KR20160141819A - 에를리히아 종 확인용 조성물 및 방법 - Google Patents

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크리스티나 알. 쿠에시코
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Abstract

본 발명은 에를리히아 항원에 결합하는 항체의 검출 및/또는 기타로부터 특정 에를리히아 종의 분화에 유용한 방법, 키트, 조성물, 및 디바이스를 제공한다. 특히, 본 발명은 단리된 펩타이드의 집단을 이용하여 에를리히아의 종을 확인하는데 유용한 방법 및 키트를 제공한다.

Description

에를리히아 종 확인용 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR IDENTIFYING EHRLICHIA SPECIES}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2014년 4월 4일 출원된 미국 가출원 번호 61/975,581의 우선권을 주장하고, 본원에서 그 전체가 참고로 편입된다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일의 설명
본원과 함께 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 본원에서 그 전체가 참고로 편입된다: 서열목록의 컴퓨터 판독가능한 구성방식 사본 (파일명: ABAX_043_01WO_SeqList_ST25.txt, 2015년 4월 1일 기록된 데이터, 파일 크기 86 킬로바이트).
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 박테리아 감염 검출용 및 박테리아 종 확인용 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 박테리아 항원 (예를 들어, 에를리히아 spp.로부터 항원)에 대하여 항체 검출용 펩타이드 조성물, 방법, 및 키트에 관한 것이다.
에를리히아 박테리아는 포유동물 숙주에서 순환 림프구를 감염시키는 절대 세포내 병원체이다. 에를리히아 전달의 가장 자연스런 방식은 다양한 진드기 벡터를 통한 것이다. 에를리히아 카니스 (E. 카니스) 및 에를리히아 샤프핀시스 (E. 샤 프핀시스)는 개과 및 인간을 감염시키고 개과 단구성 에를리히아증 (CME) 및 인간 단구성 에를리히아증 (HME)을, 각각 초래하는 에를리히아의 동일한 하위-속 그룹의 구성원이다. 에를리히아 에윈기이 (E. 에윈기이)로서 공지된 에를리히아의 또 다른 종은 과립구에 대하여 굴성을 갖고 과립구성 에를리히아증을 초래한다. 개과 질환은 열병, 간질, 실조증, 무기력, 출혈 에피소드, 림프절병증, 체중 감소, 및 범혈구감소증을 특징으로 한다. 인간에서 질환은 열병, 두통, 근육통, 및 백혈구감소증을 특징으로 한다.
간접 면역형광 검정 (IFA) 및 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)은 전형적으로 이들 질환의 진단에서 사용되고 있다. 이들 검정은 대상체의 혈액, 혈장, 또는 감염된 세포에 대한 혈청, 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제된 전체의 에를리히아 단백질로부터 항-에를리히아 항체의 결합을 측정 또는 달리 검출한다. 그러나, 항-에를리히아 항체 또는 그 단편 검출을 위해 현재 공지된 검정은 이들 시험에서 사용된 에를리히아 항원(들)의 불순한 본성에 직접적으로 관련된 민감성 및 특이성 사안 때문에 유용성에서 심하게 제한된다.
상이한 에를리히아 종에 속하는 박테리아에 의해 야기된 질환은 상이하게 나타나고 별도의 관리 일정을 필요로 한다 (Thomas, R.J., 등; Expert Rev Anti Infect Ther. 2009 August; 7(6): 709-722). 따라서, 특정한 감염을 야기하는 에를리히아 종을 확인하는 것이 중요하다. 현재 공지된 면역검정은 많은 전체의 에를리 히아 항원 또는 특이적 종이 아닌 항원의 혼합물을 사용한다. 단지 진드기가 회수되면 및/또는 숙주로부터 조직이 감염 직후 시험되면, 에를리히아 종을 확인하는데 유용할 수 있는 PCR 방법이 유용하다. 더욱이, 감염 부위로부터 박테리아의 배양, 에를리히아 종을 확인하는데 유용할 수 있는 또 다른 방법은 기술적으로 복잡할 뿐만 아니라 새롭게 감염된 조직을 필요로 한다. 또한, 종 E. 에윈기이를 위한 배양 방법은 아직 개발되지 않았다.
따라서, 에를리히아 항원 검출에 대한 추가의 검정 및 단구성 에를리히아증 및 과립구성 에를리히아증의 혈청진단에 대한 필요성이 당해기술에 남아 있다. 특히, 에를리히아 종 확인을 위한 검정, 특히 새롭게 감염된 조직으로부터 단리가 필요 없는 샘플을 포함하여, 다양한 상황에서 그리고 다양한 샘플에 사용될 수 있는 검정에 대한 필요성이 남아 있다. 본 발명은 다양한 유형의 에를리히아 감염 진단, 종 확인, 및 치료를 촉진시키기 위한 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다.
본 발명의 요약
본 발명은, 부분적으로, 에를리히아 펩타이드 또는 그 변이체의 특정한 혼합물, 또는 집단이 특정한 에를리히아 종으로부터 항원에 의해 유발된 항체에 대한 우선적인 결합 친화성을 갖는다는 발견에 기반한다. 본 발명자들은 이들 펩타이드 혼합물 또는 집단의 특별한 조합이 사용되어 항체 반응을 유도하는 에를리히아 종을 확인할 수 있다는 것을 알아내었다. 따라서, 본 발명은 대상체를 감염시키는 에를리히아의 종을 확인하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 대상체를 감염시키는 에를리히아의 종을 확인하는 방법은 하기를 포함한다:
대상체로부터의 샘플을 단리된 펩타이드의 제1 집단과 접촉시킴;
제1 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제1 세트의 형성을 검출함;
상기 샘플을 단리된 펩타이드의 제2 집단과 접촉시킴; 및
제2 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제2 세트의 형성을 검출함 (여기서 복합체의 제1 및 제2 세트 모두의 형성은 대상체가 E. 에윈기이로 감염됨을 나타내고, 여기서 복합체의 제2 세트 없는 제 1 세트의 형성은 대상체가 E. 카니스 및/또는 E. 샤프핀시스로 감염됨을 나타낸다). 일부 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제1 집단은 각각 하기를 포함하는, 적어도 3개의 상이한 펩타이드를 포함한다: S-X2-K-E-X5-K-Q-X8-T-X10-X11-X12-X13-G-L-K-Q-X18-W-X20-G-X22-X23-X24-X25-X26-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-X39-A-E-T-R-X44-T-F-G-L-X49-K-Q-Y-D-G-A-X56-I-X58-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 1)의 서열 또는 그 단편 (여기서 X2는 A 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X5는 E 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X8은 T 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X10은 T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X11은 G 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X12는 L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X13은 Y 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X18는 D 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X20은 D 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X22는 S 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X23은 A, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X24는 A 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X25는 T 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X26은 S, N, 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X39는 임의의 아미노산이고, X44는 임의의 아미노산이고, X49는 임의의 아미노산이고, X56은 임의의 아미노산이고, 그리고 X58는 임의의 아미노산이다.) 관련된 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제2 집단은 각각 하기를 포함하는, 적어도 3개의 상이한 펩타이드를 포함한다: F-S-A-K-E-E-X7-A-E-T-R-X12-T-F-G-L-X17-K-Q-Y-D-G-A-X24-I-X26-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 2)의 서열 또는 그 단편 (여기서 X7은 임의의 아미노산이고, X12는 임의의 아미노산이고, X17은 임의의 아미노산이고, X24는 임의의 아미노산이고, 그리고 X26은 임의의 아미노산이다)
특정 다른 구현예에서, 본 방법은 하기를 포함한다:
대상체로부터의 샘플을 본원에서 기재된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제1 집단과 접촉시킴;
제1 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제1 세트의 형성을 검출함;
상기 샘플을 단리된 펩타이드의 제3 집단과 접촉시킴; 및
제3 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제3 세트의 형성을 검출함 (여기서 항체-펩타이드 복합체의 제1 및 제3 세트 모두의 형성은 대상체가 E. 카니스 및/또는 E. 샤프핀시스로 감염됨을 나타내고, 여기서 항체-펩타이드 복합체의 제3 세트 없는 제1 세트의 형성은 대상체가 E. 에윈기이로 감염됨을 나타낸다). 특정 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제3 집단은 각각 하기를 포함하는, 적어도 3개의 상이한 펩타이드를 포함한다: S-X2-K-E-X5-K-Q-X8-T-X10-X11-X12-X13-G-L-K-Q-X18-W-X20-G-X22-X23-X24-X25-X26-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-X39-A-X41-T-R-X44-T-F-G-X48-X49-K-Q-Y-D-G-A-X56-I-X58-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 3)의 서열 또는 그 단편 (여기서 X2는 A 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X5는 E 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X8은 T 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X10은 T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X11은 G 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X12는 L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X13은 Y 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X18는 D 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X20은 D 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X22는 S 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X23은 A, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X24는 A 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X25는 T 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X26은 S, N, 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X39는 임의의 아미노산이고, X41은 D 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X44는 임의의 아미노산이고, X48는 V 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X49는 임의의 아미노산이고, X56은 임의의 아미노산이고, 그리고 X58는 임의의 아미노산이다.)
특정 구현예에서, 본 방법은 하기를 포함한다:
대상체로부터의 샘플을 본원에서 기재된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제1 집단과 접촉시킴;
제1 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제1 세트의 형성을 검출함;
상기 샘플을 본원에서 기재된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제2 집단과 접촉시킴; 제2 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제2 세트의 형성을 검출함
상기 샘플을 본원에서 기재된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제3 집단과 접촉시킴; 및
제3 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제3 세트의 형성을 검출함 (여기서 제3 세트 없는 복합체의 제1 및 제2 세트 모두의 형성은 대상체가 E. 에윈기이로 감염됨을 나타내고, 여기서 제2 세트 없는 복합체의 제1 및 제3 세트 모두의 형성은 대상체가 E. 카니스 및/또는 E. 샤프핀시스로 감염됨을 나타낸다.)
본 방법의 일부 구현예에서, 펩타이드의 제1 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드는 서열 식별 번호: 1의 단편을 포함한다. 서열 식별 번호: 1의 단편은 서열 식별 번호: 1로부터 적어도 20, 25, 30, 35, 또는 40 인접 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 서열 식별 번호: 1의 단편은 서열 식별 번호: 1의 아미노산 33 내지 71을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 집단에서 각각의 펩타이드는 서열 식별 번호: 1의 서열을 포함한다.
본 방법의 특정 다른 구현예에서, 펩타이드의 제2 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드는 서열 식별 번호: 2의 단편을 포함한다. 서열 식별 번호: 2의 단편은 서열 식별 번호: 2로부터 적어도 15, 20, 25, 30, 또는 35 인접 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 집단에서 각각의 펩타이드는 서열 식별 번호: 2의 서열을 포함한다.
본 방법의 다른 구현예에서, 펩타이드의 제3 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드는 서열 식별 번호: 3의 단편을 포함한다. 서열 식별 번호: 3의 단편은 서열 식별 번호: 3으로부터 적어도 20, 25, 30, 35, 또는 40 인접 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 서열 식별 번호: 3의 단편은 서열 식별 번호: 3의 아미노산 33 내지 71을 포함한다. 특정 구현예에서, 제3 집단에서 각각의 펩타이드는 서열 식별 번호: 3의 서열을 포함한다.
본 방법의 일부 구현예에서, 샘플은 감염 종이 E. 카니스 또는 E. 샤프핀시 스인지를 결정하기 위해 적어도 하나의 검정으로 분석된다.
특정 구현예에서, 본원에서 기재된 임의의 방법에서 검출 단계중 적어도 하나는 하기를 포함한다: (i) ELISA 검정 수행; (ii) 측면 유동 검정 작동; (iii) 응집 검정 수행; (iv) 웨스턴 블랏, 슬롯 블랏, 또는 닷 블랏 검정 수행; (v) 파장 시프트 검정 수행; (vi) 분석 또는 원심 회전자를 통한 샘플 작동; 또는 (vii) 마이크로어레이 검정 작동. 일부 구현예에서, 하나 또는 그 초과의 검출 단계는 분석 또는 원심 회전자에서 샘플의 스피닝을 포함한다. 다른 구현예에서, 하나 또는 그 초과의 검출 단계는 전기화학적 센서, 광학적 센서, 화학발광센서 또는 광전자 센서로 샘플을 분석하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 또는 그 초과의 검출 단계는 ELISA 검정 또는 측면 유동 검정 수행을 포함한다.
본 방법의 특정 구현예는 추가로 검출 결과 보고를 포함한다. 보고는 전자적으로, 문서로, 또는 구두로 실시될 수 있다. 기계 예컨대 컴퓨터를 통해 실시될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 에를리히아 항원에 결합하는 항체 검출 및/또는 대상체를 감염시키는 에를리히아의 종 확인을 위한 키트를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 키트는 본원에서 기재된 바와 같이 본 발명의 펩타이드의 1, 2 또는 3개의 상이한 집단을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 키트는 추가로 생물학적 샘플에서 에를리히아의 종을 확인하기 위한 펩타이드 집단의 사용 설명서를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 추가로 하나 또는 그 초과의 표지 시약을 포함한다.
본 방법의 방법 또는 키트의 특정 구현예에서, 단리된 펩타이드의 집단에서 펩타이드는 고형 지지체에 부착 또는 고정된다.
본 발명의 추가의 측면 및 구현예는 후술하는 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 에를리히아 종 확인 방법의 구현예의 도식이다. 약어 "EAL"은 펩타이드 집단 EE13 (서열 식별 번호: 2)을 이용하는 ELISA 검정용 ELISA 스코어를 나타내고, 그 동안 "CAL"은 펩타이드 집단 EE12EW1 (서열 식별 번호: 3)을 이용하는 ELISA 검정용 ELISA 스코어를 나타낸다. 이러한 구현예에서, 전혈 샘플은, 본원에서 기재된 바와 같이 펩타이드의 제1 집단을 포함하는, 펩타이드 집단 ECHEW1 (서열 식별 번호: 1)을 이용하여, ELISA 검정, ELISA ECHEW1에서 시험된다. 만일 ELISA ECHEW1의 결과가 양성이면, 샘플은, 본원에서 기재된 바와 같이 펩타이드의 제2 집단을 포함하는, 펩타이드 집단 EE13을 이용하여, 또 다른 ELISA 검정, ELISA EE13을 수행하고, 그리고 본원에서 기재된 바와 같이 펩타이드의 제3 집단을 포함하는, 펩타이드 집단 EE12EW를 이용하여, 추가 또 다른 ELISA 검정, ELISA EE12EW를 추가로 수행한다. ELISA EE12EW의 음성 결과와 조합되는 ELISA EE13의 양성 결과, 즉 CAL보다 높은 EAL은 샘플이 E. 에윈기이로 감염됨을 나타낸다. ELISA EE13의 음성 결과와 조합되는 ELISA EE12EW의 양성 결과, 즉 EAL보다 높은 CAL은 샘플이 E. 카 니스 및/또는 E. 샤프핀시스로 감염됨을 나타낸다. 만일 샘플이 E. 카니스 및/또는 E. 샤프핀시스로 감염됨이 확인되면, 샘플이 E. 카니스 또는 E. 샤프핀시스로 감염되는지를 결정하기 위해, 샘플이 또 다른 검정, 이 실시예에서 E. 카니스 또는 E. 샤프핀시스용 IFA 검정을, 동반하여 또는 비-동반하여, 실시한다.
도 2는 나타낸 에를리히아 종으로 감염된 개로부터 다양한 시간에서 뽑은 혈장 샘플의 항-에를리히아 항체 스코어의 그래픽 묘사이다. 개는 다양한 에를리히아의 종으로 실험적으로 감염되고, 혈장 샘플을 그래프에서 표시된 바와 같이 감염 후 다양한 날짜에서 뽑아졌다. ELISA 검정은 펩타이드의 각 3개 집단, ECHEW1, EE12EW, 및 EE13을 이용하여 샘플에서 수행되었다. 상부 왼쪽 및 하부 왼쪽 패널은 E. 카니스로 감염된 2마리의 개로부터 별도로 취해진 샘플로부터 결과를 보여준다. 상부 오른쪽 패널은 E. 샤프핀시스로 감염된 개로부터 취해진 샘플로부터 결과를 보여준다. 항체 스코어는 본원에서 기재된 방법을 이용하여 계산되었다.
상세한 설명
본원에서 사용된 바와 같이, 하기 용어들은 하기 의미를 가질 것이다:
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "항원,"은 항체에 의해 인식될 수 있는 분자를 언급한다. 항원은, 예를 들면, 펩타이드 또는 그 변형된 형태일 수 있다. 항원은 하나 또는 그 초과 에피토프를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "에피토프,"는 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항원의 일부이다. 에피토프는, 예를 들면, 펩타이드 (예를 들면, 본 발명의 펩타이드)의 일부를 포함할 수 있거나 또는 일부로 이루어질 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프, 순차적인 에피토프, 또는 형태적 에피토프일 수 있다. 특정 구현예에서, 에피토프는 비-인접 영역을 포함할 수 있다.
용어 "OMP-1 단백질"은, 비제한적으로, E. 카니스 P-30, E. 카니스 P30-1, E. 샤프핀시스 P28, E. 샤프핀시스 OMP-1C, E. 샤프핀시스 OMP-1D, E. 샤프핀시스 OMP-1E, 및 E. 샤프핀시스 OMP-1F를 포함하여, 에를리히아의 임의의 외막 단백질 1 파라로그를 언급한다.
용어 "MSP4 단백질"은, 비제한적으로, E. 카니스 MSP4, P30-5, 및 P28-1을 포함하여, 에를리히아의 표면 항원 MSP4 패밀리의 임의의 구성원을 언급한다. OMP 및 MSP는 대립유전자 변이체이다.
용어들 "핵산," "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고 그리고 단일가닥 또는 이중가닥인, DNA, RNA, cDNA, 뿐만 아니라 그 화학 변형을 포함한다.
본원에서 사용된 단일 글자 아미노산 약어는 당해기술에서 그 표준 의미를 갖고, 그리고 본원에서 기재된 모든 펩타이드 서열은 관례에 따라, N-말단 끝을 왼쪽으로 C-말단 끝을 오른쪽으로 쓰여진다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "스코어"는 검정 결과의 상대적인 값, 수준, 강도, 또는 정도를 언급한다. 때때로 공지된 분석물, 예를 들면, 항원 또는 항체를 갖는 샘플을 이용하여, 임의로 공지된 분석물의 공지된 농도 또는 역가를 갖는 샘플을 이용하여, 당해분야의 숙련가에 의해 또는 알고리즘 사용에 의해 인공적으로 만들어질 수 있다. 당해분야의 숙련가에 의해 수작업으로 배정된 또는 식 또는 알고리즘으로 발생된 수일 수 있다. 또한 기호, 예를 들면, "-", "+", 또는 "++"일 수 있다. 스코어는 식 또는 알고리즘을 이용한 계산으로부터 발생될 수 있거나, 또는 검정 결과의 시각 검사, 측정, 또는 추정에 의해 배정될 수 있다. 공지된 분석물의 공지된 농도 또는 역가를 갖는 샘플을 이용하는 경우, 상기 샘플은 희석 및 미희석 상태에서 검정될 수 있고, 그리고 동일한 분석물에 대하여 검정된 미공지된 샘플의 스코어를 배정 또는 평가하는데 사용될 수 있는, 스코어의 범위 또는 스코어의 표준 곡선은 바람직하게는 동일한 검정으로 발생될 수 있다.
추가의 용어들은, 필요시, 후술하는 상세한 설명에서 정의될 것이다.
본 발명은, 부분적으로, 에를리히아 펩타이드 또는 그 변이체의 특정한 혼합물, 또는 집단이 특정한 에를리히아 종으로부터 항원에 의해 유발된 항체에 대하여 우선적인 결합 친화성을 갖는다는 발견에 기반한다. 본 발명자들은 이들 펩타이드 혼합물 또는 집단의 특별한 조합이 항체 반응을 유도하는 에를리히아 종을 확인하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 존재하면, 대상체를 감염시키는 에를리 히아의 종을 확인하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 존재하면, 대상체를 감염시키는 에를리히아의 종의 확인 방법은 하기를 포함한다:
대상체로부터의 샘플을 본원에서 기재된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제1 집단과 접촉시킴;
제1 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제1 세트의 형성을 검출함;
상기 샘플을 본원에서 기재된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제2 집단과 접촉시킴; 및
제2 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제2 세트의 형성을 검출함 (여기서 복합체의 제1 및 제2 세트 모두의 형성은 대상체가 E. 에윈기이로 감염됨을 나타내고, 여기서 복합체의 제2 세트 없는 제 1 세트의 형성은 대상체가 E. 카니스 및/또는 E. 샤프핀시스로 감염됨을 나타낸다).
다른 구현예에서, 존재하면, 대상체를 감염시키는 에를리히아의 종의 확인 방법은 하기를 포함한다:
대상체로부터의 샘플을 본원에서 기재된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제1 집단과 접촉시킴;
제1 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제1 세트의 형성을 검출함;
상기 샘플을 본원에서 기재된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제3 집단과 접촉시킴; 및
제3 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제3 세트의 형성을 검출함 (여기서 항체-펩타이드 복합체의 제1 및 제3 세트 모두의 형성은 대상체가 E. 카니스 및/또는 E. 샤프핀시스로 감염됨을 나타내고, 여기서 항체-펩타이드 복합체의 제3 세트 없는 제 1 세트의 형성은 대상체가 E. 에윈기이로 감염됨을 나타낸다).
추가의 다른 구현예에서, 존재하면, 대상체를 감염시키는 에를리히아의 종의 확인 방법은 하기를 포함한다:
대상체로부터의 샘플을 본원에서 기재된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제1 집단과 접촉시킴;
제1 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제1 세트의 형성을 검출함;
상기 샘플을 본원에서 기재된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제2 집단과 접촉시킴;
제2 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제2 세트의 형성을 검출함
상기 샘플을 본원에서 기재된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제3 집단과 접촉시킴; 및
제3 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제3 세트의 형성을 검출함 (여기서 제3 세트 없는 복합체의 제1 및 제2 세트 모두의 형성은 대상체가 E. 에윈기이로 감염됨을 나타내고, 여기서 제2 세트 없는 복합체의 제1 및 제3 세트 모두의 형성은 대상체가 E. 카니스 및/또는 E. 샤프핀시스로 감염됨을 나타낸다.)
본 발명의 방법의 특정 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제1 집단은, E. 카니 스, E. 샤프핀시스 , 및 E. 에윈기이를 포함하여, 에를리히아의 다중 종으로부터 항원에 대하여 항체에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제1 집단은 각각 하기를 포함하는, 적어도 3개의 상이한 펩타이드를 포함한다: S-X2-K-E-X5-K-Q-X8-T-X10-X11-X12-X13-G-L-K-Q-X18-W-X20-G-X22-X23-X24-X25-X26-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-X39-A-E-T-R-X44-T-F-G-L-X49-K-Q-Y-D-G-A-X56-I-X58-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 1)의 서열 또는 그 단편 (여기서 X2는 A 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X5는 E 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X8은 T 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X10은 T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X11은 G 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X12는 L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X13은 Y 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X18는 D 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X20은 D 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X22는 S 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X23은 A, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X24는 A 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X25는 T 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X26은 S, N, 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X39는 임의의 아미노산이고, X44는 임의의 아미노산이고, X49는 임의의 아미노산이고, X56은 임의의 아미노산이고, 그리고 X58은 임의의 아미노산이다.
특정 구현예에서, 서열 식별 번호: 1에서 X39는 K이다. 일부 구현예에서, 서열 식별 번호: 1에서 X44는 K 또는 R이고, 및/또는 서열 식별 번호: 1에서 X49는 E 또는 D이다. 특정 구현예에서, 서열 식별 번호: 1에서 X56은 K 또는 Q이고, 및/또는 서열 식별 번호: 1에서 X58은 E 또는 T이다.
특정 다른 구현예에서, 서열 식별 번호: 1의 단편은 서열 식별 번호: 1로부터 적어도 20, 25, 30, 35, 또는 40 인접 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 서열 식별 번호: 1의 단편은 서열 식별 번호: 1의 아미노산 33 내지 71을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 집단에서 각각의 펩타이드는 서열 식별 번호: 1의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제1 집단은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열, 또는 그 단편을 포함한다:
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S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-R-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 5);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-R-T-F-G-L-D-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 6);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-R-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-Q-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 7);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-D-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 8);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-D-K-Q-Y-D-G-A-Q-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 9);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-Q-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 10);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-T-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 11);
S-V-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-T-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 12);
S-A-K-E-D-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-T-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 13);
S-V-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 14);
S-V-K-E-D-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 15);
S-A-K-E-D-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 16);
S-A-K-E-E-K-Q-P-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 17);
S-A-K-E-E-K-Q-P-T-T-A-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 18);
S-A-K-E-E-K-Q-P-T-T-G-V-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 19);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-A-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 20);
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S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-V-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 22);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-F-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 23);
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S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-N-W-N-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 27);
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S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-V-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 29);
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S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-T-I-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 35);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-I-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 36);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-P-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 37);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-P-N-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 38);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-P-K-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 39);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-N-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 40);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-K-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 41);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-N-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-R-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 42);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-K-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-R-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 43);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-R-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 44);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-Q-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 45);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-Q-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 46);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-N-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 47);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-R-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 48);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-E-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 49);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-D-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 50); 및
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-S-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 51).
일부 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제1 집단은 서열 식별 번호: 4-51로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2 또는 3개의 상이한 서열, 또는 그 단편을 포함한다.
본 방법의 특정 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제2 집단은 E. 에윈기이로부터 항원에 대하여 항체에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제2 집단은 E. 카니스 또는 E. 샤프핀시스로부터 항원에 대하여 항체에 결합하지 않거나 또는 최소로 결합한다. 특정 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제2 집단은 각각 하기를 포함하는, 적어도 3개의 상이한 펩타이드를 포함한다: F-S-A-K-E-E-X7-A-E-T-R-X12-T-F-G-L-X17-K-Q-Y-D-G-A-X24-I-X26-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 2)의 서열 또는 그 단편 (여기서 X7은 임의의 아미노산이고, X12는 임의의 아미노산이고, X17은 임의의 아미노산이고, X24는 임의의 아미노산이고, 그리고 X26은 임의의 아미노산이다.
단리된 펩타이드의 제2 집단의 특정 구현예에서, 서열 식별 번호: 2에서 X7은 K이다. 일부 구현예에서, 서열 식별 번호: 2에서 X12는 K 또는 R이고, 및/또는 서열 식별 번호: 2에서 X17은 E 또는 D이다. 특정 구현예에서, 서열 식별 번호: 2에서 X24는 K 또는 Q이고, 및/또는 서열 식별 번호: 2에서 X26은 E 또는 T이다.
특정 다른 구현예에서, 서열 식별 번호: 2의 단편은 서열 식별 번호: 2로부터 적어도 15, 20, 25, 30, 또는 35 인접 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 집단에서 각각의 펩타이드는 서열 식별 번호: 2의 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제2 집단은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열, 또는 그 단편을 포함한다:
F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 52);
F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-R-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 53);
F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-R-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-Q-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 54);
F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-R-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-T-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 55);
F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-Q-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 56);
F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-Q-I-T-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 57);
F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-T-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 58);
F-S-A-K-E-E-R-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 59);
F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-Q-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 60);
F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-Q-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 61);
F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-N-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 62);
F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-R-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 63);
F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-E-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 64);
F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-D-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 65); 및
F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-S-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 66).
일부 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제2 집단은 서열 식별 번호: 52-66으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2 또는 3개의 상이한 서열, 또는 그 단편을 포함한다.
본 방법의 추가의 다른 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제3 집단은 E. 카니 스 및 E. 샤프핀시스로부터 항원에 대하여 항체에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제3 집단은 E. 에윈기이로부터 항원에 대하여 항체에 결합하지 않거나 또는 최소로 결합한다. 일부 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제3 집단은 각각 하기를 포함하는, 적어도 3개의 상이한 펩타이드를 포함한다: S-X2-K-E-X5-K-Q-X8-T-X10-X11-X12-X13-G-L-K-Q-X18-W-X20-G-X22-X23-X24-X25-X26-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-X39-A-X41-T-R-X44-T-F-G-X48-X49-K-Q-Y-D-G-A-X56-I-X58-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 3)의 서열 또는 그 단편 (여기서 X2는 A 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X5는 E 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X8는 T 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X10은 T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X11은 G 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X12는 L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X13은 Y 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X18은 D 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X20은 D 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X22는 S 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X23은 A, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X24는 A 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X25는 T 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X26은 S, N, 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X39는 임의의 아미노산이고, X41은 D 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X44는 임의의 아미노산이고, X48는 V 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X49는 임의의 아미노산이고, X56은 임의의 아미노산이고, 그리고 X58은 임의의 아미노산이다.
단리된 펩타이드의 제3 집단의 특정 구현예에서, 서열 식별 번호: 3에서 X39는 K이다. 특정 구현예에서, 서열 식별 번호: 3에서 X44는 K 또는 R이고, 및/또는 서열 식별 번호: 3에서 X49는 E 또는 D이다. 특정 구현예에서, 서열 식별 번호: 3에서 X56은 K 또는 Q이고, 및/또는 서열 식별 번호: 3에서 X58은 E 또는 T이다.
특정 다른 구현예에서, 서열 식별 번호: 3의 단편은 서열 식별 번호: 3으로부터 적어도 20, 25, 30, 35, 또는 40 인접 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 서열 식별 번호: 3의 단편은 서열 식별 번호: 3의 아미노산 33 내지 71을 포함한다. 특정 구현예에서, 제3 집단에서 각각의 펩타이드는 서열 식별 번호: 3의 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제3 집단은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열, 또는 그 단편을 포함한다:
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 67);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-R-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 68);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-R-T-F-G-V-D-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 69);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-R-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-Q-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 70);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-D-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 71);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-D-K-Q-Y-D-G-A-Q-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 72);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-Q-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 73);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-T-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 74);
S-V-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-T-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 75);
S-A-K-E-D-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-T-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 76);
S-V-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 77);
S-V-K-E-D-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 78);
S-A-K-E-D-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 79);
S-A-K-E-E-K-Q-P-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 80);
S-A-K-E-E-K-Q-P-T-V-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 81);
S-A-K-E-E-K-Q-P-T-T-A-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 82);
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S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-Q-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 114);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-Q-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 115);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-N-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 116);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-R-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 117);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-E-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 118);
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-D-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 119); 및
S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-T-S-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-K-A-D-T-R-K-T-F-G-V-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-S-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 120).
일부 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제3 집단은 서열 식별 번호: 67-120으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2 또는 3개의 상이한 서열, 또는 그 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 방법에서 사용된 단리된 펩타이드의 집단은 본원에서 기재된 펩타이드 서열의 단편을 포함한다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 단리된 펩타이드의 집단은 서열 식별 번호: 1-120으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열의 단편을 포함한다. 단편은, 예를 들면, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 또는 44 아미노산 길이일 수 있다. 단편은 인접될 수 있거나 또는 하나 또는 그 초과 결실 (예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 초과 아미노산 잔기의 결실)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단편은 서열 식별 번호: 1-120으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열의 아미노산 1 내지 26을 포함한다. 다른 구현예에서, 단편은 서열 식별 번호: 1, 3, 4-51, 및 67-120으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열의 아미노산 33 내지 71을 포함한다. 특정 구현예에서, 단편은 서열 식별 번호: 1-120으로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드 서열의 에피토프를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법에서 사용된 펩타이드의 제1 및/또는 제3 집단에서 하나 또는 그 초과의 펩타이드는 71, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 또는 2000 이하의 아미노산 길이이다. 특정 구현예에서, 펩타이드의 제1 및/또는 제3 집단에서 적어도 3개의 펩타이드는 71, 75, 80, 85, 90, 95,100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 또는 2000 이하의 아미노산 길이이다. 특정 구현예에서, 펩타이드의 제1 및/또는 제3 집단에서 각각의 펩타이드는 71, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 또는 2000 이하의 아미노산 길이이다.
일부 다른 구현예에서, 본 방법에서 사용된 펩타이드의 제2 집단에서 하나 또는 그 초과의 펩타이드는 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 또는 2000 이하의 아미노산 길이이다. 특정 구현예에서, 펩타이드의 제2 집단에서 적어도 3개의 펩타이드는 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 또는 2000 이하의 아미노산 길이이다. 특정 구현예에서, 펩타이드의 제2 집단에서 각각의 펩타이드는 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 또는 2000 이하의 아미노산 길이이다.
특정 구현예에서, 펩타이드의 제1 및 제3 집단에서 각각의 펩타이드는 71, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 또는 2000 이하의 아미노산 길이이고, 그리고 펩타이드의 제2 집단에서 각각의 펩타이드는 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 또는 2000 이하의 아미노산 길이이다.
추가의 다른 구현예에서, 단리된 펩타이드의 집단은 미국 출원 번호 14/052,296 및/또는 미국 특허 출원 공개 No. 2011/0124125A1에 개시된 펩타이드를 포함할 수 있고, 이들의 내용은 이로써 그 전체가 참고로 편입된다.
일부 구현예에서, 상기 방법에서 사용된 단리된 펩타이드의 집단에서 펩타이드는 서열 식별 번호: 1-120으로부터 선택된 서열에 적어도 약 80, 85, 90, 95, 98, 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 퍼센트 서열 동일성은 기술 인식된 의미를 갖고 2개의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 사이에 동일성을 평가하는 수많은 방법이 있다. 참고, 예를 들면, Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, Ed., Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Griffin & Griffin, Eds., Computer Analysis Of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey, (1994); von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987); 및 Gribskov & Devereux, Eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York, (1991). 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 배정 방법은, GCG 프로그램 패키지 (Devereux 등, Nuc. Acids Res. 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul 등, J Molec. Biol. 215:403 (1990)), 및 Smith and Waterman의 국소 상동성 알고리즘 (Adv. App. Math., 2:482-489 (1981))을 이용하는 베스트피트 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)을 포함하는, 컴퓨터 프로그램에서 코드화된다. 예를 들면, FASTA 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 프로그램 ALIGN은 갭 오픈 패널티 -12 및 갭 확대 패널티 -2의 아핀 갭 조사로 사용될 수 있다.
특정한 서열이, 예를 들면, 참조 서열에 약 95% 동일한지를 결정하기 위해 임의의 서열 정렬 프로그램을 이용하는 경우, 파라미터가 설정되고 이로써 동일성의 백분율이 참조 폴리펩타이드의 전장에 걸쳐 계산되고 그리고 참조 폴리펩타이드에서 아미노산의 총 수의 최대 5%의 동일성에서 갭이 허용된다.
펩타이드 서열의 변이체는, 서열의 공지된 특성에 부분적으로 기반하여, 당해분야의 숙련가에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 예를 들면, 변이체 펩타이드는 아미노산 치환 (예를 들면, 천연 발생 아미노산, 비-천연 발생 아미노산, 또는 아미노산 유사체를 이용한 보존적 치환) 및/또는 결실 (예를 들면, 작은, 단일 아미노산 결실, 또는 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 또는 그 초과 인접 아미노산을 포함하는 결실)을 포함할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 원상태 펩타이드 서열의 변이체는 (i) 하나 또는 그 초과 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 초과) 보존적 아미노산 치환, (ii) 1 또는 그 초과 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 초과) 아미노산의 결실, 또는 (iii) 이들의 조합에 의해 천연 발생 서열과 상이한 것이다. 결실된 아미노산은 인접 또는 비-인접될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 그 측쇄 및 화학 특성에 관련되는 아미노산의 패밀리 내에서 일어나는 것이다. 이들은 하기를 포함한다: 예를 들면, (1) 산성 아미노산: 아스파르테이트, 글루타메이트; (2) 염기성 아미노산: 라이신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 무극성 아미노산: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; (4) 무전하 극성 아미노산: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신; (5) 지방족 아미노산: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌 (세린 및 트레오닌은 별도로 지방족-하이드록실로서 임의로 그룹화된다); (6) 방향족 아미노산: 페닐알라닌, 티로신, 트립토판; (7) 아미드 아미노산: 아스파라긴, 글루타민; 및 (9) 황-함유 아미노산: 시스테인 및 메티오닌. 참고, 예를 들면, Biochemistry, 2nd ed., Ed. by L. Stryer, W H Freeman and Co.: 1981. 변이체 펩타이드가 적합한지를 확인하는 방법은 관례적이고 일상적이다.
펩타이드 서열의 변이체는 이전에 정의된 펩타이드 서열의 변이를 포함한다. 예를 들면, 공지된 에피토프를 포함하는 이전에 기재된 펩타이드 서열은 한쪽 또는 양쪽 끝에서 (예를 들면, 약 1-3 아미노산만큼) 연장 또는 단축될 수 있고, 및/또는 1, 2, 3, 4 또는 그 초과 아미노산은 보존적 아미노산 등에 의해 치환될 수 있다. 더욱이, 단백질의 영역이 해당 에피토프를 함유하는 것으로 확인되면, 조사자는 활성을 최적화하기 위해 최초 대략적인 영역의 종점으로부터 (예를 들면, 어느 방향으로 약 5 아미노산만큼) 해당 영역을 "시프트"할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법에서 사용된 단리된 펩타이드의 집단에서 펩타이드는 추가로 추가의 N-말단 펩타이드 서열, 추가의 C-말단 펩타이드 서열, 또는 이들의 조합을 포함한다.
특정 구현예에서, 추가의 N-말단 펩타이드 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 초과 아미노산을 포함할 수 있고 그리고 원상태 또는 비-원상태 서열일 수 있다. 다른 구현예에서, 추가의 C-말단 펩타이드 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 초과 아미노산을 포함할 수 있고 그리고 원상태 또는 비-원상태 서열일 수 있다.
추가의 N-말단 또는 C-말단 펩타이드 서열은 원상태 서열일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "원상태" 서열은 천연 발생 에를리히아 OMP-1 서열로부터 펩타이드 서열 또는 그 변이체이다. 특정 구현예에서, 펩타이드 서열은 천연 발생 에 를리히아 OMP-1 서열의 단편이다. 펩타이드 서열은, 예를 들면, OMP-1의 보존된 또는 비-보존된 영역으로부터일 수 있다. 펩타이드 서열은, 예를 들면, 에피토프, 예컨대 면역우성 에피토프 또는 숙주 (예를 들면, 인간, 개, 등) 면역계에 의해 인식가능한 임의의 다른 에피토프를 포함할 수 있다. OMP-1 단백질 및 그 펩타이드는, 예를 들면, 미국 특허 번호 6,544,517, 6,893,640, 6,923,963, 7,063,846, 및 7,407,770, 미국 특허 출원 2004/0265333 및 2009/0075368, 및 유럽 특허 번호 1026949에 기재되어 있고, 이들 각각의 내용은 본원에서 그 전체가 참고로 편입된다.
특정 구현예에서, 추가의 N-말단 또는 C-말단 펩타이드 서열은 비-원상태 서열이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비-원상태" 서열은, 원상태 OMP-1 펩타이드 서열 이외에, 에를리히아 단백질로부터인지 아닌지, 임의의 단백질 서열이다.
특정 구현예에서, 추가의 N-말단 또는 C-말단 펩타이드 서열은 서열 식별 번호: 1-120으로부터 선택된, 서열 또는 그 단편을 갖는 또 다른 펩타이드를 포함할 수 있거나 또는 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 추가의 N-말단 또는 C-말단 펩타이드 서열은 하나 또는 그 초과 연결 아미노산 (예를 들면 글리신, 세린, 또는 시스테인 잔기)를 통해 단리된 펩타이드의 집단에서 펩타이드에 연결될 수 있다.
집단에서 단리된 펩타이드는 화학 합성 및/또는 정제에 의해 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 생물학적으로 (즉, 세포 기구, 예컨대 리보솜에 의해) 생산되고 그리고 그 다음 단리된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "단리된" 펩타이드는 합성으로 또는 생물학적으로 생산되고 그리고 그 다음, 적어도 부분적으로, 펩타이드를 생산하는데 사용된 화학물질 및/또는 세포 기구로부터 정제되는 펩타이드이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 단리된 펩타이드는 실질적으로 정제된다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "실질적으로 정제된,"은, 세포성 물질 (단백질, 지질, 탄수화물, 핵산, 등), 배양 배지, 화학 전구체, 펩타이드의 합성에서 사용된 화학물질, 또는 이들의 조합이 실질적으로 없는, 분자, 예컨대 펩타이드를 언급한다. 실질적으로 정제되는 펩타이드는 약 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1% 미만 또는 그보다 적은 양의 세포성 물질, 배양 배지, 다른 폴리펩타이드, 화학 전구체, 및/또는 펩타이드의 합성에서 사용된 화학물질을 갖는다. 따라서, 실질적으로 순수한 분자, 예컨대 펩타이드는 건조 중량으로 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 해당 분자일 수 있다. 단리된 펩타이드 또는 펩타이드의 집단은 물에서 버퍼 또는, 예를 들면, 키트의 부분으로서 재구성을 기다리는 건조 형태로 존재할 수 있다.
특정 구현예에서, 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드는 리간드에 접합된다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 펩타이드는 바이오티닐화된다. 다른 구현예에서, 펩타이드는 스트렙타비딘, 아비딘, 또는 뉴트라비딘에 접합된다. 다른 구현예에서, 펩타이드는 캐리어 단백질 (예를 들면, 혈청 알부민, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌 (KLH), 또는 면역글로불린 Fc 도메인)에 접합된다. 또 다른 구현예에서, 펩타이드는 덴드리머에 접합되고/되거나 다중 항원성 펩타이드 시스템 (MAPS)의 일부이다. 펩타이드는 또한 콜로이드성 금, 양자점 또는 다른 나노입자 및/또는 라텍스 입자에 접합될 수 있다. 더욱 또 다른 구현예에서, 펩타이드는 효소, 형광성 또는 화학-발광성 마커에 접합될 수 있다.
특정 구현예에서, 단리된 펩타이드의 집단에서 펩타이드는 변형된다. 본 발명의 펩타이드는 다양한 기술에 의해, 예컨대 열 및/또는 세제 (예를 들면, SDS)를 이용한 변성에 의해 변형될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 펩타이드는 하나 또는 그 초과 추가 모이어티와 회합으로 변형될 수 있다. 회합은 공유 또는 비-공유일 수 있고, 예를 들면, 말단 아미노산 링커, 예컨대 라이신 또는 시스테인을 통해, 화학 커플링제, 또는 펩타이드 결합일 수 있다. 추가의 모이어티는, 예를 들면, 리간드, 리간드 수용체, 융합 파트너, 검출가능한 표지, 효소, 또는 펩타이드를 고정화시키는 기질일 수 있다.
또한, 단리된 펩타이드의 집단에서 펩타이드는 임의의 다양한 공지된 화학 기 또는 분자를 포함하도록 변형될 수 있다. 상기 변형은, 비제한적으로, 하기를 포함한다:
당화, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 폴리에틸렌 글리콜에 대한 공유 결합 (예를 들면, 페길화), 플라빈의 공유 결합, 헴(heme) 모이어티의 공유 결합, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 포스파티딜이노시톨의 공유 결합, 가교결합, 고리화, 디설파이드 결합 형성, 데메틸화, 공유 교차-링크의 형성, 시스틴의 형성, 파이로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마 카복실화, 당화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백분해 가공, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 유비퀴틴화, 지방산을 갖는 변형, 단백질에 대한 아미노산의 전달-RNA 매개된 부가 예컨대 아르기닐화 등. (비천연 아미노산 포함하는) 아미노산의 유사체 및 치환된 연결기를 갖는 펩타이드가 또한 포함된다.
상기 제시된 바와 같은 변형은 당해분야의 숙련가에게 공지되고 그리고 과학 문헌에 매우 상세히 기재되어 있다. 특히 몇몇의 공통 변형, 당화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카복실화, 하이드록실화 및 ADP-리보실화가, 예를 들면, 많은 기본 본문, 예컨대 Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd ed., T. e. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993)에 기재된다. 상기 주제에 관하여 많은 상세한 보고서가, 예컨대 Wold, F., Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York 1-12 (1983); Seifter 등 (1990) Meth. Enzymol. 182:626-646 및 Rattan 등 (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62에 의해 이용가능하다.
특정 구현예에서, 펩타이드의 집단에서 하나 또는 그 초과 또는 모든 펩타이드는 기질, 예컨대 고형 또는 반-고형 지지체에 부착 또는 고정된다. 부착은 공유 또는 비-공유일 수 있고, 그리고 공유 또는 비-공유 결합을 가능하게 하는 펩타이드와 관련된 모이어티, 예컨대 캐리어, 지지체 또는 표면에 부착된 성분에 높은 친화성을 갖는 모이어티에 의해 촉진될 수 있다. 예를 들면, 펩타이드는 리간드, 예컨대 바이오틴과 관련될 수 있고, 그리고 표면과 관련된 성분은 상응하는 리간드 수용체, 예컨대 아비딘일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 융합 파트너, 예를 들면, 기질에 펩타이드의 부착을 촉진시키는 소 혈청 알부민 (BSA)과 관련될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 금속성 나노층을 통해 기질 예컨대 국재화된 표면 플라즈몬 공명 분광학 (LSPR) 표면에 부착 또는 고정된다. 한 구현예에서, 금속성 나노층은 카드뮴, 아연, 수은, 또는 귀금속, 예컨대 금, 은, 구리, 및 백금으로 구성된다. 펩타이드 또는 펩타이드의 집단은 면역검정 동안 항체를 함유하는 샘플의 부가 이전 또는 이후 기질에 부착 또는 고정될 수 있다.
특정 구현예에서, 기질은 비드, 예컨대 콜로이드성 입자 (예를 들면, 금, 은, 백금, 구리, 카드뮴으로 제조된 콜로이드성 나노입자, 금속 복합물, 다른 연질 금속, 코어-쉘 구조 입자, 또는 중공 금 나노구형체) 또는 다른 유형의 입자 (예를 들면, 자성 비드 또는 실리카, 라텍스, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리아크릴레이트, 또는 PVDF를 포함하는 입자 또는 나노입자)이다. 상기 입자는 표지 (예를 들면, 비색, 화학발광, 또는 형광 표지)를 포함할 수 있고 그리고 면역검정 동안 펩타이드의 위치를 시각화하는데 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 펩타이드의 말단 시스테인은 펩타이드를 직접적으로 금, 은, 백금, 구리, 카드뮴으로 제조된 나노입자, 금속 복합물, 또는 다른 연질 금속, 또는 금속 나노쉘 (예를 들면, 금 중공 구형체, 금-코팅된 실리카 나노쉘, 및 실리카-코팅된 금 쉘)에 결합하는데 사용된다.
특정 구현예에서, 기질은 측면 유동 면역검정 디바이스에서 닷 블랏 또는 유로이다. 예를 들면, 펩타이드는 다공성 막, 예컨대 PVDF 막 (예를 들면, Immobilon™ 막), 니트로셀룰로오스 막, 폴리에틸렌 막, 나일론 막, 또는 유사한 유형의 막에 부착 또는 고정될 수 있다.
특정 구현예에서, 기질은 분석 또는 원심 회전자에서 유로이다. 다른 구현예에서, 기질은 튜브 또는 웰, 예컨대 ELISA 검정에서 사용에 적합한 플레이트 (예를 들면, 마이크로티터 플레이트)에서 웰이다. 상기 기질은 유리, 셀룰로오스-계 물질, 열가소성 폴리머, 예컨대 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 또는 폴리에스테르, 미립자 물질 (예를 들면, 유리 또는 다양한 열가소성 폴리머)로 구성되는 소결된 구조, 또는 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리설폰, 등으로 구성되는 캐스트 막 필름을 포함할 수 있다. 기질은 다공성 폴리에틸렌, 예를 들면, Chromex Corporation (Albuquerque, NM)로부터 0.2-15 마이크론 다공성 폴리에틸렌으로서 통상적으로 공지된, 폴리에틸렌의 소결된, 미세 입자일 수 있다. 이들 기질 물질의 모두는 적합한 형상, 예컨대 필름, 시트, 또는 플레이트에서 사용될 수 있거나, 또는 이들은 적절한 불활성 캐리어, 예컨대 종이, 유리, 플라스틱 필름, 또는 패브릭에 코팅되거나 결합 또는 적층될 수 있다. 고형 상에 펩타이드의 적합한 고정화 방법은 이온성, 소수성, 공유 상호작용 등을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명의 방법은, 감염된 대상체의 면역계에 의해 그 생체액 또는 조직에서 생산되는, 그리고 펩타이드의 집단 및, 임의로, 하나 또는 그 초과 적합한 추가의 항원성 폴리펩타이드 또는 펩타이드에서 하나 의 그 초과 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 또는 그 초과 에를리히아 항원 (예를 들면, 병원성 에를리히아, 예컨대 E. 샤프핀시스, E. 뮤리스, E. 에윈기이, 또는 E. 카니 스의 항원)에 대하여 천연 발생 항체의 존재 검출을 포함한다.
예를 들면, 한 측면에서, 본 발명은 샘플을 적어도 3개의 상이한 펩타이드를 포함하는 펩타이드의 집단과 접촉하는 것을 포함하는 E. 샤프핀시스, E. 뮤리스, E. 에윈기이, 및/또는 E. 카니스로부터 항원에 대하여 항체의 존재를 대상체로부터 샘플에서 검출 (여기서 각각의 펩타이드는 서열 식별 번호: 1의 서열을 포함한다); 그리고 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 형성 검출 (여기서 복합체의 형성은 E. 샤프핀시스, E. 뮤리스, E. 에윈기이, 및/또는 E. 카니스로부터 항원에 대하여 항체의 존재를 나타낸다) 의 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 펩타이드의 집단은 서열 식별 번호: 4-51로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2 또는 3개의 상이한 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 샘플을 적어도 3개의 상이한 펩타이드를 포함하는 펩타이드의 집단과 접촉하는 것을 포함하는 E. 에윈기이로부터 항원에 대하여 항체의 존재를 대상체로부터 샘플에서 검출 (여기서 각각의 펩타이드는 서열 식별 번호: 2의 서열을 포함한다); 그리고 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 형성 검출 (여기서 복합체의 형성은 E. 에윈기이로부터 항원에 대하여 항체의 존재를 나타낸다) 의 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 펩타이드의 집단은 서열 식별 번호: 52-66으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2 또는 3개의 상이한 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 샘플을 적어도 3개의 상이한 펩타이드를 포함하는 펩타이드의 집단과 접촉하는 것을 포함하는 E. 샤프핀시스 및/또는 E. 카니스로부터 항원에 대하여 항체의 존재를 대상체로부터 샘플에서 검출 (여기서 각각의 펩타이드는 서열 식별 번호: 3의 서열을 포함한다); 그리고 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 형성 검출 (여기서 복합체의 형성은 E. 샤프핀시스 및/또는 E. 카니스로부터 항원에 대하여 항체의 존재를 나타낸다) 의 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 펩타이드의 집단은 서열 식별 번호: 67-120으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2 또는 3개의 상이한 서열을 포함한다.
본 발명의 방법에서 하나 또는 그 초과 펩타이드를 포함하는 항체-펩타이드 복합체의 형성을 검출하는데 사용될 수 있는 수많은 상이한 검정이 있다. 예를 들면, 검출 단계는 ELISA 검정 수행, 면역형광 검정 수행, 측면 유동 면역검정 수행, 응집 검정 수행, 파장 시프트 검정 수행, 웨스턴 블랏, 슬롯 블랏, 또는 닷 블랏 수행, 분석 또는 원심 회전자에서 샘플 분석, 또는 전기화학, 광학, 또는 광-전자 센서를 이용한 샘플 분석을 포함할 수 있다. 이들 상이한 검정은 본원에 기재되어 있고/있거나 당해분야의 숙련가에 공지된다.
적합한 면역검정 방법은 전형적으로 하기를 포함한다: (예를 들면, 환자로부터) 항체를 함유할 것 같은 체액 또는 조직의 샘플을 받음 또는 수득함; (예를 들면, 항체에 펩타이드의 특이적 결합을 위해) 특이적 펩타이드-항체 복합체의 형성에 효과적인 조건하에서 펩타이드의 집단과 검정되는 샘플을 접촉함 (예를 들면, 인큐베이팅 또는 반응); 및 항체-펩타이드 반응의 존재를 위해 접촉된 (반응된) 샘플을 검정함 (예를 들면, 항체-펩타이드 복합체의 양 결정). 항체-펩타이드 복합체의 상승된 양의 존재는 대상체가 감염성 에를리히아 종에 노출 및 감염됨을 나타낸다. 에를리히아 항원에 대하여 항체에 "특이적으로 결합하는" (예를 들면, "특이적인" 또는 "우선적으로" 결합하는), 그 변형된 형태를 포함하여, 펩타이드는 항체와 상호작용하거나, 또는 항체의 검출을 허용하는데 충분한 시간 및 양으로 그와 물리적 회합을 형성 또는 수행한다. "특이적으로" 또는 "우선적으로,"는 펩타이드가 샘플에서 다른 항체에 대해서 보다 상기 항체에 대해서 높은 친화성 (예를 들면, 높은 정도의 선택성)을 갖음을 의미한다. 예를 들면, 펩타이드는 샘플에서 다른 항체에 대해서 보다 적어도 약 1.5-배, 2-배, 2.5-배, 3-배, 또는 더 높은 항체에 대해서 친화성을 가질 수 있다. 상기 친화성 또는 특이성의 정도는, 예를 들면, 경쟁적 결합 연구를 포함하여, 다양한 일상적인 절차에 의해 결정될 수 있다. ELISA 검정에서, 양성 반응은 건강한 대조군의 그룹의 평균 값보다 더 큰 값 2 또는 3 표준 편차로서 정의된다. 일부 구현예에서, 제2 단계 검정은 단구성 및/또는 과립구성 에를리히아증의 명백한 혈청진단을 제공하는데 필요하다.
어구 예컨대 "항체를 함유하는 샘플" 또는 "샘플에서 항체 검출"은 항체가 함유되지 않거나 검출되지 않는 샘플 또는 결정 (예를 들면, 검출 시도)을 배제하는 것을 의미하지 않는다. 일반적인 의미에서, 본 발명은, 검출되는지와 무관하게, 감염성 에를리히아를 이용한 감염에 반응으로 생산된 항체가 샘플에 존재하는지를 결정하는 검정을 포함한다.
특이적으로 반응하는 펩타이드 및 항체의 반응용 조건은 당해분야의 숙련가에 공지된다. 참고, 예를 들면, Current Protocols in Immunology (Coligan 등, editors, John Wiley & Sons, Inc).
일부 구현예에서, 본 방법은 대상체로부터 항체를 함유할 것 같은 체액 또는 조직의 샘플을 얻거나 수득하는 것을 포함한다. 항체는, 예를 들면, IgG, IgE, IgD, IgM, 또는 IgA 유형일 수 있다. 일반적으로, 예를 들면, 감염의 초기 단계에서 검출을 위해서 IgM 및/또는 IgA 항체는 검출된다. 상기 논의된 추가의 펩타이드 (예를 들면, 편모 단백질의 검출용 펩타이드)의 일부가 본 방법에서 사용되는 경우 IgG 항체는 검출될 수 있다. 샘플은 바람직하게는 수득하기 쉽고 그리고 정맥 혈액 샘플 또는 심지어 손가락 찌름으로부터 유도된 전혈, 혈장, 또는 혈청일 수 있다. 다른 신체 부분 또는 다른 체액, 예컨대 뇌-척수액 (CSF), 타액, 위 분비, 점액, 소변, 등으로부터 조직은 항체를 함유하기 위해 공지되고 그리고 샘플의 공급원으로서 사용될 수 있다. 샘플은 또한 조직 추출물 또는 세포 용해물일 수 있다.
일단 펩타이드의 집단 및 샘플 항체가 적합한 매질에서 반응하도록 허용되면, 항체-펩타이드 반응의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 검정은 수행된다. 숙련된 작업자에게 명백한, 많은 유형의 적합한 검정중에서, 면역침강 및 응집 검정은 증대 있거나 없이 수행된다.
특이적 항체의 검출용 항원을 이용한 면역검정용 프로토콜은 업계에 잘 알려진다. 예를 들면, 종래의 샌드위치 검정은 사용될 수 있거나, 또는 종래의 경쟁적 검정 구성방식이 사용될 수 있다. 일부 적합한 유형의 검정의 논의를 위해, 참고 Current Protocols in Immunology (상기). 특정 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 항체를 함유하는 샘플의 부가 이전 또는 이후 공유 또는 비-공유 결합으로 고형 또는 반-고형 표면 또는 캐리어에 고정된다.
특이적 결합 검정, 특히 면역검정 수행용 디바이스는 공지되고 그리고 본 방법에서 사용에 쉽게 적응될 수 있다. 고형 상 검정은, 일반적으로, 시약의 분리가 더 빠르고 간단하기 때문에, 분리 단계, 예컨대 침전, 원심분리, 여과, 크로마토그래피, 또는 자기를 필요로 하는 불균질 검정 방법보다 수행하기 더 쉽다. 고형-상 검정 디바이스는 마이크로티터 플레이트, 관류 검정 디바이스 (예를 들면, 측면 유동 면역검정 디바이스), 딥스틱, 및 면역모세관 또는 면역크로마토그래피 면역검정 디바이스를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 펩타이드의 집단에 부착된 고형 또는 반-고형 표면 또는 캐리어는 마이크로티터 웰에서 바닥 또는 벽, 필터 표면 또는 막 (예를 들면, 니트로셀룰로오스 막 또는 PVDF (폴리비닐리덴 플루오라이드) 막, 예컨대 Immobilon™ 막), 중공 섬유, 비드처리된 크로마토그래피 매질 (예를 들면, 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔), 자성 비드, 섬유질 셀룰로오스 매트릭스, HPLC 매트릭스, FPLC 매트릭스, 액체상에서 용해 또는 분산된 경우, 여기에 결합된 펩타이드를 갖는 분자가 필터로 유지될 수 있는 크기의 분자를 갖는 물질, 교질입자를 형성할 수 있거나 또는 교질입자의 비말동반 없이 액체 상을 변화 또는 교환시키는 교질입자의 형성에 참여하는 물질, 수용성 폴리머, 또는 임의의 다른 적합한 캐리어, 지지체 또는 표면이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 펩타이드의 집단은 검출을 가능하게 하는 적합한 표지로 제공된다. 단독으로 또는 다른 조성물 또는 화합물과 협력하여, 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 종래의 표지가 사용될 수 있다. 적합한 표지는, 비제한적으로, 효소 (예를 들면, HRP, 베타-갈락토시다아제, 알칼리성 포스파타제, 등), 형광성 표지, 방사성 표지, 착색된 라텍스 입자, 및 금속-접합된 표지 (예를 들면, 금속성 나노층, 금속성 나노입자- 또는 금속성 나노쉘-접합된 표지)를 포함한다. 적합한 금속성 나노입자 또는 금속성 나노쉘 표지는, 비제한적으로, 금 입자, 은 입자, 구리 입자, 백금 입자, 카드뮴 입자, 복합 입자, 금 중공 구형체, 금-코팅된 실리카 나노쉘, 및 실리카-코팅된 금 쉘을 포함한다. 검출가능한 층에 적합한 금속성 나노층은 카드뮴, 아연, 수은, 및 귀금속, 예컨대 금, 은, 구리, 및 백금으로 구성되는 나노층을 포함한다.
적합한 검출 방법은, 예를 들면, 비색 검정 (예를 들면, HRP 또는 베타-갈락토시다아제 활성의 검출용), 공초점 현미경검사를 포함하여, 광학 현미경검사, 면역형광 현미경검사를 이용하는 시각 검사로, 또는 유세포측정 (FACS), 자기방사 (예를 들면, 방사성 표지된 제제의 검출용), 전자 현미경검사, 면역염색, 세포하 분획화, 등으로, 직접적으로 또는 간접적으로, 태그되는 제제의 검출을 포함한다. 한 구현예에서, 방사성 원소 (예를 들면, 방사성 아미노산)가 펩타이드 사슬에 직접적으로 편입되고; 또 다른 구현예에서, 형광성 표지는 바이오틴/아비딘 상호작용, 플루오레신 접합된 항체와 회합 등을 통해 펩타이드에 관련된다. 한 구현예에서, 항체에 대하여 검출가능한 특이적 결합 파트너는 혼합물에 부가된다. 예를 들면, 결합 파트너는 제1 항체에 결합하는 검출가능한 2차 항체 또는 다른 결합제 (예를 들면, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 키메라성 단백질 A/G, A/G/L, A/L, G/L 또는 이들의 조합)일 수 있다. 이러한 2차 항체 또는 다른 결합제는, 예를 들면, 방사성, 효소성, 형광성, 발광성, 화학-발광성, 금속성 나노입자 또는 금속성 나노쉘 (예를 들면 콜로이드성 금), 또는 다른 검출가능한 표지, 예컨대 아비딘/바이오틴, 아비딘/스트렙타비딘 또는 아비딘/폴리스트렙타비딘 시스템으로 표지될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 결합 파트너는, 효소, 예컨대 서양고추냉이 페록시다아제 또는 알칼리성 포스파타제 또는 다른 신호전달 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들면 바이오틴/아비딘 또는 바이오틴/스트렙타비딘 상호작용을 통해) 접합될 수 있는, 본 발명의 펩타이드이다. 상기 구현예에서, 검출가능한 신호는 검출가능한 신호, 예컨대 발색, 형광, 또는 화학발광 기질을 생산하는 효소의 기질 부가에 의해 생산된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 결합된 펩타이드 검출용 "검출 시스템"은 검출가능한 결합 파트너, 예컨대 펩타이드에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 결합 파트너는 직접적으로 표지된다. 또 다른 구현예에서, 결합 파트너는 신호 발생 시약, 예컨대, 적합한 기질의 존재하에, 검출가능한 신호를 생산할 수 있는 효소에 부착된다. 펩타이드 고정화용 표면은 임의로 검출 시스템을 동반할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 검출 절차는 명백하게 색상 변화에 대한 항체-펩타이드 복합체 검사, 또는 물리적-화학적 변화에 대한 항체-펩타이드 복합체 검사를 포함한다. 물리적-화학적 변화는 산화 반응 또는 다른 화학 반응과 함께 발생할 수 있다. 이들은 분광측정기 등을 사용하여 눈으로 검출될 수 있다.
매우 유용한 검정 구성방식은 측면 유동 면역검정 구성방식이다. 인간 또는 동물 (예를 들면, 개, 마우스, 사슴, 등) 면역글로불린에 대한 항체, 또는 포도상 구균 A, G, 또는 L 단백질은, 건조되고 그리고 유리 섬유 패드 (샘플 적용 패드 또는 콘주게이트 패드)에 배치되는 신호 발생제 또는 리포터 (예를 들면, 콜로이드성 금)로 표지될 수 있다. 진단 펩타이드는 막, 예컨대 니트로셀룰로오스 또는 PVDF (폴리비닐리덴 플루오라이드) 막 (예를 들면, Immobilon™ 막)에 고정된다. 샘플 (혈액, 혈청, 등)의 용액이 샘플 적용 패드에 적용되는 (또는 콘주게이트 패드를 통해 유동하는) 경우, 표지된 리포터를 용해시키고, 그 다음 샘플에서 모든 항체에 결합한다. 그 다음 수득한 복합체는 모세관 작용에 의해 다음 막 (진단 펩타이드를 함유하는 PVDF 또는 니트로셀룰로오스)으로 수송된다. 만일 진단 펩타이드에 대한 항체가 존재하면, 이들은 막에 줄무늬된 진단 펩타이드에 결합하고, 그렇게 함으로써 신호 (예를 들면, 보여질 수 있는 또는 시각화될 수 있는 밴드)를 발생시킨다. 표지된 항체에 특이적인 추가의 항체 또는 제2 표지된 항체는 대조군 신호를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
측면 유동 면역검정을 위한 대안적인 구성방식은, 리간드 (예를 들면, 바이오틴)에 결합되고 그리고 표지된 리간드 수용체 (예를 들면, 스트렙타비딘-콜로이드성 금)로 착화되는 단리된 펩타이드의 집단을 포함한다. 표지된 펩타이드 복합체는 샘플 적용 패드 또는 콘주게이트 패드에 배치될 수 있다. 본 발명의 항-인간 IgG/IgM 또는 항-동물 (예를 들면, 개, 마우스, 사슴) IgG/IgM 항체 또는 다른 펩타이드는 시험 부위 (예를 들면, 시험 라인)에서 막, 예컨대 PVDF의 니트로셀룰로오스에 고정된다. 샘플이 샘플 적용 패드에 부가되는 경우, 샘플내 항체는 표지된 펩타이드 복합체와 반응하여 이로써 본 발명의 펩타이드에 결합하는 항체는 간접적으로 표지된다. 샘플내 항체는 그 다음 모세관 작용에 의해 다음 막 (진단 펩타이드를 함유하는 PVDF 또는 니트로셀룰로오스)으로 수송되고 그리고 고정된 항-인간 IgG/IgM 또는 항-동물 IgG/IgM 항체 (또는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G 융합 단백질, 단백질 L, 또는 이들의 조합) 또는 본 발명의 고정된 펩타이드에 결합한다. 만일 임의의 샘플 항체가 본 발명의 표지된 펩타이드에 결합되면, 펩타이드에 관련된 표지는 시험 부위에서 보여질 수 있거나 또는 시각화될 수 있다. (본 발명의 펩타이드가 샘플내 항체와 반응하기 위해 가용성 표지된 복합체로서 그리고 시험 부위에서 고정된 포착 제제로서 사용되는) 이러한 유형의 측면 유동 디바이스의 또다른 구현예에서, 검출 신호를 증폭시키기 위해, 검출가능한 표지 (예를 들면, 금속성 나노입자 또는 나노쉘, HRP, ALP, 형광단, 착색된 라텍스 입자)에 접합된 단백질 A, 단백질 G, 및/또는 단백질 A/G 융합 단백질은 본 발명의 고정된 펩타이드에 의해 포착된 에를리히아 항원에 대한 임의의 항체의 Fc 영역에 결합할 시험 부위에 적용될 수 있다. 상기 검정에 적합한 대조군은, 예를 들면, 샘플 적용 패드 또는 콘주게이트 패드에 위치한 닭 IgY-콜로이드성 금 콘주게이트, 및 시험 부위 근처에 위치한 대조군 부위에 고정된 항-닭 IgY 항체를 포함할 수 있다. 다른 적합한 대조군은 닭 항-단백질 A, 마우스 IgG 또는 단백질 A/G/L에 결합할 수 있는 임의의 다른 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에서 수행된 그리고 본원에서 기재된 측면 유동 면역검정의 적어도 일부에서, 닭 항-단백질 A가 대조군 라인으로서 사용되었다.
혈액 생성물 또는 다른 생리적 또는 생물학적 유체의 스크리닝을 위한 또 다른 검정은 효소 연결된 면역흡착 검정, 즉, ELISA이다. 전형적으로 ELISA에서, 단리된 펩타이드 또는 펩타이드의 혼합물 또는 집단은 직접적으로 흡착되거나, 또는 그 다음 캐리어 단백질에, 마이크로티터 웰의 표면에 직접 또는 포착 매트릭스 (예를 들면, 항체)를 통해 콘주게이션된다. 그 다음 잔류하는 비-특이적 단백질-결합 부위는 적절한 제제, 예컨대 소 혈청 알부민 (BSA), 열-불활성화된 정상 염소 혈청 (NGS), 또는 BLOTTO (또한 보존제, 염, 및 발포방지제를 함유하는 탈지 분유의 완충된 용액)로 차단된다. 그 다음 웰은 특이적 항-에를리히아 (예를 들면, 항-E. 샤프핀시스 , 항-E. 에윈기이 , 또는 항-E. 카니스) 항체 함유를 의심받는 생물학적 샘플로 인큐베이션된다. 상기 생물학적 샘플은 샘플의 혈청, 혈장, 또는 다른 유형의 샘플일 수 있다. 샘플은 아무것도 타지 않은채 적용될 수 있거나, 또는 더욱 종종 보통 소량 (0.1-10.0중량%)의 단백질, 예컨대 BSA, NGS, 또는 BLOTTO를 함유하는 완충된 용액에서 희석될 수 있다. 특이적 결합이 발생할 수 있는 충분한 시간의 길이 동안 인큐베이팅 이후, 웰은 세정되어 비결합된 단백질을 제거하고 그 다음 최적의 농도의 (예를 들면, 또 다른 동물, 예컨대 개, 마우스, 소, 등으로부터 인간 대상체, 항-인간 면역글로불린 (αHuIg)을 위한) 적절한 항-면역글로불린 항체 또는, 표준 절차에 의해 효소 또는 다른 표지에 접합되고 차단 버퍼에서 용해되는 본 발명의 또 다른 펩타이드로 인큐베이션된다. 표지는, 서양고추냉이 페록시다아제 (HRP), 베타-갈락토시다아제, 알칼리성 포스파타제 (ALP), 글루코오스 옥시다제 등을 포함하여, 다양한 효소로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 단백질 A 또는 단백질 G-HRP는 본 발명의 방법에서 사용된다. 충분한 시간은 특이적 결합이 다시 발생하도록 허용되고, 그 다음 웰은 다시 세정되어 비결합된 콘주게이트를 제거하고, 효소를 위한 적합한 기질이 부가된다. 색상은 전개가 허용되고 웰의 내용물의 광학 밀도는 시각적으로 또는 기기적으로 측정된다 (적절한 파장 길이에서 평가된다). 컷오프 OD 값은 에를리히아증이 풍토성이 아닌 부위에서 개체로부터 수집된 적어도 50 혈청 샘플의 평균 OD+3 표준 편차 (SD)로서, 또는 다른 상기 종래의 정의에 의해 정의될 수 있다. 고 특이적 검정의 경우에서, OD+2 SD는 컷오프 값으로서 사용될 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 방법은 응집 검정을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 금속성 나노입자 또는 금속성 나노쉘 (예를 들면, 콜로이드성 금, 등) 또는 라텍스 비드는 단리된 펩타이드의 집단에 접합된다. 차후에, 생물학적 유체는 비드/펩타이드 콘주게이트로 인큐베이션되고, 그에 의해 반응 혼합물을 형성한다. 그 다음 반응 혼합물은 분석되어 항체의 존재를 측정한다. 특정 구현예에서, 응집 검정은, 경쟁 검정의 경우, 본 발명의 조성물의 펩타이드에 특이적인 항체 (1), 또는 샌드위치 검정의 경우, 샘플 항체 (예를 들면, 항-인간 IgG 또는 IgM 항체, 항-개 IgG 또는 IgM 항체, 항-고양이 IgG 또는 IgM 항체, 등)를 검출할 수 있는 항체 (2)에 접합된, 입자, 예컨대 금속성 나노입자 또는 금속성 나노쉘 (예를 들면, 콜로이드성 금, 등) 또는 라텍스 비드의 제2 집단의 용도를 포함한다. 적합한 응집 방법은 응집 규모의 평가 수단으로서 원심분리를 포함할 수 있다.
또다른 구현예에서, 단리된 펩타이드의 집단은 니트로셀룰로오스 종이에 전기- 또는 닷-블랏된다. 차후에, 샘플, 예컨대 생물학적 유체 (예를 들면, 혈청 또는 혈장)는 블랏된 항원으로 인큐베이션되고, 생물학적 유체내 항체는 항원(들)에 결합될 수 있다. 결합된 항체는 그 다음, 예를 들면, 표준 면역효소적 방법에 의해 또는 제2 항체 또는 다른 항체 결합제, 예컨대 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G 융합 단백질, 단백질 L, 또는 이들의 조합에 커플링된 금속성 나노입자 또는 나노쉘을 이용한 가시화에 의해 검출될 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드 또는 조성물은 니트로셀룰로오스 종이에 전기- 또는 닷-블랏된다. 차후에, 샘플, 예컨대 생물학적 유체 (예를 들면, 혈청 또는 혈장)는 블랏된 항원으로 인큐베이션되고, 생물학적 유체내 항체는 항원(들)에 결합될 수 있다. 결합된 항체는 그 다음, 예를 들면, 표준 면역효소적 방법에 의해 또는 제2 항체 또는 다른 항체 결합제, 예컨대 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G 융합 단백질, 단백질 L, 또는 이들의 조합에 커플링된 금속성 나노입자 또는 나노쉘을 이용한 가시화에 의해 검출될 수 있다.
또다른 구현예에서, 단백질 마이크로어레이 (또는 단백질 칩)는 본 방법에서 사용된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 마이크로어레이 또는 칩은, 상기 기재된 바와 같이 펩타이드의 집단을 포함하는 포착 단백질의 배열에 접합되는, 지지체 표면 예컨대 유리 슬라이드, 니트로셀룰로오스 막, 비드, 또는 마이크로티터 플레이트를 포함한다. 형광 염료로 임의로 표지된 샘플은 배열에 부가된다. 존재하면, 샘플내 항체 사이의 특이적 결합, 및 고정된 단백질은 레이저 스캐너에 의해 판독되는 형광성 신호를 방출한다. 본 발명의 펩타이드에 결합된 비표지된 항체는 또한 양자점-표지된 단백질 A, A/G 등으로 차후에 표지될 수 있다. 단리된 펩타이드의 마이크로어레이는 또한 원심 분석기에서 마이크로칩 칩 구성방식으로 사용될 수 있다. 소량의 샘플 및 시약을 소비하는 단백질 마이크로어레이는 고-처리량이고, 신속하고, 자동화되고, 경제적이고, 그리고 크게 민감성이다.
임의의 수의 종래의 단백질 검정 구성방식, 특히 면역검정 구성방식은 본원에서 기재된 임의의 방법용 단리된 펩타이드의 집단을 이용하도록 설계될 수 있음이 당해분야의 숙련가에 의해 이해되어야 한다. 본 발명은 따라서 특정한 검정 구성방식의 선택에 의해 제한되지 않고, 당해분야의 숙련가에 공지되는 모든 적합한 검정 구성방식을 포함한다고 믿어진다.
본원에서 기재된 또는 달리 당해분야의 숙련가에 공지된 임의의 적합한 검정 구성방식을 이용하여, 단리된 펩타이드의 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 형성이 검출될 수 있다. 복합체의 "세트"는 단리된 펩타이드의 한 집단과 샘플내 임의의 항체 사이에 형성된 복합체를 언급한다. 검출 결과가 복합체의 또 다른 세트 없는 한 세트의 형성으로서 기재된 경우, 단리된 펩타이드의 2개의 상이한 집단으로 수득될 수 있는 결과의 범위를 포함한다. "복합체의 제2 세트 없는 제1 세트의 형성"은, 예를 들면, 단리된 펩타이드의 제1 집단으로 수득된 명확히 양성 결과 및 단리된 펩타이드의 제2 집단으로 명확히 음성 결과를 포함할 수 있다. 또한 단리된 펩타이드의 제1 집단으로 수득된 결과의 매우 높은 스코어 및 단리된 펩타이드의 제2 집단으로 수득된 결과의 아주 낮은 스코어를 포함할 수 있다. 추가로 단리된 펩타이드의 제2 집단 보다 제1 집단으로 수득된 결과의 임의의 상대적으로 높은 스코어를 포함할 수 있다.
본원에서 기재된 임의의 검정 구성방식을 위해, 스코어는 각각의 샘플의 검정 결과에 배정될 수 있다. 상기 스코어는 검정 결과의 상대적인 값, 수준, 강도, 또는 정도를 언급한다. 당해분야의 숙련가에 의해 또는 알고리즘 이용, 때때로 공지된 분석물, 예를 들면, 항원 또는 항체를 갖는 샘플 이용, 임의로 공지된 분석물 ("표준" 또는 "캘리브레이터" 언급될 수 있음)의 공지된 농도 또는 역가를 갖는 샘플 이용에 의해 인공적으로 만들어질 수 있다. 스코어는 당해분야의 숙련가에 의해 수작업으로 배정된 또는, 식 또는 컴퓨터 알고리즘, 예를 들면, 음성 대조군에 대해 0 부터 양성 대조군에 대해 임의의 양수 (예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 등)로 발생된 수일 수 있다. 또한 기호, 예를 들면, 음성 대조군에 대해 "-", 및 양성 대조군에 대해 "+", "++", "+++", 등으로 나타낼 수 있다. 스코어는 식을 이용한 계산에 의해 또는 컴퓨터 알고리즘을 이용한 자동처리에 의해 결정될 수 있거나, 또는 검정 결과의 시각 검사, 측정, 또는 추정에 의해 결정될 수 있다. 공지된 분석물 (표준 또는 캘리브레이터)의 공지된 농도 또는 역가를 갖는 샘플 이용의 경우, 상기 표준/캘리브레이터는 희석된 및 비희석된 상태로 검정될 수 있고, 그리고 스코어의 범위 또는 스코어의 표준 곡선은 발생될 수 있고, 이는 바람직하게는 동일한 검정으로 그리고 동일한 검정 작동에서 동일한 분석물에 대해 검정된 미공지된 샘플의 스코어를 측정하는데 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 방법은 샘플이 1, 2 또는 모든 3개의 하기 에를리히아 종: E. 카니스 , E. 샤프핀시스 , 및 E. 에윈기이로 감염되는지를 확인하기 위해 면역화학적 검정과 펩타이드의 3개의 집단의 조합을 이용한다.
본 방법의 일부 구현예에서, 특정 종 (예를 들면, E. 에윈기이 ), 또는 종 (예를 들면, E. 카니스 및 E. 샤프핀시스 , 또는 E. 카니스 , E. 샤프핀시스 , 및 E. 에윈기이)의 특정 조합에 대하여 항체의 공지된 역가를 갖는 표준 샘플이 시험된다. 특정 구현예에서, 표준 샘플은 일련의 표준/캘리브레이터로 희석된다. 캘리브레이터는 정제된 항체를 이용하여 제조될 수 있다. 캘리브레이터는 또한 다양한 수준의 항체 역가를 갖는 항혈청/항체 샘플의 선택, 풀링 및/또는 희석으로 제조될 수 있다. 당해분야의 숙련가는 적합한 캘리브레이터를 발생시키는 방법을 알아야 한다. 스코어 및 표준 곡선은 표준/캘리브레이터의 시리즈에 대해 발생될 수 있다. 일부 구현예에서, 컷오프는 에를리히아의 특정 종에 대한 항체를 포함하기 위해 양성으로서 분류되는 샘플용으로 발생된다 (예를 들면, E. 에윈기이에 대한 항체용 컷오프, E. 카니스 및 E. 샤프핀시스에 대한 항체용 컷오프, 및 E. 카니스 , E. 샤 프핀시스, 및 E. 에윈기이에 대한 항체용 또 다른 컷오프). 샘플은 저, 중, 또는 고 샘플로 분류될 수 있다. 저 샘플은 보통 검출 한계의 바로 위이고, 그리고 초고 샘플은 주어진 집단에서 최고 반응을 보인다. ELISA용 캘리브레이터는 종종 저 내지 초고 샘플 범위를 나타내도록 제조된다.
특정 구현예에서, 미공지된 샘플은 표준으로서 동일한 검정으로 시험된다. 일부 구현예에서, 미공지된 샘플의 스코어는 각각의 표준의 스코어 또는 표준 곡선에 대하여 발생되고, 예를 들면, 미공지된 샘플의 스코어는 E. 에윈기이에 대한 항체의 공지된 역가를 갖는 표준에 대하여 발생될 수 있고; 그리고 미공지된 샘플의 또 다른 스코어는 모든 E. 카니스 및 E. 샤프핀시스에 대한 항체의 공지된 역가를 갖는 표준에 대하여 발생될 수 있다.
스코어는 동일한 분석물에 대해 또는 상이한 분석물에 대해 검정된 샘플 중에서 비교될 수 있다.
동일한 분석물에 대해 검정된 샘플의 스코어를 비교하는 경우, 만일 모든 샘플이 표준/캘리브레이터로서 동일한 조건하에 동일한 실험에서 검정되면, 스코어는 표준/캘리브레이터로부터 발생된 스코어의 동일한 범위 또는 스코어의 동일한 표준 곡선으로부터 결정될 수 있고 비교될 수 있다. 만일 샘플이 동일한 표준/캘리브레이터를 따라 상이한 실험에서 검정되면, 스코어는 또한 표준/캘리브레이터로부터 스코어의 상이한 범위 또는 스코어의 상이한 표준 곡선으로부터 결정될 수 있다. 그 다음 동일한 표준/캘리브레이터에 관하여 검정된 샘플의 상대 스코어는 서로 결정 및 비교될 수 있다.
상이한 분석물에 대해 검정된 샘플의 스코어를 비교하는 경우, 예를 들면, 에를리히아의 상이한 종에 대한 항체, 각각의 종 또는 종 (예컨대 E. 카니스 및 E. 샤프핀시스)의 조합은 그 고유의 캘리브레이터를 갖는다. 캘리브레이터 및 검정의 각각의 세트에 대한 검출의 한계는 검출되는 항체에 대해 음성으로 공지된 샘플의 평균에 2-3 표준 편차 부가에 의해 보통 배정된 컷오프를 발생시킴으로써 결정된다. 모든 에를리히아 종을 검출하는 단리된 펩타이드의 집단에 대한 캘리브레이터는 적절한 비율로 상이한 에를리히아 종, 예를 들어, 적어도 5% 각각의 항-카니스, 항-샤프핀시스, 및 항-에윈기이에 항체의 혼합물을 함유하여, 각각의 종이 충분하고 검정은 임의의 검정된 종을 놓치지 않는다. 모든 E. 카니스 및 E. 샤프핀시스를 검출하는 펩타이드의 집단에 대한 캘리브레이터는 적절한 비율로 항-카니스 및 항-샤프핀시스 샘플, 예를 들어, 적어도 5%의 각각의 종의 혼합물을 함유한다. E. 에윈기이만을 검출하는 펩타이드의 집단에 대한 캘리브레이터는 항-에윈기이 샘플만을 함유한다. E. 카니스 /E. 샤프핀시스를 검출하는 펩타이드의 집단에 대한 그리고 E. 에윈기이를 검출하는 펩타이드의 집단에 대한 캘리브레이터는 각 표준 곡선의 선형 부분으로 제한되는 스코어의 동일한 범위로 배정된다.
일부 구현예에서, 스코어는 본원에서 기재된 바와 같이 펩타이드의 집단에서 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 형성 검출로부터 발생된다. 특정 구현예에서, 스코어는, 존재하면, 샘플내 항체, 및 본원에서 기재된 바와 같이 펩타이드의 제1, 제2, 또는 제3 집단내 펩타이드를 포함하는 복합체의 형성 검출로부터 발생되어, 제1 스코어, 제2 스코어, 또는 제3 스코어를 각각 초래한다.
일부 구현예에서, 제2 스코어는 수작업으로 또는 컴퓨터 이용에 의해 제3 스코어에 비교된다. 특정 구현예에서, 만일 제2 스코어가 제3 스코어보다 높으면, 샘플은 E. 에윈기이로 감염되는 것으로 확인 또는 분류된다. 다른 구현예에서, 만일 제3 스코어가 제2 스코어보다 높으면, 샘플은 E. 카니스 및/또는 E. 샤프핀시스로 감염되는 것으로 확인 또는 분류된다.
또 다른 구현예에서, 본 방법은 추가로 감염 종이 E. 카니스 또는 E. 샤프핀시스인지를 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들어 하나의 상기 구현예에서 E. 카니 스에 대한 스코어를 발생하기 위해, 검정이 수행되어 E. 샤프핀시스 없는 E. 카니스에 대한 항체를 검출한다. E. 샤프핀시스에 대한 스코어를 발생하기 위해, 또 다른 검정이 수행되어 E. 카니스 없는 E. 샤프핀시스에 대한 항체를 검출할 수 있다. 검정 결과, 임의로 스코어는 서로 비교되어 감염종이 E. 카니스 또는 E. 샤프핀시스인지를 결정한다. 일부 구현예에서, 만일 E. 카니스에 대한 스코어가 E. 샤프핀시스에 대한 스코어보다 높으면, 샘플은 E. 샤프핀시스 없는 E. 카니스로 감염된 것으로 분류된다. 다른 구현예에서, 만일 E. 샤프핀시스에 대한 스코어가 E. 카니스에 대한 스코어보다 높으면, 샘플은 E. 카니스 없는 E. 샤프핀시스로 감염된 것으로 분류된다. 일부 구현예에서, 2개의 스코어가 동일하면, 샘플은 모든 E. 샤 프핀시스 및 E. 카니스로 감염된 것으로 또는 미결정된 것으로 분류된다.
특정 구현예에서, 본 방법에서 사용된 샘플은 야생 동물 (예를 들면, 사슴 또는 설치류, 예컨대 마우스, 칩멍크, 스쿼럴 등)로부터이다. 다른 구현예에서, 샘플은 실험 동물 (예를 들면, 마우스, 랫트, 기니아 피그, 토끼, 원숭이, 영장류 등)로부터이다. 다른 구현예에서, 샘플은 사육된 또는 위험한 동물 (예를 들면, 개, 고양이, 말)로부터이다. 또다른 구현예에서, 샘플은 인간으로부터이다. 다른 구현예에서, 샘플은 개과 또는 고양이과 대상체로부터이다. 일부 구현예에서, 샘플은 체액이다. 특정 구현예에서, 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 뇌 척수액, 점액, 소변, 또는 타액 샘플이다. 특정 구현예에서, 샘플은 전혈 샘플이다. 다른 구현예에서, 샘플은 조직 (예를 들면, 조직 균질물), 조직 추출물, 또는 세포 용해물이다.
많은 이전의 논의는 병원성 에를리히아에 대하여 항체의 검출에 관한 것이다. 그러나, 본 논의가 또한 시험관내 또는 생체내 감작된 T-세포의 검출에 적용하는 것으로 이해된다.
IgG가 생산되기 때문에, 세포-매개된 면역 반응 (예를 들면, T-헬퍼 반응)이 발생되는 것이 기대된다. 본원에서 기재된 바와 같이 감작된 T-세포와 펩타이드의 집단 사이에서 면역학적 반응성을 측정하는 것이 가능할 것임이 따라서 기대된다. 시험관내 이것은 펩타이드의 집단을 갖는 대상체로부터 단리된 T-세포 인큐베이팅 및 면역반응성 평가에 의해, 예를 들면, 차후의 T-세포 증식 평가 또는 T-세포, 예컨대 IFN-γ로부터 사이토카인의 방출 평가에 의해 실시될 수 있다. 이들 방법은 당해기술에 공지된다.
본 발명의 방법이 생체내 수행된 경우, 임의의 다양한 종래의 검정이 사용될 수 있다. 예를 들어, 사람은, 예를 들면, 대상체에 본원에서 기재된 바와 같이 펩타이드의 집단을 진피내로 주입함으로써 피부 시험의 형태로 검정을 수행할 수 있다. 주입의 위치에서 양성 피부 반응은 펩타이드의 집단이 특이적인 에를리히아 종으로 대상체가 노출됨 및 감염됨을 나타낸다. 대상체를 감염시키는 에를리히아의 종은 본원에서 기재된 바와 같이 펩타이드의 집단을 갖는 본 발명의 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 이러한 또는 다른 생체내 시험은 대상체에서 T-세포 반응의 검출에 의존한다.
본 방법의 특정 구현예는 추가로 검출 결과 보고를 포함한다. 보고는 전자적으로, 서면으로, 또는 구두로 실시될 수 있다. 기계 예컨대 컴퓨터를 통해 실시될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에서 기재된 바와 같이 단리된 펩타이드의 적어도 하나의 집단을 포함한다. 특정 구현예에서, 키트는 펩타이드의 적어도 2 또는 3개의 상이한 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에서 기재된 바와 같이 펩타이드의 제1, 제2, 및/또는 제3 집단을 포함한다. 특정 구현예에서, 키트 추가로 설명서를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 에를리히아 항원에 결합하는 항체 검출용 및/또는 존재하면 대상체를 감염시키는 에를리히아의 종 확인용 키트이다.
특정 구현예에서, 키트는 하기를 포함한다:
본원에서 기재된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제1 집단;
본원에서 기재된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제2 집단;
본원에서 기재된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제3 집단; 및
존재하면, 생물학적 샘플에서 에를리히아의 종을 확인하기 위한 펩타이드의 제1, 제2, 및 제3 집단의 사용 설명서.
키트의 특정 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제1 집단은 E. 카니스 , E. 샤프 핀시스, 및 E. 에윈기이를 포함하는 에를리히아의 다중 종으로부터 항원에 대하여 항체에 특이적으로 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제1 집단은 적어도 3개의 상이한 펩타이드를 포함하고, 각각은 본원에서 기재된 바와 같이 서열 식별 번호: 1의 서열 또는 그 단편을 포함한다. 키트에서 사용될 수 있는 서열 식별 번호: 1을 갖는 펩타이드 서열의 구체적 예, 예를 들면, 다양한 아미노산을 가질 수 있는 위치에서 특이적 아미노산을 갖는 것은 상기 기재되어 있다. 일부 구체적 예는 서열 식별 번호: 4-51이다. 키트에서 사용될 수 있는 서열 식별 번호: 1의 단편은 또한 상기 기재되어 있다.
키트의 다른 특정 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제2 집단은, E. 카니스 또는 E. 샤프핀시스로부터 항원에 대하여 항체가 아닌 또는 우선적으로 항체가 아닌, E. 에윈기이로부터 항원에 대하여 항체에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제2 집단은 적어도 3개의 상이한 펩타이드를 포함하고, 각각은 본원에서 기재된 바와 같이 서열 식별 번호: 2의 서열 또는 그 단편을 포함한다. 키트에서 사용될 수 있는 서열 식별 번호: 2를 갖는 펩타이드 서열의 구체적 예, 예를 들면, 다양한 아미노산을 가질 수 있는 위치에서 특이적 아미노산을 갖는 것은 상기 기재되어 있다. 일부 구체적 예는 서열 식별 번호: 52-66이다. 키트에서 사용될 수 있는 서열 식별 번호: 2의 단편은 또한 상기 기재되어 있다.
키트의 또 다른 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제3 집단은 E. 에윈기이로부터 항원에 대하여 항체가 아닌 또는 우선적으로 항체가 아닌, E. 카니스 및 E. 샤프핀시스로부터 항원에 대하여 항체에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 단리된 펩타이드의 제3 집단은 적어도 2 또는 3개의 상이한 펩타이드를 포함하고, 각각은 본원에서 기재된 바와 같이 서열 식별 번호: 3의 서열 또는 그 단편을 포함한다. 키트에서 사용될 수 있는 서열 식별 번호: 3을 갖는 펩타이드 서열의 구체적 예, 예를 들면, 다양한 아미노산을 가질 수 있는 위치에서 특이적 아미노산을 갖는 것은 상기 기재되어 있다. 일부 구체적 예는 서열 식별 번호: 67-120이다. 키트에서 사용될 수 있는 서열 식별 번호: 3의 단편은 또한 상기 기재되어 있다.
키트의 특정 구현예에서, 펩타이드 집단은 고형 지지체에 부착 또는 고정된다. 일부 구현예에서, 펩타이드 집단은 금속성 나노층 (예를 들면, 카드뮴, 아연, 수은, 금, 은, 구리, 또는 백금 나노층)을 통해 고형 지지체에 부착 또는 고정된다. 특정 구현예에서, 고형 지지체는 비드 (예를 들면, 콜로이드성 입자 또는 금속성 나노입자 또는 나노쉘), 측면 유동 면역검정 디바이스내 유로, 분석 또는 원심 회전자내 유로, 튜브 또는 웰 (예를 들면, 플레이트내), 또는 센서 (예를 들면, 전기화학적, 광학, 또는 광-전자 센서)이다.
검정의 특정한 유형을 위한 시약은 본 발명의 키트에서 또한 제공될 수 있다. 따라서, 키트는 (예를 들면, 응집 검정 또는 측면 유동 검정에 적합한) 비드의 집단, 또는 플레이트 (예를 들면, ELISA 검정에 적합한 플레이트)를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 키트는 디바이스, 예컨대 측면 유동 면역검정 디바이스, 분석 또는 원심 회전자, 웨스턴 블랏, 닷 블랏, 슬롯 블랏, 또는 전기화학적, 광학, 또는 광-전자 센서를 포함한다. 비드의 집단, 플레이트, 및 디바이스는 면역검정 수행에 유용하다. 예를 들어, 이들은 본 발명의 펩타이드 및 샘플로부터의 항체를 포함하는 항체-펩타이드 복합체의 형성 검출에 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 펩타이드, 상이한 펩타이드의 혼합물 (즉 펩타이드의 집단), 또는 본 발명의 펩타이드 조성물은 비드, 플레이트, 또는 디바이스에 부착 또는 고정된다.
또한, 키트는 다양한 희석제 및 버퍼, 특이적으로 결합된 항원 또는 항체 (예를 들면 표지 시약)의 검출을 위한 표지된 콘주게이트 또는 다른 제제, 및 다른 신호-발생 시약, 예컨대 효소 기질, 보조인자 및 색원체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 표지 시약으로서 검출가능한 표지 (예를 들면, 금속성 나노입자, 금속성 나노쉘, 금속성 나노층, 형광단, 양자점, 착색된 라텍스 입자, 또는 효소)에 접합된 항-인간, 항-개과, 또는 항-고양이과 IgG/IgM 항체를 포함한다. 다른 구현예에서, 키트는 표지 시약으로서 검출가능한 표지 (예를 들면, 금속성 나노입자, 금속성 나노쉘, 금속성 나노층, 형광단, 착색된 라텍스 입자, 또는 효소)에 접합된 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G 융합 단백질, 단백질 L, 또는 이들의 조합을 포함한다. 예시적인 단백질 A/G 융합 단백질은 단백질 A로부터 4개의 Fc-결합 도메인을 단백질 G로부터 2개와 조합한다. 참고, 예를 들면, Sikkema, J.W.D., Amer. Biotech. Lab, 7:42, 1989 및 Eliasson 등, J. Biol. Chem. 263, 4323-4327, 1988 (이들 모두는 이로써 그 전체가 참고로 편입된다).
키트의 다른 성분은 당해분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 상기 성분은 코팅 시약, 본원에서 기재된 바와 같이 펩타이드의 집단에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 포착 항체, 표준으로서 이들 항원의 정제된 또는 세미-정제된 추출물, 모노클로날 항체 검출기 항체, 검출가능한 표지에 접합된 항-마우스, 항-개, 항-고양이, 항-닭, 또는 항-인간 항체, 비색 비교용 지표 차트, 제염 설명서, 도포기 스틱 또는 용기, 샘플 준비 컵 등을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 키트는 펩타이드-항체 복합체의 형성을 허용하는 반응 매질 구성에 적절한 버퍼 또는 다른 시약을 포함한다.
특정 구현예에서, 키트는 에를리히아 항원에 대한 항체를 검출하기 위해 및/또는 존재하면 대상체를 감염시키는 에를리히아의 종을 확인하기 위해 본원에서 기재된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제1, 제2, 및/또는 제3 집단의 사용 방법을 나타내는 설명서를 포함한다. 특정 구현예에서, 키트는 하나 또는 그 초과 에를리히아 항원에 대한 항체를 검출하기 위해 및/또는 에를리히아의 종을 확인하기 위해 (예를 들면, 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드의 집단을 포함하는) 비드의 집단, 플레이트, 또는 디바이스의 사용 방법을 나타내는 설명서를 포함한다. 특정 구현예에서, 설명서는, 본원에서 기재된 방법에 따라, 존재하면, 대상체를 감염시키는 에를리 히아의 종을 확인하기 위한 지시사항을 포함한다. 특정 구현예에서, 설명서는 생물학적 샘플을 펩타이드의 제1, 제2, 및 제3 집단과 별도로 접촉하는 지시사항을 포함한다. 특정 구현예에서, 설명서는 생물학적 샘플을 펩타이드의 제1, 제2, 및 제3 집단과 순차적으로 접촉하는 지시사항을 포함한다.
상기 키트는 병원성 에를리히아에 의한 감염 진단 및/또는 대상체를 감염시키는 에를리히아의 종 확인을 위해 임상 실험실용의 편리한, 효율적인 방식을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 존재하면 대상체를 감염시키는 에를리히아의 종을 확인하는데 유용한 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 본원에서 기재된 바와 같이 단리된 펩타이드의 적어도 1개 집단을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 펩타이드의 제1, 제2, 및 제3 집단 각각을 포함하는 조성물의 조합을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 존재하면 대상체를 감염시키는 에를리히아의 종을 확인하는데 유용한 디바이스를 제공한다. 일부 구현예에서, 디바이스는 상기에서 정의된 바와 같이 단리된 펩타이드의 적어도 1개 집단을 포함한다. 특정 구현예에서, 디바이스는 펩타이드의 제1, 제2, 및 제3 집단을 포함한다.
특정 구현예에서, 디바이스는 면역검정을 수행하는데 유용하다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 디바이스는 측면 유동 면역검정 디바이스이다. 일부 구현예에서, 디바이스는 펩타이드 또는 펩타이드의 집단이 부착되는 복수의 비드로 구성된 슬라이드이다. 다른 구현예에서, 디바이스는 분석 또는 원심 회전자이다. 다른 구현예에서, 디바이스는 닷 블랏, 슬롯 블랏, 또는 웨스턴 블랏이다. 다른 구현예에서, 디바이스는, 예를 들면, ELISA 검정에 적합한 플레이트에서 튜브 또는 웰이다. 또다른 구현예에서, 디바이스는 전기화학적 센서, 광학적 센서, 광-전자 센서, X-선 필름, 화학발광 이미저 또는 광자 검출 장비이다.
본 발명의 방법, 키트, 조성물, 및 디바이스는 수많은 이점을 제공한다. 예를 들어, 이들은 에를리히아에 대한 항체의 단순, 저가, 신속, 민감 및 정확 검출 그리고 존재하면 대상체를 감염시키는 에를리히아의 종 확인을 허용한다. 이들은 또한 유사한 증상을 갖는 다른 증상과 혈청 교차-반응성을 피한다. 이것은 박테리아 및 종의 정확한 진단을 허용하고, 그렇게 함으로써 에를리히아의 특정한 종에 필요할 수 있는 적시 및 적합 치료를 촉진시킨다.
하기 실시예는 본 발명의 다양한 측면을 예시한다. 실시예는 물론 본 발명의 특정 구현예만의 단지 예증적으로 이해되어야 하고 그리고 본 발명의 범위에 제한이 되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1 - 에를리키아( Ehrlichia )를 사용한 개의 실험적 감염 및 ELISA를 사용한 종 특이적인 항-에를리키아 항체의 검출
본 실시예는, 특수한 에를리키아 종에 대해 특이적인 항체를 생성하고 본원에 기술된 바와 같은 펩타이드의 집단에 대해 반응성임을 밝혔음을 입증한다.
다수의 개를 병리학적 변화 및 항체 생산의 과정을 연구할 목적으로 이. 카니스(E. canis), 이. 샤펜시스(E. chaffeensis) 또는 이. 에윙기이(E. ewingii)각각의 에를리키아 종에 대해 4마리의 개)로 실험적으로 감염시켰다. 동물을 이. 카니스 및 이. 샤펜시스 각각의 배양물, 및 이. 에윙기이의 혈액 안정집단(blood stabilate)(이. 에윙기이는 성공적으로 배양되지 않았으므로 IFA를 수행하기 위한 슬라이드는 당해 종의 경우 현재 이용가능하지 않다)을 사용하여 감염시켰다. 혈장 샘플을 다양한 시점에서 감염된 개로부터 채취하여 "개 혈장 샘플"을 생성시켰다. 감염된 동물 모두는 본 연구가 허용된 시점에서, PCR에 의해 세균 DNA의 존재를 나타내었으며, 이. 샤펜시스-감염된 개 중의 1마리 만이 및 이. 카니스-감염된 개 중의 2마리가 SNAP 4DX PlusTM(IDEXX Laboratories, Inc.에 의해 제조되었으며, 이는 이. 카니스, 이. 에윙기이 및 이. 샤펜시스에 대한 항체를 검출한다)과의 반응성에 의해 측정된 것으로서 항-세균 항체의 존재를 나타내었다. SNAP 4Dx PlusTM 상에서 양성으로 발견된 감염 연구로부터의 개 혈장 샘플 모두는 또한 하기 기술된 바와 같은 펩타이드의 제1 집단(ECHEW1)을 사용하여, 하기 기술된 방법에 따라 수행된 ELISA 검정에서 또한 양성이었다.
펩타이드의 3개의 상이한 집단을 표준 합성 과정을 사용하여 합성하였다. 펩타이드의 제1 집단(ECHEW1)에서 각각의 펩타이드는 서열 번호 1의 서열을 함유하였으며, 이는 다음의 에를리키아 항원: msp4, 카니스/샤펜시스로부터의 p30 또는 p30-1 및 에윙기이로부터의 28kD에 대해 유발된 항체에 결합하는 2개의 상이한 서열을 포함하는 키메라 펩타이드를 포함한다. 펩타이드의 ECHEW1 집단은 다수의 에를리키아 아종(Ehrlichia spp.)(이. 카니스, 이. 샤펜시스 및 이. 에윙기이)에 의해 유발된 항체에 특이적으로 결합한다. 펩타이드의 제2의 집단(EE13)에서 각각의 펩타이드는 서열 번호 2의 서열을 함유하였다. 펩타이드의 EE13 집단은 이. 에윙기이에 의해 주로 유발된 항체에 특이적으로 결합하며 이. 카니스 및 이. 샤펜시스에 대해서는 어느정도 낮은 교차-반응성을 갖는다. 펩타이드의 제3의 집단(EE12EW1)의 각각의 펩타이드는 서열번호 3의 서열을 함유하였다. 펩타이드의 EE12EW1 집단은 이. 카니스 및 이. 샤펜시스에 의해 주로 유발된 항체에 특이적으로 결합하며 이. 에윙기이에 대해서는 어느 정도 낮은 교차-반응성을 갖는다.
ELISA 방법
1. 항체의 피복
1.1. 96-웰 플레이트(Thermo Scientific NuncTM MaxiSorp" 미세플레이트)내 바람직한 수의 웰을 1 내지 20μg/mL의 아박시스 에를리키아(Abaxis Ehrlichia) 항원 집단 ECHEW1, EE12EW1, 또는 EE13으로 피복하였으며, 이들 집단 각각은 BSA에 접합되어 0.1M 탄산나트륨/중탄산나트륨 완충액(pH 9 내지 9.4) 속에 희석시켰다. 피복은 0.1mL의 항원을 각각의 웰에 첨가하고 당해 플레이트를 미세 플레이트 진탕기 상에서 250 내지 300 rpm으로 실온에서 대략 1 시간 동안 항온처리함으로써 수행하였다.
1.2. 피복 용액을 제거한 후, 플레이트를 종이 타월 위에서 토닥여서 어떠한 매달린 소적(droplet)도 제거하였다. 0.3 mL의 탈이온수를 각각의 웰에 가하고, 플레이트를 250 내지 300 rpm에서 5분 동안 진탕시켰다. 액체를 상기와 같이 제거하였다.
1.3. 1.2에서와 같은 세척 단계를 2회 반복하였다.
2. 플레이트의 차단
2.1. 피복된 플레이트를 100mL의 탈이온수 속에서 30g의 탈지유로 이루어진 차단 용액으로 처리하여 차단시켰다. 각각의 웰을 0.3 ml의 차단 용액으로 충전시키고 플레이트를 진탕기 상에 250 내지 300 rpm에서 대략 1시간 동안 두었다.
2.2. 차단 용액을 제거하고 플레이트를 종이 타월에서 토닥여서 매달린 소적을 제거하였다.
3. 샘플/교정기 항온처리
3.1 항-에를리키아 항체 교정기는 공지된 종에 대해 고 역가 혈장 샘플의 혼주물(pool)을 제조함으로써 개 혈장으로부터 생성시켰다. 종은 SNAP 4DX PlusTM 및 SNAP 3DXTM(IDEXX에 의해 제조됨, 이는 이. 카니스 및 이. 샤펜시스에 대한 항체를 검출하나, 이. 에윙기이에 대해서는 검출하지 않는다) 차등 시험 및 IFA로 측정하였다. 이후에, 혼주물을 임의의 점수로 지정하고 음성의 개 혈장 희석물 속에서 다양한 수준으로 희석시켰다. 점수는 희석에 따라 선형으로 계층화하였는데: 예를 들면, 점수가 40인 샘플을 2배로 희석한 경우 생성되는 점수는 20일 수 있다. 에를리키아 교정기의 세트를 에를리키아 ELISA에 대해 각각의 플레이트 상에서 수행하였다. 하나의 세트는 이. 카니스, 이. 샤펜시스 및 이. 에윙기이에 대해 양성인 혈장 샘플로 구성되었으며 ECHEW1-피복된 플레이트와 함께 사용되었다. 하나의 세트는 카니스 및 샤펜시스 각각에 대해 IFA에서 근접한 역가(close titer)를 나타내고 ECHEW1-피복된 플레이트 및 EE12EW1-피복된 플레이트와 함께 사용된 샘플을 사용하는, 항-이. 카니스/이. 샤펜시스-양성 샘플로 구성되었다. 다른 세트는 항-이. 에윙기이-양성 샘플로 구성되었으며 EE13-피복된 플레이트와 함께 사용되었다. 각각의 개 혈장 샘플 또는 교정기를 차단 용액 속에서 250배 희석시켰다. 각각의 희석된 교정기 및 개 혈장 샘플의 0.1mL의 분취량을 웰에 가하고 플레이트를 진탕기 속에 250 내지 300 rpm에서 1시간 동안 두었다. 교정기 및 개 혈장 샘플 둘 다를 2회 수행하고 보고된 결과는 2개의 판독물의 평균이다.
3.2. 샘플 용액을 제거하고 플레이트를 50mM 트리즈마 염기(Sigma-Aldrich T1503) 및 0.05% CHAPS 세제(pH 8.0)(Sigma-Aldrich C3023)를 함유하는 세척 완충액 속에서 세척하였다. 세척 단계는 0.3mL의 세척 완충액을 첨가하고 플레이트를 250 내지 300 rpm에서 5분 동안 진탕시켜 수행하였다. 세척 용액은 플레이트를 뒤집은 후 종이 타월 위에서 토닥여서 어떠한 매달린 소적도 제거함으로써 제거하였다.
3.3 상기 세척 단계를 2회 반복하였다.
4. 접합체 항온처리
4.1. 단백질 A-HRP 접합체(Bio-Rad 170-6522)를 차단 용액(상기 2.1에서 기술됨) 속에서 8000배로 희석시키고 0.1 mL의 희석된 접합체를 각각의 웰에 가하였다. 이후에, 플레이트를 250 내지 300 rpm에서 실온에서 대략 1시간 동안 진탕시켜 항온처리하였다.
4.2. 접합체를 제거하고 플레이트를 종이 타월 위에서 토닥여서 매달린 소적을 제거하였다. 플레이트를 3.2 및 3.3에서 상기 기술된 바와 같이 3회 세척하였다. 최종적으로, 플레이트를 웰당 0.3 mL의 증류수로 세척하였다.
4.3. 결합된 접합체를 0.1 mL의 기질 TMB 용액(Millipore ES022)을 첨가하여 검정하였다. 기질은 OD 650 nm 판독을 플레이트 판독기(Spectramax 340 PC.) 상에서 수행하기 전에 실온에서 10분 동안 반응하도록 하였다.
감염된 개로부터의 혈장 샘플을 수개의 시점에서 수거하여 ECHEW1, EE13, 및 EE12EW1 각각을 사용하여 상기 기술된 바와 같이 에를리키아 ELISA로 검정하였다. 결과는 도 2에 나타낸다. 이들 결과는, ECHEW1 및 EE12EW1과 이. 카니스 및 이. 샤펜시스에 대한 반응시 생산된 항체의 반응성을 나타낸다. 이. 카니스에 대한 반응시 생산된 항체는 이. 에윙기이-특이적인 펩타이드 집단 EE13과는 반응하지 않았다. 이. 샤펜시스-감염된 개로부터의 감염 42일 후 샘플에서 EE13과의 매우 약간의 교차-반응성이 주목되었다.
실시예 2 - 펩타이드 집단을 사용하여 추가의 공지된 항- 에를리키아 -양성 또는 음성 샘플로부터 종-특이적인 항체의 존재의 검출
본 실시예는 항-에를리키아 항체의 존재 및, 존재하는 경우, ELISA에서 펩타이드의 ECHEW1, EE13 및 EE12EW1 집단을 사용하여 항-에를리키아-양성 또는 음성인 것으로 참고 방법에 의해 확인된 추가의 샘플로부터의 종-특이적인 항체의 존재의 검출을 나타낸다. ELISA 결과는 참조 방법 결과와 일치한다는 것을 보여준다.
3개의 집단, ECHEW1, EE13 및 EE12EW1에서 각각의 펩타이드를 티오-에테르 화학을 사용하여 담체 단백질 소 혈청 알부민(BSA)에 별도로 연결시켰다. 수득되는 BSA-펩타이드 접합체를 96-웰 ELISA 플레이트에서 포획 실체로서 사용하여 3개의 별개의 ELISA 검정(플레이트당 펩타이드의 1개 집단)를 생성하였다. 이후에, 플레이트를 차단시켜 바람직하지 않은 비-특이적인 결합을 방지하였다.
총 224개의 항-에를리키아-양성 샘플(IFA 및 SNAP 4DX PlusTM/SNAP 3DxTM에 의해 측정된 것으로서 이. 카니스, 이. 샤펜시스, 또는 이. 에윙기이에 대해 양성인 개 혈장) 및 264개의 항-에를리키아-음성 샘플(동일한 참고 방법에 의해 측정된 것으로서 이. 카니스, 이. 샤펜시스 및 이. 에윙기이에 대해 음성인 244마리의 개 혈장 샘플 및 20마리의 개 전혈 샘플)을 3개의 ELISA 플레이트 각각에서 고정화된 펩타이드 집단과 함께 항온처리하였다. 1시간 항온처리한 후, 반응하지 않은 물질은 마이크로 웰을 세척하여 제거하였다. 특이적으로 포획된 개 IgG 또는 IgM은 HRP-표지된 단백질 A와의 반응으로 검출하였다. HRP는 시판되는 TMB 기질을 사용하여 검정하였다. 각각의 웰의 광학 밀도를 플레이트 판독기를 사용하여 650 nm에서 판독하였다. IFA 및 SNAP 시험으로부터 "샘플 상태"로 분리한 결과의 요약은 하기 표 1에 나타낸다.
표 1 - 공지된 에를리키아-양성 또는 음성 샘플의 ELISA 결과
Figure pct00001

1 샘플 상태는 IFA 및 SNAP 시험의 결과로부터 측정하였다.
2 ECHEW1에 대한 ELISA 결과는, 이것이 3 이상의 점수를 갖는 경우 "양성"으로 또는 이것이 3 미만의 점수를 갖는 경우 "음성"으로 분류하였다.
224개의 항-에를리키아-양성 샘플(IFA 및 SNAP 시험으로 측정함) 중에서, 209개가 펩타이드 집단 ECHEW1을 사용하는 본 발명자들의 ELISA 검정에 의해 양성으로 확인되었다. 따라서, ELISA ECHEW1의 민감성 퍼센트는 93.3%이었다. 264개의 항-에를리키아-음성 샘플 중에서, 259개는 본 발명자들의 ELISA 검정에 의해 음성으로 확인되었다. 따라서, ELISA ECHEW1의 특이성 퍼센트는 98.1%이었다. 또한, IFA 및 SNAP 시험에 의해 항-이. 카니스-특이적인 또는 항-이. 샤펜시스-특이적인 것으로 확인된 108개의 샘플 중에서, 99개("EE12EW1>EE13과 함께 "ECHEW1-양성")는 본 발명자들의 ELISA 검출 과정에 의해 정확하게 확인되었다. IFA 및 SNAP 시험에 의해 항-이. 에윙기이-특이적인 것으로 확인된 92개의 샘플 중에서, 80개("EE13>EE12EW1과 함께 ECHEW1-양성")를 본 발명자들의 ELISA 검출 공정으로 확인하였다. 따라서, 본 발명자들의 ELISA 방법은 참고 방법과 매우 일치한다.
또한, 이의 종 정보가 IFA 또는 SNAP 검정에 의해 측정될 수 없었던 25개의 항-에를리키아-양성 샘플 중에서, 본 발명자의 ELISA는 이들을 상당히 높은 신뢰성으로, 이. 카니스/이. 샤펜시스 특이적이거나(EE12EW1 점수가 EE13 점수보다 더 큰 경우) 또는 이. 에윙기이 특이적(EE13 점수가 EE12EW1 점수보다 더 큰 경우)인 것으로 확인하였다.
일부 구현에에서, 측면 유동 면역검정을 위에서 기술한 방법에서 ELISA 검정 대신에 사용할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같은 펩타이드의 집단을 사용하는 다른 검정 양식을 본 발명의 방법에서 사용하여 에를리키아 종을 확인할 수 있다.
실시예 3 - 표준 곡선의 생성 및 3개의 공지되지 않은 샘플의 확인
본 실시예는, 분리된 펩타이드, ECHEW1, EE13 및 EE12EW1의 3개의 집단에 대한 표준 곡선이 생성될 수 있었던 방법, 및 또한 3개의 공지되지 않은 샘플이 본 발명의 방법에 따라 분류되었던 방법을 상세히 입증한다.
ELISA 검정을 실시예 1에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 특히, 실시예 1에 기술된 바와 같은 공지된 개 혈장 샘플로부터 생성된 5개의 에를리키아 교정기의 세트를 에를리키아 ELISA에 대한 각각의 플레이트에서 수행하였다. 하나의 세트는 이. 카니스/이. 샤펜시스 양성 샘플로 구성되었으며 ECHEW1-피복된 플레이트 및 EE12EW1-피복된 플레이트와 함께 사용하였다. 다른 세트는 이. 에윙기이 양성 샘플로 구성되었으며 EE13-피복된 플레이트와 함께 사용하였다.
3개의 공지되지 않은 개 혈장 샘플 각각을 차단 용액 속에서 250, 500 및 1000배 희석하였다. 희석된 교정기 및 공지되지 않은 샘플의 각각의 0.1mL의 분취량을 웰에 가하고 플레이트를 진탕기 상에 250 내지 300 rpm에서 1시간 동안 두었다.
교정기 및 공지되지 않은 샘플 둘 다를 2회 수행하였으며 기록된 결과는 2개의 판독물의 평균이다.
데이타 분석
각각의 펩타이드 집단에 대한 표준 곡선을 x-축 상에서 점수(모든 종에 대해 ECHEW1 점수, 카니스 및/또는 샤펜시스에 대해 EE12EW1 점수, 및 에윙기이에 대해 EE13 점수)를 지닌 각각의 ELISA 교정기 및 y 축 상에서 광학 밀도(OD)를 사용하여 제조하였다. 공지되지 않은 샘플의 에를리키아 점수를 당해 표준 곡선으로부터 보간하였다. 공지되지 않은 샘플에 대한 ECHEW1 점수, EE12EW1 점수, 또는 EE13 점수를 교정 곡선 내에 속하는 희석으로부터의 OD를 사용하여 측정하였다.
결과
교정기의 ELISA 결과(OD 650 nm 판독물)는 표 2에 나타낸다:
표 2 - 표준 곡선(지정된 점수 및 교정기의 OD 판독치 )
Figure pct00002

표준 곡선을 다음과 같이 계산하였다:
ECHEW1: OD = 0.0088(ECHEW1 점수)+ 0.0027
EE12EW1: OD = 0.0055(EE12EW1 점수)+ 0.005
EE13: OD = 0.0069(EE13 점수)+ 0.0029
공지되지 않은 샘플의 ELISA 결과를 표 3에 나타낸다:
표 3 - 공지되지 않은 샘플의 ELISA OD 판독치
Figure pct00003

공지되지 않은 샘플의 점수는 다음 식으로 계산하였다:
(점수)= (OD - B)/A
여기서 B는 표준 곡선의 절편이고 A는 기울기이다.
각각의 점수에 대해 사용된 OD 및 상수는 문제의 펩타이드 집단으로부터 온다.
각각의 공지되지 않은 샘플에 대해 계산된 점수는 다음과 같다:
1.) 공지되지 않은 1
(ECHEW1 점수)= (0.42-0.0027)/0.0088 = 47
(EE12EW1 점수)= (0.03-0.005)/0.0055 = 5
(EE13 점수)= (0 .34-0.0029)/0.0069 = 49
ECHEW1 점수를 사용하여 샘플이 이. 카니스, 이. 샤펜시스, 및 이. 에윙기이로부터의 어떠한 종에 의한 감염에 대해 양성 또는 음성인지를 측정하였다. 이후에, EE13 점수를 EE12EW1 점수와 비교하여 감염의 종을 측정하였다. 이 경우에, 공지되지 않은 1의 경우, ECHEW1 점수는 양성이고, EE13 점수 >> EE12EW1 점수이므로, 상기 샘플은 이. 에윙기이에 대해 양성이다.
2.) 공지되지 않은 2
(ECHEW1 점수)= (0.48-0.0027)/0.0088 = 54
(EE12EW1 점수)= (0.31-0.005)/0.0055 = 55
(EE13 점수)= (0.01-0.0029)/0.0069 = 1
EE12EW1 점수 >> EE13 점수이므로, 샘플은 이. 카니스/이. 샤펜시스.에 대해양성이다.
3.) 공지되지 않은 3
(ECHEW1 점수)= (0.003-0.0027)/0.0088 = 0
(EE12EW1 점수)= (0.012-0.005)/0.0055 = 1
(EE13 점수) = (0.002-0.0029)/0.0069 = 0
3개의 점수 모두는 매우 낮으므로 샘플은 3개의 에를리키아 종 모두에 대해 음성이다.
컷오프(cutoff)
ELISA 시험 방법에 대한 컷오프를 294개 샘플, 128개의 음성 및 166개의 양성의 분석을 기본으로 하여 계산하였다. 이들 샘플을 SNAP 4Dx Plus 및 이. 카니스 및 이. 샤펜시스 IFA 역가를 사용하여 분류하였다. 당해 연구에 사용된 샘플은, 상기 방법 두 다 일치하는, 즉, SNAP 및 IFA가 양성이거나 둘 다 음성인 어느 것이었다. 이 경우, 어느 IFA 역가가 더 높은지에 상관없이 사용된 값이었다. 이들 294개의 샘플 각각을, 실시예 1에 기술된 과정에 따라 ELISA 검정을 사용하여 시험하고, 항체 수준 점수를 각각의 샘플에 대해 각각의 검정 결과에 대해 지정하였다. 당해 ELISA 검정을 수행한 샘플에 대한 양성 및 음성 상태를 ECHEW1 점수 만을 기준으로 측정하였으므로 본원의 모든 계산은 이들 샘플에 대한 ECHEW1 점수에 관한 것이었다.
컷오프를 음성 평균을 초과하는 3개의 표준 편차에서 설정하였다. 당해 샘플 설정의 경우 즉:
음성 샘플의 평균은 0.37이고
음성 샘플의 표준 편차는 0.82이며
평균 + 3x{StDev} 2.84이다.
당해 실시예에서 모든 점수를 가장 근접한 정수로 모았으므로 ECHEW1 점수가 >=3인 어떠한 샘플도 양성인 것으로 고려하였다. 3의 ELISA 점수에서, 특이성은 99.2%이고 민감성은 95.8%인 것으로 예측될 수 있다.
참고로 포함된 서류에서의 특정한 정의가 본원에 제공된 정의와 불일치하는 경우에, 본원에 제공된 정의가 우선시된다. 본 발명이 현재의 바람직한 구현예를 참고로 기술되었다고 해도, 당해 분야의 숙련가에게 명백한 것으로서, 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 취지로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 다음의 청구범위에만 한정된다.
본원에 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허원, 및 공보의 청구범위, 도 및/또는 도면을 포함하는 개시내용은, 이의 전문이 참고로 본원에 포함된다.
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Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 99 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 99 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Thr Ala Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 100 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 100 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ile Thr Asn Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 101 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 101 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ile Thr Lys Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 102 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 102 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ile Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 103 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 103 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 104 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 104 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Pro Asn Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 105 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 105 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Pro Lys Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 106 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 106 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Thr Asn Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 107 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 107 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Thr Lys Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 108 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 108 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asn Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 109 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 109 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asn Thr Arg Lys Thr Phe Gly Ala 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 110 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 110 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asn Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Asp Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 111 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 111 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Ala 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 112 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 112 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Ala 35 40 45 Asp Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 113 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 113 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Arg Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 114 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 114 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Gln Thr Phe Gly Val 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 115 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 115 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Gln Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 116 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 116 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Asn Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 117 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 117 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Arg Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 118 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 118 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Glu Ile Glu Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 119 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 119 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Asp Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70 <210> 120 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ehrlichia antigenic peptide <400> 120 Ser Ala Lys Glu Glu Lys Gln Thr Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Gln Asp Trp Asp Gly Ser Ala Ala Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Ala Asp Thr Arg Lys Thr Phe Gly Val 35 40 45 Glu Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Lys Ile Ser Glu Asn Gln Val Gln Asn 50 55 60 Lys Phe Thr Ile Ser Asn Cys 65 70

Claims (31)

  1. 존재하면, 대상체를 감염시키는 에를리히아의 종 확인 방법으로서, 하기를 포함하는, 방법:
    각각 하기를 포함하는, 적어도 3개의 상이한 펩타이드를 포함하는 단리된 펩타이드의 제1 집단과 대상체로부터의 샘플을 접촉시킴: S-X2-K-E-X5-K-Q-X8-T-X10-X11-X12-X13-G-L-K-Q-X18-W-X20-G-X22-X23-X24-X25-X26-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-X39-A-E-T-R-X44-T-F-G-L-X49-K-Q-Y-D-G-A-X56-I-X58-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 1)의 서열 또는 그 단편 (여기에서 X2는 A 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X5는 E 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X8은 T 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X10은 T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X11은 G 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X12는 L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X13은 Y 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X18은 D 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X20은 D 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X22는 S 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X23은 A, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X24는 A 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X25는 T 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X26은 S, N, 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X39는 임의의 아미노산이고, X44는 임의의 아미노산이고, X49는 임의의 아미노산이고, X56은 임의의 아미노산이고, 그리고 X58는 임의의 아미노산이다);
    제1 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제1 세트의 형성을 검출함;
    각각 하기를 포함하는, 적어도 3개의 상이한 펩타이드를 포함하는 단리된 펩타이드의 제2 집단과 상기 샘플을 접촉시킴: F-S-A-K-E-E-X7-A-E-T-R-X12-T-F-G-L-X17-K-Q-Y-D-G-A-X24-I-X26-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 2)의 서열 또는 그 단편 (여기에서 X7은 임의의 아미노산이고, X12는 임의의 아미노산이고, X17은 임의의 아미노산이고, X24는 임의의 아미노산이고, 그리고 X26은 임의의 아미노산이다); 및
    제2 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제2 세트의 형성을 검출함 (여기서 복합체의 제1 및 제2 세트 모두의 형성은 대상체가 에를리히아 에윈기이 (E. 에윈기이 )로 감염됨을 나타내고, 여기서 복합체의 제2 세트 없는 제 1 세트의 형성은 대상체가 에를리히아 카니스 (E. 카니스) 및/또는 에 를리히아 샤프핀시스 (E. 샤프핀시스)로 감염됨을 나타낸다).
  2. 존재하면, 대상체를 감염시키는 에를리히아의 종 확인 방법으로서, 하기를 포함하는, 방법:
    대상체로부터의 샘플을 제 1 항에 정의된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제1 집단과 접촉시킴;
    제1 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제1 세트의 형성을 검출함;
    각각 하기를 포함하는, 적어도 3개의 상이한 펩타이드를 포함하는 단리된 펩타이드의 제3 집단과 상기 샘플을 접촉시킴: S-X2-K-E-X5-K-Q-X8-T-X10-X11-X12-X13-G-L-K-Q-X18-W-X20-G-X22-X23-X24-X25-X26-G-G-G-G-G-N-F-S-A-K-E-E-X39-A-X41-T-R-X44-T-F-G-X48-X49-K-Q-Y-D-G-A-X56-I-X58-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N-C (서열 식별 번호: 3)의 서열 또는 그 단편 (여기에서 X2는 A 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X5는 E 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X8은 T 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X10은 T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X11은 G 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X12는 L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X13은 Y 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X18은 D 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X20은 D 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X22는 S 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X23은 A, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X24는 A 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X25는 T 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X26은 S, N, 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X39는 임의의 아미노산이고, X41은 D 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X44는 임의의 아미노산이고, X48는 V 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X49는 임의의 아미노산이고, X56은 임의의 아미노산이고, 그리고 X58은 임의의 아미노산이다); 및
    제3 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제3 세트의 형성을 검출함 (여기서 항체-펩타이드 복합체의 제1 및 제3 세트 모두의 형성은 대상체가 E. 카니스 및/또는 E. 샤프핀시스로 감염됨을 나타내고, 여기서 항체-펩타이드 복합체의 제3 세트 없는 제1 세트의 형성은 대상체가 E. 에윈기이로 감염됨을 나타낸다).
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 서열 식별 번호: 1에서 X39가 K인, 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 서열 식별 번호: 1에서 X44가 K 또는 R이고, 서열 식별 번호: 1에서 X49가 E 또는 D인, 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 서열 식별 번호: 1에서 X56은 K 또는 Q이고, 서열 식별 번호: 1에서 X58는 E 또는 T인, 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 서열 식별 번호: 1의 상기 단편이 서열 식별 번호: 1로부터 적어도 20, 25, 30, 35, 또는 40 인접 아미노산을 포함하는, 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 서열 식별 번호: 1의 상기 단편이 서열 식별 번호: 1의 아미노산 33 내지 71을 포함하는, 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 제1 집단에서 각각의 펩타이드가 서열 식별 번호: 1의 서열을 포함하는, 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 서열 식별 번호: 2에서 X7이 K인, 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 서열 식별 번호: 2에서 X12가 K 또는 R이고, 서열 식별 번호: 2에서 X17이 E 또는 D인, 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 서열 식별 번호: 2에서 X24가 K 또는 Q이고, 서열 식별 번호: 2에서 X26이 E 또는 T인, 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 서열 식별 번호: 2의 상기 단편이 서열 식별 번호: 2로부터 적어도 15, 20, 25, 30, 또는 35 인접 아미노산을 포함하는, 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 제2 집단에서 각각의 펩타이드가 서열 식별 번호: 2의 서열을 포함하는, 방법.
  14. 제 2 항에 있어서, 서열 식별 번호: 3에서 X39가 K인, 방법.
  15. 제 2 항에 있어서, 서열 식별 번호: 3에서 X44가 K 또는 R이고, 서열 식별 번호: 3에서 X49가 E 또는 D인, 방법.
  16. 제 2 항에 있어서, 서열 식별 번호: 3에서 X56이 K 또는 Q이고, 서열 식별 번호: 3에서 X58이 E 또는 T인, 방법.
  17. 제 2 항에 있어서, 서열 식별 번호: 3의 상기 단편이 서열 식별 번호: 3으로부터 적어도 20, 25, 30, 35, 또는 40 인접 아미노산을 포함하는, 방법.
  18. 제 2 항에 있어서, 서열 식별 번호: 3의 상기 단편이 서열 식별 번호: 3의 아미노산 33 내지 71을 포함하는, 방법.
  19. 제 2 항에 있어서, 상기 제3 집단에서 각각의 펩타이드가 서열 식별 번호: 3의 서열을 포함하는, 방법.
  20. 존재하면, 대상체를 감염시키는 에를리히아의 종 확인 방법으로서, 하기를 포함하는, 방법:
    대상체로부터의 샘플을 제 1 항에 정의된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제1 집단과 접촉시킴;
    제1 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제1 세트의 형성을 검출함;
    상기 샘플을 제 1 항에 정의된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제2 집단과 접촉시킴; 및
    제2 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제2 세트의 형성을 검출함;
    상기 샘플을 제 2 항에 정의된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제3 집단과 접촉시킴; 및
    제3 집단에서 하나 또는 그 초과 펩타이드 및 항체를 포함하는 복합체의 제3 세트의 형성을 검출함 (여기서 제3 세트 없는 복합체의 제1 및 제2 세트 모두의 형성은 대상체가 E. 에윈기이로 감염됨을 나타내고, 여기서 복합체의 제2 세트 없는 복합체의 제 1 및 제3 세트 모두의 형성은 대상체가 E. 카니스 및/또는 E. 샤프핀 시스로 감염됨을 나타낸다).
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 추가로 적어도 하나의 검정으로 분석되어 상기 감염 종이 E. 카니스 또는 E. 샤프핀시스인지를 결정하는, 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 검정이 간접 면역형광 검정 (IFA), 닷 블랏 검정, 측면 유동 검정, ELISA, 또는 웨스턴 블랏인, 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 상기 검출 단계가 하기를 포함하는, 방법: (i) ELISA 검정 수행; (ii) 측면 유동 검정 작동; (iii) 응집 검정 수행; (iv) 웨스턴 블랏, 슬롯 블랏, 또는 닷 블랏 검정 수행; (v) 파장 시프트 검정 수행; (vi) 분석 또는 원심 회전자를 통한 샘플 작동; 또는 (vii) 마이크로어레이 검정 작동.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 인간, 개과, 또는 고양이과 대상체로부터인, 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 혈액, 혈청, 혈장, 뇌 척수액, 조직 추출물, 소변, 또는 타액 샘플인, 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 샘플이 전혈 샘플인, 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 검출 결과 보고를 포함하는, 방법.
  28. 하기를 포함하는 키트:
    제 1 항에 정의된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제1 집단;
    제 1 항에 정의된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제2 집단;
    제 2 항에 정의된 바와 같이 단리된 펩타이드의 제3 집단; 및
    존재하면, 생물학적 샘플에서 에를리히아의 종을 확인하기 위한 펩타이드의 제1, 제2, 및 제3 집단 사용 설명서.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 설명서가 생물학적 샘플을 펩타이드의 제1, 제2, 및 제3 집단과 순차적으로 접촉시키는 지시사항을 포함하는, 키트.
  30. 제 28 항에 있어서, 추가로 하나 또는 그 초과 표지 시약을 포함하는, 키트.
  31. 제 28 항에 있어서, 펩타이드의 제1, 제2, 및/또는 제3 집단이 고형 지지체에 고정되는, 키트.
KR1020167030795A 2014-04-04 2015-04-03 에를리히아 종 확인용 조성물 및 방법 KR102137378B1 (ko)

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