NL1009834C2

NL1009834C2 - Antistoffen voor toepassing in de gerichte en tijdelijke behandeling van mens en dier.

Info

Publication number: NL1009834C2
Application number: NL1009834A
Authority: NL
Inventors: Stanislaus Laurens Joh Wouters; Heinz Helmut Renggli; Danielle Angelique Horbach
Original assignee: Stanislaus Laurens Johan Woute; Heinz Helmut Renggli; Danielle Angelique Horbach
Priority date: 1998-08-10
Filing date: 1998-08-10
Publication date: 2000-02-11
Also published as: US20020034508A1; WO2000009164A1; AU5388299A; US20080038193A1; EP1104308A1; US7288247B2; CA2340116A1

Description

ANTISTOFFEN VOOR TOEPASSING IN DE GERICHTE EN TIJDELIJKE BEHANDELING VAN MENS EN DIER

De uitvinding heeft betrekking op antistoffen, of fragmenten daarvan, die kunnen worden gebruikt voor het "targetten" van (diagnostisch, therapeutisch, en cosmetisch) actieve stoffen op gewenste epitopen. De 5 uitvinding heeft verder betrekking op het gebruik van deze antistoffen, of fragmenten daarvan, in de gerichte en tijdelijke diagnostische, therapeutische en cosmetische behandeling van uitwendig toegankelijke delen van het menselijk en dierlijk lichaam.

10 Het gebruik van een antistof-antigeen binding om een therapeutisch of diagnostisch actieve stof te lokaliseren op een bepaald epitoop op een specifieke plaats van het lichaam is op zichzelf al bekend. In US- [ 5490988 en WO 95/01155 worden bijvoorbeeld antistoffen en 15 fragmenten van antistoffen beschreven, waaraan een therapeutisch actieve stof wordt gekoppeld voor het "targetten" van antimicrobiële stoffen op epitopen van ; pathogene verbindingen in de mondholte. In EP 0736544 worden antistoffen beschreven die specifiek = 20 eiwitstructuren op de tand herkennen waardoor zeer gericht en lokaal therapeutische of cosmetische stoffen ^ op de tand kunnen worden aangebracht. Door de gerichte en r lokale toediening van actieve stoffen, wordt een maximale " effectiviteit van deze stoffen bereikt.

25 Door conjugatie aan een kleurstof (bijvoorbeeld erythrocine) kunnen dergelijke antistoffen, of fragmenten daarvan, voor de detectie van bijvoorbeeld tandplaque 1 worden gebruikt. Door een vroege detectie van tandplaque bestaat de mogelijkheid om de plaque te verwijderen _ 30 voordat het tot infectieuze of carieuze aandoeningen van ^ het gebit en/of omringende weefsels aanleiding geeft. 1

Door het in contact brengen van het gebit en omringende ^ weefsels met de antistof gekoppeld aan een kleurstof die - de plaque detecteert, kan de plaque zichtbaar worden z

35 gemaakt en vervolgens worden verwijderd door het gebit en E

de omringende weefsels te reinigen, met name op die _ plaatsen waar de aanwezigheid van plaque vastgesteld is.

1009834 2

Een nadeel van het gebruik van antistoffen, of fragmenten daarvan, voor de detectie van tandplaque via deze methode, is het feit dat de antistof/epitoop binding niet snel wordt verbroken, waardoor eventuele met het oog 5 zichtbare kleurstoffen gedurende langere tijd zichtbaar blijven. Dit kan worden vermeden door toepassing van op fluoresceïne gebaseerde kleurstoffen die alleen zichtbaar zijn tijdens beschijning met UV-licht. Deze middelen zijn echter nogal omslachtig in het gebruik en niet 10 gemakkelijk voor de consument toepasbaar.

De therapeutische behandeling van ontstekingen in de mondholte met bijvoorbeeld systemische antibiotica heeft als belangrijk nadeel dat het antibioticum zich door het gehele lichaam verspreidt en ook andere organen 15 en weefsels bereikt, waardoor de natuurlijke microbiële flora van bijvoorbeeld het maag-darmkanaal kan worden verstoord. Het gebruik van antibioticagel in de mondholte kan dit weliswaar voorkomen, maar heeft als nadeel dat het niet goed blijft zitten.

20 Het is het doel van de uitvinding om bovengenoemde nadelen te vermijden. Dit wordt door de uitvinding bereikt door het verschaffen van antistoffen, of fragmenten daarvan, die aan een epitoop binden onder specifiek gekozen omstandigheden, en die van dat epitoop 25 elueren onder specifiek gekozen andere omstandigheden. Door de omstandigheden zodanig te veranderen dat de binding tussen epitoop en antistof wordt verbroken, kunnen de antistoffen op ieder gewenst moment worden verwijderd. Op deze manier kan bijvoorbeeld een 30 ontsteking in de mondholte zeer lokaal en gericht worden behandeld, en kunnen antistoffen, die zijn gekoppeld aan een kleurstof en worden gebruikt voor de detectie van tandplaque, op ieder gewenst moment worden verwijderd, zonder dat lippen, tong en tandvlees gedurende langere 35 tijd gekleurd blijven.

Een antistof volgens de uitvinding wordt geselecteerd met behulp van de op zichzelf bekende 'faag-display' techniek. Faag-display is een techniek om humane 1009834 j 3 > antistoffen te maken die voor diagnostische of therapeutische doeleinden en/of voor gebruik in de research kunnen dienen. De faag-display techniek maakt gebruik van de mogelijkheid om eiwitten tot expressie te 5 brengen in de mantel van bacteriofagen. In deze techniek worden bacteriofagen getransfecteerd met humane variabele ’ (V) genen, die de basis vormen voor de samenstelling van humane antistoffen. Door te zorgen dat de gesynthetiseerde antistoffen als fusie-eiwitten met een :

10 bacteriofaag mantel-eiwit (bijv. g3p) tot expressie komen verschijnen g3p-antistof fusie-eiwitten na synthese op het oppervlak van de bacteriofaag. In de praktijk brengt de bacteriofaag slechts een deel van een antistofmolecuul I

tot expressie, een single chain Fv-fragment (scFv).

15 Er bestaan grote zogenaamde faag-bibliotheken (of-banken) van scFv-fragmenten met verschillende antistofspecificiteiten. Dergelijke faag-bibliotheken

worden gebruikt om de antistoffragmenten te selecteren I

met de specifieke eigenschap dat deze antistoffragmenten 20 met hoge affiniteit aan een bepaald epitoop binden onder specifiek gekozen eigenschappen en dat de binding tussen antistoffragment en epitoop wordt verbroken bij specifiek I

gekozen andere omstandigheden.

Deze specifiek gekozen omstandigheden kunnen z 25 bijvoorbeeld worden gevormd door de pH of de ionsterkte. z

Voor toepassing in de behandeling van het menselijk en 1 dierlijk lichaam liggen deze omstandigheden bij voorkeur = binnen fysiologisch aanvaardbare grenzen. Voor gebruik in de mondholte kan de pH bijvoorbeeld tussen 4 en 8,5 en de 30 ionsterkte tussen Ö en 13 M worden gevarieerd.

Met behulp van een selectie procedure, zoals beschreven in voorbeeld 1, worden monoclonale faag- antistof fragmenten (scFv) verkregen, met de voor de z toepassing gewenste eigenschappen als affiniteit, 35 specificiteit en pH en/of ionsterkte gevoeligheid. Deze

scFv-fragmenten bevatten geen constant (Fc) deel. Z

Voor de toepassing volgens de uitvinding heeft het de voorkeur om bivalente antistoffen te maken omdat dit de 1 η n o « 3 λ 4 affiniteit sterk kan verhogen. Het DNA dat codeert voor de gewenste scFv fragmenten wordt overgezet in speciale eukaryotische expressievectoren die het DNA bevatten dat codeert voor het constante gedeelte (Fc) van de 5 antistoffen. Afhankelijk van de gebruikte vector worden intacte humane monoclonale antistoffen van het type IgM, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2 of IgE geproduceerd.

De door de vectoren gesynthetiseerde antistoffen kunnen uit het kweekmedium worden geïsoleerd.

10 Wanneer de affiniteit van de geselecteerde scFv-antistoffragmenten hoog genoeg blijkt te zijn is het niet direct noodzakelijk volledige antistoffen te maken. Het DNA dat codeert voor de scFv-fragmenten kan dan direct in speciale expressie-vectoren worden overgezet, 15 zodat de scFv-fragmenten niet als faag-gebonden antistoffragmenten, maar als oplosbare fragmenten gesynthetiseerd worden, die vervolgens uit het kweekmedium kunnen worden geïsoleerd.

Aan de verkregen antistoffen of fragmenten 20 kunnen diagnostisch, therapeutisch of cosmetisch actieve stoffen gekoppeld worden zoals beschreven in EP 0453097, EP 0451972 en EP 0450800, of volgens Lal et al. (Immunol. Meth. 1985; 79:307-318).

' Onder "fragmenten" worden F(ab)-, F(ab)'-, 25 F(ab)'2- of scFv-fragmenten begrepen.

Dergelijke stoffen kunnen bijvoorbeeld enzymen, kleurstoffen, fluorescente stoffen, radioactieve stoffen of antimicrobiële verbindingen zijn. Enzymen kunnen worden gebruikt als antimicrobiële middelen 30 (therapeutisch), of als bleekmiddel voor het verwijderen van aanslag op de tanden (cosmetische behandeling). Kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor de detectie van bijvoorbeeld tandplaque (diagnostisch). Antimicrobiële verbindingen kunnen worden gebruikt voor behandeling van 35 ontstekingen in de mondholte of andere uitwendig toegankelijke delen van het lichaam.

Antistoffen, of fragmenten daarvan, volgens de uitvinding kunnen worden gebruikt voor de behandeling van : 1009834 5 uitwendig toegankelijke delen van het menselijk lichaam, zoals de mondholte, maar ook de huid en het gastro-intestinale en urogenitale stelsel.

Een voorbeeld van een toepassing van 5 antistoffen volgens de uitvinding is het in contact brengen van antimicrobiële stoffen met species van de orale microflora. De orale microflora bevat een grote verscheidenheid aan microbiële species waaronder de pathogenen: Actinomyces actinomvcetem comitans, 10 Porphvromonas gincivalis. Prevotella intermedia.

Streptococcus mutans. Bacteroides forsvthus. Eikenella corrodens. Treponema denticola. Campylobacter lectus. :

Fusobacterium nucleatum. Een aantal van deze species levert een belangrijke bijdrage aan de vorming van : 15 tandplaque. Door antimicrobiële stoffen te koppelen aan antistoffen, of fragmenten daarvan, die gericht zijn tegen epitopen op deze pathogene verbindingen, kunnen 1 zeer lokaal en gericht deze species worden "aangevallen". =

Als antimicrobiële stof kan bijvoorbeeld een enzym worden 7 20 gebruikt zoals een oxidase (bijv. glucose oxidase, lactase oxidase of "uric acid" oxidase), een peroxidase (bijv. "horse radish" peroxidase, myeloperoxidase, lactoperoxidase, of chloroperoxidase), een protease 7 (bijv. papaine, pepsine, trypsine, ficine of bromeline), 25 een celwand lyserend enzym (bijv. lysozym), of een plaque matrix remmer (bijv. dextranase of mutanase).

De uitvinding heeft verder betrekking op het gebruik van dergelijke antistoffen, of antistoffragmenten i

voor het vervaardigen van een medicament voor de gerichte I

30 en tijdelijke diagnostische, therapeutische en cosmetische behandeling van uitwendig toegankelijke delen van het menselijk en dierlijk lichaam. Een medicament _

omvattende de antistoffen, of fragmenten daarvan, volgens I

de uitvinding kan een aantal vormen hebben, afhankelijk _ 35 van het gebied van het lichaam waar het medicament moet 1 worden toegepast. Voor toepassing in de mondholte kan het medicament de vorm van een spoelwater, zuig- of 1009834 = 6 kauwtablet, gebitreinigingsmiddel, crème, zalf of kauwgum hebben.

De uitvinding wordt verder toegelicht met behulp van een aantal voorbeelden. Deze voorbeelden 5 dienen ter illustratie en zijn geenszins beperkend voor de uitvinding.

VOORBEELDEN

10 VOORBEELD 1

Selectie van antistoffen: A. Opgroeien van de faag-antistof bibliotheek:

Bacteriën (E. coli) worden toegevoegd aan 50 ml 15 kweekmedium en opgegroeid bij 37° C tot de ODg00 nm is 0.5. Van deze kweek wordt 5 ml samen met een helper-faag toegevoegd aan 50 ml medium en geïncubeerd bij 37° C (30 minuten zonder schudden en 30 minuten met schudden). De kweek wordt afgedraaid, het supernatant verwijderd en 20 vervolgens wordt de pellet geresuspendeerd in buffer en overnacht opgegroeid bij 30°C.

B. Maken van faag-antistoffragmenten:

De kweek wordt afgedraaid, waarna 1/5 volume 25 PEG/NaCl wordt toegevoegd, en na mengen geïncubeerd op ijs gedurende 1 uur. Na centrifugeren wordt het supernatant verwijderd, en de faag-antistoffragmenten geresuspendeerd in 40 ml PBS. Opnieuw wordt PEG/NaCl (8 ml) toegevoegd, gemengd en geïncubeerd op ijs voor 30 30 minuten. Vervolgens wordt gecentrifugeerd, het supernatant verwijderd en wordt de pellet geresuspendeerd in 2 ml PBS/1% BSA. Na centrifugeren en filtreren (0.45 μπι) wordt de titer gesteld op ongeveer 1012-1013 cfu/ml. De antistoffaagfragmenten worden bewaard bij 4° C.

35 C. Selecteren van faag-antistoffen op pH gevoeligheid:

Om alleen die antistoffragmenten te selecteren die bij pH 5 of pH 8 kunnen binden aan een epitoop en die 1009834 7 bij pH 7 weer loslaten wordt een gewenste drager gecoat met een geschikt antigeen (bijvoorbeeld Actinomyces actinomvcetem comitans). Om aspecifieke binding te voorkomen wordt het antigeen-dragende oppervlak 5 geïncubeerd met PBS/2% melkpoeder gedurende 2 uur bij KT.

De faag-antistoffen in de faag-bibliotheek worden eveneens geblokkeerd met PBS/4% melkpoeder (PBS pH 5 of 8) voor 15 minuten bij KT. Hierna wordt het antigeen oppervlak drie keer gewassen met fosfaat buffer met pH 5 10 of 8 en vervolgens worden de geblokkeerde faag- antistof fragmenten bij dezelfde pH (5 of 8) toegevoegd.

Na incuberen bij 37° C worden de niet-gebonden fagen weggewassen door 20 keer te wassen met fosfaatbuffer met pH 5 of 8, en vervolgens 20 keer met dezelfde buffer 15 waaraan 0.1 % Tween-20 is toegevoegd.

De gebonden faag-antistoffragmenten worden geëlueerd door te wassen met een fosfaatbuffer met pH 7.

De geêlueerde faag-antistoffragmenten worden toegevoegd aan 1 ml Tris-HCl pH 7,4. Hieraan wordt 5 ml groeimedium 20 en 10 ml van de bacterie-kweek (E. coli) toegevoegd en geïncubeerd zonder schudden gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Hierna wordt de kweek afgedraaid en het supernatant (op 1 ml na) verwijderd. De geïnfecteerde cellen worden Γ uitgeplaat op 20 cm2 platen met een geschikte groeibodem : 25 en overnacht geïncubeerd bij 37° C.

D. Verzamelen van de faag-antistoffragmenten en de volgende selectieronde:

De bacteriekolonies worden van de kweekplaten ^ 30 geschraapt en in 2-3 ml medium geresupendeerd en : opgegroeid volgens protocol A.

Faag-antistoffragmenten worden gemaakt volgens ? protocol B. De gewenste faag-antistoffragmenten worden 1 geselecteerd volgens protocol C. Deze procedure moet * 35 minimaal drie maal worden herhaald.

1 0 0 O 0 O 4 - 8 E. Screenen op specificiteit en selectiviteit:

Het antigeen van interesse wordt gecoat op een drager volgens protocol C, en geblokkeerd met fosfaatbuffer (pH 5 of 8)/3% BSA/ 0.1% Tween-20. De coat 5 wordt geïncubeerd met een concentratiereeks van faag-antistofdeeltjes uit de verschillende selecties, verdund in blokbuffer. Vervolgens wordt gewassen met fosfaatbuffer (pH 5 of 8)/0.1% Tween-20, en geïncubeerd met een peroxidase-gelabeld anti-faag-antistof 10 (bijvoorbeeld anti-M13-HRP) in blokbuffer. Na wassen worden de gebonden faag-antistoffen gedetecteerd met behulp van OPD. Hiermee wordt aangetoond of de faag-antistof (fragmenten) in staat zijn bij de gebruikte pH (5 of 8) aan het antigeen te binden. Hierna kan protocol E 15 worden herhaald, maar nu bij pH 7 om te bepalen of de faag-antistoffen niet meer binden bij pH 7.

Wanneer de titer of specificiteit van de antistoffen nog niet voldoende hoog is kunnen de selectierondes worden herhaald.

2 0 F. Maken van complete antistoffen:

Wanneer de specificteit, selectiviteit en pH gevoeligheid goed zijn kunnen complete humane antistoffen worden gemaakt. Hiervoor wordt het DNA van de faag-25 antistoffragmenten (scFv) gefuseerd met DNA dat codeert voor de constante regionen van humane antistoffen (Fc), zodat volledige humane antistoffen worden gecreëerd. Aan deze antistoffen kunnen vervolgens diagnostisch, therapeutisch of cosmetisch actieve stoffen worden 30 gekoppeld.

VOORBEELD 2

Tandpasta

In de mondholte kan een pH van ongeveer 4-8,5 35 gebruikt worden.

Een antistof, of een fragment van een antistof, volgens de uitvinding, waaraan een diagnostisch, cosmetisch actieve stof wordt gekoppeld, bindt 1 nnnoo ,4 9 bijvoorbeeld aan een gewenst epitoop in de mondholte bij een pH van 4-6 of 8-8,5. Door vervolgens te spoelen met kraanwater (pH 7) kan op ieder gewenst moment de binding worden verbroken, waardoor de werking van de reactieve 5 stof op elk gewenst moment gestopt kan worden.

VOORBEELD 3

Ionsterkte als specifiek gekozen omstandigheid

In de mondholte kan een ionsterkte tussen 10 ongeveer 0 en 13 M worden gebruikt.

In een bepaalde uitvoeringsvorm volgens de uitvinding bindt de antistof of een fragment daarvan met daaraan gekoppeld de diagnostisch of cosmetisch actieve stof bij een ionsterkte tussen 0 en 500 mM. De binding 15 kan vervolgens op elk gewenst moment worden verbroken : door te spoelen met een spoelvloeistof met een ionsterkte van 1-13 M.

1009834

Claims

1. Antistof, of een fragment van een antistof, welke aan een epitoop bindt onder specifiek gekozen omstandigheden en waarvan de binding met dat epitoop wordt verbroken onder specifiek gekozen andere 5 omstandigheden, voor de gerichte en tijdelijke diagnostische, therapeutische en cosmetische behandeling van uitwendig toegankelijke delen van het menselijk en dierlijk lichaam.

2. Antistof, of een fragment van een antistof, 10 volgens conclusie 1 waaraan een diagnostisch, therapeutisch of cosmetisch actieve stof geconjugeerd is.

3. Antistof, of een fragment van een antistof, volgens conclusie 1 of 2 met het kenmerk dat zowel de specifiek gekozen bindingsomstandigheden als de 15 omstandigheden waarbij de binding wordt verbroken binnen fysiologisch aanvaardbare grenzen liggen.

4. Antistof, of een fragment van een antistof, volgens conclusie 3 met het kenmerk dat de specifiek gekozen omstandigheden worden gevormd door de pH.

5. Antistof, of een fragment van een antistof, volgens conclusie 4 met het kenmerk dat de antistof bindt aan een epitoop bij een pH tussen 4-8,5 en dat de binding wordt verbroken bij een andere pH tussen 4-8,5.

6. Antistof, of een fragment van een antistof, 25 volgens conclusie 5 met het kenmerk dat de antistof bindt aan een epitoop bij een pH van ongeveer 4-7 of 7-8,5 en dat de binding wordt verbroken bij een pH van ongeveer 7.

7. Antistof, of een fragment van een antistof, volgens conclusie 5 met het kenmerk dat de antistof bindt 30 aan een epitoop bij een pH van ongeveer 7 en dat de binding wordt verbroken bij een pH van ongeveer 4-7 of 7- 8,5.

8. Antistof, of een fragment van een antistof, volgens conclusie 5 met het kenmerk dat de antistof bindt 35 aan een epitoop bij een pH van ongeveer 4-6 of 8-8,5 en i dat de binding wordt verbroken bij een pH van ongeveer 7. 1 ΠΠ00 0 /

9. Antistof, of een fragment van een antistof, volgens conclusie 5 met het kenmerk dat de antistof bindt aan een epitoop bij een pH van ongeveer 7 en dat de binding wordt verbroken bij een pH van ongeveer 4-6 of 8- 5 8,5.

10. Antistof, of een fragment van een antistof, volgens conclusie 3 met het kenmerk dat de specifiek gekozen omstandigheden worden bepaald door de ionsterkte.

11. Antistof, of een fragment van een antistof, 10 volgens conclusie 10 met het kenmerk dat de antistof bindt bij een ionsterkte tussen 0 en 13 M en dat de binding wordt verbroken bij een andere ionsterkte tussen 0 en 13 M.

12. Antistof, of een fragment van een antistof, 15 volgens conclusie 11 met het kenmerk dat de antistof bindt bij een ionsterkte van ongeveer 0-500 mM en dat de binding wordt verbroken bij een ionsterkte van ongeveer 1-13 M. :

13. Antistof, of een fragment van een antistof, i 20 volgens conclusie 3 met het kenmerk dat de antistof bindt aan een epitoop bij een pH tussen 4-8,5 en/of een : ionsterkte tussen 0 en 13 M en dat de binding wordt verbroken bij een andere pH tussen 4-8,5 en/of een andere ionsterkte tussen 0 en 13 M.

14. Antistof, of een fragment van een antistof, : volgens een van de voorgaande conclusies met het kenmerk dat het fragment een F(ab), F(ab)', F(ab)'2 of een scFv : is.

15. Antistof, of een fragment van een antistof, " 30 volgens conclusies 1-14 met het kenmerk dat een uitwendig toegankelijk deel van het menselijk of dierlijk lichaam : de mondholte is.

16. Antistof, of een fragment van een antistof, Ξ volgens conclusies 1-15 met het kenmerk dat de 35 cosmetische behandeling van de mondholte het bleken van tanden en kiezen omvat.

17. Antistof, of een fragment van een antistof, - volgens conclusie 1-15 met het kenmerk dat de 1009834 - diagnostische behandeling van de mondholte de detectie van plaque omvat.

18. Antistof, of een fragment van een antistof, volgens conclusie 1-15 met het kenmerk dat de 5 therapeutische behandeling van de mondholte het verwijderen van plaque omvat.

19. Antistof, of een fragment van een antistof, volgens conclusie 1-15 met het kenmerk dat de therapeutische behandeling het behandelen van infecties 10 in uitwendig toegankelijke delen van het menselijk of dierlijk lichaam omvat.

20. Antistof, of een fragment van een antistof, volgens conclusie 2-19 waarin de actieve stof een enzym is.

21. Antistof, of een fragment van een antistof, volgens conclusie 20 met het kenmerk dat het enzym een oxidase (bijv. glucose oxidase, lactase oxidase of "uric acid" oxidase), een peroxidase (bijv. "horse radish" peroxidase, myeloperoxidase, lactoperoxidase, of 20 chloroperoxidase), een protease (bijv. papaine, pepsine, trypsine, ficine of bromeline), een celwand lyserend enzym (bijv. lysozym), of een plaque matrix remmer (bijv. dextranase of mutanase) is.

22. Antistof, of een fragment van een antistof, 25 volgens conclusie 2-19 waarin de actieve stof een fluorescente of radioactieve stof is.

23. Antistof, of een fragment van een antistof, volgens een van de voorgaande conclusies met het kenmerk dat de antistof, of fragment van een antistof, is gericht 30 tegen epitopen van pathogene micro-organismen of andere pathogene verbindingen.

24. Antistof, of een fragment van een antistof, volgens conclusie 23, met het kenmerk dat de pathogene micro-organismen bijvoorbeeld Actinomyces actinomvcetem 35 comitans. Porphvromonas crincrivalis. Prevotella intermedia. Streptococcus mutans. Bacteroides forsvthus, Eikenella corrodens. Treponema denticola. Campylobacter lectus of Fusobacterium nucleatum zijn. 1009834

25. Samenstelling omvattende tenminste één antistof, of een fragment van een antistof, volgens een der voorgaande conclusie samen met een gebruikelijk verdunningsmiddel of oplosmiddel of gebruikelijke drager.

26. Samenstelling volgens conclusie 25 met het kenmerk dat de samenstelling een gebitreinigingsmiddel, spoelwater, mondspray, kauwtablet, kauwgum, crème of zalf is.

27. Gebruik van een antistof, of een fragment 10 van een antistof, volgens een van de voorgaande i conclusies voor het vervaardigen van een medicament voor : de gerichte en tijdelijke behandeling van uitwendig toegankelijke delen van het menselijk en dierlijk I lichaam. 1009834 - SAMENWERKINGSVERDRAG (PCT) RAPPORT BETREFFENDE NIEUWHEIDSONDERZOEK VAN INTERNATIONAAL TYPE IDENTIFIKATIE VAN DE NATIONALE AANVRAGE Kenmerk van de aanvrager of van de gemachtigde ____4/T169/zh/2_ Nederlandse aanvrage nr. Indieningsdatum 1009834 10 augustus 1998 Ingeroepen voorrangsdatum Aanvrager (Naam) WOUTERS, Stanislaus Laurens Johan Datum van het verzoek voor ten onderzoek van internationaal type Door de Instantie voor Internationaal Onderzoek (ISA) aan het verzoek voor ten onderzoek van internationaal type toegekend nr. SN 32033 NL I. CLASSIFICATIE VAN HET ONOERIM:RP(bij toepassing van verschillende classificaties,alle classificatiesymbolen opgeven) Volgens de Internationale classificatie (IPC) Int. Cl.6: A 61 K 47/48, A 61 K 7/28 II. ONDERZOCHTE GEBIEDEN VAN DE TECHNIEK _Onderzochte minimum documentatie_ Classificatiesysteem Classificatiesymbolen Int. Cl.6 A 61 K Onderzochte andere documentatie dan de minimum documentatie voor zover dergelijke documenten in de onderzocht· gebieden zijn oogenomen m· ΓΧ1 GEEN ONDERZOEK MOGELIJK VOOR BEPAALDE CONCLUSIES (opmerkingen op aanvullingsblad) ς IV· I 1 GEBREK AAN EENHEID VAN UITVINDING (opmerkingen op aanvullingsblad) //? -—--- / ^ Porm CCT/ISA/ZOKa) 07.1979