tipo selvagem.

presente invento está também dirigido para a provisão de um processo para a produção de uma variação recombinante da proteína A (OspA) da superfície externa de B. burgdorferi que é solúvel sem exposição a detergentes enquanto retém a reactividade específica para anticorpos contra OspA de B. burgdorferi de tipo selvagem.

presente invento, num outro aspecto, é dirigido para a provisão de uma variação recombinante da proteína A (OspA) da superfície externa de B. burgdorferi que é solúvel sem exposição a detergentes, mas que retém a reactividade específica para anticorpos contra OspA de B. burgdorferi de tipo selvagem e que não está associada com a membrana celular do hospedeiro durante a expressão, mas retém a reactividade específica para anticorpos contra a OspA de B. burgdorferi de tipo selvagem.

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-60 presente invento, para além disso, é dirigido para a provisão de uma sequência nucleotídica que é altamente expressada num organismo hospedeiro tal como E. coli e que codifica para uma variação recombinante da OspA de B. burqdorferi que é solúvel sem exposição a detergentes enquanto retém a reactividade específica para anticorpos contra OspA de B. burqdorferi de tipo selvagem.

É ainda outro objecto do presente invento proporcionar plasmídeos de ADN contendo uma sequência nucleotídica que codifica uma variação recombinante de OspA de B. burqdorferi que é solúvel sem exposição a detergentes e que não está associada com a membrana celular do hospedeiro durante a expressão, mas retém a reactividade específica para anticorpos contra OspA de B.burgdorferi de tipo selvagem.

Finalmente, é um objecto do presente invento proporcionar uma estirpe transformada de E. coli. contendo plasmídeos de ADN que contém uma sequência nucleotídica que codifica uma variação recombinante de OspA de B. burqdorferi que é solúvel sem exposição a detergentes e não está associada com a membrana celular do hospedeiro durante a expressão, mas retém a reactividade específica para anticorpos contra OspA de B. burqdorferi de tipo selvagem de comprimento total.

SUMÁRIO DO INVENTO presente invento proporciona uma variação recombinante solúvel, altamente expressada da proteína A (OspA) da superfície externa de Borrelia burqdorferi e um processo de produzir a mesma. A sequência de aminoãcidos que codifica a variação recombinante de OspA é apresentada em SEQ ID NO: 4, como abaixo apresentado.

processo para proporcionar a proteína do presente invento envolveu a produção de uma versão truncada do gene ospA da estirpe de tipo selvagem de B. burqdorferi que podia ser altamente expresso num hospedeiro recombinante para produzir um

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-7— produto solúvel. Usando um molde de ADN contendo ADN de B. burqdorferi. foram utilizados iniciadores oligonucleotídicos especialmente concebidos numa reacção em cadeia de polimerase para amplificar um segmento do gene ospA de tipo selvagem que excluiu os primeiros 17 codões que contêm uma sequência sinal da peptidase sinal II. O produto resultante da amplificação foi expresso num sistema de expressão de bacteriófago T7 utilizando técnicas de ADN recombinante conhecidas na arte.

Proporciona-se, também, um plasmídeo de ADN, pET9-OspA, contendo a sequência nucleotídica que codifica a proteína do presente invento, para além da estirpe de E. coli transformada pelo mesmo.

O processo do presente invento é igualmente aplicável à produção de variações recombinantes de outras lipoproteínas de Borrelia. desde que a lipoproteína contenha a sequência sinal necessária para a peptidase sinal II.

A proteína do presente invento é altamente vantajosa no sentido em que retém reactividade para anticorpos contra OspA de B. burqdorferi de tipo selvagem enquanto mantém propriedades de solubilidade melhoradas em relação a OspA derivada de culturas vivas ou de outras técnicas de recombinação. Esta solubilidade melhorada é particularmente vantajosa em ensaios de imunodiagnóstico bem como em manipulações em laboratório, porque a proteína é solúvel na ausência de detergentes que podem prejudicar ou destruir a reactividade.

Outra vantagem da proteína do presente invento consiste no facto de não estar associada à membrana celular do hospedeiro durante a expressão ao contrário da OspA de tipo selvagem que é expressa recombinantemente. Consequentemente, a proteína do presente invento pode ser expressa em níveis elevados usando técnicas recombinantes porque não é tão tóxica para o organismo hospedeiro como a OspA selvagem. A expressão recombinante melhorada permite níveis elevados da proteína alvo ao mesmo tempo que obvia os riscos e custos de culturas de células de Borrelia

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Mis: jc 6102-68 —8— vivas.

Uma outra vantagem do presente invento consiste no facto de ele proporcionar um processo de produção de uma variação recombinante de lipoproteínas de Borrelia altamente expressas tendo solubilidade melhorada na ausência de detergentes ao mesmo tempo que retêm a reactividade específica para anticorpos contra os seus análogos lipoproteicos de tipo selvagem. Antes do processo do presente invento eram necessários detergentes para solubilizar estas lipoproteínas para uso em imunoensaios e outras manipulações laboratoriais expondo, assim, sítios epitópicos reactivos aos efeitos potencialmente danificadores dos detergentes.

Desta forma, num aspecto lato do presente invento, proporciona-se uma proteína codificada por uma sequência de aminoácidos compreendendo uma primeira e uma segunda porções, em que a segunda porção possui uma extremidade terminal 5' e uma 3 * e compreende SEQ ID NO: 10 e em que a primeira porção está posicionada na extremidade 5' da segunda porção e consiste nos resíduos de aminoácido seleccionados a partir de pelo menos um de alanina e metionina, bem como uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos. A sequência de aminoácidos pode compreender SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8 como abaixo apresentado e a sequência nucleotídica pode compreender SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7 COffiO abaixo apresentado.

Num outro aspecto lato do invento, proporciona-se uma proteína codificada por uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10 como apresentado a seguir, bem como uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos, que pode compreender SEQ ID NO: 9.

Outros aspectos específicos do invento incluem um plasmídeo pET9 para transformação de um organismo hospedeiro compreendendo pET-OspA; uma estirpe transformada de E. coli contendo o plasmídeo pET-OspA, em que a estirpe é BL21(DE3)/pLysS,

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-9pET9-0spA; e um iniciador oligonucleotídico útil para uma amplificação de uma porção de uma sequência nucleotídica que codifica uma lipoproteína de Borrelia em que o iniciador é SEQ ID NO: 11.

Outro aspecto do invento proporciona uma versão truncada de uma sequência nucleotídica que codifica para uma lipoproteína de Borrelia. compreendendo: (a) proporcionar um molde de ADN compreendendo a sequência nucleotídica que codifica a lipoproteína de Borrelia. contendo o molde uma potencial sequência sinal de peptidase sinal II, em que a sequência sinal possui uma extremidade 5' e uma extremidade 3^Z, terminando a extremidade 3' num codão que codifica um resíduo de cisteína; e (b) sintetizar um conjunto de iniciadores oligonucleotídicos compreendendo um primeiro e um segundo iniciadores, compreendendo o primeiro iniciador uma região que é suficientemente complementar a uma primeira cadeia de ADN do ADN molde para iniciar eficazmente a amplificação da primeira cadeia de ADN na direcção de 5' para 3' e um segundo iniciador compreendendo uma região que é suficientemente complementar a uma segunda cadeia de ADN do ADN molde para iniciar eficazmente a amplificação da segunda cadeia de ADN na direcção de 5' para 3', em que o primeiro iniciador inicia a polimerização do ADN num nucleótido posicionado no ADN molde a jusante a partir do resíduo de cisteína na direcção 3'.

Um aspecto adicional do invento proporciona uma variação recombinante de uma lipoproteína de Borrelia compreendendo: (a) proporcionar um molde de ADN compreendendo a sequência nucleotídica que codifica para a referida lipoproteína de Borrelia, contendo o molde uma potencial sequência sinal de peptidase sinal II, em que a sequência sinal possui uma extremidade 5' e uma extremidade 3', terminando a extremidade 3' num codão que codifica um resíduo de cisteína; (b) sintetizar um conjunto de iniciadores oligonucleotídicos compreendendo um primeiro e um segundo iniciador compreendendo o primeiro iniciador uma região que é suficientemente complementar a uma primeira cadeia de ADN do molde de ADN para iniciar eficazmente a

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amplificação da primeira cadeia de ADN na direcção de 5' para 3⁷ e um segundo iniciador compreendendo uma região que é suficientemente complementar a uma segunda cadeia de ADN do molde de ADN para iniciar eficazmente a amplificação da segunda cadeia de ADN na direcção de 5⁷ para 3 ⁷, em que o primeiro iniciador inicia a polimerização de ADN num nucleótido posicionado no referido ADN molde a jusante do resíduo de cisteína na direcção 3⁷; (c) fazer reagir os iniciadores numa reacção em cadeia de polimerase proporcionando assim um conjunto de produtos de amplificação; (d) isolar uma versão truncada da sequência nucleotídica do conjunto dos produtos de amplificação; (e) clonar a versão truncada num vector de expressão adequado; (f) transformar um organismo hospedeiro adequado utilizando o vector de expressão; e (g) cultivar o organismo hospedeiro para a produção da variação recombinante da lipoproteína.

Para um melhor entendimento do presente invento juntamente com outros objectos posteriores, é feita referência à descrição seguinte, tomada conjuntamente com os desenhos acompanhantes e o seu âmbito será salientado nas reivindicações em apêndice.

BREVE DESCRICAO DOS DESENHOS

A Fig. 1 apresenta esquematicamente a sequência nucleotídica do iniciador oligonucleotídico 201->216.

A Fig. 2 apresenta esquematicamente a sequência nucleotídica do iniciador oligonucleotídico 958<-972.

A Fig. 3 apresenta esquematicamente a sequência nucleotídica do iniciador oligonucleotídico 151->171.

A Fig. 4 apresenta esquematicamente o gene ospA de tipo selvagem, fazendo sobressair as posições onde os iniciadores 2O1->216 e 958<-972 se ligam.

A Fig. 5 apresenta esquematicamente o gene ospA de tipo selvagem, fazendo sobressair as posições onde os iniciadores 151—>171 e 958<—972 se ligam.

A Fig. 6 apresenta o produto resultante da amplificação do gene ospA de tipo selvagem pelo iniciador 201->216 e pelo iniciador 958C-972.

A Fig. 7 é uma fotografia de um gel de agarose a um por

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cento, corado com brometo de etídio, no qual foram corridos os produtos de amplificação.

A Fig. 8 é uma representação esquemática do plasmídeo pET9.

A Fig. 9 é uma representação esquemática do plasmídeo pET9-OspA.

A Fig. 10 é uma fotografia de um gel SDS-PAGE a 12,5%, corado com azul de Comassie, no qual várias amostras de proteínas celulares foram corridas subsequentemente à remoção de indução a intervalos de tempo especificados.

A Fig. 11 é uma fotografia de um gel de SDS-PAGE no qual células não induzidas foram comparadas com células induzidas, amostradas a intervalos de uma hora após a indução.

A Fig. 12 é uma fotografia de um gel de SDS-PAGE no qual foram corridas amostras de OspA. As amostras foram colhidas em diferentes fases da purificação.

A Fig. 13 é um auto-radiograma de uma análise imunoquímica por transferência de Western, de proteínas OspA e OspB de células

B. burgdorferi completas, bem como de OspA e preOspA.

A Fig. 14 é uma fotografia de um gel de SDS-PAGE a 12,5%, corado com azul de Comassie, no qual células contendo pET9-preOspA e células contendo pET9-OspA foram comparadas com células de B. burgdorferi completas.

A Fig. 15 é um auto-radiograma do gel fotografado na Fig.

14.

A Fig. 16 é um auto-radiograma da transferência para nitrocelulose do gel fotografado na Fig. 14, antes da subsequente análise de Western.

A Fig. 17 é um auto-radiograma da transferência para nitrocelulose do gel fotografado na Fig. 14, após ter sido sondado com anticorpos.

A Fig. 18 é uma fotografia da transferência de Western completa do gel fotografado na Fig. 14 após tratamento com reagentes reveladores de cor de fosfatase alcalina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Com o propósito de um entendimento do presente invento são definidos, os seguintes termos:

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-12Bactérias são organismos procariotas que possuem uma camada protectora resistente conhecida como parede celular, sob a qual uma membrana celular encerra um compartimento citoplasmático único contendo ADN, ARN, proteínas e pequenas moléculas. Exemplos incluem as espiroquetas e Escherichia coli.

Hiperexpressão é uma expressão de nível elevado de genes clonados. A ARN-polimerase do bacteriófago T7 pode dirigir a transcrição de nível elevado a partir de um promotor de T7 num plasmídeo de cópias múltiplas, transcrevendo eficazmente quase todo o ADN ligado a um promotor de T7. Isto resulta numa expressão de nível elevado do ADN ligado.

Um plasmídeo é uma molécula de ADN circular, fechada, de cadeia dupla, independente do cromossoma e compreendendo um replicão intacto tal que o plasmídeo é replicado numa célula hospedeira. Quando o plasmídeo é colocado dentro de uma célula de um organismo unicelular as características do organismo podem ser transformadas. De entre os fenótipos conferidos por plasmídeos estão a resistência a antibióticos e a produção de enzimas de restrição e de modificação.

Iniciador refere-se a um oligonucleótido (uma cadeia curta de ácido nucleico), que é capaz de actuar como um ponto de iniciação de síntese, quando colocado sob condições nas quais a síntese de um produto de prolongamento do iniciador, que é complementar a uma cadeia de ácido nucleico, é induzida. 0 iniciador pode ocorrer naturalmente, como num digerido de restrição purificado, ou ser produzido sinteticamente.

Verificou-se agora que reestruturando o gene ospA de tipo selvagem (ver SEQ ID NO: 1) para remover os primeiros 17 codões da sequência nucleotídica produz uma sequência nucleotídica truncada que pode ser hiperexpressa num organismo hospedeiro tal como E. coli para produzir uma variação recombinante de OspA de B. burqdorferi que é solúvel sem exposição a detergentes mas retém uma reactividade selectiva para anticorpos contra OspA de B. burqdorferi de tipo selvagem. É a presença dos 17 primeiros

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-13codões que tem sido considerada responsável pelas tentativas da arte anterior para reproduzir recombinante solúvel de OspA que é altamente expressa

Mais precisamente, uma região de nucleótidos (ver SEQ ID NO: 14) aparece dentro da sequência de comando (os primeiros 17 codões no gene ospA de B. burqdorferi de tipo selvagem) codificando um sinal que desencadeia a lipidificação da proteína resultante, prejudicando assim a solubilidade e a expressão durante o processamento num hospedeiro recombinante como E. coli.

Para passar à prática o presente invento vários passos têm que ser seguidos. Outros passos podem ser adicionados, retirados ou modificados onde isso seja mencionado, para reflectir outras alternativas aplicáveis. Embora o processo do presente invento seja ilustrado em termos de construção de uma variação recombinante de OspA de Borrelia burqdorferi. o processo é também aplicável a outras lipoproteínas de Borrelia. desde que essas lipoproteínas contenham a sequência sinal necessária para a peptidase sinal II, como abaixo descrito. A produção da sequência nucleotídica truncada (ver SEQ ID NO: 3) que codifica a concretização preferida da variação recombinante de OspA (ver SEQ ID NO: 4) é normalmente proporcionada como abaixo ilustrado.

O ADN contendo o gene ospA de comprimento total de Borrelia burqdorferi de tipo selvagem (estirpe B31) foi isolado e purificado. Um conjunto de iniciadores oligonucleotídicos (ver SEQ ID NO: 11/Fig. 1 e SEQ ID NO: 12/Fig. 2) foi sintetizado para utilização na reacção em cadeia de polimerase permitindo a amplificação especificada de uma versão truncada do gene ospA sem os 17 primeiros codões proporcionando, também, sítios de restrição antes e depois da sequência de codificação do produto amplificado. Um segundo conjunto de iniciadores oligonucleotídicos (ver SEQ ID NO: 13/Fig. 3 e SEQ ID NO: 12/Fig. 2) foi também sintetizado para uso na reacção em cadeia de polimerase para permitir a amplificação específica do gene ospA de tipo selvagem completo, como um mecanismo de controlo.

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-14Os fragmentos nucleotídicos resultantes produzidos pela reacção em cadeia de polimerase foram purificados e seleccionados por análise de sítios de restrição e subsequentemente subclonados num vector plasmídico de expressão apropriado era compatível do ponto de vista dos sítios de restrição. Os plasmídeos resultantes foram então transferidos para uma estirpe hospedeira de expressão para produção da proteína.

EXEMPLO 1

Para construir a proteína do presente invento foi necessário procurar uma fonte de ADN de B.Burcrdorferi de tipo selvagem contendo a sequência de nucleotídica que codifica OspA. Este ADN serviu como molde para a amplificação do segmento desejado do gene ospA de tipo selvagem (ver SEQ ID NO: 1) durante a reacção em cadeia de polimerase. É bem conhecido na arte que o material de partida para manipulações de ADN recombinante pode ser isolado a partir de culturas do organismo de tipo selvagem de interesse ou de veículos recombinantes, tal como os plasmídeos, gue tenham sido manipulados geneticamente de modo a conter cópias clonadas do ADN alvo. A última abordagem é vantajosa na medida em que promove a homogeneidade e reduz a frequência de mutação no fragmento de ADN de interesse.

No processo preferido de produção da proteína do presente invento a fonte inicial do molde de ADN contendo o gene ospA de tipo selvagem de comprimento total foi um clone recombinante do gene ospA obtido a partir de um plasmídeo previamente construído, pTRH44. O plasmídeo pTRH44, possuindo um fragmento de restrição de 1,6-Kb contendo o gene ospA de comprimento total de B. Burqdorferi de tipo selvagem, clonado em pUC9, foi descrito anteriormente. Ver Howe, T.R. , LaQuier, F.R. e Barbour, A.G., Organization of genes encoding two outer membrane proteins of the Lyme disease agent Borrelia Burqdorferi within a single transcriptional unit Infec. Immun. 54: 207-212 (1986).

Alternativamente, o ADN total de Borrelia Burqdorferi poderia ter sido isolado e purificado por extracção com fenol ou extracção com lisozima-proteinase K-SDS de células colhidas a

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-15partir de culturas em fase estacionária, para utilização como molde de ADN. Técnicas para isolamento e purificação de molde de ADN são geralmente bem conhecidas na arte. Por exemplo, ver Howe, T.R., Mayer, L.W., & Barbour, A.G., A single recombinant plasmid expressing two major outer surface proteins of the Lyme disease spirochete, Science 227: 645-646, (1985). Para exemplos de cultura e isolamento de B. Burqdorferi ver Barbour, A.G., Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes, Yale J. Biol. Med..

57: 521-525 (1984).

Um primeiro e um segundo conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos foram sintetizados num sintetizador de ADN Microsyn 1450 (disponível em Systec, Minneapolis, Minnesota). Os produtos resultantes foram subsequentemente purificados usando cassetes de purificação Poly-Pak^R (obtidas em Glen Research Corporation, Herndon, Virgínia) de acordo com as especificações do fabricante. A síntese de ADN e as subsequentes técnicas de purificação são bem conhecidas na arte da tecnologia de ADN recombinante. Quaisquer técnicas adequadas para conseguir estes passos seriam aceitáveis.

O primeiro conjunto de iniciadores oligonucleotídicos foi projectado para a amplificação de uma sequência nucleotídica que codifica a variação recombinante de OspA de B. burqdorferi. enquanto que o segundo conjunto de iniciadores foi projectado para a amplificação do gene ospA completo de B. burqdorferi de tipo selvagem. Cada iniciador continha uma extremidade 5' e uma extremidade 3'. A extremidade 3' de cada iniciador continha uma região que possuia uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência nucleotídica específica que aparece num segmento particular do gene ospA de B. burgdorferi de tipo selvagem, presente no genoma de B. burqdorferi. Foi esta região do iniciador que foi desemparelhado/emparelhado (annealed) com o molde de ADN de B. burqdorferi para promover a polimerização durante a reacção em cadeia de polimerase. A sequência nucleotídica para o gene ospA de tipo selvagem (ver SEQ ID NO: 1) foi previamente determinada. Ver Bergstrom, S., Bundoc, V.G., & Barbour, A.G., Molecular analysis of linear plasmid-encoded

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-16major surface proteins, OspA and OspB, of the LyíffeWlisèbÈre spirochete Borrelia burqdorferi.¹¹ Mol. Microbiol.. 3: 479-486 (1989).

A extremidade 5' de cada iniciador continha uma sequência nucleotídica que era não complementar ao molde de ADN de B. burqdorferi. ao mesmo tempo que introduzia sítios de restrição nos fragmentos produzidos durante a amplificação. Foi a presença dos sítios de restrição que facilitaram a clonagem dos fragmentos resultantes num vector de expressão. O uso de sítios de restrição para facilitar a clonagem é bem conhecido na tecnologia de ADN recombinante.

primeiro conjunto de iniciadores oligonucleotídicos incluía um primeiro e um segundo iniciadores. O primeiro iniciador foi denominado iniciador 201->216 e foi sintetizado para produzir a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 11) apresentada na Fig. 1. Os números 201-216 indicam as posições de nucleótidos específicos no gene ospA de tipo selvagem de comprimento total, para o qual o iniciador era complementar. Em referência à Fig. 1, a região sublinhada indica o segmento do iniciador que era complementar ao gene ospA de tipo selvagem de comprimento total da posição 201 até à 216. Os nucleótidos que aparecem em impressão a cheio indicam um sítio de restrição reconhecido pela enzima de restrição Ndel. A barra representa o sítio onde a enzima Ndel_z posteriormente, clivou a cadeia para facilitar a clonagem num vector de expressão.

O iniciador 201->216 foi usado para reestruturar a extremidade 5⁷ do gene ospA truncado (a sequência nucleotídica que codifica a variação recombinante de OspA) proporcionando um sítio de restrição Ndel e iniciando a amplificação do gene ospA de tipo selvagem, de comprimento total, por iniciação da polimerização no 18^a codão. Na versão de tipo selvagem do gene ospA. um potencial sítio de reconhecimento para a lipoproteína peptidase sinal II ocorre entre o 16^a e o 17^a codões.

mecanismo exacto para a lipidificação da OspA de tipo

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-17selvagem, de comprimento total na espiroqueta Borrelia não é conhecido. No entanto, é agora geralmente aceite na arte que a sequência de aminoácidos Leu-x-y-Cys (em que x e y são geralmente aminoácidos diferentes possuindo cadeias laterais não polares), aparecendo na sequência de comando de certas lipoproteínas bacterianas, codifica um sinal de processamento para iniciar o processamento da proteína pela enzima bacteriana, peptidase sinal II. Esta enzima é em última análise responsável pela clivagem da porção N-terminal da sequência de comando da extremidade amino do resíduo de cisteina, deixando a cisteina N-terminal para ser ligada covalentemente a ácidos gordos que dão à restante proteína um carácter altamente lipídico após ligação. Muitas células procariotas tais como E. coli utilizam o esquema de processamento anterior para processarem e transferirem as suas próprias lipoproteínas celulares para a membrana da célula. Ver Bergstrom, S., Bundoc, V. G., e Barbour, A. G., Molecular analysis of linear plasmid-encoded major surface proteins, OspA and OspB, of the Lyme disease spirochete Borrelia burqdorferi. Mol. Microbiol. . 3: 479-486 (1989). Ver também Brandt, Μ. E., Riley, B. S., Radolf, J. D. e Norgard, Μ. V. Immunogenic integral membrane proteins of Borrelia burqdorferi are lipoproteins Infect. Immun., 58:983-991 (1990).

Embora a sequência de aminoácidos total da versão de tipo selvagem de OspA de B. burqdorferi não tenha sido confirmada por análise de aminoácidos devido a problemas inerentes à proteína, a sequência tem sido previamente prevista com base na sequência nucleotídica conhecida do gene ospA de comprimento total de B. burqdorferi (B31) de tipo selvagem. Ver Bergstrom, S., Bundoc, V. G. , e Barbour, A. G., Molecular analysis of linear plasmid-encoded major surface proteins, OspA and OspB, of the Lyme disease spirochete Borrelia burqdorferi. Mol. Microbiol.. 3: 479-486 (1989). SEQ ID NO: 2 ilustra a sequência de aminoácidos prevista do OspA de comprimento total de B. burqdorferi de tipo selvagem como previamente deduzido.

Em referência a SEQ ID NO: 2 pode observar-se que a porção de comando ou a sequência de aminoácidos contém um segmento

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-18contendo os resíduos de aminoácido consecutivos Leu-Ile-Ala-Cys (ver SEQ ID NO: 15). Estes resíduos estão em conformidade com o formato do sinal do processamento para a peptidase sinal II em E. coli. como acima mencionado. Assim, na versão de tipo selvagem do gene ospA. um sítio de reconhecimento potencial para a lipoproteína peptidase sinal II ocorre entre o 16² e o 17² codões devido à homologia de sequência entre o formato de sequência sinal conhecido para a peptidase sinal II e a sequência sinal potencial que aparece na sequência de aminoácidos prevista do OspA de comprimento total de B. burqdorferi de tipo selvagem.

Para aumentar a probabilidade de a proteína recombinante resultante não ficar lipidifiçada durante a hiperexpressão, o segmento complementar do iniciador 201->216 foi construído de modo a excluir o resíduo de cisteína e para iniciar a amplificação na porção do gene ospA de B. burqdorferi de tipo selvagem que começa no 18^a codão, de modo a eliminar completamente o sítio de reconhecimento potencial para a lipidificação. Esperou-se que a eliminação deste sítio de reconhecimento potencial aumentasse a solubilidade e melhorasse a expressão da proteína resultante sem prejudicar a reactividade específica para os anticorpos contra a OspA de B. burqdorferi de tipo selvagem.

Até ao presente invento não era conhecido se a sequência sinal potencial que aparece na sequência de aminoácidos de OspA de B. burqdorferi de tipo selvagem era responsável pela lipidificação da proteína madura. Não era também conhecido se a sequência sinal potencial estaria envolvida numa lipidificação semelhante ou uma versão recombinante da OspA de tipo selvagem produzida num hospedeiro recombinante. Era também desconhecido se a eliminação de uma porção do gene ospA de tipo selvagem contendo a sequência sinal potencial resultaria num gene ospA truncado que pudesse ser expresso eficazmente utilizando métodos recombinantes para produzir uma proteína possuindo solubilidade melhorada na ausência de detergentes enquanto retém reactividade para anticorpos contra a versão selvagem da proteína.

r·

........

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-19Está bem aceite na arte da tecnologia do ADN recombinante que quanto maior for o grau de modificação imposto a uma sequência nucleotídica de ocorrência natural que codifica uma proteína, maior se torna o risco de a proteína recombinante resultante sofrer de reactividade alterada, se for de facto expressa. De facto, tal transferência recombinante pode apresentar-se tóxica ou fatal para o organismo hospedeiro pela redução ou eliminação da expressão do produto desejado.

Em referência à Fig. 1, a construção preferida do iniciador 201->216 pedia um segmento não complementar (GCT), que codifica um resíduo de alanina, a ser posicionado entre o segmento complementar do iniciador e o sítio de restrição Ndel. 0 sítio de restrição Ndel posicionado dentro do iniciador 201->216 incluía um tripleto (ATG) que codifica metionina, um resíduo de aminoácido terminal que funciona como um sítio de iniciação durante a produção da proteína. 0 tripleto que codifica a alanina foi adicionado porque a alanina é um dos aminoácidos que facilita a remoção da metionina do produto proteico final. Outros aminoácidos adequados para facilitar a remoção da metionina serão também aceitáveis. Ver Hirel, P-H., Schmitter, J-M., Dessen, P., Fayat, G., & Blanquet, S., Extent of N-terminal methionine excision from Escherichia coli proteins is governed by the side-chain length of the penultimate aminoacid, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 86:8247-8251 (1989). É geralmente conhecido que a metionina que aparece na extremidade terminal ou numa sequência de aminoácidos com o objeetivo de iniciar a tradução não é importante para as características da proteína resultante e é usualmente removida da sequência de aminoácidos.

Na forma preferida do presente invento, a sequência de aminoácidos resultante do gene ospA truncado possuía um resíduo de alanina adicional na extremidade amino-terminal. Uma vez que os primeiros 17 codões forma eliminados da versão truncada do gene ospA. o tripleto nucleotídico que codifica o resíduo de alanina estava posicionado para preceder o tripleto nucleotídico que codifica um resíduo de lisina que estaria no 18^a codão no gene ospA de tipo selvagem. A metionina foi removida na forma

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-20madura da proteína expressa. A sequência de aminoácidos resultante com a metionina removida está ilustrada na SEQ ID NO:

6. A correspondente sequência nucleotídica é mostrada na SEQ ID NO: 5.

Alternativamente o resíduo de alanina adicional podia ter sido excluído. A sequência de aminoácidos resultante incluindo a metionina iniciadora está ilustrada na SEQ ID NO: 8. A correspondente sequência nucleotídica é mostrada na SEQ ID NO: 7. A remoção da metionina resulta na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10. A correspondente sequência nucleotídica é mostrada na SEQ ID NO: 9.

O segundo iniciador foi referido como iniciador 958<-972 e foi sintetizado para produzir a sequência (ver SEQ ID NO: 12) mostrada na Fig. 2. Em referência à Fig. 2, a região em sublinhado do iniciador indica o segmento que era complementar ao gene ospA de tipo selvagem nas posições 958 até 972 ao passo que os nucleõtidos que aparecem em impressão a cheio indicam um sítio de restrição reconhecido pela enzima de restrição BglII. A barra representa o sítio em que a enzima BglII clivou posteriormente a cadeia produzida para facilitar a clonagem num vector de expressão. Em referência à SEQ ID NO: 12, pode ser observado que a sequência total é mostrada num formato não codificante em contraste com o formato apresentado na SEQ ID NOS: 11 e 13, que correspondem ao iniciador 20l->216 e iniciador 151->171, respectivamente. 0 formato não codificante foi utilizado porque a sequência do iniciador 958<-972 é efectivamente concebida para iniciar a amplificação da cadeia sem sentido do gene ospA em vez da cadeia com sentido.

O iniciador 958<-972 era comum a ambos os conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos. No que diz respeito ao primeiro conjunto de iniciadores, o iniciador 958C-972 foi usado para reestruturar a extremidade 3^Z para o gene ospA truncado proporcionando um sítio de restrição BglII e iniciando a amplificação numa direcção antiparalela à direcção de amplificação dirigida pelo iniciador 201->216.

Λ! X......

Jc***

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-21Em referência à Fig. 4., o gene ospA de tipo selvagem está representado esquematicamente. As duas regiões de nucleótidos em sublinhado salientam as posições em que o iniciador 201->216 e o iniciador 958<-972 desemparelhou/emparelhou com o molde de ADN para promover a amplificação. As pontas das setas denotam a direcção da polimerização iniciada pelo iniciador desemparelhou/emparelhou na posição indicada.

segundo conjunto de iniciadores oligonucleotídicos, concebidos para a amplificação do gene ospA completo de B. burgdorferi de tipo selvagem como controlo, incluiu também um primeiro e um segundo iniciador. O primeiro iniciador foi referido como iniciador 151->171 e foi sintetizado para produzir a sequência nucleotídica (ver SEQ ID NO: 13) mostrada na Fig. 3. Em referência à Fig. 13, a região a sublinhado indica o segmento do iniciador que era complementar ao gene ospA de tipo selvagem nas posições 151 a 171. Os nucleótidos que aparecem impressos a cheio indicam um sítio de restrição reconhecido pela enzima de restrição Ndel. A barra indica o sítio onde a enzima Ndel mais tarde clivou a cadeia do produto para facilitar a clonagem no vector de expressão.

O segundo iniciador, o iniciador 958<-972, era comum a ambos os conjuntos de oligonuleótidos como previamente mencionado. No que diz respeito ao segundo conjunto de iniciadores, o iniciador 958C-972 introduziu um sítio de restrição BglII e iniciou a amplificação do gene ospA de tipo selvagem numa direcção antiparalela à direcção da amplificação diridida pelo iniciador 151->171.

Em referência à Fig. 5, o gene ospA de tipo selvagem está representado esquematicamente. As duas regiões de nucleótidos em sublinhado salientam as posições em que o iniciador 151->171 e o iniciador 958<-972 desemparelhou/emparelhou com o molde de ADN para promover a amplificação. As pontas das setas indicam a direcção da polimerização iniciada pelo iniciador que se ligou na posição indicada.

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-22A Fig. 6 é uma ilustração esquemática do produto resultante da amplificação da versão truncada do gene ospA a partir do gene ospA de tipo selvagem pelo iniciador 201->216 e pelo iniciador 958C-972. A impressão a cheio refere os sítios de restrição proporcionados pelos iniciadores ao passo que as regiões a sublinhado indicam a secção do iniciador desemparelha/emparelha com o gene ospA de tipo selvagem antes da amplificação.

Os métodos básicos para amplificação de uma sequência de ácidos nucleicos desejada utilizando iniciadores oligonucleotídicos são geralmente conhecidos na arte e estão ilustrados na Patente E.U.A. N^s 4 683 202 de Mullis e Patente E.U.A. N^B 4 800 159 de Mullis, et al._r ambas aqui incorporadas para referência. Para informação adicional respeitante a técnicas de clonagem, ver Maniatis, T., Fritsch, E.F., & Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, N.Y. (1982). Ver também Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. , & Struhl, K., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1989).

Utilizando os iniciadores 151->171, 201->216 e 958C-972, foram realizadas amplificações por reacção de polimerase em volumes de reacção de 50 μΐ contendo uma unidade de ADN-polimerase de AmpliTaq (obtida em Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT), cada iniciador a 1 μΜ e aproximadamente 0,1 Mg de molde de ADN. A mistura de reacção continha também Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), KC1 50 mM, MgCl₂ 1,5 mM, 0,05% de Tween 20, 0,05% de Nonedet P-40, dATP 0,26 mM, dTTP 0,26 mM, dCTP 0,14 mM e dGTP 0,14 mM.

No processo de amplificação preferido, a concentração de dNTP usada reflectia o teor conhecido em bases de ADN de 29% de G+C para B. burcrdor feri para eliminar a possibilidade de mutações indesejáveis. Ver Schmid, G.P., Steigerwalt, A.G., Johnson, S., Barbour, A.G., Steere, A.C., Robinson, I.M. e Brenner, D.J., DNA characterization of Lyme disease spirochetes, Yale J. Biol. Med.. 57: 539-542 (1984).

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Antes da amplificação, a reacção foi coberta com óleo mineral e a amplificação foi realizada durante 25 ciclos num DNA Thermal Cycler (obtido em Perkin-Elmer Cetus, Minneapolis, MN) consistindo cada ciclo de 1 min a 94 °C, 1 min a 47 C e 3 min a 72 °C. A amplificação foi completada por uma incubação final de 10 min a 72 °C. Os produtos amplificados foram extractados com fenol, precipitados com etanol, clivados com as enzimas de restrição apropriadas e, então, purificados por electroforese em geles de agarose de baixo ponto de fusão a 1% (obtido em Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD). Outras técnicas conhecidas na arte para a purificação de produtos de ADN amplificados, tais como a electroforese em geles de acrilamida, seriam aceitáveis. É bem conhecido na arte que os produtos amplificados devem ser purificados e tratados com as enzimas de restrição apropriadas (Ndel e BglII para o presente exemplo) antes que a expressão possa ser iniciada.

Os produtos de amplificação foram corridos num gel de agarose a 1%, corados com brometo de etídio e fotografados com iluminação UV. Em referência à Fig. 7, as Faixas 1, 6 e 11 continham ADN de T7 digerido com HaelI como marcador de comprimento molecular. Os tamanhos estão em quilo-pares de bases (Kbp). As Faixas 2, 4, 7 e 9 contêm 1/5 do volume dos produtos das reacções com o ADN total de B. burgdorferi ao passo que as Faixas 3, 5, 8 e 10 contêm 1/50 do volume de mistura de reacção resultante da amplificação utilizando o plasmídeo pTRH44 como molde. As amostras aplicadas foram originadas utilizando iniciadores que amplificam a sequência inteira que codifica ospA (Faixas 2, 3, 7 e 8) ou a região que começa em Lys^ (Faixas 4, 5, 9 e 10). Como se mostra nas Faixas 7-10, o ADN amplificado pode ser cortado com EcoRI para dar produtos com as mobilidades esperadas para a clivagem no sítio único EcoRI em ospA (662 + 182, e 623 + 182 bp, respectivamente).

EXEMPLO 2

Para expressar a versão amplificada do gene ospA truncado bem como a versão amplificada do gene ospA de comprimento total, de tipo selvagem, os fragmentos de ADN resultantes da

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-24amplificação pela reacção em cadeia de polimerase, foram finalmente clonados num vector plasmídico para a produção de proteína. 0 vector plasmídico preferido para a produção de proteína no presente invento foi o pET9 em que o gene ospA foi colocado sob o controlo de um promotor de T7 e sinais de iniciação de tradução eficazes do bacteriófago T7. Os vectores de expressão pET9 e pLysS, os hospedeiros bacterianos para clonagem, os meios de crescimento e os processos utilizados para dirigir a expressão dos genes clonados pela ARN-polimerase de T7 foram previamente descritos. Ver Studier, F.W., Rosenberg, A.H. , Dunn, J.J. & Dubendorff, J. W., Meth. Enzymol., Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, 185: 60-89 (1990). A clonagem e expressão do gene para a ARN-polimerase de bacteriófago T7 é também apresentada na Patente U.S. N² 4 952 496 para Studier, et al.. aqui incorporada por referência. Embora o sistema do promotor T7 seja o sistema de expressão preferido no presente invento, a expressão da versão truncada do gene ospA não é para ser tão limitada no que diz respeito ao formato da expressão, desde que o sistema de expressão escolhido seja compatível com o organismo hospedeiro.

Os plasmídeos resultantes foram designados como pET9-preOspA, referindo os plasmídeos que receberam o fragmento de ADN amplificado que codifica a OspA de tipo selvagem de comprimento total utilizada como controlo, e pET9-OspA referindo os plasmídeos que receberam o produto de ADN amplificado que codifica a variação recombinante de OspA.

Na forma preferida do presente invento, o vector pET9 foi utilizado uma vez que possuía um gene kan como o seu marcador selectivo em vez de um gene bla. Consequentemente, a ampicilina não é utilizada durante o crescimento celular e, desta forma, não existe possibilidade de formação de um conjugado imunogénico de ampiciloil/proteína alvo OspA. Crê-se que conjugados deste tipo sejam as determinantes antigénicas principais na alergia à penicilina e a sua presença pode complicar estudos imunológicos projectados. Ver Υνοη, Μ. , Anglade, P., & Wal, J-M. ,

Identification of the binding sites of benzyl penicilloyl, the

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-25allergenic metabolite of penicillin, on the serum albumin molecule, FEBS. 263 : 237-240 (1990 ). Uma representação esquemática dos plasmídeos pET9 e pET9-OspA é mostrada nas Figs. 8 e 9, respectivamente.

Os plasmídeos pET9-preOspA e pET9-OspA foram inicialmente clonados em DH5a, um hospedeiro que não possui a ARN-polimerase de T7. A expressão de fundo é mínima neste hospedeiro uma vez que a ARN-polimerase bacteriana não inicia a partir do promotor de T7. Em princípio, os plasmídeos recombinantes estáveis podem ser estabelecidos neste hospedeiro mesmo se o produto do gene alvo for tóxico para E. coli. A correcção dos plasmídeos resultantes foi confirmada pela análise de sítios de restrição extensiva e sequenciação didesoxi comum das sequências codificantes completas de ospA.

Embora os iniciadores aqui utilizados fossem concebidos especificamente para amplificar certos segmentos da sequência ospA de tipo selvagem a partir de ADN total de B. burqdorferi. por razões práticas e devido ao aumento da probabilidade de mutação com o número de ciclos de amplificação, os plasmídeos utilizados no presente invento foram construídos utilizando fragmentos Ndel/BglII obtidos a partir de reacções contendo o plasmídeo ospA. pTRH44, como um molde de ADN. Subsequentemente, os 824 e 779 bp resultantes dos fragmentos Ndel/BglII a partir de cada reacção foram subclonados separadamente no vector de expressão de T7 pET9 que foi digerido com Ndel e BamHI, desfosforilado e purificado por electroforeses em geles de baixo ponto de fusão a 1%. O plasmídeo pTRH44 possuindo um fragmento de restrição de 1,6 kb contendo o gene ospA de tipo selvagem, de comprimento total, clonado em pUC9 foi previamente descrito. Ver Hows, T.R., LaQuier, F.R. & Barbour, A.G., Organization of genes encoding two outer membrane proteins of the Lyme disease agent Borrelia burqdorferi within a single transcriptional unit, Infect. Immun.. 54: 207-212 (1986).

Em referência às Figs. 8 e 9, a digestão dos ADNs amplificados com Ndel/BglII e a subsequente ligação em pET9

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-26digerido com Ndel/BamHI produziram pET9-preOspA e pET9-OspA, que possuem 5127 e 5082 bp, respectivamente. 01O-S1O representa o promotor ¢10 para a ARN-polimerase do bacteriófago T7 e a ligação ao ribossoma e o sítio de tradução para o gene 10 de T7. Τφ é o sinal de terminação de transcrição para a ARN-polimerase de T7.

EXEMPLO 3

Para a produção de proteína, os plasmídeos foram transferidos para a estirpe de expressão BL21(DE3)/pLysS, uma estirpe hospedeira que contém uma cópia cromossómica do gene para a ARN-polimerase de T7, sob controlo do promotor indutível lacUV5 e um plasmídeo baseado no pACYC184, pLysS, que especifica baixos níveis de lisozima de T7, um inibidor natural da ARN-polimerase de T7. Para informação adicional, ver Moffatt, B.A., & Studier, F.W., T7 Lysozyme inhibits transcription by T7 RNA polimerase, ’’ Cell, 49: 221-227 (1987). Em células não induzidas, a lisozima reduz a actividade basal da ARN-polimerase de T7 e aumenta o leque de genes alvo que podem ser mantidos com estabilidade no hospedeiro de expressão.

Culturas de BL21(DE3)/pLysS comportando diferentes plasmídeos foram desenvolvidas até uma fase média de crescimento logarítmico, e uma porção de cada uma foi induzida com IPTG. Por indução, o plasmídeo pET9-pre0spA revelou produzir quantidades relativamente pequenas de proteína indutível que, a partir de análises em geles de SDS-poliacrilamida, era muito semelhante, em mobilidade, à proteína OspA de tipo selvagem presente nos extractos totais de B. burgdorferi. Em referência à Fig. 10, removeram-se amostras (1,5-μ1) para análise por em SDS-12,5%-PAGE nos tempos abaixo indicados. As proteínas foram visualizadas por coloração com azul de Comassie. As faixas 1, 5 e 9 correspondem às células de B. burgdorferi completas (5 x 10⁷ células) ao passo que as faixas 2, 3 e 4 correspondem ao pET9-preOspA induzido para 1, 3 ou 18 horas. As faixas 6, 7 e 8 correspondem ao pET9-OspA induzido para 1, 3 ou 18 horas. A posição dos marcadores de massa molecular (94, 67, 43, 30 e 20) está representada. As massas moleculares das proteínas estão em kilodaltons.

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-27Realizaram-se experiências de impulso-expulsão (pulse-chase) para mostrar que a síntese ou a proteína preOspA causavam, uma a duas horas após a indução, um resultado que implicava que a proteína fosse tóxica para E. coli. Em contraste, uma taxa de expressão muito mais elevada e sustida foi observada quando o pET9-OspA foi induzido.

A Fig. 11 mostra a indução da variação recombinante de OspA seguida por SDS-PAGE. A faixa l foi carregada com células completas, não induzidas, BL21(DE3)/pLysS, pET9-OspA. As faixas 2-7 foram carregadas com células completas recolhidas com intervalos de uma hora após indução. A faixa 8 continha marcadores de massa molecular. A Fig. 12 mostra a SDS-PAGE da versão recombinante de OspA em diferentes fases de purificação como se segue: Faixa 1, marcadores de massa molecular; Faixa 2, extracto bruto anterior à centrifugação; Faixa 3, extracto bruto após centrifugação; Faixa 4, produto da passagem através de Sepharose Q; Faixa 5, fracção de gradiente de Sepharose S; e Faixa 6, fracção de hidroxilapatite. As Faixas 2-6 contêm cada uma 0,01% da proteína total presente em cada fracção. As proteínas foram analisadas num gel de gradiente de 10-20% de acrilamida. A análise por transferência de Western com dois anticorpos monoclonais, H5332 e H3TS, que se sabia reconhecerem diferentes epitopos dentro da OspA de tipo selvagem, foi também efectuada para verificar que estas bandas continham sequências OspA autênticas. Ver Brandt, M.E., Riley, B.S., Radolf, J.D. e Norgard, M.V., Immunogenic integral membrane proteins of Borrelia burgdorferi are lipoproteins, Infec. Immun.. 58:983-991 (1990). Ver também Howe, T.R., Mayer, L.W. e Barbour, A.G., A single recombinant plasmid expressing two major outer surface proteins of the Lyme disease spirochete, Science 227: 645-646 (1985).

Novamente em referência à Fig. 10, a proteína dirigida a pET9-OspA era notoriamente menor do que a produzida por pET9-pre0spA, embora se esperasse que ambas as proteínas contivessem aproximadamente o mesmo número de resíduos de aminoácido após processamento para remover a sequência de 17

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-28Mis: jc 6102-68 resíduos de comprimento no caso de OspA selvagem, ou somente a metionina de iniciação da variação recombinante de OspA. A explicação mais verosímil para a diferença era que a presença de lípidos N-terminais, ligados covalentemente, fazia diminuir a mobilidade do produto de pET9-preOspA processado. Em alguns geles (ver Fig. 13 por exemplo) o produto de preOspA migrou como duas bandas muito próximas, diferenciadas, que podem ter representado intermediários do processamento. Este resultado sugeriu que as formas processadas e precursora desta proteína possuem mobilidades semelhantes em SDS-PAGE a uma dimensão.

EXEMPLO 4

De modo a determinar a localização subcelular, uma cultura de 20 ml de BL21(DE3)/pLysS, pET9-preOspA foi recolhida 3 \ horas depois da indução com IPTG, por centrifugação a 8 000 rpm. 0 precipitado foi suspenso em 10 ml de mistura contendo Tris-HCl 20 mM, (pH 8,0), NaCl 20 mM e EDTA 2 mM. As células foram subsequentemente lisadas por congelamento e descongelamento. O lisado foi tratado com DNase e Mg⁺⁺, depois foi sedimentado durante 90 minutos a 33 000 rpm. A fracção do precipitado foi ressuspensa em 5 ml de uma mistura contendo sacarose 0,25 M, Tris-HCl 3,3 mM (pH 8,0), DTT 1 mM e EDTA 1 mM. A ressuspensão foi reprecipitada durante 1 hora a 50 000 rpm. 0 precipitado foi ressuspenso em 1 ml de sacarose a 25% (p/p), EDTA 5 mM e DTT 1 mM e subsequentemente colocado em camadas num gradiente descontínuo de sacarose. A centrifugação foi efectuada a 30 000 rpm durante 16 horas a 4 °C. Após centrifugação, foram recolhidas fracções de 0,5ml e foram analisadas amostras de 20 μΐ por SDS-PAGE e transferência de Western. A região da membrana externa do gradiente foi determinado pela sua reactividade com anticorpo para OmpA, um componente bem caracterizado da membrana externa de E. coli. Ver Zimmerman, R. , e Wickner, W., Energetics and intermediates of the assembly of protein OmpA into the outer membrane of Escherichia coli. J. Biol. Chem.. 258: 3920-3925 (1983).

Quase toda a OspA de tipo selvagem, de comprimento total, resultante de pET9-pre0spA foi recuperada na fracção do

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-29precipitado a baixa velocidade do lisado das células congeladas-descongeladas. O precipitado foi fraccionado em membranas externas e internas por centrifugação através de gradientes descontínuos de sacarose. A maior parte da proteína foi encontrada em fracções enriquecidas em componentes de membranas internas.

Estudos adicionais mostraram que este derivado recombinante, versão de tipo selvagem, da OspA apenas podia ser extraída sob condições conhecidas na arte que solubilizam selectivamente a membrana interna de E. coli. Estas condições requeriam o tratamento da fracção proteica com com um detergente como o Triton x-100 ou o N-laurilsarcosinato de sódio, por exemplo, ver Forst, S., Delgado, J., Ramakrishnan, G., & Inuoye, Μ. , Regulation of ompC and ompF expression in Escherichia coli in the absence of envZ, J. Bacteriol., 170: 5080-5085 (1988). Por outro lado, o produto de pET9-OspA, no entanto, é solúvel na ausência de qualquer detergente (> 50 mg/ml) e quantidades significativas desta variação recombinante de OspA (> 50% da proteína celular total) podem ser produzidas a partir deste plasmídeo várias horas após indução com IPTG (ver Fig. 11). Quando a indução de pET9-0spA continuou por mais de 6 horas, as células começavam a lisar e eventualmente todo o produto foi encontrado no sobrenadante da cultura.

EXEMPLO 5

De modo a purificar a variação recombinante de OspA, foi utilizado um procedimento de três passos. Uma cultura de 500 ml de E. coli BL21(DE3)/pLysS contendo pET9-OspA foi desenvolvida com agitação em balões de 2 1, a 37 °C, em caldo de triptona suplementado com sais M9, 0,4% de glucose, 25 gg/ml de cloramfenicol e 25 Mg/ml de sulfato de canamicina até a D.0. ter atingido 0,6, ponto em que foi adicionado IPTG para uma concentração final de 0,5 mM. Adicionaram-se mais 100 Mg/ml de canamicina ao mesmo tempo que o IPTG para prevenir o sobrecrescimento da cultura por quaisquer células que possam ter perdido o plasmídeo. Seis horas mais tarde, as células foram recolhidas por centrifugação e ressuspensas em 25-30 ml de tampão

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-30Mis: jc 6102-68 fosfato de sódio 20 mM (pH 7,7) e armazenados a -20 °C. 0 extracto bruto foi preparado por descongelamento, a 4 °C, das células ressuspensas, o que permite que a lisozima codificada pelo pLysS lise eficientemente as células. Isto foi seguido pela adição de MgCl₂ e DNase (concentrações finais de 2,5 mM e 5 gg/ml, respectivamente). Após 30 minutos, a 4 °C, os detritos celulares foram removidos por centrifugação (15 min, 15 OOOg). 0 precipitado resultante foi extractado com 10 ml de tampão fosfato de sódio 10 mM (pH 7,7) contendo NaCl 10 mM (tampão A). Após centrifugação, os sobrenadantes foram combinados para produzir aproximadamente 40 ml de extracto bruto.

o extracto bruto foi aplicado à temperatura ambiente a um leito pré-empacotado de 25 ml de Sepharose Q Fast Flow que tinha sido equilibrada com um tampão A. A coluna foi eluída com 50 ml de tampão A. Essencialmente toda a proteína alvo foi recuperada no tampão de eluição. As fracções contendo proteína alvo foram dialisadas durante a noite a 4 °C versus 2 mudançasx2-litros de tampão fosfato de sódio 10 mM (pH 6,0) contendo NaCl 5 mM (tampão B), clarificado por centrifugação a 10 OOOg e posteriormente aplicado à temperatura ambiente a uma coluna de 20 x 1,5 cm de Sepharose S Fast Flow equilibrada com tampão B. Após lavagem da coluna com 100 ml de tampão B para remover proteínas não ligadas e contaminantes que absorvem fortemente a 260 nm, a proteína alvo k ligada foi eluída com um gradiente linear de 300 ml de NaCl 0-100 mM em tampão B, tendo a eluição da proteína alvo ocorrido a cerca de NaCl 35 mM. A Sepharose Q Fast Flow e a Sepharose S Fast Flow foram obtidas em Pharmacia, Piscataway, NJ.

As fracções combinadas da proteína alvo resultantes do passo da Sepharose S foram conseguidas num leito de 20 ml de Bio-Gel HTP hidroxilapatite previamente equilibrado com tampão B. A coluna foi operada à temperatura ambiente e foi lavada com 50 ml de tampão B. A proteína foi eluída com um gradiente linear de 300 ml de fosfato de sódio 100-400 mM (pH 6,0). As fracções contendo a proteína alvo, que elui a um pico largo entre fosfato de sódio 150-300 mM, foram combinadas e concentradas numa célula de ultrafiltração até um volume final de 5 ml. A solução de proteína

472

Mis: jc 6102-68

-31concentrada foi dialisada contra fosfato de sódio 10 mM (pH 6,0), NaCl 50 mM (tampão D) e armazenada a 4 ⁰C. A Bio-Gel HTP hidroxiapatite foi adquirida em Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA.

processo anterior para a purificação do produto proteína recombinante é meramente ilustrativo de uma abordagem adequada para purificar a proteína do presente invento. Outras técnicas adequadas conhecidas na arte poderiam, alternativamente, ter sido empregues para a purificação. Por exemplo, a fracção de Sepharose S pode ser concentrada e aplicada a uma coluna de Sephacryl S-200 (obtida em Pharmacia, Piscataway, NJ.) ou outras matrizes adequadas de filtração por gel.

rendimento resultante foi de 60-70 mg de variação recombinante de OspA produzida a partir de 500 ml de cultura inicial. Em referência à Fig. 11, este rendimento total é de aproximadamente 50% como julgado a partir da SDS-PAGE das fracções individuais, indicando boa hiperexpressão da versão truncada do gene ospA em E. coli.

EXEMPLO 6

Amostras de proteína de variação recombinante de OspA foram analizadas por electroforese em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes. Para a técnica ver Studier, F.W., Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels, J. Mol. Biol., 79: 237-248 (1973). Os geles foram fixados e corados com azul de Coomassie ou as proteínas separadas foram transferidas electroforeticamente para membranas de nitrocelulose e sondadas com proteína A marcada com ¹²⁵I para imunoglobulina ligada. Ver Barbour, A.G., Biology of the Borrelia species, Yale J. Biol. Med.. 57: 581-586 (1984). A proteína A marcada com 125]- (5 x io 5 cpm/mi) f_oi obtida em DuPont-New England Nuclear.

Em alguns casos, as membranas de nitrocelulose foram bloqueadas com 3% de gelatina em Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 500 mM (TBS) durante um mínimo de uma hora e posteriormente lavadas com TBS contendo 0,05% de Tween 20 (TTBS) antes da

472

Mis: jc 6102-68

-32reacção com o anticorpo. Após remoção do anticorpo não ligado com várias lavagens em TTBS, as proteínas reactivas foram detectadas utilizando um anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com fosfatase alcalina, purificado por afinidade, e reagentes de revelação de cor da fosfatase alcalina.

A massa molecular nativa de OspA foi determinada por cromatografia da proteína purificada em tampão A contendo NaCl 200 mM a um caudal de 1,5 ml/min numa coluna calibrada de Sephacryl S-200 de 2,5 x 120 cm a 4 °C. Vinte resíduos de aminoácido correspondendo à sequência nucleotídica N-terminal foram determinados utilizando o procedimento de degradação de Edman num Applied Biosystems 470A Microsequencer. A sequenciação amino-terminal dos vinte primeiros resíduos da variação recombinante da OspA resultou numa sequência idêntica à prevista a partir da sequência de ADN após processamento para remover o primeiro resíduo de metionina. O coeficiente de extinção molar da proteína foi calculado a partir do conhecimento da sua composição em aminoácidos a partir da equação nat ⁼ (^^snat^ (^EM,Gdn.HCl)/í^^bsGdn.HCl)· ^{Ver Gil1}' ^s-^c·' ^{& von} Hippel, P.H. , Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data,” Anal. Biochem.. 182: 319-326 (1989). O coeficiente de extinção molar resultante (E₂go) f°i 10,59 x 10^ M”¹. Este valor revelou-se em excelente acordo (+ 5%) com aquele obtido a partir da análise da composição em aminoácidos dos hidrolisados de ácido, derivados da variação recombinante de OspA, tal como sendo consistente com as figuras relativas à produção de proteína resultante.

EXEMPLO 7

A reactividade da variação recombinante de OspA foi testada contra anticorpos humanos para a OspA de tipo selvagem. Soros de pacientes com a doença de Lyme contêm anticorpos para várias proteínas de membrana externa de B. burqdorferi. incluindo OspA. Fluido sinovial reactivo de pacientes com artrite relacionada com a doença de Lyme crónica e anticorpos H3TS específicos para OspA foram previamente descritos. Ver Barbour, A.G., Burgdorfer, W., Grunwaldt, E., e Steere, A.C., Antibodies of patients with Lyme

472

Mis: jc 6102-68

-33 — disease to components of the Ixodes dammini spirochete,” J. Clin. Invest.. 72: 504-515 (1983). Ver também Barbour, A.G., Heiland, R.A. , & Howe, T.R. , ”Heterogeneity of major proteins in Lyme disease borrelia: a molecular analysis of North American and European isolates, J. Infect. Dis., 152: 478-484 (1985).

Em referência à Fig. 13, anticorpos presentes no fluído sinovial de um paciente com artrite relacionada com a doença de Lyme reagiram fortemente em transferências de Western com as proteínas OspA e OspB de tipo selvagem de 31 kDa e 34 kDa de B. burgdorferi. Além disso, ambas as formas de OspA sintetizadas em E. coli (a variação recombinante de OspA, bem como a versão selvagem de comprimento total ou OspA sintetizado como controlo) também reagiram fortemente.

Novamente em referência à Fig. 13, a Faixa 1 continha lisados de células completas (2 x 10⁶ células) de espiroquetas de B. burgdorferi (B31) ao passo que as Faixas 2-4 continham células de E. coli induzidas. A Faixa 5 continha a variação recombinante de OspA purificada (0,5 ^g). As amostras aplicadas às Faixas 2-5 derivaram de células (6 μΐ) contendo o vector plasmídico pET9, pET9-preOspA ou pET9-OspA, respectivamente, 3 horas após indução. Proteínas separadas por SDS-12,5% PAGE foram transferidas para nitrocelulose, bloqueadas durante a noite em 2% de albumina de soro bovino e posteriormente feitas reagir com fluido sinovial de um doente com doença de Lyme. As transferências foram lavadas, incubadas com proteína A marcada com 125]- _e posteriormente expostas a um filme para autorradiografia. As posições para OspA e OspB de B. burgdorferi de tipo selvagem estão indicadas.

Embora os resultados mostrem que ambos os plasmídeos expressam proteína OspA imunoreactiva, a proteína expressa de pET9-preOspA pareceu reagir mais fortemente do que uma quantidade equivalente de proteína produzida a partir de pET9-OspA. Resultados semelhantes foram obtidos quando foi utilizado Immobilon ™, uma membrana baseada em difluoreto de polivinilideno hidrofóbico, como fase sólida para a transferência das proteínas. Foi postulado que esta diferença aparente em

472

Mis: jc 6102-68

-34reactividade pode ter sido causada por uma transferência mais pobre ou por uma retenção da variação recombinante de OspA na membrana de nitrocelulose. A teoria anterior foi subsequentemente testada por marcação de culturas induzidas com [³^S]-metionina obtida em DuPont-New England Nuclear/actividade específica = 1165 Ci/mmol.). Autorradiografia foi usada para seguir as quantidades relativas de OspA de tipo selvagem bem como da variação recombinante de OspA presentes durante cada passo da análise por transferência de Western.

Culturas de células BL21(DE3)/pLysS contendo pET9-preOspA ou pET9-0spA foram desenvolvidas, a 37 °C, até uma fase média do crescimento logarítmico em meio M9 e induzidas com IPTG. Uma hora mais tarde cada cultura foi marcada com 20 μΟϊ/πιΙ de [³⁵S]-metionina durante 5 minutos e porções de 10 μΐ foram analizadas após electroforese em geles a 12,5%. Em referência às Figs. 14 a 18, a Faixa 1 em cada painel continha células completas não marcadas de B. burqdorferi (5 χ 10⁷ células). As Faixas 2 e 3 continham células marcadas induzidas contendo pET9-preOspA ou pET9-OspA, respectivamente. As proteínas foram visualizadas por coloração com azul Coomassie como apresentado na Fig. 14 e por autorradiografia do gel como apresentado na Fig. 15. Nas Figs. 16 e 17, as proteínas são visualizadas após transferência electroforética para papel de nitrocelulose. A Fig. 16 apresenta um autoradiograma da nitrocelulose antes de posterior análise de Western. A Fig. 17 apresenta um autorradiograma após sondagem com anticorpos. A Fig. 18 apresenta uma fotografia da transferência de Western completa, após tratamento com reagentes de revelação de cor para a fosfatase alcalina. As setas a cheio apontam para a variação recombinante de OspA bem como para as proteínas de pET9-preOspA apresentadas nas Faixas 1 e 2, respectivamente. As setas a tracejado indicam a posição do produto proteína de pET9-OspA que aparece na Faixa 3.

Em referência agora às Figs. 14 a 18, é evidente que as quantidades relativas de OspA de tipo selvagem e a variação recombinante de OspA se alteraram durante o processo de transferência. A quantidade da variação recombinante de OspA que

472

Mis: jc 6102-68

-35permaneceu após a transferência foi sondada com anticorpos e subsequentemente lavada, foi consideravelmente reduzida relativamente à quantidade inicialmente transferida. Em contraste a versão de tipo selvagem de OspA foi bem retida durante cada passo. Os resultados demonstraram que a diferença aparente de reactividade das duas formas OspA (a variação recombinante e a versão de tipo selvagem) foi principalmente devida a uma perda selectiva da variação recombinante de OspA altamente solúvel, durante a análise de transferência de Western.

CONCLUSÕES E SUMÁRIO DOS RESULTADOS Embora o processo anterior de produção de uma versão recombinante de uma proteína fosse dirigido à proteína A da superfície externa de Borrelia burqdorferi. o processo é igualmente aplicável a outras lipoproteínas de Borrelia. desde que a sequência sinal para a peptidase sinal II apareça no gene que codifica para a proteína em questão.

A versão truncada do gene OspA era um excelente sobreprodutor devido à sua falta de associação com a membrana celular do organismo hospedeiro. A variação recombinante de OspA resultante constituiu mais do gue 50% da proteína celular total após algumas horas de indução. Ver exemplos 4, 5 e 6. Para álem disso, a variação recombinante de OspA não é lipidifiçada e é altamente solúvel (> 50 mg/ml) na ausência de detergentes. Ver exemplo 4. Além disso, 60-70 mg de proteína pura é conseguida a partir de tão pouco como 0,5 litros de cultura inicial, após um simples procedimento de purificação devido à boa hiperexpressão no organismo hospedeiro. Ver exemplos 5 e 6. Transferências de Western da variação recombinante de OspA mostraram que ela retinha sítios epitópicos imunoreactivos. Ver exemplos 3 e 7. Esta reactividade em conjunto com o elevado grau de pureza e as características de solubilidade da proteína do presente invento fazem dela uma boa candidata para um agente de diagnóstico para detectar a presença da doença de Lyme em isolados clínicos bem como um potencial imunogénio para uma vacina contra B. burqdorferi.

472

Mis: jc 6102-68

-36Embora as concretizações ilustrativas do presente invento tenham sido aqui descritas em referência aos esquemas acompanhantes, deve ser compreendido que o invento não é limitado a estas concretizações precisas, e que várias outras alterações e modificações podem ser aqui efectuadas por um perito na arte sem sair do âmbito ou espírito do invento.

472

Mis: jc 6102-68

-37(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1 (i) Caracteristicas da Sequência (A) Comprimento: 822 Bases (B) Tipo: Ácido nucleico (C) Tipo de Cadeia: Cadeia dupla (D) Topologia: Linear (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NO: 1 :

ATC i

AAA ,

AAA

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TTA

TTG

GGA

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GGT

CTA ,

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TTA

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48

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TTG

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GAA

AAA

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144

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AAA

GTA

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TCT

GAC

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GAA

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336

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384

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432

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472

Mis: jc 6102-68

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A»n

Ala

ltu

260

265

270

AAA TAA 822 ly» (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2 : (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 273 Aminoácidos (B) Tipo: Aminoácido (D) Topologia: Linear

Descrição	da Sequência: SEQ	ID	NO:	2 :
Hat lys 1	Ly» Tyr leu Leu Gly Ile Gly 5	leu 10	lie Leu	Ala lau Ile Ala 15
Cya lya	Gin Aan Val Ser Str lau Aap 20 25	Glu	Lys Asn	Ser Val Sar Val 30
Asp lau	Pre Gly Clu Hat lya Val Leu 35 40	Val	Ser lya	Glu lya Asn Lys 45
Aap Gly 50	Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr 55	Val	Asp Lys 60	Leu Glu leu Lys

Gly 65

Thr

Sar

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iy»

A»n 70

Ain

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90 95

Thr Thr Ltu Gtu Vai Phe ly» Glu Aip Gly Lya Thr leu Vai Ser t_n 100 105 110

472

Mis: jc 6102-68

Lye	vai	Thr Ser 115	-39-	fr·.·	>*< LlU
Lya	Aap Lya Ser Ser Thr Glu Glu Ly<>
120	125
Lya	eiy	Glu Vai	Ser	Glu Lye Ile ll· Thr	Arg Ala Aap	ciy	Thr Arg
	130			135	140
Leu	Glu	Tyr Thr	oiy	1le Lya Ser Atp Gly	Ser Gly Lya	Ala	Lyt Glu
145				150	155		160
Vai	Leu	Lya Gly	Tyr	vel Leu Glu Gly Thr	Leu Thr Ala	Glu	Lyt Thr
			165	170			175
Thr	Leu	Vai Vai	Lyt	Glu Gly Thr Vai Thr	Leu Ser Lys	Atn	lie Ser
		ISO		185		190
Lyt	Ser	Gly Glu	vel	Ser Vai Glu Leu Atn	Atp Thr Atp	Sar	Ser Ala
		195		200	205
Ala	Thr	Lyt Lyt	Thr	Ala Ala Trp Atn Ser	Gly Thr Ser	Ihr	Leu Thr
	210			215	220
1 le	Thr	Vai Atn	Ser	LVi Lyt Thr Lys Asp	Leu Vat Phe	Thr	Lys Glu
Z25				230	235		240
Aan	Thr	II· Thr	Vel	Gin Gin Tyr Atp Ser	Aan Gly Thr	lya	Leu Glu
			245	250			255
Gly	Ser	Ala Vai	Glu	1le Thr Lyt Leu Atp	Glu 1le Lyt	Asn	Ala Leu
		260		265		270
Lya
		(2)	INFORMAÇÃO PARA	SEQ ID NO:	3 :

(i) Características da Sequência (A) Comprimento: 777 Bases (B) Tipo: Ácido nucleico (C) Tipo de Cadeia: Cadeia dupla (D) Topologia: Linear (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NO: 3 :

ATG CCT AAG CAA AAT CTT AGC ACC CTT CAC CAC AAA AAC ACC GTT TCA Het Ala Lyt Gin Asn Vai Ser Ser Leu Atp Glu Lyt Atn Ser Vai Ser

5 10 15

GTA GAT TTG CCT CGT GAA ATG AAA GTT CTT GTA AGC AAA GAA AAA AAC Vai Atp lau Pro Gly Glu Het Lyt Vai Leu Vai Ser Lyt Glu Lyt Asn

25 30

472

Mis: jc 6102-68

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GAC Asp

CCC AAG TAC CAT

CTA ATT

CCA ACA CTA CAC

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Uf, Clu

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ACT ,

AAA 1

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AAA

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ATT

TCT ι

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ACA

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165 170 175

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AAA

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CTT

TCA

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CAA

CTT

AAT

CAC

ACT

CAC

ACT

ACT

576

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Lys

Ser

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Val

Ser

val

Clu

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Asp

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Ser

Ser

180

IBS

190

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CCT

ACT

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AAA

ACT

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GCT

TCC

AAT

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GCC

ACT

TCA

ACT

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624

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Ala

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Lys

Lys

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Ala

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ACT

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672

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Lys

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CAA

CAA

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AAT

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720

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Gin

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225

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CTT

CAA

ATT

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CTT

CAT

CAA

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AAA

AAC

CCT

768

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Gly

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val

Clu

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Thr

Lys

Leu

Asp

Clu

1 le

Lys

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Ala

245

250

255

TTA AAA TAA Leu Lys

777

472

Mis: jc 6102-68

-41(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4 : (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 258 Aminoácidos (B) Tipo: Aminoácido (D) Topologia: Linear (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NO: 4 :

Met Al· 1

Ly»

Gin A»n 5

Vel

Ser Sar Leu

A«P 10

Glu Ly» Aen

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val 15

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Vel

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Aen

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Ly»

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Ser

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Thr

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Leu

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Gly

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Ly»

Ser

Asp

Gly

Ser

Gly

Ly»

Ala

Ly»

130 135 no

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145			150			155					160
Thr Thr	Leu	Vel V»l	Ly»	Glu Gly	Thr vel	Thr	Leu	Ser	Lys	Asn	Ile
		165			170					175
Ser Lyt	ser	Gly Glu	vel	Ser vel	Glu Leu	Asn	Asp	Ihr	ASP	Ser	Ser
		180			IBS				190
Al» Alt	Thr	Lys Ly»	Thr	Ala Ala	Trp Asn	Ser	Gly	Thr	Ser	Thr	Leu
	195			200				205
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210				215			220
Glu Asn	Ihr	Ile Thr	val	Gin Gin	Tyr Asp	Ser	Asn	ciy	Thr	Lys	Leu
225			230			235					240
Clu Gly	Ser	Ala val	Glu	lie Thr	Lys Leu	ASP	Glu	Ile	Lys	Asn	Ala
		245			250					255

Leu Lys

472

Mis: jc 6102-68

-42(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5 (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 774 Bases (B) Tipo: Ácido nucleico (C) Tipo de Cadeia: Cadeia dupla (D) Topologia: Linear (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NO: 5

GCT AAG CAA AAT GTT AGC AGC CTT GAC GAG AAA AAC AGG GTT TGA GTA Ala lya Gin Atn Vai Scr Sar leu Asp Glu Ly* Asn Ser Vai Ser Vai

10 15 iS

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TTG

CCT

CCT

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GAT Asp

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AAC AAT Asn Asn 55

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TCT Ser

GGA GTA

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CAA GCC GTA AAA

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Gly

Val

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GAC

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GAA

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ATA

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155

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Ala Glu lys thr

160

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CTG

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AAA TCT CCG GAA CTT TCA GTT CAA CTT AAT GAC ACT GAC AGT AGT GCT Lys Ser Gly Glu vai Sar vai Glu leu Asn Asp Thr Asp Scr Sar Ala

180 185 190

576

472

Mis: jc 6102-68

GCT ACT

AAA AAA ACT CCA CCT TCG AAT TCA GCC

ACT Thr

TCA ACT

TTA leu

ACA Thr

624

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Thr

lya lya 195

Thr Ala

Ala

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CTC

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CAA

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Cln

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TTA

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Clu

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lya

Aan

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245

250

255

AAA TAA ty· (2)

774

INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6 :

(i) Características da Sequência (A) Comprimento: 257 Aminoãcidos (B) Tipo: Aminoãcidos (D) Topologia: Linear (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NO: 6 :

Ala I	lya i	Cln Aan	Val	Ser Ser	Leu ,	Aap Clu Lya	Aan Ser	val	Ser	val
1			5			10			15
Asp	Leu	Pro Cly	Clu i	Het lya	Val	leu val Ser	lys Clu	Lya	Aan	Lya
		20				25		30
Aap	Gly	lya Tyr	*ap	leu Ile	Ala	Thr val Aap	lya leu	Glu	leu	lya
		35			A0		AS
Gly	Thr	Ser Aap	lya	Aan Aan	Gly	Ser Gly Val	leu Glu	Gly	Val	Lya
	50			55			60
Ala	*»P	lya Ser	lya	val lya	leu	Thr ile Ser	Aap Aap	leu	Gly	Cln
65				70		75				80
Thr	Thr	Leu Clu	Val	Phe lya	Clu	Aap Cly lya	Thr leu	Val	Ser	lya
			85			90			95
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		100				105		110
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		115			120		125
leu	Glu	Tyr Thr	Gly	Ile lys	Ser	Aap Gly Ser	Cly lys	Ala	lya	Glu
	130			135			140
vai	leu	lya Gly	Tyr	val lau	Clu	Gly Ihr leu	Ihr Ala	Glu	lya	Thr
145				150		155				160
Ihr	lau	vai Vai	Lua	Glu Gly	Ihr	val Thr leu	i Ser lya	Aan	ι 1 le	Ser
			165			170			175

472

Mis: jc 6102-68

-44Lys Ser Gly Glu val Ser val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala 180 IBS 190

Al·

Thr

Lya

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Ala

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Sar

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Ala

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Thr

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Leu

Aap

Glu

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Lya

Par. Ala

Lau

245 250 255

Lya (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7 : (i) características da Sequência (A) Comprimento: 774 Bases (B) Tipo: Ácido nucleico (C) Tipo de Cadeia: Cadeia dupla (D) Topologia: Linear (xi)

Descrição da Sequência:

SEQ ID NO: GAG AAA AAC AGC Glu Lys Aan Ser 10

7 GTT val

• TCA Ser 15

GTA Val

48

ATG Met 1

AAG CAA AAT Lys Gin Aan

GTT Vat 5

AGC ACC CTT GAC Ser Ser Leu Asp

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TTG

CCT

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GAT *sp

AAA Lys

AAC AAT Asn Asn 55

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GCA Gly

GTA Val

CTT Leu 60

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6102-68

-4573 472 Mis: j C

CTT Leu CTT vsl 145

CAA Glu 130 TTA Leu

TAC ACA GCA

ATT AAA AGC lie Lys Ser

GAT GGA Asp Gly GGA ACT Gly Thr

TCT Ser CTA Leu 155

GGA AAA GCT AAA GAG

432 '.30

Tyr AAA Ly·

Thr Gly GGC TAT

Gly Ly»

Ala GAA litte

Lys Glu

135 GTT CTT

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V A «•V»

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Leu

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Glu

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Ly»

Asn

Al»

Leu

245 250 255

AAA TAA 774 iv»

J (h (A) (B) (D) (xi) (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8 : Características da Sequência Comprimento: 257 Aminoácidos Tipo: Aminoácido

Topologia: Linear

Descrição

da

Se

quência:

SEQ

ID

NO:

: 8

• •

Het

Lys

Gin

Asn

Val

Ser

Ser

Leu

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472

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Thr

Thr

Leu

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Lys

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Lys

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Gin

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Lys

Asn

Ala

Leu

245

250

255

Lyi (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9 : (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 771 Bases (B) Tipo: Ácido nucleico (C) Tipo de Cadeia: Cadeia dupla (D) Topologia: Linear (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NO: 9 :

AAG Lys 1

CAA AAT Gin Asn

GTT Vsl

AGC Ser 5

AGC CTT GAC Ser Leu Asp

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TCA GTA GAT

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472

Mis: jc 6102-68

-47GGC AAG TAC GAT CTA ATT GCA ACA GTA GAC AAG CTT GAG CTT AAA GGA

Gly Lys Tyr Asp Leu lie Al· Thr Vai Asp lys Leu Glu Leu Lys Gly

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Thr Ser Aep Lys Atn Asn Gly Ser Gly Vel Leu Glu Gly vel Lys Ale

55 60

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Aep Lys Ser Lys vel Lys Leu Thr lie Ser Asp Asp Leu Gly Gin Thr

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GTA ACT TCC AAA GAC AAG TCA TCA ACA GAA GAA AAA TTC AAT 5‘A é»A vel Thr Ser Lys Asp Lyt Ser Ser Thr Glu Glu Lyt Pha Asn Glu Lye

TOO T05 TIO

GCT GAA GTA TCT GAA AAA ATA ATA ACA ACA GCA GAC CCA ACC AGA 11

Gly Glu vel Ser elu Lye 11« lie Thr Arg Ata Aip Gly Thr Arg ir.

115 120 125

144

192

240

'.36

384

GAA

TAC

ACA

GGA

ATT

AAA

ACC

GAT

GGA

TCT

GGA

AAA

GCT

AAA

GAG

GTT

Glu

Tyr

Thr

Gly

lie

Lya

Ser

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Gly

tar

oiy

Lya

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val

130

133

140

TTA

AAA

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GTT

CTT

GAA

GGA

ACT

CTA

ACT

GCT

GAA

AAA

ACA

ACA

Leu

Lys

Gly

Tyr

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Glu

Gly

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Leu

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Thr

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155

180

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GTG

GTT

AAA

GAA

GGA

ACT

GTT

ACT

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AAA

Leu

Vel

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Glu

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165

170

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TCT

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CAA

GTT

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AGT

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CCT

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Vel

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Vel

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180

185

190

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AAA

AAA

ACT

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GCT

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GGC

ACT

TCA

ACT

TTA

ACA

ATT

Thr

Lys

Lys

Thr

Ala

Ala

Trp

Asn

Ser

oiy

Thr

Ser

Thr

Leu

Thr

lie

195

200

205

ACT

GTA

AAC

AGT

AAA

AAA

ACT

AAA

GAC

CTT

GTG

ITT

ACA

AAA

GAA

AAC

Thr

Vel

Asn

Ser

uy»

iv·

Thr

lys

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Vel

Phe

Thr

Lya

Glu

Asn

210 215 220

432

480

528

S76

624

672

ACA ATT Thr 11« 225

TCA GCA Ser Ata

ACA CTA Thr Vai

GTT GAA Vai Glu

CAA CAA Gin Gin

230

ATT ACA lie Thr 245

TAC GAC Tyr Atp

AAA CTT Lys Leu

TCA AAT Ser Asn

GAT GAA Asp Glu

250

GGC ACC Gly Thr 235

ATT AAA 1le Lys

AAA TTA

Lys Leu

AAC GCT Asn Ala

GAG	GCG
Glu	Gly
	240
TTA	AAA
Leu	Lys
255

720

768

TAA

771

472

Mis: jc 6102-68

-48(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10 (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 256 Aminoácidos (B) Tipo: Aminoãcido (D) Topologia: Linear (x) Descrição da Sequência: SEQ ID NO: 10 :

Lv*

Gin

Atn

Val

Ser

Ser

leu

Atp

Glu

Lya

Aan Ser

Val

Ser

Val

AtP

1

5

10

15

Leu

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ciy

Glu

Met

lv»

Val

Leu

val

Ser

Lyt Glu

Lya

Atn

lyt

Atp

20

25

30

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lya

tyr i

Aap i

Leu

Ita i

Ala

Thr

Val ,

Aap

lyt lau i

Glu l

leu

lyt i

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35

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45

Thr

Ser

Aap

ly»

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Ser

Gly

Val

lau Glu

Gly

val

lya

Ala

50

55

60

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iy«

Ser

iy«

val

Lya

leu

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lie

Ser

Aap Aap

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Gin

Thr

65

70

75

ao

Thr

lau

Glu

val

Pha

iva

Glu

*·Ρ

Gly

lya

Thr Lau

val

Sar

lya

lya

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90

95

Vai

Thr

Ser

lya

*»P

lya

Sar

Ser

Thr

Glu

Glu lya

Pha

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Clu

lya

100

105

110

Gly

Glu

Vai

Sar

Glu

Iva

II·

lie

Thr

Are

Ala Aap

Gly

Thr

Ar·

Lau

115

120

125

Glu

Tyr

Thr

Gly

lie

lya

Sar

Aap

Gly

Sar

Gly lya

Ala

lya

Glu

val

130

135

140

Leu

ir»

Gly

Tyr

val

Leu

Glu

Gly

Thr

Leu

Thr Ala

Glu

iy«

Thr

Thr

145

ISO

155

160

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vai

Val

Lus

Glu

Gly

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val

Thr

Leu

Ser Lyt

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1 la

Ser

iy«

165

170

175

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Val

Ser

Val

Glu

Leu

Atn

Atp

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Ser

Ale

Ala

ISO

IBS

190

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Lyt

iy»

Thr

Ala

Ala

Trp

i Atn

Ser

Gly

1 Thr Ser

• Thr

leu

i Thr

lie

195

200

205

Thr Vai Aan Sar Lya lyt Thr lyt Atp leu Vet Phe Ihr lya Glu Atn 210 215 220

Thr lie Thr Vai Gin Gin Tyr Atp Ser Aan Gly Thr Lyi leu Glu Gly 225 230 235 2(0

Sar Ala Vai Glu lie Thr lyt leu Atp Glu lie Lyt Atn Ala leu lya 245 250 255

472

Mis: jc 6102-68

-49(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11 : (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 32 Bases (B) Tipo: Ácido nucleico (C) Tipo de Cadeia: Cadeia simples (D) Topologia: Linear (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NO: 1 :

CCGGGATCCA T ATG GCT AAG CAA AAT GTT AGC Met Ala Lys Gin Asn Vai Ser

5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12 :

(i) Características da Sequência (A) Comprimento: 28 Bases (B) Tipo: Ácido nucleico (C) Tipo de Cadeia: Cadeia simples (D) Topologia: Linear (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NO: 12 :

GATATCTAGA TCTTTATTTT AAAGCGTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13 : (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 31 Bases (B) Tipo: Ácido nucleico (C) Tipo de Cadeia: Cadeia simples (D) Topologia: Linear (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NO: 13 :

CCGGATCCAT ATG AAA AAA TAT TTA TTG GGA Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly

5

472

Mis: jc 6102-68

-50(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14 :

(i) Características da Sequência (A) Comprimento: 12 Bases (B) Tipo: Ácido nucleico (C) Tipo de Cadeia: Cadeia dupla (D) Topologia: Linear (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NO: 14 :

TTA ATA GCA TGT

Leu Ile Ala Cys (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15 :

(i) Características da Sequência (A) Comprimento: 4 Aminoácidos (B) Tipo: Aminoácido (D) Topologia: Linear (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NO: 15 :

Leu Ile Ala Cys

Claims (18)

1 - Processo de produção de uma versão truncada de uma sequência nucleotídica codificando uma lipoproteína de Borrelia. caracterizado por compreender:

o fornecimento de um molde de ADN compreendendo a referida sequência nucleotídica que codifica para a referida lipoproteína de Borrelia. contendo o referido molde uma sequência sinal de peptidase sinal II potencial, onde a referida sequência sinal possui uma extremidade 5' e uma extremidade 3·, terminando a extremidade 3' num codão codificador de um resíduo de· cisteína; e a síntese de um conjunto de iniciadores oligonucleotídicos, compreendendo um primeiro e um segundo iniciador, compreendendo o referido primeiro iniciador uma região que é suficientemente complementar de uma primeira cadeia de ADN do referido molde de ADN, para iniciar eficazmente a amplificação da referida primeira cadeia de ADN numa direcção 5⁷ para 3⁷, e compreendendo um segundo iniciador uma região que é suficientemente complementar de uma segunda cadeia de ADN do referido molde de ADN, para iniciar eficazmente a amplificação da referida segunda cadeia de ADN numa direcção 5⁷ para 3⁷, começando o referido primeiro iniciador uma polimerização de ADN num nucleótido posicionado no referido molde de ADN a jusante do referido resíduo de cisteína numa direcção 3⁷.

2 - Processo de produção de uma variação recombinante de uma lipoproteína de Borrelia, caracterizado por compreender:

o fornecimento de um molde de ADN compreendendo a referida sequência nucleotídica que codifica a referida lipoproteína de Borrelia. contendo o referido molde uma sequência sinal de peptidase sinal II potencial, onde a referida sequência sinal possui uma extremidade 5⁷ e uma extremidade 3⁷, terminando a referida extremidade 3⁷ num codão codificador de um resíduo de cisteína;

a síntese de um conjunto de iniciadores oligonucleotídicos, compreendendo um primeiro e um segundo iniciador, compreendendo o referido primeiro iniciador uma região que é suficientemente complementar de uma primeira cadeia de ADN do referido molde de

73 472

Mis: jc 6102-68

-52ADN, para iniciar eficazmente a amplificação da referida primeira cadeia de ADN numa direcção 5^Z para 3^Z, e compreendendo um segundo iniciador uma região que é suficientemente complementar de uma segunda cadeia de ADN do referido molde de ADN, para iniciar eficazmente a amplificação da referida segunda cadeia de ADN numa direcção 5' para 3', começando o referido primeiro iniciador uma polimerização de ADN num nucleótido posicionado no referido molde de ADN a jusante do referido resíduo de cisteína numa direcção 3';

a reacção dos referidos iniciadores numa reacção em cadeia de polimerase fornecendo assim um conjunto de produtos de amplificação;

o isolamento de uma versão truncada da referida sequência nucleotídica a partir do referido conjunto de produtos de amplificação;

a clonação da referida versão truncada num vector de expressão adequado;

a transformação de um organismo hospedeiro adequado utilizando o referido vector de expressão; e a cultura do referido organismo hospedeiro para a produção da referida variação recombinante da referida lipoproteína.

3 - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o referido nucleótido estar posicionado imediatamente a jusante do referido resíduo de cisteína na referida direcção

3' .

4 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a referida sequência nucleotídica da referida lipoproteína de Borrelia conter uma sequência de comando possuindo uma extremidade 5· e uma extremidade 3'.

5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a referida sequência de comando conter, ou conter parcialmente, a referida sequência sinal.

6 - Processo de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado por a referida sequência de comando terminar, na referida

73 472

Mis: jc 6102-68

-53extremidade 3', com a referida sequência sinal e a referida sequência sinal estar posicionada imediatamente a jusante da referida extremidade 3' da referida sequência de comando.

7 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por o referido iniciador oligonucleotídico compreender uma região de nucleótidos suficientemente complementares a um segmento de uma sequência nucleotídica que codifica a lipoproteína de Borrelia. e por o referido iniciador ser eficaz para iniciar uma amplificação do referido segmento durante uma reacção em cadeia de polimerase.

8 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido vector de expressão ser um plasmídeo.

9 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o referido vector de expressão ser um plasmídeo pET9.

10 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o referido plasmídeo ser pET9-OspA.

11 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 8 a 10, caracterizado por o referido organismo hospedeiro ser tuna estirpe de E. coli.

12 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a referida estirpe de E. coli ser BL21(DE3)/pLysS.

13 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 8 a 12, caracterizado por se empregar um sistema de expressão do bacteriófago T7.

14 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido sistema de expressão do bacteriófago T7 empregar uma RNA-polimerase de T7.

15 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por a referida lipoproteína de Borrelia ser

73 472

Mis: jc 6102-68 uma lipoproteína de Borrelia burqdorferi.

16 - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a referida lipoproteína de Borrelia burqdorferi ser a proteína A da superfície externa (OspA).

17 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado por o referido primeiro iniciador ser codificado por uma sequência nucleotídica SEQ ID NO: 11

CCCCGATCCA 1 ATC CCT AAG CAA AAT GTI AGC Met Alt Lr» Gin A»n rd Str

18 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado por a referida sequência de nucleótidos que codifica a referida sequência de aminoácidos da reivindicação 1 ou 2 e caracterizado por a referida sequência de nucleótidos é: