JP2003527073A - エーリキア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａｃａｎｉｓ）の相同２８−キロドルトンイムノドミナントタンパク質遺伝子及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）の多型性多重遺伝子属由来の相同免疫反応性２８−ｋＤａタンパク質遺伝子、ＥＣａ２８−１及びＥＣａ２８ＳＡ３のクローニング、シークエンシング及び発現について示している。また、別の２８−ｋＤａタンパク質遺伝子であるＥＣａＳＡ２の全配列も提供する。さらに、エーリキア・カニスの５個すべての相同２８−ｋＤａタンパク質遺伝子がコードされた多重遺伝子座についても開示している。組換え体エーリキア・カニス２８−ｋＤａタンパク質はＥ．カニス感染イヌの回復期相抗血清と反応する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 発明の分野 本発明は一般的には分子生物学の分野に関するものである。より具体的には、
本発明は分子クローニングと、エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）の相同
２８−ｋＤａタンパク質遺伝子及びエーリキア・カニスの２８−ｋＤａ相同タン
パク質をコードする多重遺伝子座の特徴づけ、及びそれらの使用法に関している
。

【０００２】 関連技術の説明 イヌの熱帯性汎血球減少症としても知られているイヌ・エーリキア症は１９３
５年にアフリカで、そして１９６３年に米国でそれぞれ最初に報告されたイヌの
ダニ媒介リッケチア病である（Donatrien及びLestoquard、1934；Ewing、1963）
。この病気はベトナム戦争中に米国の軍用犬で起きた流行病後により良く知られ
るようになった（Walkerら、1970）。

【０００３】 イヌ・エーリキア症の病因体はエーリキア・カニスで、これは単核食細胞に対
する向性を示し（Nyindoら、1971）、褐色のイヌ・ダニであるリピセファルス・
サンギネウス（Rhipicephalus sanguineus）によって媒介される（Grovesら、19
75）小さなグラム陰性の細胞内寄生バクテリアである。イヌ・エーリキア症の伝
播は急性、潜在性、及び慢性の３つの相で起きる。急性相は熱、食欲不振、鬱状
態、リンパ節障害、及び軽度の血小板減少症によって特徴付けられる（Troy及び
Forrester、1990）。イヌは通常急性相から回復するが、数ヶ月あるいは数年間
も疾病の臨床的兆候を示さずにこの微生物の持続的に感染された保菌体となる（
Harrusら、1998）。場合によっては、血小板減少症、高血糖、食欲不振、体重減
少、そして出血、特に鼻出血、さらにそれに続く死によって特徴付けられるよう
な慢性相が発生する（Troy及びForrester、1990）。

【０００４】 １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に基づく分子分類学的解析によれば、Ｅ．カニス（E.
canis）とヒト単球性エーリキア症（ＨＭＥ）の病因体であるＥ．チャフェエン
シス（E. chaffeensis）とが非常に関連性が高いことを明らかになった（Anders
onら、1991；Andersonら、1992；Dawsonら、1991；Chenら、1994）。Ｅ．カニス
とＥ．チャフェエンシスとの間で６４、４７、４０、３０、２９及び２３−ｋＤ
ａ抗原のかなりの交差反応性が報告されている（Chenら、1994；Chenら、1997；
Rikihisaら、1994；Rikihisaら、1992）。免疫ブロットによるヒト及びイヌの回
復期相血清を用いての免疫反応性抗原の解析は３０−ｋＤａタンパク質を含む多
数のイムノドミナントタンパク質の確認につながった（Chenら、1997）。さらに
、Ｅ．カニスの３０−ｋＤａタンパク質は免疫反応の初期において抗原的にＥ．
チャフェエンシスの３０−ｋＤａタンパク質とは異なっていることが認識される
主なイムノドミナント抗原として述べられている（Rikihisaら、1992；Rikihisa
ら、1994）。分子量が２０から３０−ｋＤａの範囲のＥ．カニスのその他のイム
ノドミナントタンパク質も同定されている（Brouquiら、1992；Nyindoら、1991
；Chenら、1994；Chenら、1997）。

【０００５】 最近、２３から２８−ｋＤａタンパク質をコードする多重複遺伝子族（ｏｍｐ
−ｌ）のクローニング及びシークエンシングがＥ．チャフェエンシスに関して報
告されている（Ohashiら、1998）。カウドリア・ルミナンチウム（Cowdria rumi
nantium）ｍａｐ−１遺伝子と相同性の２８−ｋＤａイムノドミナント外膜タン
パク質遺伝子（ｐ２８）がクローン化された。組換え体ｐ２８で免疫化されたマ
ウスをその相同株で意図的に感染させようとしたが、刺激を与えてから５日目に
実施された末梢血液のＰＣＲ解析によれば、感染していなかった（Ohashiら、19
98）。Ｅ．チャフェエンシスｏｍｐ−ｌ遺伝子族及びＣ．ルミナンチウムｍａｐ
−１遺伝子と相同性のタンデムに配列された２つの類似した、しかし、まったく
同一ではないＥ．カニスの２８−ｋＤａ遺伝子の分子クローニングについても報
告されている（Reddyら、1998）。

【０００６】 先行技術はエーリキア・カニスの新しい相同２８−ｋＤa免疫反応性タンパク
質遺伝子及びそれら相同２８−ｋＤａタンパク質遺伝子を含んでいる単一の多重
遺伝子座のクローニング及び特徴づけが行われていない欠点がある。さらに、先
行技術には、エーリキア・カニスのこのような免疫反応性遺伝子の組換え体タン
パク質がないことも先行技術の欠陥である。本発明はこの技術分野におけるこの
長年のニーズと願望を達成するものである。

【０００７】 発明の要約 本発明はエーリキア・カニスの（Ｅｃａ２８−１、ＥＣａ２８ＳＡ３、及びＥ
Ｃａ２８ＳＡ２と命名された）相同成熟２８−ｋＤａ免疫反応性タンパク質遺伝
子の分子クローニング、配列決定、特徴づけ、そして発現と、エーリキア・カニ
スの５つの２８−ｋＤａタンパク質遺伝子（ＥＣａ２８ＳＡ１、ＥＣａ２８ＳＡ
２、ＥＣａ２８ＳＡ３、Ｅｃａ２８−１、ＥＣａ２８−２）を含む単一の座（５
．５９２−ｋｂ）の確認について述べるものである。Ｅ．チャフェエンシスとＥ
．カニスとの２８−ｋＤａタンパク質遺伝子間の比較を行ったところ、ＥＣａ２
８−１はＥ．チャフェエンシスｏｍｐ−１多重遺伝子族とアミノ酸がほとんど相
同であり、Ｅ．カニス単離体の間で高度に保持されていることが明らかになった
。５つの２８−ｋＤａタンパク質は成熟したタンパク質をもたらすシグナルペプ
チドを保有していることが予想され、５１〜７２％の範囲のアミノ酸相同性を有
していた。遺伝子間領域を解析したところ、各遺伝子に対してプロモータ遺伝子
と考えられる領域が明らかになり、このことはこれらの遺伝子が独立に、そして
それぞれ個別的に発現される可能性を示唆している。遺伝子間非コード領域はサ
イズが２９９〜３５５ｂｐで、４８〜７１％の相同性を示した。

【０００８】 本発明の１つの実施の形態で、エーリキア・カニスの３０−ｋＤａ免疫反応性
タンパク質をコードするＤＮＡ配列が提供される。好ましくは、このタンパク質
は配列番号２、配列番号４、及び配列番号６で構成されるグループから選択され
るアミノ酸配列、並びに、遺伝子は配列番号１、配列番号３、及び配列番号５で
構成されるグループから選択される核酸配列を有しており、多型性多重遺伝子族
の一員である。一般的に、このタンパク質は翻訳後プロセスが終了した後に切断
されるＮ末端シグナル配列を有しており、その結果成熟した２８−ｋＤａタンパ
ク質をつくりだす。さらに好ましくは、２８−ｋＤａタンパク質をコードするこ
れらのＤＮＡは、５．５９２ｋｂのサイズを有し、エーリキア・カニスの５つの
相同２８−ｋＤａタンパク質のすべてをコードする単一の多重遺伝子座に含まれ
ている。

【０００９】 本発明の別の実施の形態で、エーリキア・カニスの２８−ｋＤａ免疫反応性タ
ンパク質をコードし、そのベクターが細胞に導入されるとその遺伝子を発現する
ことができる遺伝子で構成される発現ベクターが提供される。

【００１０】 本発明のさらに別の実施の形態で、配列番号２、配列番号４及び配列番号６で
構成されるグループから選択されるアミノ酸配列を含む組換え体タンパク質が提
供される。好ましくは、このアミノ酸は配列番号１、配列番号３及び配列番号５
で構成されるグループから選択される核酸配列によってコードされる。好ましく
はこの組換え体タンパク質は表面露出され、親水性かつ抗原性の４つの可変領域
で構成される。この組換え体タンパク質は抗原として有用である可能性がある。

【００１１】 本発明のさらに別の実施の形態で、それぞれ操作できるように１つのプロモー
タに結合された配列番号２、配列番号４及び配列番号６によって構成されたグル
ープから選択されるアミノ酸配列をコードする配列で構成された発現領域で構成
されるベクターを得るステップと、そのベクターを細胞内にトランスフェクトす
るステップと、そしてその細胞を上記発現領域を発現させるのに有効な条件下で
培養するステップで構成される上記組換え体タンパク質をつくりだす方法が提供
される。

【００１２】 本発明はいくつかの実施の形態で、エーリキア・カニスにさらされた、あるい
はそれに感染されたことが疑われる個体を識別するステップと、エーリキア・カ
ニス感染を抑制するのに有効な量でエーリキア・カニスの２９−ｋＤａ抗原を構
成する組成物を投与するステップで構成される個体のエーリキア・カニス感染を
抑制する方法として述べることも可能である。この抑制はその個体の体液あるい
は細胞免疫応答の刺激、あるいは上記２８−ｋＤａ抗原の正常な機能を抑制した
り、あるいはその個体の体内でなんらかの作用物質と相互作用させるためにその
抗原と競合したりするなどのいずれの手段を通じてでも行うことができる。

【００１３】 本発明の他の、そしてさらなる側面、特徴、及び利点は開示目的のために提供
される本発明の現段階での好ましい実施の形態についての以下の説明を参照する
ことで明らかになるであろう。

【００１４】 発明の詳細な説明 本発明はエーリキア・カニス（Ehrlichia canis）の３０キロ・ドルトン（ｋ
Ｄａ）タンパク質をコードする相同遺伝子のクローニング、配列決定及び発現に
ついて述べるものである。７つのＥ．カニス単離体とＥ．チャフェエンシスｏｍ
ｐ−１多重遺伝子族との間の比較分子解析も行われた。２つの新しい２８−ｋＤ
ａタンパク質遺伝子、ＥＣａ２８−１とＥＣａ２８ＳＡ３とが同定された。ＥＣ
ａ２８−１は推定分子量が３０．５−ｋＤａである２７８アミノ酸のタンパク質
（配列番号２）をコードした、８３４ｂｐオープン・リーディング・フレームを
有している。Ｎ末端シグナル配列が確認されており、このことはそのタンパク質
が２７．７−ｋＤａの成熟したタンパク質に翻訳後修飾されることを意味してい
る。ＥＣａ２８ＳＡ３は２８０アミノ酸タンパク質（配列番号６）をコードする
８４０ｂｐオープン・リーディング・フレームを有している。

【００１５】 Ｅ．カニスの２８−ｋＤａタンパク質遺伝子を増幅するためにＰＣＲを用いて
、ＥＣａ２８ＳＡ２のこれまで配列が未決定であった部分の配列がつきとめられ
た。ＥＣａ２８ＳＡ２の配列解析は、２８３アミノ酸タンパク質（配列番号４）
をコードする８４９ｂｐオープン・リーディング・フレームを明らかにした。２
つの前分離遺伝子座に結合する２８−ｋＤａタンパク質遺伝子遺伝子間非コード
領域に対して固有のプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ったところ、５つの２８
−ｋＤａタンパク質遺伝子を含む単一の遺伝子座（５．５９２−ｋｂ）が示され
た。これら５つの２８−ｋＤａタンパク質は成熟したタンパク質をもたらすシグ
ナルペプチドを有していることが予想され、５１〜７２％の範囲のアミノ酸相同
性を有していた。遺伝子間領域の解析を行ったところ、各遺伝子に対してプロモ
ータと想定される領域が明らかにされたが、このことはこれらの遺伝子が独立的
に異なって発現されている可能性があることを示唆している。遺伝子間非コード
領域（２８ＮＣ１−４）はサイズが２９９から３５５ｂｐの範囲で、４８〜７１
％の相同性を示した。

【００１６】 本発明はエーリキア・カニスの２つの新しい相同２８−ｋＤａタンパク質遺伝
子、ＥＣａ２８−１とＥＣａ２８ＳＡ３と、これまで部分的にしか配列決定され
ていなかったＥＣａ２８ＳＡ２の完全な配列に関するものである。さらに、エー
リキア・カニスの２つの相同２８−ｋＤａ外膜タンパク質のすべてをコードして
いる多重遺伝子座も開示されている。

【００１７】 本発明の１つの実施の形態で、エーリキア・カニスの３０−ｋＤａ免疫反応性
タンパク質をコードするＤＮＡ配列が提供される。好ましくは、このタンパク質
は配列番号２、配列番号４及び配列番号６で構成されるグループから選択される
アミノ酸配列を有しており、その遺伝子は配列番号１、配列番号３及び配列番号
５で構成されるグループから選択される核酸配列を有しており、多型性多重遺伝
子族に属している。より好ましくは、このタンパク質は翻訳後プロセスで切断さ
れて成熟した２８−ｋＤａタンパク質をもたらすＮ末端シグナル配列を有してい
る。さらに好ましくは、２８−ｋＤａタンパク質をコードするＤＮＡはサイズが
５．５９２ｋｂでエーリキア・カニスの５つの相同性２８−ｋＤａタンパク質の
すべてをコードする単一の多重遺伝子座に含まれている。

【００１８】 本発明の別の実施の形態で、エーリキア・カニスの２８−ｋＤａ免疫反応性タ
ンパク質をコードする遺伝子を含み、細胞内に導入された時にその遺伝子を発現
することができる発現ベクターが提供される。

【００１９】 本発明のさらに別の実施の形態で、配列番号２、配列番号４及び配列番号６で
構成されるグループから選択されるアミノ酸配列を含む組換え体タンパク質が提
供される。好ましくは、上記アミノ酸配列は配列番号１、配列番号３及び配列番
号５で構成されるグループから選択される核酸配列によってコードされる。好ま
しくは、この組換え体タンパク質は表面露出され、親水性で抗原性の４つの可変
領域で構成されている。さらに好ましくは、この組換え体タンパク質は抗原であ
る。

【００２０】 本発明のさらに別の実施の形態で、１つのプロモータに作用するように結合さ
れた配列番号２、配列番号４及び配列番号６で構成されるグループから選択され
るアミノ酸配列をコードする配列を含む発現領域を有するベクターを得るステッ
プと、そのベクターを細胞にトランスフェクトするステップと、そしてその発現
領域を発現するのに有効な条件下でその細胞を培養するステップで構成される上
記組換え体タンパク質を製造する方法が提供される。

【００２１】 この発明は、いくつかの実施の形態では、エーリキア・カニスにさらされた、
あるいはそれに感染されていると疑われる患者を識別するステップと、エーリキ
ア・カニスの２８−ｋＤａ抗原を含む組成物をエーリキア・カニス感染を抑制す
るのに有効な量だけ投与するステップを含む患者のエーリキア・カニス感染を抑
制する方法が提供される。抑制は、このような、すなわち、患者の体液又は細胞
免疫応答の刺激、又は、上記２８−ｋＤａ抗原の正常な機能を阻害、あるいは、
その患者の体内で何らかの薬剤による相互作用に関してその抗原と競合するなど
の何らかの手段を通じて行われる。

【００２２】 本発明によれば、通常の分子生物学、微生物学、及び遺伝子組換え体ＤＮＡ技
術を先行技術の範囲内で用いることができる。こうした技術は種々の文献に十分
に述べられている。例えば、Manitias, Fritsch & Sambrook. "Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach."
Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M
. J. Gait et. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S.J. Hi
ggins eds. (1985)]: "Transcription and Translation" [B.D. Hames & S.J. H
iggins eds. (1984)]: "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)];
"Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press. (1986)]: B. Perbal. "A Pract
ical Guide to Molecular Cloning" (1984)を参照。

【００２３】 従って、ここで用いられている場合、以下の用語は以下に述べられるように定
義される。

【００２４】 『レプリコン』という用語は（例えば、プラスミド、染色体、ウィルスなどの
）イン・ビボでＤＮＡ複製の自律単位として機能することができる、つまりそれ
自体の制御下で複製を行うことができる遺伝子要素である。

【００２５】 『ベクター』とは、別のＤＮＡセグメントが取り付いて、その取り付けられた
セグメントの複製を行うことができるようなプラスミド、ファージ、あるいはコ
スミドなどのレプリコンである。

【００２６】 『ＤＮＡ分子』とは一本鎖形状であれ、二本鎖らせん形状であれ、重合体形状
のデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、又はシトシン）を
指している。この用語はその分子の一次及び二次構造だけを意味し、いかなる特
殊な三次耕造に限定するものではない。従って、この用語は、とりわけ、線形Ｄ
ＮＡ分子（例えば、制限フラグメントなど）、ウイルス、プラスミド、及びクロ
モソームに見出されるような二本鎖ＤＮＡを含んでいる。この構造について以下
に検討する場合、ＤＮＡの非転写ストランドに沿って５'−３'方向の配列だけ（
つまり、ｍＲＮＡとの相同の配列を有するストランド）を示すという従来の方法
を用いる。

【００２７】 ＤＮＡ『コード配列』は適切な調節配列の制御下に置かれるとイン・ビボでポ
リペプチドに転写され、翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。このコード配列の
境界は５'（アミノ）末端での開始コドンと３'（カルボキシル）末端の翻訳停止
コドンによって決められる。コード配列は原核生物配列、真核細胞のｍＲＮＡか
らのｃＤＮＡ、真核細胞の（例えば、哺乳動物の）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配
列、そして、合成ＤＮＡ配列などを含むことができる。ポリアデニル化信号及び
転写停止配列は通常コード配列から３'側に配置される。

【００２８】 転写及び翻訳制御配列は宿主細胞内でのコード配列の発現をもたらすプロモー
タ、エンハンサ、ポリアデニル化信号、ターミネータなどのＤＮＡ調節配列であ
る。

【００２９】 『プロモータ配列』とは細胞内のＲＮＡポリメラーゼと結合して下流の（３'
方向の）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ規制領域である。本発
明の定義の目的上、プロモータ配列はその３'末端で転写開始サイトを境界とし
、上流に（５'方向に）延びて背景との対比で検出可能なレベルで転写を開始さ
せるのに必要な要素を最小限の塩基あるいは元素を含んでいる。プロモータ配列
の内部に転写開始サイトとＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合
領域（コンセンサス領域）が見出される。真核細胞プロモータは、常にではない
が多くの場合、“ＴＡＴＡ”ボックス及び“ＣＡＴ”ボックスを含んでいる。原
核細胞プロモータは−１０及び−３５コンセンサス配列に加えてシャイン−ダル
ガノ配列を含んでいる。

【００３０】 『発現制御配列』とは別のＤＮＡ配列の転写と翻訳を制御、調節するＤＮＡ配
列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡ内に転写
して、それが次にそのコード配列でコードされるタンパク質に翻訳される場合に
、１つの細胞内で転写及び翻訳制御の『制御下』にある。

【００３１】 『シグナル配列』はコード配列の近くに含めることができる。この配列はシグ
ナルペプチド、Ｎ末端をポリペプチドにコードし、それが宿主細胞に対してその
ポリペプチドを細胞表面の方向に向かわせるか、あるいはそのポリペプチドを培
地内に分泌させるように伝え、そしてこの信号ペプチドがそのタンパク質が細胞
を出て行く前に宿主細胞によってクリップ・オフされる。信号配列は原核生物及
び真核生物に本来存在している種々のタンパク質と結合して見出される場合があ
る。

【００３２】 本発明によるプローブに関連してここで用いられている『オリゴヌクレオチド
』という用語は２つ以上、好ましくは３つより多いリボヌクレオチドで構成され
た分子と定義されている。その正確なサイズは多くの因子に依存するが、それら
の因子もそのオリゴヌクレオチドの最終的な機能と使用に依存している。

【００３３】 ここで用いられている『プライマー』という用語は純粋な制限消化の場合のよ
うに自然に発生するか又は人工的につくりだされるかには関係なく、核酸ストラ
ンドに対して相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘発されるような条件下で
、つまり、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼなどの誘発剤の存在と適切な温度
及びｐＨの下で合成開始ポイントとして作用することができるオリゴヌクレオチ
ドを指している。プライマーは一本鎖であっても二本鎖であってもよく、誘発剤
の存在下で望ましい伸長生成物の合成を起こさせるのに十分な長さでなければな
らない。プライマーの正確な長さは温度、プライマーの発生原、及びその方法の
用い方などの多くの要因に依存している。例えば、診断的な応用目的のためには
、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチド・プライマーは通常１５〜２
５、あるいはそれ以上のヌクレオチドを含んでいるが、より少数のオリゴヌクレ
チドを含んでいる場合もある。

【００３４】 プライマーは本発明においては特定の標的ＤＮＡ配列の異なったストランドに
対して『実質的に』相補的であるように選択される。このことは、それらのプラ
イマーがそれらの対応するストランドとハイブリダイズするのに十分な程度に相
補的でなければならないことを意味している。従って、プライマー配列はテンプ
レートの正確な配列を反映している必要はない。例えば、非相補性ヌクレオチド
・フラグメントをそのプライマーの５'末端に取り付けて、そのプライマーの残
りの部分をそのストランドに対して相補的にすることができる。あるいは、その
プライマーがその配列と十分な相補性を有しているか、あるいはそれとハイブリ
ダイズして、それによって伸長生成物合成のためのテンプレートを形成するので
あれば、非相補性塩基あるいはより長めの配列をそのプライマーに散在させるこ
とができる。

【００３５】 ＤＮＡがその細胞に導入された場合に、細胞は外因性あるいは異質なＤＮＡに
よって『形質転換』されたことになる。形質転換性ＤＮＡはその細胞のゲノムに
融合される（共有結合で結合される）場合とされない場合がある。原核生物、例
えばイースト菌及び哺乳動物の細胞においては、形質転換ＤＮＡはプラスミドな
どのエピソーム性要素上に保持される場合がある。真核細胞の場合、安定的に形
質転換される細胞とは形質転換ＤＮＡがクロモソームに融合されて、それがクロ
モソーム複製を通じて娘細胞に受け継がれる細胞である。この安定性はその真核
細胞がその形質転換ＤＮＡを含む一群の娘細胞で構成される細胞株あるいはクロ
ーンを確立する能力で示される。『クローン』は有糸分裂によって１つの細胞あ
るいは直系から誘導される細胞の群である。『細胞株』とは多くの世代にわたっ
てイン・ビトロで安定した成長を行うことができる一次細胞のクローンである。

【００３６】 ２つのＤＮＡ配列は、それらのヌクレオチドの少なくとも約７５％（好ましく
は少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％あるいは９５
％）がＤＮＡ配列の定義された長さにおいて一致する場合に『実質的に相同』で
ある。実質的に相同な配列は配列データ・バンクで入手できる標準的なソフトウ
エアを用いることで、あるいは、例えばその特定のシステムに対して定義される
ような厳格な条件下でサザン・ハイブリダイゼーション実験でそれらの配列を比
較することによって確認することができる。適切なハイブリダイゼーション条件
を決めることは先行技術の範囲内である。上記Maniatis et al.;DNA Cloning, V
ols. I & II;Nucleic Acid Hybridization,参照。

【００３７】 ＤＮＡ構造の『異質』領域とは、自然ではそれより大きな分子と結合した状態
では見出されないより大きなＤＮＡ分子内のＤＮＡの識別可能なセグメントであ
る。従って、その異質領域は哺乳動物の遺伝子をコードする場合、遺伝子は通常
供給原生物のゲノムにおいては哺乳動物ゲノムＤＮＡを分岐しないＤＮＡによっ
て分岐される。別の例で、コード配列はそのコード配列自体が自然では見出され
ない構成物（例えば、ゲノム性コード配列がイントロンを含んでいるｃＤＮＡ、
あるいは天然の遺伝子とは異なったコドンを有する合成配列など）である。対立
遺伝子上の違いあるいは自然発生的な突然変異事象はここに定義されているよう
なＤＮＡの異質領域を発生させない。

【００３８】 これらの研究のために最も一般的に用いられるラベルは放射性元素、酵素、紫
外線に露出された場合に蛍光を発する化学物質などである。多数の蛍光物質が知
られており、ラベルとして用いることができる。これらには、例えば、フルオレ
セイン、ローダミン、オーレミン、テキサス・レッド、ＡＭＣＡブルー、及びル
シフェル・イエローである。特殊な検出用物質はヤギの体内でつくられ、イソチ
オシアネートを通じてフルオレセインと結合される抗ウサギ抗体である。

【００３９】 タンパク質は放射性元素あるいは酵素でもラベルすることができる。放射性ラ
ベルは現在利用可能ないずれの計数手順を用いてでも検出することができる。好
ましい同位元素は³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³⁶Ｃｌ、⁵¹Ｃｒ、⁵⁷Ｃｏ、⁵⁸Ｃｏ、^{5 9} Ｆｅ、⁹⁰Ｙ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、及び¹⁸⁶Ｒｅから選択できる。

【００４０】 酵素ラベルも同様に有益で、現在用いられている比色解析、分光光度測定、蛍
光分光度測定、電流測定、あるいはガス測定などの手法のいずれかを用いて検出
することができる。酵素はカルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデ
ヒドなどの架橋性分子との反応によって選択された粒子の結合される。これらの
手順で用いることができる多くの酵素が知られており、用いることができる。好
ましいのはペルキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコース・オキシダーゼ＋ペルキシ
ダーゼ、及びアルカリ性ホスファターゼである。その他のラベル用物質及び方法
の開示については、米国特許第３，６５４，０９０号、第３，８５０，７５２号
、及び第４，０１６，０４３号を参照されたい。

【００４１】 ここで用いられる場合、『宿主』とは原核細胞だけでなく、イースト菌、植物
、及び動物細胞などの真核細胞もその意味に含んでいる。本発明によるエーリキ
ア・カニスの２８−ｋＤａ免疫反応性タンパク質をコードする組換え体ＤＮＡ分
子あるいは遺伝子を用いて、当業者に一般的に知られている技術を用いて宿主を
形質転換させることができる。特に好ましいのは原核細胞を形質転換させる目的
での本発明によるエーリキア・カニスの２８−ｋＤａ免疫反応性タンパク質をコ
ードする遺伝子に関するコード配列を含むベクターの使用である。

【００４２】 原核細胞宿主は大腸菌（E. coli）、Ｓ．チミフィムリウム（S. tymphimurium
）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、及びバシラス・サブ
チリス（Bacillus subtilis）などである。真核性宿主はピキア・パストリス（P
ichia postoris）、哺乳動物細胞、及び昆虫細胞などである。

【００４３】 一般的に、挿入されたＤＮＡフラグメントの効率的な転写を容易に行わせるプ
ロモータ配列を含む発現ベクターは宿主との関連で用いられる。発現ベクターは
通常複製の開始点、プロモータ、ターミネータ、そして形質転換された細胞にお
ける表現型選択を行うことができる特異的な遺伝子を含んでいる。形質転換され
た宿主は最適な細胞成長を行わせるためにその技術分野で知られている手段によ
って発酵、培養させることができる。

【００４４】 本発明は、そのＤＮＡのストランドが高度の厳重な条件の下で配列番号１又は
配列番号３又は配列番号５の少なくとも１５の連続したヌクレオチドの配列を含
んでいるプローブにハイブリダイズするストランドでエーリキア・カニスの２８
−ｋＤａ免疫反応性タンパク質をコードする実質的に純粋なＤＮＡを含んでいる
。この発明によるＤＮＡでコードされるタンパク質は配列番号２又は配列番号４
又は配列番号６でリストされているアミノ酸と少なくとも８０％（好ましくは８
５％、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５％）の配列同一性を有
している。より好ましくは、そのＤＮＡは配列番号１又は配列番号３又は配列番
号５のヌクレオチドのコード配列、あるいはそれらの配列の変性した変異体を含
んでいる。

【００４５】 本発明によるＤＮＡがハイブリダイズするプローブは好ましくは配列番号１又
は配列番号３又は配列番号５、あるいはそれらの相補体の少なくとも２０の連続
したヌクレオチド、より好ましくは４０のヌクレオチド、さらに好ましくは５０
のヌクレオチド、そして最も好ましくは１００あるいはそれ以上（最大１００％
）のヌクレオチドの配列で構成されている。こうしたプローブは、（ａ）その細
胞から得られるｍＲＮＡをラベルされたハイブリダイゼーション・プローブと接
触させるステップと、そして（ｂ）そのｍＲＮＡとプローブとのハイブリダイゼ
ーションを検出するステップによってヒトの細胞内でのエーリキア・カニスの上
記２８−ｋＤａ免疫反応性タンパク質の発現を検出する上で有効である。

【００４６】 本発明はまた、配列番号１又は配列番号３又は配列番号５にリストされている
ヌクレオチドからの領域の少なくとも１５（好ましくは２０、より好ましくは３
０、さらに好ましくは５０、そして最も好ましくはほぼすべての）の連続したヌ
クレオチドの配列を含んでいる。

【００４７】 『高度の厳しい』とは高温、及び低塩分濃度、例えば、約０．１ｘＳＳＣ、あ
るいは機能的にそれとほぼ同様に塩分濃度で６５℃の温度下などの洗浄条件など
によって特徴付けられるＤＮＡハイブリダイゼーション及び洗浄条件を意味して
いる。例えば、高度に厳しい条件とは約５０％ホルムアミドの存在下で４２℃の
温度でのハイブリダイゼーション、１％ＳＤＳを含む約２ｘＳＳＣによる約６５
℃の温度下での第１回目の洗浄、そしてその後での約０．１ｘＳＳＣを用いての
約６５℃の温度下での二回目の洗浄などのステップを含んでいる。

【００４８】 『実質的に純粋なＤＮＡ』とは、そのＤＮＡが自然に発生する環境において、
その環境の一部あるいはすべての分子の分離（部分的あるいは全体的精製）によ
って、あるいは権利請求されるＤＮＡから分岐する配列の変性によってその環境
の一部ではなくなっているＤＮＡを意味している。従って、この用語は、例えば
、ベクター、自律的に複製するプラスミドやウイルス、あるいは原核または真核
細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる、あるいは別個の分子（例えば、ｃＤＮＡや
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）や制限エンドヌクレアーゼ消化によってつくりだ
されるゲノムやｃＤＮＡフラグメントなど）他の配列には依存しない独立の分子
として存在する組換え体ＤＮＡを含む。それは又、追加的なポリペプチド配列を
コードするハイブリッド遺伝子、例えば融合タンパク質の一部である組換え体を
含んでいる。さらに、エーリキア・カニスの２８−ｋＤａ免疫反応性タンパク質
をコードする遺伝子の別のスプライス変種をコードする配列番号１又は配列番号
３又は配列番号５に示されるヌクレオチドの一部を含む組換え体ＤＮＡもこれに
含まれる。

【００４９】 このＤＮＡは配列番号１又は配列番号３又は配列番号５にリストされているヌ
クレオチドのコード配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５
％（例えば、少なくとも８０％）、そして最も好ましくは少なくとも９０％の配
列同一性を有している。２つの配列間の同一性は一致している、あるいは同一の
位置の数の直接の関数である。それら２つの配列の両方におけるサブユニット位
置が同じ単量体サブユニットで占められている場合、例えば、与えられた位置が
２つのＤＮＡ分子のそれぞれでアデニンで占められている場合、それらはその位
置で一致している。例えば、長さが１０ヌクレオチドの配列内の７つの位置が第
２の１０−ヌクレオチド配列の対応する位置と同じであれば、その場合２つの配
列は７０％の配列同一性を有している。比較配列の長さは通常は少なくとも５０
ヌクレオチド、好ましくは６０ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも７５
ヌクレオチド、そして最も好ましくは１００ヌクレオチドである。配列同一性は
通常は配列解析ソフトウエア（例えば、ウイスコンシン大学バイオテクノロジー
センター(1710 University Avenue, Madison, WI 53705)、遺伝コンピューター
グループの配列解析ソフトウエアパッケージ）を用いて測定される。

【００５０】 本発明はエーリキア・カニスの２８−ｋＤ免疫反応性タンパク質をコードする
遺伝子がコードされたＤＮＡ配列を含むベクターで構成されており、そのベクタ
ーは、操作可能な接合体の、ａ）複製の開始点、ｂ）プロモータ、そしてｃ）前
記タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み宿主内で複製を行うことができる。
好ましくは、本発明によるこのベクターは配列番号１又は配列番号３又は配列番
号５に示されているＤＮＡ配列の一部である。

【００５１】 『ベクター』は複製可能な核酸構成物、例えばプラスミド又はウイルス核酸と
して定義することができる。ベクターはエーリキア・カニスの２８−ｋＤａ免疫
反応性タンパク質をコードする核酸を増幅し及び／又は発現させるために用いる
ことができる。発現ベクターはポリペプチドをコードする核酸配列が細胞内で有
効にそのポリペプチドを発現させることができる適切な制御配列に操作可能に結
合された複製可能な構成物である。こうした制御配列に対する必要性は選択され
た細胞と採用される形質転換方法に応じて変わる。一般的には、制御配列は転写
プロモータ及び／又はエンハンサ、適切なｍＲＮＡリポソーム結合サイト、そし
て転写と翻訳の停止を制御する配列を含んでいる。適切な転写及び翻訳制御信号
を含む発現ベクターを構成するために当業者に公知の方法を用いることができる
。例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(2nd Ed.), Cold Spring Harbor Press, N.Yに記載されている技術参照。遺伝子
とその転写制御配列は、その転写制御配列がその遺伝子の転写を有効に制御する
場合に、『操作できるように結合された』状態にあると定義される。本発明によ
るベクターはプラスミド・ベクター及びウイルスベクターなどを含んでいる。本
発明による好ましいウイルスベクターとはレトロウイルス、アデノウイルス、ア
デノ随伴ウイルス、ＳＶ４０ウイルス、あるいはヘルペス・ウイルスを含んでい
る。

【００５２】 『実質的に純粋なタンパク質』という表現は自然の状態ではそれに付随する他
の構成要素の少なくとも一部から分離されているタンパク質を意味している。通
常、このタンパク質は、そのタンパク質がイン・ビボで通常結合しているタンパ
ク質及びその他の自然発生的有機分子の重量で少なくとも６０％を含んでいなけ
れば、実質的に純粋な状態にあると言える。好ましくは、その調製物の純度は重
量で少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましく
は少なくとも９９％である。エーリキア・カニスのほぼ純粋な２８−ｋＤａ免疫
反応性タンパク質は、例えば、自然の供給原からの抽出、エーリキア・カニスの
２８−ｋＤａ免疫反応性タンパク質をコードする組換え体核酸の発現、あるいは
そのタンパク質の化学的合成によって得ることができる。純度はエーリキア・カ
ニスの２８−ｋＤａ免疫反応性タンパク質に対して特異性を示す抗体を用いた免
疫親和性クロマトグラフィなどのカラム・クロマトグラフィ、ポリアクリルアミ
ド・ゲル電気泳動、あるいはＨＰＬＣ解析などのいずれかの適切な方法によって
測定することができる。タンパク質は、自然の状態ではそれに付随している汚染
物質の少なくとも一部から分離されている場合にほぼそれらの自然な状態で関連
している成分をほぼ含んでいない状態にある。従って、化学的に合成されるか自
然な状態でそれが発生してくる細胞とは異なった細胞システム内でつくられるタ
ンパク質は、定義上、その自然な状態で結合している成分を基本的に含んでいな
い。従って、実質的に純粋なタンパク質は大腸菌内で合成された真核性タンパク
質、他の原核細胞、あるいは自然な状態では発生しない他の生物を含んでいる。

【００５３】 実質的に全長のタンパク質に加えて、本発明はまたエーリキア・カニスの上記
２８−ｋＤａ免疫反応性タンパク質（配列版番号２又は配列番号４又は配列番号
６）のフラグメント（例えば、抗原性フラグメント）を含んでいる。ここで用い
られている『フラグメント』という用語は、ポリペプチドに対して用いられる場
合と同様、長さが、通常少なくとも１０残基、より一般的には少なくとも２０残
基、そして好ましくは少なくとも３０（例えば５０）残基であるが、元のままの
完全な配列よりは短い。エーリキア・カニスの２８−ｋＤａ免疫反応性タンパク
質のフラグメントは当業者に知られている方法、例えば、エーリキア・カニスの
自然発生的な、あるいは組換え体２８−ｋＤａ免疫反応性タンパク質の酵素消化
、エーリキア・カニスの２８−ｋＤａ免疫反応性タンパク質の定義されたフラグ
メントをコードする発現ベクターを用いた組換え体ＤＮＡ技術、あるいは化学合
成によって発生させることができる。候補のフラグメントのエーリキア・カニス
の２８−ｋＤａ免疫反応性タンパク質の特徴を示す能力（例えば、エーリキア・
カニスの２８−ｋＤａ免疫反応性タンパク質に対して特異性を発揮する抗体への
結合）はここで述べられているような方法で評価することができる。エーリキア
・カニスの精製された２８−ｋＤａ免疫反応性タンパク質は又はエーリキア・カ
ニスの２８−ｋＤａ免疫反応性タンパク質のフラグメントは当業者に公知の標準
的な手順を用いて新しい抗体を発生させたり、あるいは既存の抗体を（例えば、
診断アッセイにおけるポジティブ・コントロールとして）テストするために用い
ることができる。本発明にはエーリキア・カニスの２８−ｋＤａ免疫反応性タン
パク質、あるいはエーリキア・カニスの２８−ｋＤａ免疫反応性タンパク質のフ
ラグメントを、例えばウサギにおける免疫原として用いることによって発生され
るポリクローナル抗血清も含まれている。この技術分野の当業者に知られている
モノクローナル及びポリクローナル抗体に対する標準手順が用いられる。この手
順で発生されるモノクローナル抗体は組換え体エーリキア・カニスｃＤＮＡクロ
ーンを識別し、それらを知られているｃＤＮＡクローンから区別することができ
る能力を有しているかどうかに関してスクリーニングすることができる。

【００５４】 本発明にはさらに、配列番号１又は配列番号３又は配列番号５の部分によって
少なくとも部分的にコードされるエーリキア・カニスの２８−ｋＤａ免疫反応性
タンパク質のフラグメント、例えば、別のｍＲＮＡスプライシングやタンパク質
処理の生成物、あるいはその配列の一部が欠失されているフラグメントも含まれ
る。そのフラグメント、あるいは元のままのエーリキア・カニスの２８−ｋＤａ
免疫反応性タンパク質は、例えば、ラベル、リガンド、あるいは抗原性を増幅さ
せる手段として機能する別のポリペプチドに共有結合で結合されている場合もあ
る。

【００５５】 『薬学的に受け入れ可能な』という表現はヒトに投与された場合にアレルギー
性あるいは同様の不都合な反応を起こさない分子構成体及び組成物を指している
。タンパク質を活性成分として含んでいる水性組成物の調製はこの技術分野では
良く知られている。通常、そうした組成物は液体溶液あるいは懸濁液のいずれか
の注射剤、あるいは注射する前に液体に溶解あるいは懸濁させるのに適した個体
形状でも調製することができる。この調製物は乳剤化させることもできる。

【００５６】 タンパク質は中性あるいは塩形状で組成物に処方することもできる。薬学的に
受け入れ可能な塩は、（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）酸添加塩そし
て例えば塩酸やリン酸などの有機酸、あるいは酢酸、オキサル酸、酒石酸、マン
デル酸などの無機酸で形成される酸添加塩である。遊離カルボキシル基で形成さ
れる塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、あるい
は水酸化鉄などの無機塩、そして、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒ
スチジン、プロカインなどの有機塩基からも誘導することができる。

【００５７】 製剤化されたら、溶液は用量処方に合致した方法で、そして治療的に有効な量
で投与される。この製剤は注射用溶剤など種々の用量形態で簡単に投与すること
ができる。

【００５８】 例えば、水溶液で非経口投与する場合は、その溶液は必要があれば適切に緩衝
剤を加えるべきであり、その液体希釈物は先ず十分な食塩あるいはグルコースな
どで等張化される。これらの特殊な水溶液は静脈内、筋肉内、皮下、及び複膜内
投与に特に適している。この関連で用いることができる滅菌水性媒体は本開示を
参照すれば当業者には容易に分かるであろう。例えば、１回分の用量を１ｍＬの
等張ＮａＣｌ溶液に溶解することもできるし、１０００ｍＬの皮下注射用流体に
加えても、あるいは提案されている輸液サイトに注射してもよい（例えば、"Rem
ington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 及び1570
−1580参照）。用量の一定の変更は措置される個体の状態に応じて必然的に変わ
るであろう。投与に責任を有する人はいずれにせよその患者個人に対して適切な
用量を選択することになろう。

【００５９】 良く知られているように、与えられたポリペプチドはそれぞれ免疫原性が違っ
ている可能性がある。従って、免疫原（例えば、本発明のポリペプチド）を担体
と組み合わせる必要性もしばしば生じる。例として示す、そして好ましい担体は
キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）及びヒト血清アルブミンであ
る。他の担体にはＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ８、その他のようなアジュバント及びリ
ンフォカインが含まれる。

【００６０】 ポリペプチドを担体タンパク質に結合される手段はこの技術分野で良く知られ
ており、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサク
シンイミド・エステル、カルボ−ジイミド、及びビス−ビアゾ化ベンジジンが含
まれる。ペプチドがこの技術分野で良く知られている遺伝子工学技術でタンパク
質に結合できることも知られている。

【００６１】 この技術分野で良く知られているように、特定の免疫原に対する免疫原性はア
ジュバントとして知られている免疫応答の非固有スティミュレータを用いること
で増強させることができる。例示的かつ好ましいアジュバントは完全なＢＣＧ、
デトックス、（ＲＩＢＩ、Immunochem Research Inc．）ＩＳＣＯＭＳ及び水
酸化アルミニウムアジュバント（Superphos、Biosector）などである。

【００６２】 ここで用いられているように、『相補的』という用語は第１の核酸配列とハイ
ブリダイズして厳しい条件下で二重ストランド分子を形成する核酸のストランド
を定義するために用いられる。厳しい条件とは高度の相同性を有する２つの核酸
配列間のハイブリダイゼーションを可能とするが、ランダムな配列のハイブリダ
イゼーションは行わせないようにする条件である。例えば、低温度及び／又は高
イオン力でのハイブリダイゼーションは低い厳しさと称され、高温及び／又は低
イオン力でのハイブリダイゼーションは高い厳しさと称される。望ましい厳しさ
の温度とイオン力は特定のプローブ長、配列の長さ及び塩基含量、そしてハイブ
リダイゼーション混合物におけるホルムアミドの存在に対応することが知られて
いる。

【００６３】 ここで用いられる場合、『加工された』あるいは『組換え体』細胞とはエーリ
キア・チャフェエンシス抗原をコードする遺伝子など組換え体遺伝子が導入され
た細胞を意味する。従って、加工された細胞は組換えで導入された遺伝子を含ま
ない天然に発生する細胞から区別することができる。加工された細胞は従って人
間の手によって導入された１つ又は複数の遺伝子を有する細胞である。遺伝子組
換え的に導入された遺伝子はｃＤＮＡ遺伝子、ゲノム遺伝子のいずれの形状であ
り、その特定の導入された遺伝子と自然では結合していないプロモータに隣接し
て位置する遺伝子を含んでいる。さらに、組換え体遺伝子は宿主ゲノム内に融合
されてもよいし、ベクターに含まれていてもよいし、あるいは宿主細胞内にトラ
ンスフェクトされたバクテリアゲノムに含まれていてもよい。

【００６４】 以下の実施例は本発明の種々の実施の形態を示すためのものであって、いかな
る意味でも本発明を限定することは意図していない。

【００６５】 実施例１ エーリキア及び精製 エーリキア・カニス（フロリダ株及び単離体デーモン、DJ、ジェイク、及びフ
ァジー）はEdward Breitshwerdt博士（College of Veterinary Medicine, Nort
h Carolina State University, Raleigh, NC）から提供された。エーリキア・カ
ニス（ルイジアナ株）はRichard E. Corstvet博士（School of Veterninary,
Louisiana State University, Baton Rouge, LA）により提供され、エーリキア
・カニス（オクラホマ株）はJacqueline Dawson博士（Centers for Disease
Control and Prevention，Atlanta，GA）により提供された。エーリキアの
増殖は１０％仔ウシ血清及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンで補強されたＤＭＥＭを用
いて３７℃の温度下で、ＤＨ８２細胞内で行われた。ＤＨ８２細胞内での細胞内
成長は一般的な細胞染色方法を用いてエーリキア・カニス・モルラエの存在によ
ってモニターされた。１００％の細胞がエーリキアで感染された時に細胞を取出
して、１７，０００ｘｇで２０分間遠心分離にかけることでペレット化した。細
胞ペレットをBraun−Sonic２０００音波処理器により氷上で４０Ｗで３０秒間、
２度破壊した。エーリキアを公知の方法（Weissら、１９７５）で精製した。溶
解物を４２％−３６％−３０％レノグラフィンの不連続勾配にかけて、８０，０
００ｘｇで１時間遠心分離にかけた。エーリキアを含んでいる重く明るいバンド
を回収して、スクロース−リン酸−グルタメート緩衝液（ＳＰＧ、２１８ｍＭサ
クロース、３．８ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、７．２ｍＭ Ｋ₂ＨＰＯ₄、４．９ｍＭ グ
ルタメート、ｐＨ７．０）で洗浄して、遠心分離でペレット化した。

【００６６】 実施例２ 核酸調製 エーリキア・カニスのゲノムＤＮＡを公知の方法（McBride et al、1996）
と同様に、１％硫酸ドデシル（ＳＤＳ、ｗ／ｖ）と１００ｍｇ／ｍｌのプロテイ
ンナーゼＫで補強した１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）６００μｌ内で
レノグラフィン精製されたエーリキアを再懸濁させて調製した。この混合物を５
６℃の温度下で１時間インキュベーションして、フェノール／クロロホルム／イ
ソアミル・アルコール（２４：２４：１）の混合物で２度抽出した。ＤＮＡを無
水エタノール沈殿反応でペレット化して、７０％エタノールで１度洗浄し、乾燥
してから、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）内に再懸濁させた。プラスミドＤ
ＮＡは高純度プラスミド分離キット（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN
）を用いて精製し、ＰＣＲ生成物はQIAquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen，Sant
a Clarita，CA）を用いて精製した。

【００６７】 実施例３ エーリキア・カニス２８−ｋＤＡタンパク質遺伝子のＰＣＲ増幅 ＰＣＲ増幅のために選択されたＥ．カニスＥＣａ２８−１遺伝子の領域はＥ．
チャフェエンシス ｐ２８とカウドリア・ルミナンチウムｍａｐ−１遺伝子のJo
rtun−Heinアルゴリズム整合から作成されたコンセンサス配列において（９０％
以上で）観察される相同性に基づいて選ばれた。フォワードプライマー７９３（
５−ＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＴＴＡＣＴＣ−３’）（配列番号１６）及び
リバースプライマー１３３０（５’−ＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＧＴＴＣＴＡＴＧ
ＣＣ−３’）（配列番号１７）はカウドリア・ルミナンチウムｍａｐ−１のヌク
レオチド３１３−３３２及び８２３−８４３とＥ．チャフェエンシス Ｐ２８の
ヌクレオチド３０７−３２６及び８３４−８１４に対応していた。エーリキア・
カニス（ノース・カロライナ単離体、ジェイク）ＤＮＡは９５℃で２分間、９５
℃で３０秒間、６２℃で１分間、７２℃で２分間を３０サイクル、その後で７２
℃でさらに１０分間で伸長し、そして４℃で保存という熱循環特性を用いてプラ
イマー７９３と１３３０で増幅させた。ＰＣＲ生成物を１％アガロース・ゲルで
解析した。増幅されたＰＣＲ生成物をプライマー７９３及び１３３０を用いて直
接配列決定した。

【００６８】 ＥＣａ２８ＳＡ２遺伝子に特異的な４６ｆと名付けたプライマー（５’−ＡＴ
ＡＴＡＣＴＴＣＣＴＡＣＣＴＡＡＴＣＧＴＣＴＣＡ−３’、配列番号１８）とプ
ライマー１３３０（配列番号１７）を用いて標的とされた領域を増幅させた。増
幅された生成物をゲル精製し、ＴＡクローニング・ベクター（Invitrogen，Sant
a Clarita，CA）内にクローンした。このクローンを以下のプライマー：つまり
、そのベクターから逆方向のＭ１３、４６ｆ、ＥＣａ２８ＳＡ２（５’−ＡＧＴ
ＧＣＡＧＡＧＴＣＴＴＣＧＧＴＴＴＣ−３’、配列番号１９）、ＥＣａ５．３（
５’−ＧＴＴＡＣＴＴＧＣＧＧＡＧＧＡＣＡＴ−３’、配列番号２０）を用いて
双方向に配列決定した。ＤＮＡを９５℃で２分間、並びに、７２℃伸長１０分間
に続き、９５℃で３０秒間、４５℃で１分間、７２℃で１分間を３０サイクル、
そして４℃で保存という熱サイクルで増幅させた。

【００６９】 実施例４ ＥＣａ２８−１遺伝子の未知の５’及び３’領域のシークエンシング ＥＣａ２８−１の全長配列はユニバーサル・ゲノム・ウォルカ・キット（CLON
TECH，Palo Alto，CA）を用いて、メーカーから提供された手順に従って決定さ
れた。ゲノム・Ｅ．カニス（ジェイク単離体）ＤＮＡを平滑末端ＤＮＡをつくり
だす５つの制限酵素（DraI，EcoRV．Pvull，ScaI，StuI）を用いて完全に消化さ
せた。キットで提供されたアダプタ（ＡＰ１）をＥ．カニスＤＮＡの各末端につ
ないだ。ＥＣａ２８−Ｉ配列の知られている部分に対して相補的なＰＣＲと上記
アダプタＡＰ１に対して特異性を示すプライマーを用いるＰＣＲでＥＣａ２８−
１遺伝子の未知のＤＮＡ配列を見つけるためにゲノム・ライブラリーをテンプレ
ートとして用いた。ゲノム・ウォーキングのために用いられたＥＣａ２８−１に
特異性を示すプライマーはプライマー７９３（配列番号１６）及び１３３０（配
列番号１７）を用いてのＥＣａ２８−１のＰＣＲ増幅から誘導した公知のＤＮＡ
配列からデザインされた。プライマー３９４（５’−ＧＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＧ
ＧＡＴＣＡＴＡＧＧＴＡＡ−３’；ヌクレオチド６８７−７１０，配列番号２１
）及び３９４Ｃ（５’−ＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡＴＣＣＴＧＴ ＧＧＡＡＡＴＧＣ
−３；ヌクレオチド７１０−６８７、配列番号２２）を提供されたプライマーＡ
Ｐ１と組み合わせて用いて、ＰＣＲによりＥＣａ２８−１遺伝子の未知の５’及
び３’領域を増幅させた。プライマー３９４Ｃ及びＡＰ１（２０００−ｂｐ）を
用いて増幅させたＥＣａ２８−１遺伝子の５’領域に対応するＰＣＲ生成物をプ
ライマー７９３Ｃ（５’−ＧＡＧＴＡＡＣＣＡＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣ−３’、
配列番号２３）を用いて単一方向に配列決定した。プライマー３９４及びＡＰ１
（５８０−ｂｐ）を用いて増幅されたＥＣａ２８−１遺伝子の３’領域に対応す
るＰＣＲ生成物は同じプライマーを用いて二方向的に配列決定した。オープンリ
ーディングフレームに隣接した５’及び３’領域上の非コード領域を配列決定し
、ＥＣａ２８−１遺伝子全体を増幅するために、これらの領域に対して相補的な
プライマーＥＣ２８ＯＭ−Ｆ（５’−ＴＣＴＡＣＴＴＴＧＣＡＣＴＴＣＣ ＡＣ
ＴＡＴＴＧＴ−３’、配列番号２４）とＥＣ２８ＯＭ−Ｒ（５’−ＡＴＴＣＴＴ
ＴＴＧＣＣＡＣＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴ−３’、配列番号２５）を消化させた。

【００７０】 実施例５ Ｅ．カニス単離体の配列決定 ＤＮＡをＡＢＩプリズム３７７ＤＮＡシークエンサー（Perkin−Elmer Appli
ed Biosystems、Foster City、CA）で配列決定した。７つのＥ．カニス単離体
（４つはノース・カロライナから、あとはそれぞれオクラホマ、フロリダ、及び
ルイジアナから）のＥＣａ２８−１遺伝子全体をプライマーＥＣ２８ＯＭ−Ｆ（
配列番号２４）及びＥＣ２８ＯＭ−Ｒ（配列番号２５）を用いて、９５℃で５分
間、並びに、９５℃で３０秒間、６２℃で１分間、そして７２℃で２分間を３０
サイクル、そして７２℃伸長で１０分間という熱サイクルで増幅された。得られ
たＰＣＲ生成物を同じプライマーを用いて二方向に配列決定した。

【００７１】 実施例６ Ｅ．カニス ＥＣａ２８−１のクローニング及び発現 Ｅ．カニス ＥＣａ２８−１遺伝子全体をプライマーＥＣ２８ＯＭ−Ｆ及び
ＥＣ２８ＯＭ−ＲでＰＣＲ増幅させて、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ ＴＡクローニ
ング・ベクター内にクローンして、制限酵素切断サイトの望ましいセットを得た
（Invitrogen，Carlsbad，CA）。挿入物をＢｓｔＸ １を用いてｐＣＲ２．１−
ＴＯＰＯから切除して、後日の研究に備えてｐｃＤＮＡ３．１／ＥＣ２８と命名
されたｐｃＤＮＡ３．１真核発現ベクター（Invitrogen，Carlsbad、CA）に結合
させた。ｐｃＤＮＡ３．１／ＥＣ２８プラスミドを増幅させて、その遺伝子をＫ
ｐｎＩ−ＸｂａＩ二重消化で切除して、ｐＴｈｉｏＨｉｓ原核発現ベクター（In
vitrogen, Carlsbad, CA）に方向性をもって結合させた。このクローン（ｐＴｈ
ｉｏＨｉｓ／ＥＣ２８）は大腸菌（ＢＬ２１）内で遺伝子組換え体チオレドキシ
ン融合タンパク質をつくりだした。この組換え体融合タンパク質を遠心分離で不
溶相内で粗に精製した。コントロールのチオレドキシン融合タンパク質はニッケ
ルＮＴＡスピンカラム（Qiagen，Santa Clarita，CA）を用いて自然の状態下で
可溶性細胞溶解物から精製した。

【００７２】 実施例７ ウエスタン免疫ブロット解析 組換え体Ｅ．カニス ＥＣａ２８−１融合タンパク質を４〜１５％トリス−HC
ｌ勾配ゲル（Bio-Rad, Hercules, CA）上でＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて、セミドライトランファーセル（Bio-Ra
d, Hercules, CA）を用いて純粋なニトロセルロース（Schleicher & Schuell, K
eene, NH）に転移させた。その膜を１：５０００に希釈したエールリヒア・カニ
スを感染させたイヌからの回復期血清で１時間インキュベーションし、次に、抗
イヌＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）アルカリホスファターゼ結合親和性精製二次抗体を１：１
０００で用いて１時間インキュベーションした（Kirkegaard & Perry laborator
ies, Gaithersburg, MD）。結合した抗体を５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル・リン酸／ニトロブルー・テトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）基質（Ki
rgegaard & Perry Laboratories, Gaitherburg, MD）を用いて視覚化した。

【００７３】 実施例８ サザン・ブロット解析 ＥＣａ２８−１に相同の複数の遺伝子がＥ．カニス・ゲノム内に存在している
かどうかを判定するために、ゲノム・サザン・ブロット解析を標準的な手順（Sa
mbrook et al., 1989）を用いて行った。ＥＣａ２８−１遺伝子内では切断を行
わない酵素ＢａｎＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨａｅＩＩ、Ｋｐｎｌ及びＳｐｅＩと、ヌ
クレオチド３４、４３及び６５６でＥＣａ２８−１を消化するＡｓｅＩのそれぞ
れでＥ．カニス・ゲノムＤＮＡを完全に消化した。プライマーＥＣ２８ＯＭ−Ｆ
及びＥＣ２８ＯＭ−Ｒとディゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベル・デオキシヌクレオ
チド・トリホスフェート（ｄＮＴＰ）（Boehringer Mannheim, Indianapolis, I
N）を用いたＰＣＲ増幅でプローブを作成して、ＡｓｅＩで消化した。消化され
たプローブ（５６６−ｂｐ）をアガロース・ゲル電気泳動で分離し、ゲル精製し
、そしてハイブリダイゼーションのために用いた。完全に消化したゲノムＥ．カ
ニスＤＮＡを電気泳動させ、ナイロン膜（Boehringer Mannheim, Indianapolis,
IN）に移して、メーカーのプロトコール（Boehringer Mannheim, Indianapolis
, IN）に従ってＤＩＧイージーＨｙｂ緩衝液内でＥＣａ２８−Ｉ遺伝子ＤＩＧラ
ベル・プローブを用いて１６時間４０℃の温度でハイブリダイズさせた。結合し
たプローブを抗ＤＩＧアルカリ性ホスファターゼ結合抗体及び発光性基質（Boeh
ringer Mannheim, Indianapolis, IN）で検出し、ＢｉｏＭａｘ科学用画像形成
フィルム（Eastman Kodak, Rochester, NY）に露出させた。

【００７４】 実施例９ 配列解析及び比較 Ｅ．チャフェエンシスｐ２８及びＣ．ルミナチウムｍａｐ−１ＤＮＡ配列を国
立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) (World Wide Web site at URL: htt
p//www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)から入手した。ヌクレオチド及び推定アミノ
酸配列、及びタンパク質と系統発生的解析をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエア（
DNASTAR, Inc., Madison, WI）を用いて行った。ＰＳＯＲＴプログラム(World W
ide Web site at URL: PRIVATE HREF=http://www.imcb.osaka-u.ac.jp/nakai/fo
rm.htm, MACROBUTTON HtmlResAncher htt://www.imcb.osaka-u.ac-jp//nakai /f
orm.htm)を用いてシグナル配列認識を行うためにＭｃＧｅｏｃｈ及びｖｏｎ Ｈ
ｅｉｊｎｅの方法で翻訳後処理の解析を行った（McGeoch, 1985; von Heijne, 1
986）。

【００７５】 本研究で述べられているＥ．カニスＥＣａ２８−１遺伝子の核酸及びアミノ酸
配列に関するGenbank登録番号はジェイク、ＡＦ０８２７４４：ルイジアナ、Ａ
Ｆ０８２７４５；オクラホマ、ＡＦ０８２７４６；デーモン、ＡＦ０８２７４７
；ＤＪ、ＡＦ０８２７４８；ファジー、ＡＦ０８２７４９；フロリダ、ＡＦ０８
２７５０である。

【００７６】 Ｅ．カニスの７つの異なった株からのＥＣａ２８−Ｉの配列解析をその遺伝子
全体を増幅するように設計されたプライマーを用いて行った。解析の結果、この
遺伝子はノース・カロライナ（４）、ルイジアナ、フロリダ、及びオクラホマか
らの単離体の間で保存されていることが明らかになった。

【００７７】 実施例１０ ＥＣａ２８−１のＰＣＲ増幅、クローニング、配列決定及び発現 Ｅ．チャフェエンシス Ｐ２８及びカウドリア・ルミナンチウムｍａｐ−１か
らの核酸配列をＪｏｔｕｎ−Ｈｅｉｎアルゴリズムを用いて配列比較を行ったと
ころ、高度の相同性（＞９０％）領域を有するコンセンサス配列が得られた。こ
れらの相同性領域（Ｃ．ルミナンチウムｍａｐ−１のヌクレオチド３１３−３３
２及び８２３−８４３；Ｅ．チャフェエンシスｐ２８の３０７−３２６及び８１
４−８３４）をＰＣＲ増幅のプライマー・アニーリング・サイトとして標的とし
た。Ｅ．カニスＥＣａ２８−１及びＥ．チャフェエンシスｐ２８遺伝子のＰＣＲ
増幅をプライマー７９３及び１３３０を用いて行ったところ、５１８−ｂｐ Ｐ
ＣＲ生成物が得られた。Ｅ．カニスＰＣＲ生成物の核酸配列は、その生成物をプ
ライマー７９３及び１３３０で直接配列決定することによって得た。配列を解析
したところ、１７０アミノ酸のタンパク質をコードするオープン・リーディング
・フレームが明らかになり、Ｅ．カニスのＰＣＲ増幅によって得られた５１８−
ｂｐ配列とＥ．チャフェエンシスｐ２８遺伝子のＤＮＡ配列の配列比較で、７０
％以上の同一性が明らかになり、これらの遺伝子が相同であることが示された。
プライマー３９４と７９３Ｃを用いてアダプターＰＣＲを行って、遺伝子全体の
配列の５'及び３'セグメントについての判定を行った。プライマー３９４は４つ
のＰＣＲ生成物（３−ｋｂ、２−ｋｂ、１−ｋｂ及び０．８ｋｂ）をつくりだし
、０．８−ｂｐ生成物はプライマー３９４とＡＰ１を用いて二方向に配列決定し
た。推定された配列は５１８−ｂｐ生成物の３'末端と重複しており、さらに停
止コドンの方向にオープン・リーディング・フレーム１２−ｂｐが延びている。
ＥＣａ２８−１遺伝子の３'末端の非コード配列の追加的な６２５−ｂｐの配列
決定も行われた。提供されたプライマーＡＰ１でＥＣａ２８−１遺伝子の５'末
端を増幅するためにプライマー３９４Ｃを用いた。これらのプライマーで増幅を
行った結果、３つのＰＣＲ生成物（３．３、３−ｋｂ、及び２−ｋｂ）が得られ
た。２−ｋｂフラグメントをプライマー７９３Ｃを用いて単一方向で配列決定を
行った。この配列はＥＣａ２８−１遺伝子の開始コドンと推定されるものを含ん
でおり、２７８アミノ酸のタンパク質をコードする８３４−ｂｐオープン・リー
ディング・フレームで終わっていた。ＥＣａ２８−１遺伝子の５'非コード領域
内の読み取り可能な配列の追加的な１４４−ｂｐが発生された。プライマーＥＣ
２８ＯＭ−Ｆ及びＥＣ２８ＯＭ−ＲはＥＣａ２８−１遺伝子に隣接した相補的非
コード領域から消化された。

【００７８】 これらのプライマーで増幅されたＰＣＲ生成物は同じプライマーを用いて直接
配列決定された。Ｅ．カニスＥＣａ２８−１遺伝子に対する完全なＤＮＡ配列（
配列番号１）を図１に示す。これらのプライマーで増幅させたＥＣａ２８−１
ＰＣＲフラグメントはそのオープン・リーディング・フレーム全体と５'非コー
ドプライマー領域からの１７の追加的アミノ酸を含んでいた。この遺伝子をｐＴ
ｈｉｏＨｉｓ発現ベクターに順方向にサブクローンし、大腸菌（ＢＬ２１）はこ
の構成物で形質転換された。発現されたＥＣａ２８−１−チオレドキシン融合タ
ンパク質は不溶性であった。発現されたタンパク質はチオレドキシンと結合した
１１４個の追加的アミノ酸、エンテロキナーゼ認識サイトに関する５個のアミノ
酸、そしてＮ末端の多重クローニング・サイト及び５'非コード・プライマー・
サイトからの３２個のアミノ酸を有していた。Ｅ．カニスに感染したイヌからの
回復期抗血清は発現された組換え体融合タンパク質は認識したが、コントロール
のチオレドキシンとは反応しなかった（図２）。

【００７９】 実施例１１ 配列相同性 ＥＣａ２８−１（８３４−ｂｐ）とＥ．チャフェエンシスｏｍｐ−１ファミリ
ーのシグナル配列を含む遺伝子の核酸配列（ＥＣａ２８−１、ｏｍｐ−１Ａ、Ｂ
、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦ）をクラスタル法を用いて配列比較し、これらの遺伝子間
の相同性について調べた（配列比較については図示せず）。核酸相同性はＥＣａ
２８−１とＥ．チャフェエンシスｐ２８及びｏｍｐ−ＩＦとの間で均等に保持さ
れていた（６８．９％）。Ｅ．チャフェエンシスｏｍｐ−１ファミリーの他の外
膜タンパク質遺伝子と推定されるもの、ｏｍｐ−１Ｄ（６８．２％）、ｏｍｐ−
１Ｅ（６６．７％）、ｏｍｐ−１Ｃ（６４．１％）、カウドリア・ルミナンチウ
ムｍａｐ−１（６１．８％）、Ｅ．カニス２８−ｋＤａタンパク質１遺伝子（６
０％）及び２８−ｋＤａタンパク質２遺伝子（部分）（５９．５％）もＥＣａ２
８−１に対して相同であった。Ｅ．チャフェエンシスｏｍｐ−１ＢはＥＣａ２８
−１と最低の核酸相同性（４５．１％）を有していた。

【００８０】 ＥＣａ２８−１（配列番号２）とＥ．チャフェエンシスＰ２８の予想されたア
ミノ酸配列の配列比較を行ったところ、４つの可変領域（ＶＲ）でアミノ酸置換
が行われていることが明らかになった。このアミノ酸配列における置換あるいは
欠失とＥＣａ２８−１とＥ．チャフェエンシスＯＭＰ−１ファミリー可変領域の
位置を確認した（図３参照）。シグナルペプチドを含むアミノ酸の比較を行った
ところ、ＥＣａ２８−１はＥ．チャフェエンシスＯＭＰ−１ファミリーのＯＭＰ
−１Ｆと最も相同性が高いこと（６８％）、次ぎがＥ．チャフェエンシスＰ２８
（６５．５％）、ＯＭＰ−１Ｅ（６５．１％）、ＯＭＰ−１Ｄ（６２．９％）、
ＯＭＰ−１Ｃ（６２．９％）、カウドリア・ルミナンチウムＭＡＰ−１（５９．
４％）、Ｅ．カニス２８-ｋＤａタンパク質１（５５．６％）、そして２８−ｋ
Ｄａタンパク質２（部分）（５３．６％）、ＯＭＰ−１Ｂ（４３．２％）となっ
ていた。アミノ酸配列に基づく発生系統的関係は、ＥＣａ２８−１とＣ．ルミナ
ンチウムＭＡＰ−１、Ｅ．チャフェエンシスＯＭＰ−１タンパク質類、そしてＥ
．カニス２８−ｋＤａタンパク質１と２（部分）がそれぞれ関係していることを
示している（図４）。

【００８１】 実施例１２ 予想表面確率及び免疫反応性 疎水性及び親水性特性を用いたＥ．カニス ＥＣａ２８−１を解析して、ＥＣ
ａ２８−１上の表面露出領域を予測した（図６）。３〜９個のアミノ酸で構成さ
れる８つの主な表面露出領域がＥＣａ２８−１上で確認され、それらはＥ．チャ
フェエンシス Ｐ２８上の表面露出領域の特徴に類似していた（図６）。ＥＣａ
２８−１上の大き目の表面露出領域のうちの５つはそのタンパク質のＮ末端領域
に位置していた。表面露出親水性領域はＥＣａ２８−１の４つの可変領域のすべ
てに見出された。ロスバード−テイラー・アルゴリズム（Rothbard and Taylor,
1988）を用いてＥＣａ２８−１内の１０個のＴ細胞モチーフが予想され、この
ＥＣａ２８−１の高い抗原性がジェイムソン−ウォルフ抗原性アルゴリズムで予
想された（図６）（Jameson and Wolf, 1988）。ＥＣａ２８−１とＥ．チャフェ
エンシスＰ２８との間で抗原性とＴ細胞モチーフにおける類似性が認められた。

【００８２】 実施例１３ ＥＣａ２８−１遺伝子の相同性ゲノム・コピーの検出 ＥＣａ２８−１遺伝子に制限エンドヌクレアーゼ・サイトを有していない制限
酵素 ＢａｎＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨａｅII、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、及びヌクレオ
チド３４、４３、及び６５６に内部的制限エンドヌクレアーゼを有するＡｓｅＩ
でそれぞれ個別的に完全に消化されたＥ．カニスＤＮＡのゲノム・サザン・ブロ
ット解析は少なくとも３つの相同性ＥＣａ２８−１遺伝子コピーが存在している
ことを明らかにした（図５）。ＥＣａ２８−１は内部的ＡｓｅＩ内部制限サイト
を有しているが、このハイブリダイゼーション実験で用いられたＤＩＧラベル・
プローブはその遺伝子のＡｓｅＩ消化で作成された単一のＤＮＡフラグメント内
の遺伝子の領域を標的とした。ＡｓｅＩによる消化はＥＣａ２８−１ ＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズした３つのバンド（約５６６−ｂｐ、８５０−ｂｐ、及
び３−ｋｂ）をつくりだしたが、このことはそのゲノム内にＥＣａ２８−１に対
して相同の複数の遺伝子が存在していることを示唆している。ＥｃｏＲＶ及びＳ
ｐｅＩによる消化は上記ＥＣａ２８−１遺伝子プローブとハイブリダイズした２
つのバンドをつくりだした。

【００８３】 実施例１４ ２８−ｋＤａタンパク質遺伝子座の確認 ＥＣａ２８ＳＡ３内の領域に対応するＥｃａＳＡ３−２と命名された特殊なプ
ライマー（５'−ＣＴＡＧＧＡＴＴＡＧＧＴＴＡＴＡＧＴＡＴＡＡＧＴＴ−３'、
配列番号２６）とＥＣａ２８−１を有する領域にアニールするプライマー７９３
Ｃ（配列番号２３）を用いて、遺伝子ＳＡ３とＥＣａ２８−１間の遺伝子間領域
を増幅させた。同じプライマーで８００−ｂｐ生成物の配列決定が行われた。Ｄ
ＮＡは９５℃で２分間、並びに、７２℃伸長を１０分間に続き、９５℃で３０秒
間、５０℃で１分間、７２℃で１分間を３０サイクル、そして４℃で保持すると
いう熱サイクルで増幅させた。

【００８４】 実施例１５ ２８−ｋＤａタンパク質遺伝子のＰＣＲ増幅と多重遺伝子座の同定 ＥＣａ２８ＳＡ２から下流に存在している可能性のある未知の遺伝子を個別的
に増幅させるために、ＥＣａ２８ＳＡ２に対して特異的なプライマー４６ｆとＥ
Ｃａ２８−１遺伝子の３'末端に保守領域を標的とするプライマー１３３０を用
いて増幅を行った。２つのオープン・リーディング・フレームを含む２−ｋｂ
ＰＣＲ生成物はこれらのプライマーで増幅させた。最初のオープン・リーディン
グ・フレームは遺伝子の知られている領域、ＥＣａ２８ＳＡ２と、その遺伝子の
未だ配列決定されていない３'部分を含んでいた。ＥＣａ２８ＳＡ２から下流方
向に、追加的な、同じではないが相同性の２８−ｋＤａタンパク質遺伝子が見つ
かって、ＥＣａ２８ＳＡ３と命名された。これら２つの知られている座はＥＣａ
２８ＳＡ３の３'末端に特異性を示すプライマーＳＡ３−２による増幅で結合さ
れ、ＥＣａ２８−１の５'末端でアニーリングするリバースプライマー７９３Ｃ
と組み合わせて用いられた。ＥＣａ２８ＳＡ３の３'末端、ＥＣａ２８ＳＡ３と
ＥＣａ２８−１（２８ＮＣ３）の間の遺伝子間領域、及びＥＣａ２８−１の５'
末端を含んでいる８００−ｂｐ ＰＣＲ生成物を増幅させたところ、これまで別
個であった座が結合した（図８）。ＥＣａ２８ＳＡ３の８４９−ｂｐオープン・
リーディング・フレームは２８３アミノ酸タンパク質をコードし、そしてＥＣａ
２８ＳＡ３は２８０アミノ酸タンパク質をコードする８４０−ｂｐのオープン・
リーディング・フレームを有している。ＥＣａ２８ＳＡ３とＥＣａ２８−１間の
遺伝子間非コード領域は長さが３４５−ｂｐであった（図７及び８）。

【００８５】 実施例１６ 核酸及びアミノ酸相同性 ５つのＥ．カニス ２８−ｋＤａタンパク質遺伝子すべての核酸及びアミノ酸
配列をクラスタル法を用いて配列比較し、これらの遺伝子間の相同性を調べた。
Ｅ．カニス ２８−ｋＤａタンパク質遺伝子のメンバー間で５８〜７５％の範囲
の核酸相同性と６７〜７２％の範囲のアミノ酸相同性が観察された（図９）。

【００８６】 実施例１７ 転写プロモータ領域 ２８−ｋＤａタンパク質遺伝子間の遺伝子間領域を、コンセンサス大腸菌プロ
モータ領域及びＥ．チャフェエンシスから得たプロモータと比較することによっ
てプロモータ配列が存在しているかどうか調べた（Yu et al., 1997: Mclure, 1
985）。

【００８７】 ＲＢＳ、−１０及びー３５領域を含むプロモータ配列と推定される配列をＥＣ
ａ２８ＳＡ２、ＥＣａ２８ＳＡ３、ＥＣａ２８−１、及びＥＣａ２８−２に対応
する４つの遺伝子間配列で確認した（図１０）。ＥＣａ２８ＳＡ１の上流非コー
ド領域は知られておらず、解析されなかった。

【００８８】 実施例１８ Ｎ末端シグナル配列 アミノ酸配列解析を行ったところ、Ｅ．カニス ＥＣａ２８−１全体の推定分
子量が３０．５−ｋＤａでＥＣａ２８ＳＡ３全体の推定分子量が３０．７−ｋＤ
ａであることが明らかになった。両方のタンパク質とも、２３個のアミノ酸で構
成されるＮ末端シグナルペプチドと予想される配列（ＭＮＣＫＫＩＬＩＴＴＡＬ
ＭＳＬＭＹＹＡＰＳＩＳ、配列番号２７）を有しており、これはＥ．チャフェエ
ンシス Ｐ２８に対して予想されたもの（ＭＮＹＫＫＩＬＩＴＳＡＬＩＳＬＩＳ
ＳＬＰＧＶ ＳＦＳ、配列番号２８）及びＯＭＰ−１タンパク質ファミリー（Yu
et al., 1998: Ohashi et al., 1998b）と類似している。シグナルペプチダー
ゼ（ＳＩＳ；Ｓｅｒ−Ｘ−Ｓｅｒ）(Oliver, 1985)に対する好ましい切断サイ
トがＥＣａ２８−１の２１、２２及び２３に見出される。Ｅ．チャフェエンシス
Ｐ２８（ＳＦＳ）に対して予想される切断サイトと同じアミノ酸位置２５に追
加的な切断サイトと想定される箇所（ＭＮＣＫＫＩＬＩＴＴＡＬＩＳＬＭＩＹＳ
ＩＰＳＩＳＳＦＳ、配列番号２９）も存在しており、これは予想分子量２７．７
−ｋＤａの成熟したＥＣａ２８−１をもたらすであろう。これまで報告されてい
るＥＣａ２８ＳＡ２の部分的配列のシグナル切断サイトがアミノ酸３０に存在す
ると予想される。しかしながら、シグナル配列解析はＥＣａ２８ＳＡ１が切断不
能なシグナル配列を有していることを示した。

【００８９】 要約 Ｅ．カニス、Ｅ．チャフェエンシス、及びＣ．ルミナンチウムを含む複数のリ
ッケチア作用体から同様の分子量を有するタンパク質が確認されている（Reddy
et al., 1998; Jongejan et al., 1993; Ohashi et al., 1998）。６つの相同性
ｐ２８遺伝子を有するＥ．チャフェエンシスの単一の座と、それぞれ一定の相同
性を示す２８−ｋＤａタンパク質遺伝子を含むＥ．カニスの２つの座はこれまで
にも報告されている。

【００９０】 本発明はＥ．チャフェエンシスのｏｍｐ−１多重遺伝子族及びＣ．ルミナンチ
ウムｍａｐ−１遺伝子の対して相同性のＥ．カニスの成熟した２８−ｋＤａタン
パク質をコードする遺伝子のクローニング、発現、及び特徴づけについて示して
いる。２つの新しい２８−ｋＤａタンパク質遺伝子、ＥＣａ２８−１及びＥＣａ
２８ＳＡ３が確認された。これまでに部分的に配列決定されている（Reddy et a
l., 1998）別のＥ．カニス ２８−ｋＤａタンパク質遺伝子、ＥＣａ２８ＳＡ２
は本発明において完全に配列決定された。５つのＥ．カニス ２８−ｋＤａタン
パク質遺伝子のすべてを含んでいるＥ．カニスの１つの遺伝子座の識別と特徴づ
けについても開示されている。

【００９１】 Ｅ．カニス ２８−ｋＤａタンパク質はＥ．チャフェエンシス ＯＭＰ−１フ
ァミリー及びＣ．ルミナンチウムのＭＡＰ−１タンパク質と相同である。もっと
も相同性の高いＥ．カニス ２８−ｋＤａタンパク質（ＥＣａ２８ＳＡ３、ＥＣ
ａ２８−１、及びＥＣａ２８−２）はその座内に直列的に配置されている。これ
らのタンパク質の相同性は６７．５％から７２．３％であった。これら２８−ｋ
Ｄａタンパク質間の相違性は２７．３％から３８．６％の範囲であった。Ｅ．カ
ニス ２８−ｋＤａタンパク質、ＥＣａ２８ＳＡ１とＥＣａ２８ＳＡ２は相同性
が最も低く、相同性は５０．９％から５９．４％、ディバージェンスは５３．３
から６９．９％の範囲であった。これらの遺伝子間の違いは主に４つの高可変性
領域内に存在し、このことはこれらの領域が表面露出され、免疫システムによる
選択的圧力を受けていることを示唆している。７つのＥ．カニス単離体の間でＥ
Ｃａ２８−１が保存されていることが報告されており（McBride et al., 1999）
、このことはＥ．カニスが北米ではクローン化している可能性を示唆している。
逆に、Ｅ．チャフェエンシス単離体間のｐ２８のかなりの違いも報告されている
（Yu et al., 1998）。

【００９２】 Ｅ．カニス ２８−ｋＤａタンパク質のすべては３０−ｋＤａタンパク質から
成熟した２８−ｋＤａタンパク質となるよう翻訳後処理されると思われる。最近
、シグナル配列がＥ．チャフェエンシス Ｐ２８上で確認され（Yu et al.,1998
)、Ｎ末端アミノ酸の配列決定によってこのタンパク質が翻訳後処理されてシグ
ナル配列の切断につながり、成熟したタンパク質をつくりだすことが確認された
（Ohashi t al., 1998）。ＯＭＰ−１ＦとＯＭＰ−１Ｅのリーダー配列もリーダ
ーシグナルペプチドとして提案されている（Ohashi t al., 1998）。Ｅ．チャフ
ェエンシス ＯＭＰ−１Ｆ、ＯＭＰ−１Ｅ及びＰ２８上で確認された信号配列は
Ｅ．カニス ２８−ｋＤａタンパク質のリーダー配列と相同である。ｐ２８遺伝
子に対するプロモータ配列は実験的には確認されていないが、大腸菌及びその他
のエーリキア科のＲＢＳ、−１０及び−３５プロモータ領域のコンセンサス配列
との比較によって確認された(Yu et al., 1997; Mclure, 1985)。こうしたプロ
モータ配列は各遺伝子が転写、翻訳されることを可能とし、このことはこれらの
遺伝子が宿主内で個別的に発現されるか可能性を示唆している。イヌにおける感
染の持続はｐ２８遺伝子が差別的に発現されて、イン・ビボでの抗原性の違いを
もたらし、それによってその生物が免疫反応をまぬがれることができるようにし
ている可能性がある。

【００９３】 Ｅ．カニスの２８−ｋＤａ遺伝子はＥ．チャフェエンシスｏｍｐ−１遺伝子フ
ァミリー及びＣ．ルミナンチウムｍａｐ−１遺伝子との核酸及びアミノ酸配列相
同性を示すことが認められた。これまでの研究でＥ．チャフェエンシスに対する
回復期抗血清と反応するＥ．カニスの３０−ｋＤａタンパク質が確認されている
が、抗原的に別のものと考えられた（Rikihisa et al.、1994）。Ｅ．カニス
の２８−ｋＤａタンパク質の４つの可変領域のアミノ酸置換基の比較に基づく知
見はこの可能性を支持している。これらの知見は、Ｅ．カニスとＥ．チャフェエ
ンシス Ｐ２８との間の抗原的相違に関与するアミノ酸がこれら可変領域に存在
しており、免疫システムが容易にアクセスできることを示唆している。これら免
疫反応性タンパク質がＣ．ルミナンチウム、Ｅ．チャフェエンシス、及びＥ．カ
ニスの２８−ｋＤａタンパク質の可変領域内にあることも報告されている（Redd
y et al., 1998）。Ｅ．カニス及びＥ．チャフェエンシス Ｐ２８の解析は、こ
れら可変領域のすべてが予想された表面露出アミノ酸を有していることを明らか
にした。イヌにおける研究はＥ．カニスとＥ．チャフェエンシスとの間の交差防
御が存在しないことを明らかにした（Dawson and Ewing, 1992）。この観察結果
はＰ２８の可変領域とこれらエーリキア種の他の免疫学的に重要な抗原における
抗原性の違いに関連している可能性がある。他の研究によれば、Ｅ．チャフェエ
ンシスに感染された患者からの回復期のヒト抗血清がＥ．チャフェエンシスの２
９／２８−ｋＤａタンパク質を認識し、さらにＥ．カニスの相同性タンパク質と
反応することを明らかにした（Chen et al., 1997）。Ｅ．カニス ２８−ｋＤ
ａタンパク質とＥ．チャフェエンシス Ｐ２８上の相同で交差反応性のエピトー
プは免疫システムによって認識されるようである。Ｅ．カニス ２８−ｋＤａタ
ンパク質は重要な免疫保護抗原である可能性がある。

【００９４】 いくつかの報告は、Ｅ．カニスの３０−ｋＤａ抗原が強力な免疫性を示すこと
を実証している（Rikihisa et al., 1994; Rikihisa et al., 1992）。ヒト及び
イヌからの回復期抗血清内の抗体は、Ｅ．チャフェエンシス及びＥ．カニスから
のこのサイズ範囲のタンパク質と一貫した反応性を示し、このことはそれらが重
要な免疫防御抗原である可能性を示唆している（Rikihisa et al., 1994; Chen
et al., 1994; Chen et al., 1997）。さらに、３０、２４、及び２１−ｋＤａ
タンパク質に対する抗体はＥ．カニスに対する免疫応答の初期に発生し（Rikihi
sa et al., 1994; Rikihisa et al., 1992）、このことはこれらのタンパク質が
疾病の急性段階で免疫応答において重要な役割を果たしている可能性を示唆して
いる。最近、外膜タンパク質をコードし、分子量が２８−ｋＤａの一群の相同性
遺伝子がＥ．チャフェエンシスにおいて確認されており、組換え体Ｅ．チャフェ
エンシス Ｐ２８で免疫化されたマウスは類似の刺激に対して免疫性を発生する
ようであることが観察された（Ohashi et al., 1998）。Ｅ．チャフェエンシス
のＰ２８がその外膜に存在していることが示され、免疫電子顕微鏡調査で、その
生物の表面上でのＰ２８の位置がつきとめられたので、このことはそれがアドヘ
シンとして機能している可能性を示唆している（Ohashi et al., 1998）。こう
した方法で確認されたＥ．カニスの２８−ｋＤａタンパク質は同じ位置を占めて
おり、同様の機能を果たしている可能性がある。

【００９５】 Ｅ．カニスの異なった株からのＥＣａ２８−１を比較したところ、その遺伝子
が完全に保持されていると考えられることが明らかになった。Ｅ．チャフェエン
シスに関係する調査はＥＣａ２８−１における違いの免疫学的及び分子的証拠を
明らかにした。Ｅ．チャフェエンシスに感染された患者は２９／２８−ｋＤａタ
ンパク質に対して可変的な免疫活性を示し、そのことは抗原性の違いの存在を示
唆している（Chen et al., 1997）。最近、Ｅ．チャフェエンシスからのｐ２８
遺伝子において抗原性の違いを示唆する分子的証拠が集められている（Yu et al
., 1998）。Ｅ．チャフェエンシス単離体の比較は、２つの単離体（サプルパ及
びセント・ビンセント）は１００％同一であるが、他の３つ（アーカンサス、Ｊ
ａｘ、９１ＨＥ１７）はアミノ酸レベルで最大１３．４％異なっていることを明
らかにした。ＥＣａ２８−１の保存は、米国で発見されるＥ．カニス株が遺伝子
的に同じであり、従って、Ｅ．カニスの２８−ｋＤａタンパク質が米国でのイヌ
・エーリキア症に対する有力なワクチン候補であることを示唆している。米国外
でのＥ．カニスのさらなる解析がＥ．カニスの起源と進化に関する情報を提供し
てくれるかもしれない。２８−ｋＤａタンパク質の保存はそれがイヌ・エーリキ
ア症の信頼できる血清診断の重要な候補となる可能性を提供している。

【００９６】 複数の相同性遺伝子の役割については現在は分かっていないが、イヌにおける
エールリヒア・カニス感染の持続性が相同性２８−ｋＤａタンパク質遺伝子の可
変性発現による抗原性の違いに関係しており、それによってエールリヒア・カニ
スが免疫監視をくぐり抜けることができるようにしていることも考えられる。Ａ
．マルギナーレ（A.marginale）におけるｍｓｐ−３遺伝子の変差はＭＳＰ−３
タンパク質の違いに部分的に関与しており、しつこい感染をもたらしている（Al
leman et al., 1997）。急性及び慢性状態で感染されたイヌにおけるＥ．カニス
による２８−ｋＤａタンパク質遺伝子発現を調べる研究はその感染の持続におけ
る２８−ｋＤａタンパク質遺伝子の役割にさらに深い洞察をもたらすであろう。

【００９７】 以下の文献が本明細書に引用されている。 Alleman A.R. , et al., (1997) Infect Immun 65: 156-163 Anderson B. E., et al., (1991) J Clin Microbiol 29: 2838-2842 Anderson B. E., et al., (1992) Int J Byst Bacteriol 42: 299-302 Brouqui P., et al., (1992) J Clin Microbiol 30: 1062-1066 Chen S. M., et al., (1997) Clin Diag lab Immunol 4: 731- 735 Chen S. M., et al., (1994) Am J Trop Med Hyg 50: 52 _ 58 Dawson J. E., et al., (1992) Am J Vet Res 53: 1322-1327 Dawson J. E., et al., (1991) J Infect Dis 163: 564-567 Donatien, et al., (1935) Bull Soc Pathol Exot 28: 418-9 Ewing, (1963) J Am Vet Med Assoc 143: 503-6 Groves M. G., et al., (1975) Am J Vet Res 36: 937-940 Harrus S, et al., (1998) J Clin Microbiol 36: 73-76 Jameson B. A., et al., (1988) CABIOS 4: 181-186 Jongejan F., et al., (1993) Rev Elev Med Vet Pays Trop 46: 145-152 McBride J. W., et al., (1996) J Vet Diag Invest 8: 441-447 McBride, et al., (1999) Clin Diagn Lab Immunol: (In press) McClure, (1985) Ann Rev Biochem 54: 171-204 McGeoch D. J. (1985) Virus Res 3: 271-286 Myindo M., et al., (1991) Am J Vet Res 52: 1225-1230 Myindo, et al., (1971) Am J Vet Res 32: 1651-58 Ohashi, et al., (1998) Infect Immun 66: 132-9 Ohashi, et al., (1998) J Clin Microb 36: 2671-80 Reddy, et al., (1998) Biochem Biophys Res Comm 247: 636-43 Rikihisa, et al., (1994) J Clin Microbiol 32: 2107-12 Rothbard J. B., et al., (1988) The EMBO J7: 93-100 Sambrook J., et al., (1989) In Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
Cold Spring harbor: Cold Spring Harbor Press Troy G. C. , et al., (1990) Canine ehrlichiosis. In infectious diseases of the dog and cai. Green C. E (ed). Philadelphia: W. B. Sauders Co.
von Heijne, (1986) Nucl Acids Res 14: 4683-90 Walker, et al., (1970) J. Am. Vet Med Assoc 157: 43-55 Weiss E., et al., (1975) Appl Microbiol 30: 456-463 Yu, et al., (1997) Gene 184: 149-154 Yu, et al., (1998) J. Clin. Microbiol. (In press)

【００９８】 本明細書に述べられているすべての特許あるいは刊行物は本発明が関係する分
野での当業者のレベルを示している。これらの特許及び刊行物は、個々の刊行物
が参照によって個別的に組み込まれることを示唆されるのと同じ程度に、参照に
よって本明細書に組み込まれる。

【００９９】 当業者であれば、本発明がここに述べられている目的を実行し、課題と利点、
およびそれらと本質的に付随する課題と利点を達成するのによく適合しているこ
とが容易に理解できるであろう。これらの実施例は、ここに述べられている方法
、手順、措置、分子、及び具体的な化合物と共に現段階で好ましい実施の形態を
示すものであり、具体例であって、本発明の範囲の限定を意図するものではない
。権利請求の範囲に定義されているような本発明の精神の範囲内に含まれる変更
やその他の使用法は当業者には想起されるであろう。

【０１００】 上に述べた本発明の特徴、利点、及び目的、及び以下に明らかにされるであろ
うその他の特徴、利点及び目的を達成し、より詳細に理解することができるよう
に、上に要約的に説明した本発明のより具体的な説明を添付図面に示すそのいく
つかの実施の形態を参照して以下に行う。これらの図面は明細書の一部を構成す
るものである。しかしながら、添付図面は本発明の好ましい実施の形態を示すも
のであって、従ってその範囲を限定するものとはみなされるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は隣接する５'及び３'非コード配列を含むＥＣａ２８−１の核酸配列（配
列番号１）と推定アミノ酸配列（配列番号２）を示している。ＡＴＧ開始コドン
及びＴＡＡ末端が示されており、２３アミノ酸リーダーシグナル配列に下線が付
されている。

【図２】 図２は発現された５０−ｋＤａ組換え体ＥＣａ２８−１−チオレドキシン融合
タンパク質（レーン１、矢印）と１６−ｋＤａチオレドキシンコントロール（レ
ーン２、矢印）のＳＤＳ−ＰＡＧＥと、対応する回復期Ｅ．カニス・イヌ抗血清
によって認識された組換え体ＥＣａ−１−チオレドキシン融合タンパク質の対応
する免疫ブロット（レーン３）を示している。チオレドキシンコントロールはＥ
．カニス抗血清では検出されなかった（図示せず）。

【図３】 図３はＥＣａ２８−１タンパク質（配列番号２）、及びＥＣａ２８ＳＡ２（部
分配列、配列番号７）とＥＣａ２８ＳＡ１（配列番号８）、Ｅ．チャフェエンシ
スＰ２８（配列番号９）、Ｅ．チャフェエンシスＯＭＰ−１族（配列番号１０−
１４）、及びＣ．ルミナンチウムＭＡＰ−１（配列番号１５）アミノ酸配列の配
置構造を示している。ＥＣａ２８−１アミノ酸配列はコンセンサス配列として示
されている。図示されていないアミノ酸はＥＣａ２８−１と同じで、点で示され
ている。一致していないアミノ酸は対応する１文字省略形で示されている。それ
らアミノ酸配列の最大配置構造のために導入されているギャップはダッシュで示
されている。可変領域には下線を付して表示してある（ＶＲ１、ＶＲ２、ＶＲ３
及びＶＲ４）。矢印はそのシグナルペプチドに対して予想されるシグナルペプチ
ダーゼ切断部位を示している。

【図４】 図４はＥ．カニスＥＣａ２８−１とＥＣａ２８ＳＡ２（部分配列）及びＥＣａ
２８ＳＡ１、Ｅ．チャフェエンシスｏｐｍ−１複遺伝子系の６つのメンバー、及
び推定アミノ酸配列Ｃ．ルマンニンチウムｍａｐ−１との系統発生的関連性を不
均衡ツリー構造を用いて示してある。各ブランチ対の長さはそれらの対のアミノ
酸配列間の距離を示している。スケールは配列間の距離を示している。

【図５】 図５は６つの個別制限酵素で完全に消化されＥＣａ２８−１ ＤＩＧラベル・
プローブとハイブリダイズさせたＥ．カニス・ゲノムＤＮＡのサザン・ブロット
解析（レーン２−７）と、ＤＩＧラベル分子量マークー（レーン１及び８）を示
している。

【図６】 図６はＥＣａ２８−１（ジェイク株）及びＥ．チャフェエンシスＰ２８（アー
カンサス株）の予想されるタンパク質特性の比較を示している。表面確率はヘキ
サペプチドを用いて表面残基を予想するものである。表面残基とは水到達可能表
面積が２．０ｎｍ^２以上のいずれかの残基である。２以上の値を有するヘキサペ
プチドは表面領域と考えられる。抗原指数とは可能性のある抗原性決定因子を予
測するものである。ゼロよりおおきな値を有する領域は可能性のある抗原性決定
因子である。Ｔ細胞モチーフは残基１−グリシン又は極性、残基２−疎水性、残
基３−疎水性、残基４−疎水性又はプロリン、そして残基５−極性又はグリシン
を有する５つのアミノ酸のモチーフを用いて可能性のあるＴ細胞抗原性決定因子
を位置決定する。スケールはアミノ酸の位置を示している。

【図７】 図７はＥ．カニス２８−ｋＤａタンパク質遺伝子ＥＣａ２８ＳＡ２（ヌクレオ
チド１−８４９：配列番号３；アミノ酸配列：配列番号４）と遺伝子間非コード
配列（ＮＣ２、ヌクレオチド ８５０−１１９４：配列番号３１）を含むＥＣａ
２８ＳＡ３（ヌクレオチド １１９５−２０３１：配列番号５；アミノ酸配列:
配列番号６）の核酸配列と推定されるアミノ酸配列を示している。ＡＴＧ開始コ
ドン及び停止コドンは太字で示してある。

【図８】 図８はゲノムの方向及び遺伝子間非コード領域（２８ＮＣｌ−４）を示す５つ
のＥ．カニス２８−ｋＤａタンパク質遺伝子座（５．５９２−Ｋｂ）を図式的に
示している。遺伝子座１及び２（影部）に示されている２８−ｋＤａタンパク質
遺伝子はすでに報告されている（Mcbrideら、1999；Reddyら、1998；Ohashiら、
1998）。ＥＣａＳＡ２及び（ＥＣａ２８ＳＡ３−非影部）と名付けられた新しい
２８−ｋＤａタンパク質遺伝子の完全な配列がつきとめられた。ＥＣａＳＡ２、
ＥＣａ２８ＳＡ３及びＥＣａ２８−１間の非コード遺伝子間領域（２８ＮＣ２−
３）は前に結合していなかった遺伝子座１と２を結合することで形成された。

【図９】 図９はアミノ酸配列に基づく５つのＥ．カニス２８−ｋＤａタンパク質遺伝子
メンバーの系統発生的関連性を非均衡ツリー構造で示している。各ブランチ対の
長さはアミノ酸対間の距離を示している。スケールは配列間の距離を示している
。

【図１０】 図１０はＥ．カニス２８−ｋＤａタンパク質遺伝子非コード核酸配列（配列番
号３０〜３３）の配置構造を示している。図示されていない、点で示す核酸は非
コード領域１（２８ＮＣｌ）と同じである。違いは対応する１文字省略形で示し
てある。それらアミノ酸配列の最大配置高層のために導入されたギャップはダッ
シュ（−）で示してある。推定転写性プロモータ領域（−１０及び−３５）とリ
ボソーム結合サイト（ＲＢＳ）を線で示している。

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１１月２日（２０００．１１．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 33/00 Ｃ０７Ｋ 16/12 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/195 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/12 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ ，ＺＷ (72)発明者 ユー，シュ−リィ アメリカ合衆国 77551 テキサス，ガル ベストン，セントラル シティ ブルーバ ード 6424，ナンバー 828 (72)発明者 マクブライド，ジェリィ，ダブリュ． アメリカ合衆国 77554 テキサス，ガル ベストン，ジャマイカ ビーチ 9457 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA31 BA50 CA04 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 GA01 GA11 HA01 HA03 4B064 AG31 CA01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA01Y AA57X AA90X AB01 AB02 BA01 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA14 BA01 BA08 BA22 BA23 CA04 CA51 CA53 NA01 NA13 NA14 ZB322 ZB352 4C085 AA02 BA15 BB11 CC07 CC21 DD01 DD21 DD62 DD90 EE01 GG01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA11 DA75 DA86 EA20 EA50

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）の３０−キロドル
   トンタンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、前記タンパク質が抗エーリキ
   ア・カニス（Ehrlichia canis）血清に対して免疫反応性であるＤＮＡ配列。
2. 【請求項２】 タンパク質が配列番号２、配列番号４、及び配列番号６で構
   成されるグループから選択されるアミノ酸配列を有している請求項１記載のＤＮ
   Ａ配列。
3. 【請求項３】 タンパク質がＮ末端シグナル配列を有している請求項２記載
   のＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 タンパク質が２８キロドルトンタンパク質に翻訳後修飾され
   るものである請求項３記載のＤＮＡ配列。
5. 【請求項５】 ＤＮＡが配列番号１、配列番号３及び配列番号５で構成され
   るグループから選択される配列を有している請求項１記載のＤＮＡ配列。
6. 【請求項６】 ＤＮＡがエーリキア・カニス（Ehrlichia canis）の単一の
   遺伝子座に含まれている請求項１記載のＤＮＡ配列。
7. 【請求項７】 遺伝子座が５．５９２ｋｂの長さの多重遺伝子座である請求
   項６記載のＤＮＡ配列。
8. 【請求項８】 遺伝子座がエーリキア・カニス（Ehrlichia canis）の相同
   ２８−キロドルトンタンパク質をコードする請求項７記載のＤＮＡ配列。
9. 【請求項９】 エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）の相同２８−キロ
   ドルトンタンパク質がＥＣａ２８ＳＡ１、ＥＣａ２８ＳＡ２、ＥＣａ２８ＳＡ３
   、ＥＣａ２８−１及びＥＣａ２８−２で構成されるグループから選択される請求
   項８記載のＤＮＡ配列。
10. 【請求項１０】 請求項１記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
11. 【請求項１１】 ベクターが、細胞に導入された場合に、配列番号１、配列
    番号３及び配列番号５で構成されるグループから選択される配列によりコードさ
    れるペプチド又はポリペプチドを発現することができる発現ベクターである請求
    項１０記載のベクター。
12. 【請求項１２】 配列番号２、配列番号４及び配列番号６で構成されるグル
    ープから選択されるアミノ酸配列を含む組換え体タンパク質。
13. 【請求項１３】 アミノ酸配列が配列番号１、配列番号３及び配列番号５で
    構成されるグループから選択される配列を含む核酸セグメントによりコードされ
    る請求項１２記載の組換え体タンパク質。
14. 【請求項１４】 配列番号１、配列番号３及び配列番号５で構成されるグル
    ープから選択される核酸セグメントを含む宿主細胞。
15. 【請求項１５】 請求項１２記載の組換え体タンパク質の製造方法であって
    、作用するようにプロモータに結合された配列番号２、配列番号４及び配列番号
    ６で構成されるグループから選択されるアミノ酸配列をコードする配列を含む発
    現領域を含むベクターを得るステップと、 前記ベクターを細胞にトランスフェクションさせるステップと、 前記発現領域を発現させるために有効な条件下で前記細胞を培養するステップ
    とを含む製造方法。
16. 【請求項１６】 配列番号２、配列番号４及び配列番号６で構成されるグル
    ープから選択されるアミノ酸配列と免疫反応を示す抗体。
17. 【請求項１７】 個体におけるエーリキア・カニス（Ehrlichia canis）感
    染を抑制する方法において、 エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）にさらされ、あるいは感染された疑
    いのある個体を識別するステップと、 エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）の２８−ｋＤａ抗原を含む組成物を
    エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）感染を抑制するのに有効な量だけ投与
    するステップ を含む方法。
18. 【請求項１８】 ２８−ｋＤａ抗原が配列番号２、配列番号４、及び配列番
    号６で構成されるグループから選択されるアミノ酸配列を含む組換え体タンパク
    質であることを特徴とする請求項１７記載の方法。
19. 【請求項１９】 組換え体タンパク質が配列番号１、配列番号３及び配列番
    号５で構成されるグループから選択される配列で構成される遺伝子でコードされ
    ることを特徴とする請求項１８記載の方法。
20. 【請求項２０】 組換え体タンパク質が薬学的に受け入れ可能な担体に分散
    されていることを特徴とする請求項１８記載の方法。