DE69115104T2

DE69115104T2 - Composition comprising at least two different antibodies or fragments thereof.

Info

Publication number: DE69115104T2
Application number: DE69115104T
Authority: DE
Inventors: Thomas Stewart Beggs; Paul James Davis
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Givaudan Nederland Services BV
Priority date: 1990-03-21
Filing date: 1991-03-20
Publication date: 1996-05-15
Anticipated expiration: 2011-03-21
Also published as: CA2038578A1; AU641736B2; DE69115104D1; EP0453097B1; EP0453097A3; JP3098050B2; JPH05262669A; AU7299591A; BR9101117A; ATE131069T1; CA2038578C; IN172885B; ES2082132T3; EP0453097A2

Description

Gebiet und Hinterarund der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Abgabe von Wirkstoffen an Zielorte mit der Maßgabe der Bindung an die Zielorte. Die Funktion des Stoffes wird gewöhnlich therapeutisch sein, kann jedoch auch kosmetisch sein.
Die Verwendung eines Antikörpers zur Bindung eines therapeutischen Mittels an Zielorte wurde bereits mit Glucoseoxidase als therapeutisches Mittel vorgeschlagen. Dieses Enzym katalysiert die Oxidation von Glucose zu Gluconsäure durch molekularen Sauerstoff unter Herstellung von Wasserstoffperoxid bei den Verfahren.
Wasserstoffperoxid wird rasch in vivo zersetzt, zeigt jedoch, wenn es in die Nähe der Zielzellen gebracht werden kann, für diese Zellen starke Toxizität.

Zusammenfassung des Standes der Technik

Knowles et al., J. Clinical Investigation 52 1443 (1973) beschrieben die Verwendung von chemisch an Antikörper konjugierter Glucoseoxidase, wobei diese in der Lage sind, an Zielzellen zu binden, wodurch die Zellabtötungswirkung gegen jene Zellen, die selektiv beseitigt werden sollen, ausgerichtet wird. Zellabtötung wurde jedoch nur erreicht, wenn weitere (nicht gezielte) Enzyme in dein umgebenden Medium zur Erzeugung von toxischeren Spezies vorlagen.
Okuda et al., Infection and Immunity 27 690 (1980) beschreiben eine Weiterentwicklung der Arbeit von Knowles et al.. Okuda et al. verwendeten zwei Enzyme, beide chemisch an Antikörper für Zielzellen konjugiert. Die Enzyme waren Xanthinoxidase, die zumindest überwiegend Superoxid erzeugt, anstelle von Peroxid, und Lactoperoxidase. Über einen Zeitraum von 90 Minuten erreichten sie in vitro eine Reduktion von lebenden Candida albicans-Zellen, in vitro, was zwischen einer und zwei Größenordnungen besser war als mit Lactoperoxidase in Lösung erreicht wurde.
Arnold et al., J. Dent. Res. 59B, 961 (1980) beschrieben die Verwendung eines chemischen Konjugats von Glucoseoxidase/Antikörper gegen orale Bakterien, erreichten jedoch nur reversible Bacteriostasis anstatt Zellabtötung.
Lal et al., Journal of Immunological Methods 79 307 (1985) verwendeten chemisch an Maus-Anti-Ratte-Antikörpern konjugiertes Enzym zusammen mit Rattenantikörpern für Zielzellen. Sie waren in der Lage, einen Teil der Zielzellen abzutöten.
WO-89/11866 offenbart ein Bakterizid, chemisch konjugiert an einen Antikörper, der an mit Zahnplaoue/Karies verbundene Bakterien bindet.
EP-A-361 908, entsprechend WO-90/3185, beide veröffentlicht im April 1990, und WO-90/112, veröffentlicht im Januar 1991, offenbaren beide Enzyme mit zytotoxischer Wirkung, gebunden über kovalente Bindung an einen Antikörper, der in der Lage ist, an einen Zielort zu binden.
Pene et al., Biochemistry International 13 233 (1986) offenbaren Enzyme, die chemisch an Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper gebunden sind, welche an Kaninchen-Antikörper für Zielmyelomazellen binden.
EP-A-315 364 beschreibt ein Immunoassayverfahren, das die Herstellung eines Komplexes für einen ersten Antikörper oder Antigen, einen zweiten Antikörper oder Antigen und das zu bestimmende Antigen oder den zu bestimmenden Antikörper nach sich zieht.

Zusammenfassung der vorliegenden Erfindung

In der vorliegenden Erfindung wird ein an den Zielort abzugebender Stoff an den Zielort unter Verwendung einer Mehrzahl von Antikörpern oder Antikörperfragmenten zur Bildung einer Brücke zwischen dem Stoff und dem Zielort gebunden. Der erhaltene Komplex weist das Vermögen auf, sich selbst aufzubauen.
Folglich enthalten in der vorliegenden Erfindung ein oder mehrere Vehicula in den gleichen oder getrennten Vehicula:
i) einen ersten Antikörper oder ein erstes Antikörperfragment zur Bindung an einen Zielort,
ii) einen oder mehrere weitere Antikörper oder Antikörperfragmente, die in der Lage sind, gemeinsam durch Antikörper-Antigenbindung sowohl an einen Wirkstoff, als auch an den/das erste(n) Antikörper oder -fragment zu binden, wodurch der Stoff an den Zielort gebunden wird.
Ein Aspekt der Erfindung besteht in einem Produkt, umfassend die vorstehend genannten Vehicula. Ein weiterer Aspekt ist ein Verfahren zur Abgabe eines Wirkstoffs, insbesondere Enzym bzw. Enzyme durch Verabreichung von Vehicula.
Der Wirkstoff kann in einem der Vehicula eingeschlossen sein, jedoch kann alternativ der Wirkstoff ein Material sein, das in vivo in allgemeiner Nähe des Zielortes vorliegt. Die Antikörper oder -fragmente würden dann zur Konzentrierung des Stoffes am Zielort dienen, wodurch die Wirksamkeit gegen das Ziel erhöht wird.
Aufgrund Antikörper-Antigenbindung kann/können Wirkstoff(e) an einen Zielort als Komplexe gebunden werden, die sich spontan ausbilden, wenn ihre Bestandteile zusammenkommen.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Einige Anordnungen, Ausführungsformen der Erfindung, sind beispielhaft in den beigefügten Zeichnungen erläutert, die alle schematische Darstellungen von Zielorten und gekuppeltem/n Enzym(en) darstellen. In diesen Schemata bedeutet G.Ox Glucoseoxidase, HRP bedeutet Meerrettichperoxidase und PEI bedeutet Polyethylenimin.
In den Zeichnungen:
zeigt Figur 1 ganze Antikörper, verwendet zum Binden von Glucoseoxidase an ein Ziel;
Figur 2 zeigt eine ähnliche Bindung von einem komplexeren therapeutischen Mittel;
Figur 3 zeigt eine Bindung von Glucoseoxidase wie in Figur 1 plus chemische Konjugation eines zweiten Enzyms;
Figur 4 zeigt die Bindung von zwei Enzymen an einen Zielort, wobei beide durch ganze Antikörper gebunden sind und
Figur 5 zeigt die Bindung an Enzyme für ein Ziel, wobei Antikörperfragmente verwendet werden.

Beschreibung der Ausführungsformen im einzelnen

Wie vorstehend ausgeführt, bindet ein erster Antikörper oder ein erstes Antikörperfragment an einen Zielort und einer oder mehrere weitere Antikörper oder -fragmente binden zusammen einen Stoff an den Zielort.
Wenn die Erfindung mit ganzen Antikörpern ausgeführt wird, können die weiteren Antikörper ein Antikörper für den Wirkstoff sein, abgeleitet von (beispielsweise erzeugt in) derselben Spezies wie der Antikörper für den Zielort und weitere Spezies-Antikörper für Immunoglobulin der ersten Spezies, die als Brücke wirken und in der Lage sind, spontan einen Komplex auszubilden.
Kaninchenantikörper für S. mutans (ein Ziel) und für Glucoseoxidase (als therapeutisches Mittel) können beispielsweise zusammen mit Ziegeantikörper für Kaninchenimmunoglobulin verwendet werden. Der Ziegeantikörper weist eine Vielzahl von Stellen zum Binden an Kaninchenimmunoglobulinantigene auf und folglich kann das Enzym über eine Kette von Antikörper/Antigenbindungen gebunden werden. Diese besteht aus:
Ziel (S. mutans), gebunden an Kaninchen-S. mutans Ziege-Anti-Kaninchenimmunoglobulin, gebunden an Kaninchen- Anti-S. mutans und auch gebunden an Kaninchen-Antiglucoseoxidase, die an Glucoseoxidase selbst gebunden ist.
Eine derartige Anordnung ist in Figur 1 dargestellt, wobei Ziffer 10 einen Ort ausweist, nämlich S. mutans mit Antigenorten 12. Ziffer 14 bedeutet einen ersten Antikörper, namlich Kaninchen Anti-S. mutans. Ziffer 18 bedeutet Kaninchen-Antiglucoseoxidasebindung zu dem Enzym (G.Ox). Ziffer 20 bedeutet den überbrückenden Antikörper, nämlich Ziege-Anti- Kaninchen. Diese Anordnung dient der Bindung des zytotoxischen Enzyms an den ausgewiesenen Zielort durch einen spezifischen Antikörper für die Stelle. Wir haben eine derartige Bindung in vitro mit Abtöten der Zielzellen gezeigt.
Die Erfindung kann auch unter Verwendung von Antikörperfragmenten durchgeführt werden, insbesondere unter Ausnutzung eines ersten Antikörperfragments zur Bindung an den Zielort, zusammen mit einem oder mehreren weiteren Fragmenten zur Bindung des Wirkstoffs an das erste Fragment, wodurch das Mittel an den Zielort gebunden wird.
Das erste Antikörperfragment kann ein Fv-Fragment oder ein Antikörper für den gewünschten Zielort sein. Ein solches Fragment enthält nur die variablen Bereiche von leichten oder schweren Ketten des Antikörpers. Das Fragment kann möglicherweise ein F(ab)&sub2;-Fragment sein, das zwei kombinierende Stellen bereitstellen wurde. Es könnte alternativ so klein sein wie ein einzelner variabler Bereich einer Kette eines Antikörpers.
Verfahren zur effizienten Herstellung von biologisch wirksamen Antikörperfragmenten in E. Coli wurden von A. Skevia und A. Pluckthun (1988), Science, 240, 1038, M. Better et al., (1988), Science, 240, 1041 und E.S. Ward et al., (1989), Nature, 341, 544, beschrieben. Klonierung und Expression von Genen, die Antikörperfragmente in E. Coli kodieren, sind auch in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung EP-A- 368 684 (Medical Research Council) beschrieben.
Wir bevorzugen, daß ein erstes Antikörperfragment eine zusätzliche Peptidkette daran angehängt aufweist und außerdem Fragmente den Wirkstoff an diese Peptidkette binden. Bakterien können zur Herstellung eines variablen Bereichs mit einer extra Peptidkette, die bereits an den C-Terminus des Bereichs gebunden ist, erzeugt werden. Dies kann durch übliche genetische Techniken erreicht werden. Beispielsweise kann ein Gen, das für einen variablen Bereich kodiert, leicht mit Hilfe der ortsgerichteten Mutagenesetechnik unter Verwendung von in vitro synthetisierenden Oligonucleotiden, die die Peptide, die an den variablen Bereich angehängt werden sollen, kodieren, verlängert werden. Ortsgerichtete Mutagenese ist derzeit eine in breitem Maße verwendete Technik und hinreichende Vorschriften können in verschiedenen veröffentlichten Monographien gefunden werden, beispielsweise bei Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York. Gebundenes Extrapeptid liefert eine sehr zweckmäßige "Handhabung" für das Binden des therapeutischen Mittels.
Weitere Antikörperfragmente, die den Wirkstoff an das erste Fragment binden, sind vorzugsweise ein zweites Antikörperfragment, das in der Lage ist, an den Wirkstoff durch Antikörperantigenbindung zu binden und ein F(ab)&sub2;-Fragment (das zweiwertig ist) und in der Lage ist, an die ersten und zweiten Antikörperfragmente zu binden, insbesondere an Antigenpeptide, angehängt an die ersten und zweiten Antikörperfragmente.
Die vorliegende Erfindung könnte zur Abgabe an eine Vielzahl verschiedener Zielorte, insbesondere Zielorte, die für örtliche Anwendung an der Körperoberfläche zugänglich sind, Zielorte im Mund, und Zielorte im Material, das zeitweilig von dem Körper entfernt wird, verwendet werden. Eine bedeutende Anwendung ist die Abgabe von zytotoxischen Stoffen an Arten der supragingivalen oralen Mikroflora.
Die orale Mikroflora ist ein komplexes Ökosystem, das eine breite Vielzahl von mikrobiellen Spezies enthält. Eine dieser Spezies kann als Zielort ausgewählt werden. Die Wirkung der Zielrichtung auf eine Spezies wird der Angriff sowohl der Spezies, als auch weiterer Spezies sein, die in unmittelbarer Nähe dazu vorkommen. Durch Abgabe an eine Spezies, die in Zahnplaque auftritt, werden somit zytotoxische Stoffe an den Plaque abgegeben und werden gegen alle Spezies, die zusammen in dem Plaque vorkommen, einschließlich jenen, die für die Plaquebildung verantwortlich sind, wirken.
Extrazelluläres Dextran, hergestellt durch solche Organismen, könnte selbst als Zielort dienen, wobei in diesem Fall der erste Antikörper oder das erste Antikörperfragment Bindungsaffinität für Dextran aufweist.
Eine mögliche Zielspezies ist Streptococcus mutans. Dieses wurde als ein einen wichtigen Beitrag liefernder Faktor für Zahnplaque festgestellt und erwies sich in der Lage, klinisch Kariesläsionen bei keimfreien Tieren zu induzieren, sofern als Monoinfektion hergestellt. S. mutans hat die Fähigkeit, Nahrungskohlenhydrat für die Synthese einer unlöslichen Polysaccharidmatrix zu verwenden, die die Haftung an und die Kolonisierung von harten Oberflächen sowie die Herstellung von Säuren, die in der Lage sind, Zahnschmelz auf zulösen, erleichtert. Diese Eigenschaften wurden als wichtige Virulenzdeterminanten identifiziert. Obwohl weitere Spezies und Gattungen sich ebenfalls als sowohl säure- als auch plaqueerzeugend, oder auch Kariesbeginn bei keimfreien Tieren erzeugend erwiesen, wird S. mutans in breitem Maße als zumindest eine wichtige Ursache für Zahnabbau aufgrund des Ausmaßes seiner Säure- und Polysaccharidproduktion anerkannt.
Weitere Spezies, die als Zielspezies ausgewählt werden können, sind S. sanguis. A. viscosus und A. naeslundii. Sie liegen alle in Zahnplaque als wesentlicher Bestandteil von Spezies, die man normal in Zahnplaque findet, vor. Aufgrund des häufigen Auftretens können diese drei bevorzugte Zielspezies sein.
In einer besonders ins Auge gefaßten Anwendung dieser Erfindung ist der erste Antikörper ein Antikörper für S. mutans, S. sanguis, A. viscosus oder A. naeslundii und der Wirkstoff ist das Enzym Glucoseoxidase.
Eine weitere Anwendung ist der Angriff auf Spezies von subgingivaler Mikroflora, die für periodontale Erkrankung verantwortlich ist. Die Zielspezies könnten Bacterioides gingivalis sein.
Für eine orale Anwendung (Zahnpflege) würde es erforderlich sein, daß die Vehicula in dem Produkt für die Einnahme mit dem Mund akzeptabel sind, beispielsweise wie Vehicula, die zur örtlichen Anwendung im Mund geeignet sind.
Eine weitere mögliche Anwendung ist die Abgabe therapeutischer Stoffe zum Angriff auf menschliche Tumorzellen, insbesondere im Knochenmark, das zeitweilig aus dem Körper des Patienten zur Radiotherapie entfernt wurde.
Verschiedene Materialien werden als Wirkstoffe in Erwägung gezogen, die gemäß dieser Erfindung abgegeben werden können. Eine wichtige Möglichkeit ist ein Enzym, das in der Lage ist, ein zytotoxisches Produkt zu erzeugen: Glucoseoxidase wurde vorstehend erwähnt. Galactoseoxidase ist ein weiteres. Wenn der Zielort der Mund ist, könnte das Substrat für dieses Enzym Galactose sein, die natürlicherweise im Joghurt vorkommt. Weitere Möglichkeiten sind Xanthinoxidase, die Superoxid erzeugt und NADP-Oxidase, die sich ebenfalls so verhält.
Weitere Enzyme, die an einen Zielort abgegeben werden können, sind Lysozym, zum Angriff der Zellwand eines gramnegativen Bakteriums oder Proteasen zum Angriff von extrazellulären Enzymen, wie jenen, die die Bildung von Zahnplaque unterstützen.
Eine weitere Kategorie von Materialien, die mit Hilfe der Erfindung abgegeben werden könnten, sind Enzyminhibitoren, die zur Inhibierung der extrazellulären Enzyme am Zielorganisnus dienen könnten.
Weitere Möglichkeiten sind Sauerstofferzeuger oder Säureerzeuger, die zur Modifizierung der Umgebung in der Nähe eines Zielortes wirken könnten. Eine besondere Möglichkeit entsteht, wenn der Zielort eine periodontale Tasche ist. Die Erzeugung von Sauerstoff oder vermindertem pH in dieser Höhle ergibt Bedingungen, die weniger günstig für die anaeroben Organismen, welche in diese Tasche eindringen können, sind.
Eine weitere Möglichkeit ist die Abgabe eines Materials, das in der Lage ist, einen begrenzenden Nährstoff zu entfernen. Insbesondere könnten Aerobactin, Enterochelin oder Porphyrin an einen Zielort in der periodontalen Tasche abgegeben werden. Sie würden mit Eisen komplexieren und die Konzentration an verfügbarem Eisen für die Bakterieneindringlinge in dieser Tasche vermindern. Diese Stoffe könnten als solche als therapeutisches Mittel verwendet werden. Sie könnten jedoch in glycosylierter Form verwendet werden, wobei die Glycosylketten für einen Antikörper oder -fragment zum Binden an die Glycosylkette antigenisch sein würden. Alternativ könnten sie kovalent an einen anderen Rest gebunden sein, an den ein Antikörper gebunden werden könnte.
Eine weitere mögliche Form eines Wirkstoffs ist ein nichtenzymartiger Katalysator. Dieser könnte ein Übergangsmetall sein, gebunden an Ligand(en). Beispielsweise zeigten Borggaard, Farver und Andersen, Acta Chem. Scand. 25 [1971] 3541, daß Eisen mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) als Ligand die Umwandlung von Wasserstoffperoxid zu Hydroxylionen katalysiert und ein OH-freies Radikal entsteht, das sehr kurzlebig, jedoch auch sehr toxisch ist.
Eine mögliche kosmetische Anwendung ist die Verminderung an Verfärbung auf Zähnen. Bei dieser Anwendung ist ein Enzym der Wirkstoff, das einen bleichenden Stoff, wie Wasserstoffperoxid, erzeugt. Der Zielort ist an der Zahnoberfläche. Binden an das Ziel gemäß dieser Erfindung dient zur Lokalisierung des Enzyms in der Nähe der Oberfläche. In der Folge wird ein bleichender Stoff in der Nähe der Zahnoberfläche, die verfärbt sein kann, erzeugt.
Innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung könnten der Wirkstoff und die Antikörper oder Fragmente von Antikörpern in einem Vehiculum enthalten sein oder unter einer Vielzahl von Vehicula verteilt sein. Im ersteren Fall wird der Komplex aus Wirkstoffen und Antikörpern im Vehiculum gebildet. Im letzteren Fall können Teile des Komplexes miteinander verbunden sein, wenn sie dazu in der Lage sind und können im selben Vehiculum vorliegen. Die Bildung des vollständigen Komplexes kann jedoch nur stattfinden, wenn alle seine Komponenten zusammenkommen.
Wenn polyklonale Antikörper verwendet werden, haben wir gefunden, daß der Wirkstoff und die Antikörper zwischen mindestens zwei Vehicula verteilt sein sollten, so daß vollständige Komplexbildung in einem Vehiculum während der Lagerung vermieden wird. Wir haben gefunden, daß während der Lagerung mit polyklonalen Antikörpern gebildete vollständige Komplexe einer Abnahme in ihrem Vermögen zur Bindung an dem Zielort unterliegen. Teilweise Komplexbildung ist tolerierbar: beispielsweise ist Binden von Enzym an Antienzymantikörper innerhalb eines einzelnen Vehiculums akzeptierbar, da die erhaltenen Konjugate lagerstabil zu sein scheinen. Wenn der erste (Antizielort) Antikörper nicht direkt an den Antikörper bindet, der an das therapeutische Mittel bindet, können diese zwei Antikörper beide in demselben Vehiculum eingeschlossen sein. Dann kann ein zweites Vehiculum den Antikörper, der zur vollständigen Komplexbildung in der Lage ist, enthalten.
Eine Möglichkeit besteht darin, daß erste und weitere Antikörper ganze Antikörper sind und mindestens einer von ihnen monoklonal ist.
Verteilung von Bestandteilen des Komplexes zwischen einer Vielzahl von Vehicula kann unnötig sein, wenn monoklonale Antikörper angewendet werden. Im allgemeinen würden monoklonale Antikörper kleinere Komplexe bilden und während der Lagerung würde anzunehmen sein, daß sie ihre Aktivität besser beibehalten als mit polyklonalen Antikörpern gebildete Komplexe. Dies trifft auch zu, wenn Antikörperfragmente verwendet werden. Ein Vorteil von Antikörperfragmenten besteht darin, daß die Komplexe, die durch Antigen-Antikörperbindung gebildet werden, ziemlich klein sind und stabiler als Komplexe mit ganzen Antikörpern sind.
Ein Produkt umfassend ein Vehiculum oder Vehicula, enthaltend einen therapeutischen Stoff und Antikörper oder Antikörperfragmente, könnte eine Vielzahl von Formen annehmen. Wenn der Zielort der Mund ist, sind Möglichkeiten Mundwasser, Zahnpasta und eine Pastille, die sich im Mund auflöst. Diese Produktformen könnten auch verwendet werden, wenn eine Vielzahl von Vehicula erforderlich werden. Beispielsweise könnte das Produkt ein Zweikomponentenmundwasser sein, welches der Anwender unmittelbar vor der Verwendung vermischt.
Es könnte eine Zahnpasta mit zwei Komponenten sein, gelagert in dem Zahnpastabehälter in einer Weise, daß sie getrennt aufbewahrt sind oder zumindest nicht vermischen, jedoch zusammen ausgegeben werden und im Mund des Anwenders vermischt werden. Solche Zweikomponenten- Zahnpastaprodukte sind an sich bekannt.
Eine weitere mögliche Produktform, die eine Vielzahl von Vehicula bereitstellt, würde eine Pastille sein, die im Mund mit verschiedenen Komponenten des in verschiedenen Bereichen der Pastille enthaltenen Komplexes zergeht. Drei getrennte Bereiche wurden vorzugsweise verwendet werden und derart angeordnet, daß die Komponenten des Komplexes in der Reihenfolge freigesetzt werden, beginnend mit dem ersten (Antizielort) Antikörper. Diese würden gestatten, daß der Komplex sich am Zielort anordnet.
Zwei Vehiculum-Formen könnten in Kombination als Weg zur Bereitstellung einer Vielzahl von Vehicula verwendet werden, beispielsweise Zahnpasta, deren Anwendung gefolgt wird von Mundwasser oder Pastille.
Wenn der Wirkstoff ein Enzym ist, kann das Produkt ein Substrat für die Enzymwirkung einschließen oder kann selbst auf dem Enzymsubstrat, das am Zielort vorliegt, beruhen. Wenn das Enzym Glucoseoxidase ist, ausgerichtet auf einen Zielort im Mund, könnte das Produkt somit auf Glucose aus der Nahrung als Enzymsubstrat beruhen oder es könnte selbst Glucose eingemischt enthalten, vorausgesetzt, daß diese getrennt von Glucoseoxidase aufbewahrt wird.
Eine Entwicklung der Erfindung ist die Verwendung von mehr als einem Enzym, die in der Lage sind, miteinander zu wirken, mit Antikörper oder Antikörperfragmenten, die zur Bindung beider Enzyme an die Ortsstelle dienen. Somit werden die Enzyme in der Nähe zueinander und zu dem Zielort gehalten.
Diese Entwicklung kann in verschiedener Weise ausgeführt werden. Eine Möglichkeit würde für den Wirkstoff sein, daß er die zwei Enzyme, die beide über ein gemeinsames Zwischenprodukt verbunden sind, umfaßt.
Wenn beide Enzyme über ein gemeinsames Zwischenprodukt verbunden sind, kann dies ein synthetisches Polymer mit chemischer Funktionalität zur Ermöglichung der Anbindung der Enzyme durch chemische Reaktion sein. Ein geeignetes Polymer ist Polyethylenimin (PEI) , das ein verzweigtes Polymer mit Aminogruppen an den Enden der Verzweigungen darstellt. Eine Anordnung, die dies erläutert, ist in Figur 2 dargestellt, wobei Ziffern 10 bis 20 die gleiche Bedeutung wie in Figur 1 aufweisen. Die Enzyme sind Glucoseoxidase (G.Ox) und Meerrettichperoxidase (HRP).
Glucoseoxidase und Meerrettichperoxidase sind beide Enzyme mit Glycosylseitenketten. Solche Enzyme können kovalent an Polyethylenimin durch zunächst Oxidieren der Enzyme in wässeriger Lösung mit Perjodat zu Aldehydgruppen in den Glycosylseitenketten gebunden werden. Diese Gruppen bilden dann Schiff'sche Basen mit Aminogruppen an dem Polyethylenimin bei alkalischem pH (beispielsweise pH 9,5), wonach Reduktion mit Borhydrid angewendet werden kann, um nichtumgesetzte Aldehydgruppen zu reduzieren und um auch die Stabilität durch Reduktion der Schiff'schen Basen zu erhöhen.
Eine weitere Möglichkeit zur Verwendung von zwei Enzymen besteht darin, daß ein Enzym an den Zielort durch Antikörper-Antigenbindung gemäß dieser Erfindung gebunden wird, während das andere Enzym chemisch konjugiert ist (beispielsweise durch Bildung von kovalenter Bindung) an einen Antikörper, der bei der Bindung des Enzyms mit einbezogen ist.
Chemische Konjugation von einem Enzym an einen Antikörper kann durch das vorstehende Verfahren der Schiff'schen Basebildung hergestellt werden. In diesem Fall könnte das Enzym an einen überbrückenden Antikörper konjugiert sein, der bei der Verwendung an Antizielort-Antikörper bindet und an einen Antikörper des anderen Enzyms. Dies ist in Figur 3 veranschaulicht, wobei die Bezugsziffern die gleiche Bedeutung wie vorstehend aufweisen. Meerrettichperoxidase (HRP) ist chemisch an Ziege-Anti-Kaninchen-Immunoglobulin 22,20 konjugiert.
Eine dritte Möglichkeit zur Verwendung von zwei Enzymen besteht darin, daß beide Enzyme getrennt an den Zielort durch Antikörper-Antigenbindung gemäß dieser Erfindung gebunden sind. Ein separater Antikörper oder ein separates Antikörperfragment werden im allgemeinen erforderlich sein, um jedes der zwei Enzyme zu binden.
Ein einzelner erster Antikörper oder ein einzelnes erstes Antikörperfragment können verwendet werden und wenn ein überbrückender Antikörper oder ein überbrückendes Antikörperfragment zur Verbindung des ersten (Antizielort) Antikörpers oder -fragments mit den betreffenden Antienzymantikörpern oder -fragmenten verwendet wird, ist ein einzelner überbrückender Antikörper oder ein einzelnes überbrückendes Antikörperfragment in der Lage, an beide Antienzymantikörper oder Antikörperfragmente zu binden. Es ist jedoch denkbar, daß getrennte Systeme mit unterschiedlichen ersten Antikörpern oder -fragmenten und überbrückenden Antikörpern oder -fragmenten im Gemisch verwendet werden können, wobei beide an den gleichen Zielort binden.
Von besonderem Interesse ist die Kombination einer Oxidase, wie Glucose oder Galactoseoxidase, und einer Peroxidase, wie Meerrettichperoxidase, die Peroxid zur Umwandlung von Halogenidionen verwendet, zur Umsetzung von Halogenidionen zu oxidierten Halogenidspezies, die sogar toxischer als Peroxid sind. Eine Peroxidase kann auch Peroxid zur Umwandlung von Thiocyanat zu Hypothiocyanat verwenden. Oxidierte Halogenide oder Hypothiocyanatspezies können ebenfalls zum Zweck des Bleichens von Zahnverfärbung verwendet werden.
Wenn ganze Antikörper verwendet werden, ist es bevorzugt, daß Antikörper zu jedem der zwei Enzyme von derselben Spezies wie ein Antikörper für den Zielort stammen. Weitere Spezies-Antikörper zu jenen Spezies werden als ein nichtunterscheidender überbrückender Antikörper, der Komplexe zur Bindung beider Enzyme an den Zielort bildet, wirken. Diese Anordnung ist in Figur 4 veranschaulicht, worin die Bezugsziffern die gleiche Bedeutung wie vorstehend aufweisen. Ziffer 26 bedeutet Kaninchen-Antimeerrettichperoxidase.
Wenn zwei Enzyme angewendet werden, kann das Produkt Substrate für beide von ihnen einschließen, beispielsweise sowohl Glucose als auch Halogenid. Alternativ dazu kann nur ein Substrat oder überhaupt keines eingeschlossen sein und darauf vertraut werden, daß das Substrat von einer anderen Quelle kommt und am Zielort vorliegt.
Figur 5 zeigt eine bevorzugte Anordnung, bei der Antikörperfragmente verwendet werden.
Für die Bindung an Ziel 40, das Antigenstellen 42 aufweist, gibt es ein Fv-Antikörperfragment 44 mit verschiedenen Wiederholungen eines Peptids 46, angehängt an das entfernte (C-terminale) Ende einer der zwei Ketten in dem Fv- Fragment 44.
Die Wirkstoffe sind Glucoseoxidase 16 und Meerrettichperoxidase 24. Jeder ist über ein entsprechendes Fv-Fragment 48, 50 mit Spezifität für das betreffende Enzym und mit einer einzelnen Wiederholung desselben Peptids 46, angehängt an eine Kette des Fv-Fragments, gebunden.
Die Peptide 46, angehängt an die Antienzym-Fv-Fragmente, werden an Peptide 46 an dem Anti-Ziel-Fv-Fragment durch F(ab)&sub2;-Fragmente 52, die spezifisch an diese Peptide binden, gebunden. Da die F(ab)&sub2;-Fragmente zweiwertig sind, können sie eine Brücke bilden, die ein Antienzymfragment mit gebundenem Enzym an das Anti-Zielfragment 44 bindet.

Beispiele

Die Erfindung wird zusätzlich durch die nachstehenden experimentellen Beispiele erläutert, die die Wirksamkeit des Systems in vitro demonstrieren.
In den Beispielen bedeutet:
"PBS" phosphatgepufferte Salzlösung mit pH 6,5.
Glucoseoxidase war handelsübliches Enzym, abgeleitet von Aspergillus niger (Sigma Typ VII).
Ziege-Anti-Kaninchen-Ig-Antikörper wurden kommerziell von Atlantic Antibodies erhalten.
Verdünnungen sind in Form von "1/n" ausgedrückt, was die Menge an Ausgangslösung kennzeichnet, die mit einem Verdünnungsmittel zu einer Lösung vermischt wurde, worin die Konzentration ein n-tel der Ausgangslösung war.

Beispiel 1

Aufbau eines Glucoseoxidase/Anti-Glucoseoxidasekomplexes

Dieses Beispiel beschreibt eine Technik, die für eine ungefähre Anzeige von geeigneten Arbeitskonzentrationen von Komponenten eines solchen Komplexes, der als Ausgangspunkt geeignet ist, verwendet werden kann. Spätere Beispiele zeigen, daß Variationen von Konzentrationen dennoch möglich sind.
Der Komplex sollte unter Verwendung von Glucoseoxidaseenzym und drei Antikörpern, nämlich Kaninchen-Antiglucoseoxidase, Ziege-Anti-Kaninchen-Ig und Kaninchen-Anti-S. mutans gebildet werden. Arbeitskonzentrationen für das Enzym und die ersten zwei Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA- Formats mit einer festen Phase, bestehend aus immobilisierten Kaninchen-IgG zum Nachahmen von Kaninchen-Antikörper, angeheftet an S. mutans, hergestellt. Dies wurde wie nachstehend ausgeführt.
Nylonstifte wurden mit Ethanol gewaschen, anschließend nacheinander ausgesetzt:
Glutaraldehyd (wässerig, 2 %) als Kupplungsmittel, Kaninchen-IgG-Lösung (50 ug Protein pro ml in PBS), Rinderserumalbumin (0,2 %, in PBS), um überschüssiges Kupplungsmittel zu blockieren.
Zwischen und nach diesen Expositionen wurden die Stifte mit PBS gewaschen. Nach der Kupplung mit Kaninchen-IgG in dieser Weise wurden die Stifte in Halterungen eingepaßt, aus denen sie hervorstanden. Diese wurden anschließend verwendet, um die vorstehenden Stifte in den Vertiefungen von Mikrotiterschalen zu halten.
Drei Versuchslösungen von Glucoseoxidase in PBS wurden mit Konzentrationen von 40, 20 und 10 ug/ml aufgefüllt.
Vier Versuchslösungen von handelsüblichem Ziege -Anti- Kaninchen-Ig in PBS wurden durch Verdünnung einer Stammlösung auf 1/125, 1/250, 1/500 und 1/1000 ihrer ursprünglichen Konzentration verdünnt.
Kaninchen-Anti-Glucoseoxidaseserum wurde durch Immunisieren eines Kaninchens intramuskulär mit gereinigter Glucoseoxidase aus Aspergillus niger (Sigma Typ VIII) als Wasser-in-öl in Wasseremulsion in Freund'schem komplettem Adjuvans hergestellt, gefolgt von 2 Auffrischungen in Freund' schem unvollständigem Adjuvans. Die Anwesenheit von spezifischen Anti-Glucoseoxidaseantikörpern im Kaninchenserum wurde durch übliche immunologische Doppeldiffusionsverfahren und durch Festphasenimmunosorption in Polystyrolmikrotiterschalen gezeigt.
Vier Versuchslösungen, enthaltend die Kaninchen-Antiglucoseoxidase-Antikörper, wurden aus der Immunoglobulinfraktion des immunisierten Kaninchenserums mit Konzentrationen von 20, 10, 5 und 2,5 ug Kaninchen IgG/ml hergestellt. (Diese wurden durch Verdünnung einer Stammlösung, enthaltend 13 mg Kaninchen IgG pro ml, erhalten).
Komplexe wurden in Vertiefungen einer üblichen 96 Vertiefungen Mikrotiterschale durch Vermischen von gleichen Volumina Versuchslösungen, beziehungsweise enthaltend Glucoseoxidase, Ziege-Anti-Kaninchen-Ig und Kaninchen-Anti-Glucoseoxidase hergestellt. Die Versuchslösungen wurden in 48 Kombinationen vermischt. Die Gemische wurden bei Raumtemperatur für 45 Minuten inkubiert, wonach ein Nylonstift, vorher wie vorstehend beschrieben mit Kaninchen-IgG sensibilisiert, in jede Vertiefung eingesetzt wurde und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert wurde.
Die Menge an Komplexbindung für jeden Stift wurde durch Entfernen des Stiftes, Waschen und Anordnen in einem Substratgemisch, bestehend aus Tetramethylbenzidin (TMB 100 ug/ml), Meerrettichperoxidase (10 ug/ml) und Glucose (150 mM) in Phosphat/Citratpuffer, pH 6,5 bestimmt. Die Farbe wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur entwickeln lassen und die optische Dichte gemessen.
Für jede Verdünnung von Ziege-Anti-Kaninchen-IgG wurde die optische Dichte gegen die Konzentration von Kaninchen-Antiglucoseoxidase aufgetragen. Es zeigte sich, daß die beste Verdünnung von Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Reagens 1/250 war und daß bei dieser Verdünnung die Kaninchen-Antiglucoseoxidase in einer 20 ug/ml-Konzentration verwendet werden sollte. 40 ug/ml Glucoseoxidase lieferten die besten Ergebnisse, obwohl die Konzentration von Glucoseoxidase einen geringen Unterschied an gebundener Aktivität, mindestens zwischen 10 und 400 ug/ml, machte. Daher sollte eine dieser Glucoseoxidasekonzentrationen übernommen werden.

Beispiel 2

Bakterizide Aktivität des Komplexes

Ein Versuchsverfahren wurde ausgeführt, bei dem S. mutans Kaninchen-Anti-S. mutans, anschließend einem Komplex, der ähnlich zu jenem war, der in dem vorigen Beispiel beschrieben wurde und dann Glucose ausgesetzt wurde, die als Substrat für an den Komplex an S. mutans-Zellen gebundene Glucoseoxidase dient, was zur Abtötung der Zellen führt. Kontrollen wurden ausgeführt, in deren Schritten das Verfahren fortgelassen wurde.
Das Verfahren bestand aus einer Serie von Schritten wie nachstehend:
1. 10 ml aliquote Mengen einer Kultur von S. mutans in Todd Hewitt-Brühe wurden in sterile McCartney-Flaschen überführt. Die bakterielle Masse wurde zu einem Pellet zentrifugiert, 3 mal mit PBS gewaschen und in 9 ml PBS resuspendiert.
2. 1 ml Kaninchen-anti-S.mutans-Suspension wurde zugegeben. Diese Suspension war eine 1/40-Verdünnung in PBS von Kaninchen-Anti-S.mutans-Serum, erhalten durch das Verfahren von Edwards und Ewing, beschrieben in "Identification of Enterobacteriaceae", Burgess Publishing Co., Minneapolis, 1955. Die Verdünnung, die nach Zugabe der Mccartney-Flasche erreicht wurde, war natürlich 1/400. Alternativ wurde 1 ml PBS als Kontrolle verwendet.
3. Die Suspension wurde bei Umgebungstemperatur für 1 Stunde inkubiert; anschließend wurden die Zellen zu einem Pellet zentrifugiert und dreimal mit PBS gewaschen und in 9 ml PBS wie vorher resuspendiert.
4. 1 ml Glucoseoxidase/Antikörperkomplex wurde zugegeben. Dieser Komplex wurde vorher durch Vermischen von gleichen Volumina Glucoseoxidase (500 ug/ml) Kaninchen-Anti-Glucoseoxidase bei 1/200-Verdünnung in PBS und Ziege-Anti-Kaninchen-IgG bei 1/100-Verdünnung in PBS hergestellt und anschließend Komplexbildung während 1 Stunde bei Raumtemperatur entstehen lassen. Alle diese waren dieselben Materialien, die im vorigen Beispiel verwendet wurden, jedoch bei höherer Konzentration, um der anschließenden Verdünnung gerecht zu werden. Als Kontrolle wurde 1 ml PBS anstelle des Komplexes zugegeben.
5. Die Suspension wurde wiederum bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert, anschließend wurden die Zellen zu einen Pellet zentrifugiert und dreimal mit PBS gewaschen.
6. Die Zellen wurden in 10 ml 0,5 % Gewicht/Volumen filtersterilisierter D-Glucose resuspendiert. Bei einer Kontrolle wurde PBS verwendet und für einen Vergleich 0,5 % Gewicht/Volumen filtersterilisierte L-Arabinose anstelle von Glucose verwendet.
7. Die erhaltene Suspension wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden inkubiert und 0, 5 ml-Proben wurden unmittelbar nach dem Vermischen und in Intervallen entnommen. Die Bakterien jeder Probe wurden durch Zentrifugieren zu einem Pellet getrennt, welches dreimal mit PBS gewaschen wurde. Die Lebendzellen in jeder Probe wurden durch das Verfahren von Miles, Misra und Irwin J. Hygiene 38, 732 bis 749, (1938) bestimmt. Die Kombinationen der zugegebenen Materialien und die Zählung der Lebendzellen sind in nachstehender Tabelle 1 ausgeführt. Tabelle 1 Zugaben Anzahl der überlebenden Zellen Schritt Dauer der Inkubatian im Substrat (Stunden) Glucase Arabinose Ab bedeutet Anti-S. mutans wie für Schritt 2 beschrieben. Cplx = Komplex
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß durch die Verwendung des Komplexes und Glucose Zellabtötung erreicht wird, die nicht stattfindet, wenn die Kaninchen-Anti-S.mutans-Antikörper ohne den Komplex verwendet wurden. Dies zeigt daß Glucoseoxidase an die Zellen über den Komplex gebunden war, da sehr wenig freie Glucoseoxidase oder sogar ungebundener Komplex durch die Waschschritte übertragen würde.
Überraschenderweise gab es auch etwas Abtötung sogar ohne Kaninchen-Anti-S.mutans-Antikörper, was einen geringen Bindungsgrad des Komplexes direkt an S. mutans ahnen läßt.

Beispiel 3

Als eine weitere Demonstration, daß der Komplex Glucoseoxidase an Zellen bindet, wurde Beispiel 2 wiederholt, bis Schritt 5, wonach die Pellets der Zellen dreimal durch wiederholte Zentrifugation und Resuspension in Phosphat/Citratpuffer gewaschen wurden. Die gewaschenen Zellen wurden in einer Lösung von Glucose (150 mM), Meerrettichperoxidase (10 ug/ml) und Tetramethylbenzidin (100 ug/ml) in PBS resuspendiert. Das Reaktionsgemisch wurde in einer Mikrotitervertiefung gebildet. Es wurde bei Umgebungstemperatur für 30 Minuten inkubiert und anschließend die optische Dichte gemessen und mit einer Kalibrierkurve, erhalten unter Verwendung von Standardlösungen von Glucoseoxidase, verglichen.
Die Zugaben zu den S. mutans-Zellen und der Anteil an gebundener Glucoseoxidase wurden colorimetrisch, wie in Tabelle 2 nachstehend angegeben, bestimmt. Tabelle 2 ZUGABEN ANTEIL AN GLUCOSEOXIDASE Schritt Komplex nichts

Beispiel 4

Beispiel 2 wurde unter Verwendung von verschiedenen Verdünnungen von Serum bei Schritt 2 und verschiedenen Konzentrationen von Komplexbestandteilen wiederholt.
Für Schritt 2 wurden 3 verschiedene Lösungen von Anti-S. mutans-Serum verwendet. Diese waren 1/4-, 1/10- und 1/40-Verdünnungen in PBS, die Endverdünnungen ergaben, wenn sie zu den McCartney-Flaschen gegeben wurden, von 1/40, 1/100 und 1/400. PBS wurde auch als Kontrolle bei Schritt 2 verwendet.
Zwei Komplexe wurden hergestellt und bei Schritt 4 verwendet. Die verwendeten Konzentrationen zur Herstellung der Komplexe waren: Komplex Ziege-Anti-Kaninchen-IgG Kaninchen-Anti-Glucoseoxidase Glucoseoxidase Verdünnung
Komplex I wurde somit in Beispiel 2 verwendet, wohingegen Komplex II wie durch Beispiel 1 ausgewiesen war, (unter Berücksichtigung, daß der Komplex um das Zehnfache verdünnt wurde, wenn er zu der McCartney-Flasche gegeben wurde).
Für Schritt 6 wurden 0,5 % Gewicht/Volumen filtersterilisierte Glucoselösung, wie in Beispiel 2, gegeben und Lebendzellen wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, gezählt. Die verschiedenen Zugaben und Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angeführt. Tabelle 3 Anzehl der überlebenden Zellen pro ml Endverdünnung von Antiserum Schritt 2 Komplex verwendet in Schritt 4 Dauer der Inkubation im Substrat (Stunden)
Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, hatten bei Komplex I Schwankungen in der Menge an ausgerichteten Antiserum keine Auswirkung auf die Wirksamkeit der Zellabtötung, wobei alle Verdünnungen eine 100 %-ige Abtötung nach 24 Stunden ergaben und keine tatsächliche Differenz zwischen ihnen zu keiner Zeit davor auftrat. Komplex I ohne das ausgerichtete Antiserum hatte etwas zytotoxische Wirkung (aufgrund nichtspezifischer oder kreuzreaktiver Bindung), jedoch war dieser nicht so stark wie der vollständige Komplex und führte nicht zur 100 %-igen Abtötung.
Komplex II ergab auch eine 100 %-ige Abtötung nach 24 Stunden, jedoch nur mit 1/40-verdünntem, ausgerichteten Antiserum.

Beispiel 5

Dieses Beispiel zeigt die Abtötung von menschlichen Tumorzellen (gezüchtete LoVo-Zellen) unter Verwendung von Glucoseoxidase und Peroxidase, beide auf die Zellen gerichtet.
LoVo-Zellen wurden von einer Gewebekultur entnommen und in RPMI 1640-Zellkulturmedium suspendiert. Aliquote Mengen der Suspension wurden in Vertiefungen einer Gewebekulturplatte pipettiert, die 4 Tage bei 37ºC inkubiert wurde, um die LoVo-Zellen an die Platte zu heften. Das Kulturmedium wurde von der Kulturplatte abgetupft und eine aliquote Menge Maus-Anti-Lovo-Antikörpersuspension wurde zu jeder Vertiefung gegeben. Dieser Antikörper war ein monoklonaler Antikörper, bezeichnet AUA-1 (von Unipath Ltd.). (Jede aliquote Menge war 200 ul einer 1/1000-Verdünnung einer AUA-1 Antikörpersuspension).
Die Platte wurde für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, dann wurde die Antikörpersuspension abgetupft. Jede Vertiefung enthielt nun eine 200 ul aliquote Menge einer Lösung, enthaltend das Nachstehende:
Glucoseoxidase (G.ox) 10 ug/ml
Meerrettichperoxidase (HRP) 10 ug/nl
Maus-Anti-G.ox-Antikörper 1250 ng/ml
Maus-Anti-HRP-Antikörper 250 ng/ml
Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper 50 ug/ml
Es würde zu erwarten sein, daß 2 Komplexformen durch Antikörper-Antigenbindung gebildet würden, nämlich:
a) LoVo :Maus-Anti-LoVo: Kaninchen-Anti-Maus :Maus-Anti- G.Ox:G.Ox
b) LoVo :Maus-Anti-LoVo: Kaninchen-Anti-Maus Maus-Anti-HRP:HRP
Dies ist eine Anordnung, die in Figur 4 mit LoVo- Zellen als Ziel erläutert ist.
Einige Vertiefungen wurden als Kontrollen verwendet und erhielten eine aliquote Menge einer Lösung, die nur die Enzyme enthielt.
Jede Vertiefung enthielt nun eine 50 ul-Portion einer Katalaselösung. Verschiedene Katalasekonzentrationen wurden verwendet. Die Katalase diente zur Zerstörung von Wasserstoffperoxid.
Die Platte wurde für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, wonach das Ausmaß, zu dem die LoVo-Zellen lebend verblieben, bestimmt wurde. Dazu wurden 100 ul einer Lösung aus jeder Vertiefung entfernt und durch 50 ul einer 1 mg/ml-Lösung von: (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl)tetrazoliumbromid (MTT) (Sigma Chemical Co.) ersetzt. Lebendzellen erzeugten blaue Kristalle von Formazan. Diese blauen Kristalle wurden durch Zugabe von 100 ul 0,04 N HCl in Tsopropanol zu jeder Vertiefung gelöst. Die optische Dichte wurde an einem ELISA- Plattenablesegerät bei 570 nm abgelesen. Die Ergebnisse waren alle entweder eine ziemlich geringe Absorption, etwa 0,2, was eine Abwesenheit von Lebendzellen anzeigte, oder eine ziemlich hohe Absorption, etwa 1,1, wenn Lebendzellen vorlagen.
Die Ergebnisse waren: Catalasekonzentration (ug/ml) Absorption bei 570 nm Enzymlösung Enzyme und Antikörper L = 0,2 innerhalb des Versuchsfehlers H = 1,1 innerhalb des Versuchsfehlers
Die freien Enzyme töteten somit auch, wenn Catalase vorlag, die Lovo-Zellen. Bei 40 ug/ml oder mehr Catalase unterdrückte deren H&sub2;O&sub2;-Wirkung alle Zellabtötung. Geringere Konzentrationen von Catalase unterdrückten Zellabtötung durch freie Enzyme, jedoch nicht, wenn die Antikörper vorlagen. Dies zeigt, daß die Enzyme in der Lage waren, Zellen abzutöten und daß die Antikörper die Enzyme durch ihr Anhaften an den Zielzellen effektiver gestalteten.

Beispiel 6

Ähnlich Beispiel 5 zeigt dieses Beispiel die Abtötung von Zellen unter Verwendung von Glucoseoxidase und einer Peroxidase, beide auf die Zellen gerichtet. Die Zellen dieses Beispiels waren S. sanguis, d.h. eine Spezies, die im Mund auftritt. Die Antikörper, die in diesem Beispiel verwendet wurden, wurden durch Standardverfahren hergestellt.
S. sanguis-Zellen wurden aus einer Kulturbrühe zentrifugiert, dreimal durch Resuspendieren in PBS gewaschen und zentrifugiert, anschließend in PBS resuspendiert. Aliquote Mengen wurden zu jeder einer Vielzahl von Röhren gegeben, zentrifugiert und in einer filtersterilisierten Suspension (in PBS) von Maus polyklonalen Anti-S. sanguis-Antikörpern (erhalten aus der Bauchhöhlenflüssigkeit) resuspendiert. Die Suspensionen wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert, um die Antikörper an die Zellen binden zu lassen. Die Zellen wurden nochmals zentrifugiert und mit PBS gewaschen.
Einige Röhrchen, die bei dem Versuch verwendet wurden, enthielten PBS anstelle der Maus-Anti-S. sanguis-Suspension.
Danach wurden die Zellen in 1 ml PBS resuspendiert, enthaltend
Glucoseoxidase (G. ox) 100 ug/ml
Meerrettichperoxidase (HRP) 100 ug/ml
Maus-Anti-G.ox-monoklonaler Antikörper 1,25 ug/ml
Maus-Anti-HRP-monoklonaler Antikörper 1,25 ug/ml
Kaninchen-Anti-Maus-polyklonaler Antikörper 50 ug/ml
(Der Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper wurde zu einer Lösung, die bereits die 4 Stoffe enthielt, zugegeben).
In einigen Röhrchen wurde nur PBS gegen die vorstehende Enzyme und Antikörper enthaltende Lösung ausgetauscht. In weiteren Röhrchen wurde eine Enzyme und Antikörper enthaltende Lösung verwendet, jedoch wurde Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper fortgelassen.
Alle Suspensionen wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert, um die Enzyme an den Zellen binden zu lassen. Dann wurden die Zellen abzentrifugiert, mit PBS gewaschen und in 1 ml PBS, enthaltend 15 ug/ml Kaliumjodid und 5 Gew.-%/Volumen Glucose, resuspendiert.
Diese Suspensionen wurden für 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Probenteile wurden von jeder Suspension zu Beginn der Inkubationszeit und nach Zeiträumen von 1, 2, 3, 4 und 24 Stunden entfernt. Die Lebendzellen jeder Probe wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 bestimmt und die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 angeführt. Tabelle 3 überlebende Zellen pro ml Anti-Ziel Enzyme und Antikörper Dauer der Inkubation (Stunden) Maus-Anti-S. sanguis kein nichts alle Kaninchen-Anti-Maus weggelassen
Probe B, bei der beide Enzyme an den Zielzellen angeheftet wurden, ergab eine viel höhere Zellabtötung als in anderen Proben.

Beispiel 7

Dieses Beispiel liefert ein in vitro-Modell für die Verwendung von ausgerichteten Enzymen zum Bleichen von Zahnverfärbung. Eine Nitrocellulosemembran wurde als Modelloberfläche verwendet.
Die Membran wurde mit Mausnormalserum für 1 Stunde inkubiert. Ein solches Serum enthält Mausimmunoglobulin. Folglich wurden die Mausantikörper an die Membran geheftet. Die Membran wurde dann mit einer 3 %-igen Lösung Rinderserumalbumin zur Blockierung übrig gebliebener Bindungsstellen an der Membran inkubiert. Proben der behandelten Membran, wie vorstehend ausgewiesen, wurden als Kontrolle und Testproben (4 jeweils) verwendet.
Nun wurden die Testproben der Membran (jedoch nicht der Kontrollproben) mit einer Lösung inkubiert, enthaltend:
Glucoseoxidase (G. ox) 100 ug/ml
Meerrettichperoxidase (HRP) 100 ug/ml
Maus-Anti-G. ox-monoklonaler Antikörper 1,25 ug/ml
Maus-Anti-HRP-monoklonaler Antikörper 1,25 ug/ml
Kaninchen-Anti-Maus -polyklonaler Antikörper 50 ug/ml
ähnlich zu der Lösung, die in dem vorstehenden Beispiel verwendet wurde.
Dies führte zur Bildung von Komplexen, wie in Figur 4 erläutert, mit der Nitrocellulosemembran, die das Ziel lieferte.
Die Testproben und die Kontrollproben wurden nun mit Tee gefärbt. Eine Infusion von Blatttee (2 Gew.-%) in siedendem Wasser wurde auf Raumtemperatur abkühlen lassen und mit den Test- und Kontrollproben für 5 Minuten inkubiert, wonach die Proben mit PBS für 1 Stunde zur Entfernung ungebundener Verfärbung gespült wurden.
Die Proben wurden in einer PBS-Lösung mit einem pH- Wert von 7,2, enthaltend 5,4 Gew.-% Glucose, über Nacht (18 Stunden) inkubiert. Es wurde erwartet, daß dies ein Substrat für die gebundenen Enzyme bereitstellen würde, was zur Herstellung von reaktiven Spezies in der Nähe der Teeverfärbung führen würde.
Die Intensität der Verfärbung der Proben wurde vor und nach der Inkubation mit der Glucoselösung unter Verwendung eines Minolta CR 200 Chromometers zur Bestimmung des Reflexionsvermögens bewertet. Das Ergebnis ist auf einer numerischen Skale ausgedrückt.
Die beobachtete Steigerung im Reflexionsvermögen und die Standardabweichungen waren:
Testproben (mit Enzymen) 1,17 ± 0,042
Kontrollproben 0,15 ± 0,31
Dies zeigt eine statistisch signifikante (p < 0,05) Erhöhung in der Helligkeit der Testproben, verglichen mit den Kontrollproben.

Claims

1. Produkt, umfassend ein oder mehrere Vehicula, enthaltend in denselben oder getrennten Vehicula:

i) einen ersten Antikörper oder ein erstes Antikörperfragment zur Bindung durch Antikörper-Antigenbindung an einen Zielort,

ii) einen oder mehrere weitere Antikörper oder Antikörperfragmente, die in der Lage sind, gemeinsam durch Antikörper-Antigenbindung sowohl an einen Wirkstoff, als auch an den/das erste(n) Antikörper oder -fragment zu binden, wodurch der Stoff an den Zielort gebunden wird.

2. Produkt nach Anspruch 1, das ebenfalls einen Wirkstoff einschließt.

3. Produkt nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die weiteren Antikörper oder -fragmente einen Antikörper oder ein Antikörperfragment darstellen, der/das an den Wirkstoff und einen/ein dritten/drittes Antikörper oder -fragment bindet, welche in der Lage sind, sowohl an den/das erste(n) Antikörper oder -fragment als auch an den/das Antikörper oder -fragment, der/das an den Wirkstoff bindet, zu binden.

4. Produkt nach Anspruch 3, wobei die ersten und weiteren Antikörper ganze Antikörper sind und wobei der Antikörper für den Stoff und der erste Antikörper beide von derselben Spezies abgeleitet wird und der dritte Antikörper ein Antikörper für eine weitere Spezies zu jener Spezies ist.

5. Produkt nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Wirkstoff ein Enzym ist.

6. Produkt nach Anspruch 5, wobei das Enzym eine Oxidase ist.

7. Produkt nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das/die Vehiculum/Vehicula zwei Enzyme enthält/enthalten.

8. Produkt nach Anspruch 7, wobei die weiteren Antikörper oder Antikörperfragmente entsprechende Antikörper oder -fragmente, die zu jedem der zwei Enzyme binden und dritte Antikörper, die in der Lage sind, an entweder Antienzymantikörper oder -fragmente zu dem ersten Antikörper oder -fragment binden zu können, umfassen.

9. Produkt nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei die Enzyme eine Oxidase, die Peroxid erzeugt und eine Peroxidase darstellen.

10. Produkt nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die ersten und weiteren Antikörper ganze Antikörper sind und mindestens einer der Antikörper monoklonal ist.

11. Produkt nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das/die Vehiculum/Vehicula zur örtlichen Anwendung im Mund geeignet ist/sind.

12. Produkt nach Anspruch 11, wobei der erste Antikörper oder das erste Antikörperfragment ein Antikörper für S. mutans, S. sanguis, A. viscosus oder A. naeslundii ist.

13. Produkt nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Produkt oder mindestens ein Vehiculum durch ein Mundwasser, eine Zahnpasta oder eine Pastille bereitgestellt wird.

14. Verfahren zur Abgabe eines kosmetischen Wirkstoffs an einen Zielort, umfassend Exposition des Zielorts mit einem Produkt gemäß einem der vorangehenden Ansprüche.

15. Verfahren zur Abgabe eines kosmetischen Wirkstoffs an einen Zielort, umfassend Expositiopn des Ortes einem oder mehreren Vehicula, die in denselben oder getrennten Vehicula enthalten:

ii) einen oder mehrere weitere Antikörper oder Antikörperfragmente, die in der Lage sind, gemeinsam durch Antikörper-Antigenbindung sowohl an einen Wirkstoff, als auch an den/das erste(n) Antikörper oder -fragment zu binden, wodurch das Mittel an den Zielort gebunden wird.

16. Verwendung eines Antikörpers oder -fragmentes, ausgewiesen in einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines Produkts zur örtlichen Anwendung, um einen Wirkstoff an einen Zielort zu binden.