DE69119010T2 - Verfahren zur Herstellung von N-substituiertem 1-Deoxynojirimycin - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von N-substituiertem 1-DeoxynojirimycinInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von N-substituiertem 1-Desoxynojirimycin und Zwischenverbindungen für seine Herstellung.
- In der US-A-4 246 345 ist ein Verfahren zur Herstellung von 1-Desoxynojirimycin geoffenbart, bei welchem 1-Aminosorbit mikrobiell oxidiert wird, wobei 6-Aminosorbose erhalten wird, die dann mit einem Katalysator hydriert wird, wobei 1-Desoxynojirimycin erhalten wird. Die Ausbeuten dieses Verfahrens, insbesondere die Ausbeuten mit geringem Volumen in der mikrobiologischen Reaktion, sind mit Abbauproblemen und kurzen Reaktionszeiten verbunden, außerdem ist kein Verfahren zur Herstellung von N-substituierten Derivaten von 1-Desoxynojirimycin geoffenbart.
- Es ist bekannt, daß N-substituierte Derivate von 1-Desoxynojirimycin hergestellt werden können, indem Aminosorbite mit Schutzgruppen geschützt werden, die in nachfolgenden mikrobiellen Oxidationen stabil sind. Die Schutzgruppen können anschließend durch katalytische Hydrierung entfernt werden. Ein derartiges Verfahren ist in der US-A-4 266 025 geoffenbart. In diesem Patent werden Aminozucker mikrobiologisch oxidiert, wobei geschützte 6-Aminosorbosen erhalten werden, die dann isoliert werden. Anschließend wird die Schutzgruppe durch katalytische Hydrierung entfernt, und der Ring wird wieder geschlossen, wobei die N-substituierten Derivate von 1-Desoxynojirimycin gebildet werden. Dieses Verfahren erfordert jedoch eine große Menge an Katalysator im Hydrierungsschritt. Außerdem können die ungeschützten 6-Aminosorbosen nicht als solche isoliert werden.
- Die US-A-4 405 714 offenbart ein Verfahren zur Herstellung N-substituierter Derivate von 1-Desoxynojirimycin, bei welchem Glucose in einen 1-Aminosorbit übergeführt wird. Dann wird der 1-Aminosorbit durch eine Schutzgruppe geschützt, die im nachfolgenden mikrobiologischen Oxidationsverfahren stabil ist. Anschließend kann die Schutzgruppe unter sauren Bedingungen entfernt werden. Die Verbindungen werden mikrobiell oxidiert, wobei eine geschützte 6-Aminosorbose erhalten wird. Dann wird die Schutzgruppe an der 6-Aminosorbose unter sauren Bedingungen entfernt. Das so erhaltene 6-Aminosorbosesalz wird mit einem Katalysator hydriert, wobei das N-substituierte Derivat von 1-Desoxynojirimycin erhalten wird. Das '714-Verfahren, wie das '025- Verfahren, erfordert die Verwendung von Schutzgruppen, um N-substituierte Derivate von 1-Desoxynojirimycin zu erhalten.
- Es wurde gefunden, daß N-substituierte Derivate von 1-Desoxynojirimycin durch ein Verfahren hergestellt werden können, welches die Verwendung von Schutzgruppen nicht erfordert.
- Diese Erfindung ist ein Verfahren, welches umfaßt:
- Oxidieren von Glucamin der Formel:
- oder Salzen hievon mit einer Oxidationsmikrobe oder einem Extrakt hievon und Herstellen von Verbindungen der Formel:
- oder Salzen hievon, worin R in jedem Fall Phenyl, C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkyl, C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkyl substituiert mit Phenyl oder Carboxy, oder C&sub2;-C&sub1;&sub0;-Alkyl substituiert mit Hydroxy bedeutet.
- In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine durch die oben beschriebene Reaktion hergestellte 6-(substituiertes Amino)-6-desoxy-α-L-sorbofuranose (mit oder ohne Isolierung der Zwischen-Sorbose) zum N-substituierten 1-Desoxynojirimycin, oder zu Salzen hievon, der Formel (III) (nachstehend gezeigt) reduziert:
- worin R wie oben beschrieben ist.
- In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird D-Glucose in N-substituiertes 1-Desoxynojirimycin in einem Ein- Topf-Verfahren übergeführt: D-Glucose
- Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von N-substituierten Glucaminen und Salzen hievon.
- Die genaue Form der Struktur der Formel (II) wird durch die Umgebung vorgegeben, in der die Sorbose vorliegt (siehe H. Paulsen et al., Chem. Ber. 100:802 (1967)). Die Verwendung der Sorbofuranose- oder der Sorbose-Nomenklatur bedeutet nicht, daß die Verbindung nicht in einer anderen ihrer äquivalenten Formen vorliegen kann oder vorliegt.
- Die durch die mikrobielle Oxidation von N-substituierten Glucaminen erzeugte 6-(substituiertes Amino)-6-desoxy-α-L-sorbofuranosen sind als Zwischenverbindungen zur Herstellung N-substituierter 1-Desoxynojirimycin-Verbindungen verwendbar (die antivirale Mittel, Antidiuretika, Antidiabetika, Tierfutter- Zusatzstoffe und Antihyperglykämika sind).
- Die hier verwendeten Glucamine der obigen Formel (I) werden als "N-substituierte Glucamine" bezeichnet (auch als 1-(substituiertes Amino)-1-desoxy-D-glucit bekannt). Die Verbindungen der obigen Formel (II) werden nachstehend als "6-substituierte Amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranosen" bezeichnet. Die Verbindungen der obigen Formel (III) werden als "N-substituierte 1-Desoxynojirimycine" bezeichnet (auch als 1,5-(substituiertes Imino)- 1,5-didesoxy-D-glucit und 1-substituiertes 3,4,5-Trihydroxy-2- Piperidinylmethanol bekannt).
- Geradkettige oder verzweigtkettige Alkyle sind zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung geeignet, wobei C&sub1;-C&sub5;-Alkyl-Gruppen bevorzugt werden. Beispiele geeigneter Alkylreste sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl, n-Butyl, 1-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 3-Methylbutyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, n-Hexyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl und n-Decyl. Geeignete Hydroxy-substituierte Alkylreste sind 2-Hydroxyethyl, 3-Hydroxypropyl, 4-Hydroxybutyl, 5-Hydroxypentyl, 6-Hydroxyhexyl, 7-Hydroxyheptyl, 8-Hydroxyoctyl, 9-Hydroxynonyl und 10-Hydroxydecyl. Geeignete Carboxy-substituierte Alkylreste sind Carboxymethyl, 2-Carboxyethyl, 3-Carboxypropyl, 4-Carboxybutyl, 5-Carboxypentyl, 6-Carboxyhexyl, 7-Carboxyheptyl, 8-Carboxyoctyl, 9-Carboxynonyl und 10-Carboxydecyl. Geeignete Phenyl-substituierte Alkylreste sind Phenylmethyl (Benzyl), 2-Phenylethyl, 3-Phenylpropyl, 4-Phenylbutyl, 5-Phenylpentyl, 6-Phenylhexyl, 7-Phenylheptyl, 8-Phenyloctyl, 9-Phenylnonyl und 10-Phenyldecyl. Phenyl allein ist auch ein annehmbarer Rest.
- Beispiele von 6-substituierten Amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranosen, welche durch das Verfahren der Erfindung hergestellt werden, sind:
- 6-Methylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-Ethylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-n-Propylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(1-Methylethyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(1-Methylpropyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(1,1-Dimethylethyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-n-Pentylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(3-Methylbutyl)-amino-6-desoxy-a-L-sorbofuranose,
- 6-(1-Methylbutyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(2-Methylbutyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-n-Hexylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-n-Heptylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-n-Octylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose
- 6-n-Nonylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-n-Decylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(2-Hydroxyethyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
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- 6-(4-Hydroxybutyl)-amino-6-desoxy-ci-L-sorbofuranose,
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- 6-(10-Hydroxydecyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(Carboxymethyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(2-Carboxyethyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
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- 6-(6-Carboxyhexyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(7-Carboxyheptyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(8-Carboxyoctyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(9-Carboxynonyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(10-Carboxydecyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-Phenylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(Phenylmethyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(2-Phenylethyl )-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(3-Phenylpropyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(4-Phenylbutyl )-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(5-Phenylpentyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(6-Phenylhexyl )-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(7-Phenylheptyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(8-Phenyloctyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose,
- 6-(9-Phenylnonyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose und
- 6-(10-Phenyldecyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose.
- N-substituierte Glucamine der Formel (I) können durch bekannte Mittel erhalten werden, beispielsweise durch die Aminierung von D-Glucose. Die reduktive Alkylierung von Zuckern mit Aminen ist in der Literatur als Verfahren zur Herstellung N-substituierter 1-Amino-1-desoxyzucker angegeben (siehe F. Kagan et al., J. Amer, Chem. Soc., 79, 3541 (1957), A. Mohammad et al., J. Am. Chem. Soc., 66, 969 (1947), P.N. Rylander, Hydrogenation Methods (Academic Press, (1985) S. 82-93) und G. Mitts et al., J. Am. Chem. Soc., 66:483 (1944)). Im allgemeinen involvieren diese Zubereitungen das Umsetzen eines Zuckers und eines Amins, in variierenden Verhältnissen, in einem geeigneten Lösungsmittel, wie wässerigem Methanol oder Ethanol. Manchmal wird eine katalytische Menge an Salzsäure zugesetzt. Die erhaltene Mischung wird unter einem Wasserstoffdruck von 275,76 bis 8962,2 kPa (40 bis 1300 psig) bei 23 - 100ºC während 7 bis 30 Stunden hydriert. Dann wird der erhaltene 1-(substituiertes Amino)-1-desoxy-D-glucit (N-substituiertes Glucamin) isoliert.
- In einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung N-substituierter Glucaminsalze wird eine Parr-Schüttelflasche oder dgl. mit einem Lösungsmittel und Amin beladen. Geeignete Lösungsmittel schließen Wasser, Alkohole (wie Methanol und Ethanol) oder wässerige Alkohole ein. Vorzugsweise ist das Lösungsmittel Ethanol. Geeignete Amine schließen die Amine ein, die zur Herstellung der für die Formeln (I), (II) und (III) beschriebenen N-substituierten Glucamine angegeben sind, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Bevorzugte Amine schließen ein: Ethylamin, n-Butylamin, n-Octylamin, 2-Hydroxyethylamin, Phenylmethylamin, Phenylamin und 4-Carboxybutylamin. Das Verhältnis von D-Glucose zu Amin beträgt etwa 1:1, wodurch das Produkt ohne Isolierung oder Entfernung von überschüssigen Reagentien verwendet werden kann. Die Mischung wird gerührt und abgekühlt, wobei Säure langsam zugesetzt wird, bis ein pH im Bereich von etwa 8,0 bis 12, erhalten wird, vorzugsweise etwa 9 bis 10,5. Geeignete Säuren schließen ein: Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Essigsäure, Ascorbinsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Oxalsäure und Phosphorsäure, vorzugsweise Salzsäure.
- Der Parr-Schüttelflasche wird D-Glucose zugesetzt, gefolgt von Palladium-auf-Kohle (Pd/C)-Katalysator (50 % wasserfeucht). Eine Palladium-Katalysatorbeladung von etwa 1 bis 50 Masse-% Glucose wird verwendet, vorzugsweise etwa 10 bis 30 Masse-%. Katalysatoren aus Edelmetallen können verwendet werden, beispielsweise Platin, Palladium, Rhodium und Rhenium, vorzugsweise Palladium. Die Mischung wird gerührt und hydriert bei einem Druck von etwa 101,325 kPa bis 10 132,5 kPa (1 bis 100 atm), vorzugsweise etwa 303,9 bis 607,95 kPa (3 bis 6 atm) Wasserstoff bei einer Temperatur von etwa 25ºC bis 100ºC, vorzugsweise etwa 40ºC bis 80ºC, bis die Reaktion abgeschlossen ist (wie durch Wasserstoffaufnahme angezeigt). Der Wasserstoff wird entlüftet und das Palladium-auf-Kohle abfiltriert (vorzugsweise durch eine Schicht pulverförmiger Cellulose). Der Katalysator wird mit einem Lösungsmittel, wie einem Alkohol, vorzugsweise Ethanol, gewaschen, gefolgt vom Waschen mit Wasser. Die Waschflüssigkeiten werden mit dem Filtrat kombiniert, wobei eine Lösung erhalten wird, die eine Mischung von N-substituiertem Glucamin und seinem entsprechenden Salz enthält. Die Mischung wird gerührt und gekühlt, wobei Salzsäure langsam auf einen End-pH von etwa 1 bis 7, vorzugsweise etwa 4 bis 6, zugesetzt wird. Das Ethanol wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand enthält das N-substituierte Glucaminsalz. Der Rückstand wird mit Wasser verdünnt und ist für den nächsten Schritt der mikrobiellen Oxidation ohne Reinigung gebrauchsfertig. Daher erzeugt das Verfahren die N-substituierten Glucaminsalze aus D-Glucose ohne Isolierung oder Entfernung von überschüssigen Reagentien. Die Eliminierung der Schritte zur Isolierung und Entfernung von überschüssigem Reagens ermöglicht die direkte Verwendung von N-substituierten Glucaminen in der mikrobiellen Oxidation, welche Oxidation zu den 6-substituierten Amino-6- desoxy-α-L-sorbofuranosen führt, die ihrerseits direkt zu N-substituierten 1-Desoxynojirimycinen (d.h. in einem Ein-Topf- Verfahren) hydriert werden können.
- Ein weiterer Vorteil der N-substituierten Glucaminsalze ist die Eliminierung von Gerüchen, die mit zurückbleibenden Aminen verbunden sind. Typischerweise sind die Amine besonders starke Duftstoffe, welche die Verwendung von Atemschutzgeräten bei der Handhabung erfordern. Die Glucaminsalze sind hingegen relativ geruchsfrei, so daß sie ohne besondere Vorkehrungen, wie Atemschutzgeräten, bearbeitet werden können.
- Wie durch die Sicherheitshinweise der Lieferanten von
- N-n-Butylamin (beispielsweise Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) angegeben, ist die N-n-Butylamin-Verbindung toxisch und reizt Augen, Haut und Schleimhäute stark. Das Aussetzen an nur 5 bis 10 ppm N-Butylamin bewirkt eine Nasen- und Halsreizung. Das Aussetzen an Konzentrationen von 10 bis 25 ppm kann nicht länger als einige Minuten toleriert werden. Daher sind die Salzformen der N-substituierten Glucamin-Verbindungen vorteilhaft, welche Formen die Geruchs- und Reizungscharakteristika der Nicht-Salzformen nicht aufweisen.
- Um die mikrobielle Oxidation eines N-substituierten Glucamins zu beginnen, werden Oxidationsmikroorganismen einer Reaktionsmischung zugesetzt, die ein N-substituiertes Glucamin oder Salze hievon umfaßt. Alternativ dazu wird N-substituiertes Glucamin oder ein Salz hievon Kulturen von Oxidationsmikroorganismen zugesetzt, die den Oxidationsschritt durchführen. Vorzugsweise wird ein Salz von N-substituierten Glucamin zugesetzt. Geeignete Salze von N-substituiertem Glucamin schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Salze von Chlorid, Sulfat, Nitrat, Acetat, Ascorbat, Succinat, Citrat, Maleat, Oxalat oder Phosphat. Vorzugsweise wird das Hydrochloridsalz verwendet. Obwohl die Verwendung eines Salzes bevorzugt wird, kann ein Salz in situ durch den Zusatz eines N-substituierten Glucamins und geeigneter Säuren hergestellt werden, um den pH zu senken und ein N-substituiertes Glucaminsalz zu erzeugen. Während der Inkubation der die Mikroorganismen enthaltenden Reaktionsmischung wird die Reaktion durch einen Umkehrphasen- oder Ionenaustausch- Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)-Test überwacht, um die Überführung von N-substituiertem Glucamin in die entsprechende 6-(substituiertes Amino)-6-desoxy-α-L-sorbofuranose zu beobachten. Dünnschichtchromatographie (DC) und Gaschromatographie (GC) können ebenfalls zur überwachung der Überführung verwendet werden.
- Oxidationsmikroorganismen, die zur Durchführung der Oxidation geeignet sind (oder Mikroorganismen, aus denen aktive Extrakte zur Durchführung der Oxidation erhalten werden), können Procaryotae (Bakterien) oder Eucaryotae, beispielsweise Pilze, sein, die in jedem Fall zu verschiedenen taxonomischen Gruppen gehören können. Geeignete Mikroorganismen werden gefunden, indem eine relativ große Anzahl von Mikroorganismen in einem geeigneten Nährstoffmedium gezüchtet wird, das Sorbit oder N-substituierte Glucamine enthält, und ihre Fähigkeit zur Erzeugung von Sorbose bzw. 6-(substituiertes Amino)-6-desoxy-α-L-sorbofuranosen untersucht wird. Die Fähigkeit eines Mikroorganismus zur Katalysierung der Oxidationsreaktion gemäß der Erfindung kann durch verschiedenste Mittel gemessen werden, einschließlich des Testens mit Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC). Mikroorganismen zur Verwendung im Verfahren der Erfindung können leicht von verschiedensten Quellen erhalten werden, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich von American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland; Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois; Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen (DSM), BRD; und Fermentation Research Institute (FRL), Japan.
- Beispiele geeigneter Oxidationsmikroorganismen sind Bakterien der Ordnung Pseudomonadales, Bakterien der Familie Pseudomonadaceae, Bakterien der Familie Coryneform und Pilze der Gattung Metschnikowia. In der Ordnung der Pseudomonadales werden Mitglieder der Familie Pseudomonadaceae bevorzugt. Innerhalb der Pseudomonadaceae-Familie werden Bakterien der Gattung Gluconobacter (früher als Acetobacter bezeichnet) bevorzugt. Bakterien der Gruppe von Coryneform-Bakterien, insbesondere jene der Gattung Corynebacterium (auch als Curtobacterium bekannt), sind ebenfalls geeignet. Schließlich kann die Oxidation mit Pilzen (beispielsweise mit Hefen), insbesondere mit jenen der Familie Spermophthoraceae, wie der Gattung Metschnikowia, durchgeführt werden.
- Beispiele von geeignetem Corynebacterium sind Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acnes, Corynebacterium alkanolyticum, Corynebacterium alkanum, Corynebacterium betae, Corynebacterium bovis, Corynebacterium callunae, Corynebacterium cystitidis, Corynebacterium dioxydans, Corynebacterium equi, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium hoagii, Corynebacterium hydrocarbooxydans, Corynebacterium ilicis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium liquefaciens, Corynebacterium matruchotii, Corynebacterium melassecola, Corynebacterium mycetoides, Corynebacterium nephridii, Corynebacterium nitrilophilus, Corynebacterium oortii, Corynebacterium petrophilum, Corynebacterium pilosum, Corynebacterium pyogenes, Corynebacterium rathayi, Corynebacterium renale, Corynebacterium simplex, Corynebacterium striatum, Corynebacterium tritici, Corynebacterium uratoxidans, Corynebacterium vitarumen und Corynebacterium xerosis. Geeignetes Gluconobacterium zur Verwendung im Verfahren der Erfindung schließt ein: Gluconobacter oxydans subsp. industrius, Gluconobacter oxydans subsp. melanogenes, Gluconobacter oxydans subsp. sphaericus und Gluconobacter oxydans subsp. suboxydans. Metschnikowia (früher als Candida bezeichnet), das zur Verwendung im Verfahren der Erfindung bevorzugt wird, schließt Metschnikowia pulcherrimia ein.
- Allgemeine Wachstumsbedingungen zur Kultivierung der bestimmten Organismen werden von Hinterlegungsstellen und bekannten Texten erhalten, wie Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bd. 1, Williams and Wilkins, Baltimore/London (1984), N.R. Krieg, Hrg.
- Das Nährmedium für das Wachstum eines Oxidationsmikroorganismus sollte Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff sowie Mineralsalze enthalten. Geeignete Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Komplex-Mischungen, wie jene, die durch biologische Produkte verschiedenen Ursprungs gebildet werden, beispielsweise Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Linsenmehl, Erbsenmehl, lösliche und unlösliche Pflanzenproteine, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Peptone und Fleischextrakte. Zusätzliche Stickstoffquellen sind Ammoniumsalze und Nitrate, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und Caliumnitrat. Allgemein sollte das Nährstoffmedium die folgenden Ionen enthalten, ist jedoch nicht darauf beschränkt: Mg++, Na+, K+, Ca++, NH&sub4;+. Cl-, SO&sub4;--, PO&sub4;--- und NO&sub3;- und auch Ionen der Spurenelemente, wie Cu, Fe, Mn, Mo, Zn, Co und Ni. Die bevorzugte Quelle dieser Ionen sind Mineralsäuren.
- Wenn diese Salze und Spurenelemente nicht in ausreichenden Mengen in den Komplex-Bestandteilen des verwendeten Nährmediums oder im Wasser vorliegen, ist es zweckmäßig, das Nährmedium entsprechend zu ergänzen.
- Die im Verfahren der Erfindung verwendeten Mikroorganismen können in Form von Fermentationsbrühen, ganzen gewaschenen Zellen, konzentrierten Zellsuspensionen, Enzym-Extrakten und immobilisierten Zellen vorliegen. Vorzugsweise werden konzentrierte Zellsuspensionen, Enzym-Extrakte und ganze gewaschene Zellen im Verfahren der Erfindung verwendet (S.A. White und G.W. Claus (1982), J.Bacteriology 150:934-943).
- Konzentrierte gewaschene Zellsuspensionen können wie folgt hergestellt werden: Die Mikroorganismen werden in einer geeigneten Nährlösung kultiviert, geerntet (beispielsweise durch Zentrifugieren) und in einem kleineren Volumen suspendiert (in Salz- oder Puffer-Lösungen, wie physiologischer Natriumchlorid- Lösung oder wässerigen Lösungen von Kaliumphosphat, Natriumacetat, Natriummaleat, Magnesiumsulfat, oder einfach in Leitungswasser, destilliertem Wasser oder Nährlösungen). Dann wird N-substituiertes Glucamin oder ein Salz hievon einer Zellsuspension dieses Typs zugesetzt, und die Oxidationsreaktion gemäß der Erfindung wird unter den beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
- Die Bedingungen zur Oxidation von N-substituiertem Glucamin in wachsenden Mikroorganismuskulturen oder fraktionierten Zell- Extrakten sind zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit konzentrierten Zellsuspensionen vorteilhaft. Insbesondere beträgt der Temperaturbereich von etwa 0ºC bis etwa 45ºC und der pH-Bereich von etwa 2 bis etwa 10. Es sind keine speziellen Nährstoffe im Verfahren der Erfindung notwendig. Gewaschene oder immobilisierte Zellen können einfach einer Lösung von N-substituiertem Glucamin oder Salzen hievon zugesetzt werden, oder daß irgendein Nährmedium vorliegt.
- Das Verfahren gemäß der Erfindung kann auch mit Enzym-Extrakten oder Enzym-Extraktfraktionen, die aus Bakterien hergestellt werden, durchgeführt werden. Die Extrakte können rohe Extrakte sein, wie sie durch herkömmliche Digestion von Mikroorganismuszellen erhalten werden. Verfahren zum Aufbrechen von Zellen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf mechanisches Zerbrechen, physikalisches Zerbrechen, chemisches Zerbrechen und enzymatisches Zerbrechen. Derartige Mittel zum Aufbrechen der Zellen schließen ein: Ultraschallbehandlungen, Passagen durch French-Druckzellen, Zerkleinern mit Quarzsand, Autolyse, Erhitzen, Osmoseschock, Alkali-Behandlung, Detergentien, oder wiederholtes Einfrieren und Auftauen.
- Wenn das erfindungsgemäße Verfahren mit teilweise gereinigten Enzym-Extraktzubereitungen durchzuführen ist, können zum Erhalten derartiger Zubereitungen Verfahren der Proteinchemie, wie Ultrazentrifugieren, Ausfällungsreaktionen, Ionenaustauschchromatographie oder Absorbtionschromatographie, Gelfiltration oder Elektrophoreseverfahren, verwendet werden. Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Reaktion mit fraktionierten Zell-Extrakten kann es erforderlich sein, dem Testsystem zusätzliche Reaktanten zuzusetzen, wie physiologische oder synthetische Elektronenakzeptoren, wie NAD+, NADP+, Methylenblau, Dichlorphenolindophenol, Tetrazoliumsalze und dgl. Wenn diese Reaktanten verwendet werden, können sie entweder in äquimolaren Mengen (Konzentrationen, die jener des verwendeten N-substituierten Glucamins entsprechen) oder in katalytischen Mengen (Konzentrationen, die deutlich unter der gewählten Konzentration von N-substituiertem Glucamin liegen) verwendet werden. Wenn bei der Verwendung katalytischer Mengen sicherzustellen ist, daß das erfindungsgemäße Verfahren ungefähr quantitativ durchgeführt wird, muß der Reaktionsmischung auch ein System zugesetzt werden, welches den Reaktanten kontinuierlich regeneriert, der nur in einer katalytischen Menge vorliegt. Dieses System kann beispielsweise ein Enzym sein, das die Reoxidation (in Anwesenheit von Sauerstoff oder anderen Oxidationsmitteln) eines Elektronenakzeptors sicherstellt, der im Laufe der erfindungsgemäßen Reaktion reduziert wird.
- Wenn Nährmedien mit intakten Mikroorganismen in einer wachsenden Kultur verwendet werden, kann das Nährmedium fest, halbfest oder flüssig sein. Vorzugsweise werden wässerig-flüssige Nährmedien verwendet, sofern Medien eingesetzt werden. Geeignete Medien und geeignete Bedingungen zur Kultivierung schließen bekannte Medien und bekannte Bedingungen ein, denen N-substituierten Glucamine oder Salze hievon zugesetzt werden können.
- Das im erfindungsgemäßen Verfahren zu oxidierende N-substituierte Glucamin oder Salze hievon können einem basischen Nährmedium entweder allein oder als Mischung mit einer oder mehreren oxidierbaren Verbindungen zugesetzt werden. Zusätzliche oxidierbare Verbindungen, die verwendet werden können, schließen Polyole, wie Sorbit oder Glycerin, ein.
- Wenn eine oder mehrere oxidierbare Verbindungen der Nährlösung zugesetzt werden, können das zu oxidierende N-substituierte Glucamin oder Salze hievon entweder vor dem Beimpfen oder zu irgendeiner späteren gewünschten Zeit (zwischen der anfänglichen log-Phase und der späten stationären Wachstumsphase) zugesetzt werden. In einem derartigen Fall wird der Oxidationsorganismus mit den oxidierbaren Verbindungen vorkultiviert. Das Beimpfen der Nährmedien wird durch verschiedenste Verfahren vorgenommen, einschließlich Schrägröhrchenkulturen und Kolbenkulturen.
- Die Verunreinigung der Reaktionslösung sollte vermieden werden. Zur Vermeidung einer Verunreinigung sollten eine Sterilisierung der Nährmedien, Sterilisierung der Reaktionsgefäße und Sterilisierung der zur Belüftung erforderlichen Luft durchgeführt werden. Beispielsweise kann Dampfsterilisierung oder Trockensterilisierung zum Sterilisieren der Reaktionsgefäße verwendet werden. Die Luft und die Nährmedien können gleichermaßen durch Dampf oder durch Filtration sterilisiert werden. Es ist auch eine Wärmesterilisierung der Reaktionslösung, welche die Substrate (N-substituiertes Glucamin) enthält, möglich.
- Das Verfahren der Erfindung kann unter aeroben Bedingungen unter Verwendung von Schüttelflaschen oder belüfteten und bewegten Tanks durchgeführt werden. Vorzugsweise wird das Verfahren durch das aerobe Eintauchverfahren in Tanks, beispielsweise in herkömmlichen Fermenten, durchgeführt. Es ist möglich, das Verfahren kontinuierlich oder im Chargen- oder Zufuhrchargenbetrieb, vorzugsweise im Chargenbetrieb, durchzuführen.
- Es ist vorteilhaft sicherzustellen, daß die Mikroorganismen mit Sauerstoff und den N-substituierten Glucaminen adäquat in Kontakt gebracht werden. Dies kann durch verschiedene Verfahren bewirkt werden, einschließlich Schütteln, Rühren und Belüften.
- Wenn während des Verfahrens ein Schaum in einer unerwünschten Menge auftritt, können chemische Schaumverhüter, wie flüssige Fette und Öle, Öl-in-Wasser-Emulsionen, Paraffine, höhere Alkohole (wie Octadecanol), Silikonöle, Polyoxyethylen-Verbindungen und Polyoxypropylen-Verbindungen, zugesetzt werden. Schaum kann auch mit Hilfe mechanischer Vorrichtungen unterdrückt oder eliminiert werden.
- Die zeitabhängige Bildung von 6-(substituiertes Amino)-6- desoxy-α-L-sorbofuranose im Kulturmedium kann entweder durch Dünnschichtchromatographie, HPLC, oder mit Hilfe der Erhöhung der Inhibitor-Wirksamkeit im Saccharose-Inhibierungstest verfolgt werden. Vorzugsweise wird die zeitabhängige Bildung von 6-(substituiertes Amino)-6-desoxy-α-L-sorbose durch HPLC gemessen.
- Die gemäß dem Verfahren der Erfindung erhaltene 6-(substituiertes Amino)-6-desoxy-α-L-sorbofuranose wird aus der Reaktionslösung wie folgt isoliert: Die Zellmasse wird abfiltriert oder abzentrifugiert und die Überstandsflüssigkeit durch eine Säule geführt, die einen sauren Ionenaustauscher enthält und mit einem Alkohol oder Wasser gespült wird. Dann wird mit einer Base eluiert und das Eluat konzentriert. Nach dem Zusatz von Aceton oder dgl. kommt es zur Auskristallisation von 6-(substituiertes Amino)-6-desoxy-α-L-sorbose. Wenn beabsichtigt wird, eine Weiterverarbeitung von 6-(substituiertes Amino)-6-desoxy-α-L- sorbose zu N-substituiertem 1-Desoxynojirimycin durchzuführen, ist keine Isolierung erforderlich. Zur Herstellung von N-substituiertem 1-Desoxynojirimycin aus 6-(substituiertes Amino)-6-desoxy-α-L-sorbofuranose wird die klare Lösung nach der Entfernung der Zellmasse vorzugsweise in Anwesenheit eines Katalysators reduziert.
- Dieser Aspekt der Erfindung (keine Isolierung erforderlich) ist besonders vorteilhaft, da das Verfahren direkt von der Überstandsflüssigkeit ausgeht, die aus der Entfernung der Zellmasse der mikrobiellen Oxidationsreaktionslösung erhalten wird. Ebenso ist es besonders vorteilhaft, da im Gegensatz zu bekannten Verfahren keine Amino-Schutzgruppe entfernt werden muß. Durch das Verfahren der Erfindung entfällt die Notwendigkeit zur Herstellung und Isolierung von Schutzgruppen-Zwischenverbindungen, und die Entfernung der Schutzgruppe wird vermieden, um die gewünschte Verbindung zu erhalten. Die Eliminierung dieser Schritte führt zu einem effizienteren Verfahren mit höheren Überführungen und Gesamtausbeuten. Die 6-(substituiertes Amino)-6-desoxy-α-L- sorbofuranosen zeigen auch eine höhere Löslichkeit, daher können höhere Konzentrationen erhalten werden, was zu einer hohen Produktivität und zu höheren Raten führt. Außerdem weisen die 6-(substituiertes Amino)-6-desoxy-α-L-sorbofuranosen eine höhere Stabilität auf, die einen Abbau und sich daraus ergebende Nebenprodukte verhindert.
- Zur Reduktion sind einige bekannte Mittel verfügbar (siehe beispielsweise P.N. Rylander, Hydrogenation Methods (Academic Press, (1985), 5. 82-93, und Organic Chemistry, 3. Auflage, Hrg. James B. Hendrickson, Donald J.Cram, George S. Hammond (McGraw- Hill, Kapitel 18, 1970)). Diese Mittel schließen Metallhydrid- Reduktion, katalytische Hydrierung, Lösungs-Metallreduktion und elektrochemische Reduktion ein. Allgemein wird zur Reduktion von 6-(substituiertes Amino)-6-desoxy-α-L-sorbofuranose zu N-substituiertem 1-Desoxynojirimycin 6-(substituiertes Amino)-6-desoxy- α-L-sorbofuranose in einen Kolben geladen, gefolgt vom Zusatz von Kohlenstoff zur Entfärbung. Dann wird die gerührte Mischung filtriert, wobei der Kohlenstoff entfernt wird. Das Filtrat wird einer Hydrierungsvorrichtung, wie einem Parr-Laborreaktor, zugesetzt, der einen Hydrierungskatalysator enthält. Katalysatorbeladungen von etwa 1 bis 50 Masse-% Sorbofuranose werden eingesetzt, wobei Gruppe VIII B-Metalle verwendet werden. Vorzugsweise werden etwa 10 bis 30 % verwendet. Derartige Katalysatoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Palladium, Platin, Nickel und Rhodium. Träger für die Katalysatoren können einschließen, sind jedoch nicht beschränkt auf Aluminiumoxid, Bariumsulfat, Calciumcarbonat, Kohlenstoff, Siliciumoxid und Kieselguhr. Typischerweise enthält der Träger eine 1 bis 20 % Metallbeladung, vorzugsweise eine 4 bis 10 % Beladung. Ein Palladiumkatalysator wird bevorzugt. Der bevorzugte Katalysator für 6-Phenylmethylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose ist jedoch Platin oder Raney-Nickel. Die Mischung wird etwa 5 Stunden lang hydriert. Ein Wasserstoffdruck von etwa 101,325 bis 10 132,5 kPa (1 bis 100 atm) kann verwendet werden; vorzugsweise wird ein Bereich von etwa 101,325 bis 506,625 kPa (1 bis 5 atm) verwendet. Dann wird der Katalysator entfernt und ein saures Ionenaustauscherharz dem Filtrat zugesetzt, um das N-substituierte 1-Desoxynojirimycin zu absorbieren. Das N-substituierte 1-Desoxynojirimycin wird aus dem Harz freigesetzt und isoliert.
- Beispiele von N-substituierten 1-Desoxynojirimycinen, die erzeugt werden können, indem die durch das erfindungsgemäße mikrobielle Oxidationsverfahren hergestellte 6-(substituiertes Amino)-6-desoxy-α-L-sorbofuranose hydriert wird, sind:
- N-Methyl-1-desoxynojirimycin,
- N-Ethyl-1-desoxynojirimycin,
- N-n-Propyl-1-desoxynojirimycin,
- N-1-Methylethyl-1-desoxynojirimycin,
- N-n-Butyl-1-desoxynojirimycin,
- N-1-Methylpropyl-1-desoxynojirimycin,
- N-1,1-Dimethylethyl-1-desoxynojirimycin,
- N-n-Pentyl-1-desoxynojirimycin,
- N-3-Methylbutyl-1-desoxynojirirnycin,
- N-1-Methylbutyl-1-desoxynojirimycin,
- N-2-Methylbutyl-1-desoxynojirimycin,
- N-n-Hexyl-1-desoxynojirimycin,
- N-n-Heptyl-1-desoxynojirimycin,
- N-n-Octyl-1-desoxynojirimycin,
- N-n-Nonyl-1-desoxynojirimycin,
- N-n-Decyl-1-desoxynojirimycin,
- N-(2-Hydroxyethyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(3-Hydroxypropyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(4-Hydroxybutyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(5-Hydroxypentyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(6-Hydroxylhexyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(7-Hydroxheptyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(8-Hydroxyoctyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(9-Hydroxynonyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(10-Hydroxdecyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(Carboxymethyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(2-Carboxyethyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(3-Carboxypropyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(4-Carboxybutyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(5-Carboxypentyl)-1-desoxynojirimycin,
- N- (6-Carboxyhexyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(7-Carboxyheptyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(8-Carboxyoctyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(9-Carboxynonyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(10-Carboxydecyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-Phenyl-1-desoxynojirimycin,
- N-(Phenylmethyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(2-Phenylethyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(3-Phenylpropyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(4-Phenylbutyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(5-Phenylpentyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(6-Phenylhexyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(7-Phenylheptyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(8-Phenyloctyl)-1-desoxynojirimycin,
- N-(9-Phenylnonyl)-1-desoxynojirimycin und
- N-(10-Phenyldecyl)-1-desoxynojirimycin.
- Die folgenden Beispiele erläutern die hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen der Erfindung.
- Nachstehend bedeutet "UpM" "Umdrehungen pro Minute", und "vvm" bedeutet "Volumen Luft pro Volumen Reaktor pro Minute".
- Eine Gluconobacter oxydans-Zellpaste wird hergestellt durch das Beimpfen einer Serie von 10 1 Fermentern, jeweils enthaltend 8 l Medium mit 60 g/l D-Sorbit, 24 gil Hefe-Extrakt, 48 g/l dibasisches Kaliumphosphat und 0,3 ml/l Schaumverhüter (Ucon LB 625), mit dem Microorganismus G. oxydans (DSM2003). Die Fermenter werden gerührt und belüftet, wobei Temperatur (30ºC) und pH (5,5 bis 6,5) während der Zellwachstumsperiode reguliert werden. Die Fermentationen werden nach etwa 27 h beendet, wenn Messungen der optischen Dichte angeben, daß die log-Wachstumsphase abgeschlossen wurde. Denn werden die Brühen abgekühlt, zentrifugiert und die Zellen in Wasser (oder 0,02 M MgSO&sub4;) resuspendiert und zentrifugiert, wobei gewaschene Zellpaste erhalten wird. Diese Zellpasten werden in aliquote Mengen unterteilt und bei oder unter 10ºC gelagert, bis sie für den Zusatz zu einer Reaktionslösung aufgetaut werden.
- Die Reaktionslösung kann auch durch Autoklavieren sterilisiert werden, wie nachstehend beschrieben. Eine 5 % (M/V) Lösung von N-Butylglucamin, enthaltend 20 mM MgSO&sub4;, bei pH 5,0, wurde in einem 500 ml Schüttelkolben mit aufgesetztem Silikonverschluß autoklaviert. Die Bedingungen für das Autoklavieren waren 30 min bei 121ºC und 206,84 kPa (30 psi) Der pH wurde danach überprüft, und es wurde gefunden, daß er bei Raumtemperatur 5,0 betrug. Es gab keine sichtbare Veränderung der Farbe oder der Klarheit der Lösung, ein Anzeichen, daß keine Karamelisierung oder Ausfällung aufgetreten war. Die Analyse gemäß HPLC-Test zeigte auch, daß die Reaktionslösungen vor und nach dem Autoklavieren gleich waren. Gluconobacter oxydans-Zellen wurden dem Schüttelkolben zugesetzt, und HPLC-Ergebnisse zeigten eine Überführung von zumindest 90 % nach 48 h. Kontrollen (nicht autoklaviert) zeigten auch eine Überführung von zumindest 90 % nach 48 h. Daher kann das Autoklavieren als Verfahren zum Sterilisieren der Reaktionslösung verwendet werden.
- Eine 2,3 1 Parr-Schüttelflasche wird mit 1 l 3A-Ethanol und 83 g (1,1 mol) n-Butylamin beladen. Die Mischung wird gerührt und gekühlt, wobei 16 ml 12n Salzsäure langsam zugesetzt werden. Nach diesem Zusatz beträgt der pH 10. Der 2,3 1 Parr-Flasche werden 200 g (1,1 mol) D-Glucose zugesetzt, gefolgt von 60 g 4 % Palladium-auf-Kohle (50 % wasserfeucht). Die Mischung wird rasch gerührt und bei einem konstanten Druck-von 405,3 kPa (4 atm) Wasserstoff bei 60 ± 5ºC hydriert, bis die Reaktion abgeschlossen ist (wie durch Wasserstoffaufnahme angezeigt). Der Wasserstoff wird entlüftet und 4 % Palladium-auf-Kohle durch eine Schicht von pulverförmiger Zellulose abfiltriert. Der Katalysator wird mit 100 ml 3A-Ethanol gewaschen, gefolgt von 50 ml Wasser. Die Waschflüssigkeit wird mit dem Filtrat kombiniert, wobei eine Lösung erhalten wird, die eine Mischung von N-Butylglucamin und dem entsprechenden Hydrochloridsalz enthält. Die Mischung wird gerührt und gekühlt, wobei 80 ml 12n Salzsäure langsam zugesetzt werden. Nach diesem Zusatz beträgt der pH 2,5. Das Ethanol wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand enthält ungefähr 270 g N-n-Butylglucaminhydrochlorid. Der Rückstand wird mit Wasser auf 500 ml verdünnt, wobei eine Masselösung von N-n-Butylglucaminhydrochlorid erzeugt wird, die im nächsten Schritt ohne Reinigung verwendet wird.
- Eine Reaktionslösung wird hergestellt, indem 109 ml einer Masselösung von N-n-Butylglucaminhydrochlorid (hergestellt in Beispiel 1) mit einer Konzentration von 500 g/l gemäß HPLC zu 460 ml Wasser in einem 1 l Bioreaktor zugesetzt werden. Die Lösung wird durch den Zusatz von verdünntem Natriumhydroxid auf pH 5 eingestellt und auf etwa 15ºC gekühlt. Insgesamt werden 30 g (Naßmasse) gewaschene G. oxydans-Zellpaste zugesetzt, und die Reaktionsmischung wird gerührt (500 UpM) und belüftet (0,5 vvm), wobei die Temperatur auf 15ºC und der pH auf 5 reguliert wird. Nach 23 h zeigt der HPLC-Test, daß mehr als 99 % des Substrats für eine 80 % Ausbeute von 6-n-Butylamino-6-desoxy-α- L-sorbofuranosehydrochlorid übergeführt waren.
- Ein Kolben wird mit 490 ml einer Masselösung aus der vorherigen Reaktion (Beispiel 2) beladen, die 6-(n-Butylamino)-6-desoxy-α-L-sorbofuranosehydrochlorid enthält. Der Kolben wird mit 5 g Aktivkohle zur Entfärbung beladen. Die Mischung wird 10 min lang bei 25 ± 5ºC gerührt. Die Kohle wird durch eine Schicht aus Diatomeenerde abfiltriert. Die Kohle wird mit ungefähr 25 ml Wasser gewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat kombiniert.
- Ein Kolben wird mit 8,4 g 4 % Palladium-auf-Kohle (50 % wasserfeucht) und dem Filtrat aus der Kohlebehandlung beladen. Diese Mischung wird rasch gerührt und bei einem konstanten Wasserstoffdruck von 413,685 kPa (60 psig) bei 25 ± 5 ºC hydriert, bis die Reaktion abgeschlossen wird, wie durch Wasserstoffaufnahme angezeigt. Der Wasserstoff wird entlüftet und das Reaktionsgefäß unter eine Stickstoffatmosphäre gesetzt. Das Palladium-auf-Kohle wird durch eine Schicht von pulverförmiger Cellulose abfiltriert. Der Katalysator wird mit 50 ml Wasser gewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat kombiniert, wobei eine Lösung erhalten wird, die N-n-Butyl-1-desoxynojirimycinhydrochlord enthält, wie durch HPLC-Analyse bestimmt.
- Ein Kolben wird mit 200 ml Sulfonsäure-Kationenaustauscherharz (wasserfeucht) und dem Filtrat vom vorhergehenden Schritt, das N-n-Butyl-1-desoxynojirimycinhydrochlord enthält, beladen. Die Mischung wird 15 min lang bei 25 ± 5ºC langsam gerührt und das Harz abfiltriert. Das Harz wird mit ungefähr 100 ml Wasser gewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat kombiniert. Der Kolben wird mit weiteren 100 ml Sulfonsäure-Kationenaustauscherharz (wasserfeucht) und dem Filtrat beladen. Die Mischung wird 15 min lang bei 25 ± 5ºC langsam gerührt und das Harz abfiltriert. Das Harz wird mit ungefähr 50 ml Wasser gewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat kombiniert. Der Kolben wird mit weiteren 100 ml Sulfonsäure-Kationenaustauscherharz (wasserfeucht) und dem obigen Filtrat beladen. Die Mischung wird 15 min lang bei 25 ± 5ºC langsam gerührt und das Harz abfiltriert. Das Harz wird mit ungefähr 50 ml Wasser gewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat kombiniert.
- Die Sulfonsäure-Kationenaustauscherharz-Portionen werden kombiniert, auf das Filter geladen und mit 200 ml Methanol gewaschen.
- Ein Kolben wird mit dem obigen, mit Methanol gewaschenen Sulfonsäure-Kationenaustauscherharz, enthaltend N-n-Butyl-1- desoxynojirimycin, 500 ml Methanol und 65 ml 14,8n Ammoniumhydroxid beladen. Die Mischung wird 15 min lang langsam gerührt und das Harz abfiltriert. Das Harz wird mit 100 ml Methanol gewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat kombiniert. Das Sulfonsäure-Kationenaustauscherharz wird vom Filter entfernt und in den Kolben geladen. Der Kolben wird mit 500 ml Methanol und 65 ml 14,8n Ammoniumhydroxid beladen. Die Mischung wird 15 min lang langsam gerührt und das Harz abfiltriert. Das Harz wird mit 100 ml Methanol gewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat kombiniert. Das Sulfonsäure-Kationenaustauscherharz wird vom Filter entfernt und erneut in den Kolben geladen. Der Kolben wird mit 100 ml Methanol und 65 ml 14,8n Ammoniumhydroxid beladen. Die Mischung wird 15 min lang langsam gerührt und das Harz abfiltriert. Das Harz wird mit 100 ml Methanol gewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat kombiniert.
- Die Filtrate werden kombiniert und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Das verbleibende Wasser wird mit ungefähr 200 ml Isopropylalkohol unter vermindertem Druck azeotrop abdestilliert. Der Rückstand wird in einer Lösung von 240 ml Aceton und 15 ml Methanol suspendiert und die Mischung 15 min lang am Rückfluß gehalten. Die Mischung wird auf 25 ± 2ºC abgekühlt. Das Rohprodukt wird durch Filtration gesammelt und mit 25 ml einer kalten 10:1 Lösung von Aceton:Methanol gewaschen. Das Rohprodukt wird mit 150 ml Methanol und 13,5 g Aktivkohle zur Entfärbung gerührt und 1 h lang auf 40 ± 5 ºC erhitzt. Die Aktivkohle zur Entfärbung wird abfiltriert und mit 100 ml Methanol gewaschen. Die Methanol-Waschflüssigkeit wird mit dem Filtrat kombiniert und durch Destillation unter vermindertem Druck nahezu zur Trockenheit konzentriert. Der Kolben wird mit 21 ml Methanol beladen und auf Rückfluß erhitzt. Während der Rückfluß aufrechterhalten wird, werden 160 ml Ethylacetat zugesetzt. Die erhaltene Mischung wird 14 bis 18 h lang auf 5 ± 2ºC gekühlt. Das Produkt wird durch Filtration gesammelt und mit 20 ml einer kalten 8:1 Lösung von Ethylacetat:Methanol gewaschen. Das Produkt wird 20 h lang bei 35 ± 5ºC in einem Vakuumofen getrocknet, wobei 23,7 g (45 % der Theorie, bezogen auf Glucose) N-n-Butyl-1-desoxynojirimycin erhalten werden. Die Reinheit dieses Materials betrug gemäß HPLC und derivitisierter GC 99,8 %. Die Struktur wurde durch NMR und IR bestätigt.
- Dieses Produkt wird bei Umgebungstemperatur unter einer Argonatmosphäre in doppelten Polyethylen-Beuteln gelagert.
- Der Mikroorganismus Gluconobacter oxydans (DSM 2003, BRD) wird in zwei 10 1 Fermentern gezüchtet, jeweils enthaltend 8 l Medien mit 624 g D-Sorbit, 200 g Hefe-Extrakt, 50 g dibasischem Kaliumphosphat, 50 g Glutamin und 2,5 ml Schaumverhüter (Ucon LB 625, einem Polyalkylenglykol, Union Carbide Co., Danbury, CT). Diese Fermenter werden gerührt und belüftet, wobei die Temperatur (etwa 30ºC) und der pH (etwa 5,5 bis 6,3) während der Zellwachstumsphase reguliert werden. Die Fermentation wird nach etwa 27 h beendet (wenn Messungen der optischen Dichte anzeigen, daß das log-Zellwachstum abgeschlossen ist). Die beiden Fermentationsbrühen werden geerntet, vereinigt und die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen. Nach dem Dekantieren des Überstands werden die Zellen in Wasser resuspendiert und zentrifugiert, wobei gewaschene Zellen für die mikrobielle Oxidationsreaktion erzeugt werden. Die gewaschenen Zellen werden einige Tage lang bei etwa 4ºC gelagert. Dann werden die Zellen durch den Zusatz einer Portion der Zellen zu einer Lösung von Gelrite-Gellangummi (0,6 g pro 50 ml Wasser) bei etwa 55ºC immobilisiert (Gelrite-Gellangummi ist ein Polysaccharid, umfassend Uron, Rhamnose und Glucose, erhältlich von Kelco Co., San Diego, CA). Diese Suspension wird einer Raumtemperatur-Lösung von 0,2 M MgSO&sub4; tropfenweise zugesetzt, wobei die immobilisierten Zellen enthaltende Kügelchen erzeugt werden. Die immobilisierten Zellen enthaltenden Kügelchen werden durch Filtration gewonnen und bei etwa 4ºC gelagert. Eine Portion der die immobilisierten Zellen enthaltenden Kügelchen wird zu 50 ml einer wässerigen Lösung, enthaltend 0,5 g N-n-Butylglucamin, eingestellt auf etwa pH 6,1 (mit Oxalsäure), zugesetzt. Diese Reaktionslösung wird zu einer 250 ml Schütteiflasche zur Inkubation in einem 30ºC Schüttler transferiert. Die Reaktionslösung wird etwa 4 Tage lang bei 30ºC inkubiert, wonach ein neuer Fleck durch Dünnschichtchromatographie (DC)-Test als gewünschtes Reaktionsprodukt 6-n-Butylamino-6desoxy-α-L-sorbofuranose detektiert wird.
- Eine Reaktionslösung wird hergestellt, indem 3,0 g N-n-Butylglucamin in 120 ml Wasser gelöst werden, die Lösung auf etwa pH 5,7 mit konzentrierter Salzsäure eingestellt wird, 0,36 g wasserfreies Magnesiumsulfat zugesetzt werden, die End- Lösung auf pH 5,0 (mit konzentrierter Salzsäure) eingestellt und dann mit Wasser auf ein End-Volumen von 150 ml mit einer End- Konzentration von 20 gil verdünnt wird. Nach dem Filtrieren durch ein 0,2 µm Filter werden 50 ml der Lösung einem 500 ml Schüttelkolben zugesetzt, zusammen mit 2 g nasser Zellpaste von G. oxydans, hergestellt wie oben in Beispiel 4 beschrieben. Die Mischung wird in einem Schüttelkolben bei Raumtemperatur (etwa 23ºC) 72 h lang inkubiert (wobei periodisch Proben entnommen werden). Die Reaktion wird durch Ionenpaarungs-Umkehrphasen- Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)-Test überwacht, der eine Überführung von N-n-Butylglucamin in 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose von 47 %, 77 % und 79 % nach 24, 48 bzw. 72 h zeigt.
- Eine Reaktionslösung wird hergestellt durch das Lösen von 10 g N-n-Butylglucamin in Wasser, die dann mit konzentrierter Salzsäure auf pH 5 eingestellt wird, und 0,02 M MgSO&sub4;. Die Lösung wird mit Wasser auf 200 ml verdünnt und filtriert, wobei eine End-Lösung bei pH 5,1, enthaltend so gil N-n-Butylglucamin, erhalten wird. Diese Lösung wird mit G. oxydans-Zellpaste zu einem gerührten 250 ml Reaktor transferiert, der in einem Wasserbad bei 20ºC gehalten wird. Die Lösung wird 3 Tage lang inkubiert, wobei die Lösung gerührt und auf etwa 20ºC gehalten wird. Der Ionenpaarungs-Umkehrphasen-HPLC-Test der Reaktionslösung (nach 64 h) zeigt eine Überführung von N-n-Butylglucamin in 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose von 90 %.
- Vier 50 ml Proben von N-n-Butylglucamin bei 50 gil, pH 5,0, 20 mM Magnesiumsulfat, werden mit G. oxydans in Schüttelkolben bei Raumtemperatur behandelt. Nach drei Tagen war im wesentlichen das gesamte N-n-Butylglucamin gemäß HPLC-Test in 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose übergeführt.
- 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose wird wie folgt gereinigt. Nach dem Zentrifugieren zur Entfernung der Zellen wird der klare rotbraune Überstand mit Holzkohle (2 g in 167 ml) behandelt, um entfärbt zu werden. Diesem Filtrat werden 3 g Amberlite (Rohm & Haas) 200-Harz zugesetzt (vorher behandelt mit konzentrierter HCl und mit Wasser gewaschen, um es in die Säureform überzuführen), wobei 45 min lang zur Entfernung anorganischer Kationen äquilibrieren gelassen wird. Nach der Entfernung des Amberlite-Harzes wird der pH, der von 4,4 auf etwa 2 gefallen ist, mit aliquoten Mengen an Pharmacia Q-Sepharose eingestellt (vorher durch wiederholte Suspensionen in 2,5n NaOH in die Hydroxid-Form übergeführt), bis der pH 4,7 erreicht. Insgesamt werden 23 g nasse Q-Sepharose zugesetzt, um Sulfat- und Chloridanionen zu entfernen. Dieses leicht cremefarbene Filtrat wird aliquot in 50 ml Serumflaschen aufgeteilt, bei -50ºC über Nacht eingefroren, dann bei Lagertemperaturen von -20ºC drei Tage lang, 0ºC 24 h lang und 20ºC 2 h lang getrocknet. Die getrockneten Phiolen werden mit Silikonstöpseln versehen, verschlossen und bei -20ºC gelagert. Die getrockneten Feststoffe wurden durch NMR und IR charakterisiert, um die Struktur zu bestätigen. Die Reinheit wurde durch Feuchtigkeitsanalyse, HPLC und Ionenchromatographie bestätigt.
- Der Mikroorganismus Dorynebacterium betea (ATCC 13437), auch als Curtobacterium flaccumfaciens (DSM20141) bekannt, wird hergestellt durch das Beimpfen von 300 ml autoklavierter Nährlösung, enthaltend 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefe-Extrakt, und 5 g/l Sorbit, mit einer aliquoten 0,5 ml Menge an Kultur aus einer Vorratsphiole. Diese Lösung wurde zusammen mit 0,3 ml Schaumverhüter (wie UCON LB625) zu einem sterilen 2,8 1 Schüttelkolben transferiert. Der Kolben wird auf einen Schüttler gesetzt, der bei 200 UpM bewegt wird, wobei die Temperatur bei 25ºC gehalten wird. Nach 24 h Inkubieren werden die Zellen (die sich auf der Basis der optischen Dichte in der späten log-Phase befinden) aseptisch durch Zentrifugieren geerntet. Die Zellen werden zu einem 200 ml Schüttelkolben ohne Ablenkplatte transferiert, der 50 ml autoklavierte Nährlösung (wie oben) enthält, in der 1 g N- n-Butylglucamin gelöst wurden. Diese das N-n-Butylglucamin enthaltende Lösung hat einen pH von etwa 8. Der Schüttelkolben wird bei 25ºC auf einem Schüttler inkubiert, der 48 h lang bei 200 UpM bewegt wird. Der HPLC-Test zeigt, daß etwa 3 % des N- n-Butylglucamins in 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose übergeführt waren.
- N-n-Butylglucamin wird in Wasser gelbst und der pH mit Salzsäure auf 5,0 eingestellt und 20 mM Magnesiumsulfat zugesetzt, wobei eine End-Konzentration von N-n-Butylglucamin von 5 g/l erhalten wird. Zu 50 ml dieser Lösung (in einem autoklavierten 500 ml Schüttelkolben) werden 2 g (nasse Zellmasse) gewaschene G. oxydans-Zellen zugesetzt, und die Suspension wird bei Raumtemperatur bei 120 UpM gedreht. Nach 24 h waren 37 % der Ausgangsbeladung von N-n-Butylglucamin in 6-n-Butylamino-6- desoxy-α-L-sorbofuranose übergeführt.
- N-n-Butylglucamin wird in Wasser gelöst, wobei nach pH-Einstellung auf 5,0 (mit Salzsäure) und Zusatz von 20 mM Magnesiumsulfat eine End-Konzentration von 20 g/l erhalten wird. Zu 50 ml dieser Lösung (in einem autoklavierten 500 ml Schüttelkolben) werden 2 g (Naßmasse) gewaschene G. Oxydans-Zellen zugesetzt, und die Suspension wird unter 30ºC gesetzt und bei 200 UpM gedreht. Nach 24 h waren 47 % der Ausgangsbeladung von N-n-Butylglucamin in 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose übergeführt (gemäß HPLC-Test). Nach 48 h waren 81 % in 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose übergeführt.
- 20 g N-n-Butylglucamin werden in 156 ml Wasser suspendiert und 6 ml konzentrierte HCl zugesetzt. Dann werden 0,48 g wasserfreies Magnesiumsulfat zugesetzt, und der pH wird auf 5,0 (mit Natriumhydroxid) eingestellt. Nach dem Einstellen des Volumens auf 200 ml wird die Lösung durch ein 0,2 µm filtriert und in einen 200 ml Drehkolben gegeben. Die Lösung wird bei 1 vvm mit Luft belüftet, auf 5ºC abgekühlt, und 8,7 g (Naßmasse) gewaschene G. Oxydans-Zellen werden zugesetzt. Nach 5 Tagen waren 67 % der ursprünglichen Beladung von N-n-Butylglucamin in 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose übergeführt (gemäß HPLC-Test).
- Der pH von 50 ml einer 50 g/l N-n-Butylglucamin-Lösung wird auf 3,5 (mit Salzsäure) eingestellt, diese wird in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben, und 5 g einer 40 % Suspension von gewaschenen G. oxydans-Zellen werden zugesetzt. Diese wird bei Raumtemperatur auf einen Schüttler gegeben. Nach 24 h waren 46 % des Aminozuckers in 6-n-Butylamino-6-desoxy-αL-L-sorbofuranose gemäß HPLC-Test übergeführt.
- In 305 g Wasser werden 22 g N-n-Butylglucamin suspendiert, und der pH wird auf 7,0 (mit Salzsäure) eingestellt. Nach dem Einstellen des Volumens auf 415 ml werden aliquote 50 ml Mengen eingeteilt und 2,9 ml frisch aufgetaute und gewaschene G. oxydans-Zellen werden zugesetzt. Nach 20 h waren 81 % des Ausgangs- N-n-Butylglucamins in 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose übergeführt, wie durch HPLC-Test detektiert.
- 2,5 g N-n-Butylglucamin, suspendiert in 42 ml Wasser, werden mit Salpetersäure auf pH 5 titriert, und das Volumen wird auf 50 ml eingestellt. Dieses wird durch ein 0,2 µm Filter filtriert und in einen Schüttelkolben gegeben. Gewaschene G. oxydans-Zellen werden zugesetzt. Nach 4 h waren 44 % der Ausgangsbeladung von N-n-Butylglucamin in 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L- sorbofuranose übergeführt, und nach 24 h beträgt die Produktüberführung mehr als 90 % (gemäß HPLC-Test).
- N-n-Butylglucamin wird im wesentlichen gemäß den Lehren von Beispiel 14 hergestellt, außer daß Schwefelsäure anstelle von Salpetersäure verwendet wird. Nach 4 h zeigt der HPLC-Test eine Überführung von 7 % der Ausgangsbeladung von N-n-Butylglucamin in 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose, und nach 24 h erhöhte sich die Überführung auf 32 %.
- N-n-Butylglucamin wird im wesentlichen gemäß den Lehren von Beispiel 14 hergestellt, außer daß Essigsäure anstelle von Salpetersäure verwendet wird. Nach 4 h waren 20 % der Ausgangsbeladung von N-n-Butylglucamin in 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L- sorbofuranose übergeführt, und nach 24 h wurden 35 % der Ausgangsbeladung als 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose detektiert.
- N-n-Butylglucamin wird im wesentlichen gemäß der Lehre von Beispiel 14 hergestellt, außer daß Phosphorsäure anstelle von Salpetersäure verwendet wird. Nach 4 h wurde gemäß HPLC eine Überführung von 21 % der Ausgangsbeladung von N-n-Butylglucamin in 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose und von 44 % nach 24 h detektiert.
- 10 g N-n-Butylglucamin werden in 160 ml Wasser plus 8 ml 0,5 M Magnesiumsulfat suspendiert&sub1; dann mit Salzsäure auf pH 5,0 titriert und auf 200 ml verdünnt. Von dieser Lösung werden dann 50 ml 30 min lang bei 121ºC autoklaviert, auf Raumtemperatur abgekühlt und in einen Schüttelkolben gegeben. 24 h nach dem Zusatz von G. Oxydans-Zellen waren 57 % der Ausgangsbeladung von N-n-Butylglucamin in 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose übergeführt.
- Gluconobacter oxydans (DSM 2003) wird in Schüttelkolben unter Standardbedingungen gezüchtet, 5 % Sorbit, 2 % Hefe-Extrakt, 3 g/l Bernsteinsäure, pH 6,3, 30ºC (siehe S.A. White and G.W. Claus (1982), J. Bacteriology 150:934-943 und Noel R. Krieg Hrg., Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bd. 1, Williams & Wilkins, Baltimore/London, S. 275; c. 1984). Die Zellen wurden durch Zentrifugieren isoliert und mit 20 mM Magnesiumsulfat (bei 2ºC) gewaschen. Zu 50 ml N-n-Butylglucamin (pH 5,0 mit Salzsäure) werden 2 g gepackte nasse Zellen zugesetzt, und diese Suspension wird bei 120 UpM bei Raumtemperatur 24 h lang gerührt. Nach 24 h zeigt HPLC-Analyse, daß 38 % der Ausgangsbeladung von N-n-Butylglucamin in 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose übergeführt waren.
- Gluconobacter oxydans (ATCC 621) wird gezüchtet und überführt N-n-Butylglucamin im wesentlichen gemäß der Lehre von Beispiel 6, außer daß 51 % des Ausgangs-N-n-Butylglucamins in 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose übergeführt werden.
- Eine Reaktionslösung wird durch den Zusatz von 91 g N-n-Butylglucamin zu 580 ml Wasser in einem 1 l Bioreaktor hergestellt. Die Suspension wird auf etwa pH 5 (mit konzentrierter HCl) eingestellt und auf etwa 15ºC abgekühlt. Insgesamt werden 24 g (Naßmasse) gewaschene G. oxydans-Zellpaste zugesetzt, und die Reaktionsmischung wird gerührt (500 UpM) und belüftet (0,5 vvm), wobei die Temperatur bei 15ºC und der pH bei 5 reguliert wird. Nach 23 h zeigt der HPLC-Test, daß mehr als 99 % des Substrats für eine 83 % Ausbeute an 6-n-Butylamino-6-desoxy- α-L-sorbofuranose übergeführt waren.
- Eine Reaktionslösung wird durch den Zusatz von 750 g N-n-Butylglucamin zu 7,2 1 Wasser in einem 10 1 Bioreaktor hergestellt. Die Suspension wird auf pH 5 (mit konzentrierter Hcl) eingestellt und auf etwa 15ºC abgekühlt. Insgesamt werden 300 g (Naßmasse) gewaschene G. oxydans-Zellpaste zugesetzt, und die Reaktionsmischung wird gerührt (350 bis 500 UpM) und belüftet (0,4 vvm), wobei die Temperatur bei 15ºC und der pH bei 5 reguliert wird. Nach 14 h zeigt der HPLC-Test, daß mehr als 97 % des Substrats für eine Ausbeute von 85 % an 6-n-Butylamino-6-desoxy- α-L-sorbofuranose übergeführt waren.
- Eine Reaktionslösung wird durch den Zusatz von 46 g N-n-Butylglucamin zu 620 ml Wasser in einem 1 l Bioreaktor hergestellt. Die Suspension wird auf pH 5 (mit konzentrierter Salzsäure) eingestellt und auf etwa 15ºC abgekühlt. Insgesamt werden 30 g (Naßmasse) gewaschene G. oxydans-Zellpaste zugesetzt, und die Reaktionsmischung wird gerührt (350 UpM) und belüftet (0,2 vvm), wobei die Temperatur bei 15ºC und der pH bei 5 reguliert wird. Nach 77 h zeigt der HPLC-Test, daß mehr als 97 % des Substrats für eine 75 % Ausbeute von 6-n-Butylamino-6- desoxy-α-L-sorbofuranose übergeführt waren.
- Eine Reaktionslösung wird durch den Zusatz von 81 g N-n-Butylglucaminhydrochlorid zu 640 ml Wasser in einem 1 1 Bioreaktor hergestellt. Die Lösung, die einen pH von 5 aufweist, wird auf etwa 15ºC abgekühlt. Insgesamt werden 70 g (Naßmasse) gewaschene G. oxydans-Zellpaste zugesetzt, und die Reaktionsmischung wird gerührt (400 UpM) und belüftet (0,5 vvm), wobei die Temperatur bei 15ºC und der pH bei 5 reguliert wird. Nach 20 h zeigt der HPLC-Test, daß mehr als 99 % des N-n-Butylglucamins für eine 80 % Ausbeute von 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose übergeführt waren.
- Eine Reaktionslösung wird hergestellt durch den Zusatz von 170 ml einer Masselösung von N-n-Butylglucaminhydrochlorid mit einer Konzentration von 450 g/l (gemäß HPLC) zu 210 ml Wasser in einem 1 l Bioreaktor. Die Lösung wird durch den Zusatz von verdünntem Natriumhydroxid auf pH 5 eingestellt und auf etwa 15ºC abgekühlt. Insgesamt werden 20 g (Naßmasse) gewaschene G. oxydans-Zellpaste zugesetzt, und die Reaktionsmischung wird gerührt (1000 UpM) und belüftet (1 vvm), wobei die Temperatur bei 15ºC und der pH bei 5 reguliert wird. Nach 27 h zeigt der HPLC-Test, daß mehr als 97 % des Substrats für eine Ausbeute von 80 % von 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose übergeführt waren.
- 1,0 g N-Ethylglucamin wird in 50 ml Wasser suspendiert und mit konzentrierter HCl auf pH 5,0 titriert (wobei gleichzeitig der Aminozucker gelöst wird). Diese Lösung wird in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben. Dieser Lösung werden 2,0 g (Naßmasse) gewaschene Gluconobacter oxydans-Zellen zugesetzt, und die Lösung wird bei 100 bis 120 UpM gerührt. Nach 24 h zeigt HPLC-Analyse, daß 70 % der Ausgangsbeladung von N-Ethylglucamin in 6-n-Ethylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose und nach 48 h zumindest 90 % übergeführt waren. Nach 72 h wird der Überstand von den Zellen getrennt und sterilfiltriert. Eine aliquote Menge (10 ml) des Überstands wird mit konzentriertem NH&sub4;OH auf pH 9, eingestellt, in einem Eisbad gekühlt, und 100 mg NaBH&sub4; werden zugesetzt. Nach dem Stehenlassen im Eisbad über Nacht werden die Proben acetyliert und durch Gaschromatographie (GC)-Massenspektroskopie getestet. GC-Massenspektroskopie zeigt eine 60 % Ausbeute von N-Ethyl-1-desoxynojirimycin aus 6-n-Ethylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose (chemische Ionisationsmassenspektroskopie des acetylierten Produktes zeigt, daß der dem reduzierten cyclisierten Produkt entsprechende GC-Peak eine Stamm-Peakmasse von 360 (M+H) aufweist, was tetraacetyliertem N-Ethyl-1-desoxynojirimycin entspricht).
- N-(2-Hydroxyethyl)-glucamin wird im wesentlichen gemäß der Lehre von Beispiel 26 mikrobiell oxidiert, außer daß N-(2-Hydroxyethyl)-glucamin anstelle von N-Ethylglucamin verwendet wird, und N-(2-Hydroxyethyl)-1-desoxynojirimycin anstelle von N-Ethyl-1-desoxynojirimycin erhalten wird. HPLC-Analyse nach 24 h zeigt, daß 79 % der Ausgangsbeladung von N-(2-Hydroxyethyl)-glucamin in 6-(2-Hydroxyethyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose übergeführt waren. Nach 48 h waren zumindest 90 % der Ausgangsbeladung übergeführt. Nach 72 h wird der Überstand von den Zellen getrennt und sterilfiltriert. Der pH einer aliquoten Menge (10 ml) wird mit konzentriertem NH&sub4;OH auf pH 9,0 eingestellt, in einem Eisbad gekühlt, und 100 mg NaBH&sub4; werden zugesetzt. Nach dem Stehenlassen im Eisbad über Nacht werden die Proben acetyliert und durch Gaschromatographie-Massenspektroskopie (GC-MS) getestet. GC-MS zeigt eine 95 % Ausbeute von N-(2-Hydroxyethyl)-1-desoxynojirimycin aus 6-(2-Hydroxyethyl)amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose (chemische Ionisationsmassenspektroskopie des acetylierten Produkts zeigt, daß der GC-Peak, der dem reduzierten cyclisierten Produkt entspricht, eine Stamm- Peakmasse von 418 (M+H) aufweist, was dem pentaacetylierten N-2-Hydroxyethyl-1-desoxynojirimycin entspricht).
- N-Phenylmethylglucamin wird im wesentlichen gemäß der Lehre von Beispiel 26 mikrobiell oxidiert, außer daß N-Phenylmethylglucamin anstelle von N-Ethylglucamin verwendet wird, und N-Phenylmethyl-1-desoxynojirimycin anstelle von N-Ethyl-1-desoxynojirimycin erhalten wird. Nach 4 h zeigt die HPLC-Anlayse, daß 48 % der Ausgangsbeladung von N-Phenylmethylglucamin in 6-(Phenylmethyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose übergeführt waren. Nach 24 h waren zumindest 90 % der Ausgangsbeladung übergeführt. Bei Reduktion und Acetylierung im wesentlichen gemäß der Lehre von Beispiel 26 ergab GC-MS (chemische Ionisation) einen Stamm-Peak (M+H) von 422, der dem Tetraacetyl-N-phenylmethyl-1-desoxynojirimycin entspricht. GC zeigt eine 98 % Ausbeute von N-Phenylmethyl-1-desoxynojirimycin aus 6-(Phenylmethyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose.
- N-n-Octylglucamin wird im wesentlichen gemäß der Lehre von Beispiel 26 mikrobiell oxidiert, außer daß N-n-Octylglucamin anstelle von N-Ethylglucamin verwendet wird, und N-n-Octyl-1- desoxynojirimycin anstelle von N-Ethyl-1-desoxynojirimycin erhalten wird. Aufgrund der hohen Affinität des N-n-Octylglucamins für die zur Analyse der Überführungen verwendeten Harze wird der HPLC-Test nicht verwendet. Die Überführung wird durch Reduktion mit NaBH&sub4; bei alkalischem pH, Acetylierung und GC-Massenspektroskopie überwacht. Bei Reduktion und Acetylierung im wesentlichen gemäß der Lehre von Beispiel 26 ergibt GC-MS Tetraacetyl-N-octyl-1-desoxynojirimycin entspricht. GC-MS zeigt eine 94 % Ausbeute von N-n-Octyl-1-desoxynojirimycin aus 6-n-Octylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose.
- Etwa 1500 ml einer wässerigen Lösung, die etwa 96 g (0,41 mol) 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose enthält, werden in einen 4 1 Erlenmeyer-Kolben geladen, gefolgt von 13 g Kohle zur Entfärbung. Die Mischung wird etwa 10 min lang gerührt und die Kohle abfiltriert. Das Filtrat wird einer 2,3 1 Parr- Flasche zugesetzt, die etwa 19 g (50 % naß) 4 % Palladium-auf- Kohle enthält. Die Mischung wird etwa 5 h lang bei 413,68 kPa (60 psig) Wasserstoffdruck und Umgebungstemperatur hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators werden 550 ml Dowex 50 x 8-200 Ionenaustauscherharz (Dow Chemical, Midland, MI), ein stark saures Kationenaustauscherharz mit einem Polystyroldivinylbenzol-Gerüst, dem Filtrat zugesetzt. Die Aufschlämmung wird 30 min lang gerührt und das Harz (welches das Produkt enthält) gesammelt. Das Filtrat wird erneut (wie oben beschrieben) mit etwa 250 ml Dowex-Harz behandelt. Die beiden Harzfilterkuchen werden kombiniert und das Produkt unter Verwendung von etwa 2,5 1 MeOH/NH&sub4;OH (4:1) aus dem Produkt freigesetzt. Die Extrakte werden konzentriert und das Wasser azeotrop abdestilliert. Der Rückstand wird aus etwa 610 ml Methanol/Aceton (1:16) umkristallisiert. Die Feststoffe werden in etwa 375 ml Methanol gelöst und unter Verwendung von etwa 7,6 g Kohle entfärbt. Das Filtrat wird konzentriert und der Rückstand aus etwa 625 ml Methanol/ Ethylacetat (1:9) umkristallisiert. Dann wird das Produkt getrocknet.
- Ausbeute: 65 g = 75 % der Theorie
- Schmelzpunkt: 132-135ºC
- Reinheit durch derivitisierten GC-Test: 99,5 %
- Einige Reaktionslösungen, wie die in Beispiel 5, 6 und 7 hergestellten, werden zentrifugiert, vereinigt und filtriert, wobei eine geklärte Lösung zur Überführung in N-n-Butyl-1-desoxynojirimycin erhalten wird. Etwa 100 ml dieser klaren jedoch gefärbten Lösung werden zuerst mit Aktivholzkohle behandelt und dann zu einem Parr-Laborreaktor (Baxter Healthcare Corp., Scientific Products Division, McGaw, IL) transferiert, dem auch Palladium/Kohle-Katalysator zugesetzt wird. Das System wird bei Raumtemperatur mit 344,7 kPa (50 psig) Wasserstoff etwa 2,5 h lang betrieben, wonach der Katalysator abfiltriert wird, um ein Filtrat zur weiteren Reinigung herzustellen. Das Filtrat wird mit einem stark sauren Kationenharz (Dowex 50 x 8 - 200 Mesh) in Berührung gebracht, um das Produkt (N-Butyl-1-desoxynojirimycin) zu absorbieren, das mit einer Methanol:Ammoniumhydroxid (3:1)- Lösung eluiert wird. Diese Lösung wird durch Eindampfen zu einem dicken Öl konzentriert, wonach eine Mischung von Methanol:Aceton (1:16) zugesetzt wird, um das Produkt zu kristallisieren. Das isolierte Material wird als N-n-Butyl-1-desoxynojirimycin mit einer Reinheit von 99,5 % gemäß Gaschromatographie (GC)-Test für eine isolierte Ausbeute von 53 % von N-n-Butyl-1-desoxynojirimycin identifiziert.
Claims (45)
1. Verfahren, welches umfaßt: Oxidieren von Glucamin der
Formel:
oder Salzen hievon mit einer Oxidationsmikrobe oder einem
Extrakt hievon und Herstellen einer Verbindung der Formel:
worin R Phenyl, C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkyl, C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkyl substituiert mit
Phenyl oder Carboxy, oder C&sub2;-C&sub1;&sub0;-Alkyl substituiert mit Hydroxy
bedeutet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Mikrobe zur
Ordnung Pseudomonadales gehört.
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei welchem die Mikrobe
Gluconobacter oxydans ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem die Mikrobe
Gluconobacter oxydans, Subsp. suboxydans, ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Mikrobe zur
Familie Coryneform gehört.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem die Mikrobe
Corynebacterium betea ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Mikrobe in Form
einer Zellsuspension verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Mikrobe in Form
immobilisierter Zellen verwendet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei R C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkyl bedeutet.
10. Verfahren nach Anspruch 9, bei welchem N-n-Butylglucamin
oxidiert und 6-n-Butylamino-6-desoxy-a-L-sorbofuranose
hergestellt
wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9, bei welchem N-n-Octylglucamin
oxidiert und 6-n-Octylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose
hergestellt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 9, bei welchem N-Ethylglucamin
oxidiert und 6-Ethylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose hergestellt
wird.
13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei R C&sub2;-C&sub1;&sub0;-Alkyl,
substituiert mit Hydroxy, bedeutet.
14. Verfahren nach Anspruch 13, bei welchem
N-(2-Hydroxyethyl)glucamin oxidiert und 6-(2-Hydroxyethyl)-amino-6-desoxy-α-L-
sorbofuranose hergestellt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei R Ci-C&sub1;&sub0;-Alkyl,
substituiert mit Phenyl, bedeutet.
16. Verfahren nach Anspruch 15, bei welchem
N-Phenylmethylglucamin oxidiert und 6-(Phenylmethyl)-amino-6-desoxy-α-L-
sorbofuranose hergestellt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei R C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkyl,
substituiert mit Carboxy, bedeutet.
18. Verfahren nach Anspruch 17, bei welchem
N-(3-Carboxypropyl)-glucamin oxidiert und 6-(3-Carboxypropyl)-amino-6-
desoxy-α-L-sorbofuranose hergestellt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem N-Phenylglucamin
oxidiert und 6-Phenylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose
hergestellt wird.
20. Verfahren, welches umfaßt: Oxidieren von Glucamin der
Formel:
oder Salzen hievon, worin R Phenyl, C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkyl, C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkyl
substituiert mit Phenyl oder Carboxy, oder C&sub2;-C&sub1;&sub0;-Alkyl
substituiert mit Hydroxy bedeutet, mit einer Oxidationsmikrobe oder
einem Extrakt hievon und Herstellen einer Verbindung der Formel:
worin R wie oben beschrieben ist, und anschließend Reduzieren
der Verbindung, wobei N-substituiertes 1-Desoxynojirimycin der
Formel:
worin R wie oben beschrieben ist, erhalten wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20, bei welchem die Mikrobe zur
Ordnung Pseudomonadales gehört.
22. Verfahren nach Anspruch 21, bei welchem die Mikrobe
Gluconobacter oxydans ist.
23. Verfahren nach Anspruch 22, bei welchem die Mikrobe
Gluconobacter oxydans, Subsp. suboxydans, ist.
24. Verfahren nach Anspruch 20, bei welchem die Mikrobe zur
Familie Coryneform gehört.
25. Verfahren nach Anspruch 24, bei welchem die Mikrobe
Corynebacterium betea ist.
26. Verfahren nach Anspruch 20, bei welchem N-n-Butylglucamin
oxidiert wird, wobei 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose
hergestellt wird, die dann reduziert wird, wobei N-n-Butyl-1-
desoxynojirimycin erzeugt wird.
27. Verfahren nach Anspruch 20, bei welchem
N-(2-Hydroxyethyl)glucamin oxidiert wird, wobei 6-(2-Hydroxyethyl)-amino-6-desoxy-
α-L-sorbofuranose hergestellt wird, die reduziert wird, wobei
N-(2-Hydroxyethyl)-1-desoxynojirimycin erzeugt wird.
28. Verfahren nach Anspruch 20, bei welchem N-n-Octylglucamin
oxidiert wird, wobei 6-n-Octylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose
hergestellt wird, die reduziert wird, wobei N-n-Octyl-1-
desoxynojirimycin erzeugt wird.
29. Verfahren nach Anspruch 20, bei welchem
N-Phenylmethylglucamin oxidiert wird, wobei 6- (Phenylmethyl)-amino-6-desoxy-α-
L-sorbofuranose hergestellt wird, die reduziert wird, wobei
N-Phenylmethyl-1-desoxynojirimycin erzeugt wird.
30. Verfahren nach Anspruch 20, bei welchem
N-(3-Carboxypropyl)-glucamin oxidiert wird, wobei
6-(3-Carboxypropyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose hergestellt wird, die reduziert wird,
wobei N-(3-Carboxypropyl)-1-desoxynojirimycin erzeugt wird.
31. Verfahren nach Anspruch 20, bei welchem N-Phenylglucamin
oxidiert wird, wobei 6-Phenylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose
hergestellt wird, die reduziert wird, wobei N-Phenyl-1-
desoxynojirimycin erzeugt wird.
32. Verfahren nach Anspruch 20, bei welchem N-Ethylglucamin
oxidiert wird, wobei 6-Ethylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose
hergestellt wird, die reduziert wird, wobei N-Ethyl-1-
desoxynojirimycin erzeugt wird.
33. Verfahren, welches umfaßt: Aminieren von D-Glucose zu einem
N-substituierten Glucamin der Formel:
oder Salzen hievon, worin R Phenyl, C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkyl, C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkyl
substituiert mit Phenyl oder Carboxy, oder C&sub2;-C&sub1;&sub0;-Alkyl
substituiert mit Hydroxy bedeutet, mit einer Oxidationsmikrobe oder
einem Extrakt hievon und Herstellen einer Verbindung der Formel:
worin R wie oben beschrieben ist, und anschließend Reduzieren
der Verbindung, wobei N-substituiertes 1-Desoxynojirimycin der
Formel:
worin R wie oben beschrieben ist, erhalten wird.
34. Verfahren nach Anspruch 33, bei welchem die Mikrobe zur
Ordnung Pseudomonadales gehört.
35. Verfahren nach Anspruch 34, bei welchem die Mikrobe
Gluconobacter oxydans ist.
36. Verfahren nach Anspruch 35, bei welchem die Mikrobe
Gluconobacter oxydans, Subsp. suboxydans, ist.
37. Verfahren nach Anspruch 33, bei welchem die Mikrobe eine
Coryneform ist.
38. Verfahren nach Anspruch 37, bei welchem die Mikrobe
Coryneform betea ist.
39. Verfahren nach Anspruch 33, bei welchem D-Glucose zu
N-n-Butylglucamin aminiert wird, das seinerseits oxidiert wird,
wobei 6-n-Butylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose hergestellt
wird, die reduziert wird, wobei N-n-Butyl-1-desoxynojirimycin
erzeugt wird.
40. Verfahren nach Anspruch 33, bei welchem D-Glucose zu
N-(2-Hydroxyethyl)-glucamin aminiert wird, das seinerseits
oxidiert wird, wobei 6-(2-Hydroxyethyl)-amino-6-desoxy-α-L-
sorbofuranose hergestellt wird, die reduziert wird, wobei
N-(2-Hydroxyethyl)-1-desoxynojirimycin erzeugt wird.
41. Verfahren nach Anspruch 33, bei welchem D-Glucose zu
N-n-Octylglucamin aminiert wird, das seinerseits oxidiert wird,
wobei 6-n-Octylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose hergestellt
wird, die reduziert wird, wobei N-n-Octyl-1-desoxynojirimycin
erzeugt wird.
42. Verfahren nach Anspruch 33, bei welchem D-Glucose zu
N-Phenylmethylglucamin aminiert wird, das seinerseits oxidiert
wird, wobei 6-(Phenylmethyl)-amino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose
hergestellt wird, die reduziert wird, wobei N-Phenylmethyl-1-
desoxynojirimycin erzeugt wird.
43. Verfahren nach Anspruch 33, bei welchem D-Glucose zu
N-(3-Carboxypropyl)-glucamin aminiert wird, das seinerseits
oxidiert wird, wobei 6-(3-Carboxypropyl)-amino-6-desoxy-α-L-
sorbofuranose hergestellt wird, die reduziert wird, wobei
N-(3-Carboxypropyl)-1-desoxynojirimycin erzeugt wird.
44. Verfahren nach Anspruch 33, bei welchem D-Glucose zu
N-Phenylglucamin aminiert wird, das seinerseits oxidiert wird,
wobei 6-Phenylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose hergestellt wird,
die reduziert wird, wobei N-Phenyl-1-desoxynojirimycin erzeugt
wird.
45. Verfahren nach Anspruch 33, bei welchem D-Glucose zu
N-Ethylglucamin aminiert wird, das seinerseits oxidiert wird,
wobei 6-Ethylamino-6-desoxy-α-L-sorbofuranose hergestellt wird,
die reduziert wird, wobei N-Ethyl-1-desoxynojirimycin erzeugt
wird.
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