ES2928463T3 - DIVA (que diferencia animales infectados de vacunados) de Ehrlichia canis - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a antígenos de Echrilichia canis que pueden usarse para diferenciar animales infectados con E. canis de animales que han sido desafiados con E. canis, por ejemplo, vacunados contra E. canis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

DIVA (que diferencia animales infectados de vacunados) de Ehrlichia canis

Antecedentes de la invención

Las Ehrlichia son patógenos intracelulares obligados que infectan los glóbulos blancos circulantes en huéspedes mamíferos. Ehrlichia canis puede infectar a caninos y seres humanos y provocar ehrlichiosis monocítica canina (CME) y ehrlichiosis monocítica humana (HME), respectivamente. La enfermedad canina se caracteriza por fiebre, linfadenopatía, pérdida de peso y pancitopenia. En los seres humanos, la enfermedad se caracteriza por fiebre, dolor de cabeza, mialgia y leucopenia. La detección y el tratamiento tempranos son importantes para tratar tanto la ehrlichiosis canina como la humana.

Resumen de la invención

En la presente descripción se describe un método para determinar si un animal está infectado con E. canis, está vacunado con una vacuna de E. canis, o no está infectado y no está vacunado. El método comprende poner en contacto una muestra biológica del animal con un primer polipéptido de E. canis purificado que no es un elemento de la vacuna de E. canis, poner en contacto la muestra biológica con un segundo polipéptido de E. canis purificado que es un elemento de la vacuna de E. canis; y detectar si los anticuerpos en la muestra se unen específicamente al primer y al segundo polipéptidos de E. canis purificados. Si los anticuerpos en la muestra se unen específicamente tanto al primer como al segundo polipéptidos de E. canis purificados, entonces el animal está infectado con E. canis, y si un anticuerpo en la muestra se une específicamente al segundo polipéptido de E. canis purificado pero no al primer polipéptido de E. canis purificado, entonces el animal se ha vacunado pero no está infectado y en donde, y si un anticuerpo no se une específicamente a cualquiera de los polipéptidos, entonces el animal no está infectado y no está vacunado. El primer polipéptido de E. canis purificado puede comprender las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17 o sus combinaciones.

La invención proporciona un método para determinar la presencia o ausencia de un anticuerpo o fragmento de este, en una muestra de prueba, en donde el anticuerpo o fragmento de este se une específicamente a un polipéptido purificado que comprende la SEQ ID NO: 10. El método comprende poner en contacto la muestra de prueba con un polipéptido purificado que comprende la SEQ ID NO: 10 en condiciones adecuadas para la unión específica del polipéptido purificado al anticuerpo o fragmento de este, y detectar la presencia o ausencia de unión específica. La presencia de unión específica indica la presencia del anticuerpo o fragmento de este. La ausencia de unión específica indica la ausencia del anticuerpo o fragmento de este. El método puede comprender además detectar la cantidad de unión específica. La muestra de prueba puede ser suero, sangre o saliva. El polipéptido purificado puede inmovilizarse en un soporte sólido. El polipéptido purificado puede marcarse. La detección puede realizarse mediante radioinmunoensayo, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas, inmunohistoquímica o ensayo inmunoenzimático.

Aún otra modalidad de la invención proporciona un método para determinar la presencia o ausencia de un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 10 en una muestra de prueba. El método comprende poner en contacto la muestra de prueba con un anticuerpo o fragmento de este que se une específicamente a un polipéptido purificado que consiste en la SEQ ID NO: 10 en condiciones adecuadas para la unión específica del polipéptido al anticuerpo o fragmento de este, y detectar la presencia o ausencia de unión específica. La presencia de unión específica indica la presencia del polipéptido, y la ausencia de unión específica indica la ausencia del polipéptido. El método puede comprender además detectar la cantidad de unión específica. La muestra de prueba puede ser suero, sangre o saliva. El anticuerpo o fragmento de este puede inmovilizarse en un soporte sólido. El anticuerpo o fragmento de este puede marcarse. La detección puede realizarse mediante radioinmunoensayo, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas, ensayo inmunohistoquímico o ensayo inmunoenzimático.

En la presente descripción se describe una composición que comprende uno o más polipéptidos purificados que consisten en la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 o sus combinaciones y un polinucleótido que codifica el uno o más polipéptidos purificados.

El polipéptido purificado puede estar en una forma multimérica. El polipéptido purificado puede unirse a una proteína heteróloga (una secuencia de aminoácidos no asociada normalmente con el polipéptido purificado en la naturaleza), un reactivo indicador, un separador de aminoácidos, un enlazador de aminoácidos, una secuencia señal, una secuencia de parada de transferencia, un dominio transmembrana, un ligando para la purificación de proteínas, o una de sus combinaciones.

En la presente descripción se describe una proteína de fusión que comprende uno o más polipéptidos que consisten en la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:17 o una de sus combinaciones.

Por lo tanto, la invención proporciona métodos para determinar la presencia de anticuerpos contra E. canis y para la detección de la infección por E. canis.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la evaluación del ensayo SNAP® 3Dx® de beagles de laboratorio. El dispositivo SNAP® se usó como se describió por el fabricante. La muestra "Pre" es del día 0. La muestra "Pos" es del día 42. El punto positivo de E. canis se convirtió en positivo en los 4 perros para la muestra del día 42. Se observaron resultados similares para la muestra del día 70.

La Figura 2 muestra un gel de proteínas de E. canis separadas mediante el uso de electroforesis en gel 2D. Tinción con azul Coomassie BIOSAFE™ (Bio-Rad Inc.).

La Figura 3 muestra una inmunoelectrotransferencia de proteínas de E. canis mediante el uso de sueros de perros recolectados el día 0. La dilución del plasma es 1:100. - Estos perros fueron negativos para la reactividad con los antígenos de E. canis.

La Figura 4 muestra una inmunoelectrotransferencia de proteínas de E. canis mediante el uso de sueros de perros de una mezcla de cuatro animales expuestos. La dilución del suero es 1:100.

La Figura 5 muestra una inmunoelectrotransferencia de proteínas de E. canis mediante el uso de plasma de perros de una mezcla de animales infectados. La dilución del suero es 1:1000.

La Figura 6 muestra una inmunoelectrotransferencia de seis antígenos DIVA diferentes de E. canis expresados en E. coli y probados con sueros de perros de una mezcla de cuatro animales infectados (A) o sueros de perros mezclados de cuatro animales expuestos (B). Las diluciones del suero fueron de 1:100 para los animales expuestos o de 1:500 para los animales infectados. Los antígenos DIVA representados incluyen: (1) antígeno de 200 kDa, (2) proteína ribosomal L1, (3a y 3b) dos segmentos diferentes de "ATPasa", (4) antígeno de 120 kDa, (5) proteínas de choque térmico / antígeno p16.

La Figura 7 demuestra que el antígeno p16 clonado se reconoce por sueros de perros infectados con E. canis pero no de aquellos que se expusieron al organismo cultivado. Los lisados de bacterias no inducidos (U) o inducidos (I) transformados con un vector que expresa el antígeno p16 o el fragmento genómico original (+C) se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa para el análisis por inmunoelectrotransferencia. La Figura 8 muestra la secuencia repetida en la SEQ ID NO: 15.

La Figura 9A muestra la SEQ ID NO:16.

La Figura 9B muestra la SEQ ID NO:17.

Descripción detallada de la invención

Se describen antígenos de Ehrlichia canis que pueden usarse para diferenciar a los animales infectados naturalmente con E. canis de los animales que se han expuesto a E. canis, por ejemplo, vacunados contra E. canis. Antes de describir la presente invención en detalle, se definirán varios términos. Como se usa en la presente, las formas singulares "un", "uno/a" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo dicte claramente de cualquier otra manera.

Como se usa en la presente, el término "polipéptido" se refiere a un compuesto de una sola cadena o un complejo de dos o más cadenas de residuos de aminoácidos enlazados mediante enlaces peptídicos. La(s) cadena(s) puede(n) tener cualquier longitud y pueden comprender una proteína de fusión. Aunque "proteína" se usa frecuentemente en referencia a polipéptidos relativamente grandes, y "péptido" se usa frecuentemente en referencia a polipéptidos pequeños, el uso de estos términos en la técnica se solapa y varía. El término "polipéptido" como se usa en la presente se refiere, por tanto, indistintamente a péptidos, polipéptidos, proteínas o proteínas de fusión a menos que se indique de cualquier otra manera. El término "aminoácido" se refiere a una unidad monomérica de un péptido, polipéptido o proteína.

Como se usa en la presente, "antígeno" se refiere a una molécula contra la cual un sujeto puede iniciar una respuesta inmunitaria humoral y/o celular. Los antígenos pueden ser cualquier tipo de molécula biológica que incluye, por ejemplo, metabolitos intermedios simples, azúcares, lípidos y hormonas, así como también macromoléculas tales como carbohidratos complejos, fosfolípidos, ácidos nucleicos y proteínas. En los métodos de la invención, se prefiere que el antígeno sea un polipéptido, por ejemplo, uno que comprende al menos aproximadamente seis o más aminoácidos.

Como se usa en la presente, un "derivado" de un polipéptido antígeno de E. canis, o un antígeno o polipéptido que se "deriva de" un antígeno o polipéptido de E. canis, se refiere a un antígeno o polipéptido en el que la forma nativa se ha purificado, modificado o alterado. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a: sustituciones, modificaciones, adiciones o deleciones de aminoácidos; alteraciones en el patrón de lipidación, glicosilación o fosforilación; reacciones de grupos laterales libres amino, carboxilo, o hidroxilo de los residuos de aminoácidos presentes en el polipéptido con otras moléculas orgánicas y no orgánicas; y otras modificaciones, cualquiera de las cuales puede dar lugar a cambios en la estructura primaria, secundaria o terciaria.

Una "muestra biológica" es cualquier muestra de un animal que se espera que contenga inmunoglobulinas.

Generalmente, estas muestras son sangre completa y componentes de la sangre, pero en algunas circunstancias pueden incluir saliva, orina, lágrimas, otros fluidos corporales, extractos de tejidos o extractos celulares.

Una "infección", tal como en una infección por E. canis, significa que un animal se ha expuesto a E. canis, independientemente de si el animal presenta síntomas clínicos de E. canis. Una infección natural se refiere a una exposición que se produce como resultado de uno de los métodos de transmisión natural para E. canis, tal como la transmisión por garrapatas. Una infección no incluye una exposición a E. canis mediante la vacunación.

Un "polipéptido o antígeno que no es un elemento de una vacuna de E. canis" es cualquier polipéptido o antígeno de E. canis que no está presente en, o no es una porción inmunogénicamente activa de, una vacuna o vacunas de E. canis en particular. Los elementos de la(s) vacuna(s) pueden ser porciones de una vacuna de subunidades que incluye menos que la bacteria completa; estas porciones pueden sintetizarse químicamente o expresarse recombinantemente antes de convertirse en parte de la vacuna, y estas porciones pueden codificarse por uno o más vectores que expresan una composición inmunogénica in vivo.

Un "anticuerpo que es un componente de la respuesta inmunitaria de un animal a una vacuna de E. canis" se refiere a un anticuerpo que se induce como resultado de una vacunación con una vacuna de E. canis. Estos anticuerpos pueden ser idénticos o similares a los anticuerpos inducidos como resultado de una infección por E. canis natural. Estos anticuerpos se mantendrán a un título suficiente y para proporcionar un efecto protector y neutralizante contra las bacterias. Una vacunación exitosa produce un nivel medible del anticuerpo (o anticuerpos) que se induce por un componente de la vacuna de E. canis. Los ejemplos de antígenos de E. canis que inducen anticuerpos que pueden ser un componente de la respuesta inmunitaria de un animal a una vacuna de E. canis son p28-1, p28-2, p28-3, p28-4, p28-5, p28-6, p28-7, p28-8, p28-9 (ver, patentes de Estados Unidos núms. 6660269; 6,458,942; 6,403,780; 6,392,023), proA, ProB, mmpA, citocromo oxidasa (ver, publicación de patente de Estados Unidos núm.

20040170972), p43 (ver, patente de Estados Unidos núm. 6,355,777), que es la porción N-terminal de p153, una glicoproteína (ver, publicación de patente de Estados Unidos 2004/0121433), y p153.

Una respuesta inmunitaria es el desarrollo en un organismo de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos a un antígeno tal como un polipéptido. Usualmente, tal respuesta incluye, pero no se limita a, uno o más de los siguientes: producción de anticuerpos, linfocitos B, linfocitos T auxiliadores, linfocitos T supresores y/o linfocitos T citotóxicos. Una respuesta inmunitaria puede detectarse mediante el uso de cualquiera de varios ensayos conocidos por los expertos en la técnica.

Polipéptidos de la invención

Las muestras biológicas de animales que se han vacunado contra E. canis tienen el potencial de producir un resultado positivo en una prueba para la detección de infección por E. canis debido a la presencia de anticuerpos producidos en respuesta a la vacuna.

En la presente descripción se describe un método para distinguir entre animales que se han infectado con E. canis, animales que no se han infectado con E. canis, y animales que se han vacunado contra E. canis. Los métodos incluyen poner en contacto una muestra biológica del animal con un antígeno derivado de E. canis que no se une específicamente a un anticuerpo que es un componente de la respuesta de anticuerpos del animal a una vacuna de E. canis en particular.

El desarrollo de anticuerpos contra E. canis en un animal contra una vacuna es dependiente de la vacuna en particular usada para vacunar al animal. La diferencia en la respuesta inmunitaria entre los animales que se vacunan contra E. canis y los animales que se infectan natural o experimentalmente con E. canis proporciona un medio para determinar si un animal se ha vacunado o se infectó natural o experimentalmente. Por lo tanto, mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción, los animales que se han infectado con E. canis pueden distinguirse de los animales que no se han infectado con E. canis o que se han vacunado contra E. canis. Los antígenos de la invención, sus regiones inmunodominantes y los epítopos pueden usarse en los métodos de la invención. Estas composiciones pueden denominarse antígenos DIVA de E. canis (que diferencia animales infectados de animales vacunados). Un antígeno DIVA de E. canis induce una respuesta inmunitaria, por ejemplo, la producción de anticuerpos específicos, en un animal que es diferente de la respuesta inmunitaria inducida en el animal por una vacuna de E. canis en particular.

En consecuencia, la detección de la unión entre un antígeno DIVA de E. canis y un anticuerpo que no es un componente de la respuesta inmunitaria de un animal a una vacuna en particular puede indicar una infección natural. La ausencia de tal unión puede indicar vacunación o ausencia de infección. Además, un segundo antígeno separado, tal como un antígeno de E. canis que se une específicamente a un anticuerpo que es un componente de la respuesta inmunitaria de un animal a una vacuna de E. canis en particular, puede usarse para detectar anticuerpos producidos en respuesta a la vacunación. La detección de ninguno de los anticuerpos indica que no hay infección ni vacunación. Como tal, diversas combinaciones de reactivos de captura separados pueden conducir a una determinación del estado de vacunación y/o infección del sujeto de prueba.

En un aspecto, un método incluye poner en contacto una muestra biológica de un animal con un antígeno que es una parte de la bacteria E. canis nativa, pero que no es un elemento de una vacuna de E. canis en particular. Un animal es cualquier mamífero que es probable que se vacune contra E. canis y, en particular, los caninos. Además, los seres humanos pueden vacunarse contra E. canis. En otro aspecto, la invención incluye un método para determinar si un animal no se ha infectado por E. canis y no se ha vacunado contra E. canis. Se analiza una muestra biológica de un animal para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos específicos para un antígeno DIVA de E. canis, y la presencia o ausencia de anticuerpos específicos para una vacuna de E. canis en particular. Después se determina que el animal no se ha infectado y no se ha vacunado mediante la determinación de la ausencia de tales anticuerpos.

En un aspecto, un antígeno DIVA no es un elemento de una vacuna de E. canis. El estado de vacunación o infección de un animal puede determinarse mediante la detección de si los anticuerpos en la muestra se unen a uno o más antígenos usados en la vacuna. Si los anticuerpos en la muestra se unen a uno o más de los antígenos, el animal está vacunado o infectado. Si ningún anticuerpo se une al polipéptido DIVA, entonces puede determinarse que el animal se ha vacunado. Si no se detecta unión para ninguno de los antígenos, entonces puede determinarse que el animal no está infectado ni vacunado.

Un polipéptido de la invención puede modificarse de manera postraduccional. Un polipéptido purificado es una preparación de polipéptido que está sustancialmente libre de material celular, otros tipos de polipéptidos, precursores químicos, sustancias químicas usadas en la síntesis del polipéptido, o sus combinaciones. Una preparación de polipéptido que está sustancialmente libre de material celular, medio de cultivo, precursores químicos, sustancias químicas usadas en la síntesis del polipéptido tiene menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 1 % o más de otros polipéptidos, medio de cultivo, precursores químicos, y/u otras sustancias químicas usadas en la síntesis. Por lo tanto, un polipéptido purificado es aproximadamente 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más puro.

Los polipéptidos purificados de la invención pueden ser polipéptidos de longitud completa o fragmentos de polipéptidos. Por ejemplo, los fragmentos de polipéptidos de la invención pueden comprender aproximadamente 6, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, 750 aminoácidos contiguos o más de polipéptidos de la invención. Los ejemplos de polipéptidos de la invención incluyen aquellos que se muestran en la s Eq ID NO: 10. Las variantes de polipéptidos son al menos aproximadamente 80, o aproximadamente 90, 96, 98 o 99 % idénticas a las secuencias de polipéptidos mostradas en la SEQ ID NO: 10 y también son polipéptidos de la invención. Las variantes de polipéptidos tienen una o más variaciones de aminoácidos conservadoras u otras modificaciones menores y retienen la actividad biológica, es decir, son equivalentes biológicamente funcionales. Un equivalente biológicamente activo tiene una función sustancialmente equivalente en comparación con el polipéptido de tipo salvaje correspondiente.

La identidad de secuencia en por ciento tiene un significado reconocido en la técnica y existe una serie de métodos para medir la identidad entre dos secuencias de polipéptidos o polinucleótidos. Ver, por ejemplo, Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, Nueva York, (1988); Smith, Ed., Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Academic Press, Nueva York, (1993); Griffin & Griffin, Eds., Computer Analysis Of Sequence Data, Parte I, Humana Press, Nueva Jersey, (1994); von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987); y Gribskov & Devereux, Eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, Nueva York, (1991). Los métodos para alinear polinucleótidos o polipéptidos se codifican en programas de computadora, que incluyen el paquete de programas GCG (Devereux y otros, Nuc. Acids Res. 12:387 (1984)), BLASTP, BLAsTn , FA^s T^a (Atschul y otros, J. Molec. Biol. 215:403 (1990)), y programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) que usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Adv. App. Math., 2:482-489 (1981)). Por ejemplo, el programa de computadora ALIGN que emplea el algoritmo FASTA puede usarse, con una búsqueda de interrupción afín con una penalización de interrupción abierta de -12 y una penalización de extensión de interrupción de -2.

Cuando se usa cualquiera de los programas de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia en particular es, por ejemplo, aproximadamente 95 % idéntica a una secuencia de referencia, los parámetros se establecen de manera que el porcentaje de identidad se calcula a lo largo de la longitud completa del polinucleótido de referencia y que se permiten huecos en la identidad de hasta el 5 % del número total de nucleótidos en el polinucleótido de referencia.

Las variantes generalmente pueden identificarse mediante la modificación de una de las secuencias de polipéptidos de la invención, y la evaluación de las propiedades del polipéptido modificado para determinar si es un equivalente biológico. Una variante es un equivalente biológico si reacciona sustancialmente igual que un polipéptido de la invención en un ensayo tal como un ensayo inmunohistoquímico, un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunoenzimático o ensayo de inmunoelectrotransferencia, por ejemplo, tiene 90-110 % de la actividad del polipéptido original. En una modalidad, el ensayo es un ensayo de competencia en donde el polipéptido equivalente biológicamente es capaz de reducir la unión del polipéptido de la invención a un antígeno o anticuerpo reactivo correspondiente en aproximadamente 80, 95, 99 o 100 %. Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de tipo salvaje correspondiente también se une específicamente a la variante de polipéptido. Las variantes de polipéptidos de la invención pueden comprender aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos conservadoras.

Una sustitución conservadora es una en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido se mantuvieran sustancialmente sin cambios. En general, los siguientes grupos de aminoácidos representan cambios conservadores: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his.

Un polipéptido de la invención puede comprender además una secuencia señal (o líder) que dirige la transferencia de la proteína de manera cotraduccional o postraduccional. El polipéptido puede comprender además un enlazador u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His), o para mejorar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido puede conjugarse a una región Fc de inmunoglobulina o albúmina sérica bovina.

Un polipéptido puede unirse de manera covalente o no covalente a una secuencia de aminoácidos a la que el polipéptido no se asocia normalmente en la naturaleza. Adicionalmente, un polipéptido puede unirse de manera covalente o no covalente a compuestos o moléculas que no sean aminoácidos. Por ejemplo, un polipéptido puede unirse a un reactivo indicador, un separador de aminoácidos, un enlazador de aminoácidos, una secuencia señal, una secuencia de parada de transferencia, un dominio transmembrana, un ligando para la purificación de proteínas, o una de sus combinaciones. En una modalidad de la invención un ligando para la purificación de proteínas puede ser uno o más residuos de aminoácidos C en, por ejemplo, el extremo amino o extremo carboxi terminal de un polipéptido de la invención. Un separador de aminoácidos es una secuencia de aminoácidos que no está asociada usualmente con un polipéptido de la invención en la naturaleza. Un separador de aminoácidos puede comprender aproximadamente 1, 5, 10, 20, 100 o 1000 aminoácidos.

Si se desea, un polipéptido puede ser una proteína de fusión, que también puede contener otras secuencias de aminoácidos, tales como enlazadores de aminoácidos, separadores de aminoácidos, secuencias señales, secuencias de parada de la transferencia TMR, dominios transmembrana, así como también ligandos útiles en la purificación de proteínas, tales como glutatión-S-transferasa, etiqueta de histidina y proteína A de estafilococo, o sus combinaciones. Más de un polipéptido de la invención puede estar presente en una proteína de fusión. Los fragmentos de polipéptidos de la invención pueden estar presentes en una proteína de fusión de la invención. Una proteína de fusión de la invención puede comprender uno o más polipéptidos mostrados en la SEQ ID NO: 10, o fragmentos de estos.

Los polipéptidos de la invención pueden estar en una forma multimérica. Es decir, un polipéptido puede comprender una o más copias de la SEQ ID NO: 10. Un polipéptido multimérico puede ser un péptido antígeno múltiple (MAP). Ver, por ejemplo, Tam, J. Immunol. Methods, 196:17-32 (1996).

Los polipéptidos de la invención pueden comprender un antígeno que se reconoce por un anticuerpo reactivo contra E. canis. El antígeno puede comprender uno o más epítopos (es decir, determinantes antigénicos). Un epítopo puede ser un epítopo lineal, un epítopo secuencial o un epítopo conformacional. Los epítopos dentro de un polipéptido de la invención pueden identificarse mediante varios métodos. Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 4,554,101; Jameson & Wolf, CABIOS 4:181-186 (1988). Por ejemplo, un polipéptido de la invención puede aislarse y cribarse. Una serie de péptidos cortos, que juntos abarcan una secuencia completa de polipéptidos, pueden prepararse mediante escisión proteolítica. Al comenzar con, por ejemplo, fragmentos de polipéptido de 100 mer, cada fragmento puede someterse a prueba para detectar la presencia de epítopos reconocidos en un ELISA. Por ejemplo, en un ensayo ELISA un polipéptido de E. canis, tal como un fragmento de polipéptido de 100 mer, se une a un soporte sólido, tal como los pocillos de una placa plástica de múltiples pocillos. Se marca una población de anticuerpos, se adiciona al soporte sólido y se permite que se una al antígeno no marcado, en condiciones en las que se bloquea la absorción no específica, y se elimina cualquier anticuerpo no unido y otras proteínas. La unión de anticuerpos se detecta, por ejemplo, mediante una reacción que convierte un sustrato incoloro en un producto de reacción coloreado. Después, pueden someterse a prueba fragmentos progresivamente más pequeños y solapados a partir de 100 mer identificados para mapear el epítopo de interés.

En una modalidad de la invención, un antígeno DIVA comprende un epítopo o región inmunodominante. Es decir, un epítopo o región que más frecuentemente induce y se une a los anticuerpos en una población de estos en comparación con otros epítopos. Un antígeno puede tener uno o más epítopos inmunodominantes. Los epítopos inmunodominantes pueden mapearse en, por ejemplo, un polipéptido después de que el polipéptido se ha administrado a un animal o antes de tal administración. Ver, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos 2004/0209324.

Un polipéptido de la invención puede producirse de manera recombinante. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención puede introducirse en un vector de expresión recombinante, que puede expresarse en un sistema de células huésped de expresión adecuado mediante el uso de técnicas bien conocidas en la técnica. Una variedad de sistemas de expresión de bacterias, levaduras, plantas, mamíferos e insectos están disponibles en la técnica y puede usarse cualquiera de tales sistemas de expresión. Opcionalmente, un polinucleótido que codifica un polipéptido puede traducirse en un sistema de traducción libre de células. Un polipéptido también puede sintetizarse químicamente u obtenerse a partir de células de E. canis.

Un polipéptido inmunogénico de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 10. Un polipéptido inmunogénico puede inducir anticuerpos u otras respuestas inmunitarias (por ejemplo, respuestas de linfocitos T del sistema inmunitario) que reconocen epítopos de polipéptidos que tienen la SEQ ID NO: 10. Un polipéptido inmunogénico de la invención también puede ser un fragmento de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 10. Un fragmento de polipéptido inmunogénico de la invención puede tener aproximadamente 6, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, 750 aminoácidos de longitud.

Los anticuerpos específicos para E. canis pueden detectarse en fluidos biológicos o tejidos mediante cualquier método conocido en la técnica. Los métodos más simples generalmente son los métodos de inmunoensayo. Un método de este tipo es un método basado en la competencia en donde las muestras de suero se incuban previamente con un antígeno de E. canis que no es un elemento de una vacuna de E. canis (por ejemplo, un antígeno DIVA de E. canis), y después se adicionan a una fase sólida, tal como una placa de microtitulación, que tiene un anticuerpo monoclonal inmovilizado específico para el antígeno DIVA de E. canis. Los anticuerpos específicos para el antígeno DIVA de E. canis en la muestra evitarán que el antígeno DIVA de E. canis se una al anticuerpo inmovilizado. La detección de cualquier unión del antígeno DIVA de E. canis al anticuerpo inmovilizado puede determinarse mediante la adición de una segunda pareja de unión para el antígeno de E. canis, ya sea directamente marcado o capaz de marcarse a través de la unión a otra pareja de unión que tiene un marcador. Una muestra positiva, es decir, una muestra que tiene anticuerpos específicos para un antígeno DIVA de E. canis, se asocia con una disminución de la señal del marcador.

En una modalidad particular, los anticuerpos contra un antígeno DIVA de E. canis en una muestra biológica pueden detectarse al poner en contacto la muestra con un antígeno DIVA de E. canis y adicionar la muestra a una placa de microtitulación recubierta con un anticuerpo monoclonal anti antígeno DIVA. La unión del antígeno DIVA a la placa de microtitulación puede detectarse mediante la adición de un anticuerpo policlonal de conejo contra el antígeno DIVA y la adición de un anticuerpo policlonal de burro anticonejo conjugado con HRP. Los anticuerpos de la muestra evitarán la unión del antígeno DIVA al anticuerpo inmovilizado, lo que provocará de esta manera una disminución de la señal.

Otro método para detectar anticuerpos específicos para un antígeno DIVA de E. canis es un ensayo tipo sándwich donde una muestra biológica sospechosa de contener un anticuerpo específico para un antígeno DIVA de E. canis se pone en contacto con un antígeno DIVA de E. canis inmovilizado para formar un complejo inmunológico. La presencia de un anticuerpo específico para un antígeno DIVA de E. canis se determina mediante la detección de la unión de una pareja de unión marcada para el anticuerpo de E. canis, tal como un segundo anticuerpo.

En un aspecto de la invención, los antígenos DIVA de E. canis pueden inmovilizarse sobre un soporte sólido adecuado. Una muestra biológica se pone en contacto con el antígeno DIVA de E. canis, al que se unen los anticuerpos anti-E. canis, si tales anticuerpos están presentes en la muestra. La unión puede detectarse por cualquier medio adecuado, por ejemplo, enzimas, radionúclidos, partículas o marcadores fluorescentes. En una modalidad adecuada, el reactivo de detección puede asociarse con una proteína que es la misma o similar a la que se usa para capturar anticuerpos anti-E. canis (si están presentes). En una modalidad particular, los anticuerpos contra E. canis pueden detectarse mediante la inmovilización de un antígeno de E. canis sobre un soporte sólido. Las muestras biológicas pueden ponerse en contacto con el soporte sólido y, después de la eliminación de la muestra no unida, la unión de los anticuerpos de E. canis al antígeno puede lograrse con, por ejemplo, un anticuerpo IgG marcado.

Los antígenos DIVA de la invención pueden comprender además mimotopos de antígenos DIVA de la invención. Un mimotopo es un epítopo de péptido aleatorio que imita un epítopo antigénico natural durante la presentación del epítopo. Los epítopos de péptidos aleatorios pueden identificarse mediante la generación o selección de una biblioteca de epítopos de péptidos aleatorios. La biblioteca se pone en contacto con un anticuerpo. Los mimotopos que se identifican son específicamente inmunorreactivos con el anticuerpo. Las bibliotecas de péptidos aleatorios pueden, por ejemplo, mostrarse en fagos o generarse como bibliotecas combinatorias.

Los antígenos DIVA de E. canis, por ejemplo, polipéptidos, pueden ser naturales, es decir, aislados de una fuente natural, o pueden ser sintéticos (es decir, sintetizados químicamente o producidos de manera recombinante mediante el uso de técnicas de ingeniería genética). Las proteínas naturales pueden aislarse de la bacteria completa mediante técnicas convencionales, tales como la cromatografía de afinidad. Los anticuerpos policlonales o monoclonales pueden usarse para preparar una columna de afinidad adecuada mediante técnicas bien conocidas. Pueden sintetizarse químicamente proteínas que son inmunológicamente reactivas de forma cruzada con una proteína de E. canis natural. Por ejemplo, los polipéptidos que tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos, más usualmente menos de aproximadamente 80 aminoácidos, y típicamente menos de aproximadamente 50 aminoácidos, pueden sintetizarse mediante el conocido método de síntesis en fase sólida de Merrifield donde los aminoácidos se adicionan secuencialmente a una cadena en crecimiento. (Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2156). También pueden usarse proteínas recombinantes. Estas proteínas pueden producirse mediante la expresión en células cultivadas de moléculas de ADN recombinante que codifican una porción deseada del genoma de E. canis. La porción del genoma de E. canis puede ser natural o sintética, con genes naturales que pueden obtenerse de la bacteria aislada mediante técnicas convencionales.

Polinucleótidos de E. canis

Los polinucleótidos descritos en la presente descripción contienen menos de un genoma microbiano completo y pueden ser ácidos nucleicos monocatenarios o bicatenarios. Un polinucleótido puede ser ARN, ADN, ADNc, ADN genómico, ARN o ADN sintetizado químicamente o sus combinaciones. Los polinucleótidos pueden purificarse sin otros componentes, tales como proteínas, lípidos y otros polinucleótidos. Por ejemplo, el polinucleótido puede purificarse al 50 %, 75 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. Los polinucleótidos codifican los polipéptidos descritos anteriormente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos codifican los polipéptidos que se muestran en la SEQ ID NO: 10. Los polinucleótidos de la invención incluyen aquellos que se muestran en la SEQ ID NO: 9. Los polinucleótidos pueden comprender otras secuencias de nucleótidos, tales como secuencias que codifican para enlazadores, secuencias señales, secuencias de parada de la transferencia TMR, dominios transmembrana, o ligandos útiles en la purificación de proteínas tales como glutatión-S-transferasa, etiqueta de histidina y proteína A de estafilococo.

Los polinucleótidos pueden aislarse. Un polinucleótido aislado es un polinucleótido que no es inmediatamente contiguo a una o ambas de las secuencias genómicas flanqueantes 5' y 3' con las que se asocia naturalmente. Un polinucleótido aislado puede ser, por ejemplo, una molécula de ADN recombinante de cualquier longitud, siempre y cuando se eliminen o estén ausentes las secuencias de ácido nucleico que naturalmente flanquean de manera inmediata la molécula de ADN recombinante en un genoma de origen natural. Los polinucleótidos aislados también incluyen moléculas de ácido nucleico de origen no natural. Una molécula de ácido nucleico que existe entre cientos y millones de otras moléculas de ácido nucleico dentro de, por ejemplo, bibliotecas genómicas o de ADNc, o cortes de gel que contienen un preparado de ADN genómico hidrolizado enzimáticamente no deben considerarse un polinucleótido aislado. La secuencia de nucleótidos completa para E. canis está disponible en, por ejemplo, GenBank como número de acceso de NCBI: NZ_AAEJ01000001.

Los polinucleótidos pueden comprender además fragmentos que codifican polipéptidos inmunogénicos. Los polinucleótidos pueden codificar polipéptidos de longitud completa, fragmentos de polipéptidos y variantes de polipéptidos o polipéptidos de fusión.

Las secuencias de nucleótidos degeneradas que codifican polipéptidos, así como también las secuencias de nucleótidos homólogas que son al menos aproximadamente 80, o aproximadamente 90, 96, 98 o 99 % idénticas a las secuencias de polinucleótidos y los complementos de estas también se describen en la presente descripción. La identidad de secuencia en por ciento puede calcularse como se describió en la sección "Polipéptidos". Las secuencias de nucleótidos degeneradas son polinucleótidos que codifican un polipéptido o fragmentos de este, pero difieren en la secuencia de ácido nucleico de la secuencia de polinucleótidos de tipo salvaje, debido a la degeneración del código genético. Las moléculas de ADN complementario (ADNc), los homólogos de especies y las variantes de los polinucleótidos de E. canis que codifican polipéptidos de E. canis biológicamente funcionales también son polinucleótidos de E. canis. Los polinucleótidos pueden aislarse a partir de secuencias de ácidos nucleicos presentes en, por ejemplo, una muestra biológica, tal como sangre, suero, saliva o tejido de un individuo infectado. Los polinucleótidos también pueden sintetizarse en el laboratorio, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador automático. Un método de amplificación tal como PCR puede usarse para amplificar polinucleótidos de ADN genómico o ADNc que codifica los polipéptidos.

Los polinucleótidos descritos en la presente descripción pueden comprender secuencias codificantes para polipéptidos de origen natural o pueden codificar secuencias alteradas que no son de origen natural. Si se desea, los polinucleótidos pueden clonarse en un vector de expresión que comprende elementos de control de la expresión, que incluyen, por ejemplo, orígenes de replicación, promotores, potenciadores u otros elementos reguladores que impulsan la expresión de los polinucleótidos en células huésped. Un vector de expresión puede ser, por ejemplo, un plásmido, tal como pBR322, pUC, o ColE1, o un vector de adenovirus, tal como un vector de adenovirus de tipo 2 o un vector de tipo 5. Opcionalmente, pueden usarse otros vectores, que incluyen pero no se limitan al virus Sindbis, virus de simios 40, vectores de alfavirus, vectores de poxvirus y vectores de citomegalovirus y retrovíricos, tales como el virus del sarcoma murino, virus del tumor de mama de ratón, virus de la leucemia murina de Moloney y virus del sarcoma de Rous. Los minicromosomas tales como MC y MC1, bacteriófagos, fagémidos, cromosomas artificiales de levadura, cromosomas artificiales de bacterias, partículas de virus, partículas similares a virus, cósmidos (plásmidos en los que se insertaron sitios cos de fagos lambda) y replicones (elementos genéticos que son capaces de replicarse bajo su propio control en una célula) también pueden usarse.

Los métodos para preparar polinucleótidos unidos operativamente a una secuencia de control de la expresión y expresarlos en una célula huésped se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 4,366,246. Un polinucleótido está unido operativamente cuando se posiciona adyacente a o cerca de uno o más elementos de control de la expresión, que dirigen la transcripción y/o traducción del polinucleótido.

Los polinucleótidos pueden usarse, por ejemplo, como sondas o cebadores, por ejemplo, cebadores de PCR, para detectar la presencia de polinucleótidos de E. canis en una muestra, tal como una muestra biológica. La capacidad de tales sondas y cebadores para hibridarse específicamente con las secuencias de polinucleótidos de E. canis les permitirá ser de uso en la detección de la presencia de secuencias complementarias en una muestra dada. Las sondas y cebadores de polinucleótidos pueden hibridarse a secuencias complementarias en una muestra tal como una muestra biológica, que incluye saliva, esputo, sangre, orina, heces fecales, fluido cefalorraquídeo, fluido amniótico, exudado de heridas, o tejido. Los polinucleótidos de la muestra pueden someterse, por ejemplo, a electroforesis en gel u otras técnicas de separación por tamaño o pueden inmovilizarse sin separación por tamaño. Las sondas de polinucleótidos o los cebadores pueden marcarse. Los marcadores adecuados, y los métodos para marcar sondas y cebadores se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, marcadores radiactivos incorporados por traducción de mellas o por cinasa, marcadores de biotina, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, marcadores bioluminiscentes, marcadores de quelantes de metal y marcadores enzimáticos. Los polinucleótidos de la muestra se ponen en contacto con las sondas o cebadores en condiciones de hibridación estrictas adecuadas.

En dependencia de la aplicación, pueden usarse condiciones variables de hibridación para lograr diversos grados de selectividad de la sonda o el cebador hacia la secuencia objetivo. Para aplicaciones que requieren una alta selectividad, pueden usarse condiciones relativamente estrictas, tales como condiciones de baja sal y/o alta temperatura, tales como las proporcionadas por una concentración de sal de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,15 M de sal a temperaturas de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C. Para aplicaciones que requieren menos selectividad, pueden usarse condiciones de hibridación menos estrictas. Por ejemplo, las condiciones de sal de aproximadamente 0,14 M a aproximadamente 0,9 M de sal, a intervalos de temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 55 °C. La presencia de un complejo hibridado que comprende la sonda o el cebador y un polinucleótido complementario a partir de la muestra de prueba indica la presencia de E. canis o una secuencia de polinucleótidos de E. canis en la muestra.

Anticuerpos

Los anticuerpos descritos en la presente descripción son moléculas de anticuerpos que se unen de manera específica y estable a un polipéptido de E. canis de la invención o fragmento de este. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo de cadena única (scFv), o un fragmento de un anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos son una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión a antígeno o la región variable de un anticuerpo intacto, en donde la porción está libre de los dominios constantes de la cadena pesada de la región Fc del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')² y F^v .

Un anticuerpo puede ser cualquier clase de anticuerpo, que incluye, por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Un anticuerpo o fragmento de este se une a un epítopo de un polipéptido de la invención. Un anticuerpo puede producirse in vivo en animales de laboratorio adecuados o in vitro mediante el uso de técnicas de ADN recombinante. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998); Dean, Methods Mol. Biol. 32:361-79 (1994); Baileg, Methods Mol. Biol.

32:381-88 (1994); Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994); Drenckhahn y otros Methods Cell. Biol. 37:7-56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992); Wright y otros Crit. Rev. Immunol. 12:125-68 (1992). Por ejemplo, los anticuerpos policlonales pueden producirse al administrar un polipéptido de la invención a un animal, tal como un ser humano u otro primate, ratón, rata, conejo, cobaya, cabra, cerdo, perro, vaca, oveja, burro o caballo. El suero del animal inmunizado se recolecta y los anticuerpos se purifican a partir del plasma mediante, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, seguido de cromatografía, tal como cromatografía de afinidad. Las técnicas para producir y procesar anticuerpos policlonales se conocen en la técnica.

"Se une específicamente" o "es específico para" significa que un antígeno, por ejemplo, un polipéptido, reconoce y se une a un anticuerpo con mayor afinidad que a otras moléculas no específicas. Por ejemplo, un anticuerpo generado contra un antígeno (por ejemplo, un polipéptido) al que se une más eficientemente que a una proteína no específica puede describirse como que se une específicamente al antígeno. La unión específicamente puede someterse a prueba mediante el uso, por ejemplo, de un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de inmunoelectrotransferencia mediante el uso de una metodología bien conocida en la técnica.

Adicionalmente, también pueden producirse fácilmente anticuerpos monoclonales dirigidos contra epítopos presentes en un antígeno, por ejemplo, un polipéptido de la invención. Por ejemplo, los linfocitos B normales de un mamífero, tal como un ratón, que se inmunizó con un polipéptido de la invención pueden fusionarse con, por ejemplo, células de mieloma de ratón sensibles a HAT para producir hibridomas. Los hibridomas que producen anticuerpos específicos de E. canis pueden identificarse mediante el uso de RIA o ELISA y aislarse mediante la clonación en agar semisólido o mediante dilución limitante. Los clones que producen los anticuerpos específicos de E. canis se aíslan mediante otra ronda de cribado. Los anticuerpos monoclonales pueden cribarse para determinar la especificidad mediante el uso de técnicas estándar, por ejemplo, al unir un polipéptido de la invención a una placa de microtitulación y medir la unión del anticuerpo monoclonal mediante un ensayo ELISA. Las técnicas para producir y procesar anticuerpos monoclonales se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975). Los isotipos particulares de un anticuerpo monoclonal pueden prepararse directamente, mediante la selección de la fusión inicial, o prepararse secundariamente, a partir de un hibridoma parental que secreta un anticuerpo monoclonal de un isotipo diferente mediante el uso de una técnica de selección sib para aislar variantes de conmutación de clase. Ver, Steplewski y otros, P.N.A.S. U.S.A. 82:8653 1985; Spria y otros, J. Immunolog. Meth.

74:307, 1984. Los anticuerpos monoclonales también pueden ser anticuerpos monoclonales recombinantes. Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 4,474,893; patente de Estados Unidos núm. 4,816,567. Los anticuerpos también pueden construirse químicamente. Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 4,676,980.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos quiméricos (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm.

5,482,856), humanizados (ver, por ejemplo, Jones y otros, Nature 321:522 (1986); Reichmann y otros, Nature 332:323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 (1992)), o humanos. Los anticuerpos humanos pueden producirse, por ejemplo, mediante inmortalización directa, presentación en fagos, ratones transgénicos o una metodología Trimera, ver, por ejemplo, Reisener y otros, Trends Biotechnol. 16:242-246 (1998).

Los anticuerpos que se unen específicamente a los antígenos de E. canis (por ejemplo, los polipéptidos de E. canis que se muestran en la SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17), son particularmente útiles para detectar la presencia de E. canis o antígenos de E. canis en una muestra, tal como una muestra de suero, sangre, orina o saliva de un animal infectado con E. canis tal como un ser humano o un perro. Un inmunoensayo para E. canis o un antígeno de E. canis puede utilizar un anticuerpo o varios anticuerpos. Un inmunoensayo para E. canis o un antígeno de E. canis puede usar, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal dirigido hacia un epítopo de E. canis, una combinación de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia epítopos de un polipéptido de E. canis, anticuerpos monoclonales dirigidos hacia epítopos de polipéptidos de E. canis diferentes, anticuerpos policlonales dirigidos hacia el mismo antígeno de E. canis, anticuerpos policlonales dirigidos hacia antígenos de E. canis diferentes o una combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales. Los protocolos de inmunoensayo pueden basarse en, por ejemplo, ensayos de competencia, reacción directa o tipo sándwich mediante el uso, por ejemplo, de un anticuerpo marcado. Los anticuerpos pueden marcarse con cualquier tipo de marcador conocido en la técnica, que incluye, por ejemplo, marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivos, enzimáticos, metal coloidal, radioisótopos y bioluminiscentes.

Los anticuerpos o fragmentos de estos pueden unirse a un soporte y usarse para detectar la presencia de E. canis o un antígeno de E. canis, por ejemplo, un antígeno DIVA de E. canis o un antígeno no DIVA de E. canis. Los soportes incluyen, por ejemplo, vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, celulosa natural y modificada, poliacrilamidas, agarosa y magletita.

Los anticuerpos pueden usarse además para aislar organismos E. canis o antígenos de E. canis mediante columnas de inmunoafinidad. Los anticuerpos pueden fijarse a un soporte sólido mediante, por ejemplo, adsorción o por enlace covalente de manera que los anticuerpos mantengan su actividad inmunoselectiva. Opcionalmente, los grupos separadores pueden incluirse de manera tal que el sitio de unión al antígeno del anticuerpo aún sea accesible. Los anticuerpos inmovilizados pueden usarse para unirse a los organismos E. canis o a los antígenos de E. canis de una muestra, tal como una muestra biológica que incluye saliva, suero, esputo, sangre, orina, heces fecales, fluido cefalorraquídeo, fluido amniótico, exudado de heridas, o tejido. Los organismos E. canis o los antígenos de E. canis unidos se recuperan de la matriz de la columna, por ejemplo, mediante un cambio en el pH.

Los anticuerpos también pueden usarse en estudios de inmunolocalización para analizar la presencia y distribución de un polipéptido de la invención durante diversos eventos celulares o condiciones fisiológicas. Los anticuerpos también pueden usarse para identificar moléculas implicadas en la inmunización pasiva e identificar moléculas implicadas en la biosíntesis de antígenos no proteicos. La identificación de tales moléculas puede ser útil en el desarrollo de vacunas. Los anticuerpos que incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales y anticuerpos de cadena única, pueden usarse para monitorear el curso de mejora de una enfermedad provocada por E. canis. Mediante la medición del aumento o disminución de los anticuerpos de E. canis para los antígenos de E. canis en una muestra de prueba de un animal, puede determinarse si un régimen terapéutico particular dirigido a mejorar el trastorno es efectivo. Los anticuerpos pueden detectarse y/o cuantificarse mediante el uso, por ejemplo, de ensayos de unión directa tales como RIA, ELISA o ensayos de inmunoelectrotransferencia.

Detección

Los métodos de la invención pueden lograrse mediante el uso, por ejemplo, de técnicas de inmunoensayo bien conocidas por los expertos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, el uso de microplacas y dispositivos de flujo lateral. En una modalidad, uno o más antígenos DIVA de E. canis se inmovilizan sobre un soporte sólido en una ubicación distinta. La detección de complejos antígeno-anticuerpo en el soporte sólido puede ser por cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 5,726,010 describe un ejemplo de un dispositivo de flujo lateral útil en la presente invención. El dispositivo puede usarse para detectar uno o más anticuerpos contra los antígenos de E. canis.

La inmovilización de uno o más reactivos de captura de analitos, por ejemplo, polipéptidos de E. canis, sobre un dispositivo o soporte sólido se realiza de modo que los procedimientos de muestra, diluyente y/o lavado no eliminen un reactivo de captura de analitos. Uno o más reactivos de captura de analitos pueden unirse a una superficie mediante adsorción física (es decir, sin el uso de enlazadores químicos) o mediante unión química (es decir, con el uso de enlazadores químicos). La unión química puede generar una unión más fuerte de los reactivos de captura sobre una superficie y proporcionar una orientación y conformación definidas de las moléculas unidas a la superficie. En la presente descripción se describe un dispositivo que es adecuado para un ensayo de flujo lateral. Por ejemplo, una muestra de prueba se adiciona a una matriz de flujo en una primera región (una zona de aplicación de muestra). La muestra de prueba se transporta en una trayectoria de flujo de fluido por acción capilar a una segunda región de la matriz de flujo donde un marcador es capaz de unirse y formar un primer complejo con un analito en la muestra de prueba. El primer complejo se transporta a una tercera región de la matriz de flujo donde un polipéptido de E. canis se inmoviliza en una ubicación distinta. Se forma un segundo complejo entre un polipéptido inmovilizado y el primer complejo que incluye el anticuerpo de la muestra. Por ejemplo, un primer complejo que comprende una partícula de sol de oro y un polipéptido de E. canis unido a un anticuerpo de E. canis se unirá específicamente y formará un segundo complejo con un segundo polipéptido de E. canis inmovilizado o con un segundo anticuerpo dirigido a anticuerpos de E. canis. El marcador que es parte del segundo complejo puede visualizarse directamente.

En la presente descripción se describen uno o más reactivos de unión específicos marcados que pueden mezclarse con una muestra de prueba antes de su aplicación a un dispositivo descrito en la presente descripción. En este caso, no es necesario tener reactivos de unión específicos marcados depositados y secados en una almohadilla de reactivo de unión específico en el dispositivo. Un reactivo de unión específico marcado, ya sea adicionado a una muestra de prueba o predepositado en el dispositivo, puede ser, por ejemplo, un anticuerpo marcado que se une específicamente a un anticuerpo para E. canis.

Cualquiera o todos los casos anteriores pueden proporcionarse como un kit. En un ejemplo particular, tal kit incluiría un dispositivo completo con reactivos de unión específicos (por ejemplo, un reactivo de unión específico marcado no inmovilizado y un reactivo de captura de analito inmovilizado) y reactivo de lavado, así como también un reactivo detector y reactivos de control positivo y negativo, si se desea o es apropiado. Además, pueden incluirse otros aditivos, tales como estabilizadores, tampones y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse, para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, usualmente liofilizados, que en disolución proporcionarán una solución de reactivo que tenga las concentraciones adecuadas para combinarse con una muestra.

Un antígeno DIVA de E. canis, por ejemplo, un polipéptido, puede ser un reactivo de captura de analito inmovilizado en una zona de reacción (fase sólida). Un segundo reactivo de captura de analito, por ejemplo un anticuerpo anti-IgG o anti-IgM, que se ha conjugado a un marcador, puede adicionarse a la muestra antes de adicionar la muestra al dispositivo, o el segundo reactivo de captura de analito puede incorporarse en el dispositivo. Por ejemplo, el reactivo de unión específico marcado puede depositarse y secarse en una trayectoria de flujo de fluido que proporciona una comunicación de fluidos entre la zona de aplicación de la muestra y la fase sólida. El contacto del reactivo de unión específico marcado con la muestra de fluido da como resultado la disolución del reactivo de unión específico marcado.

El dispositivo puede incluir, además, un reactivo líquido que transporta material no unido (por ejemplo, muestra de fluido no reaccionado y reactivos de unión específicos no unidos) fuera de la zona de reacción (fase sólida). Un reactivo líquido puede ser un reactivo de lavado y servir solo para eliminar material no unido de la zona de reacción, o puede incluir un reactivo detector y servir para eliminar material no unido y facilitar la detección de analitos. Por ejemplo, en el caso de un reactivo de unión específico conjugado a una enzima, el reactivo detector incluye un sustrato que produce una señal detectable tras la reacción con el conjugado enzima-anticuerpo en la zona reactiva. En el caso de un reactivo de unión específico marcado conjugado a una molécula radiactiva, fluorescente o de absorción de luz, el reactivo detector actúa simplemente como una solución de lavado que facilita la detección de la formación del complejo en la zona reactiva mediante la eliminación del reactivo marcado no unido.

Dos o más reactivos líquidos pueden estar presentes en un dispositivo, por ejemplo, un dispositivo puede comprender un reactivo líquido que actúa como un reactivo de lavado y un reactivo líquido que actúa como un reactivo detector y facilita la detección de analitos.

Un reactivo líquido puede incluir además una cantidad limitada de un "inhibidor", es decir, una sustancia que bloquea el desarrollo del producto final detectable. Una cantidad limitada es una cantidad de inhibidor suficiente para bloquear el desarrollo del producto final hasta que la mayoría o todo el exceso de material no unido se transporte lejos de la segunda región, en cuyo momento se produce el producto final detectable.

Métodos de tratamiento, mejora o prevención de una enfermedad provocada por E. canis

Un polipéptido, polinucleótido o anticuerpo DIVA descrito en la presente descripción puede usarse para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad provocada por E. canis. Sin embargo, si se usa un polipéptido DIVA para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad provocada por E. canis, no podría, después de eso, usarse como un polipéptido DIVA para la detección y diferenciación de animales infectados, no vacunados y vacunados porque el sistema inmunitario de un animal vacunado podría reconocer el antígeno DIVA usado para la vacunación. Sin embargo, un polipéptido DIVA que no reacciona de forma cruzada con anticuerpos al polipéptido DIVA usado para el tratamiento, mejora o prevención de una enfermedad provocada por E. canis todavía puede usarse como un antígeno DIVA de E. canis.

Por ejemplo, si la SEQ ID NO:2 o un fragmento de esta se usa como vacuna, entonces las SEQ ID NOs:4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, o sus combinaciones pueden usarse como un polipéptido DIVA, si no reaccionan de forma cruzada con anticuerpos específicos para la SEQ ID NO:2. Por lo tanto, los polipéptidos, polinucleótidos y anticuerpos DIVA pueden usarse de dos maneras diferentes: (1) como composiciones para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad o infección provocada por E. canis; y (2) como un antígeno DIVA de E. canis para la detección y diferenciación de animales que están vacunados; no vacunados; infectados o no infectados con E. canis.

Los polipéptidos, polinucleótidos y anticuerpos descritos en la presente descripción pueden usarse para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad provocada por E. canis. Por ejemplo, un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal o fragmentos de este, puede administrarse a un animal, tal como un ser humano. Un anticuerpo o fragmento de este se administra a un animal en una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmentos de este. Una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad efectiva para aliviar los síntomas de la infección por E. canis o para reducir la cantidad de organismos de E. canis en un sujeto.

Los polipéptidos o polinucleótidos descritos en la presente descripción pueden presentarse en una composición inmunogénica y usarse para inducir una respuesta inmunitaria en un huésped. Una composición inmunogénica es capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un animal. Una composición inmunogénica de polipéptidos o polinucleótidos es particularmente útil para sensibilizar un sistema inmunitario de un animal de manera que, como resultado, se produce una respuesta inmunitaria que mejora o previene el efecto de la infección por E. canis. La inducción de una respuesta inmunitaria en un modelo animal puede ser útil para determinar, por ejemplo, dosis óptimas o rutas de administración. La inducción de una respuesta inmunitaria también puede usarse para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o infección provocada por E. canis. Una respuesta inmunitaria incluye respuestas inmunitarias humorales o respuestas inmunitarias mediadas por células, o sus combinaciones. Una respuesta inmunitaria puede comprender además la promoción de una respuesta generalizada del huésped, por ejemplo, mediante la promoción de la producción de defensinas.

La generación de un título de anticuerpos por un animal contra E. canis puede ser importante en la protección contra la infección y la eliminación de la infección. La detección y/o cuantificación de los títulos de anticuerpos después del suministro de un polipéptido o polinucleótido puede usarse para identificar epítopos que son particularmente efectivos para inducir títulos de anticuerpos. Los epítopos responsables de una respuesta fuerte de anticuerpos contra E. canis pueden identificarse al inducir anticuerpos dirigidos contra los polipéptidos de E. canis de diferentes longitudes. Los anticuerpos inducidos por un epítopo de polipéptido particular pueden probarse mediante el uso, por ejemplo, de un ensayo ELISA para determinar qué polipéptidos contienen epítopos que son más efectivos para generar una respuesta fuerte. Los polipéptidos o proteínas de fusión que contienen estos epítopos o los polinucleótidos que codifican los epítopos pueden construirse y usarse para inducir una respuesta fuerte de anticuerpos.

Un polipéptido, polinucleótido o anticuerpo descrito en la presente descripción puede administrarse a un mamífero, tal como un ratón, conejo, cobaya, macaco, babuino, chimpancé, ser humano, vaca, oveja, cerdo, caballo, perro, gato o a animales tales como pollos o patos, para inducir anticuerpos in vivo. La inyección de un polinucleótido tiene las ventajas prácticas de la simplicidad de construcción y modificación. Además, la inyección de un polinucleótido da como resultado la síntesis de un polipéptido en el huésped. Por tanto, el polipéptido se presenta al sistema inmunitario del huésped con modificaciones, estructura y conformación postraduccionales nativas.

Un polinucleótido puede suministrarse a un sujeto como "ADN desnudo".

La administración de un polinucleótido, polipéptido, o anticuerpo puede ser mediante cualquier medio conocido en la técnica, lo que incluye inyección intramuscular, intravenosa, intrapulmonar, intradérmica, intraperitoneal o subcutánea, aerosol, intranasal, bomba de infusión, supositorio, mucosa, tópica y oral, lo que incluye la inyección mediante el uso de una pistola balística biológica ("pistola de genes"). Un polinucleótido, polipéptido o anticuerpo puede acompañarse de un portador de proteína para la administración oral. También puede usarse una combinación de métodos de administración para inducir una respuesta inmunitaria. Los anticuerpos pueden administrarse a una dosis diaria de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 200 mg. En un caso los anticuerpos se administran a una dosis diaria de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 mg.

Los portadores y diluyentes farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico se conocen bien en la técnica y se describen en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ed. (1985)). El portador no debe inducir por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el huésped. Tales portadores incluyen, pero no se limitan a, macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos tales como SEPHAROSE^® funcionalizada con látex, agarosa, celulosa, perlas de celulosa y similares, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos tales como ácido poliglutámico, polilisina, y similares, copolímeros de aminoácidos, peptoides, lipitoides, y partículas de virus avirulentas, inactivas o células bacterianas. Los liposomas, hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables, y bioadhesivos también pueden usarse como portadores de una composición descrita en la presente descripción.

Las sales farmacéuticamente aceptables también pueden usarse en las composiciones descritas en la presente descripción, por ejemplo, sales minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, o sulfatos, así como también sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, proprionatos, malonatos o benzoatos. Los sustratos proteicos especialmente útiles son las albúminas séricas, hemocianina de lapa de ojo de cerradura, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina, toxoide tetánico, y otras proteínas bien conocidas por los expertos en la técnica. Las composiciones descritas en la presente descripción también pueden contener líquidos o excipientes, tales como agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer, solución de Hank, glucosa, glicerol, dextrosa, malodextrina, etanol, o similares, individualmente o en combinación, así como también sustancias tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes para ajustar la tonicidad, detergentes, o agentes tamponantes de pH. También pueden usarse agentes activos adicionales, tales como agentes bactericidas.

Si se desea, las moléculas coestimuladoras, que mejoran la presentación del inmunógeno a los linfocitos, tales como B7-1 o B7-2, o citocinas tales como MIP1a, GM-CSF, IL-2 e IL-12, pueden incluirse en una composición descrita en la presente descripción. Opcionalmente, los adyuvantes también pueden incluirse en una composición. Los adyuvantes son sustancias que pueden usarse para aumentar de forma no específica una respuesta inmunitaria específica. Generalmente, un adyuvante y un polipéptido de la invención se mezclan antes de su presentación al sistema inmunitario, o se presentan por separado, pero se presentan en el mismo sitio del animal. Los adyuvantes pueden incluir, por ejemplo, coadyuvantes oleosos (por ejemplo, adyuvantes completo e incompleto de Freund) sales minerales (por ejemplo, Alk(SO⁴)²; AlNa(SO^² , AlNH⁴(SO⁴), sílice, alúmina, Al(OH)³, y Ca³(PO⁴)²), polinucleótidos (es decir, ácidos poliícos y poli AU), y ciertas sustancias naturales (por ejemplo, cera D de Mycobacterium tuberculosis, así como también sustancias encontradas en Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis y miembros del género Brucella. Los adyuvantes que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a MF59-0, hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637), denominado nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, denominado MTP-PE), y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, lípido A de monofosforilo, dimicolato de trehalosa y esqueleto de la pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsión de escualeno al 2 %/TWEEN^® 80.

Las composiciones descritas en la presente descripción pueden formularse en comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, formulaciones inyectables, enjuagues bucales, dentríficos, y similares. El porcentaje de uno o más polipéptidos, polinucleótidos o anticuerpos en tales composiciones y preparaciones puede variar del 0,1 % al 60 % del peso de la unidad.

La administración de polipéptidos, polinucleótidos o anticuerpos puede inducir una respuesta inmunitaria en el animal que dura al menos 1 semana, 1 mes, 3 meses, 6 meses, 1 año, o más. Opcionalmente, una respuesta inmunitaria puede mantenerse en un animal al proporcionar una o más inyecciones de refuerzo del polipéptido, polinucleótido, o anticuerpos en 1 mes, 3 meses, 6 meses, 1 año o más después de la inyección primaria. Si se desea, las moléculas coestimuladoras o los adyuvantes también pueden proporcionarse antes, después, o junto con las composiciones.

Una composición descrita en la presente descripción que comprende un polipéptido, polinucleótido, anticuerpo, o una de sus combinaciones se administra de una manera compatible con la composición particular usada y en una cantidad que es efectiva para inducir una respuesta inmunitaria detectada mediante, por ejemplo, un ELISA. Un polinucleótido puede inyectarse intramuscularmente a un mamífero, tal como un babuino, chimpancé, perro o ser humano, a una dosis de 1 ng/kg, 10 ng/kg, 100 ng/kg, 1000 ng/kg, 0,001 mg/kg, 0,1 mg/kg o 0,5 mg/kg. Un polipéptido o anticuerpo puede inyectarse intramuscularmente a un mamífero a una dosis de 0,01, 0,05, 0,5, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 5 o 10 mg/kg.

Los polipéptidos, polinucleótidos o anticuerpos, o una de sus combinaciones pueden administrarse a un animal que no está infectado con E. canis o pueden administrarse a un animal infectado con E. canis. Las dosis particulares de polinucleótido, polipéptidos o anticuerpos en una composición dependerán de muchos factores que incluyen, pero no se limitan a la especie, edad, sexo, medicación concurrente, condición general del mamífero al que se administra la composición, y el modo de administración de la composición. Una cantidad efectiva de la composición de la invención puede determinarse fácilmente mediante el uso solamente de experimentación rutinaria. La invención descrita ilustrativamente en la presente descripción puede practicarse adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se describen específicamente en la presente descripción. Por tanto, por ejemplo, en cada caso en la presente descripción, cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente de" y "que consiste de" puede reemplazarse con cualquiera de los otros dos términos. Los términos y expresiones que se han empleado se usan como términos de descripción y no de limitación, y no existe la intención de que en el uso de tales términos y expresiones se excluya cualquier equivalente de las características mostradas y descritas o porciones de estas, pero se reconoce que diversas modificaciones son posibles dentro del alcance de la invención reivindicada. Por tanto, debe entenderse que aunque la presente invención se ha descrito específicamente mediante modalidades, puede recurrirse a características opcionales, la modificación y la variación de los conceptos descritos en la presente descripción por los expertos en la técnica, y que tales modificaciones y variaciones se consideran dentro del alcance de esta invención como se define por las reivindicaciones adjuntas. Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación de E. canis inactivada con formalina para la inmunización en perros

E. canis se cultiva en cultivo celular canino mediante el uso de los métodos descritos en la literatura. Ver, por ejemplo, Breitschwerdt, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1998, Vol. 42:362-368. Mediante el uso de microscopía óptica, se estimó que las células 030 se infectaron por E. canis por más del 80 %. Se recolectaron dos litros de cultivo celular infectado con E. canis, se centrifugaron y el sedimento se retuvo y produjo 7,31 g de material (peso húmedo). Se supone que el agua representa el 80 % del peso del material, lo que da un peso en seco estimado de 1,462 g (20 % del peso del material). El sedimento celular se resuspendió a 20 mg/ml en PBS (peso en seco) para un volumen total de 73 ml.

A este sedimento celular resuspendido, se adicionaron 0,73 ml de solución de formalina (Catálogo Sigma Solución de formalina HT50-1-2 al 10 %, tamponada neutra) para una concentración final de formaldehído de 0,04 %. La solución se agitó durante toda la noche a 4 °C. La mezcla inactivada se centrifugó y el sedimento celular se retuvo. El sedimento se lavó mediante resuspensión en 250 ml de PBS. El material se recolectó mediante centrifugación y el lavado se repitió una vez.

El sedimento celular lavado se resuspendió en 73 ml de PBS. La muestra se distribuyó en alícuotas en 73 viales con tapón de rosca y se congeló a -80 °C. Cada vial contiene 20 mg (peso en seco) de cultivo celular de E. canis inactivada con formalina, adecuados para combinarse con el adyuvante adecuado para la inmunización en animales. Ejemplo 2

Preparación de E. canis fijada con formalina con dos adyuvantes diferentes, protocolo para la inmunización de beagles con antígeno de E. canis y análisis de sueros de beagles inmunizados mediante el uso de SNAP® 3Dx®. La preparación del antígeno con adyuvante de hidróxido de aluminio es una técnica bien conocida para los expertos en la técnica. Por ejemplo, ver "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, 1988, pág. 99.

Para la inmunización en perros (beagles de laboratorio), se prepararon dos conjuntos de dosis con adyuvante de hidróxido de aluminio preparado como se describió anteriormente y dos conjuntos de dosis se prepararon con adyuvante Ribi (Corixa Corp., Seattle WA) mediante el uso del protocolo descrito por el fabricante. Cada dosis contenía aproximadamente 20 mg de cultivo celular de E. canis inactivada con formalina (peso en seco).

Los beagles de laboratorio mantenidos en la jaula se seleccionaron para la inmunización con el antígeno de E. canis inactivada con formalina. Dos grupos de dos perros cada uno; donde cada grupo usa un adyuvante diferente se administraron con la preparación de E. canis fijada con formalina (óxido de aluminio o Ribi). En el día 0 se encontró que los 4 perros eran seronegativos con el uso tanto del diagnóstico por SNAP® 3Dx® así como también por análisis de inmunoelectrotransferencia mediante el uso del organismo E. canis.

El comité del IACUC de Covance Research Products Inc. aprobó el protocolo para la inmunización de beagles de laboratorio. Los perros se expusieron en los días 0, 28 y 56 con sangrados semanales de 1 ml y se monitorearon mediante el uso de SNAP® 3Dx®. A todos los perros se les administró el artículo de prueba adecuado por vía subcutánea en el área dorsoescapular. Los cuatro animales se convirtieron a una prueba positiva en E. canis por SNAP®3Dx® para el día 42. Los sangrados de producción se obtuvieron en los días 42 y 70 (aproximadamente 50 ml de sangre que produjo aproximadamente 25 ml de suero).

La Figura 1 muestra la evaluación por el ensayo SNAP® 3Dx® de beagles de laboratorio. El dispositivo SNAP® se usó como se describió por el fabricante. La muestra "Pre" es del día 0. La muestra "Pos" es del día 42. El punto positivo a E. canis se vuelve positivo en los 4 perros para la muestra del día 42. Se observaron resultados similares para la muestra del día 70.

Experimentos con una tercera vacuna que comprende un tercer adyuvante, BCG, (Calbiochem de EMD Biosciences, Inc. San Diego, CA) reveló resultados similares. La preparación de la tercera vacuna fue idéntica a las preparaciones descritas para la vacuna con adyuvante Ribi descrita anteriormente, excepto: 1) la inactivación con formalina fue durante 24 h a 4 °C, y 2) se adicionó 1 mg de BCG. El calendario de vacunación fue el día 0, día 14, con sangrados semanales analizados para determinar la reactividad con las proteínas de E. canis.

Ejemplo 3

Enriquecimiento de E. canis a partir de cultivo celular mediante el uso de gradientes de PERCOLL.

Para el aislamiento de ADN y el análisis de inmunoelectrotransferencia, E. canis se enriqueció a partir de un cultivo celular mediante el uso de gradientes de densidad de PERCOLL®. El proceso de aislamiento de patógenos intracelulares a partir del cultivo celular, tal como Ehrlichia, es una técnica bien conocida para los expertos en la técnica. Por ejemplo, ver Akira y otros (1982) Purification of Rickettsia tsutsugamushi by PERCOLL® density gradient centrifugation, Microbiol. Immunol., 26:321-328.

Un enriquecimiento típico de E. canis comenzó con 1,5 litros de cultivo celular infectado (ver más arriba). Las células se centrifugaron 6000 x g, el sedimento celular se retuvo y el sobrenadante se desechó. El sedimento celular se resuspendió en 20 ml de PBS, seguido de una segunda centrifugación. El sobrenadante se desechó y el sobrenadante se conservó. El sedimento se resuspendió después en 20 ml de PBS, se sometió a ultrasonido durante 5 segundos a 20 kHz, ajuste de potencia 1,5 mediante el uso de un ultrasonido Branson. Después la muestra se centrifugó a 500 x g durante 5 minutos para sedimentar residuos grandes.

Se adicionó PERCOLL® al sobrenadante a una concentración final de 32 % (4,5 ml de PERCOLL® con 10 ml de muestra). La muestra se cargó en tubos Oak Ridge compatibles con un rotor de ultracentrífuga de 70,1 Ti y se centrifugó durante 30 minutos a 63000 x g. La banda opaca se recolectó mediante el uso de una pipeta Pasteur. La banda opaca está altamente enriquecida para Ehrlichia (confirmada mediante el uso de microscopía óptica de la muestra recolectada). Después de una dilución 1:4 con PBS, la muestra se distribuyó en alícuotas y se centrifugó a 12 000 x g. Se desechó el sobrenadante y el sedimento de Ehrlichia se conservó a -80 °C.

Ejemplo 4

Análisis de sueros o plasma de perros expuestos e infectados por inmunoelectrotransferencia.

El uso del análisis de gel de SDS-PAGE en 1 dimensión y el análisis de gel en 2 dimensiones (enfoque isoeléctrico en la 1ra dimensión, SDS-PAGE en la 2da dimensión) se conoce bien para los expertos en la técnica. Por ejemplo, ver Current Protocols in Molecular Biology, eds. F.M. Ausubel y otros, John Wiley & Sons Inc., 1997, páginas 10.2.2­ 10.3.11. El uso de inmunoelectrotranferencias para analizar proteínas separadas mediante el uso de estos métodos se conoce bien para los expertos en la técnica. Por ejemplo, ver Current Protocols in Molecular Biology, eds. F.M. Ausubel y otros, John Wiley & Sons Inc., 1997, páginas 10.8.1-10.8.116.

El trabajo inicial se realizó mediante el uso del análisis por inmunoelectrotransferencia de proteínas separadas con geles 1D (datos no mostrados), seguido del análisis por inmunoelectrotransferencia de proteínas separadas mediante el uso de geles 2D. Las proteínas de E. canis entera cosechadas a partir de cultivo celular se analizaron mediante el uso de electroforesis en gel 2D (materiales y reactivos usados como se describió por el fabricante; Bio-Rad Life Sciences Research, Hercules, CA 94547). La cantidad de muestra a cargar por gel se determinó empíricamente (ver Figura 2). Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa y se probaron mediante el uso de sueros caninos de beagles de laboratorio en el día 0, perros expuestos con el antígeno de E. canis inactivada con formalina (ver más arriba), o sueros de animales infectados con E. canis (ver Figuras 3, 4 y 5).

Se aislaron sueros y plasma caninos positivos de perros infectados con E. canis. La infección por E. canis se verificó mediante el análisis por inmunoelectrotransferencia de linfocitos cosechados de sangre completa de estos perros, y se confirmó mediante el uso del ensayo IDEXX SNAP®3Dx® con suero o plasma canino (comercialmente disponible en IDEXX Laboratories Inc., usado como se describió por el fabricante).

Para el análisis de inmunoelectrotransferencia, las proteínas se separaron mediante el uso de geles de enfoque isoeléctrico/SDS-PAGE 2D o SDS-PAGE 1D seguidos de electrotransferencia de las proteínas de los geles a nitrocelulosa. Las transferencias en nitrocelulosa se incubaron en una solución de bloqueo de leche descremada al 2,5 % disuelta en solución salina tamponada con Tris (pH 7,5), TWEEN® 20 al 0,05 %. Los sueros o el plasma caninos se diluyeron hasta el título como se describió en un tampón que contenía un lisado de E. coli para bloquear la unión no específica con suero normal de ternero al 30 % y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4 °C. Después de lavar 3 veces en TBS-TWEEN® (0,05 %), las manchas se transfirieron a un tampón que contenía suero fetal de ternero al 50 %, TBS-TWEEN®-Kathon al 50 % (0,05 % y 0,5 %, respectivamente) para prevenir la unión inespecífica de un anticuerpo policlonal anti-Fc canino de conejo conjugado a peroxidasa de rábano picante (Jackson Immuno Research, West Grove, PA 19390). El conjugado de anticuerpo policlonal anti-Fc canino de conejo se diluyó 1:5000. Los geles se lavaron 3 veces con TBS TWEEN® (0,05 %), una vez con TBS y la presencia de HRP se detectó mediante el uso de reactivos de detección de inmunoelectrotransferencia de ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 08855-1327) usados como se describió por el fabricante. Las imágenes digitales de la película de rayos X expuesta se capturaron mediante el uso de un GelDoc 2000 (Bio-Rad Inc.).

Ejemplo 5

Aislamiento de ADN de E. canis y construcción de una biblioteca de expresión lambda y cribado de la biblioteca de expresión lambda de E. canis para determinar clones que tienen actividad DIVA.

La preparación y el cribado de bibliotecas de expresión lambda es una técnica bien conocida para los expertos en la técnica. Por ejemplo, ver Current Protocols in Molecular Biology, eds. F.M. Ausubel y otros, John Wiley & Sons Inc., 1997, páginas 5.1 a 5.8.6. Para la construcción de la biblioteca de expresión, el ADN genómico se purificó a partir de E. canis aislada a partir de cultivo celular mediante centrifugación por gradiente de PERCOLL® (ver más arriba). El ADN se purificó mediante el uso de un kit de purificación de ADN genómico de Qiagen Sciences (Germantown, MD). Para la construcción de la biblioteca se usó un kit de vector EcoRI/CIAP prehidrolizado enzimáticamente Lambda ZAP® II (Stratagene Corp., La Jolla, CA 92037) como se especificó por el fabricante. El ADN genómico de E. canis se hidrolizó enzimáticamente parcialmente con TSP509 y los fragmentos que están en el intervalo de 2-6 kb se aislaron mediante el uso de electroforesis en gel de agarosa y se ligaron en el vector lambda. Los fagos se empaquetaron y cultivaron como se especificó por el fabricante.

Se cribaron aproximadamente 120 000 placas lambda individuales para determinar la unión a sueros aislados de perros identificados como positivos para la infección con E. canis, pero negativos para reactividad con sueros de animales expuestos a un cultivo de E. canis en cultivo celular (ver más arriba). A partir del cribado inicial se identificaron 84 placas individuales con esta actividad.

Las placas lambda se sometieron a dos rondas de purificación de la placa y se volvieron a analizar para verificar la reactividad positiva con sueros de animales infectados con E. canis, reactividad negativa cuando se cribaron con sueros de animales expuestos.

Las placas lambda aisladas se sometieron a cribado para determinar la reactividad cruzada con sueros de animales identificados como seropositivos para Anaplasma phagocytophilia, Borrelia burgdorferi (agente causal de la enfermedad de Lyme), Rickettsia rickettsii (agente causal de la fiebre moteada de las Montañas Rocosas), Leptospira interrogans y Dirofilaria immitis (agente causal del gusano del corazón canino).

Al final del proceso de cribado, se encontraron 43 placas lambda que reaccionaban con sueros de animales infectados con E. canis que no reaccionaban con sueros de perros expuestos o sueros de perros infectados con otros patógenos caninos (ver más arriba).

Mediante el uso de la función ZAP® del vector de clonación según las instrucciones del fabricante, los insertos en el vector lambda se convirtieron en plásmidos. Los plásmidos se transformaron en la cepa de E. coli XL-1 azul para la expresión de proteínas y el análisis de proteínas codificadas por inmunoelectrotransferencia. Los extremos de los insertos de ADN de E. canis se sometieron a análisis de secuencia de ADN mediante el uso de cebadores de secuenciación T7 y T3.

La información de la secuencia de tanto la reacción de T7 como de T3 para los 43 clones se envió para el análisis BLAST al sitio web del NCBI. Los resultados se tabularon en un formato Excel. Basado en la identidad de secuencia entre el clon y la secuencia del genoma de escopeta disponible para E. canis (NCBI: NZ_AAEJ01000001), se identificaron segmentos de ADN genómico para cada clon. Los clones individuales que compartían genes comunes se agruparon para un análisis adicional por inmunoelectrotransferencia mediante el uso de mezclas de sueros caninos infectados y expuestos a bacterias. Basados en patrones de bandas similares, se eliminaron clones duplicados. Se eliminó cualquier clon que mostrara reactividad a ambos conjuntos de sueros. Como resultado de este análisis, se seleccionaron 23 clones para una evaluación adicional. La agrupación de los clones y el antígeno común por grupo se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1.

Ejemplo 6

Análisis de inmunoelectrotransferencia mediante el uso de muestras de suero canino individuales positivas a E. canis

Los 23 clones se analizaron en geles de SDS-PAGE individuales. Cada gel se transfirió a nitrocelulosa y se sometió a inmunoelectrotransferencia mediante el uso de muestras individuales de suero canino de perros que solo eran positivos para infecciones por E. canis mediante la prueba ELISA/SNAP®. El suero canino se diluyó 1:500 en el mismo diluyente descrito en el Ejemplo 4 que contiene el lisado de E. coli y se detectó la reactividad mediante el uso de técnicas colorimétricas estándar de peroxidasa de rábano picante (Opti-4CN, Bio-Rad). Se evaluó un total de trece muestras individuales de suero canino. Se compararon las manchas en las muestras para determinar el número de perros que muestran reactividad a una banda predominante o conjunto de bandas por clon. Los resultados se resumen en la Tabla 2 y la Figura 6 (los clones enumerados en negrita se representan en la figura).

Tabla 2.

Los 23 clones también se analizaron por inmunoelectrotransferencia mediante el uso de sueros caninos mezclados que habían dado positivo para otras enfermedades infecciosas transmitidas por vectores. Se evaluaron las muestras que dieron positivo por ELISA o SNAP^® para las siguientes infecciones únicas: Gusano del corazón, Lyme, Anaplasma phagocytophilum, o E. ewingii. Ninguno de los clones identificados en la tabla anterior mostró reactividad cruzada con sueros caninos positivos para estas otras infecciones transmitidas por vectores.

Ejemplo 7

Identificación de segmentos génicos relevantes que codifican antígenos DIVA de E. canis.

a. Antígeno de 120 kDa

Este antígeno fue descrito previamente por Yu y otros (J Clin Microbiol. Enero de 2000;38(1):369-74) y demostró ser útil en el diagnóstico de infecciones por E. canis en perros. El número de acceso para este gen es AF112369 y la proteína asociada es AAD34330. Los clones 2, 10, 17 y 33 contienen segmentos de longitud completa del gen del antígeno de 120 kDa. El clon 35 puede contener un truncamiento de este gen. (Ver SEQ ID NOs:1 y 2).

Este gen se amplificó a partir de ADN genómico de E. canis y se subclonó en un sistema de expresión pET con una etiqueta 6-His de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Los resultados de secuenciación de este plásmido coincidieron exactamente con la secuencia génica que codifica la proteína mostrada en la SEQ ID NO: 2, de los aminoácidos 58 a 589. Los lisados de proteínas de las bacterias BL21 inducidas a expresar esta proteína se analizaron mediante inmunoelectrotransferencia con sueros caninos infectados y se compararon con las inmunoelectrotransferencias sondeadas con sueros de animales expuestos a organismos adaptados en cultivo. De acuerdo con hallazgos anteriores, solo los sueros de perros infectados reconocieron esta proteína del peso molecular esperado (datos no mostrados).

P120 tiene un motivo de 36 aminoácidos que se repite 14 veces. Ver, Figura 8, SEQ ID NO:15. La porción repetida (región subrayada en la Figura 8) es un péptido de 60 kD. La Figura 9A muestra las 14 repeticiones alineadas (SEQ ID NO:16). La Figura 9B muestra las secuencias consenso de las 14 repeticiones (SEQ ID NO:17).

En la presente descripción se describe un polipéptido que comprende:

KEEX¹TPEVX²AEDLQPAVDX³SX⁴EHSSSEVGX⁵KVSX⁶TS (SEQ ID NO:17).

Donde X¹ = S o N

X² = K o R

X³ = G, D, o S

X⁴ = V o I

X⁵ = E o K

X⁶ = E o K

En la presente descripción se describe además un polipéptido multimérico donde la SEQ ID NO:17 se repite dos o más veces. El polipéptido multimérico puede comprender, además, uno o más polipéptidos heterólogos.

b. Antígeno de 200 kDa

Este antígeno se describió previamente por McBride y otros (J Clin Microbiol. Enero de 2001;39(1):315-22) y se demostró que es útil en el diagnóstico de ehrlichiosis. El número de acceso para este gen es AF252298 y la proteína asociada es AAK01145. Una porción de esta secuencia de proteínas se asocia con una patente publicada (SEQ ID NO:2 de la patente de Estados Unidos núm. 6,355,777, número de acceso AAE96254). Identificamos una región diferente de esta proteína que sirve como antígeno diagnóstico para la ehrlichiosis y un reactivo DIVA. La porción del gen se extiende desde el nucleótido 1081 de AF252298 hasta el extremo, el nucleótido 4266. (Ver SEQ ID NOs:3 y 4).

Este gen se amplificó a partir de ADN genómico de E. canis y se subclonó en un sistema de expresión pET con una etiqueta 6-His de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Los resultados de secuenciación de este plásmido coincidieron exactamente con la secuencia génica que codifica la proteína mostrada en la SEQ ID NO:4, de los aminoácidos 1 a 1061. Los lisados de proteínas de las bacterias BL21 inducidas a expresar esta proteína se analizaron mediante inmunoelectrotransferencia con sueros caninos infectados y se compararon con las inmunoelectrotransferencias sondeadas con sueros de animales expuestos a organismos adaptados en cultivo. De acuerdo con hallazgos anteriores, solo los sueros de perros infectados reconocieron esta proteína del peso molecular esperado (datos no mostrados).

c. ATPasa

Este gen (Etiqueta de locus "Ecan02000699") se ha predicho mediante el análisis computacional automatizado de la secuencia del genoma de escopeta de E. canis. Este codifica una proteína de más de 4000 aminoácidos (ZP_00210575). El cribado de DIVA de E. canis identificó dos regiones separadas de este gen y su proteína asociada como posibles antígenos inmunodominantes y reactivos DIVA. Los segmentos de la proteína identificados en los clones 84 y 7 son los aminoácidos 1984-2774 y 2980-3740, respectivamente, del número de acceso 46308382. (Ver SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8).

Ambos fragmentos de este gen se amplificaron a partir de ADN genómico de E. canis y se subclonaron por separado en un sistema de expresión pET con una etiqueta 6-His de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Los resultados de secuenciación de este plásmido coincidieron exactamente con las secuencias génicas asociadas con las proteínas mostradas en SEQ ID NOs:6 y 8, de los aminoácidos 1 a 782 y 1 a 746, respectivamente. Los lisados de proteínas de las bacterias BL21 inducidas a expresar estas proteínas se analizaron mediante inmunoelectrotransferencia con sueros caninos infectados y se compararon con las inmunoelectrotransferencias sondeadas con sueros de animales expuestos a organismos adaptados en cultivo. De acuerdo con hallazgos anteriores, solo los sueros de perros infectados reconocieron estas proteínas del peso molecular esperado (datos no mostrados).

d. Proteínas de choque térmico

Aunque este clon contenía un gen para la proteína de choque térmico, GrpE, la secuencia génica que codifica para el antígeno inmunodominante surge de una secuencia de proteína hipotética predicha mediante el análisis computacional automatizado del genoma. Basado en el peso molecular y pI de la proteína, el gen de interés en el clon 9 es el número de locus "Ecan02000495" y la proteína asociada 46308954.

Debido a que esta proteína solo se predice a partir de la anotación por computadora del genoma y no se ha identificado previamente a partir de organismos E. canis como una proteína inmunodominante, esta es la primera evidencia de que este gen se expresa en E. canis y estimula una respuesta inmunitaria en el huésped canino infectado. La proteína se identificará como el antígeno p16 (ver la SEQ ID NO: 9 y 10).

Este gen se amplificó a partir del vector pBlueScript que contiene el ADN genómico de interés y se subclonó en un sistema de expresión pET con una etiqueta 6-His de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Los resultados de secuenciación de este plásmido coincidieron exactamente con la secuencia génica asociada con el número de locus "Ecan02000495". Los lisados de proteínas de las bacterias BL21 inducidas a expresar esta proteína se analizaron mediante inmunoelectrotransferencia con sueros caninos infectados y se compararon con las inmunoelectrotransferencias sondeadas con sueros de animales expuestos a organismos adaptados en cultivo. De acuerdo con los hallazgos anteriores, solo los sueros de perros infectados reconocieron esta proteína del peso molecular esperado (ver Figura 7).

e. Proteína ribosomal L1

Este gen se identifica mediante la etiqueta de locus "Ecan02000476" del genoma de E. canis. La proteína asociada tiene el número de acceso ZP_00211130 (ver SEQ ID NOs:11 y 12). La identificación de esta proteína se ha predicho basado en el análisis computacional automatizado del genoma. Un análisis de BLAST de esta proteína revela que la secuencia es aproximadamente 70 % idéntica a una proteína superficial de E. chaffeensis (número de acceso 4894576). La inmunorreactividad a la proteína E. chaffeensis se notificó previamente por Yu y otros, (J Clin

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la presencia o ausencia de un anticuerpo o fragmento de este, en una muestra de prueba, en donde el anticuerpo o fragmento de este se une específicamente a un polipéptido purificado que consiste en la SEQ ID NO:10 que comprende:

poner en contacto la muestra de prueba con un polipéptido purificado que comprende la SEQ ID NO:10 en condiciones adecuadas para la unión específica del polipéptido purificado al anticuerpo o fragmento de este; y detectar la presencia o ausencia de unión específica;

en donde la presencia de unión específica indica la presencia del anticuerpo o fragmento de este, y en donde la ausencia de unión específica indica la ausencia del anticuerpo o fragmento de este.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende además detectar la cantidad de unión específica.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido purificado se inmoviliza en un soporte sólido.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido purificado está en una forma multimérica.

5. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido purificado se une a una proteína heteróloga, un reactivo indicador, un separador de aminoácidos, un enlazador de aminoácidos, una secuencia señal, una secuencia de parada de transferencia, un dominio transmembrana, un ligando para la purificación de proteínas, o una de sus combinaciones.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra de prueba es una muestra biológica obtenida de un animal.

7. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra de prueba es una muestra biológica obtenida de un animal vacunado para Ehrlichia canis.

8. El método de la reivindicación 1, en donde los anticuerpos específicos para el gusano del corazón, la enfermedad de Lyme y Anaplasma phagocytophilum no se unen específicamente al polipéptido purificado que comprende la S^eQ ID N^o : 10.

9. Un método para detectar la infección por Ehrlichia canis en un animal que comprende poner en contacto una muestra de prueba del animal con un polipéptido purificado que consiste en la SEQ ID NO: 10 en condiciones adecuadas para la unión específica del polipéptido purificado al anticuerpo o fragmento de este; y

detectar la presencia o ausencia de unión específica;

en donde la presencia de unión específica indica la presencia del anticuerpo o fragmento de este y la infección por Ehrlichia canis en el animal.