NO303453B1 - FremgangsmÕte ved fremstilling av en terapeutisk aktiv variant av overflateproteinet OspA fra Borrelia burgdorferi - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av en rekombinant variant av overflateproteinet ospA fra Borrelia bur<g>dorferi omfattende en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO:10 med ett ellet fler alanin-eller metionin-residuer ved den N-terminale ende av SEQ ID NO:10-sekvensen.

Borrelia-spirochæter er ansvarlig for et antall lidelser så som Lyme's lidelse. Lyme's lidelse er en .infeksjon forårsaket av spirochæten Borrelia burgdorferi. som blir båret av midd. Spirochæten blir overført til mennesker og dyr via bittet fra en midd, og kan forårsake en alvorlig dermato-logisk, artritisk, nevrologisk og andre patologiske lidelser i en infisert vert. Nylig har Lyme's lidelse blitt av alvorlig epidimiologisk viktighet i Nord-Amerika såvel som Europa, Asia og Russland.

Det er godt dokumentert at personer og dyr infisert med Borrelia-patogener, typisk utvikler antistoff som respons på tilstedeværelsen av forskjellige Borrelia-anti<g>ener, innbefattende yttermembran-lipoproteiner. F.eks. utvikler pasienter infisert med Lyme's lidelse antistoff mot ytterm-embranprotein' A (ospA), et lipoprotein fra Borrelia bur<g>do-rferi spirochæten. Se Craft, J.E., Fischer, D.K., Shimamo-to, G.T., og Steere, A.C., "Antigens of Borrelia burgdorferi recognized during Lyme disease. Appearance of a new immunoglobulin in response and expansion of the immunoglobulin G response late in the illness, "J. Clin.Invest., 78: 934-939 (1986). Se også Barbour, A.G., Heiland, R.A. , og Howe, T.R., "Heterogeneity of major proteins in Lyme disease borrelia: a molecular analysis of North American and European isolates, "J. Infect.Dis., 152: 474-484

(1985). Ytteroverflateprotein A (ospA) er et lipoprotein kodet for av nukleotidsekvensen til ospA-genet som er tilstede i DNA hos B. burgdorferi-spirochæten. Nukleotidsekvensen som koder for villtype ospa av full lengde (Se SEQ ID nr. 1) , har nylig blitt bestemt for B31 den Nord-Amerikanske stamme av B. burgdorferi. Se Bergstrøm, S., Bundoc, V.G., & Barbour, A.G., "Molecular Analysis of linear plasmid-encoded major surface proteins, ospA and OspB of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi."Mol. Microbiol., 3: 479-486 (1989). Følgelig har ospA aminosyresekvensen blitt forutsagt fra nukleotid-dataene (se SEQ ID nr. 2).

Fra et klinisk synspunkt er det meget ønskelig å utvikle en metode for å fremstille store mengder av høyrensede Borrelia- lipoproteiner i en oppløselig form, for bruk i immunoassays og andre diagnostiske utvelgelsesforsøk som påviser tilstedeværelsen av antistoff mot disse proteiner i serum fra pasienter infisert med Borrelia-spirochæter. Videre ville oppløselige meget rene former av disse lipoproteiner, være potensielt verdifulle som kliniske immuno-gener for vaksinering både av folk og dyr mot Borrelia-patogener, såvel som anvendelige forskningsverktøy for påfølgende laboratoriebehandling innbefattende separasjon og opprenskning av antistoff mot slike proteiner.

Fra rekombinant DNA teknologisynspunkt er det meget ønskelig å erholde'en nukleotidsekvens eller et gen, som kan bli uttrykt i meget høye nivå (hyperekspresjon) i et rekombinant vert/vektorekspresjonssystem, for å gi store mengder av det resulterende rekombinante protein mens den ønskede spesifikke aktivitet blir opprettholdt.

Tidligere forsøk har blitt foretatt for å isolere rensede oppløselige Borrelia-lipoproteiner via dyrking og påfølgen-de rensing av Borrelia-cellekulturer. Det er imidlertid flere ulemper ved denne fremgangsmåte. Veksten og den påfølgende opprenskning av disse proteiner fra grove celleekstrakter av Borrelia er meget tidkrevende og kostbar. I tillegg tilfører dyrking og manipulering av levende Borrelia-kulturer vesentlig risiko for laboratoriepersonalet. Mest viktig er at villtypeversj onene av full lengde av Borrelia-lipoproteiner fremstilt ved denne metode har dårlige oppløselighetsegenskaper, idet disse proteiner har en hydrofob lipidert karakter, sannsynligvis grunnet sin assosiasjon med celle-membranen til spirochæten under ekspresjon. Følgelig er det nødvendig med detergenter for å gjøre disse lipiderte proteiner oppløselige.

Det er vanlig akseptert innen faget, at behandlingen av lipoproteiner med detergenter forbedrer oppløselighet, men nedsetter ofte reaktiviteten ved å endre eller ødelegge foldekonfigurasjonen av målproteinet, såvel som de epitope seter. Følgelig ville det være ønskelig å utvikle en rekombinant variasjon av ospA såvel som andre Borrelia-lipo-proteiner som er oppløselige uten eksponering til detergenter, mens de opprettholder spesifikk reaktivitet overfor antistoff mot deres villtypelipoproteinanaloger av full lengde. I tillegg til de foregående oppløselighets-problemer danner assosiasjonen av Borrelia-lipoproteinene med ytter-cellemembranen av spirochæten også problemer ved separasjonen og opprenskningen av disse proteiner fra grove celleekstrakter.

Alternativt kan visse rekombinante DNA-teknikker bli brukt for å uttrykke Borrelia-gener ved å bruke et vert/vektor-ekspresjonssystem såsom E. coli, inneholdende rekombinante kloningsvektorer kjent i faget. En passende rekombinant kloningsvektor ville være et plasmid med en nukleotidsekvens som kunne modifiseres til å motta et innskudd av villtype- Borrelia DNA. Selv om disse rekombinante teknikker unngår behovet for levendeBorrelia-kulturer har de flere ulemper.

F.eks. har rekombinante versjoner av vi11type- Borrelia burgdorferi av full lengde, dannet ved å bruke E. coli dårlige oppløselighetsegenskaper ved fravær av detergenter, sannsynligvis pga. assosiasjonen av proteinet med ytter- cellemembranen til verten under ekspresjon. Følgelig innehar påfølgende manipuleringer rettet mot separasjonen og opprenskningen av det resulterende proteinprodukt, problemer lik dem som påtreffes når det blir forsøkt å isolere og rense ospA fra levende B. burgdorferi-kulturer.

En annen ulempe ved ovennevnte fremgangsmåte er at rekombinante versjoner av villtype ospA-genet av full lengde, undergår dårlig hyperekspresjonen i en E. coli-vert. Denne dårlige ekspresjonen er sannsynligvis grunnet de akkumuler-te toksiske effekter av ospA-proteinbeliggenheten ved E. coli-cellemembranen i løpet av ekspresjonen.

Foreliggende oppfinnelse er i et aspekt rettet mot en metode for å fremstille rekombinante variasjoner av vill-type Borrelia-lipoproteiner som er oppløselige uten eksponering til detergenter og som blir høyt uttrykt i vertsorganisme såsom E. coli, mens de opprettholder spesifikk reaktivitet overfor antistoff mot deres tilsvarende Borrelia- lipoproteinanaloger.

Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot en metode for å fremstille en rekombinant variasjon av B. burgdorferi-ytteroverf lafeprotein A (ospA) , som er oppløselig uten eksponering til detergenter, mens det opprettholder spesifikk reaktivitet overfor antistoff mot villtype B. burgdorferi ospA.

Foreliggende oppfinnelse er i et ytterligere aspekt rettet mot fremskaffelsen av en rekombinant variasjon av B. bur<g>dorferi-ytteroverflateprotein A (ospA), som er oppløse-lig uten eksponering til detergenter, men som opprettholder spesifikk reaktivitet overfor antistoff mot villtype B. bur<g>dorferi ospA, og som ikke er assosiert med vertcelle-membranen under ekspresjonen, men opprettholder spesifikk reaktivitet overfor antistoff mot villtype B. burgdorferi ospA.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en oppløselig, sterkt uttrykt, rekombinant variasjon av ytre overflateprotein A (ospA) av Borrelia bur<g>dorferi. Aminosyresekvensen som utgjør den rekombinante variasjon av ospA, er vist i SEQ ID NO: 4, som angitt nedenfor.

Fremgangsmåten for å fremstille proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse, innbefatter fremstilling av en forkortet versjon av villtype B. burgdorferi ospA-gen, som kan bli sterkt uttrykt i en rekombinant vertsorganisme, for å gi et oppløselig produkt. Ved å bruke et DNA-templat inneholdende B. bur<g>dorferi-DNA, ble spesielt utformede oligonukleotidprimere brukt i en polymerasekjedereaksjon for å amplifisere et segment av villtype ospA-gehet som utesluttet de første 17 kodoner som inneholder en signalpreptidase II signalsekvens. Det resulterende amplifiseringsprodukt ble uttrykt i et T7 bakteriofag-ekspresjonssystem ved å bruke rekombinante DNA-teknikker kjent i faget.

Proteiner fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er meget fordelaktige ved at de opprettholder reaktivitet overfor antistoff mot villtype B. burgdorferi ospA, mens de opprettholder forbedrede oppløselighetsegenskaper i forhold til ospA avledet fra levende kulturer, eller andre rekombinante teknikker. Denne forbedrede oppløselighet er spesielt fordelaktig i immunodiagnostiske assays såvel som laboratoriebehandling, fordi proteinet er oppløselig ved fravær av detergenter som kan nedsette eller ødelegge reaktiviteten.

En annen fordel hos proteiner fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er at det ikke er assosiert med vertcellemem-branen under ekspresjon ulikt villtype ospA som blir uttrykt rekombinant. Følgelig kan proteiner fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse bli uttrykt ved høye nivå ved å bruke rekombinante teknikker, fordi de ikke er så toksiske overfor vertsorganismen som villtype ospA. Forbedret rekombinant ekspresjon gir høye utbytter av målproteinet, mens det fjerner risiko og omkostninger ved levende Borrelia celle-kulturer.

En ytterligere fordel ved foreliggende oppfinnelse er at den gir en fremgangsmåte for å fremstille en rekombinant variasjon av høyt uttrykte Borrelia lipoproteiner med forbedret oppløselighet i fravær av detergenter, mens den opprettholder spesifikk reaktivitet overfor antistoff mot sin vill-type-lipoproteinanaloger. Før fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse var det nødvendig med detergenter for å oppløse disse lipoproteiner for bruk i immunoassays og andre laboratoriebehandlinger, noe som derved eksponerte reaktive epitopseter overfor de potensielt skadelige effekter av detergentene.

Følgelig, i et bredt aspekt av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, er det fremskaffet et protein med en aminosyresekvens omfattende en første og en andre del, og som omfatter SEQ ID NO:10 og består av aminosyreresi-duene valgt fra minst en av alanin og metionin. Amino-syresekvensen kan omfatte SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 eller SEQ ID NO: 8 som angitt nedenfor, og nukleotidsekvensen kan omfatte SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 eller SEQ ID NO: 7 som angitt nedenfor.

I et annet bredt aspekt av oppfinnelsen, er det fremskaffet en fremgangsmåte for fremstilling av et protein med aminosyresekvensen SEQ ID NO: 10 som angitt nedenfor.

Ytterligere kan det ved fremgangsmåten anvendes et pET9-plasmid for å transformere en vertsorganisme omfattende pET9-ospA; en transformert stamme av E. coli inneholdende plasmid pET9-ospA, hvor stammen er BL21(DE3)/pLysS, pET9- ospA; og en oligonukleotidprimer som er anvendelig for en amplifisering av en del av en nukleotidsekvens, som koder for et Borrelia lipoprotein, hvor primeren er SEQ ID NO: 11.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan det benyttes en forkortet versjon av en nukleotidsekvens som koder for et Borrelia lipoprotein, omfattende: (a) et DNA-templat omfattende nukleotidsekvensen som koder for Borrelia lipoproteinet, hvor templatet inneholder en potensiell signalpeptidase II signalsekvens, hvor signalsekvensen har en 5' og en 3' ende og den 3' ende slutter i et kodon som koder for et cysteinresiduun, og (b) et sett av oligonukleotidprimere omfattende en første og andre primer, hvor første primer omfatter en område som er tilstrekkelig komplementært til en første DNA-kjede av det DNA-templatet for effektivt å fremskaffe amplifisering av den første DNA-kjede i en 5' til 3' retning, og en andre primer omfattende et område som er tilstrekkelig komplementært til en andre DNA-kjede av DNA-templatet for effektivt å fremskaffe amplifisering av den andre DNA-kjede i en 5' til 3' retning, hvor første primer igangsetter en DNA-polymerisering ved et nukleotid som ligger på DNA-templatet nedstrøms fra cysteinresidiet i en 3' retning.

Fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen gir en rekombinant variasjon av et Borrelia lipoprotein, hvor fremgangsmåten omfatter: (a) å fremskaffe et DNA-templat omfattende en nukleotidsekvens som koder for nevnte Borrelia lipoprotein, hvor templatet inneholder en potensiell signalpeptidase II signalsekvens hvor signalsekvensen har en 5' ende og en 3' ende, hvor den 3' ende slutter i et kodon som koder for et cysteinresiduum; (b) å syntetisere et sett av oligonukleotidprimere omfattende en første og en andre primer, hvor første primer omfatter et område som er tilstrekkelig komplementært til en første DNA-kjede av DNA-templatet for effektivt å igangsette amplifisering av den første DNA- kjede i en 5' til 3' retning, samt den andre primer omfattende et område som er tilstrekkelig komplementært til en andre DNA-kjede av DNA-templatet for effektivt igangsette amplifisering av den andre DNA-kjede i en 5' til 3' retning, hvor første primer igangsetter en DNA-polymerisering ved et nukleotid som ligger på nevnte DNA-templat nedstrøms fra cysteinresidiet i en 3' retning; (c) å omsette primerne i en polymerasekjedereaksjon for derved å fremskaffe et sett av amplifiseringsprodukter; (d) å isolere en forkortet versjon av nukleotidsekvensen fra settet av amplifiseringsprodukter; (e) å klone den forkortede versjon i en egnet ekspresjonsvektor; (f) å transformere en passende vertsorganisme ved å bruke ekspresjonsvektoren; og (g) å dyrke vertsorganismen for fremstilling av den rekombinante variasjon av lipoproteinet. Generelt angitt er fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen særpreget ved de trekk som er angitt i krav 1 s karakteriserende del.

For en bedre forståelse av foreliggende oppfinnelse sammen med andre og ytterligere mål, blir det referert til den følgende beskrivelse tatt sammen med de medfølgende tegn-inger, og dets omfang vil bli utpekt i de medfølgende krav.

Kort beskrive- lse av tegningene

Figur 1 viser nukleotidsekvensen av oligonukleotidprimer 201->216 skjematisk. Figur 2 viser nukleotidsekvensen av oligonukleotidprimer 958<-972 skjematisk. Figur 3 viser nukleotidsekvensen av oligonukleotidprimer 151->171 skjematisk. Figur 4 viser villtype ospA-genet skjematisk, og uthever posisjonene hvor primerne 201->216 og 958<-972 kobles sammen. Figur 5 viser villtype ospA-genet skjematisk, og uthever posisjonene hvor primerne 151->171 og 958<-972 kobles sammen. Figur 6 viser produktet som stammer fra amplifiseringen av villtype ospA-genet med primer 201->216 og primer 958<-972. Figur 7 er et fotografi av en enprosent agarosegel farget med etidiumbromid på hvilken amplifiseringsprodukter ble påsatt. Figur 8 er en skjematisk representasjon av plasmid pET9. Figur 9 er en skjematisk representasjon av plasmid pET9-ospA. Figur 10 er et fotografi av en SDS-12,5% PAGE gel farget med Coomassie blue, på hvilken forskjellige cellulære proteinprøver ble påsatt etter fjerning fra induksjon ved spesielle tidsintervaller. Figur 11 er et fotografi av en SDS-PAGE gel, på hvilken uinduserte celler ble sammenlignet med induserte celler, innhøstet ved en-times intervaller etter induksjonen. Figur 12 er et fotografi av en SDS-PAGE gel på hvilken ospA-prøver ble påsatt. Prøvene ble tatt ved forskjellige opprenskningstrinn. Figur 13 er et autioradiogram av en Western blot immuno-kjemisk analyse av ospA- og ospB-proteiner fra hele B. bur<g>dorferi-celler, såvel som hos ospA og preospA. Figur 14 er et fotografi av SDS-12,5% PAGE gel farget med Coomassie blue, på hvilken celle som bærer pET9-preospA, og celler som bærer pET-ospA ble sammenlignet med hele B_;_

burgdorferi-celler.

Figur 15 er et autoradiogram av gelen fotografert i figur 14 . Figur 16 er et autoradiogram av nitrocelluloseblottet av gelen fotografert i figur 14 før ytterligere Western-analyse. Figur 17 er et autoradiogram av nitrocelluloseblottet av gelen fotografert i figur 14 etter probing med antistoff. Figur 18 er et fotografi av det fullstendige Western-blot av gelen, fotografert i figur 14, etter behandling med alkalisk fosfotasefargeutviklingsreagenser.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

For det formål å forstå foreliggende oppfinnelse blir de følgende uttrykk definert:"Bakterier" er prokaryote organismer som har en sterk beskyttende kappe, kjent som en cellevegg under hvilken en cellemembran 'inneslutter et enkelt cytoplasmisk rom inneholdende DNA, RNA, proteiner og små molekyler. Eksempler innebefatter spirochæter og Escherichia coli.

"Hyperekspresjon" er en høynivåekspresjon av klonede gener. Bakteriofag T7 RNA-polymerase kan dirigere høynivå-tran-skripsjonen fra en T7 promoter på et multikopiplasmid, og effektivt transkribere nesten ethvert DNA knyttet til en T7 promoter. Dette resulterer i en høyt ekspresjonsnivå av det tilkoblede DNA.

Et "plasmid" er et dobbeltkjedet, lukket, sirkulært DNA-molekyl som er uavhengig av kromosomet og som omfatter et intakt replikon, slik at plasmidet blir replikert i en verts-celle. Når plasmidet blir plassert i en celle av en encellet organisme, kan egenskapene til organismen bli omgjort. Blant fenotypene fremskaffet av plasmider, er motstandsdyktighet overfor medikamenter og fremstilling av restiksjons- og modifi-seringsenzymer.

"Primer" refererer til et oligonukleotid (en kort nukleinsyrekjede) som er i stand til å virke som et igangsettings-punkt for syntese, når det plasseres under betingelser hvor syntese av et primerutvidelsesprodukt, som er komplementært til en nukleinsyrekjede, induseres. Primeren kan opptre naturlig, som i et renset restriksjonsfordøyelsesmateriale, eller bli dannet syntetisk.

Det har nå blitt funnet at det å omforme villtype-ospA-genet (se SEQ ID NO: 1) ved å fjerne de første 17 kodoner fra nukleotidsekvensen gir en forkortet nukleotidsekvens som kan bli hyperuttrykt i en vertsorganisme såsom E. coli, for å danne en rekombinant variasjon av B. burqdorferiospA som er oppløselig uten eksponering til detergenter, men som opprettholder en selektiv reaktivitet overfor antistoff mot villtype B. burqdorf er iospA. Det er nærværet av de 17 første kodoner som har stått for ulempene ved forsøk ifølge tidligere teknikk, for å reprodusere en oppløselig rekombinant form av ospA som blir høyt uttrykt i E. coli.

Mer nøyaktig, opptrer et område av nukleotider (se SEQ ID NO: 14) inne i ledersekvensen (de første 17 kodoner i villtype B. bur<q>dorferiospA-gene) som koder for et signal som igangsetter lipidering av det resulterende protein, og nedsetter derved både oppløseligheten såvel som ekspresjon under behandling inne i en rekombinant vert, såsom E. coli.

For å danne et ekspresjonssystem som kan brukes til å utføre foreliggende oppfinnelse, må flere trinn bli fulgt. Andre trinn kan bli lagt til, fjernet eller modifisert, hvor de er nevnt for å reflektere andre brukbare alternati- ver. Selv om det er illustrert i forhold til å fremstille en rekombinant variasjon av B. burqdorferiospA, er metoden like anvendelig overfor andre Borrelialipoproteiner, forutsatt at lipoproteinene inneholder den nødvendige signalsekvens for signalpeptidase II, som beskrevet nedenfor. Fremstillingen av den forkortede nukleotidsekvens (se SEQ ID NO: 3) som koder for den foretrukne utførelsesform av den rekombinante variasjon av ospA (se SEQ ID NO: 4) , er generelt beskrevet som illustrert nedenfor.

DNA inneholdende genet av full lengde for villtype B. bur<g>dorferi (B31 stamme) ospA, ble isolert og renset. Et sett av oligonukleotidprimere (SEQ ID NO: 11/fig. 1 og SEQ ID NO: 12/fig. 2) ble syntetisert for bruk i polymerase-kjedereaksjonen, ved å ta hensyn til den anførte amplifisering av en forkortet versjon av ospA-genet som mangler de første 17 kodoner, såvel som å fremstille restriksjonseter før og etter de kodende sekvenser av amplifiserte produkt. Et andre sett av oligonukleotidprimere (se SEQ ID NO: 13/ fig. 3 og SEQ ID NO: 12/fig. 2) ble også syntetisert for bruk i polymerase-kjedereaksjonen, for å fremskaffe den angitte amplifisering av det fullstendige villtype ospA-gen som en kontrollmekanisme.

De resulterende nukleotidfragmenter fremstilt ved polymerase -kjedereaksjonen ble renset og utvalgt med restrik-sjonsseteanalyse, og derpå subklonet i en passende ekspresjonsvektor, som var kompatibel fra synspuktet med .restriksjonsseter. De resulterende vektorer ble så overført til en vertsekspresjonsstamme for proteinproduksjon.

Eksempel 1

For å konstruere det aktuelle proteinet, var det nødvendig å fremskaffe en kilde for villtype B. bur<q>dorferi-DNA inneholdende nukleotidsekvensen som koder for ospA. Dette DNA virket som et templat for amplifiseringen av det ønskede segment av villtype ospA-genet (SEQ ID NO: 1) i løpet av polymerasekjedereaksjonen. Det er velkjent i faget at utgangsmateriale for rekombinante DNA-manipuleringer, kan være DNA isolert fra kulturer av villtypeorganismen av interesse, eller rekombinante hjelpemidler såsom plasmider som har blitt genetisk behandlet til å inneholde klonede kopier av mål-DNA. Sistnevnte fremgangsmåte er fordelaktig ved at den gir homogenitet og reduserer frekvensen av mutasjonen i DNA-fragmentet av interesse.

I den foretrukne fremgangsmåte ved fremstilling av det aktuelle proteinet var utgangskilden for templat-DNA inneholdende villtype ospA-genet av full lengde en rekombinant klon av ospA-genet skaffet fra et på forhånd behandlet plasmid pTRH44. Plasmidet pTRH44, med et 1,6-kb restriksjonsfragment inneholdende villtype B. bur<q>dorferiospA-genet av full lengde, klonet i pUC9 har blitt tidligere beskrevet. Se Howe, T.R., LaQuier, F.R. og Barbour, A.G. "Organization of genes encoding two outer membrane proteins of the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi within a single transcriptional unit," Infec. Immun., 54: 207-212

(1986) .

Alternativt kunne totalt Borrelia burgdorferi-DNA ha blitt isolert og renset ved fenolekstraksjon eller lysozyme-proteinase K-SDS-ekstrakt av celler, innhøstet fra kulturer i stasjonær fase for bruk som templat-DNA. Teknikker for isolering og opprenskning av templat-DNA er generelt velkjent i faget. Se f.eks. Howe, T.R., Mayer, L.W. og Barbour, A.G., "A single recombinant plasmid expressing two major outer surface proteins of the Lyme disease spiro-chete," Science 227: 645-646, (1985). F.eks. angående dyrkning og isolering av B. bur<g>dorferi, se Barbour, A.G., "Isolation and cultivation of Lyme disease spriochetes,", Yale J. Biol. Med., 57: 421-525 (1984).

Et første og andre sett av oligonukleotidprimere ble syntetisert i en Microsyn 1450 DNA-syntetisator (til-gjenelig fra Systec, Minneapolis, Minnesota). De resulterende produkter ble derpå renset ved å bruke Poly-Pak<R>opprenskningspakker (erholdt fra Glen Research Corporation,Herndon, Virginia) i henhold til forhandlers anvisninger. DNA-syntese og påfølgende opprenskningsteknikker er velkjent i faget, angående rekombinant DNA-teknologi. Alle passende teknikker for å oppnå disse trinn, vil være akseptable.

Det første sett av oligonukleotidprimere ble utformet for amplifiseringen av en nukleotidsekvens som koder for en rekombinant variasjon av B. bur<g>dorferi-ospA, mens det andre sett av primere ble utformet for amplifisering av det fullstendige villtype B. bur<g>dorferi-ospA-gen. Hver primer inneholdt en 5' og en 3' ende. Den 3' ende av hver primer inneholdt et område med en nukleotidsekvens som var komplementær til en spesiell sekvens av nukleotider, som opptrer ved et spesielt segment av villtype B. bur<g>dorferi-ospA-genet som er tilstede inne i B. burgdorf er i -genomet. Det var dette området av primeren som koblet seg til B. bur<g>do-rf er i -DNA- templatet for å fremme polymerisering i løpet av polymerasekjedereaksjonen. Nukleotidsekvensen for villtype-ospA-genet (se SEQ ID NO: 1) har på forhånd blitt bestemt. Se Bergstrøm, S., Bundoc, V.G. & Barbour, A.G., "Molecular Analysis of linear plasmid-encoded major surface proteins, ospA og ospB, of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi," Mol. Microbiol., 3: 479-486 (1989).

Den 5' ende av hver primer, inneholdt en nukleotidsekvens som var ikke-komplementær til B. burgdorferi-DNA-templatet, mens den innfører restriksjonsseter i fragmentene dannet under amplifisering. Den var kilden for restriksjonssetene som lettet kloningen av de resulterende fragmenter -i en ekspresjonsvektor. Bruken av restriksjonsseter for å lette kloning, er velkjent rekombinant DNA-teknologi.

Det første sett av oligonukleotidprimere innebefattet en første og en annen primer. Den første primer ble angitt som primer 201->216, og ble syntetisert for å gi nukleotidsekvensen (SEQ ID NO: 11) vist i figur 1. Tallene 201-216 indikerer de spesielle nukleotidposisjoner og villtype-ospA-genet av full lengde til hvilket primeren var komplementær. Under henvisning til figur 1 indikerer det understrekede område segmentet av primeren, som var komplementært til villtype-ospA-genet av full lengde ved nukleotidposisjoner 201 til 216. Nukleotidene som opptrer i uthevet skrift angir et restriksjonssete gjenkjent av restriksjonsenzym Ndel. Skråstreken representerer setet hvor Ndel-enzymet senere spaltet kjeden for å lette kloning i ekspresj onsvektoren.

Primer 201->216 ble brukt for å omstrukturere en 5' ende for det forkortede ospA-gen (nukleotidsekvens som koder for den rekombinante variasjon av ospA) ved å fremskaffe et Ndel-restriksjonssete og igangsette amplifiseringen fra villtype-ospA-genet av full lengde, ved å igangsette polymerisering ved det 18. kodon. I villtype-versjonen av ospA-gene, opptrer et potensielt gjenkjennelsessete for lipoproteinsignalpeptidase II mellom 16. og 17. kodon.

Den nøyaktige mekanisme for lipidering av villtype-ospA av full lengde inne i Borrelia-spirochæten er ikke kjent. Imidlertid er det nå generelt godtatt innen faget, at amino-syresekvensen Leu-x-y-Cys (hvor x og y generelt er forskjellige aminosyrer med ikke-polare sidekjeder) som opptrer i ledersekvensen hos visse bakterielle lipoproteiner, koder for et behandlingssignal for igangsetting av proteinbehandling av bakteriell enzympeptidase II. Dette enzym er endelig ansvarlig for spalting av den N-terminale del av ledersekvensen ved aminoenden av cysteinresiduet, noe som etterlater det N-terminale cystein, og blir kovalent bundet til fettsyrer som gir det gjenværende protein en sterkt lipidert karakter ved festing. Mange prokaryote celler, såsom E. coli. anvender det ovennevnte behandlings-skjema til å behandle og overføre sine egne cellulære lipoproteiner til cellemembranen. Se Bergstrøm, S., Bundoc, V.G. og Barbour, A.G., "Molecular Analysis of linear plasmid-encoded major surface proteins, ospA and ospB, of the Lyme disease spirochete Borrelia bur<g>dorferi."Mol. Microbiol., 3: 479-486 (1989). Se også Brandt, M.E., Riley, B.S., Radolf, J.D. og Norgard, M.V., "Immunogenic integral membrane proteins of Borrelia burgdorferi are lipoproteins," Infect. Immun., 58: 983-991 (1990).

Selv om den fullstendige aminosyresekvens av villtypeversjonen av B. bur<g>dorferi-ospA, ikke har blitt bekreftet ved aminosyreanalyse grunnet iboende problemer ved proteinet, har sekvensen tidligere blitt forutsagt basert på den kjente nukleotidsekvens av villtype B. burgdorferi(B31) ospA-genet av full lengde. Se Bergstrøm, S., Bundoc, V.G. og Barbour, A.G., "Molecular Analysis of linear plasmid-encoded major surface proteins, ospA and ospB, of the Lyme disease spiro-chete Borrelia burgdorferi, " Mol. Microbiol., 3: 479-486 (1989) . SEQ ID NO: 2 illustrerer den forutsagte aminosyresekvens av villtype B. bur<g>dorferi-os<p>A av full lengde som tidligere utledet.

Under henvisning til SEQ ID NO: 2 kan det bli observert at lederdelen, eller den forutsagte aminosyresekvens, inneholder et segment med de følgende aminosyrerresiduer Leu-Ile-Ala-Cys (se SEQ ID NO: 15) . Disse residuer bekrefter formatet av behandlingssignalet for signalpeptidase II E. coli som nevnt ovenfor. Således i villtypeversjonen av ospA-genet opptrer et potensielt gjenkjennelsessete for lipoproteinsignalpeptidase II mellom 16. og 17. kodon, grunnet sekvenshomologien mellom det kjente signalfrekvens-format for signalpeptidase II og den potensielle signalsekvens som opptrer i den forutsagte aminosyresekvens av villtype B. bur<g>dorferi-ospA av full lengde.

For å øke sannsynligheten for at det resulterende rekombinante protein ikke vil bli lipidert under hyperekspresjon, ble det komplementære segment av primer av 2 01->216 utar-beidet til å utelukke cysteinresiduet, og til å igangsette amplifisering ved delen av B. burqdorferi-villtype-ospA-genet som starter ved 18. kodon, for fullstendig å fjerne det spesielle gjenkjennelsesete for lipidering. Det ble håpet at elimineringen av dette potensielle gjenkjennelsessete ville øke oppløseligheten, og forbedre ekspresjonen av det resulterende protein, uten å nedsette den spesifikke reaktivitet overfor antistoff mot villtype B. burgdorferi-ospA.

Det var tidligere uvisst hvorvidt den potensielle signalsekvens som opptrer i aminosyresekvensen til villtype B. bur<q>dorferi-ospA, var ansvarlig for lipideringen av det ferdigutviklede protein. Det var videre ukjent hvorvidt den potensielle signalsekvens vil være innvolvert i en lignende lipidering, eller en rekombinant versjon av villtype-ospA dannet i en rekombinant vertsorganisme. Det var ytterligere utkjent hvorvidt elimineringen av en del av villtype-ospA-genet inneholdende den potensielle signalsekvens ville resultere i et forkortet ospA-gen, som kunne bli effektivt uttrykt ved -å bruke rekombinante metoder for å gi et protein med forbedret oppløselighet ved fravær av detergenter, mens det opprettholdt reaktivitet ovenfor antistoff mot villtypeversjonen av proteinet.

Det er generelt akseptert i faget, angående rekombinant DNA-teknologi, at jo større modifiseringsgraden som påføres en naturlig forekommende nukleotidsekvens som koder for et protein er, desto større blir risikoen for at det resulterende rekombinante protein vil lide av endret reaktivitet, hvis det i det hele tatt blir uttrykt. Faktisk kan en .slik rekombinant overføring vise seg å være toksisk eller dødelig overfor vertsorganismen, og reduserer eller elimi-nerer derved ekspresjon av det ønskede produkt.

Under henvisning til figur 1, krevet den foretrukne kon-struksjon av primer 201->216 et ikke-komplementært segment (GCT) som koder for et alaninresiduum, å bli plassert mellom det komplementære segment av primeren og Ndel-restriksjonssete. Ndel-restriksjonssete som ligger inne i primer 201->216, innbefattet et triplikat (ATG) som koder for metionin, et terminalt aminosyreresiduum som virker som et igangsettingssete i løpet av proteinproduksjonen.Triplikatet som koder for alanin ble lagt til fordi alanin er en av amino-syrene som letter fjerning av metionin fra det endelige proteinprodukt. Andre aminosyrer som er egnet for å lette fjerning av metionin vil også være akseptable. Se Hirel, P-H., Schmitter, J-M., Dessen, P., Fayat, G.&Blanquet, S.; "Extent of N-terminal methionine excision from Escherichia coli proteins is governed by the side-chain length of the penultimate amono acid," Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 86: 8247-8251 (1989). Det er generelt kjent at metionin som opptrer ved den terminale ende eller en aminosyresekvens for formålet med translasjonsigangse-tting, ikke er viktig med hensyn til særtrekkene ved det resulterende protein, og blir vanligvis fjernet fra amino-syresekvensen.

I den foretrukne form hadde proteinet fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, aminosyresekvensen som stammer fra det forkortede ospA-gen, samt et ytterligere alaninresiduum ved den aminoterminale ende. Siden de 17 første kodoner var fjernet fra den forkortede versjon av ospA-gene, var nukleotidtripletten som koder for alaninresidiet plassert slik at det lå foran nukleotidtripletten som koder for et lysinresiduum ved hva som vil være det 18. kodon i villtype-ospA-gene. Metionin ble fjernet i den ferdigutviklede form av det uttrykte protein. Den resulterende aminosyresekvens med metionin fjernet, er illustrert i SEQ ID NO: 6. Den tilsvarende nukleotidsekvens er vist i SEQ ID NO: 5.

Alternativt kunne det ytterligere alaninresiduum ha blitt utelatt. Den resulterende aminosyresekvens innbefattende det igangsettende metionin er illustrert i SEQ ID NO: 8. Den tilsvarende nukleotidsekvens er vist i SEQ ID NO: 7. Fjerning av metionin resulterer i aminosyresekvens SEQ ID NO: 10. Den tilsvarende nukleotidsekvens er vist i SEQ ID NO: 9.

Den andre primer ble betegnet som primer i 958<-972, og ble syntetisert for å gi sekvensen (se SEQ ID NO: 12) vist i figur 2. Under henvisning til figur 2 indikerer det understrekede området av primeren segmentet som var komplementært til villtype-ospA-genet ved posisjonen 958 til 972, men nukleotidene som opptrer med uthevet skrift, indikerer et restriksjonssete gjenkjent av restriksjonsenzym Bglll. Skråstreken representerer setet hvor Bglll-enzymet senere spaltet produktkjeden for å lette kloning i ekspresjonsvektoren. Under henvisning til SEQ ID NO: 12 kan det obser-veres at den fullstendige sekvens er vist i et ikke-kodende format, i motsetning til formatet presentert i SEQ ID NO: 11 og 13 som tilsvarer henholdsvis primer 201->216 og primer 151->171. Det ikke-kodende format ble brukt, fordi sekvensen av primer 958<-972 faktisk er utformet til å igangsette amplifisering av non-sense-kjeden av ospA-gene, istedetfor sense-kjeden.

Primer 958<-972 var felles for begge sett oligonukleotidprimere. Med hensyn til det første sett av primere ble primer 958<-972 brukt til å omforme en 3' ende for det forkortede ospA-gen, noe som gir et Bglll-restriksjonssete og igangsetter amplifiseringen i en retning som er antiparallell med retningen av amplifiseringen dirigert av primer 201->216.

Under henvisning til figur 4, er villtype-ospA-genet skjematisk. De to områder med understrekede nukleotider uthever posisjonene hvor primer 201->216 og primer 958<-972 koblet seg til templat-DNA for å fremme amplifisering. Pilene betegner polymeriseringsretningen igangsatt av primeren, som koblet seg til det den angitte posisjonen.

Det andre sett av oligonukleotidprimere utformet for amplifiseringen av det fullstendige villtype B. burgdorferi -ospA-cren, som en kontroll innbefattet også en første og en andre primer. En første primer ble betegnet som primer 151->171, og ble syntetisert for å gi nukleotidsekvensen (se SEQ ID NO: 13) vist i figur 3. Under henvisning til figur 3 indikerer det understrekede område segmentet av primeren som var komplementær til villtype-ospA-genet ved nukleotidposisjonen 151->171. Nukleotidene som vises i uthevet skrift, indikerer et restriksjonssete igjenkj ent av restriksjonsenzym Ndel. Skråstreken indikerer setet hvor Ndel-enzymet senere spaltet produktkjeden for å lette kloning inn i ekspresjonsvektoren.

Den andre primer 958<-972 var felles for begge sett av oligonukleotider som tidligere nevnt. Angående det andre sett av primere, innførte primer 958<-972 et Bglll restriksjonssete og igangsatte amplifiseringen av villtype-ospA-genet i retning antiparallell til retningen av amplifisering dirigert av primer 151->171.

Under henvisning til figur 5, blir villtype-ospA-genet vist skjematisk. De to nukleotidområder som er understreket, uthever posisjonene hvor primer 151->171 og primer 958<-972 koblet seg sammen for å fremskaffe amplifisering. Pilene betegner retningen av polymerisering igangsatt av primeren som koblet seg til ved den angitte posisjonen.

Figur 6 er en skjematisk illustrasjon av produktet som stammer fra amplifiseringen av den forkortede versjonen av ospA-genet fra villtype-ospA-genet av primer 201->216 og primer 958<-972. Den uthevede skrift betegner restriksjonsseter fremskaffet av primerne, mens de understrekede områder indikerer området av primeren som er tilkoblet til villtype-ospA-genet før amplifisering.

De grunnleggende metoder for amplifisering av en ønsket målnukleinsyresekvens ved å bruke oligonukleotidprimere er generelt kjent i faget, og er illustrert i US patent nr. 4,683,202 til Mullis og US patent 4,800,159 til Mullis et al, hvorav begge er innbefattet heri per referanse. For ytterligere informasjon angående kloningsteknikker, se Maniatis, T., Fritsch, E.F. og Sambrook, J. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982). Se også Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York, N.Y.

(1989) .

Ved å anvende primere 151->171, 201->216 og 958<-972, ble polymerasereaks jonsamplif iseringer utført i 50/xm rea-ksjonsvolum inneholdende en enhet AmpliTaq DNA-polymerase (erholdt fra Perkin-Eimer Cetus, Norwalk, CT), hver primer ved 1/xm et ca. 0,1/xm templat DNA. Reaksjonsblandingen inneholder også 10 m Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,05% -Tween 20, 0,05% Nonedet P-40, 0,26 mM dATP, 0,26 mM dTTP, 0,14 mM dCTP og 0,14mM dGTP.

I den foretrukne amplifiseringsmetode reflekterte dNTP-konsentrasjonen som ble brukt, det kjente DNA-baseinnhold på 29% G + C for B. bur<q>dorferifor å eliminere muligheten for uønskede mutasjoner. Se , G.P., Steigerwalt, A.G., Johnson, S., Barboug, A.G., Steere, A.C., Robinson, I.M. og Brenner, D.J., "DNA characterization of Lyme disease spirochetes," Yale J. Biol. Med., 57:539-542 (1984).

Før amplifisering ble reaksjonen overlagt med mineralolje og amplifisering ble utført i 25 sykler i en DNA Thermal Cycler (erholdt fra Perkin-Elmer Cetus, Minneapolis, MN.), hvor hver syklus bestod av 1 min. ved 94°C, 1 min. ved 4 7°C og 3 min. ved 72 248°C. Amplifisering ble avsluttet med en endelig inkubering ved 72°C i 10 min. The amplifiserte produkter ble ekstrahert med fenol, utfelt med etanol, spaltet med de passende restriksjonsenzymer, og så renset med elektroforese på 1% agarosegeler med lavt smeltepunkt (erholdt fra Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) . Andre teknikker kjent i faget for opprenskning av amplifiserte DNA-produkter, såsom elektroforese og akryl-amidgeler vil være akseptable. Det er velkjent i faget at de amplifiserte produkter må bli renset og behandlet med de passende restriksjonsenzymer (Ndel og Bglll for foreliggende eksempel) før ekspresjon kan bli igangsatt.

Amplifiseringsproduktene ble satt på en 1% agarosegel farget med etidiumbromid og fotografert med UV-belysning. Under henvisning til figur 7, inneholder brønn 1, 6 og 11 Haell-fordøyet T7 DNA, som markører for molekyllengde. Størrelser er i kilobasepar (kB) . Brønn 2, 4, 7 og 9 inneholder en 1/5 volumdel av produktene fra reaksjonene med totalt B. burqdorferi-DNA, mens brønn 3, 5, 8 og 10 inneholder 1/50 volumdel av reaksjonsblandingen som stammer fra amplifiseringen ved å bruke plasmid pTRH44 som et templat. De påsatte prøver ble dannet ved å bruke primere som amplifiserer den fullstendige ospA-kodende sekvens 18 (brønn 2, 3, 7 og 8) eller området som starter ved Lys (brønn 4, 5, 9 og 10) . Som vist i brønn 7-10, kan det amplifiserte DNA bli spaltet med EcoRI for å gi produkter med mobiliteter som er ventet fra spalting ved det eneste EcoRI-sete i ospA (662 + 182, og 623 + 182 bps) .

Eksempel 2

For å uttrykke den amplifiserte versjon av det forkortede ospA-gen, såvel som den amplifiserte versjon av villtype-ospA-genet av full lengde ble DNA-fragmentene som stammet fra amplifisering ved polymerasekjedereaksjonen til slutt klonet i en vektor for proteinproduksjon. Den foretrukne vektor for proteinproduksjonen i foreliggende oppfinnelse var pET9, hvor ospA-genet blir plassert under kontroll av en T7-promotor og effektive translasjonsigangsettelses-signaler fra bakteriofag T7. pET9- og pLysS- ekspresjons-vektorene, de bakterielle vertsorganismer for kloning, vekstmedia og metodene brukt for å dirigere ekspresjon av klonede gener med T7 RNA polymerase er tidligere blitt beskrevet. Se Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J.&Dubendorff, J.W., Meth. Enzymol., "Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes," 185: 60-89 (1990). Kloning og ekspresjon av genet for bakteriofag T7 RNA-polymerase er også angitt i US patent nr. 4,952,496 til Studier et al, innbefattet heri per referanse. Selv om et T7 promotorsystem er det foretrukne ekspresjonssystem i foreliggende oppfinnelse, skal ekspresjon av det forkortede ospA-gen ikke være slikt begrenset med hensyn til ekspre-sjonsformat forutsatt at ekspresjonssystemet som er valgt er kompatibelt med vertsorganismen.

De resulterende plasmider ble betegnet som pET9-preospA, noe som betegner at plasmidene som mottok det amplifiserte fragment som koder for villtype-ospA av full lengde brukt som en kontrdll, og pET9-ospA som betegner plasmidene som mottok de amplifiserte DNA-produkt som koder for den rekombinante variasjon av ospA.

I den foretrukne form av foreliggende oppfinnelse ble pET9-vektoren brukt siden den har et kan-gen som sin selektive markør i stedet for et blad-gen. Følgelig blir ampicillin ikke brukt under cellevekst, og derfor er det ingen mulig-het for at et immunogent ampicilloyl/ospA målproteinkon-jugat kan dannes. Konjugater av denne type er antatt å være hovedantigene-determinanter ved pencillinallergi, og deres tilstedeværelse kunne komplisere senere immunologiske studier. Se Yvon. M. , Anglade, P. & Wal, J-M., "Identi-fication of the binding sites of benzyl penicilloyl, the allergenic metabo-lite of penicillin, on the serum albumin molecule," FEBS, 263: 237-240 (1990). En skjematisk fremstilling av pET9 og pET9-ospA-plasmidene er henholdsvis vist i figur 8 og 9.

Plasmidene pET9-preospA og pET9-ospA ble initielt klonet iDH5a, en vertsorganisme som mangler T7 RNA-polymerase.Bakgrunnekspresjonen er minimal i denne vert, siden den bakterielle RNA-polymerase ikke initierer fra T7 promo-toren. I prinsipp kan stabile rekombinante plasmider bli etablert i denne vertsorganisme selv om målgenproduktet er toksisk overfor E. coli. Riktigheten av de resulterende plasmider ble bekreftet ved utstrakt restriksjonsse-teanalyse og standard dideoksysekvensiering av de fullstendige ospA-kodende sekvenser.

Selv om primerne som er brukt her var spesifikt utformet for å amplifisere visse segmenter av villtype-ospA-sekvensen fra totalt B. bur<g>dorferi-DNA, ble av praktiske grunner og fordi mutasjonssannsynligheten øker med antallet am-plifiseringssykler, plasmidene brukt i foreliggende oppfinnelse konstruert ved å bruke Ndel/Bglll fragmenter erholdt fra reaksjoner inneholdende ospA-plasmidet pTRH44, som et DNA-templat. - Derpå ble de resulterende 824 og 779 bp Ndel/Bglll fragmenter fra hver reaksjon subklonet separat i T7 ekspresjonsvektoren pET9, som hadde blitt fordøyet med Ndel og BamHI, defosforylert og renset ved elektroforese på 1% agarose geler med lavt smeltepunkt. Plasmidet pTRH44 med et 1,6-kb restriksjonsfragment inneholdende villtype-ospA-genet av full lengde, klonet i pUC9 har tidligere blitt beskrevet. Se Howe, T.R., LaQuier, F.R. og Barbour, A.G. "Organization of genes encoding two outer membrane proteins of the Lyme disease agent Borrelia bur<g>dorferi within a single transcriptional unit," Infec. Immun., 54: 207-212

(1986) .

Under henvisning til figur 8 og 9, dannet fordøying av de amplifiserte DNA med en Ndel/Bglll og etterfølgende lige-ring i Ndel/BamHI fordøyet pET9, pET9-preospA og pET9-ospA, som henholdsvis er 5127 og 5082 bps. 010-SlO representerer 010 promotor for bakteriofag T7 RNA-polymerase og det ribosom-bindende og translasjonelle startsete for T7 gen 10. Tø er det transkripsjonene termineringssignal for T7 RNA-polymerase.

Eksempel 3

For proteinproduksjonen ble plasmidene overført til ekspre-sjonsstammen BL21 (DE3)/pLysS, en vertsstamme inneholdende en kromosomal kopi av genet for T7 RNA-polymerase under kontroll av den induserbare lacUV5-promotor og et pACYC184-basert plasmid pLysS, som spesifiserer lave nivå av T7 lysozym, en naturlig inhibitor for T7 RNA-polymerase. For ytterligere informasjon, se Moffatt, B.A. & Studier, F.W., "T7 Lysozyme inhibits transcription by T7 RNA polymerase, " Cell, 49: 221-227 (1987). I uinduserte celler reduserer lysozym den basale aktivitet av T7 RNA-polymerase, og øker området for målgener som kan bli stabilt opprettholdt i ekspresj onsverten.

Kulturer av BL21(DE3)/pLysS som bærer forskjellige plasmider ble dyrket til midtre logaritmisk fase, og en porsjon av hver ble indusert med IPTG. Ved induksjon ble plasmid pET9-preospA funnet å danne relativt små mengder induser-tbart protein som fra analyse SDS-polyakrylamidgeler var meget likt i mobilitet med villtype-ospA-proteinet som er tilstede i totale ekstrakter av B. burgdorferi. Under henvisning til figur 10, ble prøver (1,5/il) fjernet for analyse ved SDS-12,5% PAGE, ved tidene angitt nedenfor. Proteiner ble gjort synlige ved å farge med Coomassie blue. Brønn 1, 5 og 9 tilsvarte hele B. burgdorferi-celler -(5 x 10<7->celler), mens brønn 2, 3 og 4 tilsvarte pET9-preospA indusert i en, tre eller 18 timer. Brønn 6, 7 og 8 tilsvarte pET9-ospA i en, tre eller 18 timer. Posisjonen av molekylvektsmarkører (94, 67, 43, 30 og 20) er vist. Molekylmasser av proteiner er i kilodalton.

Pulse-chase eksperimenter ble utført for å demonstrere at syntese av preospA-proteinet inntraff en til to timer etter induksjon, et resultat som antydet at proteinet var toksisk overfor E. coli. I motsetning til dette, ble en meget høyere og vedvarende ekspresjonsgrad observert når pET9-ospA ble indusert.

Figur 11 viser induksjonen av den rekombinante variasjon av ospA fulgt av SDS-PAGE. Brønn 1 ble tilført hele celler av uindusert BL21(DE3)/pLysS, pET9-ospA. Brønn 2-7 ble tilført hele celler innhøstet ved 1-times intervaller etter induksjonen. Brønn 8 inneholdt molekylvektsmarkører. Figur12 viser SDS-PAGE av den rekombinante variasjon av ospA, ved forskjellige opprenskningstrinn som følger: Brønn 1, molekylvektsmarkører; brønn 2, grovekstrakt før sentrifugering; brønn 3, grovekstrakt etter sentrifugering; brønn 4, Q Sepharose eluat; brønn 5, S Sepharose gradientfraksjon; og brønn 6, hydroksylapatitfraksjon. Brønn 2-6 inneholder hver 0,01% av det totale protein som er tilstede i hver fraksjon. Proteiner ble analysert på en 10-20% akrylamidg-radientgel. Western blott-analyse med to monoklonalantis-toff H5332 og H3TS, kjent for å gjenkjenne forskjellige epitoper inne i villtype-ospA, ble også utført for å bekrefte at disse bånd inneholdt autentiske ospA-sekvenser. Se Brandt, M.E., Riley, B.S., Radolf, J.D. og Norgard, M.V., "Immunogenic integral membrane proteins of Borrelia burgdorferi are lipoproteins," Infect. Immun., 58: 983-991

(1990). Se også Howe, T.R., Mayer, L.W. og Barbour, A.G., "A single recombinant plasmid expressing two major outer surface proteins of the Lyme disease spirochete, " Science 227: 645-646, (1985).

Igjen under henvisning til figur 10, var proteinet rettet mot pET9-ospA merkbart mindre enn det dannet av pET9- preospA selv om begge proteiner ble ventet å inneholde omtrent det samme antallet aminosyreresidier etter behandling, for å fjerne enten den 17 residuers lange sekvens i tilfelle med villtype-ospA, eller bare det initierende metionin fra den rekombinante variasjon av ospA. Den mest sannsynlige forklaring for forskjellen, var at tilstedeværelsen av kovalent bundet N-terminal lipid, minket mobiliteten av det behandlede pET9-preospA-produkt. På enkelte geler (se f.eks. figur 13) migrerte preospA-produktet som to nærliggende bånd, noe som kan ha representert behandlede intermediater. Dette resultat antyder at de behandlende og prekursorformene av dette protein har lignende mobiliteter på en-dimensjonell SDS-PAGE.

Eksempel 4

For å bestemme subcellulær beliggenhet, ble en 20 ml kultur av BL21(DE3)pLysS, pET9-preospA innhøstet 3M time etter IPTG-induksjon ved sentrifugering ved 8.000 rpm. Pelleten ble suspendert i en 10 ml blanding, inneholdende 2 0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM NaCl og 2 mM EDTA. Cellene ble derpå lysert ved frysing og tining. Lysatet ble behandlet med DNase og Mg<++>, derpå sedimentert i 90 min. ved 33.000 rpm. Pelletfraksjonen ble resuspendert i en 5 ml blanding inneholdende 0,25 M sukrose, 3,3 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM DTT og 1 mM EDTA. Resuspens j onen ble repelletert ved sentrif ugering i en time ved 50.000 rpm. Pelleten ble resuspendert i 1 ml 25% (w/w) sukrose, 5 mM EDTA og 1 mM DTT og derpå lagt på en diskontinuerlig sukrosegradient. Sentrifugering ble utført ved 30.000 rpm i 16 timer ved 4°C. Etter sentrifugering ble 0, 5 ml fraksjoner samlet opp, og 2 0 itl prøver ble analysert med SDS-PAGE og Western bloting. Yttermembranområdet av gradienten ble bestemt ved sin reaktivitet med antistoff mot OmpA, en velkarakterisert E. coli<y>ttermembrankomponent. Se Zimmerman, R. og Wickner, W. , "Energetics and intermediates of the assembly of protein OmpA into the outer membrane of Escherichia coli,"

J. Biol. Chem., 258: 3920-3925 (1983).

Nesten alt av villtype ospA av full lengde som stammet fra pET9-preospA ble gjenvunnet i lavhastighetspelletf raksjonen av det fryse-tinede cellelysat. Pelleten ble fraksjonert i indre og ytre membraner ved sentrifugering gjennom dis-kontinuerlige sukrosegradienter. Mesteparten av proteinet ble funnet i fraksjoner anriket i innermembrankomponenter.

Ytterligere studier viste at denne rekombinantavledede villtypeversjon av ospA, kunne bli ekstrahert under betingelser kjent i faget for selektivt å solubilisere EJ__coli.'s innermembran. Slike betingelser krever behandling av proteinfraksjonen med en detergent såsom Triton X-100 eller natrium N-laurylsarkosinat. Se f.eks. Forst, S., Delgado, J., Ramakrishnan, G. & Inouye, M., "Regulation of ompC and ompF expression in Escherichia coli in the absence of envZ," J. Bacteriol., 170: 5080-5085 (1988). På den annen side er det imidlertid produktet av pET9-ospA oppløselig ved fravær av enhver detergent (s 50 mg/ml) og signifikante mengder av denne rekombinante variasjon av ospA (a 50% av det totale cellulære protein) kan bli fremstilt fra dette plasmid flere timer etter induksjon med IPTG (se figur 11). Når induksjon av pET9-ospA ble fortsatt lenger enn seks timer begynte cellene å lysere, og alt produkt ble til slutt funnet i kultursupernatanten.

Eksempel 5

For å rense den rekombinante variasjon av ospA ble en tre-trinnsfremgangsmåte anvendt. En 500 ml kultur av E. coli BL21(DE3)/pLysS inneholdende pET9-ospA ble dyrket i rist-ende 2-liters flasker ved 37°C i tryptonmedium supple-mentert med M9-salter, 0,4% glukose, 25/xg/ml kloramfenikol og 25/xg/ml kanamysinsulf at, inntil OD 600 nådde 0,6 ved hvilket punkt IPTG ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0,5 mM. Ytterligere 100/xg/ml kanamysin ble tilsatt, sammen med IPTG for å forhindre overvekst i kulturen av enhver celle som kunne ha tapt målplasmidet. Seks timer senere ble cellene samlet opp ved sentrifugering og suspendert i 25-30 ml av 20 mM natriumf orsf atbuf f er (Ph 7,7) og lagret ved -20°C. Grov-ekstraktet ble preparert ved tining av resuspenderte celler ved 4°C, noe som tillater lysozymer kodet for pLysS effektivt å lysere cellene. Dette ble fulgt av tilsetting av MgCl2og DNase (endelige konsentrasjoner på henholdsvis 2,5 mM og 5/xg/ml). Etter 3 0 min. ved 4°C ble celleavfallet fjernet ved sentrifugering (15 min. , 15.000 g). Den resul-terende pellet ble ekstrahert med 10 ml lOmM natriumf osf atbuf f er (pH 7,7) inneholdende lOmM NaCl (buffer A) . Etter resentrifugering ble supernatantene slått sammen for å gi omtrent 4 0 ml grovekstrakt.

Grovekstraktet ble satt på ved romtemperatur et på forhånd pakket 25 ml bed av Q Sepharose fast flow, som hadde blitt ekvilibrert med buffer A.Kolonnen ble eluert med 50 ml buffer A. I hovedsak alt av målproteinet ble gjenvunnet i gj ennomstrømningsbufferen.

Fraksjonene inneholdende målprotein ble dialysert over natten ved 4°C mot 2x2 liter skift av 10 mM natrium-fosfatbuffer -(pH 6,0) inneholdende 5 mM NaCl (buffer B) , klargjort ved sentrifugering ved 10.000 g, og derpå påført ved rom-temperatur til en 20 x 1,5 cm kolonne av S Sepharose fast flow ekvilibert med buffer B. Etter vask av kolonnen med 100 ml buffer B for å fjerne ubundede proteiner og forurensninger som absorberer sterkt ved 260 nm, ble det bundede målprotein eluert med en lineær 3 00 ml gradient av 0-100 mM NaCl i buffer B, hvor eluer ingen av målproteinet inntraff ved omkring 35 mM NaCl. Q Sepharose fast flow og S Sepharose fast flow ble erholdt fra Pharmacia, Piscataway, NJ.

De sammenslåtte fraksjoner av målproteinet som stammet fra S Sepharose - trinnet, ble satt på et 20 ml bed av Bio-Gel

HTP hydroksyapatit på forhånd ekvilibert med buffer B. Kolonnen ble bearbeidet ved romtemperatur og vasket med 50 ml buffer B. Proteinet ble eluert med en lineær 3 00 ml gradient av 100-400 mM natriumfosfat (pH 6,0). Fraksjoner inneholdende målproteinet som eluerer som en bred topp mellom 150-300 ml natriumfosfat ble slått sammen og konsentrert i en ultrafiltreringscelle til et endelig volum på 5 ml. Den konsentrerte proteinoppløsning ble dialysert mot10 mM natriumfosfat (pH 6,0), 50 mM NaCl (buffer D) og lagret ved 4°C. Bio-Gel HTP hydroksyapatit ble kjøpt fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA.

Den foregående metode for opprenskning av det rekombinante proteinprodukt er kun illustratorisk for en passende fremgangsmåte for opprenskning av proteinet ifølge foreliggende oppfinnelse. Andre egnede teknikker kjent i faget, kunne alternativt bli brukt for opprenskning. F.eks. kan S Sepharose-fraksjonen bli konsentrert og satt på en kolonne av Sephacryl S-200 (erholdt fra Pharmacia, Piscataway, NJ) eller andre egnede gelfiltreringsmatriser.

Det resulterende utbytte var 60-70 mg av den rekombinante variasjon av ospA, som dannet fra en 500 ml starterkultur. Under henvisning til figur 11 er dette totale utbytte omtrent 50% som vurdert fra SDS-PAGE av de enkelte fraksjoner, noe som indikerer god hyperekspresjon av den forkortede versjon av ospA-genet i E. coli.

Eksempel 6

Proteinprøver av den rekombinante variasjon av ospA, ble analysert med polyakrylamidgelelektroforese under denatu-rerende betingelser. For fremgangsmåten, se Studier, F.W., "Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels," J. Mol. Biol., 79: 237-248 (1973). Geler ble fiksert og farget med Commassie blue eller de adskilte proteiner ble elektroforetisk overført til nitrocellulose- membraner og probet med [125Tl , ...c3cI]-merket protein A for bundet immunoglobulin. Se Barbour, A.G., "Biology of the Borrelia-species," Yale J. Biol. Med., 57, 581-586 (1984). [<1>25I]-merket protein A (5 x IO<5>cpm/ml) ble erholdt fra DuPont-New England Nuclear.

I enkelte tilfeller ble nitrocellulosemembranene blokkert med 3% gelatin i 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 500 mM NaCl (TBS) i et minimum på én time, og derfor vasket med TBS inneholdende 0,05% Tween 20 (TTBS) før reaksjon med antistoff. Etter fjerning av ubundet antistoff ved flere vasker i TTBS, ble reaktive proteiner påvist ved å bruke afinitetsr-enset alkalisk fosfatase konjugert geite-anti-muse-antistoff og alkalisk fosfatase fargeutviklingsreagenser.

Den native molekylvekt av ospA ble bestemt ved kromatografi eller det rensede protein i buffer A, inneholdende 2 00 mM NaCl ved en strømningshastighet på 1,5 ml/min på en kalibr-ert 2,5 x 120 cm Sephacryl S-200 kolonne ved 4°C. 2 0 aminosyreresidier tilsvarende den N-terminale nukleotidsekvens ble bestemt ved å bruke Edman degraderingsprosed-yren på en Applied Biosystems 470A mikrosekvensator. Aminoterminalsekvensering av de første 20 residier av den rekombinante variasjon av ospA, ga en sekvens som er identisk med den forutsagt fra DNA-sekvensen etter behandling for å fjerne det første metioninresiduum. Den molare ekstinksjonskoeffisient til proteinet ble regnet ut fra kunnskap om dets aminosyresammensetning fra ligningen<E>M,nat<=>(<Abs>nat} (<E>M,Gdn.HC1<>/A>bsGdn.HC1}' Se Gil1'S"<C>-& von Hippel, P.H., "Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data," Anal. Biochem. 182: 319-326 (1989). Den resulterende molare ekstinksjonsk-oef f isient (E28cPvar 10'59 x 1<q3>m~ • Denne verdi ble funnet å være i utmerket overensstemmelse (± 5%) med det som ble erholdt fra analysen av aminosyresammensetningen av syrehydrolysater, avledet fra den rekombinante variasjon av ospA, såvel som å være konsistent med tallene angående det

resulterende proteinutbytte.

Eksempel 7

Reaktivitet en av den rekombinante variasjon av ospA ble undersøkt mot humane antistoff overfor villtype-ospA. Serum fra pasienter med Lyme's lidelse inneholder antistoff mot flere B . bur<q>dorferi-yttermembranproteiner innebefattende ospA. Reaktiv synovialvæske fra pasienter med kronisk Lyme's lidelsesrelatert artritt og ospA-spesifikke antistoff H3TS har ovenfor blitt beskrevet. Se Barbour, A.G., Burgdorfer, W., Grunwaldt, E. og Steere, A.C., "Antibodies of patients with Lyme disease to components of the Ixodes dammini spirochete," J. Clin. Invest., 72: 504-515 (1983). Se også Barbour, A.G., Heiland, R.A. & Howe, T.R., "Heterogeneity of major proteins in Lyme disease borrelia: a molecular analysis of North American and European isolates," J. Infect. Dis., 152: 478-484 (1985).

Under henvisning til figur 13 reagerte antistoff som var tilstede i synovialvæske fra en pasient med Lyme's lidelsesrelatert artritt, sterkt i Western blots med 31-kDa og 34-kDa villtype-ospA og ospB-proteiner fra B. bur<g>dorferi. I tillegg reagerte begge former av ospA syntetisert i E. coli (den rekombinante variasjon eller ospA såvel som villtypeversjonen av full lengde eller ospA syntetisert som en kontroll) også sterkt.

Igjen under henvisning til figur 13, inneholdt brønn 1 helcellelysater (2 x IO<6>celler) av B. burgdorferi(B31) spirochæter, mens brønn 2-4 inneholdt indusert E. coli-celler. Brønn 5 inneholdt den rensede rekombinante variasjon av ospA (0,5 /xg) . Prøver satt på brønn 2-5 var avledet fra celler (6 iil) , som bærer henholdsvis pET9 vektoren, pET9-preospA eller pET9-ospA tre timer etter induksjonen. SDS-12,5% PAGE separerte proteiner ble overført til nitro-cellulose blokkert over natten i 2% bovinserumalbumin og derpå reagert med synovialvæske fra en pasient med Lyme's lidelse. Blottene ble vasket, inkubert med [ 125I]-merket protein A og derpå eksponert til film for autoradigrafi. Posisjonene av villtype B. bur<q>dorferi-ospA og ospB er indikert.

Selv om resultatene viser at begge plasmider uttrykker immunoreaktivt ospA-protein, synes proteiner uttrykt fra pET9-preospA å reagere sterkere enn en ekvivalent mengde av protein produsert fra pET9-ospA. Lignende resultater ble

TM

erholdt når Immobilon , en hydrofobisk polyvinyliden difluoridbasert membran ble brukt som den faste fase for proteinblotting. Det ble hevdet at denne tilsynelatende forskjell i reaktivitet kunne ha blitt forårsaket av dårligere overføring til eller tilbakeholdelse av den rekombinante variasjon av ospA på nitrocellulosemembranen. Den foregående teori ble derpå undersøkt ved å merke indu-35

serte kulturer med [ S] metionin (erholdt fra DuPont-New England Nuclear/spesifikk aktivitet = 1165 Ci/mmol.). Autoradiografi ble brukt for å følge de relative mengder av villtype-ospA såvel som den rekombinante variasjon av ospA, som var tilstede under hvert trinn under Western blot-analysen.

Kulturer av BL21(DE3)/pLysS-celler som bærer pET9-preospA eller pET9-ospA, ble dyrket ved 37°C til midtre logaritmisk fase i M9 medium og indusert med IPTG. En time senere ble hver kultur merket med 20/xCi/ml [ 3 5S] metionin i 5 min. og 10/xl porsjoner ble analysert etter elektroforese på 12,5% geler. Under henvisning til figur 14-18, inneholdt brønn 1 i hvert panel hele, umerkede B. bur<g>dorferi-celler (5 x IO<7>celler). Brønn 2 og 3 inneholdt induserte, merkede celler som henholdsvis bærer pET9-preospA eller pET9-ospA. Proteiner ble gjort synlige ved å farge med Coomassie blue som vist i figur 14, og ved autoradiografi av gelen som vist i figur 15. I figur 16 og 17 er proteinene gjort synlig etter elektroforetisk overføring til nitrocellulosepapir. Figur 16 viser et autoradiogram av nitrocellulosen før videre Western analyse. Figur 17 viser et autoradiogram etter probing med antistoffer. Figur 18 viser et fotografi av det ferdige Western blot etter behandling med alkalisk fosfatase -f argeutviklende reagenser. De tykke piler peker mot den rekombinante variasjon eller ospA, såvel som pET9-preospA-proteiner vist henholdsvis i brønn 1 og 2. De stiplede piler indikerer posisjonen til pET9-ospA-proteinproduktet som opptrer i brønn 3.

Nå under henvisning til figur 14-18, er det tydelig at de relative mengder av villtype-ospA og den rekombinante variasjon av ospA, endret seg under blottingprosedyren. Mengden av den rekombinante variasjon av ospA, som var tilbake etter blottet var probet med antistoff og derpå vasket, var vesentlig redusert i forhold til den opprinne-lig overførte mengde. I motsetning til dette ble villtypeversjonen av ospA, godt gjenvunnet under hvert trinn. Resultatene viste at den tilsynelatende forskjell i reaktivitet av de to former ospA (den rekombinante variasjon og villtypeversjonen) i hovedsak var grunnet selektivt tap av den sterkt oppløselige rekombinante variasjon av ospA under Western blott-analyse.

Konklusjoner og oppsummering av data

Selv om den foregående metode for fremstilling av en rekombinante variasjon av et protein var rettet mot ytter-overf lateprotein A av Borrelia burgdorferi, er metoden like anvendelig på andre Borrelialipoproteiner. forutsatt at signalsekvensen for signalpeptidase 2 opptrer i genet som koder for det aktuelle lipoprotein.

Den forkortede versjon av ospA-genet var en utmerket over-produsent grunnet sin mangel på assosiasjon med vertsorga-nismens cellemembran. Den resulterende rekombinante variasjon av ospA, var ansvarlig for mer enn 50% av det totale cellulærprotein etter et par timer induksjon. Se eksempel 4, 5 og 6. I tillegg blir den rekombinante variasjon av ospA, ikke lipidert og er meget oppløselig (a 50 mg/ml) ved fravær av detergenter. Se eksempel 4. Videre er 60-70 mg rent protein tilgjengelig fra så lite som 0,5 liter utgang-skultur etter en enkel opprenskningsprosedyre grunnet god hyperekspresjon i vertsorganismen. Se eksempel 5 og 6. Western blots av den rekombinante variasjon av ospA, viste at den beholdt immunoreaktive epitopseter. Se eksempel 3 og 7. Denne reaktivitet i forbindelse med de sterkt rensede og oppløselighetssærtrekkene av proteinet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, gjør det til en god kandidat for et diagnostisk middel for å påvise tilstedeværelse av Lyme's lidelse i kliniske isolater, såvel som et potensielt immunogen for en vaksine mot B. burgdorferi.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en terapeutisk aktiv rekombinant variant av overflateproteinet OspA fra Borrelia burgdorferi omfattende en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO:10 med ett eller fler alanin- eller metionin-residuer ved den N-terminale enden av SEQ ID NO:10-se-kvenen,

karakterisert vedå dyrke en egnet mi-kroorganisme som er transformert med et ekspresjonssystem inneholdende en DNA-sekvens som koder for nevnte protein, operativt bundet til transkripsjons- og translasjons-regulerende sekvenser som er i stand til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA-sekvens, hvorpå proteinet isoleres og renses.