DE69131572T2 - Nucleinsäure kodierend für transformierenden wachstumsfaktor-beta1 bindendes protein - Google Patents
Nucleinsäure kodierend für transformierenden wachstumsfaktor-beta1 bindendes proteinInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft Nukleotidmoleküle, die mit einem Bestandteil des grossen, latenten Komplexes des Materials kodieren, das als umwandelnder Wachstumfaktor-Beta1 bekannt ist (im folgenden kurz als "TGF-Beta1" bezeichnet für Transforming Growth Factor - Beta 1), welches als TGF-Beta1 bindendes Protein bezeichnet wird (im folgenden kurz als "TGF-Beta1-BP" bezeichnet). Das Protein ist zum Beispiel nützlich, wenn man ein Antiserum zur Verbindung für den oben erwähnten Komplex oder eine markierte Probe in Ansätzen hierfür erzeugen möchte, sowie für andere Verwendungen, wie sie nachfolgend beschrieben werden.
- Der transformierende Wachstumsfaktor-Beta (TGF-Beta) ist eine Familie von strukturell in Verbindung stehenden Molekülen, die als TGF-Beta1, -Beta2, -Beta3, -Beta4 und Beta5 bezeichnet werden; diese Moleküle stehen wiederum entfernter mit einigen anderen Faktoren in Beziehung, die Inhibierer/Aktivierer, die Müllersche hemmende Substanz, Knochen bildende Proteine, das Produkt des dekapentaplegischen Komplexes der Taufliege und des Xenopus umfassen. Hierfür wird Bezug genommen auf Roberts et al., Handbuch der experimentellen Pharmakologie, Band 95 (in Druck, 1990). TGF-Beta wurde ursprünglich wegen seiner Fähigkeit identifiziert, verankerungsunabhängiges Wachstum der NRK-Zellen in Synergie mit TGF-Alpha zu stimulieren; Roberts et al. in Fed. Proc. Band 42, Seiten 2621-2626 (1983). Es ist nachher festgestellt worden, dass es das Wachstum und die Differentiation vieler unterschiedlicher Zellarten anregt oder hemmt. Hierfür wird Bezug genommen auf Roberts et al., 1990, wie oben erwähnt.
- TGF-Beta's binden sich mit mindestens drei unterschiedlichen Rezeptoren ähnlichen Molekülen; mit zwei kleineren Arten von 53 und 73 kDa, die als Typ I beziehungsweise Typ II Rezeptoren bezeichnet werden, und mit einer grösseren Proteoglycan ähnlichen Struktur (Cheifetz et al., Cell, Band 40, Seiten 409- 415 (1987); Cheifetz et al., J. Biol. Chem., Band 264, Seiten 2272-2278 (1988); Andres et al., J. Cell. Biol., Band 109, Seiten 3137-3146 (1989); Segarini et al., J. Biol. Chem., Band 263, Seiten 8366-8370 (1988)). Die biologischen Effekte von TGF- Beta scheinen durch den Rezeptor des Typs I vermittelt zu werden (Boyd und Massague, J. Biol. Chem., Band 264, Seiten 2272-2278 (1989)).
- TGF-Beta's sind 25 kDa Disulfid gebundene dimerische Moleküle, die als inaktive hohe Mr Komplexe synthetisiert und abgesondert werden (Pircher et al., Cancer Res., Band 44, Seiten 5538-5543 (1984); Pircher et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Band 136, Seiten 30-37 (1984); Wakefield et al., J. Cell Biol., Band 105, Seiten 965-975 (1987)). Der grosse latente Komplex von TGF- Beta1 aus menschlichen Blut-Plättchen ist gereinigt und gekennzeichnet worden wie von Miyazono et al. in J. Biol. Chem., Band 263, Seiten 6407-6415 (1988) beschrieben. In diesem Komplex ist das TGF-Beta1 Molekül in nicht kovalenter Weise mit einem Disulfid gebundenen Komplex eines Dimers des N-endständigen Propeptids des Vorläufer TGF-Beta1 und einem dritten Bestandteil verbunden, der als TGF-Beta1 bindendes Protein (TGF-Beta1-BP) bezeichnet wird. Das von Plättchen abgeleitete TGF-Beta1-BP wurde in verschiedenen Arten gefunden, die Grössen zwischen 125 und 160 kDa aufwiesen, siehe hierfür Miyazono et al. wie oben erwähnt.
- Die Tatsache, dass TGF-Beta5 drastische Effekte auf Wachstum und Differenzierung der meisten Zellarten haben, zusammen mit der Beobachtung, dass sie durch viele unterschiedliche Zellarten synthetisiert werden, zeigt an, dass die Aktivierung von TGF- Beta's von ihren hohen Mr latenten Komplexen ein wichtiger regelnder Schritt in vivo sein muss. In vitro wird die Aktivierung zum Beispiel durch Säureung zu pH-Werten unter 4 erzielt, wie dies durch Pircher et al. und Miyazono et al. entsprechend obigen Zitaten beschrieben wird. In vivo werden solche niedrigen pH-Werte selten extrazellulär gefunden. Die in vivo Mechanismen der Aktivierung werden nicht völlig verstanden; mögliche Mechanismen umfassen Proteolyse oder Störungen der Kohlenhydratstrukturen des TGF-Beta1 Propeptids im latenten Komplex, siehe hierfür Miyazono und Heldin, Nature, Band 338, Seiten 158-160 (1989) und Lyons et al., J. Cell Biol., Band 106, Seiten 1659-1665 (1988).
- Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Nukleinsäure Molekül (wie genomische DNS, cDNS oder mRNS), das TGF-Beta1-BP kodiert, von der die komplementäre Sequenz zu Nukleotiden 2900 bis 3834 der Fig. 4b hybridisiert bei 0,1 · SSC, 0,1 Prozent SDS bei 55 Grad Celsius.
- Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zellinie, die TGF-Beta1-BP erzeugt, die eine Wirtszelle umfasst, die mit dem im wesentlichen reinen Nukleotid transformiert wird, wobei das besagte Nukleotid heterolog in Bezug auf die Wirtszelle ist.
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung und Characterisierung von TGF-Beta1-BP, insbesondere die Fibroblast- und Plättchen-Formen des Moleküls. Unter Einsatz von Komplexen der Proteine, die aus den Plättchen erhalten wurden, wurde die Plättchenform des Moleküls isoliert, zersplittert und seine Primärstruktur (d. h. die Aminosäuren-Sequenz) abgeleitet. Die Fragmente wurden dazu benutzt, um DNS-Proben zu entwickeln, die dann benutzt wurden, um eine Nukleotidsequenz von einer Gesamt- cDNS-Bibliothek von Fibroblasten zu erhalten, um eine im wesentlichen reine Nukleotid Sequenz festzustellen, die die Fibroblast Form des Moleküls exprimiert. Eine Aminosäuresequenz wurde vom cDNS-Klon abgeleitet, und es wurde gefunden, dass die Sequenz für die Plättchen Form des Moleküls völlig innerhalb der 60 Prozent der Fibroblast Form enthalten ist und dem C- endständigen Ende der Fibroblast Form entsprach. Die Fibroblast Form des Moleküls ist durch ein Molekulargewicht von ungefähr 170 bis ungefähr 190 Kilodaltons gekennzeichnet, verglichen mit der Plättchen Form, welche ein Molekulargewicht von ungefähr 125 bis ungefähr 160 Kilodaltons aufweist. Die cDNS Klone, isoliert von der Bibliothek, werden eingesetzt, um Aufnahme Wirtszellen zu transfektieren, und dann wird das bindende Protein exprimiert. Die Nukleotidsequenz ist in Vektoren enthalten, zum Beispiel, um die Transfektion zu vollziehen.
- Eindeutige Eigenschaften des Proteins umfassen eine Reihe von sechzehn Wiederholungen eines Gebietes, das hier als "epidermales Wachstumfaktor ähnliches" Gebiet angesprochen wird, sowie drei Wiederholungen eines Gebietes, welches vorher im Stand der Technik nicht festgestellt worden ist.
- Fig. 1 zeigt eine HPLC-Analyse (Hochleistungflüssigkeitschromatographie), einschliesslich der Trennung und des Sequenzierens von proteolytischen Fragmenten des hierin beschriebenen Plättchen TGF-Beta1-BP,
- Fig. 2 stellt die Daten dar, die das Vorhandensein eines Betahydroxylierten Asparaginresiduums in TGF-Beta1-BP beweist,
- Fig. 3 zeigt eine RNS-Identifikation (Northern Blotting Analyse) von TGF-Beta1-BP mRNS,
- Fig. 4a stellt in schematischer Weise einen cDNS-Klon BPA 13 dar, wobei die übersetzten und die nicht übersetzten Bereiche mit " " beziehungsweise "-" bezeichnet sind,
- Fig. 4b gibt die Nukleotidsequenz und Aminosäuresequenzen für cDNS wieder, die das Fibroblast TGF-Beta1-BP und das BP selbst exprimieren,
- Figs. 5(a)-(c) zeigen verschiedene Aspekte des Erscheinens des Proteins. In der Fig. 5(a) sind die EGF-ähnlichen Wiederholungen von Sequenzen ausgerichtet. In der Fig. 5(b) ist eine vorher unerkannte Wiederholung der Sequenz ausgerichtet, die dreimal im Protein auftritt. Die Fig. 5(c) zeigt die Position der Wiederholungen, die in den Figs. 5(a) und 5(b) dargestellt ist, im vollständigen Protein an, sowie andere Fragmente und mögliche Orte der N-Glycosylation,
- Figs. 6(a)-(c) betreffen Untersuchungen über die Zellen, die mit cDNS für das Protein transformiert sind. Die Fig. 6(a) stellt Immunoausfällungsstudien der COS Zellen dar, die mit der cDNS transfektiert sind. Die Fig. 6(b) zeigt die endo H Behandlung der Vorläuferform von TGF-Beta1-BP von den transformierten Zellen. Fig. 6c zeigt die Immunoausfällung des Proteins von Fibroblasten und das Immunoblotting des Proteins von Plättchen,
- Fig. 7 stellt die Wechselwirkung von markiertem, gereinigtem TGF-Beta1 und dem sogenannten "grossen latenten TGF- Beta1 Komplex" bildlich dar, und
- Fig. 8 zeigt eine Studie der konkurrierenden Bindung zwischen TGF-Beta1 und TGF-Beta1-BP zu den NRK-Zellen.
- TGF-Beta1-BP wurde von menschlichen Plättchen ausgehend gereinigt, wie von Miyazono et al. beschrieben, JBC, Band 263(13), Seiten 6407-6415 (1988), wobei dieses Zitat durch Referenz hierin aufgenommen wird. Zur Vereinfachung wird hier das Protokoll wiederholt. Es wird festgehalten, dass, nach Miyazono, das TGF-Beta1-BP als Teil eines Komplexes der verschiedenen Moleküle gereinigt wird. Die Isolierung des einzelnen Proteins, das hier beschrieben wird, wird in Beispiel 2 behandelt, das folgt.
- Ungefähr 800-1000 Liter menschliches Blut wurden verwendet, um 15 Liter Plättchenprotein als nichtadsorbierender Anteil aus CM- Sephadex Chromatographie nach Heldin et al. in Meth. Enzymol Band 147, Seiten 3-13 (1987), zu erhalten. Dieses Material wurde dann über QAE-Sephadex nach Miyazono et al. in J. Biol. Chem. Band 262, Seiten 4098-4103 (1987), verarbeitet. Ein Komplex latenten TGF-Beta1 (kurz als "L-TGF-Beta1" bezeichnet) wurde daraus zwischen 250 und 800 mM NaCl in 10 mM Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,4 eluiert. Ammoniumsulfat (209 g/liter; 35 prozentige Sättigung) wurde dem QAE-Sephadex Säuleneluat hinzugefügt. Nach einer Gleichgewichtsherstellung über 2 Stunden bei 4 Grad Celsius wurde die Probe mit 2075fachem g für 15 Minuten zentrifugiert. Die Ausfällungen sind aufgesammelt und erneut suspendiert worden in ungefähr 100 ml von 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, bei einem pH-Wert von 7,4, und extensiv gegen den gleichen Puffer dialysiert. Ein gleiches Volumen 2 M Ammoniumsulfat, 10 mM Tris-HCl, bei einem pH-Wert von 7,4, wurde dann der Probe hinzugefügt, die dann bei 2075fachem g für 15 Minuten zentrifugiert worden ist. Der Flüssigkeitsüberstand wurde dann in einer 20-ml Säule aus Octyl-Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) eingesetzt, die vorher mit 1 M Ammoniumsulfat, 10 mM Tris-HCl, bei einem pH-Wert von 7,4, ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Die Säule ist mit dem gleichen Puffer gewaschen worden und ist mit 10 mM Tris-HCl bei einem pH-Wert von 7,4 eluiert worden. Das Eluat der Octyl- Sepharose Chromatographie ist gegen einen 10 mM Phosphat Puffer, bei einem pH-Wert von 6,8, 0,01 mM CaCl&sub2; dialysiert worden und ist in eine Hydroxylapatit Hochleistungssäule (100 · 7,8 Millimeter, Bio-Rad) geladen worden, die mit einer Schutzsäule (50 · 4,0 Millimeter, Bio-Rad) ausgerüstet ist. Die Säule ist mit 10 mM Phosphat, bei einem pH-Wert von 6,8, 0,01 mM CaCl&sub2; ins Gleichgewicht gebracht worden und dann mit einer Steigung von 10-300 mM Phosphat, bei einem pH-Wert von 6,8, 0,01 mM CaCl&sub2; mit einer Flussrate von 0,5 ml/min eluiert worden. Die Anteile mit einer hohen Konzentration von L-TGF-Beta1 sind zusammengeführt worden, auf 100 ul mit einem Centricon 10 Microconcentrator (Amicon Copr.) konzentriert worden, und in einer Superose 6 Säule (HR 10/30, Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) eingesetzt worden. Die Säule wurde mit 500 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, bei einem pH-Wert von 7,4 ins Gleichgewicht gebracht und ist mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml/min eluiert worden. Die Anteile, die L-TGF-Beta1 enthalten, sind gesammelt worden und sind in einem gleichen Volumen von 2,8 M Ammoniumsulfat (HPLC-Qualität, Bio-Rad), 100 mM Phosphat, bei einem pH-Wert von 6,8 gemischt worden und in einer alkyl-Superose HR 5/5 Säule angewendet worden (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.), die in einem 1,4 M Ammoniumsulfat in Phosphatpuffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Die Säule wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml/min mit einer Steigung von 1,4-0 M Ammoniumsulfat in 100 mM Phosphat bei einem pH-Wert von 6,8 eluiert.
- Dieses Protokoll erbrachte einen Komplex, der das TGF-Beta1 bindende Protein sowie TGF-Beta1 enthält. Die Aktivität wurde mit einem [³H] - Thymidin Incorporation Assay gemessen, wie er von Miyazono et al. in J. Biol. Chem. Band 263(13), Seiten 6407- 6415 (1988) beschrieben worden ist.
- Der Proteinkomplex, der in Beispiel 1 erhalten worden ist, wurde dann benutzt, um hieraus reines TGF-Beta1-BP zu isolieren. Es ist festgestellt worden, dass freies TGF-Beta1-BP sofort eluiert, nachdem der grosse L-TGF-Beta1 Komplex aus der Alkyl- Superose Säule eluiert. Dieses freie TGF-Beta1-BP wurde dann weiter behandelt, um es zu reinigen und seine Aminosäuresequenz festzustellen.
- Ungefähr 75 Mikrogramm Anteile an reinem TGF-Beta1-BP sind auf einer C4 schmalbohrigen gegenphasischen Säule (Brownlee, Aquapore BU-300, 2.1 · 30 Millimeter) entsalzt und eluiert worden in 0,1% Trifluor Essigsäure (TFA) mit einem Gradienten des Acetonitrils. Das Material wurde dann in einem Speedvac Konzentrator getrocknet und wiederum aufgelöst in 200 Mikroliter von 6 M Guanidin-HCl, 0.25 M Tris-HCl, bei einem pH-Wert von 8,5, 1 mM EDTA, welches 100 Mikrogramm Dithiothreitol enthält. Die Lösung ist mit N&sub2; über 20 Sekunden gewaschen worden und ist dann bei Raumtemperatur über 3 Stunden lang gehalten worden, wonach 2 Mikroliter des 4-Vinyl-Pyridins hinzugefügt worden sind. Nach einer weiteren Inkubation über 3 Stunden bei Raumtemperatur ist die Probe durch Chromatographie in der C4 Säule entsalzt worden, wie dies oben beschrieben worden ist. Das flüchtige Lösungsmittel ist verdunstet worden und TGF-Beta1-BP wurde dann bei 37 Grad Celsius 14 Stunden lang mit TPCK-Trypsin (Sigma, St. Louis, MO) bei einem Substrat zu Enzymverhältnis von 50 : 1 (w/w) in 200 Mikroliter des 0.1 M Ammoniumbicarbonats, das 2 M Harnstoff enthält, versetzt. Die Trypsin-Fragmente wurden sofort in einer schmalbohrigen C4 gegenphasischen HPLC-Säule geladen, die mit einem linearen Gradienten des Acetonitrils in 0,1% TFA eluiert worden ist. Nicht homogene Peptide wurden auf der HPLC-, schmalbohrigen, gegenphasischen Säule unter unterschiedlichen Bedingungen wieder laufen gelassen. Die Säulentemperatur wurde bei 35 Grad Celsius gehalten, die Strömungsgeschwindigkeit betrug 100 Mikroliter je Minute und der Abfluss ist bei 220 nm überwacht worden. Anteile wurden manuell in Polypropylenröhrchen gesammelt. Peptide wurden auch von TGF- Beta1-BP isoliert, das mit Staphylokokken V8 Protease durch ähnliche Methoden fragmentiert wurde (Boehringer Mannheim Biochemica, BRD). Die Aminosäuresequenz der Peptide wurde mittels eines automatisierten Gasphasen Sequenzierers (Applied Biosystems Protein Sequencer, Modell 470A, mit einem Online-PTH- Analysator, Modell 120A) festgestellt.
- Die Analyse der Peptidfragmente mit abgeleiteten Aminosäuresequenzen ist in der Fig. 1 dargestellt.
- Im Sequenzprotokoll wurden das Trypsin und die Staphylokokken V8 Protease eingesetzt, weil Versuche, die N-endständige Aminosäuresequenz festzustellen, anzeigten, dass der N- endständige Abschluss geblockt wird. Wie in der Fig. 2 gezeigt, sind 27 Peptide sequenziert worden. Ziemlich überraschend zeigten 22 von diesen Ähnlichkeiten zu dem EGF-Gebiet. Zusätzlich enthielten mehrere die bekannte Übereinstimmungssequenz für Beta-Hydroxylierung der Residuen von Asparagin-Säure, die in vielen vom Vitamin K abhängigen Proteinen gefunden worden sind, die in der Blutkoagulation einbezogen sind (siehe hier Drakenberg et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 80, Seiten 1802-1806 (1983)). Resultierend aus dieser Beobachtung sind die Fragmente weiter analysiert worden, um festzustellen, ob sie diese ungewöhnlichen Nach- Translationalen Aminosäuren enthielten. Das gegenphasische Chromatogramm des Zyklus 1 der Sequenzermittlung des Peptidfragments Nummer 5 zeigte keine Spitzen, die Derivaten des Phenylthiohydantoin (PTH) der allgemeinen Aminosäuren entsprechen würden, was in der Fig. 2(b) und 2(c) gesehen werden kann. Eine besondere doppelte Spitze wurde früh im Chromatogramm gefunden, und diese coelutierte genau mit dem PTH-Derivat des hydroxylierten Asparagins, das als Standard laufen gelassen worden war. Dieses ist zu sehen, indem man die Fig. 2a und 2b vergleicht. Ein ähnliches Muster, beobachtet in Zyklus 5 der V8 Peptide 2 und 3, führt zu dem Schluss, dass das TGF-Beta1-BP hydroxylierte Asparagin-Residuen enthält.
- Nach Isolierung und Reinigung des TGF-Beta1-BP wurde cDNS erhalten, das für dieses Molekül exprimiert oder kodiert.
- Für das Sieben einer cDNS-Bibliothek wurde eine 24 Aminosäure- Peptid-Sequenz (Fig. 1; Trypsin-Fragment Nr. 11 und V8-Fragment Nummern 8 und 9, beginnend mit der Sequenz ECYY und endend mit TKQE) für die Vorbereitung einer Probe gewählt, indem PCR in Übereinstimmung mit Lee et al. in Science, Band 239, Seiten 1288-1291 (1988) verwendet worden war. Kurz, es wurde PCR mit dem ersten Strang von cDNS durchgeführt, der aus menschlichen Fibroblasten AG1518 (Human Genetic Mutant Cell Repositoty, Camden, NJ) und aus Taq Polymerase (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) hergestellt worden ist. Nach 30 Zyklen PCR, wurde die DNS auf einem 2,5% Agarose Gel getrennt; das Material von ungefähr 50-110 bp wurde für einen zweiten Umlauf der PCR-Verstärkung eingesetzt. Ein Fragment der erwarteten Grösse von 86 bp (72 bp und hinzugefügte Beschränkungsorte) wurde dann nach Trennung auf einem 2,5% Agarose Gel sichtbar gemacht und durch Electroelution wiedergewonnen. Wiedergewonnene DNS wurde mit Vektoren M13 für die Sequenzanalyse verbunden, und die erhaltene Sequenz wurde für das 24 Aminosäurepeptid kodierend aufgezeigt, das als Schablone benutzt wurde.
- Eine menschliche Vorhaut Fibroblast lambda-gt10 cDNS Bibliothek (Claesson-Welsh et al.) in Proc. Natl. Acad. Sci., Band 86, Seiten 4917-4921 (1989) ist mit der PCR-Probe gesiebt worden, die durch das Multiprime DNS Markierungssystem (Amersham, Grossbritannien) markiert worden ist. Die Hybridisierung der Nitrozellulose-Replica-Filterpapiere wurde durchgeführt in 40% Formamid, in 5-fachem SSC (1x SSC enthält 15 mM Natriumcitrat und 150 mM NaCl mit einem pH-Wert von 7,4), 5 facher Denhardt Lösung, 0,1% SDS und 50 Mikrogramm/ml Lachssamenzellen-cDna bei 37 Grad Celsius über die Nacht mit ungefähr 500.000 cpm der ³²P markierten Probe/ml der Hybridisierungslösung. Die Filter wurden in 2 facher SSC, 0,1% SDS bei 37 Grad Celsius, dreimal für 20 Minuten gewaschen, getrocknet und Fuji-Röntgenstrahlfilmen ausgesetzt. Ungefähr 10&sup7; Bakteriophagen Plättchen wurden gescreent und erbrachten 6 positive Klone. Der grösste markierte Klon war 5,1 Kilobasenpaare lang, ist mit BPA 13 bezeichnet worden und wurde gereinigt nach Maniatis et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor) und wurde sequenziert nach Sanger et al. in Proc. Natl. Acad. Sci., Band 74, Seiten 5463-5467 (1977) auf beiden Faserenden mit Sequenase (United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio), nachdem er in pUC19 subgeklont worden ist, wie dies von Yannisch-Perron et al. in Gene, Band 33, Seiten 103-119 (1985) beschrieben worden ist. Die Sequenz ist in Fig. 4b, zusammen mit einer abgeleiteten Aminosäuresequenz, dargestellt.
- Vollständige Boten-cRNS ("mRNS") wurde aus menschlichen Fibroblasten (AG1518) gezüchtet, indem man die Guanidium Schwefelcyanat Methode von Chirgwin et al. aus Biochemistry, Band 18, Seiten 5294-5299 (1979) verwendete. mRNS wurde ausgewählt, indem man oligo-dT-Zellulose (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Uppsala, Schweden) entsprechend obigem Zitat von Maniatis et al. verwendete.
- Für mRNS-Identifikation (Northern Blotting Analyse) (2,5 Mikrogramm) wurde bei 55 Grad Celsius für 15 Minuten mit Formaldehyd und Formamid denaturiert, auf einem 1% Agarose Gel in Anwesenheit des Formaldehyds der Electrophorese unterworfen und auf Nitrozellulosefilter übertragen. Die Hybridisierung wurde in 50% Formamid, 5 facher SSC 5 facher Denhardt Lösung, 0,1% SDS, 50 mM Natriumphosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 6,5 und mit 0,1 mg/ml Lachssamenzellen-cDNA bei 37 Grad Celsius über Nacht durchgeführt, indem man ein ³²P-markiertes Fragment pVU II (BP Nr. 2900-3834 von BPA13) als Probe verwendete. Das Filterpapier wurde 3mal für 30 Minuten in 0,1 facher SSC, 0,1% SDS bei 55 Grad Celsius gewaschen, getrocknet und einem Amersham Hyperfilm MP ausgesetzt.
- Wie in Fig. 3 dargestellt, wenn BPA 13 als Probe verwendet worden ist, sind zwei Bänder von 7 und 5,2 kilobases in der Länge erhalten worden. Aus diesen Daten wird gefolgert, dass BPA 13 in der Länge dem kürzeren der zwei mRNS-Arten ähnlich ist.
- Die Nukleotidsequenz von BPA 13 wurde nach den Methoden abgeleitet, die am Ende von Beispiel 3 oben festgelegt worden sind.
- Diese Methoden zeigten, dass BPA 13 5089 bp in der Länge ist und aus einem offenen Lesegerüst von 4182 bp besteht, begrenzt durch eine unübersetzte Sequenz von 90 bp in dem 5'Ende, 803 pb in dem 3'Ende und 14 bp von EcoRI Adaptersequenzen (Fig. 4), wobei die 3' unübersetzte Sequenz ein Polyadenylisierungs Signal, AATAAA umfasst, aber das Poly-A Endstück fehlte. Zwei ATTTA-Sequenzen, die in Instabilität und schneller Veränderung der entsprechenden mRNS-Moleküle impliziert sind (in Shaw und Kamen, Cell, Band 46, Seiten 659-667), wurden gefunden. Im 5' Teil des offenen Lesegerüstes waren zwei mögliche initialisierende Methionin Codons anwesend. Das erste ATG folgte den Regeln für die translatorische Initiierung, die von Kozak in Cell, Band 44, Seiten 283-292 (1986) beschrieben worden ist, aber die zweite folgte diesen nicht (Fig. 4b). Es scheint so, dass die Übersetzung am ersten ATG initialisiert wird. Die abgeleitete Aminosäuresequenz sagt voraus, dass TGF-Beta1-BP 1394 Aminosäuren beginnend mit einer hydrophoben Führersequenz enthält. Die Signalsequenz ist vermutlich zwischen Aminosäuren 20 und 21 gespalten, die einen bevorzugten Ort entsprechend den Vorhersagen von Heine in J. Mol. Biol., Band 173, Seiten 243-251 (1984) ergeben. Der errechnete Mr des translatorischen Primärproduktes von TGF-Beta1-BP ohne Signalsequenz ist ungefähr 151.000.
- Die Fig. 4(a) und 4(b) geben mehr Informationen betreffend diese cDNS-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von TGF- Beta1-BP. Insbesondere wird die Struktur des cDNS-Klons BPA 13 schematisch in (A) umrissen mit seinen übersetzten ( ) und nicht übersetzten (-) Bereichen. Die Lokalisation der Probe, die für das Screenen der cDNS-Bibliothek benutzt wird, wird auch mit ( ) angezeigt.
- Die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von BPA13 ist in Fig. 4b dargestellt. Nukleotide und abgeleitete Aminosäuren werden rechts numeriert; die Aminosäuren werden beginnend mit dem vorgeschlagenen initialisierenden Methioninresiduum numeriert und der mutmassliche N-endständige Abschluss des fertigen Proteins wird durch einen Pfeilkopf ( ) angezeigt. Mögliche N-Glycosylationsorte sind mit Vollinien überzeichnet und eine RGD-Sequenz ist mit einer unterbrochenen Linie dargestellt. Zwei Endcodons in der 5' nicht übersetzten Sequenz und der Endcodon, der das offene Lesegerüst beendet, werden mit (*) gekennzeichnet. In dem 3' nicht übersetzten Bereich werden zwei ATTTA-Motive unterstrichen und ein Poly A zusätzliches Signal (AATAAA) wird mit zwei Linien angezeigt. Die EcoRI-Adaptersequenz ist von einem Kasten umgeben geschachtelt.
- Weitere Studien wurden auf dem isolierten TGF-Beta1-BP Molekül durchgeführt, sobald einmal die Aminosäuresequenz seiner Fragmente und die vorausgesagte Aminosäuresequenz gefunden worden sind.
- Die bemerkenswerteste Eigenschaft der TGF-Beta1-BP Sequenz ist, dass 64 Prozent von ihr aus Wiederholungen der Sequenz besteht, die reich in den Cysteinresiduen ist; es gibt 16 EGF-ähnliche Wiederholungen (Fig. 5a) und zusätzlich sind 3 Wiederholungen eines ungefähr 70 Aminosäure langen Motivs, das 8 Cysteinresiduen enthält, in der Datenbank (Genebank Nr. 60, Protein-Identifikations-Ressource Nr. 21) nicht in irgendeiner anderen Sequenz gefunden worden (Fig. 5b). Die zwei Arten der Wiederholung der Sequenzen, die entfernt miteinander in Verbindung zu stehen scheinen, insbesondere in dem Bereich mitten in der erneuten Wiederholung, die in den Cystein- und Glycin-Residuen reich ist, wird auch in EGF gefunden. Die 16 EGF-ähnlichen Wiederholungen waren zueinander ähnlicher als zu anderen bekannten EGF-ähnlichen Wiederholungssequenzen (siehe Appella et al., 1988, für eine Zusammenfassung der EGF-ähnlichen Wiederholungen), und bei fünfzehn von ihnen wurde gefunden, dass die Übereinstimmungssequenz für Beta-Hydroxylierung der Asparaginresiduen enthalten ist (Stenflo et al. in Proc. Natl. Acad. USA, in Band 84, Seiten 368-372 (1978) (Fig. 5a)). Das Aminosäure-Sequenzieren des Plättchen TGF-Beta1-BP führte zur Identifizierung der Betahydroxylierten Asparaginresiduen in Wiederholungen 4 und 8 (Fig. 5a). Bei der EGF-ähnlichen Wiederholung in Nr. 9 wurde gefunden, dass sie eine RGD-Sequenz enthält; bei dieser Sequenz in den Matrixproteinen ist gefunden worden, dass sie Interaktionen mit Zellenoberflächen Rezeptoren ausgleicht (Ruoslahti et al. in Science, Band 288, Seiten 491- 497 (1978). Bei einem der an Cystein-reichen Motive (Fig. 5B, Wiederholung A) wurde gefunden, dass es eine Sequenz von 8 Aminosäuren enthält, die zu einer Sequenz in der Kette B2 von Laminin identisch ist (Sasaki et al. in J. Biol. Chem., Band 262, Seiten 17111-17117 (1987)). Die zu 36% nicht wiederholende Sequenz von TGF-Beta1-BP zeigte keine Ähnlichkeit zu anderen bekannten Sequenzen.
- Eine Gesamtmenge von 322 Aminosäuren wurde identifiziert, indem Peptide von menschlichem Plättchen TGF-Beta1-BP sequenziert worden sind; die erhaltene cDNS-Sequenz brachte die Proteinsequenz in jedem dieser Proteine zusammen. Von den 7 möglichen N-Glycosylisierungsorten in der Proteinsequenz, die vom cDNS abgeleitet wurde, wurde der grösste Teil des Carboxyendtsändigen Abschlusses durch die sequentierten Peptide abgedeckt (Fig. 5c). Da keine Aminosäure dieser Position nach dem Sequenzieren der entsprechenden Trypsin- und V8-Peptiden zugewiesen werden konnte (Fig. 1; Peptide Nr. 11 bzw. 8 bzw. 9), ist dieses Asparaginresiduum vermutlich im reifen Protein glykosyliert. Wie in Fig. 5c veranschaulicht, werden die Sequenzen aller Peptide, die vom Plättchen TGF-Beta1-BP abgeleitet worden sind, in den Carboxy-endständigen 60% der Fibroplasten-Sequenz auftreten. Dieses Ergebnis ist mit dem Unterschied bezüglich der Grösse zwischen dem Plättchen (125-160 kDa) und den 170-190 kba Proteinen der Fibroblasten übereinstimmend, wie unten behandelt werden wird.
- Die Ausrichtung der EGF-ähnlichen Wiederholungssequenzen von TGF-Beta1-BP aus menschlichen Fibroblasten wird in einem gewissen Detail in der Fig. 5 gezeigt. Die Wiederholungssequenzen werden fortlaufend vom N-endständigen Ende aus numeriert (nach links); die Anzahl der Aminosäuren in den TGF-Beta1-BP-Sequenzen werden auch dargestellt (rechts). Aminosäureresiduen, die in > 12 der 16 Wiederholungssequenzen vorhanden sind, werden als Übereinstimmungssequenz gezeigt. Asparaginresiduen, die in der Plättchenform von TGF-Beta1-BP Beta-hydroxyliert gefunden worden sind, werden unterstrichen, sowie eine RGD-Sequenz. Zum Vergleich seien angeführt: EGF- ähnliche Sequenzen menschlichen Proteins S (Aminosäuren 116-159 im Protein), menschliches Uromodulin (Aminosäuren 84-125 im Protein) und menschliches EGF.
- Eine Ausrichtung eines zweiten, vorher unbekannten Typs der Wiederholungssequenz in TGF-Beta1-BP ist in Fig. 5(b) gezeigt. Die Wiederholungen werden durch Buchstaben (links) angezeigt und die Zahlen den Aminosäuren in den TGF-Beta1-BP-Sequenzen werden (rechts) dargestellt. Die Aminosäure-Residuen, die in den drei Wiederholungen identisch sind, werden als Übereinstimmungs sequenz gezeigt. Eine acht Aminosäure umfassende Aminosäurensequenz, in der Wiederholung a, die identisch ist zu einer Sequenz im Laminin B2, ist unterstrichen.
- Eine schematische Darstellung von TGF-Beta1-BP aus menschlichen Fibroblasten wird in Fig. 5(c) dargestellt, Signalsequenz ( ) 16 EGF-ähnliche Wiederholungen ( ), 3 Wiederholungssequenzen einer anderen Art ( ) und 7 mögliche Arten von N- Glycosylisierungen ( ) sind angezeigt. Die Wiederholungssequenzen werden mit Zahlen und Zeichen gekennzeichnet (siehe Fig. 5a und b). Die Lokalisierung der Aminosäuresequenzen der Fragmente der Protease von Trypsin ( ) und von V8 Protease ( ) von TGF-Beta1-B, die von den menschlichen Plättchen gereinigt worden sind, sind dargestellt.
- Experimente sind durchgeführt worden, um den Übergangsausdruck von TGF-Beta1-BP in den eukaryotischen Zellen zu studieren. Um dies zu tun, wurde ein TGF-Beta1-BP cDNS (bp 3-4943), das den übersetzten Teil enthalten hat, in den auf SV40 basierenden Ausdruck Vektor pSV7d geklont, der von Truett et al. in DNA, Band 4, Seiten 333-349 (1985) beschrieben worden ist. Für den Übergangsausdruck ist dieses Konstrukt in COS-Zellen durch das Kalziumphosphat Ausfällungsverfahren nach Wigler et al. in Cell, Band 16, Seiten 777-785 (1979) transfektiert worden. Transfektierte COS-Zellen sind zwei Tage nach der Transfektion für den Ausdruck von TGF-Beta1-BP analysiert worden.
- Die COS-1 Zellen (American Type Culture Collection) und die menschlichen Fibroblasten (AG1518) und die COS-1 Zellen, die durch TGF-Beta1-BP cDNS transfektiert worden sind, sind in Dulbeccos geänderten Eagle's Medium (DMEM) mit 10% bovinen Föten (FBS, Flow Laboratories, Irvine, Schottland), 100 Masseinheiten Penicillin und 50 Mikrogramm Streptomycin pro ml bei 37 Grad Celsius in einem Brutkasten mit 5% CO2 gezüchtet worden.
- Um das Messen des transienten Exprimierens des Proteins zu erleichtern, wurden Zellen in 75 oder 175 cm² Gewebekulturflaschen mit 0,2 mCi ³&sup5;S-Methionin und ³&sup5;S-Cystein (Amersham, Grossbritannien) pro ml im Methionin und in Cysteinfreiem DMEM (3 oder 6 ml) mit 10% FBS bei 37 Grad Celsius für 4 Stunden lang markiert. Nach 4 Stunden des Markierens wurde das Medium gesammelt und Zellen wurden dreimal durch eiskalt Phosphat gepuffertes Salz (PBS) gewaschen. Zellen sind abgetrennt und lysiert worden, indem 1 oder 2 ml von 0,5% Triton X-100, 0,5% Desoxycholat, 20 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% Trasylol (Bayer, Leverkusen, BRD) und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma, St. Louis, MO) hinzugefügt wurde. Lysierte Zellen sind bei 4 Grad Celsius für 15 Minuten inkubiert und bei 10,000fachem g bei 4 Grad Celsius für 30 Minuten zentrifugiert worden. Das Medium und die aus Flüssigkeitsüberstand gebildeten lysierten Zellen sind mit nicht-immunem Kaninchenserum und mit Hitze abgetöteten, Formalin-fixiertem Staphylokokken Bakterium aureus Cowan 1 vorgeklärt worden. 10 Mikroliter des Kaninchenantiserums gegen gereinigtes TGF-Beta1-BP von den menschlichen Plättchen (Ab39) oder 10 Mikroliter des Ab39 plus 1 Mikrogramm TGF-Beta1-BP sind zu 1 ml von vorgeklärten Proben hinzugefügt und unter dem leichten Schütteln bei 4 Grad Celsius 14 Stunden lang inkubiert worden. Protein A-Sepharose (Pharmacia, Biotechnology, Uppsala, Schweden) wurde benutzt, um immune Komplexe auszufällen. Die Perlen der Proteins A-Sepharose wurden dreimal mit 1% Triton X- 100, 1% Desoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl, bei einem pH- Wert von 7,5, 150 mM NaCl und 10 mM EDTA, einmal mit 1% Triton X-100, 0, 5 M NaCl und 20 mM Tris-HCl, bei einem pH-Wert von 7,5 und einmal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Immunkomplexe wurden von den Perlen eluiert, indem man für S Minuten im SDS- Probenpuffer kochte, der 4% SDS, 0,2 M Tris-HCl, bei einem pH- Wert von 8, 8, 0,5 M Saccharose, 0,01% Bromophenolblau und 2% Beta-Merkaptoethanol enthielt und durch SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese mit 5-10% Steigungsplattengelen (Blobel und Dobberstein, 1975) analysiert worden ist. Gele von Immunoausfällungen wurden für die Fluorographie behandelt, indem sie in Amplify (Amersham, Grossbritannien) getränkt worden waren, getrocknet und Amersham Hyperfilm MP ausgesetzt worden sind. Gele von gereinigtem TGF-Beta1-BP aus menschlichen Plättchen wurden elektrophoretisch auf Nitrozellulosepapiere übertragen und dem Immunoblotting unterworfen nach Terracio et al. in J. Cell. Biol., Band 107, Seiten 1947-1957 (1988), wobei ein Antikörper gegen ein synthetisches Peptid des Plättchens TGF-Beta1-BP (Ab37) verwendet worden ist; Aminosäuren 1111-1122 von TGF-Beta1-BP; gebundene Antikörper sind mit ¹²&sup5;I-Protein A gefolgt von Autoradiographie sichtbar gemacht worden.
- Proben, die mit Ab39 von ³&sup5;S-Methionin und ³&sup5;S-Cystein markierten COS Zellen immunoausgefällt worden sind, sind mit TGF-Beta1-BP cDNS transfektiert worden und wurden inkubiert mit 1 mU Endo H (Miles Laboratories Inc. Naperville, IL, USA) in einem Puffer, der 0,1 M Tris-HCl, bei einem pH-Wert von 6,8, 0,1% SDS und 2% Beta-Merkaptoethanol bei 3 V Grad Celsius für 6 Stunden. Proben wurden durch SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese und Fluorographie analysiert.
- TGF-Beta1 (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN) ist mit 125i (Amersham, Grossbritannien) durch das Chloramin-T-Verfahren zu einer spezifischen Aktivität von 80 uCl/ug markiert worden. TGF- Beta1-BP und der grosse latente TGF-Beta1 Komplex wurden von menschlichen Plättchen gereinigt (nach Miyazono et al. wie oben erwähnt) und durch Chromatographie auf Superose 6 in 500 mM NaCl, 10 mM 2-Hydroxyäthyl-Piperazin Äthansulfonat (Hepes) bei einem pH-Wert von 7,5 entsalzt. Ein Mikrogramm TGF-Beta1-BP oder 250 ng des grossen latenten TGF-Beta1 Komplexes ist mit 5 ng ¹²&sup5;I-TGF-Beta1 in 100-200 ul aus 128 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl&sub2;, 1, 2 mM MgSO&sub4; und 50 mM Hepes, bei einem pH-Wert von 7,4, bei 4 Grad Celsius 2 Stunden lang inkubiert. Die Vernetzung wurde durchgeführt durch Inkubation mit 0,25 mM abschliessender Konzentration von DSS (Pierce, Rockford, Illinois, USA), für 15 Minuten bei 20 Grad Celsius; die Reaktion wurde gelöscht, indem 20 mM abschliessender Konzentration des Tris-HCl-Puffers bei einem pH-Wert von 7,4 hinzugefügt worden ist. Proben wurden durch Ab39 und Protein A-Sepharose immunoausgefällt, eluiert durch 5 Minuten Kochen im SDS-Probenpuffer und analysiert durch SDS-Polyacrylamid Gel Electrophorese unter reduzierenden Bedingungen gefolgt von Autoradiographie.
- Die Fähigkeit von TGF-Beta1-BP, das Binden von ¹²&sup5;I-TGF-Beta1 zu den Zellen zu hemmen, wurde unter Einsatz von NRK-Zellen (NRK 49F, American Type Culture Collection) analysiert, die in 24 mit Gelatine vorbeschichteten Probenplatten (Costar, Badhoevedorp, Die Niederlande) eingesetzt worden sind. Konfluente Zellkulturen sind für einen Tag Serum-frei gehalten worden und dann zweimal mit eiskaltem Bindepuffer gewaschen worden, der 25 mM Hepes, bei einem pH-Wert von 7,4, 0,1% bovines Serumalbumin (BSA, fraction V, Boehringer Mannheim Biochemica, BRD) in PES enthalten hat, das 0,1 mg/ml CaCl&sub2; und 0,13 mg/ml MgCl&sub2; umfasst. Zellen sind dann mit 25 pM ¹²&sup5;I-TGF-Beta1 zusammen mit verschiedenen Mengen von unmarkierten TGF-Beta1, oder entsalztem TGF-Beta1-BP, in 0,2 ml Bindepuffer über 3 Stunden bei 4 Grad Celsius inkubiert worden. Nach dreimaligem Waschen mit dem eiskalten Bindepuffer, wurde die Zell-gebundene Radioaktivität für 20 Minuten bei 4 Grad Celsius mit 0,5 ml 1% Triton X-100, 10% Glycerin, 0,01% BSA, 20 mM Hepes, bei einem pH-Wert von 7, 4 gelöst und in einem γ-Zähler bestimmt.
- Die oben beschriebene Immunoausfällungsstudie, die die transfektierten COS-Zellen einsetzt, deckte ein SDS-Gel Elektrophoreseband von ungefähr 170-190 Kilodaltons im Zelllysat auf und 190 kDa in den konditionierten Medien. Diese Bestandteile waren ähnlich zu der Grösse des TGF-Beta1-BP, gereinigt von den Fibroblasten wie oben beschrieben, und bildlich dargestellt in den Figs. 6(a) und 6(c). Demgegenüber zeigte Plättchen TGF-Beta1-BP, parallel dazu nach dem Immunoblottingverfahren analysiert, eine Art von 125-160 kDa, wie dies in Fig. 6(c) dargestellt ist. Die untransfektierten COS-Zellen enthielten keine Bestandteile, die mit den Antiseren immunoreaktiv sind.
- Als TGF-Beta1-BP transfektierte COS-Zellen für eine kürzere Zeit (15 Minuten) mit ³&sup5;S-Methionin und ³&sup5;S-Cystein markiert worden sind, ist ein Band von 170 kDa aus dem Zelllysat (Fig. 6b) immunoausgefällt worden. Dieses Band verschob sich zu 160 kDa nach dem Versetzen mit Endoglycosidase H, was anzeigte, dass es eine Vorläuferform darstellt, die unreife N-gebundene Kohlenhydratgruppen enthält. Die Verschiebung in der Grösse des Vorläufers nach der Behandlung mit Endoglycosidase H ist übereinstimmend mit dem Vorhandensein der möglichen N- Glycosylationsorte in der Sequenz, die vom cDNS-Klon abgeleitet wird (Fig. 5c). Ausserdem ist die Grösse des deglycosylatierten Proteins (160 kDa) nah an der vorausgesagten Grösse des Kernproteins (151 kDa). Wie von einem reifen Glucoprotein erwartet, verschob sich die 170-190 kDa Form, die nach einer längeren markierenden Zeitdauer festgestellt werden kann, nicht in der Grösse nach der Endoglycosidase H Behandlung.
- Der Rezeptor der Art III für TGF-Beta (Betaglycan) tritt in einer löslichen Variante auf (Andres et al. in J. Cell. Biol., Band 109, Seiten 3137-3146 (1989)). Einige Anstrengungen wurden unternommen, um der Möglichkeit nachzuforschen, dass TGF-Beta1- BP der löslichen Variante dieses Rezeptors ähnlich ist.
- Der Rezeptor der Art III ist ein Proteoglycan-ähnliches Molekül, das Heparinsulfat- und Chondroitinsulfat-Polysaccharidketten enthält (Cheifetz et al. wie oben erwähnt, Segarini und Seyedin wie oben erwähnt). Jedoch erzeugte die Inkubation von TGF-Beta1- BP, das aus übergehenden exprimierenden COS-Zellen mit Heparinase, Heparitinase aus Chondroitinase-ABC immunoausfällte, keine Verschiebung in der Mobilität nach SDS-Gel Elektrophorese, wie dies erwartet werden würde, wenn es Polysaccharidketten enthalten hätte.
- Um zu erforschen, ob TGF-Beta1-BP TGF-Beta1 direkt bindet, wurden Plättchen TGF-Beta1-BP oder der zur Kontrolle eingesetzte grosse latente TGF-Beta1 Komplex mit ¹²&sup5;I-TGF-Beta1 inkubiert; nach 2 Stunden bei 4 Grad Celsius wurde ein kovalenter Quervernetzer, Disuccinimidylsuberat (DSS), hinzugefügt. Nach Immunoausfällung mit einem TGF-Beta1-BP Antikörper, wurden Proben durch SDS-Gel Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen und der Autoradiographie analysiert (Fig. 7). Es wurde kein Binden von ¹²&sup5;I-TGF-Beta1 mit der freien Form des TGF- Beta1-BP festgestellt. Demgegenüber wurde ¹²&sup5;I-TGF-Beta1 mit dem grossen latenten Komplex TGF-Beta1 quer verbunden; Bänder von 50 kDa, von 90-100 kDa, von 150-160 kDa und von 230-260 kDa wurden gefunden (Fig. 7). Die Grössen dieser Bestandteile sind die erwarteten Grössen von ¹²&sup5;I-TGF-Beta1 (12,5 kDa unter reduzierenden Bedingungen), das kovalent verbunden ist mit einer Untereinheit des N-endständigen Propart (40 kDa), einem Dimer des Propart (80 kDa), TGF-Beta1-BP (125-160 kDa) und allen dreien dieser Bestandteile (ungefähr 210 kDa) (nach Miyazono et al. wie oben erwähnt). Diese Daten legen nahe, dass in dem grossen latenten TGF-Beta1 Komplex, TGF-Beta1-BP nah an TGF- Beta1 angeordnet ist, aber dass TGF-Beta1-BP in der freien Form eine geringe oder keine Affinität für TGF-Beta1 aufweist. Wenn TGF-Beta1-BP beim Latenthalten von TGF-Beta1 eine Rolle spielte, würde erwartet werden, dass es die Bindung von TGF-Beta1 mit den Zelloberflächen-Rezeptoren behindern würde. Der Fähigkeit von TGF-Beta1-BP, die Bindung von ¹²&sup5;I-TGF-Beta1 zu den NRK-Zellen zu hemmen, wurde folglich nachgegangen. Wie in Fig. 8 gezeigt, hatte TGF-Beta1-BP keinen Effekt auf die Bindung von ¹²&sup5;I-TGF- Beta1, selbst bei sehr hohen Konzentrationen. Dieses ist mit der Schlussfolgerung übereinstimmend, dass TGF-Beta1-BP TGF-Beta1 nicht bindet und inaktiviert.
- Die vorangehenden Experimente zeigen, dass TGF-Beta1-BP hauptsächlich aus zwei sich wiederholenden Sequenzen besteht, d. h. die 16 EGF-ähnlichen Wiederholungen und die drei Wiederholungen eines vorher unbekannten Motivs. Beide Motive sind reich an Cystein und die häufigste Aminosäure des Proteins ist Cystein. Die beiden hierin studierten Typen, d. h. Plättchen und Fibroblast TGF-Beta1-BP unterscheiden sich deutlich in der Grösse, wie oben beschrieben. Alle Peptide, die im Plättchen Typ Protein auftreten, werden in den Cendständigen 60% der Fibroblastform lokalisiert, was zur Annahme führt, dass das TGF- Beta1-BP Gen ein differentielles Zerlegen oder eine Zellen spezifische Proteolyse durchmacht.
- Fibroblast TGF-Beta1-BP enthielt IS übereinstimmende Orte für Betahydroxylierung der Asparagin-Säure. Es wurde auch gezeigt, dass das Asparagin bei zwei solchen Orten im Plättchen abgeleiteten Protein beta hydroxyliert war. Es ist möglich, dass die Betahydroxylierung der Aminosäuren eine Rolle in der Ca²&spplus; Bindung spielt, obgleich dies noch nicht experimentell gezeigt worden ist.
- Die bindenden Proteine, die hierin beschrieben worden sind, weisen auch eine sogenannte "RGD-"Sequenz auf. Diese Sequenzen sind impliziert bei dem Aktivieren von Proteinen, welche die Sequenz enthalten, um mit der Kategorie der Zellen Oberflächen Moleküle zu binden, die als "Integrins" bekannt sind. Siehe hierfür Hynes, Band 48, Seiten 549-554 (1987). Dieses Zitat schlägt vor, dass das TGF-Beta1 bindende Protein beim Binden an solche Integrins in oder auf der Zellenoberfläche impliziert sein kann.
- Die Experimente, die hierin beschrieben werden, schlagen vor, dass die DNS für das TGF-Beta1-BP auch in anderen hematopoietischen Zellen exprimiert werden kann, deren Wahl vom Fachmann getroffen werden kann.
- Die Bezeichnungen und Ausdrücke, die hier eingesetzt worden sind, sind als Bezeichnung der Beschreibung verwendet worden und nicht in beschränkender Absicht, und es besteht auch keine Absicht, in dem Gebrauch solcher Bezeichnungen und Ausdrücken irgendwelche Äquivalente dieser gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon auszuschliessen, wobei erkannt worden ist, dass verschiedene Änderungen innerhalb des durch die Ansprüche vorgegebenen Bereichs möglich sind.
Claims (9)
1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das TGF-Beta1-BP kodiert,
von dem die komplementäre Sequenz hybridisiert zu Nukleotiden
2900-3834 der Fig. 4b bei 0,1 · SSC, 0,1 Prozent SDS bei 55 Grad
Celsius.
2. Nukleotid nach Anspruch 1, bei dem das TGF-Beta1-BP aus
Fibroblasten erhalten wird.
3. Nukleotid nach Anspruch 2, enthaltend cDNS.
4. Nukleotid nach Anspruch 3, enthaltend die in Fig. 4b
bildlich dargestellte Sequenz.
5. Nukleotid nach Anspruch 1, welches in einem Vektor vorhanden
ist.
6. Nukleotid nach Anspruch 1, bei dem das TGF-Beta1-BP aus
Plättchen erhalten wird.
7. Nukleotid nach Anspruch 1, enthaltend mRNS.
8. Zellinie, die TGF-Beta1-BP herstellt, die eine Wirtszelle
enthält, die mit dem im wesentlichen reinen Nukleotid gemäss
einem der Ansprüche 1 bis 6 transformiert, bei der das besagte
Nukleotid heterolog in Bezug auf die Wirtszelle ist.
9. Verfahren des Transformierens eines Vektors, das das
Einsetzen des Nukleotids nach Anspruch 1 in den Vektor umfasst.
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