DE69130660T2

DE69130660T2 - Verfahren zur beschützung von pflanzen gegen pathogene

Info

Publication number: DE69130660T2
Application number: DE69130660T
Authority: DE
Inventors: Peter Jozef Gerard Marie Nl-3911 Xm Rhenen De Wit
Original assignee: Mogen International NV
Current assignee: Syngenta Mogen BV
Priority date: 1990-04-02
Filing date: 1991-03-27
Publication date: 1999-06-17
Anticipated expiration: 2011-03-28
Also published as: DK0474857T3; AU642252B2; US5866776A; IE911083A1; NL9000773A; EP0474857B1; ES2128318T3; IE990337A1; ATE174931T1; JPH05505110A; IL97736A; GR3029461T3; PT97230A; EP0474857A1; WO1991015585A1; EP0874055A2; IL97736A0; DE69130660D1; EP0874055A3; IE911110A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines von einem Pathogen abgeleiteten Auslöserpeptids, das eines aus einem Paar von Genprodukten eines pathogen-abgeleiteten Avirulenzgens und eines pflanzen-abgeleiteten Resistenzgens ist, zur Einführung von Pathogenresistenz in Pflanzen, indem eine Pflanze, die das besagte Resistenzgen enthält, mit einer Polynucleotidsequenz transformiert wird, die den besagten pathogen-abgeleiteten Auslöser codiert, worin die Expression sowohl des Auslöserpeptids wie auch des Produkts des Resistenzgens oder von einem von beiden durch einen pathogen-induzierbaren Promotor reguliert wird.
Im Verlauf der Evaluation haben sich viele Pilze und Bakterien, die pflanzenpathogen sind, auf eine einzige Wirtsart oder sogar auf eine Varietät der besagten Art spezialisiert. Es können also pathogene Arten gefunden werden, die nur bestimmten Kulturvarietäten des Wirts befallen, aber nicht andere Kulturvarietäten. In letzterem Fall sind die Kulturvarietäten mittels eines schnell induzierbaren Abwehrmechanismus resistent.
Um einen erfolgreichen Befall der Pflanze durchzuführen muss das Pathogen den vorhandenen Abwehrmechanismus der Pflanze umgehen, unterdrücken oder aufheben. Genetisch ausgedrückt können die spezifischen Interaktionen Rasse-Kulturvarietät mit einem Gen-für-Gen-Modell beschrieben werden, wobei ein Molekül eines Auslöserproteins (e), das durch ein Avirulenzgen (E) eines Pathogens codiert wird, mit einem Molekül eines Rezeptorproteins (r), das durch ein Pflanzen-Resistenzgen (R) codiert wird, interagiert und so den Abwehrmechanismus induziert, der oft phänotypisch als hypersensible Antwort (HR) sichtbar wird: Lokaler Tod einiger weniger Pflanzenzellen, der gleichzeitig das Pathogen zerstört (De Wit, 1986).
Die Genetik der Gen-für-Gen-Interaktion ist in der Literatur ausführlich beschrieben, insbesondere die Interaktionen zwischen pathogenen Pilzen und Pflanzen (I.R. Crute, 1985), aber es ist nur sehr wenig über die biochemischen und molekularen Mechanismen bekannt (De Wit, 1987, Collinge und Slusarenko, 1987).
Ein Pathogen, das das Avirulenzgen nicht aufweist oder ein Pathogen, in dem das Avirulenzgen nicht exprimiert wird, löst den Abwehrmechanismus des Wirts nicht aus und es kann daraufhin der erfolgreiche Befall erfolgen: In dem Fall ist die Wirtspflanze anfällig.
Es wurden verschiedene rassenspezifische Avirulenzgene aus verschiedenen pflanzenpathogenen Bakterien geklont, wobei virulente Rassen mit genomischen Klonen avirulenter Rassen transformiert wurden und anschliessend auf Pflanzengenotypen mit dem entsprechenden Resistenzgen auf Avirulenz getestet wurden (Staskawicz et al., '84, Staskawicz et al., '87, Shintaku M.W. et al., '89, Vivian et al. '80, Hitchin et al., '89). Dieses Verfahren der Isolierung bakterieller Avirulenzgene ist jedoch nicht auf Pilz-Avirulenzgene anwendbar, da der Wirkungsgrad der Transformation niedrig ist und geeignete Klonierungssysteme wie etwa Cosmid-Vektoren mit breitem Wirtsspektrum fehlen. Der einzige Pilz, bei dem ein wirksames Transformationssystem mit einem selbstreplizierenden Vektor erarbeitet wurde, ist Ustilago maydis (Leong, 1989).
Es wurde gefunden, dass Pflanzen ein breiter Schutz gegen Pathogene verliehen werden kann, indem eine Polynucleotidsequenz, die mindestens eine Sequenz eines Pathogen- Avirulenzgens (E) umfasst, das ein spezifisches Auslöseprotein-Molekül (e) oder eine Portion davon codiert, in das Genom einer Pflanze, die ein zugehöriges Resistenzgen (R) enthält, eingeführt wird, und Mittel zur Regulierung der Expression der besagten Gene dergestalt bereitgestellt werden, dass die gleichzeitige Expression nur am Infektionsort stattfindet und die Induktion der besagten gleichzeitigen Expression von einem weiten Spektrum von Pathogenen bewirkt wird.
Es ist möglich, die oben erwähnte Polynucleotidsequenz, die mindestens eine Sequenz eines Pathogen-Avirulenzgens (E) umfasst, in eine Pflanze einzuführen, die ein Resistenzgen (R) enthält, das mindestens am Infektionsort, mutmasslich sogar grundsätzlich in der ganzen Pflanze exprimiert wird. In diesem Fall muss das Avirulenzgen (E) durch eine Promotor reguliert werden, der durch das Pathogen induziert wird und die Expression nur am Infektionsort gestattet, um die Induzierung der hypersensiblen Antwort in der ganzen Pflanze zu vermeiden.
Die hypersensible Antwort darf nur durch das Pathogen oder durch einen aspezifischen, durch das Pathogen hergestellten Auslöser aktiviert werden. Die hypersensible Antwort darf nicht oder nur wenig durch andere äussere Einflüsse induziert werden und sollte auf ein den Infektionsort umgebendes Gebiet beschränkt sein. Ohne diese Einschränkungen würde die Aktivierung zur virtuellen Zerstörung der ganzen Pflanze führen.
Es ist auch möglich, ein Resistenzgen (R), das zum Avirulenzgen (E) gehört, in eine Pflanze einzuführen, die das zugehörige Resistenzgen (R) noch nicht enthält. Dies kann durch Züchtungs- oder Genmanipulierungsverfahren erreicht werden.
Im letzteren Fall ist es möglich, eine Polynucleotidsequenz, die mindestens eine Sequenz eines Resistenzgens (R) oder eine Portion davon umfasst, und einen Pflanzenpromotor (P) einzuführen, der durch ein weites Spektrum von Pathogenen dergestalt induziert wird, dass das Produkt des Resistenzgens (R) nur am Infektionsort exprimiert wird. In diesem Fall ist es sogar möglich, dass das Avirulenzgen (E) grundsätzlich in der ganzen Pflanze exprimiert wird. Es ist auch möglich, dass das Gen (E) und das Gen (R) durch identische Promotoren reguliert werden, vorausgesetzt, sie sind strikt am Infektionsort und nur durch ein Pathogen induzierbar.
Bei den oben erwähnten Ausführungsformen wird vom zu verwendenden pathogen-induzierbaren Promotor verlangt, dass:
a) er durch alle oder die meisten der Pathogene der Pflanze oder durch die aspezifischen, durch die besagten Pathogene gebildeten Auslöser induziert wird,
b) er fast nur durch die Pathogene und nicht oder nur wenig durch andere äussere Einflüsse induzierbar ist,
c) er die durch den Promotor gesteuerten Gene nur sehr lokal und niemals systemisch exprimieren kann.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das Gen (E) oder (R) gewebespezifisch sein und das andere Gen muss nur in Geweben, für die das erste Gen gewebespezifisch ist, am Infektionsort pathogen-induzierbar sein. In diesem Fall ist es beispielsweise möglich, ein Gen (R), das nur in den Wurzeln der Pflanze exprimiert wird, und ein Gen (E), das durch ein Pathogen in den Wurzeln lokal, aber in anderen Geweben grundsätzlich exprimiert wird, einzuführen, wodurch Schutz gegen Pathogene in den Wurzeln erzielt wird.
Das Avirulenzgen (E) kann von einem Pilz, einem Bakterium, einem Virus oder einer Nematode abgeleitet sein. Ein Beispiel für einen pflanzenpathogenen Pilz, von dem leicht ein Avirulenzgen abgeleitet werden kann, ist Cladosporium fulvum.
Es kann dasjenige Resistenzgen (R) verwendet werden, das zum Beispiel natürlicherweise in einer Pflanze vorhanden ist, die ein Mitglied der Familie der Solanaceae ist, wie etwa einer Pflanze der Art Lycopersicon esculentum. Es ist möglich, dieses Gen (R) durch Züchtung in ein anderes Mitglied der Familie der Solanaceae zu übertragen. Dieses besagte andere Mitglied kann entweder das straff regulierte Avirulenzgen (E) enthalten oder dieses besagte Avirulenzgen kann anschliessend über genetische Manipulationsverfahren in die Pflanze eingeführt werden. Das Resistenzgen (R) kann offensichtlich auch über genetische Manipulationsverfahren eingeführt werden.
Die Wahl der Kombination von Avirulenzgen (E) und Resistenzgen (R) sowie der in die Pflanze einzuführenden Promotoren, sei es durch Züchtung oder durch genetische Manipulationsverfahren, hängt von der zu schützenden Pflanzen sorte ab und ob das Resistenzgen (R) in der Pflanze natürlicherweise vorhanden ist.
Es sind im ganzen Pflanzenreich pathogen-induzierbare Promotoren bekannt die durch ein breites Spektrum von Pathogenen und durch unspezifische, von diesen Pathogenen gebildete Auslöser induziert werden. Es sind auch solche Pflanzenpromotoren bekannt, die nur sehr lokal und niemals systemisch exprimiert werden. Matton und Brisson (1989) beschreiben zum Beispiel die Nucleotidsequenz eines cDNA- Klons (pSTH-2), die mRNA-Sequenzen entspricht, die sich spezifisch in Kartoffeln nach der Auslösung mit unspezifischen Auslösern von P. infestans akkumulieren (Marineau et al., 1987), sowie einen eng verwandten Klonen, pSTH-21, der eine grosse Ähnlichkeit in der Aminosäuresequenz zu den cDNA-Klonen zeigt, die dem Auslöser und den Proteinen, die mit der durch das Pathogen induzierten Pathogenese zu tun haben, aus Erbsen (42%) (Fritensky et al., 1988) und Petersilie (37%) (Somsisch 1988) entsprechen. Matton und Brisson (1989) beschreiben auch die Akkumulation von mRNA's, die den besagten Klonen pSTH-2 und pSTH-21 entsprechen, in verschiedenen Tomatengeweben und in Tomatenblättern. Somsisch (1986) beschreibt, wie die de novo-Synthese von Proteinen, die mit der Pathogenese zu tun haben (PR), in kultivierten Petersiliezellen durch Behandlung mit einem Pilz-Auslöser erreicht werden kann. In diesem System geht der PR-Proteinsynthese die mRNA-Synthese voraus, die sich aus der schnellen und zeitlich begrenzten Aktivierung der entsprechenden Gene ergibt. Eine solche Aktivierung wird auch bei intakten Petersiliepflanzen nach einer Pilzinfektion beobachtet (Somsisch, 1988) und wird von einer massiven aber lokalen Akkumulation von mRNA rund um die Infektionsherde begleitet. Im allgemeinen werden die Gene, die mit der Synthese von Phytoalexinen zu tun haben, in Pflanzen durch verschiedene Typen von Pathogenen und ihre spezifischen Auslöser sehr lokal induziert. (Hahlbrock, H. und Scheel, D., 1989; Kuc, J. und Rush, J.S., 1985).
Eines der Verfahren, das zur Detektion eines Resistenzgens (R) aus einer Pflanze verwendet werden kann, wobei das Produkt (r) des besagten Gens eine Interaktion mit einem spezifischen Auslöser-Proteinmolekül (e) zeigt, das durch ein Pathogen-Avirulenzgen (E) codiert wird, kann wie folgt beschrieben werden: Bei diesem Verfahren werden ein spezifisches Auslöserprotein (e), ein Produkt (r) eines Resistenzgens und anschliessend ein Resistenzgen (R) mit der Hilfe des Produkts eines Avirulenzgens (E) isoliert. Dieses Verfahren kann im Prinzip zur Isolierung irgend eines Produkts (r) eines Resistenzgens und des codierenden Resistenzgens (R) verwendet werden, wenn das zugehörige Avirulenzgen (E) und sein Produkt (e) bekannt sind. Das Verfahren kann wie folgt dargestellt werden: eine cDNA-Bibliothek einer Pflanze, die das Resistenzgen (R) enthält, wird in einen Expressionsvektor eingefügt, wodurch das Produkt von (R), der Rezeptor (r), gebildet wird. Ein positiver Klon wird in der cDNA-Bibliothek durch Bindung eines spezifischen Auslöserproteins (e) an das Rezeptorprotein (r) detektiert. Die Bindung (Komplexierung von (e) an (r)) wird sichtbar gemacht, indem (e) mit einer detektierbaren Markierung versehen wird. Dieser positive cDNA-Klon enthält die codierende Sequenz für das Resistenzgen. Das intakte Gen (R) kann in der genomischen Bibliothek aus der Pflanze, die das Resistenzgen enthält, mit diesem cDNA-Klon detektiert werden. Mit der Hilfe der cDNA oder des genomischen Klons kann eine Pflanze, der das Resistenzgen fehlt, transformiert werden; positiven Transformanten werden auf Vor handensein des Resistenzgens gescreent, indem das geeignete Pathogen zugefügt (kontaminiert) wird. Das geklonte Gen (R) kann in Pflanzen entweder über genetische Manipulationsverfahren oder über Züchtung eingeführt werden.
Andererseits kann das Resistenzgen (R) mittels der veröffentlichten Verfahren des Transposon-Taggings, der Chromosomenwanderung und der genomischen Substitution (Dickinson, M.D. et al., 1991) kloniert werden.
Es ist höchst unwahrscheinlich, dass Pathogene eine Toleranz gegen eine Pflanze entwickeln werden, die beide Komponenten, d. h. das Gen (E) und das Gen (R) umfasst (das Zweikomponenten-Sensorsystem) und die über das erfindungsgemässe Verfahren erhalten wurde, weil zur Induktion der gleichzeitigen lokalen Expression des Avirulenzgens (E) und des Resistenzgens (R) aspezifisch induzierbare Pflanzenpromotoren verwendet werden, die durch alle Pathogene induzierbar sind. Es ist notwendig, dass mindestens einer der beiden Promotoren, entweder derjenige, der das Avirulenzgen (E) reguliert oder derjenige, der das Resistenzgen (R) reguliert, nur am Infektionsort induzierbar ist, um die Zerstörung praktisch der ganzen Pflanze zu verhindern, was offensichtlich unerwünscht ist.
Da das erfindungsgemässe Zweikomponenten-Sensorsystem mit jeder Kombination Avirulenzgen/Resistenzgen und in jeder Pflanze, in der das Avirulenzgen und das Resistenzgen exprimiert werden können, erhalten werden kann, ist es sehr breit gegen viele, wenn nicht alle Pathogene des Pflanzenreichs anwendbar.
Das Zweikomponenten-Sensorsystem ergibt eine ausgezeichnete Lösung zur Reduktion der Verwendung der gegenwärtig oft gegen Pathogene eingesetzten Pestizide. Auf längere Sicht wird es es ermöglichen, die Umwelt von einem grossen Teil dieser Agentien zu entlasten.
Als Beispiel wird eine Beschreibung einer Herstellung eines Zweikomponenten-Sensorsystems nach dem erfindungsgemässen Verfahren gegeben.

BEISPIEL

Es wird ein Avirulenzgen aus Cladosporium fulvum (d. h. das avr9-Avirulenzgen, das bisher in der Literatur als A9 bezeichnet wurde) als Avirulenzgen in Kombination mit dem zugehörigen Resistenzgen Cf9, das in einer Tomaten- Kulturvarietät natürlich vorhanden ist, verwendet. Dieses Zweikomponenten-Sensorsystem kann mindestens vervielfältigt werden, indem es in Varietäten der Gattung Lycopersicon und einem Teil der Familie der Solanaceae gezüchtet wird, und kann wahlweise über genetische Manipulationsverfahren in besagte Pflanzen oder in andere Familien eingeführt werden. Es wurden verschiedene in Pilzen codierte rassenspezifische Auslösermoleküle gefunden, die auf Tomaten-Kulturvarietäten, die das entsprechende Resistenzgen enthalten, Nekrosen hervorrufen (De Wit und Spikman 1982; De Wit et al., 1985). Ein solches rassenspezifisches Auslösermolekül, das Produkt des Avirulenzgens avr9, wurde bis zur Homogenität gereinigt. Das gereinigte Protein induzierte ein schnelle und lokale Nekrose bei der Injektion in Blättern von Tomaten- Genotypen, die das Resistenzgen Cf9 enthalten. Bei Genotypen, die andere Cf-Gene enthielten, geschah dies nicht. Die Aminosäuresequenz des gereinigten Auslösermoleküls wurde bestimmt (Scholtens-Toma und De Wit 1988). Das Auslösermolekül wurde bei allen kompatiblen Interaktionen zwischen Tomate und C. fulvum-ähnlichen Pilzrassen gebildet, die auf Cf9-Genotypen der Tomate avirulent sind, jedoch bei keiner Interaktion mit Pilzrassen, die auf Cf9-Genotypen virulent sind (Scholtens-Toma et al., 1989). Um die mRNA zu detektieren, die das nekroseinduziernde Protein, d. h. ein Auslöserprotein, codiert, wurden 4 Oligonucleotid-Testsequenzen synthetisiert, die von der Aminosäuresequenz (Fig. 1) abgeleitet sind. Die Oligonucleotide enthalten entweder Mischungen von Nucleotiden (wie etwa in der Testsequenz B) oder Inosine (wie etwa in Testsequenz D) oder eine Kombination von beiden (wie etwa in den Testsequenzen A und C). Alle vier Oligonucleotide wurden am 5'-Ende markiert und auf identische Northern Blots, die identische Mengen von Poly(A)-RNA enthielten, die aus gesunden Tomatenpflanzen, von in vitro gezüchtetem C. fulvum und von 3 verschiedenen kompatiblen Interaktionen Tomate-C. fulvum abgeleitet waren, hybridisiert. Fig. 2 zeigt, dass Testsequenz B spezifisch auf eine mRNA aus ungefähr 600 Nucleotiden hybridisierte, die in zwei kompatiblen Interaktionen vorhanden war, nämlich: Kulturvarietät Cf4/Rasse 4 (Spur 3) und Kulturvarietät Cf5-Rasse 5 (Spur 4). Diese mRNA wurde in nicht infizierten Tomatenpflanzen (Spur 1) oder bei in vitro gezüchtetem C. fulvum (Spur 2) nicht gefunden. Bei der Interaktion der Kulturvarietät Cf5 mit der Rasse 2.4.5.9.11 (Spur 5) wurde ebenfalls keine Hybridisierung festgestellt, was für eine Interaktion einer auf Cf9-Genotypen der Tomate virulenten Rasse erwartet werden konnte. Es wurde also festgestellt, dass die Testsequenz B mRNA für das nekroseinduzierende Protein detektierte. Die Testsequenzen A, C und D detektierten spezifische mRNA's nicht, wie in Fig. 2 gezeigt ist.
Die Oligonucleotid-Testsequenz B wurde in einem Primer-Verlängerungsversuch eingesetzt. Das Oligonucleotid wurde am 5'-Ende markiert und auf gleiche Mengen von Poly(A)-RNA hybridisiert, die aus kompatiblen Interaktionen der Kulturvarietät Cf5 mit entweder Rasse 5 oder Rasse 2.4.5.9.11 (dargestellt in Fig. 1, Spuren 4 bzw. 5) abgeleitet waren. Der Primer wurde mit reverse Transcriptase verlängert und die Verlängerungsprodukte wurden auf einem PAGE-Gel analysiert. Fig. 3 zeigt, dass ein spezifisches Verlängerungsprodukt auf Poly(A)-RNA gebildet wurde, die aus der Interaktion der Kulturvarietät Cf5/Rasse 5 (Spur 1) abgeleitet war, nicht jedoch auf Poly(A)-RNA, die aus der Interaktion der Kulturvarietät Cf5/Rasse 2.4.5.9.11 (Spur 2) abgeleitet war. Die Grösse des Verlängerungsproduktes betrug ungefähr 270 Nucleotide, was zeigte, dass die avr9- mRNA ungefähr 200 Nucleotide als die das nekroseinduzierende Protein codierende Sequenz aufweist.
Poly(A)-RNA, die aus der Interaktion Cf5/Rasse 5 abgeleitet war (dargestellt in Fig. 2, Spur 4) wurde verwendet, um eine cDNA-Bibliothek in Lambda gt11 herzustellen. Es wurde eine Bibliothek erhalten, die 100.000 unabhängige Rekombinanten enthielt. Die Untersuchung von Filtern, die 5000 Phagen mit endständig markierter Oligonucleotid-Testsequenz B enthielten, führte zur Isolierung von zwei möglichen Kandidaten, einer der schwach hybridisierte (Phage A9- 1) und einer, der beträchtlich besser hybridisierte (Phage A9-2). Beide Phagen wurden gereinigt und die DNA isoliert. Die Phagen-DNA wurde markiert und auf Blots hybridisiert, identisch mit dem in Fig. 2 gezeigten Blot waren. Der Phage A9-1 hybridisierte auf eine mRNA die ungefähr 1500 Nucleotide enthielt und in kleinen Mengen in 3 Interaktionen zwischen Tomate und C. fulvum vorhanden war. Dieser Phage ent hielt keine cDNA, die der in Fig. 2 beobachteten mRNA entsprach, und wurde nicht weiter untersucht.
Die markierte DNA des Phagen A9-2 hybridisierte mit einer mRNA von ungefähr 600 Nucleotiden, die nur in den kompatiblen Interaktionen von Kulturvarietät Cf4/Rasse 4 und Kulturvarietät Cf5/Rasse 5 vorhanden war, d. h. in einem Muster, das der Hybridisierung entsprach, die mit der Oligonucleotid-Testsequenz B beobachtet wurde. Daher enthielt der Phage A9-2 eine Kopie der mRNA, die das nekroseinduzierende Protein codierte. Die in Phage A9-2 vorhandene cDNA wurde subkloniert und die Sequenz wurde bestimmt. Die Insertion wies eine Länge von 405 Basenpaaren auf und entsprach dem 3'-Ende der mRNA einschliesslich eines Poly(A)-Endes von 20 Nucleotiden. Die Insertion codierte die ganze Sequenz des nekroseinduzierenden Proteins und war in einem längeren offenen Leserahmen enthalten. Aus der Position der Oligonucleotid-Testsequenz B in der DNA-Sequenz und der Grösse des Primer-Verlängerungsproduktes wurde geschlossen, dass der Insertion des Klonen A9-2 ungefähr 110 Basenpaare am 5'-Ende der mRNA fehlten. Um einen cDNA-Klonen mit voller Länge zu erhalten wurde die cDNA-Bibliothek erneut mit einer markierten RNA-Testsequenz untersucht, die 70 Nucleotide des 5'-Terminus der Insertion des Klonen A9-2 enthielt. Es wurden 3 verschiedene Phagen A9-3, A9-5 und A9-8 erhalten und deren Insertionen wurden subkloniert und sequenziert. Die Sequenz der drei Klonen war in den überlappenden Gebieten vollkommen identisch zur Sequenz des Klonen A9-2. Die 4 Klone enthalten Poly(A)-Enden, die bei verschiedenen Positionen in der Sequenz beginnen. Es wurde aus dem Primer-Experiment, das in Fig. 3 gezeigt ist, geschlossen, dass dem längsten Klonen (A9-3) ungefähr 35 Nucleotide fehlten. Daher wurde ein neuer Primer entworfen, der bei den Positionen 75-100 hybridisierte. Dieser Primer wurde in einem Primer-Verlängerungsexperiment auf Poly(A)- RNA in Gegenwart von Dideoxynucleotiden eingesetzt. Diese RNA-Sequenz führte zum Hinzufügen von weiteren 24 Nucleotiden am Beginn der Insertion von A9-3. Es wurden andere Endprodukte beobachtet, die 5-20 Nucleotide länger als das grösste Verlängerungsprodukt waren. Die verschiedenen Endprodukte der Primerverlängerung wurden nicht durch einen Abbau der mRNA bewirkt, da ein Verlängerungsexperiment mit einem Primer für eine andere mRNA nur ein einziges Verlängerungsprodukt mit der richtigen Länge ergab. Die Sequenz der avr9-cDNA und die Struktur der zugehörigen cDNA-Klonen ist in Fig. 4 gezeigt. Die Isolierung und Charakterisierung der cDNA-Klone zeigte, dass das nekroseinduzierende Protein als Vorläuferprotein von mindestens 63 Aminosäuren gebildet wird. Überraschenderweise zeigte die DNA-Sequenz beim C- Ende der Sequenz des reifen Auslösermoleküls ein zusätzliches Histidin-Codon. Es wurde bereits vorher gezeigt, dass das Auslösermolekül eine Länge von 27 Aminosäuren aufwies (Scholtens-Toma und De Wit, 1988). Die erneute Untersuchung der Daten der Proteinsequenz bestätigte jedoch die Anwesenheit eines zusätzlichen Histidinrestes bei Position 28. Dieser Rest war bei der ursprünglichen Analyse aufgrund des mit dieser Aminosäure erhaltenen schwachen Signals übersehen worden. Das Molekulargewicht des reifen avr9-Auslöserproteins beträgt 3189 Dalton.
Ein genomischer Klone des Avirulenzgens avr9 wurde aus einer genomischen Bibliothek (im Vektor lambdaEMBL3) der Rasse 5 von C. fulvum unter Verwendung des Klonen A9-2 isoliert. Die Sequenzanalyse zeigte ein Intron von 59 Basenpaaren, eine mutmassliche TATA-Box und mehrere Wiederholungen in den Promotor- und Teminatorgebieten. Stabile Transformanten der Rasse 2.4.5.9.11 wurden mit dem genomischen Klonen nach Kotransformation mit pAN7 (Hygromycinresistenz) erhalten. Die Wildtyp-Rasse 2.4.5.9.11 ist auf Cf9-Genotypen der Tomate virulent, aber der Transformant war es nicht. Das bedeutet, dass die Spezifizität für Kulturvarietäten dieser Transformaten auf Cf9-Genotypen phänotypisch von virulent zu avirulent geändert wurde, und zeigte, dass das Avirulenzgen avr9 den Genotypen der Rasse 2.4.5.9.11 in denjenigen der Rasse 2.4.5.11 geändert hat. Dieses Experiment beweist, dass das Avirulenzgen avr9 in Kombination mit dem Cf9-Resistenzgen tatsächlich der ursprünglich Verursacher der Resistenz ist. Daher kann geschlossen werden, dass die lokale gleichzeitige Expression eines Avirulenzgens (E) und eines zugehörigen Resistenzgens (R) in einer Pflanze eine lokale Nekrose bewirkt.

Literaturverzeichnis

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Claims

1. Verfahren zur Einführung von Pathogenresistenz in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Pflanze mit Polynucleotidsequenzen transformiert wird, die ein Paar aus einem pathogen-abgeleiteten Avirulenzgen und einem pflanzen-abgeleiteten Resistenzgen codieren, worin die Expression sowohl des Auslöserpeptids wie auch des Resistenzgens oder von einem von beiden durch einen pathogen-induzierbaren Promotor reguliert wird.

2. Verfahren zur Einführung von Pathogenresistenz in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Pflanze, die ein Resistenzgen enthält, wobei dieses Gen eines aus einem Paar aus einem pathogen-abgeleiteten Avirulenzgen und einem pflanzen-abgeleiteten Resistenzgen ist, mit einer Polynucleotidsequenz transformiert wird, die einen pathogenabgeleiteten Auslöser codiert, wobei dieser Auslöser eines aus einem Paar von Genprodukten eines pathogen-abgeleiteten Avirulenzgens und eines pflanzen-abgeleiteten Resistenzgens ist und worin die Expression sowohl des Auslöserpeptids wie auch des Resistenzgens oder von einem von beiden durch einen pathogen-induzierbaren Promotor reguliert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte Pflanze durch die Transformation mit einem Gen, das das besagte Resistenzgen codiert, zur Bildung des besagten Resistenzgens befähigt ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression des Auslöserpeptids durch einen pathogen-induzierbaren Promotor reguliert wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression des Produkts des Resistenzgens durch einen pathogen-induzierbaren Promotor reguliert wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Resistenzgen natürlicherweise in der Pflanze vorkommt, vorzugsweise wenn die Pflanze aus der Familie der Solanaceae ist, eher bevorzugt eine Pflanze der Art Lycopersicon esculentum, am meisten bevorzugt wenn das Resistenzgen das Cf9-Gen ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der pathogen-induzierbare Promotor ein Pflanzenpromotor ist, vorzugsweise einer, der aus der Familie der Solanaceae und eher bevorzugt aus der Gattung Lycopersicon oder Solanum isoliert ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Auslöserpeptid von einem pflanzenpathogenen Pilz, vorzugsweise von Cladosporium fulvum abgeleitet ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Auslöserprotein avr9 oder eine Portion davon und vorzugsweise ein Protein ist, das die in Fig. 4 dargestellte Aminosäure umfasst.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Auslöserpeptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem pflanzenpathogenen Bakterium, ei nem pflanzenpathogenen Virus und einem pflanzenparasitären Nematoden besteht.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, um einer Pflanze Resistenz gegen Pilzpathogene zu verleihen.